JP2012501172A - 開花時期制御遺伝子であるｆｔの、サトウダイコンのホモログのトランスジェニック発現による、サトウダイコンにおける抽薹耐性の改変 - Google Patents

開花時期制御遺伝子であるｆｔの、サトウダイコンのホモログのトランスジェニック発現による、サトウダイコンにおける抽薹耐性の改変 Download PDF

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Abstract

本発明は、サトウダイコンの抽薹及び開花制御の分野、特にＦＴ遺伝子のベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）ホモログであるＢｖＦＴ１とＢｖＦＴ２の発現を改変することにより、サトウダイコンの抽薹耐性を操作するための方法、並びに核酸分子、キメラ構築物、及びベクターに関する。特に本発明は、抽薹耐性の表現型を有するサトウダイコン植物を提供する。

Description

本発明は、サトウダイコン（ｓｕｇａｒ ｂｅｅｔ）の抽薹及び開花制御の分野に関し、具体的には、抽薹耐性を付与する遺伝子、サトウダイコンにおいて抽薹耐性を改変する方法、及び遅延抽薹を示すトランスジェニック・サトウダイコン植物に関する。特に本発明は、ＦＴ遺伝子のベータホモログであるＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の発現を変化させることによるサトウダイコンの春化応答の調節に関する。
サトウダイコンは数千年の間甘味源として栽培されてきたが、糖源としてのその潜在性は１８世紀まで発見されなかった。栽培されるサトウダイコン（ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）種、ブルガリス・エル（ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．））は、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）に属する二年生植物である。その通常の生活環は２年で完了する。一年目には、ロゼット葉と大きな多肉根が発達し、これはショ糖の形でエネルギー貯蔵場所として役立つ。このためにこれは、一年生植物として栽培される。二年目にこれは、ある低温期間後茎の伸長（抽薹）と開花が始まり、花及び種子を生産する。たまたま一年目に長い低温期間が存在すると、薹が発芽し得る。この遺伝学的に決定された温度誘導が、抽薹（ｂｏｌｔｉｎｇ）と呼ばれる現象を引き起こす。糖抽出のためのサトウダイコンの収穫は、二年生周期を半分に短縮し、一方でショ糖はその最盛期にある。
伝統的にサトウダイコンを収穫するための２つの方法（春作と秋作）が存在し、これらはそれぞれ南の穏やかな気候で、又は北半球で行われる。両方法とも、程度の異なる自然の抽薹耐性を有する品種に依存する。抽薹耐性は、薹誘導のために耐え得る温度、期間、照射限界に影響を与え、そしてそれはサトウダイコン育種における重要な形質である。春化を阻止するか、春化処理された植物を脱春化させるか、又は花もしくは生長可能種子の産生を抑制するかのいずれかにより、抽薹及び開花の完全な制御を可能にすることは、サトウダイコン作物が、次の季節に抽薹及び開花の危険なしに北半球地方で秋に播種されることを可能にする。春作から冬作へのこの変更は、栽培者が秋にそれらの種子を蒔き、次の年の夏に収穫することを可能にする。小麦や菜種のような作物における冬品種と春品種の比較は、冬品種が常に春品種よりも高収量であることを示した。その結果は、作物の採算性及び収益性を改善するであろう。さらなる利点は、春及び冬作の栽培を組み合わせ得る可能性であり、これは２ヶ月から３ヶ月早く始めることによる収穫期間が延長され、従ってサトウダイコンの収穫、輸送及び加工のために必要な設備及びインフラへの投資に対する改善された収益を可能にする。サトウダイコン加工のこの延長は、糖産業の１つの要求に応えるであろう。
完全なサトウダイコン生活環の必須部分としての低温誘導春化は、植物の抽薹を誘導する。春化とその二年生サトウダイコンに対する作用は、詳細に記載されている（例えば、ＪＡＧＧＡＲＤ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。サトウダイコンは３〜１２℃の温度に応答する。サトウダイコンが抽薹を開始するには、３〜１２℃が数週間必要である。ＩＴＢ抽薹モデルは、フランスではドリリング(畝)後９０日（１３週間）まで春化が起きることを示す。この９０日中、１７日間、７℃は、抽薹を開始するために極めて重要な値である。抽薹の確率は、最高温度が１２℃を超えない日数に比例して上昇する。これは早播き法が適用される時は、収率低下につながり、作物の１％の抽薹（ｂｏｌｔｅｒ）は、糖の収率を０．４〜０．７％低下させると推定される。
開花誘導の最も重要な因子としての春化応答の知識は、サトウダイコン農家に利用され得る抽薹耐性サトウダイコン品種の開発をもたらした。しかし糖産業の要求に答えるために、冬季に（すなわち冬作物として）中央ヨーロッパで本サトウダイコンを栽培することは、不可能である。高収率の冬サトウダイコンの栽培でも、抽薹のために多くの大きな問題がある。サトウダイコン春化を、予測可能に遅らせるために利用可能である植物又は方法が現在存在しないため、冬季における低温への曝露によって誘導される春化は、なお抽薹や収率低下を引き起こす。
以上の理由により、春化応答を調節して、低温誘導後の抽薹に対する耐性を付与するか又はこれを有意に遅らせるために、例えばトランスジェニック手段により、抽薹耐性が改変される非抽薹冬サトウダイコンを開発することは極めて望ましい。従って、春化応答に関与する遺伝子のヌクレオチド配列、及びサトウダイコンの春化応答を調節するために前記遺伝子配列を利用するトランスジェニック手段に対するニーズが存在する。本発明は、かかるヌクレオチド配列、及びかかるトランスジェニック手段を今回提供する。
モデル生物であるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の機能解析により、４つの明確な開花経路が区別された（ＬＥＶＹ ａｎｄ ＤＥＡＮ，１９９８）。これらの４つの経路は、環境刺激、例えば光周期と春化促進経路、又は固有の生長シグナル、例えば自律促進、及び開花抑制経路に割り当てられる。幾つかの種において、開花の時期は、主に環境因子、例えば光周期、光質／量、春化及び水又は養分利用可能性により影響を受ける。他の種は、外部シグナルにあまり影響を受けず、内部シグナル、例えば植物サイズ又は節の数に、より依存する。
対象となる１つの遺伝子座は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の天然に存在する後期開花生態型で発見された開花遺伝子座（ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ）Ｔ（ＦＴ）である（ＫＯＯＲＮＥＥＦ ｅｔ ａｌ，１９９１）。ＦＴは２３ＫＤの小さいタンパク質であり、ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質と同族であり、これはまた、ＲＡＦキナーゼインヒビタータンパク質と呼ばれる（ＫＡＲＤＡＩＬＳＫＹ ｅｔ ａｌ，１９９９；ＫＯＢＡＹＡＳＨＩ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
本発明者らは、サトウダイコン中のＦＴ遺伝子のオルソログを今回同定した。これらの遺伝子の発現操作により、サトウダイコン中の春化応答が調節され、春化応答が遅延されるか又は抑制されるサトウダイコン植物が得られた。
発明の概要
本発明は、サトウダイコンＦＴ遺伝子のヌクレオチド配列を含み、及び、サトウダイコン中のこれらのＦＴ遺伝子発現を抑制又は上方制御することにより、サトウダイコン春化応答を調節する方法を含む。
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（ＡｔＦＴ、受入番号ＮＭ＿１０５２２２）、柑橘類（ＣｉＦＴ、受入番号ＡＢ０２７４５６）、小麦（ＴａＦＴ、受入番号ＡＹ７０５７９４）、及びコメ（ＯｓＨｄ３ａ、受入番号ＮＭ＿００１０６３３９５）からのＦＴオルソログのｍＲＮＡ間の配列整列である。縮重プライマーＨｉＮＫ５８１（配列番号１）及びＨｉＮＫ８６０（配列番号２）の位置は四角で囲まれる。 ＢｖＦＴ１遺伝子構造の略図である。 ＢｖＦＴ２遺伝子構造の略図である。 ＢｖＦＴ１タンパク質とＡｔＦＴタンパク質との間のアミノ酸配列の比較を示す。保存されたアミノ酸は濃い灰色で、弱い類似性は薄い灰色で、類似性のないものは白色で示す。 ＢｖＦＴ２タンパク質とＡｔＦＴタンパク質との間のアミノ酸配列の比較を示す。保存されたアミノ酸は濃い灰色で、弱い類似性は薄い灰色で、類似性のないものは白色で示す。 サトウダイコンのＦＴホモログを含むいくつかの植物種からの、ＦＴ遺伝子ファミリー中の複数のメンバーの系統発生解析を示す。系統樹は近隣結合法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）により構築され、ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（ＦＴ、受入番号ＮＰ＿１７６７２６；ＴＦＬ１、受入番号ＮＰ＿１９６００４；ＭＦＴ、受入番号ＮＰ＿１７３２５０；ＡＴＣ、受入番号ＮＰ＿１８０３２４；ＴＳＦ、受入番号ＮＰ＿１９３７７０、及びＢＦＴ、受入番号ＮＰ＿２０１０１０）、ブドウのつる（ＶｖＦＴ、受入番号ＡＢＩ９９４６５；ＶｖＴＦＬ１Ａ、受入番号ＡＢＩ９９４６６；ＶｖＴＦＬ１Ｂ、受入番号ＡＢＩ９９４６７；ＶｖＴＦＬ１Ｃ、受入番号ＡＢＩ９９４６８；及びＶｖＭＦＴ、受入番号ＡＢＩ９９４６９）、柑橘類（ＣｉＦＴ、受入番号ＢＡＡ７７８３６；及びＣｉＴＦＬ１、受入番号ＡＡＲ０４６８３）、リンゴ（ＭｄＦＴ、受入番号ＢＡＤ０８３４０；ＭｄＴＦＬ１−１、受入番号ＢＡＤ１０９６１；及びＭｄＴＦＬ１−２、受入番号ＢＡＤ１０９６７）、アサガオ（Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ）（ＰｈＦＴ１、受入番号ＡＢＷ７３５６２；及びＰｈＦＴ２、受入番号ＡＢＷ７３５６３）、トマト（ＳＰ、受入番号ＡＡＣ２６１６１；ＳＰ２Ｇ、受入番号ＡＡＯ３１７９１；ＳＰ３Ｄ、受入番号ＡＡＯ３１７９２；ＳＰ５Ｇ、受入番号ＡＡＯ３１７９３；ＳＰ６Ａ、受入番号ＡＡＯ３１７９４；及びＳＰ９Ｄ、受入番号ＡＡＯ３１７９５）、小麦（ＴａＦＴ、受入番号ＡＢＫ３２２０５）、コメ（ＯｓＨｄ３ａ、受入番号ＮＰ＿００１０５６８６０；及びＯｓＲＦＴ、受入番号ＢＡＦ９２７１２）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）（ＢｎＴＦＬ１、受入番号ＢＡＡ３３４１５）、及びポプラ（ＰｎＦＴＬ１、受入番号ＢＡＤ０８３３９；ＰｎＴＦＬ１、受入番号ＢＡＤ２２５９９；ＰｎＦＴＬ３、受入番号ＢＡＤ２２６０１；ＰｎＦＴＬ４、受入番号ＢＡＤ２２６７７；ＰｎＦＴ１、受入番号ＢＡＤ０１６１２；ＰｎＦＴ２、受入番号ＢＡＤ０１５６１；ＰｎＦＴ３、受入番号ＢＡＤ０２３７１；及びＰｎＦＴ４、受入番号ＢＡＧ１２９０４）を含む。アミノ酸配列の整列から、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用して、アンルーティッドデンドログラム（ｕｎｒｏｏｔｅｄ ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ）（樹状図）を作成し、系統樹は、ＭＥＧＡ４ソフトウェアパッケージにより示した（ＴＡＭＵＲＡ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。１０００の再サンプリングについてのブートストラップ値を各枝に示す。スケールは、１部位あたりの置換の平均数を示す。ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＦＴホモログを、三角で印を付けた。 サトウダイコン染色体ＩＸ及びＩＶの遺伝子地図を示す。マーカーを染色体の右側に示す；累積遺伝子距離を左側に示す。遺伝子地図は、ＪｏｉｎＭａｐ ３．０ソフトウェアを使用して構築した。ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の遺伝子位置をそれぞれ強調してある。 二年生サトウダイコン植物の種々の器官におけるＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２遺伝子の相対的発現を示す。試料は、ＬＤ条件（１６時間の明／８時間の暗）下で１８℃の温度で生長させた二年生サトウダイコン植物から採取した。検出されたアンプリコンのレベルは、ベータイソクエン酸脱水素酵素（ＢｖＩＣＤＨ）遺伝子に対応する増幅産物を参照して標準化した。データ点は、３つの生物学的複製（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）の平均値を示す。 二年生及び一年生サトウダイコンの異なる生長段階にわたるＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の相対的遺伝子発現レベルを示す。破線の棒は、春化期間を示す。ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の検出されたアンプリコンのレベルは、内部較正物質遺伝子として使用したベータイソクエン酸脱水素酵素（ＢｖＩＣＤＨ１）遺伝子に対応する増幅産物を参照して標準化した。データ点は、２つの生物学的複製の平均値を示す。 一年生、二年生、及び春化二年生植物中のＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２遺伝子の日内変動を示す。２４時間にわたって２時間毎にサンプリングした葉組織からの転写物を、定量的ＰＣＲにより定量した。ＳＤ条件（１０時間の明／１４時間の暗）、ＬＤ条件（１８時間の明／６時間の暗）、又はＳＤＬＤ条件（植物を、ＳＤ条件で１週間生長させた後、ＬＤ条件に移す）下で、３つの独立した実験を行った。検出されたアンプリコンのレベルは、内部較正物質遺伝子として使用したＢｖＩＣＤＨ１遺伝子に対応する増幅産物を参照して標準化した。データ点は、３つの生物学的複製の平均値を示す。 異なる光周期で生長させた一年生、二年生、及び春化二年生サトウダイコン植物の抽薹時間を示す。ＳＤ条件は、１０時間の明／１４時間の暗であった。ＬＤ条件は、１８時間の明／６時間の暗であった。抽薹時間は、６個の独立した植物からの葉の総数に基づいて測定した。 ７２時間にわたる一年生植物中のＢｖＦＴ１とＢｖＦＴ２の相対的発現を示す。最初の２４時間は、１０時間の明／１４時間の暗であり、次の４８時間では、照射周期を１８時間の明／６時間の暗に変更した。検出されたアンプリコンのレベルを、ＢｖＩＣＤＨ遺伝子に対応する増幅産物を参照して標準化した。データ点は、３つの生物学的複製の平均値を示す。 シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の開花時期に及ぼす、遺伝子ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の異所性発現の影響を示す。（Ａ）ＬＤ条件下で生長させた、３０日齢の野生型（Ｃｏｌ−０）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の、並びにＢｖＦＴ１、及びＢｖＦＴ２を発現するトランスジェニック・シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の表現型。（Ｂ）ＬＤ条件（１６時間の明／８時間の暗）下で生長させた、２０日齢のｆｔ−１０変異体、及びＢｖＦＴ２を発現するトランスジェニックｆｔ−１０変異体の表現型。 ＰＥＢＰタンパク質の外部ループをコードするエクソン４のセグメントＢへのＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２比活性のマッピングを示す。（Ａ）この試験で使用した異なるキメラの構造、及びシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の開花時期に及ぼすそれらの効果。ＢｖＦＴ１とＢｖＦＴ２のエクソン部分を、それぞれ黒と白の丸角の長方形で示す。ＢｖＦＴ１１１２（配列番号２９）は、エクソン１、２、及び３がＢｖＦＴ１由来であり、エクソン４がＢｖＦＴ２由来であるキメラを示す。ＢｖＦＴ２２２１（配列番号３０）は、エクソン１、２、及び３がＢｖＦＴ２由来であり、エクソン４がＢｖＦＴ１由来であるキメラを示す。ＢｖＦＴ１Ｅ４Ｂ２（配列番号３１）は、エクソン４のセグメントＢがＢｖＦＴ２由来である、ＢｖＦＴ１に基づくキメラを示す。ＢｖＦＴ２Ｅ４Ｂ１（配列番号３２）は、エクソン４のセグメントＢがＢｖＦＴ１由来である、ＢｖＦＴ２に基づくキメラを示す。（Ｂ）ＢｖＦＴ１、ＢｖＦＴ２、又はＢｖＦＴ１／ＢｖＦＴ２キメラを発現するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の開花時期。Ｔ１植物をＬＤ条件下で生長させた。葉の数を、少なくとも１５個の独立したＴ１植物の平均値±ＳＤとして示す。 ＰＭＩ選択マーカーと組合せて、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からの構成性ＵＢＱ３プロモーターの制御下でＢｖＦＴ２のＲＮＡｉ遺伝子カセットを有するバイナリーベクターｐＨｉＮＫ５２５（配列番号３３）のプラスミド地図を示す。 抽薹誘導条件（１８℃；１８時間の明／６時間の暗）下で生長させたＴ０一年生サトウダイコンの抽薹時間に及ぼす、ＢｖＦＴ２遺伝子の抑制の影響を示す。（Ａ）非トランスジェニック一年生系統、及びトランスジェニックＢｖＦＴ２ ｄｓＲＮＡｉ一年生植物の表現型。（Ｂ）非抽薹性の４００日齢のトランスジェニックＢｖＦＴ２ ｄｓＲＮＡｉ一年生植物の表現型。 抽薹誘導条件（１８℃；１８時間の明／６時間の暗）下で生長させたＴ１一年生サトウダイコンの抽薹時間に及ぼす、ＢｖＦＴ２遺伝子の抑制の影響を示す。左の３つの抽薹植物は非トランスジェニック（ＮＴ）植物であり、右の３つの非抽薹植物はＢｖＦＴ２ ｄｓＲＮＡｉ植物である（イベント２Ａ）。写真は実験の３６日目に撮った。 ｓｕｐｅｒＭＡＳプロモーターの制御下のＰＭＩ選択マーカー遺伝子と組合せたＢｖＦＴ１のＵｂｉ３：：ＢｖＦＴ１遺伝子カセットを有する、バイナリーベクターＵｂｉ３：：ＢｖＦＴ１（配列番号３４）のプラスミド地図を示す。 Ｕｂｉ３：：ＢｖＦＴ１遺伝子カセットを有するＰＭＩ陽性Ｔ０苗条中のＢｖＦＴ１の相対的発現を示す。検出されたアンプリコンのレベルは、ＢｖＩＣＤＨ遺伝子に対応する増幅産物を参照して標準化した。非トランスジェニック対照Ｔ０植物のデータ点は、３つの生物学的測定の平均値を示す。 ｐＯｐ６プロモーターの下流にＰＭＩ選択マーカー遺伝子を有し、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＵｂｉ３プロモーターの制御下のＬｈＧ４Ａｔｏの構成性発現のための遺伝子カセットと組合せた、バイナリーベクターｐＨｉＮＫ４９８（配列番号５３）のプラスミド地図を示す。 ｐＯｐ６プロモーター断片の下流のｐＨｉＮＫ５２５（実施例７参照）に存在する逆方向反復を有し、ＳｕｐｅｒＭＡＳプロモーターの制御下のＰＭＩ選択マーカー遺伝子と組合せた、バイナリーベクター（配列番号５４）のプラスミド地図を示す。 ｐＯｐ６プロモーター断片の下流でＢｖＦＴ１の完全長コード領域を有し、ＳｕｐｅｒＭＡＳプロモーターの制御下のＰＭＩ選択マーカー遺伝子と組合せた、バイナリーベクター（配列番号５５）のプラスミド地図を示す。
ある態様において、本発明は、配列番号５、６、８、又は９のいずれかに記載の核酸配列又はその相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）の群から選択される核酸配列と、少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列、好ましくは単離された核酸配列に関し、配列番号５、６、８、又は９のいずれかに記載の核酸配列又はその相補体から成る群から選択される核酸配列の少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む核酸配列に関し、或いは配列番号５、６、８、又は９のいずれかに記載の核酸配列又はその相補体の群から選択される核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列に関する。
好適な実施形態において、本発明の核酸配列は、配列番号５、６、８、又は９のいずれかに記載の核酸配列を含む。
別の態様において本発明はさらに、前記の本発明の核酸配列によりコードされる、ポリペプチド、好ましくは単離されたポリペプチドを、さらに提供する。好適な実施形態において本発明のポリペプチドは、配列番号７又は１０に記載のアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明のさらに別の態様において、調節エレメントの制御下、好ましくは植物中で機能する調節エレメントの制御下にある、前記の本発明の核酸配列を含むキメラ構築物が提供される。
ある好適な実施形態において、本発明のキメラ構築物は、選択工程において、形質転換植物物質と非形質転換植物物質との区別を可能にする選択マーカー遺伝子をさらに含む。
さらに好適な実施形態において、本発明のキメラ構築物は、サトウダイコン中の内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現のトランスジェニック下方制御又は抑制のために、又はサトウダイコン中の内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現のトランスジェニック上方制御のために、提供される。
ある態様において、本発明は、サトウダイコン中の内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現のトランスジェニック下方制御又は抑制のために提供されるキメラ構築物に関する。
この態様の好適な実施形態において、本発明のキメラ構築物は、これを用いて、ｄｓＲＮＡ、アンチセンス抑制、又はコサプレッションから選択される手段により、下方制御又は抑制が行われるキメラ構築物である。
さらに別の好適な実施形態において、本発明のキメラ構築物は、第１のＲＮＡ鎖及び第２のＲＮＡ鎖をコードし、転写されたときに第１のＲＮＡヌクレオチド配列及び第２のＲＮＡヌクレオチド配列を生成する異種ＤＮＡであって、ここで前記第１のＲＮＡ鎖は、サトウダイコン中の内因性ＢｖＦＴ２遺伝子のＲＮＡ鎖の少なくとも一部と十分に相補的であり、前記内因性ＢｖＦＴ２遺伝子により産生されるＲＮＡ鎖にハイブリダイズ若しくはアニーリングして、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現の下方制御若しくは抑制を引き起こし、かつ、前記第１のＲＮＡヌクレオチド配列及び前記第２のＲＮＡヌクレオチド配列は、２本鎖ＲＮＡを形成し、ここで、当該２本鎖ＲＮＡはサトウダイコン植物中における発現時に、前記内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現のＲＮＡ干渉に関与し、それにより内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現の下方制御若しくは抑制を引き起こす、前記異種ＤＮＡを含む。
さらなる実施形態において、上記した本発明のキメラ構築物は逆方向反復を含み、好ましくは構成的プロモーターに作動可能に連結された逆方向反復を含み、そしてそれは転写されたときに、前記第１及び第２のＲＮＡ鎖を含むサトウダイコン植物細胞中で２本鎖ＲＮＡ分子を形成し、ここで、前記２本鎖ＲＮＡ分子はＢｖＦＴ２サイレンシングを引き起こす。
さらなる好適な実施形態において、本発明のキメラ構築物は、配列番号８若しくは９に記載の本発明の核酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列か、又は配列番号８若しくは９に記載の本発明の核酸配列の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む核酸配列をコードする異種ＤＮＡを、或いは、配列番号８若しくは９に記載の本発明の核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする異種ＤＮＡを含む。
ある実施形態において本発明のキメラ構築物は、ヌクレオチド配列５’−ＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＣＡＡＴＧ−３’（配列番号４４）を有する順方向プライマーＨｉＮＫ６３８２、及びヌクレオチド配列５’−ＧＴＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＴＡＴＧ−３’（配列番号４５）を有する逆方向プライマーＨｉＮＫ６３８４を使用するＰＣＲ反応で、ＢｖＦＴ２遺伝子のエクソン４からなる０．２７ＫｂのｃＤＮＡ断片から得られる異種ＤＮＡを含む。
さらなる実施形態において本発明のキメラ構築物は、配列番号３３のヌクレオチド８７４７〜９０４６で示される異種ＤＮＡを含む。
さらに別の実施形態において、本発明のキメラ構築物に含まれる異種ＤＮＡは、プロモーターとターミネーターとの間に挿入され、ここで前記異種ＤＮＡは、
ａ）ＢｖＦＴ２遺伝子のエクソン４から得られる０．２７ＫｂのｃＤＮＡ断片を、ヌクレオチド配列５’−ＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＣＡＡＴＧ−３’（配列番号４４）を有する順方向プライマーＨｉＮＫ６３８２、及びヌクレオチド配列５’−ＧＴＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＴＡＴＧ−３’（配列番号４５）を有する逆方向プライマーＨｉＮＫ６３８４、並びに鋳型としてサトウダイコンｃＤＮＡを使用するＰＣＲ反応で増幅し、ここで、サトウダイコンｃＤＮＡは、プライマーとしてヌクレオチド配列５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴ１２ＶＮ−３’（配列番号３５）を有する３’ＲＡＣＥアダプター（ＡＤＡＰＴＥＲ）を使用する逆転写反応で、サトウダイコンの葉から抽出された総ＲＮＡから得られ；
ｂ）ヌクレオチド配列５’−ＣＡＴＡＧＣＡＧＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号４６）を有する順方向プライマーＨｉＮＫ６３８３、及びヌクレオチド配列５’−ＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＧＧＡＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡ−３’（配列番号４０）を有する逆方向プライマーＨｉＮＫ５２９、並びに鋳型としてジャガイモＳｔ−ＬＳ１イントロンを含有するジャガイモＤＮＡを使用して、ＳＴ−ＬＳ１イントロン、及び隣接するスプライシング部位を含む０．１９Ｋｂの断片を増幅し；
ｃ）プライマーＨｉＮＨ６３８２及びＨｉＮＫ５２９を使用し、並びに鋳型として工程ａ）とｂ）で得られる増幅生成物の両方の混合物を使用する２回目のＰＣＲにより、両方の増幅生成物を互いに融合させて、長さ０．４７Ｋｂの融合生成物を得；
ｄ）ヌクレオチド配列５’−ＴＡＡＡＴＣＣＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＴＡＴＧ−３’（配列番号４７）を有する順方向プライマーＨｉＮＫ６３８５、及びヌクレオチド配列５’−ＣＴＡＴＴＴＧＴＣＧＡＣＧＣＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＣ−３’（配列番号４８）を有する逆方向プライマーＨｉＮＫ６３８６、並びに鋳型として上記サブセクションａ）で得られるサトウダイコンｃＤＮＡを使用して、０．２７ＫｂのＢｖＦＴ２断片の２回目の増幅を行い；
ｅ）ＳａｃＩＩ制限部位で両方の断片を融合させて、ジャガイモＳＴ−ＬＳ１遺伝子からイントロンにより分離されたＢｖＦＴ２配列の逆方向反復を作成する、
ことにより得られる。
この態様のさらなる実施形態において、本発明のキメラ構築物は、配列番号３３２に記載のヌクレオチド配列で示される配列を含む。
さらなる態様において本発明は、サトウダイコン中の内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現のトランスジェニック上方制御のために提供されるキメラ構築物に関する。
この態様のある実施形態において、本発明のキメラ構築物は、ＢｖＦＴ１遺伝子又はその一部をコードするヌクレオチド配列を含む、内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現のトランスジェニック上方制御のためのキメラ構築物であり、ここで、ＢｖＦＴ１遺伝子又はその一部をコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号５若しくは６に記載の本発明の核酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するか、又はこれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、ここで、ＢｖＦＴ１遺伝子又はその一部をコードする前記ヌクレオチド配列は、植物中での発現時に、内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現の上方制御が起こるように、制御配列に作動可能に連結される。
さらに好適な実施形態において、本発明のキメラ構築物に含まれるＢｖＦＴ１遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６に記載のヌクレオチド配列を有する。
別の好適な実施形態において、上記の本発明のキメラ構築物は、配列番号３４のヌクレオチド２０７６〜２６１５で示されるヌクレオチド配列を含む。
さらに別の好適な実施形態において、上記の本発明のキメラ構築物は、配列番号３４で示されるヌクレオチド配列を含む。
さらに好適な実施形態において、本発明のキメラ構築物に含まれる異種ＤＮＡは、構成的プロモーター、好ましくはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＵｂｉ３プロモーターに作動可能に連結される。
本発明のさらなる態様は、上記した本発明のキメラ構築物を含む、植物形質転換ベクター及び／又は植物発現ベクターに関する。
この態様のある好適な実施形態において、本発明の植物形質転換ベクターは、上記した本発明のキメラ構築物を含むＲＮＡｉ発現ベクター、及び／又は本発明のキメラ構築物を含む植物発現ベクターである。
別の好適な実施形態において本発明のＲＮＡｉ発現ベクターは、配列番号３３に記載のヌクレオチド配列を有するキメラ構築物を含む。
さらに別の好適な実施形態において、本発明の発現ベクターは、配列番号３４に記載のヌクレオチド配列を有するキメラ構築物を含む。
本発明のさらに別の態様において、内因性ＢｖＦＴ１遺伝子及び／又はＢｖＦＴ２遺伝子の発現が調節されているトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子が提供され、ここで、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現は、前記トランスジェニック・サトウダイコン植物中で下方制御若しくは抑制され、及び／又は内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現は、前記トランスジェニック・サトウダイコン植物中で上方制御される。
この態様のある好適な実施形態は、ｄｓＲＮＡ、アンチセンス抑制、又はコサプレッションから成る群から選択される方法により、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現が下方制御若しくは抑制されるトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子を提供する。
さらなる実施形態において、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子は、本発明のキメラ構築物又は本発明の核酸配列を含み、ここで、ｄｓＲＮＡを発現する前記トランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子は、抽薹耐性であり、遅延抽薹の表現型、好ましくは非抽薹表現型を示す。
別の好適な実施形態において、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子は、本発明のキメラ構築物又は本発明の核酸配列を含み、ここで、前記トランスジェニック・サトウダイコン植物中で内因性ＢｖＦＴ１は過剰発現されており、並びに前記植物は遅延抽薹の表現型、好ましくは非抽薹表現型を示す。
別の好適な実施形態において、トランスジェニック・サトウダイコン植物は、本発明のかつ上記した細胞、組織、又は種子から産生される。
別の好適な実施形態は、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物の根又は後代に関する。
本発明の別の態様は、抽薹耐性の表現型を有するサトウダイコン植物がそこから生長するハイブリッド種子を生産する方法であって、以下の工程：
ａ．抽薹耐性の表現型を有するサトウダイコン系統、特に第１の親系統として上記した本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物を提供し、
ｂ．工程ａ）のサトウダイコン系統とは異なる遺伝子型を有するサトウダイコン系統を第２の親系統として提供し、
ここで、工程ａ）又は工程ｂ）の親系統の１つは雄性不稔ｃｍｓ系統であり、他の親系統は雄性稔性であり、並びに、
ｃ．雄性稔性親系統の植物を雄性不稔親系統の花に受粉させ、種子を生長させ、ハイブリッド種子を採取し；
ここで、採取されたハイブリッド種子は、遅延抽薹の表現型、好ましくは非抽薹表現型を有するサトウダイコン・ハイブリッド植物の種子であること
を含む、前記方法に関する。
この態様のある実施形態は、雄性不稔ＣＭＳサトウダイコン親系統が、上記した本発明のキメラ構築物を含む同系繁殖系サトウダイコン系統である、本発明のサトウダイコン・ハイブリッド種子を生産する方法である。
さらにある好適な実施形態は、遅延抽薹の表現型、好ましくは非抽薹表現型を有するサトウダイコン植物のハイブリッド種子に関する。
別の好適な実施形態において、本発明のハイブリッド種子は、上記の本発明のサトウダイコン・ハイブリッド種子を生産する方法により産生される。
さらに別の好適な実施形態において、遅延抽薹の表現型、好ましくは非抽薹表現型抽薹耐性を有するハイブリッド・サトウダイコン植物は、上記の本発明のハイブリッド種子を生長させることにより産生される。
本発明の別の態様は、種子、胚、小胞子、葯、接合子、プロトプラスト、細胞、卵子、胚珠、花粉、主根、子葉、抽出物、又は生物学的試料から成る群から選択される植物の部分に関し、ここで前記植物の部分は、上記した本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子から、あるいは上記した本発明のハイブリッド種子から、あるいは上記した本発明のハイブリッド・サトウダイコン植物から得られる。
さらに別の態様において本発明は、サトウダイコン植物細胞の形質転換のための、上記した本発明の核酸配列若しくはキメラ構築物、又はその断片の使用に関する。
ある実施形態において、上記した本発明の核酸配列若しくはキメラ構築物、又はベクターの使用を含む、サトウダイコン植物細胞を形質転換する方法が提供される。
本発明の別の実施形態は、糖生産法、好気性発酵法、及び嫌気性発酵法を含む群から選択される方法、特に糖生産法における、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物、本発明のハイブリッド・サトウダイコン植物、又は本発明の植物の部分の使用に関する。
好適な実施形態において、上記した本発明のサトウダイコン植物、又はその細胞若しくは組織が加工されて糖が生産される、糖の生産法が提供される。
本発明のさらなる態様は、本発明のサトウダイコン植物、又はその細胞若しくは組織から生産された糖に関する。
配列
配列番号１は、縮重プライマーＨｉＮＫ５８１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２は、縮重プライマーＨｉＮＫ８６０のヌクレオチド配列を示す。
配列番号３は、実施例１に記載の縮重プライマーを使用してＰＣＲ反応から得られる、サトウダイコンＦＴ１遺伝子の断片（ＢｖＦＴ１断片と呼ぶ）である。
配列番号４は、実施例１に記載の縮重プライマーを使用してＰＣＲ反応から得られる、サトウダイコンＦＴ２遺伝子の断片（ＢｖＦＴ２断片と呼ぶ）である。
配列番号５は、ＢＡＣ ＳＢＡ０６６−Ｇ０４の配列決定から得られる、サトウダイコンＦＴ１遺伝子のゲノム配列である。
配列番号６は、配列番号５に記載のサトウダイコンＦＴ１遺伝子の対応するコード配列である。
配列番号７は、配列番号６に記載のサトウダイコンＦＴ１のコード配列によりコードされるタンパク質のタンパク質配列である。
配列番号８は、ＢＡＣ ＳＢＡ０７７−Ｎ０２の配列決定から得られる、サトウダイコンＦＴ２遺伝子のゲノム配列である。
配列番号９は、配列番号８に記載のサトウダイコンＦＴ２遺伝子の対応するコード配列である。
配列番号１０は、配列番号９に記載のサトウダイコンＦＴ２のコード配列によりコードされるタンパク質のタンパク質配列である。
配列番号１１は、ＢｖＦＴ１のための順方向プライマーＳＥＬＡ３７７０のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１２は、ＢｖＦＴ１のための逆方向プライマーＳＥＬＡ３７７１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１３は、ＢｖＦＴ２のための順方向プライマーＳＥＬＡ３７７６のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１４は、ＢｖＦＴ２のための逆方向プライマーＳＥＬＡ３７７７のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１５は、ＦＴ１（Ｔ１）のための順方向プライマーＳＥＬＡ４２５９のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１６は、ＦＴ１（Ｔ１）のための逆方向プライマーＳＥＬＡ４２６０のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１７は、ＦＴ１（Ｔ１）のための、ＳＥＬＡ４２６１プローブ＃１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１８は、ＦＴ１（Ｔ１）のための、ＳＥＬＡ４２６２プローブ＃２のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１９は、ＦＴ２（Ｔ１）のための順方向プライマーＳＥＬＡ４２６３のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２０は、ＦＴ２（Ｔ１）のための逆方向プライマーＳＥＬＡ４２６４のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２１は、ＦＴ２（Ｔ１）のためのＳＥＬＡ４２６５プローブ＃１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２２は、ＦＴ２（Ｔ１）のためのＳＥＬＡ４２６６プローブ＃２のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２３は、ＢｖＦＴ１のための順方向プライマーＳＥＬＡ３７３０のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２４は、ＢｖＦＴ１のための逆方向プライマーＳＥＬＡ３７３１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２５は、ＢｖＦＴ２のための順方向プライマーＳＥＬＡ３７３２のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２６は、ＢｖＦＴ２のための逆方向プライマーＳＥＬＡ３７３３のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２７は、ベータイソクエン酸脱水素酵素遺伝子ＢｖＩＣＤＨ１の順方向プライマーＳＥＬＡ３７２４のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２８は、ベータイソクエン酸脱水素酵素遺伝子ＢｖＩＣＤＨ１の逆方向プライマーＳＥＬＡ３７２５のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２９は、ＢｖＦＴ１１１２と呼ぶ遺伝子キメラの配列を示す。
配列番号３０は、ＢｖＦＴ２２２１と呼ぶ遺伝子キメラの配列を示す。
配列番号３１は、ＢｖＦＴ１Ｅ４Ｂ２と呼ぶ遺伝子キメラの配列を示す。
配列番号３２は、ＢｖＦＴ２Ｅ４Ｂ１と呼ぶ遺伝子キメラの配列を示す。
配列番号３３は、ＢｖＦＴ２遺伝子のエクソン４の逆方向反復を含む発現カセットを含む、バイナリーベクターｐＨｉＮＫ５２５のヌクレオチド配列を示す。
配列番号３４は、構成的プロモーターの制御下のＢｖＦＴ１のコード配列を含む発現カセットを有するバイナリーベクター１７６０２（Ｕｂｉ３：：ＢｖＦＴ１）のヌクレオチド配列を示す。
配列番号３５は、逆転写酵素反応で使用される３’ＲＡＣＥアダプターのヌクレオチド配列を示す。
配列番号３６は、３’ＲＡＣＥ外部プライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号３７は、３’ＲＡＣＥ内部プライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号３８は、ＢｖＦＴ１の順方向プライマーＨｉＮＫ６３７１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号３９は、ＢｖＦＴ１の逆方向プライマーＨｉＮＫ６３７２のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４０は、プライマーＨｉＮＫ５２９のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４１は、ＢｖＦＴ１のプライマーＨｉＮＫ６３７３のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４２は、ＢｖＦＴ１のためのプライマーＨｉＮＫ６３７４のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４３は、ＢｖＦＴ１のためのプライマーＨｉＮＫ６３７５のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４４は、ＢｖＦＴ２のためのプライマーＨｉＮＫ６３８２のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４５は、ＢｖＦＴ２のためのプライマーＨｉＮＫ６３８４のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４６は、ＢｖＦＴ２のためのプライマーＨｉＮＫ６３８３のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４７は、ＢｖＦＴ２のためのプライマーＨｉＮＫ６３８５のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４８は、ＢｖＦＴ２のためのプライマーＨｉＮＫ６３８６のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４９は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＦＴ遺伝子のエクソン１に位置するアミノ酸モチーフ「ＫＰＲＶＥＩＧＧ」（アミノ酸残基５１〜５８）のアミノ酸配列を示す。
配列番号５０は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＦＴ遺伝子のイントロン２のスプライシング部位のすぐ下流のエクソン３のアミノ酸モチーフ「ＬＶＴＤＩＰＡＴＴ」（アミノ酸残基８９〜９８）のアミノ酸配列を示す。
配列番号５１は、ＰＭＩのためのプライマーＳＥＬＡ２６７のヌクレオチド配列を示す。
配列番号５２は、ＰＭＩののためのプライマーＳＥＬＡ２６８のヌクレオチド配列を示す。
配列番号５３は、ｐＯｐ６プロモーターの下流にＰＭＩ選択マーカー遺伝子を含む発現カセットを有し、シロイヌナズナ（Arabidopsis）からのＵｂｉ３プロモーターの制御下のＬｈＧ４Ａｔｏの構成性発現のための遺伝子カセットと組み合わされた、バイナリーベクターｐＨｉＮＫ４９８のヌクレオチド配列を示す。
配列番号５４は、ｐＯｐ６プロモーター断片の下流でｐＨｉＮＫ５２５（実施例７参照）に存在する逆方向反復を含む発現カセットを有し、ＳｕｐｅｒＭＡＳプロモーターの制御下のＰＭＩ選択マーカー遺伝子と組み合わされた、バイナリーベクターのヌクレオチド配列を示す。
配列番号５５は、ｐＯｐ６プロモーター断片の下流にＢｖＦＴ１の完全長コード領域を含む発現カセットを有し、ＳｕｐｅｒＭＡＳプロモーターの制御下のＰＭＩ選択マーカー遺伝子と組み合わされた、バイナリーベクターのヌクレオチド配列を示す。
定義
本出願の範囲内で使用される技術用語や表現は一般に、後述で特に明記しない場合は、植物の育種及び栽培の関連分野で一般的に適用される意味が与えられる。
本明細書及び特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は特に明記しない場合は複数形を含む。したがって、例えば「ある植物（ａ ｐｌａｎｔ）」への言及は１つ又はそれ以上の植物を含み、「ある細胞（ａ ｃｅｌｌ）」は、細胞、組織などの混合物を含む。
「サトウダイコン（Ｓｕｇａｒ ｂｅｅｔ）」は、ベータ（Ｂｅｔａ）属内のすべての種と亜種、及びベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）のすべての種類の栽培ビート（ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｂｅｅｔ）を意味する。栽培ビートは４群に分けられる：フダンソウ、レッドビート、飼料ビート、及びサトウダイコン。「サトウダイコン」は、糖の生産以外の目的で栽培されるもの、例えばエタノール、プラスチック、又は他の工業製品の生産のために栽培されるものを含むすべての栽培ビートも意味する。特に「サトウダイコン」は、飼料ビート及びサトウダイコンを意味するが、特にサトウダイコンを意味する。この用語はまた、熱帯又は亜熱帯地域での栽培に適合されたサトウダイコン植物を含む。
「一年生サトウダイコン」は、１年で発芽し、開花し、そして死滅するサトウダイコンを意味する。「二年生サトウダイコン」は、その生物学的生活環を完了するのに２年かかるサトウダイコン植物を意味する。
「抽薹」は、栄養ロゼット期から花又は生殖増殖期への移行を意味する。
本発明の関連において「抽薹耐性の改変」は、遺伝子工学による、サトウダイコンのベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）のＦＴ遺伝子の発現の調節を意味する。かかる改変サトウダイコン植物は、春化に応答して抽薹反応が遅れているか又は完全に抑制されている抽薹耐性の表現型を示す。植物の抽薹が無いと花が生長しないように、抽薹耐性であるサトウダイコン植物はまた非開花性（開花耐性）である。
本明細書において、「抽薹反応の遅延」又は「抽薹の遅延」は、春化に応答するサトウダイコン植物の自然の抽薹反応の調節として理解すべきである。遅延抽薹のあるサトウダイコン植物（すなわち抽薹耐性である植物）では、抽薹の最初の肉眼で見える工程である茎の伸長が、通常の植物より遅く開始する。抽薹反応は、数日間のみ（すなわち、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日間）、数週間まで（すなわち、２、３、４、５、６、７、又は８週間）、又は数ヶ月間まで（すなわち、１、２、３、４、５、又は６ヶ月間）遅れる。抽薹の遅延はまた、抽薹応答の完全な抑制を引き起こし、かかる植物は春化後に抽薹せず、そして栄養生長が続く非抽薹表現型を示す。
「春化」は、植物をある期間低温に曝露することにより、幾つかの植物における開花誘導が促進される過程を意味する。
本明細書において「表現型形質」という用語は、そのゲノムと環境との相互作用により生じる個体の外観、又は他の検出可能な特性を意味する。
「表現型」は、本明細書の範囲内で、遺伝的に制御された形質の区別可能な１又は２以上の特徴を意味する。
「コード配列」は、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡへと転写される核酸配列である。好ましくは、ＲＮＡはその後、生物中で翻訳されてタンパク質を産生する。そえは、「中断されないコード配列」、すなわちｃＤＮＡのようなイントロンの無い配列を構成し得、又はそれは、適切なスプライス・ジャンクションにより結合された１又は２以上のイントロンを含み得る。「イントロン」は、ＲＮＡの配列であり、一次転写物中に含有されるが、細胞内でＲＮＡの切断と再結合により除去されて、成熟ｍＲＮＡを生成し、これがタンパク質に翻訳され得る。
「遺伝子」は、ゲノム内に位置する明確な領域であり、これは前記のコード核酸配列以外に、コード部分の発現（すなわち、転写及び翻訳）の制御に寄与する他の、主に制御性の、核酸配列を含む。遺伝子はまた、他の５’及び３’非翻訳配列、並びに停止配列を含む。存在し得るさらなる要素は、例えばイントロンである。
用語「目的の遺伝子」は、植物に移したときに、植物に所望の特徴又は表現型（例えば、抗生物質耐性、ウイルス耐性、昆虫耐性、疾患耐性、又は他の害虫に対する耐性、除草剤耐性、改善された栄養価、工業的工程における改良された性能、又は変更された生殖性）を付与する任意の遺伝子を意味する。
本明細書において「遺伝子型」は、後代のサトウダイコン植物でその必ずしもすべてが発現されることは無い親サトウダイコン植物から遺伝した遺伝物質である。遺伝子型は、植物のゲノムへ形質転換された異種遺伝物質、並びに挿入された配列に隣接する遺伝物質を意味する。
用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを意味する。用語「核酸」は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡポリマー中に組み込まれ得る、合成、非天然、若しくは改変ヌクレオチド塩基を場合により含有し、糖、リン酸、及び、プリン若しくはピリミジンのいずれかである塩基を含有する、２以上の単量体（ヌクレオチド）から構成される、１本鎖若しくは２本鎖であり得る、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、及びそのポリマーを意味する。特に限定しない場合この用語は、標準の核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される、天然のヌクレオチドの既知の類縁体を含有する核酸を含む。特に明記しない場合は、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換体）及び相補配列を暗示的に包含し、ならびに明示的に記載された配列も包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ又はそれ以上の選択された（又はすべての）コドンの３番目の位置を、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換した配列を作成することにより行われる（ＢＡＴＺ−ＥＲ ｅｔ ａｌ．，１９９１；ＯＨＴＳＵＫＡ ｅｔ ａｌ．，１９８５；ＲＯＳＳＯＬＩＮＩ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。
「核酸断片」は、ある核酸分子の一部である。高等植物では、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が遺伝物質であり、リボ核酸（ＲＮＡ）は、ＤＮＡ内に含有された情報のタンパク質への移動に関与する。用語「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」は、１本鎖若しくは２本鎖であり、ＤＮＡ若しくはＲＮＡポリマー中に取り込むことができる合成、非天然、若しくは改変ヌクレオチド塩基を場合により含む、ＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを意味する。用語「核酸」又は「核酸配列」はまた、遺伝子、遺伝子にコードされるｃＤＮＡ、ＤＮＡ、及びＲＮＡと同義に使用され得る。
用語「単離された」は、本発明の核酸分子に関連して使用される時、各起源生物内の染色体性核酸配列内で同定され、及びそこから単離／分離された核酸配列を意味する。単離された核酸は、たとえ天然に存在するものと同じものを持っていても、天然に存在するものとは異なる。これに対して単離されていない核酸は、ＤＮＡやＲＮＡのような核酸であり、天然に存在する状態で見つかる。例えばあるＤＮＡ配列（例えば遺伝子）は、隣接遺伝子の近傍で宿主細胞染色体上に存在する。単離された核酸配列は、１本鎖又は２本鎖形態で存在し得る。あるいはこれは、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含有し得る（すなわち、核酸配列は２本鎖であり得る）。好適な実施形態において、本発明の核酸分子は、単離されると理解される。
用語「異種」は、遺伝子又は核酸に関して使用される時、自然の環境において存在しない（すなわち、ヒトの手により変更された）因子をコードする遺伝子を意味する。例えば異種遺伝子は、別の種から導入されたある種の遺伝子を含んでよい。異種遺伝子はまた、何らかの方法（例えば、変異、複数のコピーへの添加、非天然のプロモーター若しくはエンハンサー配列への連結）で変更されている、ある生物に固有の遺伝子を含み得る。異種遺伝子はさらに、ｃＤＮＡ形態の植物遺伝子を含む植物遺伝子配列を含み；当該ｃＤＮＡ配列は、センス方向（ｍＲＮＡを産生する）、又はアンチセンス方向（ｍＲＮＡ転写物に相補的なアンチセンスＲＮＡ転写物を産生する）で発現される。本発明のある態様において、異種遺伝子配列が通常、異種遺伝子にコードされるタンパク質の遺伝子と、若しくは染色体内の植物遺伝子配列と、天然では結合していないプロモーターのような、又は天然では見られない染色体の一部（例えば、通常は遺伝子が発現されない遺伝子座で発現される遺伝子）と結合しているプロモーターのような、調節エレメントを含むヌクレオチド配列に結合しているという点で、異種遺伝子は内因性植物遺伝子とは区別される。さらに「異種」ヌクレオチド配列は、それが導入される宿主細胞に天然では結合していないヌクレオチド配列であり、天然に存在する核酸配列の天然に存在しない複数のコピーを含む。
「同種」ヌクレオチド配列は、それが導入される宿主細胞において天然で付随するヌクレオチド配列である。
本明細書において用語「キメラ構築物」は、単一の核酸分子中に組み立てられた、起源の異なる２個又はそれ以上の核酸配列の構築物を意味する。キメラ構築物という用語は、（１）一緒に天然に存在することは無い、制御配列及びコード配列を含むＤＮＡ配列（すなわち、少なくとも１つのヌクレオチド配列が、少なくとも１つの他のヌクレオチド配列について異種である）、又は（２）天然には結合していないタンパク質部分をコードする配列、又は（３）天然には結合していないプロモーター部分を含有する、任意の構築物を意味する。さらにキメラ構築物は、異なる起源から得られる制御配列及びコード配列を含み得、又は同じ起源由来だが、天然に存在するものとは異なる方法で構成配置されている、制御配列とコード配列を含み得る。本発明の好適な態様においてキメラ構築物は、調節エレメントの制御下、特に植物中で機能する調節エレメントの制御下にある本発明の核酸配列を含む発現カセットを含む。
本明細書において使用される「発現カセット」は、停止シグナルに作動可能に連結された、目的の１又は２以上のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、適切な宿主細胞中において、１又は２以上の特定のヌクレオチド配列の発現を指令することができる核酸分子を意味する。それはまた、１又は２以上のヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列を含む。発現カセットはまた、目的のヌクレオチド配列の直接発現に必要ではないが、発現ベクターからのカセットの除去のための便利な制限部位のために存在する配列を含み得る。１又は２以上の目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラでもよく、これは、その成分の少なくとも１つが他の成分の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットはまた、天然に存在するが異種発現のために有用な組換え型で得られているものも含んでよい。しかし典型的には、発現カセットは宿主に対して異種であり、すなわち発現カセットの特定の核酸配列は宿主細胞中に天然には存在せず、当該分野で公知の形質転換工程により、宿主細胞中又は宿主細胞の祖先中に導入されていなければならない。発現カセット中の１又は２以上のヌクレオチド配列の発現は一般に、プロモーターの制御下にある。植物のような多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織、若しくは器官、又は生長段階に特異的である。発現カセット又はその断片はまた、植物中に形質転換されると「挿入された配列」、又は「挿入配列」と呼ばれる。
用語「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」は、本明細書において同義で使用される。
用語「プロモーター」は、コード配列の上流（５’）に通常存在し、ＲＮＡポリメラーゼ及び適切な転写のために必要な他の因子を認識することにより、コード配列の発現を制御する、ヌクレオチド配列を意味する。
「構成的プロモーター」は、植物のすべて又はほとんどすべての生長段階に、植物組織のすべて又はほとんどすべてでそれが制御する読みとり枠（ＯＲＦ）を発現（「構成性発現」とも呼ばれる）することができるプロモーターを意味する。各転写活性化要素は絶対的な組織特異性を示さないが、転写活性が最も高い植物の一部で達成されるレベルの≧１％のレベルで、ほとんどの植物の部分における転写活性化を仲介する。
「制御されたプロモーター」は、構成性ではなく一時的に及び／又は空間的に制御された方法で、遺伝子発現を指令するプロモーターを意味し、そして組織特異的で誘導性のプロモーターを含む。それは、天然及び合成の配列、ならびに合成及び天然の配列の組合せであり得る配列を含む。異なる組織若しくは細胞タイプで、又は異なる生長段階において、又は異なる環境条件に応答して、異なるプロモーターが遺伝子発現を指令し得る。
「組織特異的プロモーター」は、すべての植物細胞中で発現されるのではなく、１つ又はそれ以上のタイプの細胞で、特異的器官（例えば葉又は種子）、特異的組織（例えば胚又は子葉）、又は特定の細胞種（例えば葉柔組織又は種子貯蔵細胞）中でのみ発現されるプロモーターを意味する。これらはまた、例えば早期若しくは後期胚形成期に、生長する種子又は果実の熟成中に、完全に分化した葉で、又は老化期の開始時に、一時的に制御されるプロモーターを含む。
「誘導性プロモーター」は、１つ又はそれ以上の細胞種で、外部刺激（例えば、化学物質、光、ホルモン、ストレス、又は病原体による刺激）によりスイッチが入る制御されたプロモーターを意味する。
「作動可能に連結される」は、１つの核酸配列が他の核酸配列の機能に影響を与えるような、単一の核酸断片上の核酸配列の結合を意味する。例えばプロモーターは、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現に影響を与えることができる（すなわち、コード配列又は機能性ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）時、コード配列又は機能性ＲＮＡに作動可能に連結される。センス又はアンチセンス方向のコード配列は、制御配列に作動可能に連結され得る。
本明細書において使用される「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションにより相補的標的ＤＮＡ鎖にアニーリングして、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間でハイブリッドを形成し、その後ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ）により標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長され得る、単離された核酸である。プライマー対又はセットは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は他の従来の核酸増幅法により、核酸分子の増幅のために使用することができる。
「ＰＣＲ」又は「ポリメラーゼ連鎖反応」は本発明の範囲内で、ＤＮＡの比較的多量の特異的領域を産生し、それにより当該領域に基づく種々の分析を可能にする方法を意味する。
「ＰＣＲプライマー」又は「プライマー」は、本発明の範囲内において、ＤＮＡの特定の領域のＰＣＲ増幅で使用される単離された１本鎖ＤＮＡの短い断片を意味する。それらは、核酸ハイブリダイゼーションにより相補的標的ＤＮＡ鎖とアニーリングして、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間でハイブリッドを形成し、その後ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼにより標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される。プライマー対又はセットは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は他の従来の核酸増幅法により、核酸分子の増幅のために使用することができる。プライマーは一般に、１０〜１５個又はそれ以上のヌクレオチド長である。プライマーはまた、少なくとも２０個、若しくはそれ以上のヌクレオチド長、又は少なくとも２５個、若しくはそれ以上のヌクレオチド長、又は少なくとも３０個、若しくはそれ以上のヌクレオチド長でもよい。かかるプライマーは、高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズする。本発明のプライマーは、標的配列と完全な配列相補性を有する。本発明のプライマーの長さは、本明細書に記載の任意の数値である。すなわち、１０〜１５個若しくはそれ以上のヌクレオチド長のプライマーは、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のヌクレオチド長を有するプライマーを包含し、「少なくとも２０個のヌクレオチド」という表現はさらに、１６、１７、１８、１９、又は２０個のヌクレオチド長を有するプライマーを含む。同じことが、「少なくとも２５個又はそれ以上のヌクレオチド」及び「少なくとも３０個又はそれ以上のヌクレオチド長」という表現に当てはまる。
本明細書において使用される用語「増幅された」は、核酸分子の複数のコピーの構築、又は少なくとも１つの核酸分子を鋳型として使用する、当該核酸分子に相補的な複数のコピーの構築を意味する。増幅システムには、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システム、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）システム、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ，Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）、Ｑ−ベータレプリカーゼシステム、転写ベースの増幅システム（ＴＡＳ）、及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）がある。例えば、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＰＥＲＳＩＮＧ ｅｔ ａｌ．Ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９３）を参照。増幅産物はアンプリコンと呼ばれる。
「プローブ」は、従来の検出可能な標識物又はレポーター分子（例えば、放射活性同位体、リガンド、化学発光物質、蛍光標識物、又は酵素）を結合した単離された核酸である。このようなプローブは、標的核酸鎖に相補的である。本発明のプローブは、デオキシリボ核酸又はリボ核酸だけでなく、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するポリアミド及び他のプローブ物質を含み、標的ＤＮＡ配列の存在を検出するのに使用することができる。
プライマー及びプローブは一般に、１０〜１５個、又はそれ以上のヌクレオチド長である。プライマー及びプローブはまた、少なくとも２０個若しくはそれ以上のヌクレオチド長、又は少なくとも２５個若しくはそれ以上のヌクレオチド長、又は少なくとも３０個若しくはそれ以上のヌクレオチド長でもよい。かかるプライマー及びプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズする。本発明のプライマー及びプローブは、標的配列と完全な配列相補性を有するが、標的配列とは異なり、標的配列にハイブリダイズする能力を保持するプローブは、従来法により設計され得る。本発明のプライマー及びプローブの長さは、本明細書に記載の任意の数値である。したがって一般的に、１０〜１５個、若しくはそれ以上のヌクレオチド長のプライマー及びプローブは、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のヌクレオチド長を有するプライマー及びプローブを包含し、「少なくとも２０個のヌクレオチド長」という表現はさらに、１６、１７、１８、１９、又は２０個のヌクレオチド長を有するプライマー、及びプローブを含む。同じことが、「少なくとも２５個又はそれ以上のヌクレオチド長」及び「少なくとも３０個又はそれ以上のヌクレオチド長」という表現に当てはまる。
２つの核酸又はタンパク質配列において実質的に同一又は相同的とは、最大に一致するように比較し整列した時、後述の配列比較アルゴリズム又は視覚的検査を使用して測定すると、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％のヌクレオチド又はアミノ酸残基同一性を有する、２個又はそれ以上の配列を意味する。特に少なくとも約５０残基の長さの領域にわたって、さらに詳しくは少なくとも約１００残基の領域にわたって、実質的な同一性が存在し、特に当該配列は少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である。具体的な実施形態において配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。さらに実質的に同一な核酸又はタンパク質配列は、実質的に同一の機能を果たす。
配列比較について典型的には１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する時は、試験配列と参照配列はコンピューターに入力され、必要であればサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。配列アルゴリズムプログラムはその後、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する、１又は２以上の試験配列の配列同一性パーセントが計算される。
比較のための最適な配列整列は、例えばＳＭＩＴＨ＆ＷＡＴＥＲＭＡＮ（１９８１）のローカル相同性アルゴリズムにより、ＮＥＥＤＬＥＭＡＮ＆ＷＵＮＳＣＨ（１９７０）の相同性整列アルゴリズムにより、ＰＥＡＲＳＯＮ＆ＬＩＰＭＡＮ（１９８８）の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、又は視覚的検査（総説は、ＡＵＳＵＢＥＬ ｅｔ ａｌ．，後述）により実施することができる。配列同一性パーセントと配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの１つの例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）に記載されている。
２つの核酸配列が実質的に同一であることを示すもう１つの指標は、２つの分子がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることである。
核酸ハイブリダイゼーション（例えばサザンハイブリダイゼーション及びノーザンハイブリダイゼーション）実験において「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存的であり、異なる環境パラメータ条件下では異なる。高温では、より長い配列が特異的にハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、ＴＩＪＳＳＮ（１９９３）に記載されている。本発明において用語「ハイブリダイズする」は通常のハイブリダイゼーション条件、好ましくは、溶液及び／又はハイブリダイゼーション温度が３５℃〜７０℃、好ましくは６５℃である時、５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、１×デンハルト溶液が使用されるハイブリダイゼーション条件を意味する。ハイブリダイゼーション後、洗浄は、２×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、及びその後０．２×ＳＳＣで、３５℃〜７５℃、特に４５℃〜６５℃の温度で、しかし特に５９℃の温度で行われる（ＳＳＰＥ、ＳＳＣ、及びハイブリダイゼーション条件の定義については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．を参照）。例えば上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．中に記載されている高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件が特に好ましい。特に好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば、ハイブリダイゼーションと洗浄が上記のように６５℃で行われる場合に存在する。例えば、ハイブリダイゼーションと洗浄が４５℃で行われる非ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は好ましく無く、３５℃はさらに好ましくない。
２つの核酸又はタンパク質が実質的に同一であることのさらなる指標は、最初の核酸にコードされるタンパク質が、第２の核酸にコードされるタンパク質と免疫学的に交差反応するか又は特異的に結合することである。例えば、２つのタンパク質が保存的置換でのみ異なる場合、タンパク質は第２のタンパク質と実質的に同一である。
「形質転換」は、異種核酸を宿主細胞又は生物に導入する工程である。特に「形質転換」は、目的の生物のゲノムへのＤＮＡ分子の安定な組み込みを意味する。
「形質転換した／トランスジェニック／組換え」は、異種核酸分子が導入された宿主生物、例えば細菌又は植物を意味する。核酸分子は宿主のゲノム中に安定に組み込まれるか、又は核酸分子は染色体外分子として存在することもできる。かかる染色体外分子は自己複製性であり得る。形質転換された細胞、組織、又は植物は、形質転換工程の最終生成物のみでなく、そのトランスジェニック後代も包含することを理解されたい。「非形質転換」、「非トランスジェニック」、又は「非組換え」宿主は、異種核酸分子を含まない野生型生物、例えば細菌又は植物を意味する。
トランスジェニック「イベント」という用語は、異種ＤＮＡ、例えば目的の遺伝子を含む発現カセットを用いる単一の植物細胞の形質転換及び再生により産生される組換え植物を意味する。用語「イベント」は、異種ＤＮＡを含む元々の形質転換体及び／又は形質転換体の後代を意味する。用語「イベント」はまた、形質転換体と別のサトウダイコン系統との性的異種交配により産生される後代を意味する。反復親への反復戻し交配の後でも、形質転換した親からの挿入ＤＮＡ及び隣接するＤＮＡは、同じ染色体位置における交配種の後代中に存在する。植物組織の形質転換は通常、複数のイベントを産生し、その各々が植物細胞のゲノム中の異なる位置へのＤＮＡ構築物の挿入を示す。トランス遺伝子又は他の好ましい特性の発現に基づいて、特定のイベントが選択される。
「トランス遺伝子」は、その遺伝子型を改変するために遺伝子操作により生物のゲノム中に導入される遺伝子を意味する。トランス遺伝子は、例えば形質転換される特定の植物の遺伝子に対して異種又は同種である遺伝子を含んでよい。さらにトランス遺伝子は、非天然の生物に挿入される天然の遺伝子、又はキメラ遺伝子を含んでよい。
本明細書において遺伝子又は形質の「積層（ｓｔａｃｋｉｎｇ）」は、所望の遺伝子又は形質を１つのトランスジェニック植物系統へと結合させることである。植物育種家は、それぞれ所望の形質を有する親を交配させ、これらの所望の形質の両方を有する後代を同定することにより、トランスジェニック形質を積層する（いわゆる「育種積層」）。遺伝子を積層する別の方法は、形質転換中に同時に植物の細胞核中へと２個又はそれ以上の遺伝子を移入することによる。遺伝子を積層する別の方法は、目的の別々の遺伝子を用いるトランスジェニック植物を形質転換することによる。例えば遺伝子積層は、２つの異なる昆虫耐性形質、昆虫耐性形質及び疾患耐性形質、又は除草剤耐性形質（例えばＢｔ１１）を結合させるために使用することができる。目的の遺伝子に加えて、選択マーカーの使用も、遺伝子積層と見なされる。
「トランスジェニック植物」は、発現ベクターを含有する１つ又はそれ以上の植物細胞を有する植物である。
「植物」は、任意の生長段階における任意の植物、特に種子植物である。
植物に関して用語「栽培された」は、その生産のために商業的に栽培される各種の任意の植物を意味する。用語「栽培植物」は、生長目的に栽培され、選択的に育種されている植物を含む。栽培植物は、天然の形質及び／又は天然の遺伝的性質の一部として本発明の形質を含む野生型種を含まない。
「植物細胞」は、プロトプラストと細胞壁を含む植物の構造的及び生理学的単位である。植物細胞は、単離された単一の細胞若しくは培養細胞の形態で、又はより高度に組織化された単位（例えば、植物組織、植物器官、又は植物全体）の一部として存在し得る。
「植物細胞培養物」は、種々の生長段階における、植物単位の培養物、例えば、プロトプラスト、細胞培養細胞、植物組織中の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、接合子、及び胚を意味する。
「植物物質」は、葉、茎、根、花若しくは花の一部、果実、花粉、卵細胞、葯、子房、接合子、種子、挿穂、細胞培養若しくは組織培養、又は植物の他の部分若しくは生成物を意味する。これはまた、カルス若しくはカルス組織、ならびに試料の抽出物（例えば主根の抽出物）を含む。用語「植物物質」は通常、完全な植物細胞を有する比較的加工されていない植物物質を意味する。
「植物器官」は、明確且つ視認可能な、植物の構造及び分化部分、例えば根、茎、葉、花、芽、又は胚である。
本明細書において「植物組織」は、構造及び機能単位に組織化された植物細胞群を意味する。植物体中又は培養中の植物の任意の組織が含まれる。この用語は、特に限定されないが、植物全体、植物器官、植物種子、組織培養物、並びに構造及び／又は機能単位に組織化された任意の植物細胞群を含む。上記の又はこの定義に包含される植物組織の特定のタイプとともに、又はその非存在下でこの用語を使用することは、任意の他のタイプの植物組織を排除することを企図していない。
用語「メッセンジャーＲＮＡ」又は「ｍＲＮＡ」は、イントロンを含まず、細胞によりタンパク質中に翻訳されることが可能なＲＮＡを意味する。
「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに相補的であり、且つｍＲＮＡから得られる、１本鎖又は２本鎖ＤＮＡを意味する。
植物中の核酸配列、例えば、植物中の遺伝子、ＯＲＦ若しくはその一部、又はトランス遺伝子に関して使用される時、用語「発現」は、遺伝子中にコードされている遺伝情報を、遺伝子の「転写」により（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼの酵素的作用を介して）ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はｓｎＲＮＡ）へ変換工程、及び該当する場合（例えば、遺伝子がタンパク質をコードする場合）は、ｍＲＮＡの「翻訳」によりタンパク質に変換する工程を意味する。遺伝子発現は、この工程の多くの段階で制御することができる。例えばアンチセンス又はｄｓＲＮＡ構築物の場合は、発現はそれぞれアンチセンスＲＮＡのみの又はｄｓＲＮＡのみの転写を意味する。さらに発現は、センス（ｍＲＮＡ）又は機能性ＲＮＡの転写及び安定な蓄積を意味する。発現はまた、タンパク質の産生を意味する。
「下方制御」は、通常の若しくは非形質転換（非トランスジェニック）細胞若しくは生物中の発現レベルより低い、トランスジェニック細胞若しくは生物の発現レベルを意味する。特に「下方制御」は、標的遺伝子からのタンパク質及び／又はｍＲＮＡ生成物のレベルの、２０％〜１００％、特に４０％〜８０％、さらに詳しくは５０％〜９０％、さらに詳しくは６０％〜９５％、特に７５％〜９８％及び１００％までの範囲の低下を意味する。「抑制」は、標的遺伝子からのタンパク質及び／又はｍＲＮＡ生成物の欠如（すなわち、標的遺伝子の発現の完全な下方制御）を意味する。阻害の結果は、細胞若しくは生物の外面的性質の観察、又は当業者に公知の生化学的及び遺伝子発現検出法により確認することができる。例えば、ＦＴ遺伝子発現の下方制御及び／又は抑制は、生長しているサトウダイコン植物中の春化応答の欠如又は遅延により示される。
「過剰発現」又は「上方制御」は、通常の若しくは非形質転換（非トランスジェニック）細胞若しくは生物中の発現レベルを超える、トランスジェニック細胞若しくは生物における発現レベルを意味する。特に「過剰発現」又は「上方制御」は、標的遺伝子からのタンパク質及び／又はｍＲＮＡ生成物のレベルの、２０％〜１００％、特に４０％〜８０％、さらに詳しくは５０％〜９０％、さらに詳しくは６０％〜９５％、特に７５％〜９８％及び１００％までの範囲の上昇を意味する。
用語「コサプレッション」は、「センス下方制御」とも呼ばれる、遺伝子発現をサイレンシングするためのトランスジェニック法を意味する。この方法において、目的の遺伝子の発現は、天然ｍＲＮＡとトランスジェニックｍＲＮＡとの相互作用を介して、目的の遺伝子と相同性を有するトランスジェニック配列の発現により阻害される。
用語「ティリング（ｔｉｌｌｉｎｇ）」（又は「ＴＩＬＬＩＮＧ」、「ゲノムに誘導した局所的損傷部位のターゲティング」（「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ Ｉｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ」））は、目的の特定の遺伝子のヌル（ｎｕｌｌ）又はノックアウト対立遺伝子の作成のための非トランスジェニック法を意味する（ＭｃＣＡＬＬＵＭ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
「アンチセンス阻害」は、内因性遺伝子又はトランス遺伝子からのタンパク質の発現を抑制することができるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を意味する。
「遺伝子サイレンシング」は、遺伝子、トランス遺伝子、又は内因性核遺伝子の相同性依存性抑制を意味する。遺伝子サイレンシングは、抑制が、影響を受ける遺伝子の転写低下による時は転写性であり、抑制が、影響を受ける遺伝子と相同性を有するＲＮＡ種のターンオーバー（分解）上昇による時は、転写後性であり得る。遺伝子サイレンシングは、ウイルス誘導性遺伝子サイレンシングを含む。
「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）は、ｄｓＲＮＡを含む低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に仲介される植物や動物中の、配列特異的転写後遺伝子サイレンシング工程を意味する。ｓｉＲＮＡ、標的ＲＮＡ分子、ダイサー（ｄｉｃｅｒ）又はリボヌクレアーゼIII酵素などの種々の用語は当業者に公知の概念であり、これらの用語及びＲＮＡｉに関する他の概念の完全な説明は文献中に存在する。参照のためにＲＮＡｉに関するいくつかの用語が後述される。しかし、ＲＮＡｉの機序を説明する特定の仮説は、本発明の実施には必要ではないことを理解されたい。
「ｄｓＲＮＡ」又は「２本鎖ＲＮＡ」は、２つの相補鎖を有するＲＮＡであり、これはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている工程を介して、ｍＲＮＡの配列特異的分解を指令する。ｄｓＲＮＡは切断されてｓｉＲＮＡになり、特異的遺伝子の発現を干渉する。
「逆方向反復」は、同じ核酸配列上であるが反対の方向の、２つの部位に存在するヌクレオチド配列を意味する。
用語「ｓｉＲＮＡ」は、いわゆる低分子干渉ＲＮＡを意味する。ある実施形態においてｓｉＲＮＡは、約２１〜２３個のヌクレオチド長の２本鎖領域を含む；ｓｉＲＮＡはしばしば、各鎖の３’末端に約２〜４個の対になっていないヌクレオチドを含有する。ｓｉＲＮＡの２本鎖領域の少なくとも１つの鎖は、標的ＲＮＡ分子と実質的に相同的であるか又は実質的に相補的である。標的ＲＮＡ分子に相補的な鎖は「アンチセンス鎖」である；標的ＲＮＡ分子と相同的な鎖は「センス鎖」であり、そしてｓｉＲＮＡアンチセンス鎖に対して相補的でもある。ｓｉＲＮＡはまた追加の配列を含有し；かかる配列の非限定例には、結合配列、又はループ、ならびにステム及び他の折り畳み構造がある。ｓｉＲＮＡは、無脊椎動物や脊椎動物のＲＮＡ干渉の開始において、及び植物の転写後遺伝子サイレンシング中の配列特異的ＲＮＡ分解の開始において、主要な仲介役として機能するようである。
用語「標的ＲＮＡ分子」は、これに対してｓｉＲＮＡの短い２本鎖領域の少なくとも１つの鎖が相同的又は相補的であるＲＮＡ分子を意味する。典型的にはこのような相同性又は相補性が約１００％である場合、ｓｉＲＮＡは標的ＲＮＡ分子の発現をサイレンシング又は阻害することができる。処理されたｍＲＮＡがｓｉＲＮＡの標的であると考えられるが、本発明は特定の仮説に限定されず、そのような仮説は本発明の実施には必要ではない。すなわち他のＲＮＡ分子もまたｓｉＲＮＡの標的であり得ることが企図される。そのようなＲＮＡ標的分子には、未処理ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、及びウイルスＲＮＡゲノムがある。ｄｓＲＮＡの全長にわたって、標的ＲＮＡ分子とｄｓＲＮＡとの間に１００％の相同性がある必要は無く、ｄｓＲＮＡのヘアピンは、標的ＲＮＡ分子との間で少なくとも９５％、好ましくは１００％の相同性を有する、少なくとも２１個のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも２３個のヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも５００個のヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも７００個のヌクレオチド長、最大１０００個のヌクレオチド長を含むべきである。
「ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体」（ＲＩＳＣ）は、ｓｉＲＮＡ２本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する１本鎖ＲＮＡの切断を仲介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ２本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中間で起きる（ＥＬＢＡＳＨＩＲ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
用語「充分な相補性」は、標的遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現の抑制が開始するように、植物細胞中に導入されるＲＮＡの第１又は第２の鎖の配列が、前記植物細胞の細胞質中で見られる条件下で、標的遺伝子（ｍＲＮＡ）により産生されるＲＮＡと充分にハイブリダイズ又はアニーリングすることができることを意味する。例えば標的遺伝子により産生されるｍＲＮＡに結合するＲＮＡの第１又は第２の鎖の配列は、標的遺伝子の対応するｍＲＮＡ配列と少なくとも５０％同一、さらに好ましくは少なくとも７０％同一、さらに好ましくは少なくとも９０％同一、さらに好ましくは少なくとも９５％同一である。
ＲＮＡの第１又は第２の鎖の配列と標的遺伝子により産生されるｍＲＮＡの配列との同一性パーセント（これは少なくとも７０％同一性から、少なくとも９５％同一性の範囲である）は、この範囲内の任意の数値でよいと理解されたい。
本明細書において「発酵」は、微生物を使用して有機分子を別の分子に変換する方法を意味する。特に明記しない場合、用語「発酵」は嫌気性発酵及び好気性発酵を含む。
本明細書において用語「生物燃料」は、植物物質の好気性又は嫌気性発酵により産生される生物燃料を意味する。好気性発酵により得られる生物燃料の非限定例は、バイオエタノールである。嫌気性発酵により得られる生物燃料には、特に限定されないが、バイオガス及び／又はバイオディーゼルがある。好気性及び／又は嫌気性発酵の方法は、当業者に公知である。
用語「糖」は、発酵可能な単糖、二糖、及び三糖、特に単糖と二糖である。すなわち本発明において糖は、特に限定されないが、ショ糖、フルクトース、グルコース、ガラクトース、マルトース、乳糖、及びマンノースを含む。
用語「バイオプラスチック」は、生物学的源から産生されるプラスチックを意味する。この関連で「生物学的源」は、トランスジェニック植物で直接産生されるプラスチックと、化学プラント又は微生物中の化学的工程により、バイオマス（例えば植物油、デンプン、又は糖）から産生されるプラスチックの両方を包含する。用語「バイオプラスチック」は、特に限定されないが、デンプン系プラスチック、ポリ乳酸（ＰＬＡ）プラスチック、ポリ−３−ヒドロブチレート（ＰＨＢ）、ポリアミド１１（ＰＡ１１）、生物由来ポリエチレン、及び遺伝子修飾された生物（例えば細菌又は植物）で産生されるバイオプラスチックを含む。
発明の詳細な説明
本発明は、サトウダイコン及びトランスジェニック・サトウダイコン植物の春化応答に関与する、サトウダイコンのＦＴ遺伝子（ベータＦＴ遺伝子とも呼ばれる）のヌクレオチド配列を開示し、並びに、サトウダイコン中のＦＴ遺伝子発現を抑制することにより、サトウダイコン抽薹耐性を調節する方法を開示する。
栽培したサトウダイコン（ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）種、ブルガリス・エル（ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．））は、１年目に貯蔵根と葉ロゼットを生成する二年生植物である。苗条伸長（抽薹）と開花は、ある低温期間後に始まる。植物の抽薹を引き起こすこの低温誘導春化は、サトウダイコン全生活環における必須部分である。春化の詳細と二年生サトウダイコンに対するその影響は、文献に詳細に記載されている（例えば、ＪＡＧＧＡＲＤ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。
しかしサトウダイコンの春化応答と抽薹の遺伝的基礎についての詳細は、いまだに不明である。特に、サトウダイコンの春化の中心的存在としての遺伝子は、今のところ特定されていない。
モデル生物であるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の機能解析により、４つの明確な開花経路の区別が可能になった（ＬＥＶＹ ａｎｄ ＤＥＡＮ，１９９８）。これらの４つの経路は、環境刺激、例えば光周期促進経路と春化促進経路、又は固有の生長シグナル、例えば自律促進経路と開花抑制経路に割り当てられる。ある種では開花の時期は、主に環境因子、例えば光周期、光質／量、春化及び水又は養分利用可能性により影響を受ける。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）中で同定されている１つの目的遺伝子座は開花遺伝子座Ｔ（ＦＴ）である。この遺伝子座は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の天然に存在する晩生開花性型で発見された（ＫＯＯＲＮＥＥＦ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。ＦＴは２３ｋＤの小タンパク質であり、ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質と相同的であり、それはまたＲＡＦキナーゼインヒビタータンパク質と呼ばれる（ＫＡＲＤＡＩＬＳＫＹ ｅｔ ａｌ，１９９９；ＫＯＢＡＹＡＳＨＩ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
春化に応答してサトウダイコンの抽薹に関与する遺伝子を特定するために、本発明者らは、サトウダイコン中のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＦＴ遺伝子のオルソログを特定することに集中した。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（ＡｔＦＴ）、柑橘類（ＣｉＦＴ）、小麦（ＴａＦＴ）、及びコメ（ＯｓＨｄ３ａ）のＦＴオルソログのｃＤＮＡ配列中の保存されたヌクレオチド配列は、これらの配列を整列することにより特定された（図１）。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＦＴタンパク質の配列に従うエクソン１に位置する保存されたアミノ酸配列モチーフ「ＫＰＲＶＥＩＧＧ」（アミノ酸残基５１〜５８）を標的とする縮重プライマー、ならびにアミノ酸配列モチーフ「ＬＶＴＤＩＰＡＴＴ」（アミノ酸残基８９〜９８）を標的とするイントロン２のスプライシング部位のすぐ下流のエクソン３を使用し、鋳型としてサトウダイコンの葉から抽出した総ＲＮＡを使用するＰＣＲ反応で、２つのヌクレオチド断片が増幅された（実施例１参照）。その後の増幅断片の配列解析により、異なる配列を有する２つのＢｖＦＴホモログが明らかとなった。これらのホモログは、それぞれＢｖＦＴ１断片（配列番号３）及びＢｖＦＴ２断片（配列番号４）と呼ばれる。これらの両方は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からのＦＴタンパク質と強い配列相同性を有する（図４と５）。
ＢｖＦＴ１断片とＢｖＦＴ２断片の両方に基づいて、これらの配列を含むＢＡＣクローンを同定し、配列決定した（実施例１参照）。両方のｃＤＮＡ断片へのゲノム配列の整列とシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＦＴ遺伝子への配列相同性に基づいて、イントロンとエクソンとを含むベータＦＴ遺伝子の推定遺伝子構造を予測した（図２及び３）。ＢｖＦＴ１のコード配列とアミノ酸配列を、それぞれ配列番号６と７に示す。ＢｖＦＴ２のコード配列とアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９と１０に示す。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＦＴのタンパク質配列へのＢｖＦＴ１とＢｖＦＴ２の完全長アミノ酸配列の整列は、それぞれ７２％同一性と８２％類似性（ＢｖＦＴ１について）、及び７５％同一性と８８％類似性（ＢｖＦＴ２について）の強い配列相同性を示した（図４及び５；実施例１）。
驚くべきことに、二年生及び一年生サトウダイコン植物の異なる生長段階を通じて、サトウダイコン植物の葉における、これら２つの遺伝子の相反する発現パターンを発現解析は示した（実施例３参照）。ＢｖＦＴ１転写物は、二年生植物の早期生長段階の葉で検出されたが、発現レベルは春化後に低下し、生長段階から生殖期への移行を通して低いままであり、一方ＢｖＦＴ２遺伝子の発現は、抽薹の最初の視覚的兆候の前に劇的に上昇した。抽薹時期前に観察されたＢｖＦＴ２の発現の上昇は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＦＴ遺伝子の発現プロフィールと非常によく似ており、それは、ＢｖＦＴ２が実際、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＦＴ遺伝子のサトウダイコンオルソログであることを示唆する。異なる光周期を有する日周サイクルにわたるこれらの遺伝子の発現解析（実施例４を参照）は、この示唆をさらに支持した。
一方、ＢｖＦＴ１のコード領域を過剰発現するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の発現試験（実施例５参照）は、驚くべきことに、ＢｖＦＴ１がＡｔＴＦＬ１（ＲＡＣＬＩＦＦＥ ｅｔ ａｌ．，１９９８）（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の開花のインヒビター）のように作用することを示した。これは、ＢｖＦＴ１は驚くべきことに、ＦＴ遺伝子ファミリーの系統樹中のＦＴ様系統クレードに密集するにもかかわらず、開花のプロモーターではなくリプレッサーのように作用することを例示する（図６）。一方シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）中のＢｖＦＴ２の異所性発現は、極端な早期開花表現型を与えた。上記したＢｖＦＴ１とＢｖＦＴ２のこれらの相反する機能（すなわち、ＢｖＦＴ１が付与する開花抑制に対して、ＢｖＦＴ２が付与する開花の促進）は、上記したようにサトウダイコンで見つかった相反する発現プロフィールと一致した。
本発明者らは、サトウダイコンの両方のＦＴ遺伝子は、非常に異なる発現プロフィールを有する植物の生長段階に依存して活性に制御され、サトウダイコンの春化応答においてさらに主要な役割を果たす、という発現プロフィールを有することを証明できた。したがって、両方の遺伝子は、春化応答を遅延させるか又は抑制することにより、サトウダイコン植物の抽薹耐性を改変するために使用され得る。
第１の態様において本発明は、配列番号５、６、８、又は９のいずれかに記載の核酸配列の群から選択される核酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するか、配列番号５、６、８、又は９のいずれかに記載の核酸配列の群から選択される核酸配列の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むか、又は配列番号５、６、８、又は９のいずれかに記載の核酸配列の群から選択される核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ベータ・ブルガリス（Beta vulgaris）のＦＴ遺伝子の核酸配列に関する。
好ましくは、本発明の核酸配列は、単離された核酸である。
好適な実施形態において、本発明の核酸配列は、配列番号５、６、８、又は９のいずれかに記載の核酸配列の群から選択される核酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、及び最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する。
配列同一性について、本発明を通して、記載された範囲内に入るすべての各数値は、本発明により同様に包含される。例えば本明細書において上記した用語「少なくとも７０％」という用語はまた、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を包含し、上記した用語「少なくとも８０％」という用語もまた、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を包含する。同じことが、用語「少なくとも８５％」、「少なくとも９０％」、「少なくとも９５％」、及び「少なくとも９８％」に当てはまる。
好適な実施形態において、本発明の核酸配列は、配列番号５、６、８、又は９のいずれか１つに記載の核酸配列の群から選択される核酸配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、さらに好ましくは少なくとも３５個、さらに好ましくは少なくとも５０個、さらに好ましくは少なくとも７５個、最も好ましくは少なくとも１００個の連続ヌクレオチドを含む。本発明を通して用語「少なくともｘ個のヌクレオチド」は、ｘ及びそれ以上の数字で始まる、任意の数値を有する核酸分子を包含することは理解されたい。例えば用語「少なくとも１５個のヌクレオチド」は、配列番号５、６、８、又は９のいずれか１つに記載の核酸配列中に存在する１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、及びそれ以上のヌクレオチドを包含することを企図する。同様に用語「少なくとも２０個のヌクレオチド」は、配列番号５、６、８、又は９のいずれか１つに記載の核酸配列中に存在する２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、及びそれ以上のヌクレオチドを包含することを企図する。同じことが、本発明で上記した他の範囲に当てはまる。
さらに好適な実施形態において、上記した本発明の核酸配列は、ストリンジェントな条件下で、より好ましくは高ストリンジェントな条件下で、配列番号５、６、８、又は９のいずれか１つに記載の核酸配列から成る群から選択される核酸配列とハイブリダイズする。
本態様のさらに好適な実施形態において、本発明の核酸配列は、配列番号５、６、８、又は９のいずれか１つに記載の核酸配列、及びその相補体を含む。
任意の対応するアンチセンス構築物を含む本発明の核酸配列は、本明細書で後述されるプロモーター配列又はその変異体を含む、植物宿主内で機能性である任意のプロモーターに、作動可能に連結され得る。
本発明は、上記の本発明の核酸配列にコードされるポリペプチドをさらに提供する。
この態様の好適な実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号７又は１０に記載のアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明の核酸の発現の調節は、特にトランスジェニック・サトウダイコン植物のようなトランスジェニック植物中で発現されるときに、サトウダイコンに抽薹耐性を与える（例えば、実施例７及び８を参照）。
したがってさらなる態様において、本発明のヌクレオチド配列は、サトウダイコンゲノム中に安定に組み込まれた前記ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック・サトウダイコン植物を生産するための、トランスジェニック手法において使用される。特に、ゲノムからの発現時において、発現生成物は、サトウダイコン植物の春化応答を調節することにより、抽薹耐性を付与するのに使用することができる。上記した、異なる発現プロフィールに基づいて、これは、ＢｖＦＴ２遺伝子の発現を抑制若しくは下方制御することにより、又はＢｖＦＴ１遺伝子の発現を上方制御することにより、又は両方の組合せにより達成される。
ある態様において、本発明の核酸配列は、調節エレメントの制御下で、好ましくは植物中で機能性の調節エレメントの制御下で、トランスジェニック植物中で発現される核酸配列を含有するキメラ構築物中へと組み立てられる。かかるキメラ構築物を組み立てる方法は当業者に公知である。本発明のキメラ構築物は、植物細胞のような適切な宿主細胞中の特定のヌクレオチド配列（すなわち、本発明のヌクレオチド配列）の発現を指令することができる核酸配列である。
従って、サトウダイコン中の本発明のキメラ構築物に含まれるヌクレオチド配列の発現は、ＢｖＦＴ１及び／又はＢｖＦＴ２の発現を調節し、こうして春化応答を遅延させるか又は抑制することにより抽薹耐性を付与する。
本発明のキメラ構築物において、核酸は、好ましくはヌクレオチド配列を発現できる宿主細胞中のヌクレオチド配列の発現のための調節エレメントを含む発現カセット内に含まれる。かかる調節エレメントは通常、プロモーターと停止シグナルを含み、好ましくは本発明の核酸によりコードされるポリペプチドの効率的な翻訳を可能にする要素も含む。
本発明の核酸を含む本発明のキメラ構築物は、特定の宿主細胞中で、好ましくは染色体外分子として複製でき、従って宿主細胞中で本発明の核酸を増幅するのに使用される。さらに別の実施形態において、かかるキメラ構築物はウイルスベクターであり、特定の宿主細胞（例えば植物細胞）中のヌクレオチド配列の複製のために使用される。宿主細胞への本発明のヌクレオチド配列の形質転換のために組換えベクターも使用され、それによりヌクレオチド配列がトランスジェニック宿主のＤＮＡ中に安定に組み込まれる。
ある好適な実施形態において本発明のキメラ構築物はさらに、選択工程で形質転換植物物質と非形質転換植物物質との区別を可能にする選択マーカー遺伝子を含む。選択目的に使用できるマーカー遺伝子及びその応用は、当業者に公知である。
ある態様において本発明のキメラ構築物は、サトウダイコン中の内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現のトランスジェニック下方制御又は抑制のために提供される。
ＢｖＦＴ２の発現の下方制御又は抑制は、生長しているサトウダイコン植物中で春化応答を遅延させるか、又はサトウダイコン植物の非抽薹表現型への進展を引き起こし、それは、サトウダイコン植物が抽薹と以後の開花により、１８週間の典型的な春化期間にもはや応答せず、その反対に栄養生長（非抽薹）を続け、正常な主根を生長させることを意味する。前記遅延春化応答又は前記非抽薹表現型を発現する植物は、標準化生長条件を利用する表現型解析実験を適用することにより、容易に同定され且つ選択される。
本発明は、サトウダイコン中の内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現、量、活性、及び／又は機能を低下させる種々の方法を含む。所望の方法で、植物の遺伝子の発現、量、活性、及び／又は機能に影響を与えるために、多くの方法が利用可能である。特に限定されないが、以下はその例である：
「センス」抑制
植物中の遺伝子（すなわち、サトウダイコン中のＢｖＦＴ２遺伝子）の発現の変更、好ましくはその発現の低下は、「センス」抑制により行われる（例えば、ＪＯＲＧＥＮＳＥＮ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１，９５７−９７３）。この場合、本発明のヌクレオチド配列の全て又は一部は、ＤＮＡ分子中に含まれる。ＤＮＡ分子は好ましくは、標的遺伝子を含む細胞、好ましくは植物細胞中で機能性のプロモーターに作動可能に連結しており、細胞に導入され、そこでヌクレオチド配列は発現可能である。ヌクレオチド配列は「センス方向」でＤＮＡ分子中に挿入され、これは、ヌクレオチド配列のコード鎖が転写できることを意味する。好適な実施形態において、ヌクレオチド配列は完全に翻訳可能であり、ヌクレオチド配列に含まれる全ての遺伝情報又はその一部には、翻訳されてポリペプチドになる。別の好適な実施形態において、ヌクレオチド配列は部分的に翻訳可能であり、短いペプチドへと翻訳される。好適な実施形態において、これは、ヌクレオチド配列中に少なくとも１つの推定停止コドンを挿入し、それが翻訳を停止することにより行われる。さらに別の好適な実施形態において、ヌクレオチド配列は転写されるが、翻訳生成物は産生されない。これは通常、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの開始コドン（例えば「ＡＴＧ」）を除去することにより行われる。さらに好適な実施形態において、ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子又はその一部は、植物細胞のゲノム中に安定に組み込まれる。別の好適な実施形態において、ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子又はその一部は、染色体外複製分子中に含まれる。
直前に記載したＤＮＡ分子の１つを含むトランスジェニック植物では、ＤＮＡ分子に含まれるヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の発現が好ましくは低下される。好ましくは、ＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列は、その発現が低下されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であり、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一であり、そして最も好ましくは少なくとも９９％同一である。
「アンチセンス」抑制
別の好適な実施形態において、植物中の遺伝子（すなわち、サトウダイコン中のＢｖＦＴ２遺伝子）の発現の変更、好ましくはその発現の低下は、「アンチセンス」抑制により行われる。本発明のヌクレオチド配列のすべて又は一部がＤＮＡ分子中に含まれる。このＤＮＡ分子は好ましくは、植物細胞中で機能性のプロモーターに作動可能に連結しており、植物細胞に導入され、そこでヌクレオチド配列は発現可能である。ヌクレオチド配列は「アンチセンス方向」でＤＮＡ分子中に挿入され、これは、ヌクレオチド配列の逆相補体（時に非コード鎖とも呼ばれる）が転写できることを意味する。好適な実施形態において、ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子又はその一部は、植物細胞のゲノム中に安定に組み込まれる。別の好適な実施形態において、ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子又はその一部は、染色体外複製分子中に含まれる。さらなる例示のために、この方法を記載するいくつかの刊行物が引用される（ＧＲＥＥＮ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：５６９−５９７（１９８６）；ＶＡＮ ＤＥＲ ＫＲＯＬ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｐｐ．１２５−１４１（１９９１）；ＡＢＥＬ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６９４９−６９５２（１９８９）；ＥＣＫＥＲ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５３７２−５３７６（１９８６））。
直前に記載したＤＮＡ分子の１つを含むトランスジェニック植物では、好ましくはＤＮＡ分子に含まれるヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の発現が低下される。好ましくは、ＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列は、その発現が低下されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であり、さらに好ましくは少なくとも９０％同一であり、さらに好ましくは少なくとも９５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９９％同一である。
相同的組換え
別の好適な実施形態において、本発明のヌクレオチド配列に対応する少なくとも１つのゲノムコピーは、ＰＡＳＺＫＯＷＳＫＩ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ７：４０２１−２６（１９８８）にさらに例示されているように、相同的組換えにより植物のゲノム中で修飾される。この技術は、相同的組換えとして当該分野で公知の方法により、相同配列の性質を使用して、互いを認識し、互いにヌクレオチド配列を交換する。相同的組換えは、細胞中のヌクレオチド配列の染色体コピーと、形質転換により細胞中に導入されるヌクレオチド配列の入ってくるコピーとの間で起きる。従って特定の修飾が、ヌクレオチド配列の染色体コピー中に正確に導入される。ある実施形態において、各植物遺伝子（すなわち、サトウダイコン中のＢｖＦＴ２遺伝子）の調節エレメントが修飾される。かかる調節エレメントは、本発明のヌクレオチド配列又はその一部をプローブとして使用して、ゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより容易に得られる。既存の調節エレメントは異なる調節エレメントで置換され、こうしてヌクレオチド配列の発現が変更されるか、又はこれらは変異若しくは欠失され、こうしてヌクレオチド配列の発現が排除される。別の実施形態においてヌクレオチド配列は、一部のヌクレオチド配列若しくは全ヌクレオチド配列の欠失により、又は突然変異により修飾される。植物細胞中の変異ポリペプチドの発現もまた、本発明で企図される。内因性植物遺伝子を破壊するためのこの方法の最近の改良が記載されている（ＫＥＭＰＩＮ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８９：８０２−８０３（１９９７）ａｎｄ ＭＩＡＯ ＆ ＬＡＭ， Ｐｌａｎｔ Ｊ．，７：３５９−３６５（１９９５））。
標的化方法でゲノム配列を修飾するための多くの可能な方法は、当業者にとって既知である。これらには特に、例えば停止コドン、読みとり枠中のシフトなどを作成することによる標的化相同的組換え手段によりノックアウト変異体を生成する方法（ＨＯＨＮ ＆ ＰＵＣＨＴＡ（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９６：８３２１−８３２３）、又は例えば、配列特異的リコンビナーゼ若しくはヌクレアーゼ手段による配列の標的化欠失若しくは反転のような方法がある。別の好適な実施形態において、末端に二重ヘアピンキャップを有する２本鎖コンフォメーション中のＲＮＡ及びＤＮＡ残基の連続的ストレッチからなるキメラオリゴヌクレオチドを用いて細胞を形質転換することにより、ヌクレオチド配列の染色体コピー中の変異が導入される。オリゴヌクレオチドの追加の特徴は、例えばＲＮＡ残基での２’−Ｏ−メチル化の存在である。ＲＮＡ／ＤＮＡ配列は、本発明のヌクレオチド配列の染色体コピーの配列と整列させて、所望のヌクレオチド変化を含むように設計される。例えばこの技術はさらに、米国特許第５，５０１，９６７号、及びＺＨＵ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：８７６８−８７７３に例示されている。
リボザイム
さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡは、かかるＲＮＡに特異的な触媒ＲＮＡ又はリボザイムにより切断される。リボザイムはトランスジェニック植物中で発現され、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡの量を低下させ、こうして細胞中に蓄積されるポリペプチドの量が低下する。この方法はさらに、米国特許第４，９８７，０７１号に例示されている。
ドミナントネガティブ変異体
別の好適な実施形態において、本発明のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの活性が変化される。これは、トランスジェニック植物中におけるタンパク質のドミナントネガティブ変異体の発現によって達成され、そしてそれは内因性タンパク質の活性の喪失をもたらす。
アプタマー（Ａｐｔａｍｅｒ）
さらなる実施形態において本発明のポリペプチドの活性は、トランスジェニック植物中でタンパク質に特異的に結合する核酸リガンド（いわゆるアプタマー）を発現することにより阻害される。アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）法により優先的に得られる。ＳＥＬＥＸ法では、ランダム化配列の領域を有する１本鎖核酸の混合物候補をタンパク質と接触させ、標的への親和性が上昇した核酸が、残りの混合物候補から分離される。分離された核酸を増幅して、リガンド濃縮混合物を得る。数回繰り返した後、ポリペプチドに対する最適親和性を有する核酸を得て、トランスジェニック植物中の発現に使用する。この方法はさらに、米国特許第５，２７０，１６３号に例示されている。
ジンクフィンガータンパク質
本発明のヌクレオチド配列又はその制御領域に結合するジンクフィンガータンパク質もまた、ヌクレオチド配列の発現を変更するために使用される。好ましくはヌクレオチド配列の転写は、低下されるか又は上昇される。ジンクフィンガータンパク質は、例えばＢＥＥＲＬＩ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＰＮＡＳ ９５：１４６２８−１４６３３．、又はＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９８／５４３１１、又はＷＯ９６／０６１６６（これらのすべては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
好適な実施形態において、サトウダイコンの内因性ＢｖＦＴ２の発現のトランスジェニック下方制御又は抑制は、ｄｓＲＮＡ、アンチセンス抑制、又はコサプレッションのいずれかから選択される方法により行われる。
目的の植物遺伝子（例えばサトウダイコン中のＢｖＦＴ２）の発現の変更はまた、ｄｓＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により行われる。２本鎖ＲＮＡによる遺伝子制御の方法（「２本鎖ＲＮＡ干渉」；ｄｓＲＮＡｉ）は、動物及び植物について何度も記載されている（例えば、ＭＡＴＺＫＥ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４３：４０１−４１５；ＦＩＲＥ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−８１１；ＷＯ９９／３２６１９；ＷＯ９９／５３０５０；ＷＯ００／６８３７４；ＷＯ００／４４９１４；ＷＯ００／４４８９５；ＷＯ００／４９０３５；ＷＯ００／６３３６４、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。上記の文献に記載されている工程及び方法は、本明細書において明示的に参照される。ｄｓＲＮＡｉ法は、遺伝子転写物の相補鎖及びコンター（ｃｏｎｔｏｕｒ）鎖の同時導入が、対応する遺伝子の発現を極めて効率的に抑制するという現象に基づく。現在の理解では、ｄｓＲＮＡは、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によって処理されて、ｄｓＲＮＡが低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと切断される。好ましくは、得られる表現型は、対応するノックアウト変異体の表現型に非常によく似ている（ＷＡＴＥＲＨＯＵＳＥ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：１３９５９−６４）。ｄｓＲＮＡｉ法は、マーカータンパク質発現を低下させるのに特に効率的で有利であることがわかった。サトウダイコンＢｖＦＴ２遺伝子ｍＲＮＡ発現を干渉すると、サトウダイコンの春化応答の抑制又は遅延が起きる。春化応答の遅延は、サトウダイコンが栄養生長を続け、正常の主根を生長させることになる。
本発明の範囲内において、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子は好ましくは、相補的配列のために、理論的（ワトソン−クリックの塩基対合規則に従って）に及び／又は実際（例えば、インビトロ及び／又はインビボのハイブリダイゼーション実験により）に２本鎖ＲＮＡ構造体を生成できる、１つ又はそれ以上のリボ核酸配列を意味する。２本鎖ＲＮＡ構造の生成が平衡状態を示すという事実は当業者にとって既知である。好ましくは、２本鎖分子と対応する分離型の比は、少なくとも１：１０、好ましくは１：１、特に好ましくは５：１、最も好ましくは１０：１である。
従ってある態様において、本発明はさらに、サトウダイコン植物（あるいはそれ由来の細胞、組織、器官、又は増殖物質）中に導入されると、少なくとも内因性ＢｖＦＴ２の発現の低下を引き起こす２本鎖ＲＮＡ分子に関する。少なくとも内因性ＢｖＦＴ２の発現を低下させるための２本鎖ＲＮＡ分子は好ましくは、（ａ）少なくとも内因性ＢｖＦＴ２の「センス」ＲＮＡ転写物の少なくとも一部と基本的に同一の、少なくとも１つのリボヌクレオチド配列を含む「センス」ＲＮＡ鎖、及び（ｂ）（ａ）のＲＮＡセンス鎖と基本的に好ましくは完全に相補的な「アンチセンス」ＲＮＡ鎖を含む。
「基本的に同一」とは、ｄｓＲＮＡ配列がまた、標的遺伝子配列と比較して、挿入、欠失、及び個々の点突然変異を有し、それにもかかわらず発現を効率的に低下させ得ることを意味する。阻害性ｄｓＲＮＡの「センス」鎖と、標的遺伝子核酸配列の「センス」ＲＮＡ転写物の少なくとも一部との（又は標的遺伝子の核酸配列の相補鎖の「アンチセンス」鎖との）の相同性（後述のように定義される）は、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％である。
ｄｓＲＮＡとマーカータンパク質遺伝子転写物との１００％配列同一性は、標的遺伝子発現の効率的低下を引き起こすために、絶対に必要ということはない。従ってこの方法は、遺伝的変異、多型、又は進化的分岐のために存在するような配列の逸脱に対して、有利に耐性である。すなわち、例えば第１の生物の標的遺伝子の配列から開始して作成されるｄｓＲＮＡを使用して、第２の生物中の標的遺伝子の発現を抑制することができる。この目的に、ｄｓＲＮＡは好ましくは、保存領域に対応する標的遺伝子転写物の配列領域を含む。前記保存領域は、配列比較により容易に得られる。
あるいは「基本的に同一の」ｄｓＲＮＡはまた、標的遺伝子転写物の一部とハイブリダイズすることができる核酸配列と定義される。
「基本的に相補的」とは、「アンチセンス」ＲＮＡ鎖がまた、この「センス」ＲＮＡ鎖の相補体と比較して、挿入、欠失、及び個々の点突然変異を有し得ることを意味する。「アンチセンス」ＲＮＡ鎖と「センス」ＲＮＡ鎖の相補体との相同性は、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％である。
標的遺伝子の核酸配列の「「センス」ＲＮＡ転写物の一部」は、標的遺伝子の核酸配列から転写されるか又は転写可能な、ＲＮＡ又はｍＲＮＡの断片を意味する。この関連で、断片は、好ましくは少なくとも２０塩基、好ましくは少なくとも５０塩基、特に好ましくは少なくとも１００塩基、さらに特に好ましくは少なくとも２００塩基、最も好ましくは少なくとも５００塩基の配列長を有する。完全に転写可能なＲＮＡ又はｍＲＮＡも含まれる。また、天然の条件下で、本来転写されていない標的遺伝子の領域、例えばプロモーター領域から人工的条件下で転写され得る配列も含まれる。
ｄｓＲＮＡは、ポリリボヌクレオチドの１つ又はそれ以上の鎖からなってよい。同じ目的を達成するためには、当然、各場合に上記リボヌクレオチド配列セクションの１つを含む複数の個々のｄｓＲＮＡ分子を、細胞又は生物中に導入することができる。２本鎖ｄｓＲＮＡ構造は、２つの相補的な別々のＲＮＡ鎖から開始して、又は好ましくは単一の自己相補性ＲＮＡ鎖から開始して形成され得る。この場合、「センス」ＲＮＡ鎖と「アンチセンス」ＲＮＡ鎖は好ましくは、逆方向「反復」の形で互いに共有結合している。
例えばＷＯ９９／５３０５０に記載のように、ｄｓＲＮＡはまた、「センス」及び「アンチセンス」鎖が連結配列（「リンカー」、例えばイントロン）により連結されるヘアピン構造体を含んでよい。自己相補性ｄｓＲＮＡ構造体はＲＮＡ配列の発現のみを必要とし、絶えず相補的ＲＮＡ鎖を等モル比で含むため、自己相補性ｄｓＲＮＡ構造体が好ましい。連結配列は、好ましくはイントロン（例えば、ジャガイモＳＴ−ＬＳ１遺伝子のイントロン；ＶＡＮＣＡＮＮＥＹＴ ｅｔ ａｌ．（１９９０））である。
ｄｓＲＮＡをコードする核酸配列は、例えば転写停止シグナル又はポリアデニル化シグナルのような追加の要素を含んでよい。
所望であれば、細胞又は植物中のｄｓＲＮＡの２つの鎖をつなぐことは、例えば以下の方法により行われる：（ａ）両方の発現カセットを含むベクターを用いる細胞又は植物の形質転換、（ｂ）２つのベクターを用いる細胞又は植物の同時形質転換、その１つは「センス」鎖を含有する発現カセットを含み、他の１つは「アンチセンス」鎖を含有する発現カセットを含む。ＲＮＡ２本鎖の形成は、細胞の外又は中で開始される。
ｄｓＲＮＡは、インビボ又はインビトロで合成される。この目的のために、ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、少なくとも１つの遺伝調節エレメント（例えばプロモーター）の制御下で発現カセット中に挿入される。ポリアデニル化は必要ではなく、翻訳を開始するための要素も必要としない。形質転換構築物又は形質転換ベクター上に存在する標的遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡの発現カセットが好ましい。この目的のために、標的遺伝子を標的とする「アンチセンス」鎖及び／若しくは「センス」鎖をコードする発現カセット、又はｄｓＲＮＡの自己相補鎖をコードする発現カセットが、好ましくは後述の方法を使用して形質転換ベクター中に導入され、植物細胞中に導入される。ゲノムへの安定な挿入は本発明の目的のために有利であるが、絶対に必要という訳ではない。ｄｓＲＮＡは長期作用を引き起こすため、多くの場合一過性発現で充分である。ｄｓＲＮＡはまた、例えば前記ＲＮＡの３’非翻訳部分に融合することにより挿入される核酸配列により発現されるＲＮＡの一部でもよい。
ｄｓＲＮＡは、細胞当たり少なくとも１つのコピーを可能にする量で導入され得る。適宜、より多量（例えば、細胞当たり少なくとも５、１０、１００、５００、又は１０００コピー）のコピーが、より効率的な低下を引き起こす。
ある好適な実施形態において、本発明のキメラ構築物は、第１のＲＮＡ鎖と第２のＲＮＡ鎖とをコードする異種ＤＮＡを含み、これは転写されると、第１のＲＮＡヌクレオチド配列と第２のＲＮＡヌクレオチド配列とを与え、ここで、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現の下方制御又は抑制を引き起こすために、前記第１のＲＮＡ鎖は、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子により産生されるＲＮＡ鎖にハイブリダイズ又はアニーリングするのに充分に、サトウダイコン中の内因性ＢｖＦＴ２遺伝子のＲＮＡ鎖の少なくとも一部と相補的であり、ここで前記第１のＲＮＡヌクレオチド配列と前記第２のＲＮＡヌクレオチド配列は２本鎖ＲＮＡを形成し、ここで２本鎖ＲＮＡはサトウダイコン植物中で発現されると、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現のＲＮＡ干渉に関与し、それにより、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現の下方制御若しくは抑制を引き起こす。
本発明の具体的な実施形態において、逆方向反復を含むキメラ構築物が提供され、これはサトウダイコン細胞中で転写されると、前記第１の及び第２のＲＮＡ鎖を含む前記サトウダイコン植物細胞中で２本鎖ＲＮＡ分子を形成し、ここで前記２本鎖ＲＮＡ分子はＢｖＦＴ２サイレンシングを引き起こす。さらに好適な実施形態において、逆方向反復は好ましくは構成的プロモーターに作動可能に連結される。
本発明の別の実施形態において、本発明のキメラ構築物中に含まれる異種ＤＮＡによりコードされる第１又は第２のＲＮＡ鎖配列は、ＢｖＦＴ２遺伝子により産生されるＲＮＡのヌクレオチド配列と充分に相補的であるか又は同一であり、ＲＮＡサイレンシングを引き起こすことができる。用語「充分に相補的」は、第１又は第２のＲＮＡ鎖配列が、細胞質中に存在する条件下で内因性ＢｖＦＴ２遺伝子により産生されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に充分にハイブリダイズするか又はアニーリングすることができ、従ってＲＮＡｉが引き起こされて、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現の抑制をもたらす。ＢｖＦＴ２遺伝子のこの抑制は、サトウダイコン植物に非抽薹表現型を出現させ、そしてそれは、抽薹及び以後の開花により、１８週間の典型的な春化期間にもはや応答せず、栄養生長（非抽薹）を続け、正常な主根を発生させることを意味する。
ある実施形態において、本発明のキメラ構築物は、ＢｖＦＴ２遺伝子の少なくとも一部に充分に相補的な又は同一の核酸鎖をコードする異種ＤＮＡを含む。ｓｉＲＮＡ鎖が同一である場合、標的ｍＲＮＡは切断されて無用なＲＮＡ断片になることは公知である。しかし対合が同一ではない場合、ＲＩＳＣ複合体はｍＲＮＡに結合し、天然のｍＲＮＡに沿ったリボソームの運動を阻止することができるが、ｍＲＮＡを小断片に切断することができない。しかしいずれの場合も、そこからｍＲＮＡが転写される遺伝子の発現はサイレンシングされ、従って標的遺伝子（例えばＢｖＦＴ２）にコードされるタンパク質は生成されない。従って本発明はさらに、その発現が変更される内因性ＢｖＦＴ２遺伝子から転写されるｍＲＮＡの対応する配列と充分に相補的又は同一である、低分子干渉ＲＮＡの１つの鎖を含む。例えばｍＲＮＡに結合する低分子干渉ＲＮＡの鎖は、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の対応するｍＲＮＡ配列と好ましくは少なくとも５０％同一、さらに好ましくは少なくとも７０％同一、さらに好ましくは少なくとも８０％同一、さらに好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは少なくとも９５％同一である。
その発現が変更される内因性ＢｖＦＴ２遺伝子から転写されるｍＲＮＡの対応する配列と充分に相補的又は同一である低分子干渉ＲＮＡの１つの鎖と、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子により産生されるｍＲＮＡとの同一性パーセント（これは少なくとも５０％同一性〜少なくとも９５％同一性の範囲である）は、この範囲内の任意の数値である。
標的配列と比較して挿入、欠失、及び単一の点突然変異を有するＲＮＡ配列はまた、標的遺伝子発現の抑制に有効である。ｓｉＲＮＡ分子と標的遺伝子転写生成物（例えば、標的遺伝子ｍＲＮＡ）との配列同一性は、当該分野で公知の整列アルゴリズムにより、及びヌクレオチド配列間のパーセント類似性を計算することにより最適化される。あるいは本発明のｓｉＲＮＡ分子は、標的分子に対するその配列類似性によってではなく、標的配列にハイブリダイズしその発現をサイレンシングする能力により同定される。
本発明のさらに好適な実施形態において、キメラ構築物は、配列番号８又は９に記載の本発明の核酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するか、又は配列番号８又は９に記載の本発明の核酸配列の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む核酸配列をコードするか、又は配列番号８又は９に記載の本発明の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、異種ＤＮＡを含む。
さらなる実施形態において、本発明のキメラ構築物に含まれる異種ＤＮＡによりコードされる核酸配列との配列同一性は、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは少なくとも９５％である。
本発明のある実施形態において、キメラ構築物は、１８〜３０個のヌクレオチド長である第１のＲＮＡヌクレオチド配列と、細胞、特に細胞の細胞質及び／又は核内の条件のような生物学的条件下で、第１の配列にハイブリダイズする第２のＲＮＡヌクレオチド配列とをコードする異種ＤＮＡを含む。前記第１のＲＮＡ分子は、第１のＲＮＡ鎖がＢｖＦＴ２遺伝子の一部にハイブリダイズ若しくはアニーリングして内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現の抑制を引き起こすことが可能である程度の、サトウダイコンの内因性ＢｖＦＴ２遺伝子のＲＮＡの一部への相補性度を有する。
本発明のさらに別の実施形態において、キメラ構築物は、２１〜２５ヌクレオチドの長さである第１のＲＮＡヌクレオチド配列と、細胞、特に細胞の細胞質及び／又は核中の条件のような生物学的条件下で、第１の配列にハイブリダイズする第２のＲＮＡ鎖とをコードする異種ＤＮＡを含む。前記第１のＲＮＡ分子は、第１のＲＮＡ鎖が前記ＢｖＦＴ２遺伝子の一部にハイブリダイズ若しくはアニーリングして内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現の抑制を引き起こすことが可能である程度の、サトウダイコンの内因性ＢｖＦＴ２遺伝子のＲＮＡの一部への相補性度を有する。
本発明のさらに別の実施形態において、キメラ構築物は、２１〜２３ヌクレオチドの長さである第１のＲＮＡヌクレオチド配列と、細胞、特に細胞の細胞質及び／又は核中の条件のような生物学的条件下で、第１の配列にハイブリダイズする第２のＲＮＡ鎖とをコードする異種ＤＮＡを含む。前記第１のＲＮＡ分子は、第１のＲＮＡ鎖が前記ＢｖＦＴ２遺伝子の一部にハイブリダイズ若しくはアニーリングして内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現の抑制を引き起こすことが可能である程度の、サトウダイコンの内因性ＢｖＦＴ２遺伝子のＲＮＡの一部との相補性度を有する。
一般に本発明は、キメラ構築物中に含まれる異種ＤＮＡが、サトウダイコンＢｖＦＴ２遺伝子ｍＲＮＡのＲＮＡ干渉を開始する役割を果たすことを条件として、任意の長さのキメラ構築物を含む。
別の実施形態において、本発明は、ヌクレオチド配列５’−ＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＣＡＡＴＧ−３’（配列番号４４）を有する順方向プライマーＨｉＮＫ６３８２と、ヌクレオチド配列５’−ＧＴＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＴＡＴＧ−３’（配列番号４５）を有する逆方向プライマーＨｉＮＫ６３８４とを使用して、ＰＣＲ反応で上記のＢｖＦＴ２遺伝子のエクソン４からなる０．２７ＫｂのｃＤＮＡ断片から得られる異種ＤＮＡを含む上記キメラ構築物に関する。この実施形態は、実施例７でさらに概説される。本発明のこの具体的な実施形態において、キメラ構築物は好ましくは、配列番号３３のヌクレオチド８７４７〜９０４６で示される異種ＤＮＡを含む。
ある実施形態において本発明は、ＢｖＦＴ２について上記した本発明のキメラ構築物に関し、ここで前記キメラ構築物に含まれる前記異種ＤＮＡは、プロモーターとターミネーターとの間に挿入され、ここで前記異種ＤＮＡは：
ａ．ヌクレオチド配列５’−ＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＣＡＡＴＧ−３’（配列番号４４）を有する順方向プライマーＨｉＮＫ６３８２、及びヌクレオチド配列５’−ＧＴＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＴＡＴＧ−３’（配列番号４５）を有する逆方向プライマーＨｉＮＫ６３８４、並びに鋳型としてサトウダイコンｃＤＮＡを使用して、ＰＣＲ反応でＢｖＦＴ２遺伝子のエクソン４から得られる０．２７ＫｂのｃＤＮＡ断片を増幅し、ここでサトウダイコンｃＤＮＡは、ヌクレオチド配列５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴ１２ＶＮ−３’（配列番号３３）を有する３’ＲＡＣＥアダプターをプライマーとして使用して、逆転写酵素反応で、サトウダイコンの葉から抽出された総ＲＮＡから得られ；
ｂ．ヌクレオチド配列５’−ＣＡＴＡＧＣＡＧＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号４６）を有する順方向プライマーＨｉＮＫ６３８３、及びヌクレオチド配列５’−ＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＧＧＡＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡ−３’（配列番号４０）を有する逆方向プライマーＨｉＮＫ５２９、並びに鋳型としてジャガイモＳｔ−ＬＳ１イントロンを含有するジャガイモＤＮＡを使用して、Ｓｔ−ＬＳ１イントロンと隣接するスプライシング部位とを含む０．１９Ｋｂの断片を増幅し；
ｃ．プライマーＨｉＮＨ６３８２及びＨｉＮＫ５２９を使用し、工程ａ）とｂ）で得られた増幅生成物の両方を鋳型として使用する第２ラウンドのＰＣＲにより、工程ａ）とｂ）で得られた増幅生成物を互いに融合させて、長さ０．４７Ｋｂの融合生成物を得て；
ｄ．ヌクレオチド配列５’−ＴＡＡＡＴＣＣＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＴＡＴＧ−３’（配列番号４７）を有する順方向プライマーＨｉＮＫ６３８５、及びヌクレオチド配列５’−ＣＴＡＴＴＴＧＴＣＧＡＣＧＣＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＣ−３’（配列番号４８）を有する逆方向プライマーＨｉＮＫ６３８６、並びに鋳型として上記サブセクションａ）で得られたサトウダイコンｃＤＮＡを使用して、０．２７ＫｂのＢｖＦＴ２断片の２回目の増幅を行い；
ｅ．ＳａｃＩＩ制限部位で両方の断片を融合して、ジャガイモＳｔ−ＬＳ１遺伝子から、イントロンにより分離されたＢｖＦＴ２配列の逆方向反復を作成すること
によって得ることができる。
本発明のこの好適な実施形態の構築についての詳細は、以下の実施例７に概説される。ＳＴ−ＬＳ１遺伝子のイントロン配列は、当業者に既知の方法によりジャガイモＤＮＡから容易に得られる。異種ＤＮＡの構築に使用されるＳａｃII制限部位は、上記で概説した特異的プライマーを使用して導入される。
具体的な実施形態において、配列番号３３のヌクレオチド配列で示される配列を含む、ＢｖＦＴ２サイレンシングのための本発明のキメラ構築物が提供される。
本発明のさらに具体的な実施形態において、キメラ構築物中に含まれる逆方向反復は、構成的プロモーター、特にＣａＭＶプロモーターに作動可能に連結される。
上記の転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）又はＲＮＡｉを用いる遺伝子発現の抑制のためのコード配列の使用に加えて、非コード配列、特にプロモーター配列の使用が、遺伝子発現の下方制御のために報告されている。プロモーター配列を含有するｄｓＲＮＡのトランスジェニック発現は、標的プロモーター領域のデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）メチル化、及びそのプロモーターの同時サイレンシング（転写性遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）としても知られている工程）を引き起こす（ＭＥＴＴＥ ｅｔ ａｌ．，２０００；ＳＩＪＥＮ ｅｔ ａｌ．，２００１；ＨＥＩＬＥＲＳＩＧ ｅｔ ａｌ．，２００６）。そのアンチセンス、センス、又はｄｓＲＮＡ発現のための遺伝子カセットへのプロモーター断片の構築は、いくつかの植物種中の同種の遺伝子の転写を下方制御するのに有効であった。それぞれ配列番号５及び配列番号８に開示されたＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の両方のプロモーター領域の配列が、キメラ構築物の構築と、対応するＢｖＦＴホモログの以後の転写性遺伝子サイレンシングのために同様に利用できることを、当業者は理解し得る。
ＢｖＦＴ２の発現の抑制のためのさらに別の方法は、元々ＳＣＨＷＡＢ ｅｔ ａｌ．，（２００６）及びＡＬＶＡＲＥＺ ｅｔ ａｌ．，（２００６）に記載された人工的ｍＲＮＡの使用である。人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）は１本鎖の２１量体ＲＮＡであり、これは通常植物中に存在し、内因性ｍｉＲＮＡ前駆体からプロセシングされる。その配列は、２１量体が目的の標的遺伝子すなわち本発明のＢｖＦＴ２を特異的にサイレンシングするように、植物ｍｉＲＮＡ標的選択の決定要因に従って設計される。例えば、サトウダイコン中のＢｖＦＴ２の抑制のための手段としての人工ｍｉＲＮＡの使用及び設計に関するさらなる詳細は、Ｗｅｂ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｍｄ３．ｗｅｉｇｅｌｗｏｒｌｄ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｗｅｂａｐｐ．ｃｇｉ）を参照するＯＳＳＯＷＳＫＩ ｅｔ ａｌ．，（２００８）により提供される。
本発明により包含される、サトウダイコン中の内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現、量、活性、及び／又は機能を低下させるための方策のさらなる（非限定の）例は、以下である：
ＤＮＡ分子の挿入（挿入突然変異誘発）
別の好適な実施形態において、ＤＮＡ分子は、本発明のヌクレオチド配列の染色体コピー中に、又はその制御領域中に挿入される。好ましくは、かかるＤＮＡ分子は、植物細胞中で転位できる転位可能要素（例えば、Ａｃ／Ｄｓ、Ｅｍ／Ｓｐｍ、突然変異誘発遺伝子）を含む。あるいはＤＮＡ分子は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｔ−ＤＮＡのＴ−ＤＮＡボーダー（ｂｏｒｄｅｒ）を含む。ＤＮＡ分子はまた、植物細胞の染色体からＤＮＡ分子の一部を除去するのに使用できる、リコンビナーゼ又はインテグラーゼ認識部位を含んでよい。Ｔ−ＤＮＡ、トランスポゾン、オリゴヌクレオチドを使用する挿入突然変異誘発法、又は当業者に公知の他の方法も包含される。挿入突然変異誘発のためにＴ−ＤＮＡ及びトランスポゾンを使用する方法は、ＷＩＮＫＬＥＲ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８２：１２９−１３６、及びＭＡＲＴＩＥＮＳＳＥＮ（１９９８）ＰＮＡＳ ９５：２０２１−２０２６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。さらに適切な方法は、例えば植物にＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドを導入することによる、内因性標的遺伝子へのナンセンス変異の導入である（ＺＨＵ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８（５）：５５５−５５８）。点突然変異はまた、「キメラプラスティ（ｃｈｉｍｅｒａｐｌａｓｔｙ）」としても知られているＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを用いて作成することもできる（ＣＯＬＥ−ＳＴＲＡＵＳＳ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７（５）：１３２３−１３３０；ＫＭＩＥＣ（１９９９）Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ８７（３）：２４０−２４７）。
欠失変異
さらに別の実施形態において、本発明の核酸分子の変異は、ヌクレオチド配列の一部又はレギュレーター配列の欠失により、細胞又は植物中の配列のゲノムコピー中に作成される。欠失突然変異誘発の方法は当業者に既知である。例えばＭＩＡＯ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｊ．７：３５９を参照されたい。標的遺伝子の発現の活性又は量はまた、標的遺伝子中の標的欠失によって、例えば標的遺伝子の核酸配列中又はその近くのＤＮＡ２本鎖切断の配列特異的誘導のための認識配列における、ＤＮＡ２本鎖切断の配列特異的誘導によって低下される。
さらに別の実施形態において、この欠失は、化学的突然変異誘発又は放射線照射によって、大きな植物集団中にランダムに作成され、本発明の遺伝子中に欠失を有する植物は、順遺伝学的方法又は逆遺伝学的方法により単離される。高速中性子又はガンマ線照射は、植物の欠失変異を引き起こすことが知られている（ＳＩＬＶＥＲＳＴＯＮＥ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１０：１５５−１６９；ＢＲＵＧＧＥＭＡＮＮ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１０：７５５−７６０；ＲＥＤＥＩ ＆ａ ＫＯＮＣＺ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９２），ｐｐ．１６−８２）。本発明の遺伝子中の欠失変異は、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）で証明されているように、プールされたセットのゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲを使用する逆遺伝学的方法で回収することができる（ＬＩＵ ｅｔ ａｌ．，（１９９９），Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９：８５９−８６７）。順遺伝学的方法は、ＰＴＧＳを示す系統の突然変異誘発と、その後のＰＴＧＳの不在についてのＭ２後代のスクリーニングとを含む。これらの変異体中には、本発明の遺伝子を破壊するものがあることが予測される。これは、これらの変異体からのゲノムＤＮＡを用いて、本発明の遺伝子についてサザンブロッティング又はＰＣＲを行うことにより評価され得る。
上記変異の導入法に加えて、目的の遺伝子のヌル又はノックアウト対立遺伝子の作成のために多くの突然変異誘発法が利用できることを、当業者は理解し得る。これらの方法は、その物理的性質と突然変異誘発作用により分類することができる。ガンマ線照射と高速中性子照射は染色体を破断させ、通常、転座や欠失を引き起こすが、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）はグアニン塩基のアルキル化により転移を誘導するために極めて効率的である。ゲノムに誘導した局所的損傷部位のターゲティング（ＴＩＬＬＩＮＧ）法は、ある配列内の点突然変異についてスクリーニングされる突然変異誘発された植物の大集団を利用する（ＭｃＣＡＬＬＵＭ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。近年サトウダイコンを含むいくつかの主要な作物種について、ＴＩＬＬＩＮＧプロジェクトの使用開始が成功している（ＨＯＨＭＡＮＮ ｅｔ ａｌ．，２００５）。目的の遺伝子のクローニングと配列解析により、ＴＩＬＬＩＮＧのような標的化突然変異誘発法が、これらの遺伝子の変異対立遺伝子の供給源として利用可能になった。
さらに別の実施形態において、植物のすべての細胞で本発明のヌクレオチド配列の発現が変更される。これは例えば、相同的組換えにより又は染色体への挿入により行われる。これはまた、例えば植物のすべての細胞中でセンス若しくはアンチセンスＲＮＡ、ジンクフィンガータンパク質、又はリボザイムを発現できるプロモーターの制御下で、センス若しくはアンチセンスＲＮＡ、ジンクフィンガータンパク質、又はリボザイムを発現することにより行われる。センス若しくはアンチセンスＲＮＡ、ジンクフィンガータンパク質、又はリボザイムの発現のための、又は本発明のヌクレオチド配列の過剰発現のための構築物が調製され、本発明の教示（例えば後述されるもの）に従って植物細胞中に形質転換される。
組合せ適用も考えられる。さらなる方法が当業者に既知であり、標的遺伝子のプロセシングの妨害若しくは停止、標的遺伝子又はそのｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の輸送、リボソーム結合の阻害、ＲＮＡスプライシングの阻害、標的遺伝子ＲＮＡを分解する酵素の誘導、及び／又は翻訳伸長若しくは停止の阻害を含んでよい。
さらにある態様において、サトウダイコン中の内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現のトランスジェニック上方制御のために、本発明のキメラ構築物が提供される。
内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現の上方制御は、生長するサトウダイコン植物中の春化応答の遅延につながり、サトウダイコン植物の非抽薹表現型を引き起こし、これは、サトウダイコン植物が抽薹と以後の開花により、１８時間の典型的な春化期間にもはや応答せず、反対に栄養生長（非抽薹）を続け、正常な主根が生長することを意味する。前記遅延春化応答又は前記非抽薹表現型を示す植物は、標準化生長条件を利用する表現型解析実験を適用することにより、容易に同定され、且つ選択され得る。
本発明は、サトウダイコン中の内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現、量、活性、及び／又は機能を上昇させる種々の方法を含む。多くの異なる方法が、植物中の標的遺伝子の発現を上方制御し、又は所望の方法で植物の遺伝子の量、活性、及び／又は機能に影響を与えるために利用できるという事実を当業者は理解している。この関連で用語「上方制御」は、過剰発現を含むと考えるべきであることに注意されたい。
本態様のある実施形態において、内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現のトランスジェニック上方制御のための本発明のキメラ構築物は、ＢｖＦＴ１遺伝子若しくはその一部をコードするヌクレオチド配列を含み、ＢｖＦＴ１遺伝子若しくはその一部をコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号５又は６に記載の本発明の核酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するか、又はこれにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、ここでＢｖＦＴ１遺伝子又はその一部をコードする前記ヌクレオチド配列は、植物中で発現されると、内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現の上方制御が引き起こされるように、制御配列に作動可能に連結される。
さらなる実施形態において、本発明のキメラ構築物中に含まれるＢｖＦＴ１遺伝子又はその一部をコードする核酸配列と、配列番号５又は６に記載の本発明の核酸配列との配列同一性は、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは少なくとも９５％同一である。
別の好適な実施形態において本発明は、配列番号６に記載のサトウダイコンのＢｖＦＴ１遺伝子のコード配列である。キメラ構築物に含まれるＢｖＦＴ１遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列はまた、配列番号３４のヌクレオチド２０７６〜２６１５で示される。
さらに別の実施形態において、上記の内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現のトランスジェニック上方制御のための本発明のキメラ構築物は、配列番号３４に記載のヌクレオチド配列を含む。
好ましくは、内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現のトランスジェニック上方制御のための本発明のキメラ構築物に含まれる異種ＤＮＡは、構成的プロモーター、好ましくはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＵｂｉ３プロモーターに作動可能に連結される。
適切な植物組織中でトランス遺伝子発現の充分なレベルを得ることは、遺伝子工学的に作成された作物の生産における重要な側面である。植物宿主中の異種ＤＮＡ配列の発現は、植物宿主内で機能する作動可能に連結されたプロモーターの存在に依存する。プロモーター配列の選択は、異種ＤＮＡ配列がいつ生物内のどこで発現されるかを決定するであろう。
異なるプロモーターが、異なる組織又は細胞タイプ中の、又は生長の異なる段階での、又は異なる環境条件に応答する、遺伝子の発現を指令し得る。植物細胞で有用な種々のタイプの新しいプロモーターが絶えず発見されており、多くの例がＯＫＡＭＵＲＯ ｅｔ ａｌ．（１９８９）による編集物中に存在する。植物中で有用な典型的な制御プロモーターには、特に限定されないが、緩和剤誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性システムから得られるプロモーター、サリチレート誘導性システムから得られるプロモーター、アルコール誘導性システムから得られるプロモーター、糖質コルチコイド誘導性システムから得られるプロモーター、病原体誘導性システムから得られるプロモーター、及びエクジソン誘導性システムから得られるプロモーターがある。例えば再生植物のすべての組織中の遺伝子の発現を指令する植物プロモーター断片が使用され得る。かかるプロモーターは本明細書において「構成性」プロモーターと呼ばれ、最も多くの環境条件下、生長段階、又は細胞分化期において活性である。
構成的プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴ−ＤＮＡから得られる１’−若しくは２’−プロモーター、及び当業者に公知の種々の植物遺伝子からの他の転写開始領域がある。かかる遺伝子には、例えばＡＰ２遺伝子、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＡＣＴ１１（ＨＵＡＮＧ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：１２５−１３９）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＣａｔ３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｕ４３１４７，ＺＨＯＮＧ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．２５１：１９６−２０３）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）のステアロイル−アシルキャリアータンパク質デサチュラーゼをコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．Ｘ７４７８２，ＳＯＬＯＣＯＭＢＥ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１１６７−１１７６）、トウモロコシのＧＰｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ１５５９６，ＭＡＲＴＩＮＥＺ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２０８：５５１−５６５）、及サトウダイコンモロコシのＧｐｃ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｕ４５８５５，ＭＡＮＪＵＮＡＴＨ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：９７−１１２）がある。
あるいは、植物プロモーターは、特定の組織中で本発明の核酸分子又はキメラ構築物の発現を指令するか、又はより正確な環境若しくは生長制御下にあってもよい。誘導性プロモーターにより転写に影響を与える環境条件の例には、嫌気的条件、高温、又は光の存在がある。かかるプロモーターは、本明細書において「誘導性」又は「組織特異的」プロモーターと呼ばれる。組織特異的プロモーターが、標的組織以外の組織中で作動可能に連結された配列の発現を指令することを、当業者は認識し得る。したがって本明細書において、組織特異的プロモーターは、標的組織中で優先的に発現を指令するものであるが、同様に他の組織中でのある程度の発現も、もたらし得る。
生長制御下のプロモーターの例は、ある組織、例えば果実、胚珠、種子、又は花中でのみ（又は主に）転写を指令するプロモーターを含む。本明細書において、種子特異的又は優先的プロモーターは、種子組織中で特異的又は優先的に発現を指令するものであり、かかるプロモーターは、例えば胚珠特異的、胚特異的、内胚乳特異的、珠皮特異的、種皮特異的、又はこれらの組合せでもよい。例としては、ＲＥＩＳＥＲ ｅｔ ａｌ．（１９９５）（Ｃｅｌｌ ８３：７３５−７４２；ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｕ３９９４４）に記載のＢＥＬ１遺伝子のプロモーターがある。他の適切な種子特異的プロモーターは、以下の遺伝子から得られる：トウモロコシからのＭＡＣ１（ＳＨＥＲＩＤＡＮ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４２：１００９−１０２０（１９９６）、トウモロコシからのＣａｔ３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ０５９３４，ＡＢＬＥＲ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２２：１０１３１−１０３８）、トウモロコシからのオレオシン１８ｋＤをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ，Ｊ０５２１２，ＬＥＥ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：１９８１−１９８７）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からのｖｉｖｐａｒｏｕｓ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．Ｕ９３２１５）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からのオレオシンをコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．Ｚ１７６５７）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からのＡｔｍｙｃｌ（ＵＲＡＯ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：５７１−５７６）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からの２ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子ファミリー（ＣＯＮＣＥＩＣＡＯ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ ５：４９３−５０５）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）からのオレオシン２０ｋＤをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｍ６３９８５）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）からのｎａｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｊ０２７９８，ＪＯＳＥＦＳＳＯＮ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＪＢＬ ２６：１２１９６−１３０１）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）からのナピン遺伝子ファミリー（ＳＪＯＤＡＨＬ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔａ １９７：２６４−２７１）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）からの２Ｓ貯蔵タンパク質（ＤＡＳＧＵＰＴＡ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｅ １３３：３０１−３０２）、大豆からのオレオシンＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．Ｕ０９１１８）とオレオシンＢをコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．Ｕ０９１１９）、及び大豆からの低分子量硫黄リッチタンパク質をコードする遺伝子（ＣＨＯＩ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ Ｇｅｎ，Ｇｅｎｅｔ．２４６：２６６−２６８）。
用語「プロモーター」はさらに、ＴＡＴＡボックス、及び転写開始部位を特定するために役立つ他の配列を含む、短いＤＮＡ配列である最小プロモーターを含み、それに、発現の制御のために調節エレメントが加えられる。「プロモーター」はまた、最小プロモーター、及び機能性ＲＮＡのコード配列の発現を制御できる調節エレメントを含むヌクレオチド配列を意味する。このタイプのプロモーター配列は、近傍の及びより遠くの上流要素からなり、後者の要素は通常、エンハンサーと呼ばれる。従って「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激できるＤＮＡ配列であり、プロモーターのレベル若しくは組織特異性を増強するために挿入される、プロモーターの固有の要素又は異種要素であり得る。これは両方の方向（正常又は反転）で作用することができ、プロモーターから上流へ又は下流へ移動しても機能することができる。エンハンサーと他の上流プロモーター要素の両方は、これらの作用を仲介する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に結合する。プロモーターは天然の遺伝子から完全に得られるか、又は天然に存在する異なるプロモーターから得られる異なる要素を含むか、又はさらには合成ＤＮＡセグメントを含む。プロモーターはまた、生理学的又は生長条件に応答して、転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列を含有し得る。
「開始部位」は、転写配列の一部である第１のヌクレオチドの周りの位置であり、これはまた位置＋１と定義される。この部位に関して、遺伝子とその制御領域のすべての他の配列に番号が付けられる。下流の配列（すなわち、３’方向にタンパク質をコードするさらなる配列）は＋とされ、上流配列（ほとんど５’方向への制御領域）は−とされる。上流の活性化の非存在下では不活性化であるか又は大幅に低いプロモーター活性を有するプロモーター要素、特にＴＡＴＡ要素は、「最小プロモーター又はコアプロモーター」と呼ばれる。適切な転写因子の存在下では、最小プロモーターは転写を可能にするように機能する。すなわち「最小プロモーター又はコアプロモーター」は、転写開始に必要なすべての基本的要素、例えばＴＡＴＡボックス、及び／又はイニシエーターのみからなる。
あるいは、所望の発現特性を有するプロモーターを提供する特定の配列、又は発現増強活性を有するプロモーターを提供するに具体的な配列が特定され、これらの若しくは類似の配列が変異を介して配列中に導入される。特定の種中のトランス遺伝子の発現を増強するために、これらの配列を突然変異誘発できることがさらに企図される。
さらに、２個以上のプロモーターからの要素を組み合わせるプロモーターが有用であり得ることが企図される。例えば米国特許第５，４９１，２８８号は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーターをヒストンプロモーターと組み合わせることを開示している。したがって、本明細書に開示のプロモーターからの要素は、他のプロモーターからの要素と組み合わされ得る。
種々の５’及び３’転写制御配列が本発明で利用できる。転写ターミネーターは転写の停止に関与し、ｍＲＮＡポリアデニル化を修正する。３’非翻訳制御性ＤＮＡ配列は、好ましくは約５０〜約１，０００、さらに好ましくは約１００〜約１，０００のヌクレオチド塩基対を含み、植物の転写と翻訳停止配列を含有する。適切な転写ターミネーターと植物中で機能することが知られているものには、ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター、ｔｍｌターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーター、エンドウマメｒｂｃＳ Ｅ９ターミネーター、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のオクトピンシンターゼ遺伝子からのＴ７転写物のターミネーター、及びジャガイモ又はトマトからのプロテアーゼインヒビターＩ若しくはＩＩ遺伝子の３’末端があるが、当業者に既知の他の３’要素も使用することができる。あるいは、ガンマコイキシン、オレオシン３、又はＣｏｉｘ属の他のターミネーターを使用することもできる。好適な３’要素には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリンシンターゼ遺伝子からのもの（ＢＥＶＡＮ ｅｔ ａｌ．， １９８３）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のオクトピンシンターゼ遺伝子からのＴ７転写物のターミネーター、及びジャガイモ若しくはトマトからのプロテアーゼインヒビターI若しくはII遺伝子の３’末端がある。
転写開始部位とコード配列の開始点の間のＤＮＡ配列、すなわち非翻訳リーダー配列は、遺伝子発現に影響を与えるため、特定のリーダー配列を使用したいことがある。好適なリーダー配列には、結合した遺伝子の最適発現を指令することが予測される配列を含むもの、すなわちｍＲＮＡ安定性を上昇若しくは維持する好適なコンセンサスリーダー配列があることが企図される。かかる配列の選択は本開示から当業者に既知であり得る。植物中で高度に発現される遺伝子から得られる配列が、最も好ましいものであり得る。
トランスジェニック植物中で遺伝子発現を増強することがわかっている他の配列は、イントロン配列（例えばＡｄｈ１、ブロンズ１、アクチン１、アクチン２（ＷＯ００／７６００６７）、又はショ糖シンターゼイントロン）、及びウイルスリーダー配列（例えば、ＴＭＶ、ＭＣＭＶ、及びＡＭＶ）を含む。例えば、ウイルスから得られる多くの非翻訳リーダー配列が、発現を増強することが知られている。特にタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トウモロコシクロロティックモットルウイルス（ＭＣＭＶ）、及びアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）は、発現を増強するのに有効であることが証明されている（例えば、ＧＡＬＬＩＥ ｅｔ ａｌ．，１９８７；ＳＫＵＺＥＳＫＩ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。当該分野で既知の他のリーダーには、特に限定されないが以下がある：ピコルナウイルスリーダー、例えばＥＭＣＶリーダー（脳脊髄炎５非コード領域）（ＥＬＲＯＹ−ＳＴＥＩＮ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；ポチウイルスリーダー、例えばＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス）；ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシドワーフモザイクウイルス）；ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）リーダー（ＭＡＣＥＪＡＫ ｅｔ ａｌ．，１９９１）；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡからの非翻訳リーダー（ＡＭＶＲＮＡ４）、（ＪＯＢＬＩＮＧ ｅｔ ａｌ．，１９８７；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（ＧＡＬＬＩＥ ｅｔ ａｌ．，１９８９；及サトウダイコンモロコシクロロティックモットルウイルス（ＭＣＭＶ）（ＬＯＭＭＥＬ ｅｔ ａｌ．，１９９１。またＤＥＬＬＡ−ＣＩＯＰＰＡ ｅｔ ａｌ．，１９８７も参照）。
Ａｄｈイントロン１のような調節エレメント（ＣＡＬＬＩＳ ｅｔ ａｌ．， １９８７）、ショ糖シンターゼイントロン（ＶＡＳＩＬ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、又はＴＭＶオメガ要素（ＧＡＬＬＩＥ ｅｔ ａｌ．， １９８９）は、所望であればさらに含まれる。
エンハンサーの例には、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、オクトピンシンターゼ遺伝子（ＥＬＬＩＳ ｅｌ ａｌ．，１９８７）、コメアクチンＩ遺伝子、トウモロコシアルコール脱水素酵素遺伝子（ＣＡＬＬＩＳ ｅｔ ａｌ．，１９８７）、トウモロコシｓｈｒｕｎｋｅｎ Ｉ遺伝子（ＶＡＳＩＬ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、ＴＭＶオメガ要素（ＧＡＬＬＩＥ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、及び非植物真核生物からのプロモーター（例えば酵母；ＭＡ ｅｔ ａｌ．，１９８８）がある。
いったん完了すると、発現カセット（例えば、ＢｖＦＴ２のＲＮＡｉカセット）を含む本発明のキメラ構築物は、植物形質転換に適したベクター（例えば、バイナリーベクター）中に動員され、これは次に既知の形質転換法の１つ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介性形質転換を使用して、サトウダイコンに動員される。
さらなる態様において、本発明は、上記の本発明の核酸及び／又は本発明のキメラ構築物を含む植物形質転換ベクター及び／又は植物発現ベクターを提供する。
かかるベクターにおいて、核酸は好ましくは、ヌクレオチド配列を発現することができる宿主細胞中における、ヌクレオチド配列の発現のための調節エレメントを含む発現カセットに含まれる。かかる調節エレメントは通常、プロモーター及び停止シグナルを含み、好ましくは本発明の核酸によりコードされるポリペプチドの効率的翻訳を可能にする要素も含む。
さらに別の実施形態において、かかるベクターはウイルスベクターであり、特に宿主細胞（例えば植物細胞）中でのヌクレオチド配列の複製のために使用される。
組換えベクターはまた、宿主細胞への本発明のヌクレオチド配列の形質転換のために使用され、それにより、ヌクレオチド配列は、トランスジェニック宿主のＤＮＡ中に安定に組み込まれる。
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌種のＴｉ及びＲｉプラスミドのバイナリー型ベクターを使用することが、特に好ましい。Ｔｉ由来ベクターは、単子葉植物及び双子葉植物を含む広範囲の高等植物、例えばサトウダイコン、大豆、綿、菜種、及び米を形質転換する（ＰＡＣＣＩＯＴＴＩ ｅｔ ａｌ．， １９８５： ＢＹＲＮＥ ｅｔ ａｌ．， １９８７； ＳＵＫＨＡＰＩＮＤＡ ｅｔ ａｌ．， １９８７； ＬＯＲＺ ｅｔ ａｌ．， １９８５； ＰＯＴＲＹＫＵＳ， １９８５； ＰＡＲＫ ｅｔ ａｌ．， １９８５： ＨＩＥＩ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。植物細胞を形質転換するためのＴ−ＤＮＡの使用は広く研究されており、充分に報告されている（ＥＰ１２０５１６；ＨＯＥＫＥＭＡ，１９８５；ＫＮＡＵＦ，ｅｔ ａｌ．，１９８３；及びＡＮ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。植物への導入のために、本発明のキメラ構築物は、実施例に記載のようにバイナリーベクター中に挿入される。
この態様のある好適な実施形態において、植物形質転換ベクターは、上記した本発明のキメラ構築物を含むＲＮＡｉ発現ベクターである。好ましくは、ＲＮＡｉ発現ベクターは、配列番号３３に記載のヌクレオチド配列を有するキメラ構築物を含む。このＲＮＡｉ発現地図のプラスミド地図は、図１５に示される。
さらなる実施形態において、植物形質転換ベクターは、本発明のキメラ構築物を含む植物発現ベクターである。好ましくは、発現ベクターは、配列番号３４に記載のヌクレオチド配列を有するキメラ構築物を含む。このＲＮＡｉ発現地図のプラスミド地図は、図１８に示される。
本発明の植物形質転換ベクター又は植物発現ベクターはまた、２個以上のキメラ構築物を含むことを、当業者は理解し得る。そのような植物形質転換ベクター又は植物発現ベクターを使用することにより、２個以上のヌクレオチド配列を植物中に導入することができる。すなわち、例えば同じベクター内で、１つ又はそれ以上の遺伝子の発現の上方制御のための２個又はそれ以上のキメラ構築物を挿入することができる（例えばこれらの１つ又はそれ以上は、ＢｖＦＴ１の発現の調節のための本発明のキメラ構築物である）。
別の実施形態において、１つ又はそれ以上の遺伝子の発現の下方制御又は抑制のための、２個又はそれ以上のキメラ構築物が、挿入され得る（例えばこれらの１つ又はそれ以上は、ＢｖＦＴ２の発現の調節のための本発明のキメラ構築物である）。１又はそれ以上のある遺伝子（例えばＢｖＦＴ１）の発現の上方制御のためのキメラ構築物、及びある遺伝子（例えばＢｖＦＴ２）の発現の下方制御のためのキメラ構築物はまた、同じベクター中に導入することができる。本発明のキメラ構築物はさらに、サトウダイコンの開花応答に影響を与える他の遺伝子の発現を調節するキメラ構築物と積層することができる。これは後に概説される。
本発明に関連して示されるように、ベータＦＴホモログの発現レベルを調節又は制御することは、抽薹耐性の改変を可能にする。しかし、抽薹耐性サトウダイコンは、抽薹の欠如のために種子を生産せず、花が咲かない。本発明の抽薹耐性サトウダイコン植物を維持、増殖、そして販売するために、ＢｖＦＴ１の過剰発現及び／又はＢｖＦＴ２の発現の下方制御により、ベータＦＴホモログの発現を調節することは、条件的又は潜伏的であることが必要である。当業者は、トランス遺伝子の発現を制御するシステム（例えば特に限定されないが、誘導性プロモーターに基づくアクチベーターシステム又は標的化組換えの使用）を理解している。
さらに、２成分トランス活性化システムが、植物中の遺伝子発現の条件的制御のためにすでに記載されている。これらのシステムにおいて転写因子は、下流の遺伝子の転写を行うこれらの同種のプロモーターを認識する（ＧＵＹＥＲ ｅｔ ａｌ．，１９９８；ＭＯＯＲＥ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。サトウダイコンにおける本発明のキメラ構築物の発現の条件的制御のためのｐＯｐ６／ＬｈＧ４システムの適用が、後述の実施例８で詳述される。ｐＯｐ６／ＬｈＧ４システムはキメラ転写因子ＬｈＧ４を含み、ここでＧａｌ４のトランス活性化ドメインＩＩは、ｌａｃリプレッサーの高親和性ＤＮＡ結合性変異体に融合される。これは、最小ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの上流に最適化ｌａｃオペレーターの６個のコピーを有するｐＯｐ６のようなプロモーターからの転写を活性化する（ＲＵＴＨＥＲＦＯＲＤ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ｐＯｐ６／ＬｈＧ４トランス活性化システムが機能するトランスジェニックイベントの作成及び選択を促進する目的で、ＰＭＩ選択マーカー遺伝子は、ｐＯｐ６プロモーターの下流にクローン化され、同じＴ−ＤＮＡ上でシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からのＵｂｉ３プロモーター（ＮＯＲＲＩＳ ｅｔ ａｌ．， １９９３）の制御下で、ＬｈＧ４Ａｔｏ（ＲＵＴＨＥＲＦＯＲＤ ｅｔ ａｌ．， ２００５）の構成性発現のための遺伝子カセットと結合させた。
ベータＦＴホモログの条件的発現のための第２の遺伝子要素は、ｐＯｐ６プロモーターの制御下の１つ又は２つのＢｖＦＴ遺伝子の遺伝子カセットからなる。これらの２つのバイナリーベクターのサトウダイコンへの形質転換と、ＬｈＧ４ハイブリッド転写因子を発現する「アクチベーター」イベントへの得られたイベントの以後の交配は、本発明のＢｖＦＴキメラ構築物の転写を引き起こし、制御された方法で抽薹耐性を付与する。商業的応用のために、両方の遺伝子要素は典型的には、ハイブリッド種子の生産のために使用されるいずれかの親系統中において、ホモ接合性状態で存在する。雄と雌の親系統の交配により、得られるハイブリッド種子は、ヘテロ接合性状態で両方の遺伝子要素のコピーを遺伝しており、本発明のＢｖＦＴキメラ構築物のトランス活性化の成功と抽薹耐性な商業的ハイブリッドを与える。
すなわち、さらに好適な実施形態において本発明は、反応キメラ構築物の発現の遺伝的制御のためのベクターを与える。このようなベクターの非限定例は、実施例９とさらに配列番号５３、５４、及び５４に記載され、図２０、２１、及び２２にも示される。本発明はさらに、本発明のキメラ構築物の発現のトランス活性化制御に必要な１つ又は両方のベクターを含むトランスジェニック・サトウダイコン植物を与える。好ましくは、トランス活性化制御に必要なベクターは、ｐＯｐ／ＬｈＧ４又はｐＯｐ６／ＬｈＧ４トランス活性化システムに属するベクターである。別の好適な実施形態において、本発明は、本発明のキメラ構築物の発現がトランス活性化システム、好ましくはｐＯｐ／ＬｈＧ４又はｐＯｐ６／ＬｈＧ４トランス活性化システムの使用により制御される、本発明のハイブリッド・サトウダイコン植物を与える。
本発明の核酸配列又はキメラ構築物を組み込んでおり、且つ発現するトランスジェニック植物（又は、植物細胞、又は植物外植片、又は植物組織）は、種々の確立された方法により生産される。本発明の、及び前記した核酸配列を含む本発明のキメラ構築物の構築後、標準的方法を使用して、キメラ構築物を目的の植物、植物細胞、植物外植片、又は植物組織に導入する。場合により、植物細胞、外植片、又は組織は再生されて、トランスジェニック植物を生産する。
サトウダイコン植物細胞の形質転換及び再生は現在日常的に行われ、最も適切な形質転換法の選択は実施者により決定される。適切な方法には、特に限定されないが、植物プロトプラストの電気穿孔法；リポソーム介在形質転換；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）介在形質転換；ウイルスを使用する形質転換；植物細胞の微量注入法；植物細胞の微量射出衝撃；真空浸透；及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）介在形質転換を含み得る。植物の形質転換は、単一のＤＮＡ分子又は複数のＤＮＡ分子を用いて行うことができ（すなわち同時形質転換）、これら２つの方法は、本発明のキメラ構築物とともに使用するのに適している。植物形質転換のために多くの形質転換ベクターが利用でき、本発明の発現カセットをこのようなベクターとともに使用することができる。ベクターの選択は、好適な形質転換法と形質転換のための標的種に依存し得る。
植物細胞宿主への構築物の導入のために、種々の方法が利用でき、当業者に既知である。これらの方法には一般に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）若しくはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を形質転換物質として使用する、ＤＮＡを用いた形質転換、リポソーム、ＰＥＧ沈降、電気穿孔法、ＤＮＡ注入、直接ＤＮＡ取り込み、微量注入衝撃、粒子加速などがある（例えば、ＥＰ２９５９５９及びＥＰ１３８３４１を参照）（後述参照）。しかし、植物細胞以外の細胞は、本発明の核酸配列を含有する発現ベクター又はキメラ構築物を用いて形質転換され得る。植物発現ベクター及びレポーター遺伝子、及びアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、及びアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介在遺伝子輸送の一般的説明は、ＧＲＵＢＥＲ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）に記載されている。
本発明の核酸配列を含有する発現ベクター又はキメラ構築物は、プロトプラスト中に、又は無傷組織若しくは単離された細胞中に導入される。好ましくは、発現ベクターは無傷組織中に導入される。植物組織を培養する一般的方法は、例えばＭＡＫＩ ｅｔ ａｌ． （１９９３）とＰＨＩＬＬＩＰＳ ｅｔ ａｌ． （１９８８）に与えられる。好ましくは、発現ベクターは、微量注入送達、ＤＮＡ注入、電気穿孔法などの直接遺伝子輸送法を使用して、サトウダイコン又は他の植物組織中に導入される。さらに好ましくは、発現ベクターは、例えば遺伝子銃装置を用いる微量注入媒体送達を使用して、植物組織中に導入される。例えばＴＯＭＥＳ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）参照。
本発明の主要な焦点は、サトウダイコンの形質転換である。サトウダイコンの形質転換の実験法は当業者に既知であり、例えば外植片物質としてサトウダイコン分裂組織を使用するＣＨＡＮＧ ｅｔ ａｌ．（２００２）による方法、又はＪＯＥＲＳＢＯ ｅｔ ａｌ．（１９９８）による方法がある。
本発明のキメラ構築物を用いる遺伝子型Ｇ０１８の一年生及び二年生サトウダイコンの形質転換のための実験法は、基本的にサトウダイコン分裂組織組織を外植片物質として使用し、ＷＯ９４／２０６２７に記載のように、選択マーカーとしてのホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子と一緒に、マンノース−６−ホスフェートを選択物質として使用する、ＷＯ０２／１４５２３に記載の複数苗条プロトコールであった（実施例７と８に示される）。トランスジェニック苗条を、例えばＰＭＩ活性のような選択マーカーの発現についてチェックする（ＪＯＥＲＳＢＯ ｅｔ ａｌ．１９９８）。陽性苗条と非トランスジェニック対照を根付かせ、温室に移し、１８℃で少なくとも２週間馴化期間を経た後、春化処理を行う。充分に樹立されたら、トランスジェニック植物に春化処理を行う。次に植物を植え換えて大きな鉢（２リットル）に入れ、抽薹を追跡する（例えば実施例７を参照）。
さらに、目的の形質が、導入された本発明の核酸配列の発現によるものであることを確認するために、目的の遺伝子（すなわち、ＢｖＦＴ１若しくはＢｖＦＴ２、又は両方）の発現レベル又は活性を、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、若しくはマイクロアレイを使用してｍＲＮＡ発現を分析することにより、又は免疫ブロット若しくはゲルシフトアッセイを使用してタンパク質発現を分析することにより測定される。
すなわち本発明は、トランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子を含み、ここで内因性ＢｖＦＴ１遺伝子及び／又はＢｖＦＴ２遺伝子の発現は調節され、より具体的には、ここで内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現は下方制御されるか若しくは抑制され、又はここで内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現は上方制御されるか、或いは、ここで内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現が下方制御されるか若しくは抑制され、及び内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現は上方制御される。
ＢｖＦＴ２に関して、サトウダイコン中の内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現の下方制御は、生長しているサトウダイコン植物中で春化応答を遅延させるか、又はサトウダイコン植物の非抽薹表現型への進展を引き起こし、これは、サトウダイコン植物が抽薹と以後の開花により、１８週間の典型的な春化期間にもはや応答せず、その反対に栄養生長（非抽薹）を続け、正常な主根を生長させることを意味する。前記遅延春化応答又は前記非抽薹表現型を示す植物は、標準化生長条件を利用する表現型解析実験を適用することにより、容易に同定され、且つ選択される。
この態様のある好適な実施形態において、トランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子が提供され、ここで内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現は、ｄｓＲＮＡ、アンチセンス抑制、又はコサプレッション（好ましくはｄｓＲＮＡによる）により下方制御される。
したがって、好適な実施形態において、本発明のキメラ構築物又は本発明の核酸配列を含む本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子が提供され、ここで前記トランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子は本発明のｄｓＲＮＡを発現し、抽薹耐性であり、遅延抽薹の表現型、好ましくは非抽薹表現型を示す。
さらなる実施形態において、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子が提供され、ここで前記植物に導入される異種ＤＮＡは、ヌクレオチド配列５’−ＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＣＡＡＴＧ−３’（配列番号４４）を有する順方向プライマーＨｉＮＫ６３８２、及びヌクレオチド配列５’−ＧＴＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＴＡＴＧ−３’（配列番号４５）を有する逆方向プライマーＨｉＮＫ６３８４を使用するＰＣＲ反応において、上記したＢｖＦＴ２遺伝子のエクソン４からなる０．２７ＫｂのｃＤＮＡ断片から得られる。
さらに具体的な実施形態において、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子は、配列番号３３のヌクレオチド８７４７〜９０４６で示される異種ＤＮＡを含む。
さらに別の具体的な実施形態において、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子は異種遺伝子構築物を含み、これは、転写されると、前記第１及び第２のＲＮＡ鎖を含む前記植物細胞中で２本鎖ＲＮＡ分子を形成する逆方向反復を含み、ここで前記２本鎖ＲＮＡ分子はＢｖＦＴ２遺伝子サイレンシングを引き起こす。
本発明の具体的な実施形態において、プロモーターとターミネーターとの間に挿入された、ＢｖＦＴ２のための異種ＤＮＡを含むトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子が提供され、ここで異種ＤＮＡは：
ａ）ヌクレオチド配列５’−ＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＣＡＡＴＧ−３’（配列番号４４）を有する順方向プライマーＨｉＮＫ６３８２と、ヌクレオチド配列５’−ＧＴＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＴＡＴＧ−３’（配列番号４５）を有する逆方向プライマーＨｉＮＫ６３８４とを使用し、サトウダイコンｃＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲ反応で、ＢｖＦＴ２遺伝子のエクソン４から得られる０．２７ＫｂのｃＤＮＡ断片を増幅し、ここで、サトウダイコンｃＤＮＡは、プライマーとしてヌクレオチド配列５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴ１２ＶＮ−３’（配列番号３５）を有する３’ＲＡＣＥアダプターを使用する逆転写反応で、サトウダイコンの葉から抽出された総ＲＮＡから得られ；
ｂ）ヌクレオチド配列５’−ＣＡＴＡＧＣＡＧＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号４６）を有する順方向プライマーＨｉＮＫ６３８３、及びヌクレオチド配列５’−ＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＧＧＡＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡ−３’（配列番号４０）を有する逆方向プライマーＨｉＮＫ５２９、並びに鋳型としてジャガイモＳｔ−ＬＳ１イントロンを含有するジャガイモＤＮＡとを使用して、ＳＴ−ＬＳ１イントロン及び隣接するスプライシング部位を含む０．１９Ｋｂの断片を増幅し；
ｃ）プライマーＨｉＮＨ６３８２及びＨｉＮＫ５２９を使用する２回目のＰＣＲにより、かつ工程ａ）とｂ）で得られる増幅生成物を鋳型として使用して、両方の増幅生成物を互いに融合させて、長さ０．４７Ｋｂの融合生成物を得て；
ｄ）ヌクレオチド配列５’−ＴＡＡＡＴＣＣＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＴＡＴＧ−３’（配列番号４７）を有する順方向プライマーＨｉＮＫ６３８５、及びヌクレオチド配列５’−ＣＴＡＴＴＴＧＴＣＧＡＣＧＣＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＣ−３’（配列番号４８）を有する逆方向プライマーＨｉＮＫ６３８６、並びに鋳型として上記サブセクションａ）で得られるサトウダイコンｃＤＮＡとを使用して、０．２７ＫｂのＢｖＦＴ２断片の２回目の増幅を行い；
ｅ）ＳａｃＩＩ制限部位で両方の断片を融合させて、ジャガイモＳＴ−ＬＳ１遺伝子からのイントロンにより分離されたＢｖＦＴ２配列の逆方向反復を作成すること
によって得られる。
別の具体的な実施形態において本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子は、ＢｖＦＴ２のための異種遺伝子構築物を含み、ここで前記遺伝子構築物は好ましくは、配列番号３２のヌクレオチド７３８８〜９７７９で示される発現カセットを含む。
本発明の別の具体的な実施形態において、本発明の及び上記した発現カセットを含む、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子が提供される。
ｄｓＲＮＡに加えて、上で概説したサトウダイコン中の内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現、量、活性、及び／又は機能を低下させるための他の方法も使用される。
ＢｖＦＴ１に関して、内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現の上方制御は、生長しているサトウダイコン植物中で春化応答を遅延させるか、又はサトウダイコン植物の非抽薹表現型への進展を引き起こし、これは、サトウダイコン植物が抽薹と以後の開花により、１８週間の典型的な春化期間にもはや応答せず、その反対に栄養生長（非抽薹）を続け、正常な主根を生長させることを意味する。前記遅延春化応答又は前記非抽薹表現型を示す植物は、標準化生長条件を利用する表現型解析実験を適用することにより、容易に同定され、且つ選択される。
この態様のある好適な実施形態において、トランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子が提供され、ここで内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現は上方制御される。
したがって、好適な実施形態において、本発明のキメラ構築物又は本発明の核酸配列を含む本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子が提供され、ここで前記トランスジェニック・サトウダイコン植物において、内因性ＢｖＦＴ１は過剰発現され、植物は遅延抽薹の表現型、好ましくは非抽薹表現型を示す。
好ましくは、ＢｖＦＴ１を上方制御するためのサトウダイコン植物に導入されるＢｖＦＴ１遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６に記載のヌクレオチド配列を有する。
別の好適な実施形態において、ＢｖＦＴ１を上方制御するためのサトウダイコン植物に導入されるキメラ構築物は、配列番号３４のヌクレオチド２０７６〜２６１５で示されるヌクレオチド配列を含む。好ましくは、前記キメラ構築物は、配列番号３４に示されるヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態において、内因性ＢｖＦＴ２の発現を下方制御するか、又は内因性ＢｖＦＴ１の発現を上方制御することに加えて、開花応答に関与する１つ又はそれ以上の追加の遺伝子の発現が調節され、生長しているサトウダイコン植物の春化応答の遅延又は非抽薹表現型の付与について相乗作用が与えられる。このような追加の遺伝子の例は、後に概説される。
本発明のトランスジェニック植物又はその後代、ならびに本発明のハイブリッド・サトウダイコン植物（以下参照）はまた、その生産のために商業的に生長させた「栽培」植物でもよいと理解され得る。用語「栽培植物」は、生長目的に栽培され、選択的に育種された植物を含む。栽培植物は、天然の形質として、及び／又はその天然の遺伝の一部として、本発明の形質を含む野生型種を含まない。
さらなる実施形態において、本発明はまた、本発明の及び上記した細胞、組織、又は種子から得られるトランスジェニック・サトウダイコン植物を含む。
本発明の細胞、組織、又は種子から得られるこれらのトランスジェニック・サトウダイコン植物は非抽薹表現型を有し、これは、サトウダイコン植物が抽薹と以後の開花により、１８週間の典型的な春化期間にもう応答せず、その反対に栄養生長（非抽薹）を続け、普通の主根を生長させることを意味する。
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物の根に関する。特に根は、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物から採取される主根である。
さらに別の実施形態において、本発明は、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物の後代に関する。この関連で用語「後代」は、特定の交配の派生物、例えばＦ１、Ｆ２、又は任意の以後の世代を意味する。典型的には、後代は２つの個体の交配から生まれるが、後代はサトウダイコンの自殖からも生まれる（すなわち、同じ植物が雄配偶子と雌配偶子のドナーとして作用する）。後代という用語は、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物から得られる種子から生長させたサトウダイコンも含む。
より具体的には、本発明はまた、非抽薹表現型を有する本発明の及び上記したトランスジェニック・サトウダイコン植物から得られる後代を含み、これは、後代のサトウダイコン植物が抽薹と以後の開花により、１８週間の典型的な春化期間にもはや応答せず、その反対に栄養生長（非抽薹）を続け、正常な主根を生長させることを意味する。
本発明の核酸配列を含む本発明の及び上記したベクター又はキメラ構築物は、特定の植物種にいったん形質転換されると、その種の中で増殖されるか、又は従来の育種法を使用して同じ種の他の変種（特に市販変種を含む）に移される。
上記したトランスジェニック植物に改変される遺伝的性質は、有性生殖又は栄養生長により伝えられ、こうして後代植物中に維持し増殖することができる。一般に前記維持及び増殖は、耕作、種まき、又は収穫のような特定の目的に合うよう開発された既知の農業的方法を使用する。水耕法又は温室技術のような特殊な方法も使用することができる。
本発明のトランスジェニック遺伝子型は、異なるトランスジェニック若しくは非トランスジェニック遺伝子型を含む他の植物系統（好ましくはサトウダイコン植物系統）に育種することにより、遺伝子移入をすることができることを、当業者は理解し得る。この異なるトランスジェニック又は非トランスジェニック遺伝子型は任意の遺伝子型でもよいが、少なくとも１つの目的の形質を含む遺伝子型が好ましい。例えば本発明のトランスジェニック遺伝子型を含むサトウダイコン同系交配系が、サトウダイコン植物に感染することが知られているウイルスに耐性のイベントのトランスジェニック遺伝子型を含むサトウダイコン同系交配系と交配される。得られる種子及び後代植物は、遅延抽薹の形質及び耐性形質を積層した形で有し得る。例えば本発明のトランスジェニック遺伝子型と同系繁殖させたサトウダイコンを、例えばグリホセート耐性Ｈ７−１イベント（欧州特許出願ＥＰＡ１−１５９７３７３、参照により本明細書に組み込まれる）のトランスジェニック遺伝子型のような除草剤耐性を含むサトウダイコン同系交配系と交配することができる。得られる種子及び後代植物は、耐性形質及び遅延抽薹形質の両方を有し得る。一般に、除草剤耐性、疾患耐性、又はウイルス（すなわち、トランスジェニック型のＢＮＹＶＶ、又は通常の起源のＢＮＹＶＶのようなウイルス（例えばＨｏｌｌｙ又はＣ４８）、或いはＢＮＹＶＶ以外のウイルス）に対する耐性のような形質は、本発明のトランスジェニック遺伝子型と積層するために使用することができる。本発明のトランスジェニック遺伝子型及び他の組合せ又は積層を作成することができ、従ってこれらの例は限定的と見るべきではないことは、認識され得る。
本発明のトランスジェニック遺伝子型は、認められている育種法を使用して、任意のサトウダイコン同系交配系又はハイブリッドに遺伝子移入することができる。植物育種の目標は、改良された性質を有する植物を開発するために、単一の変種の又はハイブリッドに種々の好ましい形質を組合せることである。畑の作物に関して、これらの形質は、昆虫及び疾患に対する耐性（例えば、特に限定されないが、Ｈｏｌｌｙ又はＣ４８を含む通常の供給源から得られるもの）、除草剤に対する耐性、熱及び干ばつに対する耐性、高い収率、及び良好な農業的性質を含み得る。多くの作物の機械的収穫には、発芽及び主根樹立、生長速度、成熟、並びに根のサイズのような植物特性の均一性が重要である。
何代も自家受粉され、且つ系統について選択されてきた植物は、ほとんどすべての遺伝子座でホモ接合性となり、真の育種後代の均一な集団を作り出す。２つの異なるホモ接合性系統の交配により、多くの遺伝子座についてヘテロ接合性であるハイブリッド植物の均一な集団が作成される。多くの遺伝子座でそれぞれヘテロ接合性である２つの植物の交配により、遺伝的に異なり均一ではないハイブリッド植物の集団が作成される。
当該分野で既知であり、且つサトウダイコン植物育種計画で使用される植物育種法には、特に限定されないが、循環選抜、戻し交配、系統育種、制限長多型増強選択、遺伝マーカー増強選択、及び形質転換を含む。サトウダイコン植物育種計画におけるサトウダイコン・ハイブリッドの開発は、一般にホモ接合性同系交配系の開発、これらの系統の交配、及び交配の評価を必要とする。系統育種及び循環選抜育種法は、育種集団から同系交配系を開発するために使用される。サトウダイコン植物育種計画は、２個又はそれ以上の同系交配系又は種々の他の生殖質源からの遺伝的背景を、そこから所望の表現型の自殖と選択により新しい同系交配系が開発される育種プールに組み合わせる。新しい同系交配系は他の同系交配系と交配され、これらの交配からのハイブリッドは、商業的可能性のあるものを決定するために評価される。サトウダイコン植物育種計画で実施されるように、植物育種及びハイブリッド開発は、費用及び時間のかかる工程である。
系統育種は、それぞれが他の遺伝子型では欠失しているか又は他の遺伝子型を補完する１つ又はそれ以上の好ましい特性を有する、２つの遺伝子型の交配で開始される。２種類の元々の親がすべての好ましい特性を提供しない場合は、育種集団中に他の供給源を含めることができる。系統育種法では、優れた植物が自殖され、連続する世代で選択される。以後の世代では、自家受粉と選択の結果として、ヘテロ接合性条件は均一な系統に移行する。典型的には、系統育種法では、Ｆ１→Ｆ２；Ｆ２→Ｆ３；Ｆ３→Ｆ４；Ｆ４→Ｆ５など、５又はそれ以上の世代の自殖と選択が行われる。
循環選抜育種、例えば戻し交配法は、同系繁殖系及びこれらの同系繁殖系を使用して作成されるハイブリッドを改良するのに使用することができる。戻し交配法を使用すれば、ある同系繁殖系又は供給源から特定の望ましい形質を、その形質を欠く同系繁殖系に移入することができる。これは例えば、初めに、優れた同系繁殖系（繰り返し親）を、問題の形質に対応する適正遺伝子をもつドナー同系繁殖系（非繰り返し親）と交配することによって実現することができる。次に、この交配の後代を優れた繰り返し親と戻し交配して、非繰り返し親から移入された望ましい形質をもつ後代を選抜する。
エリート同系繁殖系、すなわち純粋交配のホモ接合性同系繁殖系はまた、そこから他の同系繁殖系を開発するための育種又は起源集団向けの出発素材として使用することができる。エリート同系繁殖系から派生するこれらの同系繁殖系は、前述の系統育種法及び循環選抜育種法を使用して開発することができる。例えばサトウダイコン植物育種プログラムで戻し交配育種法を使用してこれらの派生系統を作成するときは、エリート同系繁殖系を親系統又は出発素材又は起源集団として使用し、またドナー親又は繰り返し親にすることができる。
互いに他を補完する遺伝子型を有する２つの同系繁殖系の交配から単一の交配ハイブリッドが得られる。この第１世代ハイブリッド後代はＦ１という。サトウダイコン植物育種プログラムにおける商業用ハイブリッドの開発では、Ｆ１ハイブリッド植物だけを追求する。好ましいＦ１ハイブリッドは、同系繁殖系の両親よりも生長力がある。この雑種強勢又はヘテローシスは、栄養生長及び収量の上昇を含む多数の多遺伝子性形質において出現し得る。
サトウダイコン植物育種プログラムにおけるサトウダイコン・ハイブリッドの開発は、次の３工程を含む：（１）初期育種交配の種々の生殖質プールからの植物の選択；（２）互いに異なるが繁殖能力があり均一性も高い一連の同系繁殖系を生産するための、数世代にわたる育種交配に由来する選択された植物の自殖；及び（３）選択された同系繁殖系を異なる同系繁殖系と交配してハイブリッド後代（Ｆ１）を生産すること。サトウダイコンの同系繁殖工程中、この系統の強勢は低下する。２つの異なる同系繁殖系を交配してハイブリッド後代（Ｆ１）を生産すると、強勢が回復される。同系繁殖系のホモ接合性と均一性の重要な結果は、同系繁殖系の明確な対の間のハイブリッドはいつも同じであることである。優れたハイブリッドを与える同系繁殖系がいったん特定されると、この同系繁殖系親の均一性が維持される限り、ハイブリッド種子は無期限に再生され得る。
２つの同系繁殖系を交配してＦ１後代を生産すると、単一の交配ハイブリッドが生産される。４種の同系繁殖系を対（Ａ×ＢとＣ×Ｄ）で交配し、次に２つのＦ１ハイブリッドを再度交配（Ａ×Ｂ）×（Ｃ×Ｄ）して、二重交配ハイブリッドが生産される。三重交配ハイブリッドは、２種の同系繁殖系を交配（Ａ×Ｂ）し、次に生じたＦ１ハイブリッドを第３の同系繁殖系と交配（Ａ×Ｂ）×Ｃすることにより、３種の同系繁殖系から生産される。Ｆ１ハイブリッドが示した雑種強勢のほとんどは、次の世代（Ｆ２）で失われる。従ってハイブリッドからの種子は、親木を植えるのに使用されない。
ハイブリッド種子生産では、雌親による花粉生産を排除又は不活性化することが好ましい。花粉の不完全な除去又は不活性化は、自家受粉の可能性を与える。偶然自家受粉された種子が誤って収穫され、ハイブリッド種子と一緒にされることがある。種子をいったん植えると、これらの自家受粉植物を特定し選択することができる。これらの自家受粉植物は、ハイブリッドを生産するために使用される雌の同系繁殖系と同等である。典型的には、これらの自家受粉植物は、その強勢の低下により特定され、且つ選択される。雌の自殖体は、栄養生長及び／又は生殖特性について強勢が低下した外観から特定される。これらの自家受粉系の特定はまた、分子マーカー解析により行われる。
しかし商業的ハイブリッド種子生産で自家受粉体を排除することにより、雑種強勢を利用することを確実にする簡便で効率的な受粉制御システムが存在する。片方の親が、自家受粉できないか又は花粉を生産できない自家不和合性（ＳＩ）、細胞質雄性不稔性（ＣＭＳ）、又は核雄性不稔性（ＮＭＳ）植物の場合、異花受粉のみが起きる。親が均一な品質で育種家が単交雑のみを行うなら、異種交配体の片方の親品種の花粉を排除することにより、植物育種家は均一な品質のハイブリッド種子を得ることができる。細胞質雄性不稔性（ＣＭＳ）は母方から遺伝する現象であり、その遺伝決定因子は細胞質中の小器官であるミトコンドリアのゲノム中に存在する。このような植物は、機能性の花粉粒を生産する能力が大幅に傷害される。ＣＭＳシステムの回復遺伝子は優性核遺伝子であり、これは細胞質の雄性不稔作用を抑制する。ＣＭＳ植物中の雄性不稔性の発現は、劣性核遺伝子と雄性不稔性特異的細胞質遺伝子との不和合性の結果である。
好適な実施形態において、ＣＭＳシステムは、本発明の雑種サトウダイコン植物の生産のために適用される。このようなシステムにおいて、雄性不稔性ＣＭＳ系統は、雄親として使用される雄稔性系統により受粉される雌親として使用される。本発明の抽薹耐性形質は、ＣＭＳ雄性不稔性（雌）親系統、又は雄性不稔性（雄）親系統、又はこの両方に存在してもよい。好ましくは、雄親が示す形質を含む花粉を介するＧＭ汚染を避けるために、遅延抽薹形質は、雄性不稔性上に維持される。さらに、このようなシステムでは、片親又は両親がトランスジェニック植物でもよい。
従って、別の態様において本発明は、それから抽薹耐性の表現型を有するサトウダイコン植物が生長する雑種種子を生産するための方法を提供する。前記方法は以下の工程からなる：（ａ）抽薹耐性の表現型を有するサトウダイコン系統、特に第１親系統としての上記した本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物を提供する工程、（ｂ）第２の親系統として異なる遺伝子型を有する第２のサトウダイコン系統を提供する工程、ここで、工程ａ）又は工程ｂ）で使用される片方の親系統は雄性不稔性ｃｍｓ系統であり、他の親系統は雄性稔性であることを特徴とする工程。前記方法の次の工程は、（ｃ）雄性稔性親系統の植物を雄性不稔親系統の花に受粉させ、種子を生長させ、ハイブリッド種子を採取する工程であり、ここで収穫されたハイブリッド種子は、遅延抽薹の表現型、好ましくは抽薹耐性の表現型を有するサトウダイコン・ハイブリッド植物の種子である。
一般に、ハイブリッド生産のための第２親系統はまた、抽薹耐性の表現型を有するサトウダイコン植物系統、例えば本発明のサトウダイコン植物でもよい。好ましくはハイブリッド種子の生産に使用される第１親系統と第２親系統は、遺伝的に多様な背景に基づく。遺伝距離は、例えばＫＮＡＡＫ（１９９６）に記載された分子マーカーの使用により測定することができる。しかし第２親系統はまた、目的の別の形質、例えば特に限定されないが、除草剤（例えばグリホセート）耐性（例えば、欧州特許出願ＥＰ−Ａ１−１５９７３７３に記載のＨ７−１イベントを含む、これは参照により本明細書に組み込まれる）を含むサトウダイコン同系繁殖系でもよい。得られるハイブリッド種子は、遅延抽薹及びグリホセート耐性の積層形質を含み得る。
この態様のある実施形態において、第１親系統又は第２親系統は、本発明の核酸又はキメラ構築物又はベクターを含む同系繁殖系サトウダイコン系統である。この態様のさらなる実施形態において他の親系統は、（ａ）トランスジェニック又は通常の起源（例えばＨｏｌｌｙ又はＣ４８）からの、サトウダイコンに影響を与える少なくとも１つのウイルス、例えばサトウダイコンえそ性葉脈黄化ウイルス（ＢＮＹＶＶ）に対して耐性の同系繁殖系サトウダイコン植物系統；（ｂ）少なくとも１つの除草剤に耐性の同系繁殖系サトウダイコン植物系統；（ｃ）少なくとも１つの疾患に対する耐性を有する同系繁殖系サトウダイコン植物系統；及び（ｄ）抽薹耐性を示す同系繁殖系サトウダイコン植物系統（例えば、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物）から成る群から選択される。本発明のトランスジェニック遺伝子型と積層するためのサトウダイコンに影響を与える通常のウイルスや疾患及びこれらのウイルス若しくは疾患に対する耐性の供給源の例は、当業者に既知である。さらにサトウダイコンで使用される除草剤及びこれらの除草剤に対する耐性供給源もまた、当業者に既知である。本発明のトランスジェニック遺伝子型を用いて、他の組合せ又は積層が製造され得ること、従ってこれらの例は限定するものではないことは、さらに理解され得る。
この態様のある実施形態において、本発明のサトウダイコン・ハイブリッド種子を生産する方法で使用される雄性不稔性ＣＭＳサトウダイコン植物系統は、上記したように本発明の核酸配列、キメラ構築物、及び／又はベクターを含む同系繁殖系サトウダイコン系統である。
当業者には明らかなように、上記説明は、本発明のトランスジェニック遺伝子型を他のサトウダイコン系統に遺伝子移入しようとする方法により、本発明の同系繁殖系が得られる種々の方法のほんの一部である。他の手段も利用でき、かつ当業者に既知であり、上記例は単なる例示である。
本発明の別の好適な実施形態は、遅延抽薹の表現型、好ましくは非抽薹表現型を有するサトウダイコン植物のハイブリッド種子に関する。本発明のある態様において前記ハイブリッド種子は、上記の本発明の遅延抽薹の表現型を有するサトウダイコン植物のサトウダイコン・ハイブリッド種子を生産するための方法により生産される。このような方法は当業者に既知である。本発明のさらに別の態様において、本発明のハイブリッド種子を増殖させることにより生産される遅延抽薹の表現型、好ましくは非抽薹表現型を有する雑種サトウダイコン植物が提供される。好ましくは、このハイブリッド植物は決して抽薹ではなく、すなわち春化応答の完全な抑制を示し、従って抽薹耐性である。
本発明のさらなる態様は、本発明のサトウダイコン植物の部分に関する。好ましくは前記植物の部分は、種子、胚、小胞子、葯、接合子、プロトプラスト、細胞、卵子、胚珠、花粉、主根、子葉、又は他の生殖性若しくは栄養部分若しくは抽出物若しくは試料を含む群から選択される。抽出物又は生物学的試料を含むこれらのすべての植物の部分は、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子から、又は本発明のハイブリッド種子若しくはハイブリッド植物から得られ、これらの全ては上記した。
別の態様は、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物又はハイブリッド・サトウダイコン植物の根又は後代に関する。
さらなる態様において、本発明は、サトウダイコン植物細胞の形質転換のための、上記した本発明の核酸配列又はその断片の使用に関する。別の実施形態において本発明は、サトウダイコン植物細胞の形質転換のための、上記した本発明のキメラ構築物又はベクターの使用に関する。
さらなる実施形態において、サトウダイコン植物細胞の形質転換方法であって、本発明の核酸配列、又はそのキメラ構築物、又はベクターの使用を含む方法が提供される。サトウダイコンを形質転換する方法は上記で詳述され、また当業者に既知である。サトウダイコン植物細胞を形質転換する方法の例はさらに、後述実施例７と８に提供される。
本発明のさらに別の実施形態において、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子のセンスＲＮＡ断片と同じ遺伝子のアンチセンスＲＮＡ断片とを、植物細胞に別々に導入することを含む遺伝子サイレンシング方法が提供され、ここでセンスＲＮＡ断片及びアンチセンスＲＮＡは２本鎖ＲＮＡ分子を形成することができ、細胞中の内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現が変更される。好適な実施形態においてＲＮＡ断片は、２種類の異なるＲＮＡ分子中に含まれる。
別の好適な実施形態において、ＲＮＡ断片は、２本鎖ＲＮＡ分子を形成することを可能にする条件下で細胞に導入される前に、混合される。
別の好適な実施形態においてＲＮＡ断片は、連続して前記細胞中に導入される。さらに別の実施形態においてＲＮＡ断片は、１種類のＲＮＡ分子中に含まれる。このような場合にＲＮＡ分子は好ましくは、そこに含まれる前記ＲＮＡ断片が２本鎖ＲＮＡ分子を形成するように、折り畳むことができる。標的をサイレンシングするために、センス及びアンチセンスＲＮＡ断片を使用するための種々の方法が、国際公開第９９／６１６３１号に記載されている。
本発明はさらに、標的遺伝子ｍＲＮＡのセンス及びアンチセンス断片を含むｄｓＲＮＡ分子を、植物細胞中に導入する方法を提供する。
ある実施形態において、本発明は、サトウダイコン植物細胞の内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現を下方制御又は抑制する方法に関し、ここで前記方法において、ＢｖＦＴ２の配列から得られる核酸配列を含む本発明の核酸配列、キメラ構築物、又はベクターが、前記植物細胞中に導入される。本発明の核酸配列、キメラ構築物、又はベクターの前記植物細胞中での発現により、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現の下方制御又は抑制が引き起こされる。内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現のこの下方制御又は抑制により、生長しているサトウダイコン植物中の春化応答の遅延が起きるか、又はサトウダイコン植物は非抽薹表現型を示し、これは、サトウダイコン植物が抽薹と以後の開花により、１８週間の典型的な春化期間にもはや応答せず、その反対に栄養生長（非抽薹）を続け、正常な主根を生長させることを意味する。
本発明のさらに別の実施形態において、サトウダイコンの内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現を上方制御する方法が提供され、ここで、ＢｖＦＴ１の配列から得られる核酸配列を含む本発明の核酸配列、キメラ構築物、又はベクターは、前記植物細胞中に導入され、従って、核酸配列、キメラ構築物、又はベクターの前記植物細胞中での発現により、内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現の上方制御が引き起こされる。内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現のこの上方制御により、生長しているサトウダイコン植物中の春化応答の遅延が起きるか、又はサトウダイコン植物は非抽薹表現型を示し、これは、サトウダイコン植物が抽薹と以後の開花により、１８週間の典型的な春化期間にもはや応答せず、その反対に栄養生長（非抽薹）を続け、正常な主根を生長させることを意味する。
別の態様において、本発明はさらに：
ａ）本発明のかつ上記したキメラ構築物又はベクターを用いてサトウダイコン細胞を形質転換し；
ｂ）異種ＤＮＡを含むサトウダイコン細胞を同定し；
ｃ）工程ｂ）で同定された前記植物細胞からトランスジェニック植物を再生し；
ｄ）非抽薹（ＮＢ）表現型になる、春化応答の遅延又は春化応答の完全な抑制を示すサトウダイコン植物を同定し；
ｅ）場合により、工程ａ）で導入された植物細胞ゲノム中の異種ＤＮＡの存在を確認すること
を含む、上記した本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物を生産する方法に関する。
工程（ａ）で使用されるキメラ構築物は、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現の下方制御又は抑制のためのキメラ構築物を含有する本発明のＲＮＡｉ発現ベクターであるか、又は両方とも上記した内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現の上方制御のためのキメラ構築物を含有する本発明の発現ベクターである。別の好適な実施形態において、工程（ａ）で使用されるベクターは、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現の下方制御又は抑制のためのキメラ構築物、及び内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現の上方制御のためのキメラ構築物を含有する。
本発明はまた、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の一部と十分に同一であるか若しくは相補的である、本発明の且つ上記した第１のＲＮＡ断片、及び、第１のＲＮＡ断片と充分に相補的である第２のＲＮＡ断片を、植物細胞中に導入して、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現の抑制を引き起こすことを含む、サトウダイコン植物細胞中の内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現を抑制する方法であって、第１及び第２のＲＮＡ断片は植物細胞中で２本鎖ＲＮＡ分子を形成し、前記２本鎖ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ介在サイレンシングによりＢｖＦＴ２遺伝子の発現を抑制する、前記方法を含む。
本発明はまた、サトウダイコン植物中の内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現を抑制する方法であって、
ａ）本発明の第１のＲＮＡ鎖をサトウダイコン植物細胞中に導入し；
ｂ）前記植物細胞を生長させて第１の植物とし；
ｃ）第２のＲＮＡ鎖を第２のサトウダイコン植物細胞に導入し、ここで前記第１のＲＮＡ鎖は、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子により産生されるＲＮＡにハイブリダイズ又はアニーリングするのに充分に、前記内因性ＢｖＦＴ２遺伝子により産生されるＲＮＡ鎖の少なくとも一部に相補的であり、その結果、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現の抑制を引き起こし、前記第１のＲＮＡ鎖及び前記第２のＲＮＡ鎖は２本鎖ＲＮＡを形成することができ；
ｄ）前記第２のサトウダイコン植物細胞を生長させて第２の植物とし；
ｅ）前記第１の植物及び前記第２の植物を交配させて種子を生産し；並びに
ｆ）前記種子から植物を生長させ、ここで前記第１及び第２のＲＮＡ鎖は、前記内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現のＲＮＡ干渉に関与する２本鎖ＲＮＡを形成すること
を含む、前記方法を含む。
本発明の別の態様において、生物学的試料中の本発明の核酸配列又はキメラ構築物の存在を検出する方法が提供される。かかる方法は、（ａ）本発明の核酸配列又はキメラ構築物を有するサトウダイコンのゲノムＤＮＡを用いた核酸増幅反応で使用されたとき、本発明のサトウダイコンの診断に用いるアンプリコンを産生する、一対のプライマーを、ＤＮＡを含む試料に接触させ；（ｂ）核酸増幅反応を実施してアンプリコンを産生させ；並びに（ｃ）アンプリコンを検出すること、を含む。アンプリコンの検出は、特に限定されないが、蛍光法、化学発光法、放射線法、免疫学的方法などを含む、当該分野で既知の任意の手段により行うことができる。ハイブリダイゼーションが特定の配列を増幅してアンプリコンを産生することを目的とする場合、当該分野で既知の任意の手段によるアンプリコンの産生及び検出は、１つの標的配列（１つのプローブ又はプライマーが使用される場合）又は複数配列（２個又はそれ以上のプローブ又はプライマーが使用される場合）への目的のハイブリダイゼーションを示すことを目的とする。
本発明は、糖生産法、好気性発酵法、及び嫌気性発酵法から選択される方法における、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はハイブリッド・サトウダイコン植物、又は植物の部分の使用を含む。本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はハイブリッド・サトウダイコン植物、又は植物の部分は、好ましくは糖生産法で使用される。
糖を生産するための本発明の方法は、糖を生産するための当業者に既知の任意の方法でもよい。好適な実施形態において、上記した本発明のサトウダイコン植物、又はその細胞若しくは組織を処理して糖を生産する糖生産法が提供される。さらに本発明は、本発明の糖生産法により生産される糖を提供する。
本発明の別の実施形態は、好気性発酵法又は嫌気性発酵法における、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物、本発明のハイブリッド・サトウダイコン植物、又は本発明の植物の部分の使用に関する。好気性発酵法又は嫌気性発酵法は、当業者に既知である。
例えば「発酵」は、アルコール（例えばエタノール、メタノール、ブタノール）、有機酸（例えばクエン酸、酢酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸）、ケトン（例えばアセトン）、アミノ酸（例えばグルタミン酸）、気体（例えば水素及び二酸化炭素）、抗生物質（例えばペニシリン及びテトラサイクリン）、酵素、ビタミン（例えばリボフラビン、Ｂ１２、ベータカロチン）、及び／又はホルモンを生産するための、植物物質、例えば本発明の植物物質からの糖又は他の分子の好気的変換を意味する。発酵は、消費アルコール産業で使用される発酵を含む（例えばビール及びワイン）。発酵はまた、例えば生物燃料の生産のための嫌気性発酵を含む。発酵は、所望の発酵工程で使用するのに適した任意の生物（特に限定されないが、細菌、真菌、古細菌、及び原生生物を含む）により行うことができる。適切な発酵生物は、単糖、二糖、三糖、特にグルコース及びマルトース、又は他のバイオマス由来分子を、直接又は間接に所望の発酵生成物（例えばエタノール、ブタノールなど）に変換できるものを含む。適切な発酵生物はまた、非糖分子を所望の発酵生成物に変換できるものを含む。かかる生物及び発酵法は、当業者に既知である。
他の好適な態様は、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物、又は細胞若しくは組織、又は生物学的試料若しくはその抽出物を処理して、１つ又はそれ以上の生物燃料を生産することにより、エタノール、バイオガス、及び／又はバイオディーゼルから成る群から選択される１つ又はそれ以上の生物燃料を生産する方法に関する。
本明細書において用語「生物燃料」は、バイオマス、すなわち生きているか又は最近生きていた生物（例えば植物又は動物の排出物）から得られる燃料に関する。生物燃料は、特に限定されないが、バイオディーゼル、バイオ水素、バイオガス、バイオマス由来ジメチルフラン（ＤＭＦ）などを含む。特に用語「生物燃料」は、植物由来アルコール、例えばエタノール、メタノール、プロパノール、又はブタノール（これらは所望であれば、使用前に変性してもよい）を示すのに使用される。用語「生物燃料」はまた、植物由来燃料、例えばアルコール／ガソリン混合物（すなわちガソホール）を含む燃料混合物を示すのに使用される。ガソホールは、植物由来のアルコールの任意の所望のパーセントを含む（すなわち、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の植物由来アルコール）。例えば、１つの有用な生物燃料に基づく混合物はＥ８５であり、これは８５％のエタノールと１５％のガソリンを含む。生物燃料は、植物物質の好気性発酵又は嫌気性発酵により生産される任意の生物燃料でもよい。好気性発酵により得られる生物燃料の非限定例は、バイオエタノールである。嫌気性発酵により得られる生物燃料は、特に限定されないが、バイオガス及び／又はバイオディーゼルを含む。好気性発酵及び／又は嫌気性発酵法は、当業者に既知である。１つ又はそれ以上の生物燃料を生産するための方法又は本発明の方法により生産されるエタノール、バイオガス、及び／又はバイオディーゼルから成る群から選択される生物燃料も、さらに本発明に包含される。
本発明は、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物での抗生物質又はバイオプラスチックの製造のような、他の工業的応用を含む。さらに、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物又はその部分はまた、さらなる処理をすることなく、例えば牛の飼料として使用することもできる。
さらに具体的な実施形態において本発明はトランスジェニック・サトウダイコン植物に関し、ここで、内因性サトウダイコン遺伝子ＢｖＦＴ１及び／又はＢｖＦＴ２の発現の調節以外に、開花制御に関与する１つ又はそれ以上の追加の遺伝子の発現が調節される。
さらに具体的な実施形態において、開花制御に関与する前記１つ又はそれ以上の追加の遺伝子は、ＡＧＬ２０（ＡＧＡＭＯＵＳ−ＬＩＫＥ ２０）、ＶＲＮ１（ＲＥＤＵＣＥＤ ＶＥＲＮＡＬＩＺＡＴＩＯＮ ＲＥＳＰＯＮＳＥ １）、ＶＲＮ２（ＲＥＤＵＣＥＤ ＶＥＲＮＡＬＩＺＡＴＩＯＮ ＲＥＳＰＯＮＳＥ ２）、ＶＩＮ３（ＶＥＲＮＡＬＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＳＥＮＳＩＴＩＶＥ ３）、ＣＯＮＳＴＡＮＳ、ＧＩＧＡＮＴＥＡ、ＦＰＦ１（ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＰＲＯＭＯＴＩＮＧ ＦＡＣＴＯＲ １）、ＳＶＰ（ＳＨＯＲＴ ＶＥＧＥＴＡＴＩＶＥ ＰＨＡＳＥ）、及びＡＧＬ２４（ＡＧＡＭＯＵＳ−ＬＩＫＥ ２４）、ＦＬＣ（ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ Ｃ）、ＦＲＩＧＩＤＡ、及びＴＦＬ１（ＴＥＲＭＩＮＡＬ ＦＬＯＷＥＲ １）を含む、遺伝子の群から選択される。
トランスジェニック・サトウダイコンの抽薹耐性を調節して、遅延抽薹の表現型、好ましくは非抽薹表現型を引き起こすために、開花制御に関する１つ又はそれ以上の追加の遺伝子の機能に依存して、前記１つ又はそれ以上の遺伝子の発現を上方制御又は抑制する必要がある。開花制御に関与するこの１つ又はそれ以上の追加の遺伝子の遺伝子機能に基づいて、特定の遺伝子について過剰発現又は抑制が必要かどうかは当業者には明らかであろう。例えば、ＡＧＬ２０が使用される時、ＡＧＬ２０の発現は抑制される必要があり、一方ＦＬＣ遺伝子の発現は上方制御される必要がある（例えば、ＷＯ０７／１２２０８６参照）ことは明らかである。ある実施形態において、サトウダイコン植物のゲノムへの同じタイプの２個又はそれ以上の遺伝子の導入が企図される。この関連で「同じタイプの」は、その発現を同じ方法で調節（すなわち、下方制御と比較して上方制御）する必要がある遺伝子を意味する。
したがって、さらなる態様において本発明は、上記した内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現を下方制御又は抑制する方法であって、開花制御に関与する少なくとも１つの追加の細胞のサトウダイコン植物細胞中での発現を調節することを含む方法を提供する。
この態様の好適な実施形態において、開花制御に関与する追加の少なくとも１つの遺伝子は、ＡＧＬ２０、ＶＲＮ１、ＶＲＮ２、ＶＩＮ３、ＣＯＮＳＴＡＮＳ、ＧＩＧＡＮＴＥＡ、ＦＰＦ１、ＳＶＰ、及びＡＧＬ２４から成る群から選択され、この場合抽薹耐性を付与するために、サトウダイコン植物中のこれらの遺伝子の発現を下方制御又は抑制する必要がある。この態様のさらに好適な実施形態において、開花制御に関与する追加の少なくとも１つの遺伝子は、ＦＬＣ、ＦＲＩＧＩＤＡ、ＢｖＦＴ１、及びＴＦＬ１から成る群から選択され、この場合、抽薹耐性を付与するために、サトウダイコン植物中のこれらの遺伝子の発現を上方制御する必要がある。
さらなる態様において本発明は、上記した内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現を上方制御する方法であって、開花制御に関与する少なくとも１つの追加の遺伝子のサトウダイコン植物細胞中の発現を調節することを含む方法を提供する。
この態様の好適な実施形態において、開花制御に関与する追加の少なくとも１つの遺伝子は、ＡＧＬ２０、ＶＲＮ１、ＶＲＮ２、ＶＩＮ３、ＣＯＮＳＴＡＮＳ、ＧＩＧＡＮＴＥＡ、ＦＰＦ１、ＳＶＰ１、ＡＧＬ２４、及びＢｖＦＴ２から成る群から選択され、この場合、抽薹耐性を付与するために、サトウダイコン植物中のこれらの遺伝子の発現を下方制御又は抑制する必要がある。この態様のさらに好適な実施形態において、開花制御に関与する追加の少なくとも１つの遺伝子は、ＦＬＣ、ＦＲＩＧＩＤＡ、及びＴＦＬ１から成る群から選択され、この場合抽薹耐性を付与するために、サトウダイコン植物中のこれらの遺伝子の発現を上方制御する必要がある。
好ましくは、内因性ＢｖＦＴ１及び／又はＢｖＦＴ２の発現の調節に加えて、開花制御に関与する１つ又はそれ以上の追加の遺伝子の発現の調節は、前記サトウダイコン植物中の春化応答の相乗作用的遅延につながる。
さらに別の具体的な態様において、本発明は、内因性サトウダイコン遺伝子ＢｖＦＴ１及び／又はＢｖＦＴ２の調節に加えて、開花制御に関与する１つ又はそれ以上の他の遺伝子の発現が調節される上記したトランスジェニック・サトウダイコン植物に関し、この植物は２種の親植物の交配により得られ、ここでＢｖＦＴ１及び／又はＢｖＦＴ２の発現を調節するための第１の異種遺伝子構築物は１つの親による寄与であり、開花制御に関与する前記１つ又はそれ以上の他の遺伝子の発現を調節するための第２の異種遺伝子構築物は他の親による寄与であり、少なくとも１つの親植物は非抽薹（ＮＢ）表現型を示さない。
好適な実施形態において、両方の異種遺伝子構築物は同じベクター中に含まれ、上記のサトウダイコン植物細胞を形質転換する方法によりサトウダイコン植物中に同時に形質転換される。
さらなる実施形態において、内因性サトウダイコン遺伝子ＢｖＦＴ１及び／又はＢｖＦＴ２の調節以外に、開花制御に関与する１つ又はそれ以上の他の遺伝子の発現が調節されている、上記のトランスジェニック・サトウダイコン植物は、以下の工程：
ａ）サトウダイコン細胞を、異種ＤＮＡを含む第１のキメラ構築物を用いて形質転換する工程であって、ここで前記異種ＤＮＡは、開花制御に関与する遺伝子から得られ、開花制御に関与する前記内因性遺伝子の発現を上方制御又は下方制御することができる異種遺伝子構築物を含む、本発明の及び前記した制御配列及び／又は発現カセットに作動可能に連結される、前記工程、
ｂ）異種ＤＮＡを含有するサトウダイコン細胞を同定する工程、
ｃ）異種ＤＮＡ（ここで前記異種ＤＮＡは開花制御に関与する遺伝子から得られ、開花制御に関与する前記内因性遺伝子の発現を上方制御又は下方制御することができる異種遺伝子構築物を含む制御配列に、作動可能に連結される）を含む第２の第１キメラ構築物を用いて、又は開花制御に関与する前記内因性遺伝子の発現を上方制御又は下方制御することができる異種遺伝子構築物を含む、本発明の及び上記した発現カセットを用いて、工程ｂ）で同定されたサトウダイコン細胞を形質転換し、そして導入された両方の異種ＤＮＡを含有するサトウダイコン細胞を同定する工程、
ｄ）工程ｂ）で同定された前記植物細胞からトランスジェニック植物を再生する工程、
ｅ）春化応答の遅延又は春化応答の完全な抑制を示すことにより、非抽薹（ＮＢ）表現型すサトウダイコン植物を同定する工程、
ｆ）場合により、工程ａ）で及び随時工程ｃ）で導入された植物細胞ゲノム中の異種ＤＮＡの存在を確認する工程
を含む、連続的形質転換法により得られる。
好ましくは、第１及び第２のキメラ構築物は、開花制御に関与する異なる遺伝子から得られる、異なる異種ＤＮＡを含む。
具体的な実施形態において、トランスジェニック・サトウダイコン植物を生産する方法は、２つの親植物の交配を含み、ここで、第１のキメラ構築物は、ＡＧＬ２０（ＡＧＡＭＯＵＳ−ＬＩＫＥ ２０）、ＶＲＮ１（ＲＥＤＵＣＥＤ ＶＥＲＮＡＬＩＺＡＴＩＯＮ ＲＥＳＰＯＮＳＥ １）、ＶＲＮ２（ＲＥＤＵＣＥＤ ＶＥＲＮＡＬＩＺＡＴＩＯＮ ＲＥＳＰＯＮＳＥ ２）、ＶＩＮ３（ＶＥＲＮＡＬＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＳＥＮＳＩＴＩＶＥ ３）、ＣＯＮＳＴＡＮＳ、ＧＩＧＡＮＴＥＡ、ＦＰＦ１（ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＰＲＯＭＯＴＩＮＧ ＦＡＣＴＯＲ １）、ＳＶＰ（ＳＨＯＲＴ ＶＥＧＥＴＡＴＩＶＥ ＰＨＡＳＥ）、及びＡＧＬ２４（ＡＧＡＭＯＵＳ−ＬＩＫＥ ２４）、ＦＬＣ（ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ Ｃ）、ＦＲＩＧＩＤＡ、及びＴＦＬ１（ＴＥＲＭＩＮＡＬ ＦＬＯＷＥＲ １）を含む、遺伝子の群から選択される、本発明の及び前記の開花制御に関与する遺伝子、好ましくはＡＧＬ３０又はＦＬＣ遺伝子を含むサトウダイコン植物で示される親１により与えられ、第２のキメラ構築物は、本発明の及び前記した内因性ＢｖＦＴ１遺伝子及び／又は内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現を調節することができる本発明のキメラ構築物を含む、サトウダイコン植物で示される親２により与えられる。前記方法で得られる、すなわち前記交配から生じる植物、特に親１と親２の両方により与えられるキメラ構築物を含む植物は、遅延春化応答又は非抽薹表現型を示す植物である。
具体的な実施形態において本発明は、少なくとも１つの親植物は非抽薹（ＮＢ）表現型を示さないことを特徴とする、トランスジェニック・サトウダイコン植物を生産する方法に関する。
さらに好適な実施形態は、上記した前記トランスジェニック・サトウダイコン植物から得られる根、後代、又は種子（例えばハイブリッド種子）に関し、ここで内因性サトウダイコン遺伝子ＢｖＦＴ１及び／又はＢｖＦＴ２の調節以外に、開花制御に関与する１つ又はそれ以上の他の遺伝子の発現が調節されている。
さらに好適な実施形態は、前記トランスジェニック・サトウダイコン植物、その植物の部分、細胞、又は根から得られる糖又は生物燃料に関する。
本発明はさらに、糖生産法、好気性発酵法、及び嫌気性発酵法から成る群から選択される方法における、内因性サトウダイコン遺伝子ＢｖＦＴ１及び／又はＢｖＦＴ２の調節以外に、開花制御に関与する１つ又はそれ以上の他の遺伝子の発現が調節されているトランスジェニック・サトウダイコン植物の使用を含む。開花制御に関与する１つ又はそれ以上の他の遺伝子は、好ましくは上記したＡＧＬ２０（ＡＧＡＭＯＵＳ−ＬＩＫＥ ２０）、ＶＲＮ１（ＲＥＤＵＣＥＤ ＶＥＲＮＡＬＩＺＡＴＩＯＮ ＲＥＳＰＯＮＳＥ １）、ＶＲＮ２（ＲＥＤＵＣＥＤ ＶＥＲＮＡＬＩＺＡＴＩＯＮ ＲＥＳＰＯＮＳＥ ２）、ＶＩＮ３（ＶＥＲＮＡＬＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＳＥＮＳＩＴＩＶＥ ３）、ＣＯＮＳＴＡＮＳ、ＧＩＧＡＮＴＥＡ、ＦＰＦ１（ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＰＲＯＭＯＴＩＮＧ ＦＡＣＴＯＲ １）、ＳＶＰ（ＳＨＯＲＴ ＶＥＧＥＴＡＴＩＶＥ ＰＨＡＳＥ）、及びＡＧＬ２４ （ＡＧＡＭＯＵＳ−ＬＩＫＥ ２４）、ＦＬＣ（ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ Ｃ）、ＦＲＩＧＩＤＡ、及びＴＦＬ１ （ＴＥＲＭＩＮＡＬ ＦＬＯＷＥＲ １）を含む遺伝子の群から選択される。
好適な実施形態において、内因性サトウダイコン遺伝子ＢｖＦＴ１及び／又はＢｖＦＴ２の調節に加えて、上記の本発明の開花制御に関与する１つ又はそれ以上の他の遺伝子の発現が調節されているサトウダイコン植物、又はその細胞若しくは組織が処理されて糖を生産する糖生産法が提供される。開花制御に関与する１つ又はそれ以上の他の遺伝子は、好ましくは上記したＡＧＬ２０（ＡＧＡＭＯＵＳ−ＬＩＫＥ ２０）、ＶＲＮ１（ＲＥＤＵＣＥＤ ＶＥＲＮＡＬＩＺＡＴＩＯＮ ＲＥＳＰＯＮＳＥ １）、ＶＲＮ２（ＲＥＤＵＣＥＤ ＶＥＲＮＡＬＩＺＡＴＩＯＮ ＲＥＳＰＯＮＳＥ ２）、ＶＩＮ３（ＶＥＲＮＡＬＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＳＥＮＳＩＴＩＶＥ ３）、ＣＯＮＳＴＡＮＳ、ＧＩＧＡＮＴＥＡ、ＦＰＦ１（ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＰＲＯＭＯＴＩＮＧ ＦＡＣＴＯＲ １）、ＳＶＰ（ＳＨＯＲＴ ＶＥＧＥＴＡＴＩＶＥ ＰＨＡＳＥ）、及びＡＧＬ２４（ＡＧＡＭＯＵＳ−ＬＩＫＥ ２４）、ＦＬＣ（ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ Ｃ）、ＦＲＩＧＩＤＡ、及びＴＦＬ１（ＴＥＲＭＩＮＡＬ ＦＬＯＷＥＲ １）を含む遺伝子の群から選択される。
さらに、本発明は、本発明の糖生産法により生産される糖を提供する。
本発明の別の実施形態は、好気性発酵法又は嫌気性発酵法の方法における、本発明の、内因性サトウダイコン遺伝子ＢｖＦＴ１及び／又はＢｖＦＴ２の調節に加えて、開花制御に関与する１つ又はそれ以上の他の遺伝子の発現が調節されているトランスジェニック・サトウダイコン植物、又は植物の部分の使用に関する。好気性発酵法又は嫌気性発酵の方法は、当業者に既知である。開花制御に関与する１つ又はそれ以上の他の遺伝子は、好ましくは上記したＡＧＬ２０（ＡＧＡＭＯＵＳ−ＬＩＫＥ ２０）、ＶＲＮ１（ＲＥＤＵＣＥＤ ＶＥＲＮＡＬＩＺＡＴＩＯＮ ＲＥＳＰＯＮＳＥ １）、ＶＲＮ２（ＲＥＤＵＣＥＤ ＶＥＲＮＡＬＩＺＡＴＩＯＮ ＲＥＳＰＯＮＳＥ ２）、ＶＩＮ３（ＶＥＲＮＡＬＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＳＥＮＳＩＴＩＶＥ ３）、ＣＯＮＳＴＡＮＳ、ＧＩＧＡＮＴＥＡ、ＦＰＦ１（ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＰＲＯＭＯＴＩＮＧ ＦＡＣＴＯＲ １）、ＳＶＰ（ＳＨＯＲＴ ＶＥＧＥＴＡＴＩＶＥ ＰＨＡＳＥ）、及びＡＧＬ２４（ＡＧＡＭＯＵＳ−ＬＩＫＥ ２４）、ＦＬＣ（ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ Ｃ）、ＦＲＩＧＩＤＡ、及びＴＦＬ１（ＴＥＲＭＩＮＡＬ ＦＬＯＷＥＲ １）を含む遺伝子の群から選択される。
別の好適な態様は、内因性サトウダイコン遺伝子ＢｖＦＴ１及び／又はＢｖＦＴ２に加えて、開花制御に関与する１つ又はそれ以上の他の遺伝子の発現が調節されている本発明のサトウダイコン植物、又は生物学的試料、若しくはその抽出物を処理して、１つ又はそれ以上の生物燃料を生産することにより、エタノール、バイオガス、及び／又はバイオディーゼルから成る群から選択される１つ又はそれ以上の生物燃料を生産する方法に関する。開花制御に関与する１つ又はそれ以上の他の遺伝子は、好ましくは上記したＡＧＬ２０（ＡＧＡＭＯＵＳ−ＬＩＫＥ ２０）、ＶＲＮ１（ＲＥＤＵＣＥＤ ＶＥＲＮＡＬＩＺＡＴＩＯＮ ＲＥＳＰＯＮＳＥ １）、ＶＲＮ２（ＲＥＤＵＣＥＤ ＶＥＲＮＡＬＩＺＡＴＩＯＮ ＲＥＳＰＯＮＳＥ ２）、ＶＩＮ３（ＶＥＲＮＡＬＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＳＥＮＳＩＴＩＶＥ ３）、ＣＯＮＳＴＡＮＳ、ＧＩＧＡＮＴＥＡ、ＦＰＦ１（ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＰＲＯＭＯＴＩＮＧ ＦＡＣＴＯＲ １）、ＳＶＰ（ＳＨＯＲＴ ＶＥＧＥＴＡＴＩＶＥ ＰＨＡＳＥ）、及びＡＧＬ２４（ＡＧＡＭＯＵＳ−ＬＩＫＥ ２４）、ＦＬＣ（ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ Ｃ）、ＦＲＩＧＩＤＡ、及びＴＦＬ１（ＴＥＲＭＩＮＡＬ ＦＬＯＷＥＲ １）を含む遺伝子の群から選択される。
本発明は、本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物における、抗生物質又はバイオプラスチックの生産のような他の工業的応用を含む。さらに本発明のトランスジェニック・サトウダイコン植物又はその部分もまた、さらなる処理をすることなく、例えば牛の飼料として使用することもできる。
以下の例は例示的実施形態を提供する。本開示、及び当該分野の一般的レベルを考慮すると以下の例は例示のみであり、本発明で請求される主題の変更態様から逸脱することなく、多くの変化、修飾、及び変更がなされ得ることを、当業者は理解し得る。
実施例１：ベータＦＴホモログのクローニング、及びその進化的関係の解析
サトウダイコンからのＦＴホモログ（ベータＦＴホモログと呼ばれる）を増幅しクローン化するために、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（ＡｔＦＴ、受入番号ＮＭ＿１０５２２２）、柑橘類（ＣｉＦＴ、受入番号ＡＢ０２７４５６）、小麦（ＴａＦＴ、受入番号ＡＹ７０５７９４）、及びコメ（ＯｓＨｄ３ａ、受入番号ＮＭ＿００１０６３３９５）からのＦＴオルソログのｃＤＮＡを整列して、保存されたヌクレオチド配列に対する縮重プライマーを設計した（図１）。後述のように、プライマーＨｉＮＫ５８１とＨｉＮＫ８６０との組合せが最も有効であった。
縮重プライマーＨｉＮＫ５８１（５’−ＡＣＣＡＧＣＣＮＡＧＲＧＴＹＧＡＲＡＴＨＧＧＹＧＧ−３’、配列番号１）は、サトウダイコンからのＦＴホモログの配列のエクソン１（アミノ酸残基５１〜５８）に位置する保存アミノ酸配列モチーフ「ＫＰＲＶＥＩＧＧ」を標的とする；プライマーＨｉＮＫ８６０（５’−ＧＧＹＴＧＧＴＳＡＣＮＧＡＹＡＴＹＣＣＮＧＣＮＡＣＮＡＣ−３’、配列番号２）は、イントロン２のスプライシング部位のすぐ下流のエクソン３にハイブリダイズし、アミノ酸配列モチーフ「ＬＶＴＤＩＰＡＴＴ」（アミノ酸残基８９〜９８）を標的とする。
ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉキットを使用して、サトウダイコンの葉から総ＲＮＡを抽出し、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．のＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ（登録商標）ＲＬＭ−ＲＡＣＥキットを使用してｃＤＮＡに変換した。実験条件は基本的にキットとともに供給された３’ＲＬＭ−ＲＡＣＥプロトコールに記載されたものであり、逆転写酵素反応のプライマーとして３’ＲＡＣＥアダプター（５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴ12ＶＮ−３’；配列番号３５）を使用した。その後、ｃＤＮＡ反応から開始し、２回の連続したＰＣＲにおける初期鋳型として、３’ＲＡＣＥ外部プライマー（５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ−３’；配列番号３６）を、縮重プライマーＨｉＮＫ５８１と組合せて使用し、次に通常のＰＣＲ反応において、３’ＲＡＣＥ内部プライマー（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’；配列番号３７）を縮重プライマーＨｉＮＫ８６０と組み合わせて使用して、推定ＢｖＦＴホモログを増幅した。こうして得られた増幅断片は、異種物からのＦＴオルソログの配列にしたがって予測されるように約０．３Ｋｂのサイズであった。当業者に既知の日常的方法を応用して、ＰＣＲ産物を切断し、精製し、クローン化し、配列決定した。続く配列決定解析により、２種類のホモログが明らかとなったが、これらはＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２（それぞれ、配列番号３と４に示す）と呼ばれる異なる配列であり、両方ともシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＦＴタンパク質（ＡｔＦＴ、受入番号ＮＰ＿１７６７２６）と強い配列相同性を有した。
サトウダイコンからの両方のＦＴホモログの完全長ゲノム配列を回収するために、各ＦＴホモログに対して設計されたプライマーを使用するＰＣＲにより、サトウダイコンＢＡＣライブラリーをスクリーニングした。このライブラリーは、二年生の商業的栽培品種Ｈ２０から開発され、平均挿入体サイズが１２０Ｋｂの６個のゲノム相当物であると計算された（ＭｃＧＲＡＴＨ ｅｔ ａｌ．，２００４）。このライブラリーのＤＮＡプールは、Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｐｕｌｌｍａｎ ＷＡにより配布された。ＤＮＡプールのスクリーニングのためのＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃で５分の初期変性後、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、そして７２℃で３０秒の増幅サイクルを３５回行い、次に７２℃で５分とした。ＰＣＲ実験は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．のＧｅｎｅＡＭＰ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００装置でＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼとＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの対応する反応ミックスを、業者の勧める通りに使用して行った。次にいずれかのＢｖＦＴ断片の存在についてＤＮＡプールを業者の勧める通りにスクリーニングすると、ＢｖＦＴ１についてＢＡＣ ＳＢＡ０６６＿Ｇ０４が、そしてＢｖＦＴ２についてＳＢＡ０７７＿Ｎ０２が確実に同定された。すでに利用できるｃＤＮＡ断片から開始してＳａｎｇｅｒ配列解析を行うために、両方のＢＡＣをＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙに送った。
両方のｃＤＮＡ断片に対するゲノム配列の整列と、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＦＴ遺伝子に対する配列相同性とに基づき、図２と３に模式的に示すように、イントロンとエクソンとを含むベータＦＴ遺伝子の指定遺伝子構造が予測された。この予測に基づくと、ＢｖＦＴ１のゲノム配列はＡＴＧ開始コドンの上流の０．７Ｋｂの全遺伝子にまたがる（配列番号５）。ＢｖＦＴ１の対応するコード配列とアミノ酸配列とをそれぞれ配列番号６と７に示す。ＢｖＦＴ２のゲノム配列は、ＡＴＧ開始コドンの上流の１．１Ｋｂの全遺伝子にまたがる（配列番号８）。ＢｖＦＴ２の対応するコード配列とアミノ酸配列とをそれぞれ配列番号９と１０に示す。ＢｖＦＴ１とＢｖＦＴ２の完全長アミノ酸配列をシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＦＴのタンパク質配列と整列させると、強い配列相同性がさらに確認された：ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して、ＢｖＦＴ１は７２％の同一性と８２％の類似性とを示し、ＢｖＦＴ２は７５％の同一性と８８％の類似性とを示した（図４と５）。さらに異なる種からのＦＴファミリーメンバーの大きな集団に対してＢｖＦＴ１とＢｖＦＴ２タンパク質を整列させ、Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ法（ＳＡＩＴＯＵ ａｎｄ ＮＥＩ，１９８７）に従って整列を系統樹に変換すると、ＢｖＦＴ１とＢｖＦＴ２の両方ともＦＴ様クレード中に集まる（図６）。
実施例２：ＢｖＦＴ１とＢｖＦＴ２のマッピング
それぞれＢｖＦＴ１とＢｖＦＴ２とを標的とするプライマー対ＳＥＬＡ３７７０（配列番号１１）及びＳＥＬＡ３７７１（配列番号１２）、ならびにＳＥＬＡ３７７６（配列番号１３）及びＳＥＬＡ３７７７（配列番号１４）を使用して、１６個のサトウダイコン系統のセットにわたって、各遺伝子につき全エクソン１、イントロン１、及びエクソン２からなるゲノム断片を増幅し、且つ配列決定した。ＢｖＦＴ１については、５個のハプロタイプ又は対立遺伝子が７個のＳＮＰと１個のＩＮＤＥＬにより区別され、ＢｖＦＴ２については、２個の対立遺伝子が２個のＳＮＰのみにより解析された（表１参照）。
表１：ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の両方に関して、サトウダイコン系統間で観察された配列多型。多型ヌクレオチド位置の番号付けは、それぞれ配列番号５及び８に従う。
Figure 2012501172
ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２をマッピングするために、ＥｎｄＰｏｉｎｔ ＴａｑＭａｎ（登録商標）法を使用して、ＢｖＦＴ１について位置＃９３５のＳＮＰ（配列番号５）、そしてＢｖＦＴ２について位置＃１５０８のＳＮＰ（配列番号８）を標的とする２つのアッセイを開発した。表２は、２つのアッセイについて設計されたプライマーとプローブ（ＦＴ１（Ｔ１）及びＦＴ２（Ｔ１）と呼ぶ）のヌクレオチド配列を要約する。反応物はさらに、製造業者の勧めに従って、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．のＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，Ｎｏ ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ＵＮＧ（２Ｘ）から構成された。ＰＣＲ増幅を以下のように行った：Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ７５００ Ｓｙｓｔｅｍ装置を使用して９５℃で１０分後、９５℃で１５秒と６０℃で１分を４０サイクル。終点測定は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアを使用して行った。
表２：それぞれＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２を標的とする、ＴａｑＭａｎアッセイＦＴ１（Ｔ１）及びＦＴ２（Ｔ１）のために設計され、且つ当該アッセイのために使用された、プライマーとプローブのヌクレオチド配列
Figure 2012501172
上記ＴａｑＭａｎアッセイを使用して、ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２遺伝子を、それぞれＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２を示す位置＃９３５と＃１５０８の両方のＳＮＰから得られる２８４個体のＦ３集団中にマッピングした。この集団はあらかじめ、パブリックＳＮＰマーカー（ＳＣＨＮＥＩＤＥＲ ｅｔ ａｌ．，１９９９；ＳＣＨＮＥＩＤＥＲ ｅｔ ａｌ．，２００２）のセットを用いて遺伝子型判定された。当業者に既知の遺伝子マッピングのためのＪｏｉｎＭａｐ３．０ソフトウェアを使用して、ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２をそれぞれ染色体ＩＸ及び染色体ＩＶにマッピングした（図７）。
実施例３：ＢｖＦＴホモログの遺伝子発現解析
ベータＦＴホモログの発現パターンの解析のために、二年生植物の種子、実生、栄養器官、及び生殖器官からなる植物組織をサンプリングした。植物を１８℃の定温で１８時間の明／６時間の暗（ＬＤ）の光周期のチャンバー中で培養した。これらの組織中のＦＴホモログの発現レベルを、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により解析した。
基本的に業者の説明書に従って、Ａｍｂｉｏｎから販売されているＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）−４ＰＣＲキットを使用して総ＲＮＡを単離した。ＲＥＴＲＯｓｃｒｉｐｔ（登録商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、鋳型として１μｇの総ＲＮＡから出発して、ＲＮＡ試料をｃＤＮＡに変換した。ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の発現は、Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ７５００ Ｓｙｓｔｅｍ装置上でＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を使用して測定した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃で１０分の初期変性後、９５℃で１５秒と６０℃で１分の増幅サイクルを４０回。ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の順方向プライマー及び逆方向プライマーのヌクレオチド配列は以下の通りであった：ＢｖＦＴ１のために、５’−ＣＡＣＡＡＧＴＧＣＡＴＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＧ−３’（配列番号２３）、及び５’−ＴＴＣＣＣＡＡＴＴＧＣＣＧＡＡＡＣＡＡ−３’（配列番号２４）、並びにＢｖＦＴ２のために５’−ＧＧＧＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＣＴＧＧＴＴＧＧＴＧＡＣＴ−３’（配列番号２５）及び５’−ＴＣＣＡＡＣＴＧＡＴＧＧＴＣＴＴＧＧＡＴＴＴＴ−３’（配列番号２６）。ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の発現を標準化するための基準遺伝子として、イソクエン酸脱水素酵素遺伝子（ＢｖＩＣＤＨ）を使用した。ＢｖＩＣＤＨ（ＡＦ１７３６６６）のプライマー配列は、５’−ＣＡＣＡＣＣＡＧＡＴＧＡＡＧＧＣＣＧＴ−３’（配列番号２７）及び５’−ＣＣＣＴＧＡＡＧＡＣＣＧＴＧＣＣＡＴ−３’（配列番号２８）であった。発現レベルは三重測定の平均として計算し、各ｑＰＣＲ反応を３回繰り返した。データを、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、及びＧｅｎＥｘソフトウェア（ＭｕｌｔｉＤ Ａｎａｌｙｓｅｓ）を使用して解析した。
ＢｖＦＴ１は幼若期植物の葉の先端で高度に発現されたが、生殖期の植物ではその転写がかろうじて検出できただけであった（図８）。ＢｖＦＴ１と比較して、ＢｖＦＴ２は主に生殖期植物の広がった葉で発現されることがわかった。
ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の発現レベルはまた、二年生及び一年生サトウダイコン植物における異なる生長段階にわたって採取された葉で解析された。植物を１８℃の定温で１８時間の明／６時間の暗（ＬＤ）の光周期の環境が制御されたチャンバー中で栽培した。二年生植物の生長を、５℃に設定した温度と、１２時間の明／１２時間の暗の１４週間の春化期間により妨害した。春化処理の前後の栽培期間を通じて、毎週、昼日中に葉を採取した。最後のサンプリングは、約１０ｃｍの茎の伸長（これは生殖期へのスイッチを示す）を示す植物について行った（図９）。
ＢｖＦＴ１転写物は、二年生植物の栄養生長段階の葉で容易に検出されたが、春化後発現レベルが低下し、栄養生長段階から生殖期まで低く維持された。対照的に、ＢｖＦＴ２発現は、幼若期二年生植物でかろうじて検出され、抽薹の最初の兆候の前に劇的に上昇した。驚くべきことに、ＢｖＦＴ１は、一年生植物の幼若期に非常に低レベルで発現され低いままであり、一方ＢｖＦＴ２発現は、二年生植物で観察されたように抽薹の最初の目に見える兆候の前に高レベルまで上昇した。これらの観察結果は、ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の両方の発現が、植物の生長段階に応じて活発に制御され、非常に異なる発現プロフィールを有することを示す。抽薹時期の前に一年生植物及び二年生植物で観察されたＢｖＦＴ２の発現の上昇は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＦＴ遺伝子の発現プロフィールと非常によく似ており、これは、ＢｖＦＴ２がＦＴオルソログであることを示唆する。
実施例４：ＢｖＦＴ１とＢｖＦＴ２発現に対する光周期の影響
開花時期の制御におけるＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の制御、並びにその役割をさらに調べるために、一年生、二年生、及び春化二年生サトウダイコン植物の葉試料について、異なる光周期で日内周期にわたって発現解析を行った。３つの実験を独立に行い、ここで植物は、１８℃の定温でそれぞれＳＤ条件下（１０時間の明／１４時間の暗）、ＬＤ条件（１８時間の明／６時間の暗）、又はＬＤＳＤＬＤ条件下のいずれかで栽培した。ＬＤＳＤＬＤ条件は、植物を最初にＳＤ条件で栽培し、１週間ＳＤ条件に移し、次にＬＤ条件に戻したことを意味する（図１０）。植物を抽薹時期について追跡し（図１１）、上記実施例３に記載のように、ｑＰＣＲにより遺伝子発現解析を行った。ＳＤ条件下で、ＢｖＦＴ２は３種類の植物（すなわち、一年生、二年生、及び春化二年生サトウダイコン植物）でほとんど検出されず、一方ＢｖＦＴ１は、夜明け後４時間目に明らかな発現ピークを示した。ＢｖＦＴ１発現の変動強度は、すべての植物で同様に高かった。ＳＤ条件とは異なり、ＢｖＦＴ２は、ＡｔＦＴとよく似て一年生及び春化二年生植物において、ＬＤ条件下で日内変動を示し、発現ピークはその日の最後であり、ＢｖＦＴ２がベータ中の真のＦＴオルソログである可能性をさらに示唆した。ＢｖＦＴ１はまたＬＤ条件下で発現、制御されていることがわかったが、強度は一年生及び春化二年生植物で大きく低下した。ＢｖＦＴ１とＢｖＦＴ２との間で観察された対照的な発現プロフィールは、開花時期と関連していることがわかった。実際、植物が、高発現レベルのＢｖＦＴ１及び低発現レベルのＢｖＦＴ２を示すＳＤ条件下では、いずれの植物も抽薹まで進行せず、一方、主に発現されるＦＴホモログがＢｖＦＴ２であるＬＤ条件下では、一年生及び春化二年生植物は開花にスイッチした。ＬＤ条件への移行の前にＳＤ条件下で植物を栽培すると、驚くべきことに一年生植物のみがＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の発現レベルに顕著な変化を示さずに抽薹した。これに対して春化二年生植物はＢｖＦＴ１とＢｖＦＴ２発現レベルが非春化二年生植物で観察された発現レベルまでの後退を示し、これは連続的栄養生長に関連していた。
まとめると、これらのデータは、二年生植物が抽薹できるためには春化が必要であるが、春化後の最後のスイッチを起動するためにＬＤが必須であることが確認された。ここで我々は、一回のみの光周期から１週間のＳＤへの光周期の変動が、二年生植物が春化中に獲得する開花の開始を逆転するのに充分であることを示す。ＢｖＦＴ２発現の誘導がＬＤ条件下でいかに速く起きるかを評価するために、我々は、一回のＳＤ後でさえ、ＬＤに応答するような一年生植物中のＢｖＦＴ２の発現探索を継続した。一年生植物をＳＤ（１０時間の明／１４時間の暗）で１０日間栽培し、次に１１日目に明期を延長して昼の長さの条件をＬＤ（１８時間の明／６時間の暗）に移した。我々は、ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の発現を７２時間にわたって測定した。ＢｖＦＴ２は、昼の長さの延長の２４時間以内に誘導されることが分かり（図１２）、そしてそれはまた、ＢｖＦＴ１発現の低下に関連していることが分かった。従って、ＬＤへの一回の２４時間の曝露は、ＢｖＦＴ１の発現を下方制御し、ＢｖＦＴ２の上方制御を促進するのに充分であった。これらの観察結果は、ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の発現が互いに排他的であり、ＢｖＦＴ１が発現される限りＢｖＦＴ２の発現が妨害されることを示唆しており、そしてそのことは、この２つの遺伝子間のネガティブフィードバックを示唆している。
実施例５：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における、ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の分子的機能の評価
ＢｖＦＴホモログの機能を評価するために、ＢｖＦＴ１とＢｖＦＴ２の両方のｃＤＮＡのコード領域を、構成性ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下の遺伝子カセット中に集め、その後シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）へ形質転換した。
Ｇａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ ｆｌａｇｓと隣接した、それぞれ配列番号６と９で示されるＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の両方のコード領域の合成を、Ｍｉｌｌｅｇｅｎ ＳＡ（Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）へ外注した。得られたｃＤＮＡ断片を次に、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニングシステム（Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＢＥＰ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ）を使用して、業者の勧めるプロトコールに従って、相同性ＢＰ組換えにより、ｐＤＯＮＲ２０１ドナーベクター中に導入した。組換えベクターを電気穿孔法により大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株に形質転換し、当業者に既知の標準的方法を使用して組換えの成否についてスクリーニングした。ｐＤＯＮＲ２０１−ＢｖＦＴ１及びｐＤＯＮＲ２０１−ＢｖＦＴ２エントリーベクターの遺伝子カセットを、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニングシステム（Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＢＥＰ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ）を使用して、業者の勧めるプロトコールに従って、相同性ＬＲ組換えにより、ｐＢ７ＷＧ２Ｄ目的ベクター中に導入した。ＢｖＦＴカセットに加えて、こうして得られたバイナリーベクターは、グルホシネート耐性に対する選択を可能にするｎｏｓプロモーターの制御下でｂａｒ遺伝子を有した。バイナリーベクターを電気穿孔法によりアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＷＦ３１０１−ｐＭＰ９０ＫＲ中に移すと、Ｔ−ＤＮＡを、基本的にＣＬＯＵＧＨ ＆ ＢＥＮＴ （１９９８）に記載された花浸漬（ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐｐｉｎｇ）法により、開花しているシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物中に形質転換した。野生型（Ｃｏｌ−０）ならびにｆｔ−１０変異体（これはＦＴとは異なり、１６時間の明／８時間の暗からなる古典的な昼長条件下で、特徴的な晩生開花性表現型を示す）の両方とも、花浸漬実験のアクセプターとして使用した。トランスジェニック植物について選択するために、「浸漬」植物において採取された種子を発芽させ、実生をＢａｓｔａ（登録商標）で処理した。Ｂａｓｔａ（登録商標）耐性植物を別の鉢に移し替え、次に非トランスジェニック実生をコントロールとして使用して、開花について追跡した。
ＢｖＦＴ２の異所性発現により、花成時に平均５．０の葉が形成されたシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（Ｃｏｌ−０）の極端な早生開花性表現型が得られた（図１３及び表３）。ｆｔ−１０変異体の晩生開花性表現型はＢｖＦＴの発現により完全に補完され、ＢｖＦＴ２が実際にサトウダイコン中のＦＴオルソログであることを示唆した。これに対して、ＢｖＦＴ１を発現するトランスジェニックイベントは、開花時に野生型Ｃｏｌ−０とｆｔ−１０変異体植物でそれぞれ平均５６．９と７４．３の葉の、非常に晩生開花性の表現型を示した（図１３と表３）。晩生開花性表現型以外に、ＢｖＦＴ１を発現するトランスジェニック・シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物では、花弁の欠如や花序構造の形成の欠如のようないくつかの形態的異常が観察された。一般にＢｖＦＴ１を発現するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の花器は、包葉により区切られていない花と花序の間の中間的形態を示した。これらのすべての特徴は、ＡｔＴＦＬ１（ＲＡＴＣＬＩＦＦＥ ｅｔ ａｌ．，１９９８）（開花の既知のインヒビター）を過剰発現するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物ですでに観察されており、これは、ＢｖＦＴ１がＦＴ遺伝子ファミリーの系統樹においてＦＴ様クレード中に集まるのにもかかわらず、開花のプロモーターではなくリプレッサーのように作用するという事実をさらに例示する（図６）。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）中の過剰発現実験で明らかとされたＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の相反する機能（すなわち、ＢｖＦＴ１が付与する開花の抑制、これ対して、ＢｖＦＴ２が付与する開花の促進）は、実施例３と４で上記したようにサトウダイコン中の同様に相反する発現プロフィールと一致する。
表３：開花時期に対する、シロイヌナズナ野生型（Ｃｏｌ−０）及びシロイヌナズナｆｔ−１０変異体植物中の、ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の異所性発現の影響。（ＢｖＦＴ２により付与される）開花促進作用は、開花時の葉の数の少なさで示され、（ＢｖＦＴ１により付与される）開花抑制表現型は、開花時の葉の数の多さで示される。
Figure 2012501172
実施例６：エクソン４のＢセグメントへの、ＢｖＦＴ１特異的活性及びＢｖＦＴ２特異的活性のマッピング
ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の相反する機能の原因をさらに調べるために、我々は、インビボでＢｖＦＴ１様又はＢｖＦＴ２様タンパク質活性を付与する領域をマッピングすることを目的として、ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２のキメラを用いて、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（Ｃｏｌ−０）を形質転換した。この実験は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）中でＦＴ様活性とＴＦＬ１様活性とを区別する関連タンパク質モチーフの同定を可能にした、ＨＡＮＺＡＷＡ ｅｔ ａｌ．（２００５）、及びＡＨＮ ｅｔ ａｌ．（２００６）が行った研究に基づく。これらの研究は、ＦＴ遺伝子とＴＦＬ１遺伝子の間の拮抗活性における４番目のエクソンの決定的に重要な役割を実証したため（ＡＨＮ ｅｔ ａｌ．２００６）、この領域がＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の活性の決定因子でもあると予測した。従って、まずＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２の遺伝子間で全エクソン４を交換することにした。２つの対応するキメラ遺伝子を、ＢｖＦＴ１１１２（配列番号２９）及びＢｖＦＴ２２２１（配列番号３０）と呼び、これらは、前者はエクソン１、２、及び３がＢｖＦＴ１由来であり、且つエクソン４がＢｖＦＴ２由来であり、後者はエクソン１、２、及び３がＢｖＦＴ２由来であり、且つエクソン４がＢｖＦＴ１由来であることを示す。少なくとも１５の独立したＴ１形質転換体の葉の数を数えて、キメラＢｖＦＴ遺伝子の活性を解析した（図１４）。ＢｖＦＴ２２２１を発現するトランスジェニック・シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物は野生型よりはるかに遅く開花したが、３５Ｓ：：ＢｖＦＴ１過剰発現体ほど遅くはなかった。対照的に、トランスジェニックＢｖＦＴ１１１２シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物は、トランスジェニック３５Ｓ：：ＢｖＦＴ１植物ですでに観察された晩生開花性表現型を示さず、平均８．１の葉で野生型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物より早く開花した。
それぞれＢｖＦＴ１とＢｖＦＴ２及びＡｔＦＴとＡｔＴＦＬ１の両方の比較で観察されたエクソン４の強い作用のために、ＴＦＬ１オルソログ中では高度に変動性であるが、ＦＴオルソログ中ではほとんど変化しなかったエクソン４の領域Ｂ（ＡＨＮ ｅｔ ａｌ．，２００６）のみを交換することにより、第２のセットのキメラ遺伝子（ＢｖＦＴ１Ｅ４Ｂ２（配列番号３１）とＢｖＦＴ２Ｅ４Ｂ１（配列番号３２））を作成した。この領域ではＢｖＦＴ１とＢｖＦＴ２タンパク質は３つのアミノ酸のみが異なり（図１４）、これがＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２タンパク質の陰イオン結合ポケットの隣接外部ループ内の変化を引き起こし、これが、２つのタンパク質間で観察された相反する生物学的機能に寄与し得る。トランスジェニックＢｖＦＴ２Ｅ４Ｂ１植物は、トランスジェニックＢｖＦＴ２２２１植物と同様の晩生開花性表現型を示し、一方で、ＢｖＦＴ１Ｅ４Ｂ２の過剰発現は早生表現型を促進し、花器時期に平均７．３の葉が形成された。従ってＦＴ２タンパク質の外部ループドメインを有するＢｖＦＴ１タンパク質は基本的に、真正のＢｖＦＴ２タンパク質として開花を加速するのに有効であり、かつ逆も真であり、ＦＴ１の外部ループドメインを有するＢｖＦＴ２タンパク質は基本的に、真正のＢｖＦＴ１として開花の有効なサプレッサーとなる。これらの結果は、エクソン４のＢセグメントに対応するＦＴ様タンパク質の外部ループ領域がタンパク質機能に決定的に重要であり、ＢｖＦＴ１とＢｖＦＴ２の間で観察されたような３つのみのアミノ酸置換の差が、開花のプロモーターをベータ中の開花のリプレッサーに変換するのに充分であり、逆も真であることを示している。
実施例７：ＢｖＦＴ２のトランスジェニック抑制は、サトウダイコンに抽薹耐性を付与する
ＢｖＦＴ２を下方制御することによってサトウダイコン中の抽薹耐性を改変する実現可能性を探るために、一年生及び二年生背景の両方で、ＢｖＦＴ２から得られるＲＮＡｉカセットを有するトランスジェニック・サトウダイコン植物を作成した。「リコンビナントＰＣＲ」（ＨＩＧＵＣＨＩ，１９９０）と呼ばれる方法により、主にエクソン４からなるＦＴホモログＢｖＦＴ２の０．２７ＫｂのｃＤＮＡ断片を、ジャガイモＳｔＬＳ１遺伝子からの第２イントロンに融合させた（ＥＣＫＥＳ ｅｔ ａｌ．，１９８６；ＶＡＮＣＡＮＮＥＹＴ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ＢｖＦＴ１に影響を与えることなくＢｖＦＴ２の特異的サイレンシングを保証するために、ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２は、エクソン４にわたって充分な配列変化を示す。（実施例１に記載した通りに、二年生サトウダイコンの葉から得られた総ＲＮＡから合成された）ｃＤＮＡから、プライマーＨｉＮＫ６３８２：
Figure 2012501172
（配列番号４４）、及びＨｉＮＫ６３８４：
Figure 2012501172
（配列番号４５）（前者はＢａｍＨＩ制限部位を付加する短いリンカーを有し、後者はＳｔＬＳ１イントロンの５’末端に相補的な１７ヌクレオチドのテイル（ｔａｉｌ）を有する）を使用して、ＢｖＦＴ２断片を増幅した（リンカーとテイルにはこれ以後、下線が引かれる）。ＳｔＬＳ１イントロン、及び隣接するスプライシング部位を含む、０．１９Ｋｂの断片を、ＳｔＬＳ１イントロンを含むジャガイモＤＮＡから、プライマーＨｉＮＫ６３８３：
Figure 2012501172
（配列番号４６）、及びＨｉＮＫ５２９：
Figure 2012501172
（配列番号４０）（ＨｉＮＫ５２９はＳａｃＩＩの認識配列を含むリンカーを有し、ＨｉＮＫ６３８２は０．２７ＫｂのＢｖＦＴ２断片の５’末端と同一である２２個のヌクレオチドのテイルを有する）を使用して増幅した。テイル付加の結果として、プライマーＨｉＮＫ６３８４、及びＨｉＮＫ６３８３、並びにこれらの同種の増幅生成物は、３９個のヌクレオチド長にわたって互いに相補的である。この重複のために、両方の増幅生成物を、プライマーＨｉＮＫ６３８２及びＨｉＮＫ５２９を使用して、鋳型として両方の増幅生成物の混合物を使用する２回目のＰＣＲによって互いに融合して、ＳｔＬＳ１イントロン断片の上流でアンチセンス方向のＢｖＦＴ２断片の間に、長さ０．４７Ｋｂの融合生成物を得た。ＢｖＦＴ２における、それぞれＨｉＮＫ６３８２及びＨｉＮＫ６３８４と同じ配列を標的とするが、異なるリンカーを有する、プライマーＨｉＮＫ６３８５：
Figure 2012501172
（配列番号４７）、及びＨｉＮＫ６３８６：
Figure 2012501172
（配列番号４８）を使用して、２回目の０．２７Ｋｂ ＢｖＦＴ２断片の増幅を行った（ＨｉＮＫ６３８５及びＨｉＮＫ６３８６は両方とも、それぞれＳａｃＩＩ及びＳａｌ Ｉ認識配列を付加するための５’リンカーを有する）。両方の断片をＳａｃＩＩ制限部位で融合して、ジャガイモＳｔＬＳ１遺伝子からのイントロンにより分離されたＢｖＦＴ２配列の逆方向反復を作成した。ＢｖＦＴ２断片の逆方向反復は、ジャガイモＳｔＬＳ１遺伝子からの２番目のイントロンにより分離されてＲＮＡｉカセットを安定化したが、ＲＮＡｉサイレンシングの効率を改良した（ＳＭＩＴＨ ｅｔ ａｌ．，２０００；ＷＡＮＧ ａｎｄ ＷＡＴＥＲＨＯＵＳＥ，２００１）。約０．７３Ｋｂのこうして得られた逆方向反復を次に、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からのＵＢＱ３プロモーター（ＮＯＲＲＩＳ ｅｔ ａｌ．，１９９３）と、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）からのｎｏｓターミネーターとの間に導入した。次に、遺伝子カセットを２．４ＫｂのＡｓｃＩ−ＰａｃＩ断片として、特許で保護されているバイナリー形質転換ベクターｐＶｉｃｔｏｒＨｉＮＫのＴ−ＤＮＡに移して、ｐＨｉＮＫ５２５を得た。アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）からのｈｓｐ８０プロモーター（ＢＲＵＮＫＥ ａｎｄ ＷＩＬＳＯＮ，１９９３−ＥＰ０５５９６０３）の制御下のＰＭＩ選択マーカー遺伝子と組み合わせて、ＢｖＦＴ２のＲＮＡｉ遺伝子カセットを有するバイナリーベクターのプラスミド地図を図１５に示す。バイナリーベクターｐＨｉＮＫ５２５の配列を配列番号３３に示す。ＲＮＡｉカセットによる遺伝子型Ｇ０１８の一年生及び二年生サトウダイコンの形質転換の実験法は、基本的にＷＯ０２／１４５２３に記載のような複数苗条プロトコールであり、外植片物質としてサトウダイコン分裂組織と選択剤としてマンノース−６−ホスフェートを、ＷＯ９４／２０６２７に記載のように選択マーカーとしてのホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子とともに使用した。初代形質転換体をＴ０植物と呼び、以後の世代は、Ｔ１、Ｔ２、Ｔn植物と呼ぶ。温室に入れると、土壌を入れた鉢で強化したＣＯ２条件下で２週間栽培したＰＭＩ陽性Ｔ０苗条と非トランスジェニック対照がまず根付いた。次に、根付いた植物をφ１２ｃｍ（０．７リットル）の鉢に移して置いて、バイオチャンバーに移し１８℃で少なくとも２週間の馴化期間（１８時間の人工的光；日中１８℃＋夜間温度）後、春化を行った。
二年生トランスジェニック植物及び対照植物を、６℃の定温で１２時間の明／１２時間の暗の光周期で１４〜１６週間春化した。抽薹誘導条件を適用する前に、温度を１０℃から１８℃に徐々に段階的に上昇させて人工気象室中で２週間、春化植物をゆっくり馴化させた。次に植物を大きな鉢（２リットル）に移し替え、１８℃の定温で１８時間の明／６時間の暗の光周期に曝露しながら抽薹を追跡した。抽薹は３〜４日毎に追跡し、頂端分裂組織の最初の視認可能な伸長として定義した。抽薹の遅延は、絶えず同じ再生と春化法を行って、非トランスジェニック対照植物と比較してスコア化した。
非トランスジェニック対照植物、並びにトランスジェニック植物は、春化の３〜４週間後に抽薹を開始した。しかし完全な生殖生長に達した対照植物とは異なり、トランスジェニック植物は、数センチメートルの茎伸長後抽薹が止まり、栄養生長を再開した（表４Ａ）。この現象はまた、脱春化サトウダイコン植物で記載されており、生長阻害（ｓｔｕｎｔｉｎｇ）と呼ばれる。
実施例３に記載のように、内因性ＢｖＦＴ２標的遺伝子のサイレンシングを評価するために、定量的ＰＣＲにより遺伝子発現解析を行った。トランスジェニック植物は、非トランスジェニック対照植物中のＢｖＦＴ２の正常な発現レベルの９５〜９９％の範囲のサイレンシングを示した（表４Ｂ）。トランスジェニック植物を開花させ種子形成させようと何度も試みたが（春化の延長及び／又はジベレリン酸による処理）、得られた二年生イベントは花芽をつけず種子形成もしなかった。
花の生長を開始するために、一年生物質は低温（冬温度）を必要としない。従って、一年生物質を直接人工気象室に移し、春化無しで抽薹誘導条件（１８℃で、１８時間の明／６時間の暗の光周期）に曝露した。馴化及び鉢の植え換えの３〜４週間後、非トランスジェニック一年生植物は抽薹を開始したが、ＢｖＦＴ２を抑制する２４個の一年生イベントのうち１８個は非常に遅い開会表現型を示し、抽薹が２ヶ月以上遅延した。５個のイベントは少なくとも２ヶ月間非抽薹のままであった。１つの非抽薹クローン植物を抽薹誘導条件下に維持すると、少なくとも１５ヶ月間栄養生長のままであった（図１６及び表４Ａ）。ＢｖＦＴ２が抑制された非抽薹一年生サトウダイコンは主根を生長させ、これは一年生遺伝背景では異常であった。遺伝子発現解析は、内因性ＢｖＦＴ２を少なくとも５０％サイレンシングするには、トランスジェニック植物が少なくとも１ヶ月遅れることが必要であることを証明した。非抽薹トランスジェニック植物は、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子のほとんど完全な遺伝子サイレンシング（＞９０％）を示した（表４Ｂ）。
表４：（Ａ）一年生及び二年生対照植物（すなわち非トランスジェニック）とトランスジェニック植物（すなわち、ＢｖＦＴ２の発現が抑制されている植物）における抽薹の遅延。抽薹の遅延は、各クローン植物について、対照植物の平均抽薹日数を同じ決定日から引いて計算した。各イベントの抽薹の遅延は、総数のクローン植物の抽薹の平均遅延（３〜８）を計算して定義した。＜３ｗ＝対照植物と比較して３週間（＝２１日）未満の遅延；＞４ｗ＝対照植物と比較して４週間（＝２８日）を超える遅延；ＮＢ＝実験中抽薹無し；生長阻害（ｓｔｕｎｔｉｎｇ）＝茎伸長（抽薹）が抑制され、植物は栄養生長を再開した。（Ｂ）表４Ａで要約された植物についてさらに詳細を示す表。葉の先端での内因性ＢｖＦＴ２の遺伝子サイレンシングは、定量的ＰＣＲにより、かつ同様の生長段階の対照植物と比較して計算した。イベント−識別子中の数は元々のサトウダイコン外植片を意味する；文字は、すべて同じサトウダイコン外植片に由来する異なるイベントを意味する；Ａｎ／Ｂｉ＝一年生／二年生；植物のＮｏ．＝イベント当たりの植物の数；ＧＭ平均遅延日数＝１つのイベントのクローン植物の平均遅延（いくつかのクローン植物が抽薹を開始したが、スクリーニングの最後に他のクローン植物がまだ非抽薹（ＮＢ）であった時、イベントの抽薹の平均遅延は、少なくとも平均日数の抽薹遅延として計算した；Ｓｔ．Ｄｅｖ＝標準偏差。
Figure 2012501172
しかし春化及び／又はジベレリンによる一年生イベントの処理は、抽薹耐性ＢｖＦＴ２植物から種子を良好に産生した。予想されたように、Ｔ１後代は、トランスジェニック植物と非トランスジェニック植物とに分離された；トランスジェニック植物は、ＰＣＲ解析により同定された。表現型スクリーニング中、トランスジェニック及び非トランスジェニック分離物は、並行して扱い、且つ栽培した。このような方法で、トランスジェニック植物の抽薹挙動は、同じ遺伝背景且つ同じ条件下で、対照植物と直接比較できた。第２世代（Ｔ１）形質転換クローン植物の表現型スクリーニングは、種子から開始した。Ｔ０世代について記載したように、トランスジェニック及び非トランスジェニック対照植物の鉢の植え換えを行い、１８℃で少なくとも１８時間の明の光周期のバイオチャンバーに移し、抽薹について追跡した。内因性ＢｖＦＴ２の６０％を抑制する遅延Ｔ０イベントから得られるトランスジェニック後代植物は、対照植物と比較して８．７日の有意な抽薹遅延を示し、ＢｖＦＴ２の９５〜９９％を抑制するイベントから得られる後代は少なくとも１０週間非抽薹のままであった（実際は、７２日間の実験の最後に植物は非抽薹である）（図１７及び表５）。これらのＴ１の結果は、ＢｖＦＴ２に仲介される抽薹耐性が次世代にうまく移されたことを実証した。
表５：ＢｖＦＴ２を抑制するＴ１サトウダイコンイベントの抽薹挙動。平均抽薹日数＝抽薹が開始した日数の平均数；ＮＢ＝７２日間の実験中、非抽薹。Ｄｕｎｃａｎ検定を行うために、非抽薹表現型に７５日の値を与えた。異なるＤｕｎｃａｎ群を有するイベントは、抽薹時期が有意に異なる；ＧＭ平均遅延日数＝トランスジェニック植物における抽薹の平均遅延。
Figure 2012501172
実施例８：ＢｖＦＴ１のトランスジェニック過剰発現は，サトウダイコンに抽薹耐性を付与する
ＢｖＦＴ１を過剰発現することにより、サトウダイコン中の抽薹耐性を改変する実現可能性を探るために、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の構成性Ｕｂｉ３プロモーター（ＮＯＲＲＩＳ ｅｔ ａｌ．， １９９３）の制御下のＢｖＦＴ１のコード配列（配列番号６）からなる遺伝子カセットを有するトランスジェニック・サトウダイコン植物を、一年生及び二年生背景の両方で作成した。この目的のために、ＧＥＮＥＡＲＴ Ｉｎｃ（ｗｗｗ．ｇｅｎｅａｒｔ．ｃｏｍ）が提供する遺伝子合成サービスで、ＡＴＧ開始コドンのすぐ上流にＢａｍＨ Ｉ制限部位を有し、終止コドンのすぐ下流にＳａｃ Ｉ制限部位を有する０．５６Ｋｂの１つの単一断片として、ＢｖＦＴ１のコード配列を合成した。ＢａｍＨ Ｉ及びＳａｃ Ｉ制限部位を利用して、合成ＢｖＦＴ１断片をＵｂｉ３プロモーター断片とｎｏｓターミネーター断片との間で連結した。次に２．６Ｋｂの完全な遺伝子カセットを、バイナリーベクターｐＶｉｃｔｏｒＨｉＮＫにすでに存在していたＳｕｐｅｒＭＡＳ：：ＰＭＩ：：ｎｏｓ選択マーカー遺伝子の隣のＲｓｒ ＩＩ部位に、ＳａｎＤ Ｉ／Ｒｓｒ ＩＩ断片として、固有の形質転換ベクターｐＶｉｃｔｏｒＨｉＮＫのＴ−ＤＮＡに移した。ＰＭＩ選択マーカー遺伝子とＢｖＦＴ１遺伝子の両方についての遺伝子カセットを有するバイナリーベクター１７６０３のプラスミド地図を図１８に示し、配列番号３４に記載する。一年生及び二年生サトウダイコンへのこのベクターの形質転換は、実施例７に記載の通りに行った。
ＰＭＩ陽性Ｔ０苗条中のＢｖＦＴ１過剰発現をチェックするために、ＢｖＦＴ１転写物の量を、実施例３で上記したように、トランスジェニック植物及び非トランスジェニック対照Ｔ０植物中の初生葉試料で定量した。トランスジェニックイベント間で発現レベルの変動が観察されたが、平均してすべてのトランスジェニックＴ０植物は、非トランスジェニック対照Ｔ０植物と比較してＢｖＦＴ１の発現が上昇した（図１９）。この結果は、Ｕｂｉ３：：ＢｖＦＴ１遺伝子カセットが機能性であり、開花抑制遺伝子ＢｖＦＴ１の強くて構成性の発現を行うことを示している。
根付きと馴化時において、二年生イベントは春化に曝露され、鉢を植え換えられ、実施例７に記載のように１８℃の定温で１８時間の明／６時間の暗の光周期で生長中、抽薹について追跡した。一年生背景で得られたトランスジェニックイベントを抽薹について直接追跡した。二年生対照植物は春化の３〜４週間後、一年生植物は馴化と植え換えの３〜４週間後、抽薹を開始した。ＢｖＦＴ１を過剰発現するトランスジェニック植物は、数週間〜４ヶ月以上の抽薹範囲で、しばしば抽薹の遅延を示した。数個のイベント（一年生と二年生背景の両方）は、バイオチャンバー中で適用した条件下で抽薹を開始しなかった。抽薹と開花の遅延とは別に、トランスジェニック植物は正常に生長し、表現型異常を示さなかった。一般に、抽薹が遅延した植物は、栄養生長段階が延長した結果として、抽薹時期の葉の数が多く、最も遅延した植物は、非春化二年生植物について典型的に観察されたような主根を示した。
実施例９：ＢｖＦＴの条件的発現のためのトランス活性化システム
上記実施例に例示したように、ベータＦＴホモログの発現レベルを制御することは、抽薹耐性の改変を可能にする。そのような抽薹耐性サトウダイコン植物を栽培させ市販するために、ＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２のそれぞれの場合の過剰発現及び／又は下方制御は、条件的で潜伏性であることが必要である。本例では、サトウダイコン中のＢｖＦＴ１及びＢｖＦＴ２に関する遺伝子発現の条件的制御について、ｐＯｐ６／ＬｈＧ４システムの成績を評価した。ｐＯｐ６／ＬｈＧ４システムはキメラ転写因子ＬｈＧ４を含み、ここでＧａｌ４のトランス活性化ドメインＩＩはｌａｃリプレッサーの高親和性ＤＮＡ結合性変異体に融合される。これは、最小ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（ＲＵＴＨＥＲＦＯＲＤ ｅｔ ａｌ．，２００５）の上流の最適化ｌａｃオペレーター配列の６つのコピーを有するｐＯｐ６のようなプロモーターからの転写を活性化する。
ｐＯｐ６／ＬｈＧ４トランス活性化システムが機能性であるトランスジェニックイベントの生成及び選択を促進するために、ＰＭＩ選択マーカー遺伝子をｐＯｐ６プロモーターの下流にクローン化し、同じＴ−ＤＮＡ上のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＵｂｉ３プロモーター（ＮＯＲＲＩＳ ｅｔ ａｌ．，１９９３）の制御下で、ＬｈＧ４Ａｔｏ（ＲＵＴＨＥＲＦＯＲＤ ｅｔ ａｌ．，２００５）の構成性発現のための遺伝子カセットと一緒にして、ｐＨｉＮＫ４９８を得た。このバイナリーベクターのプラスミド地図を図２０に示す。このベクターの配列を配列番号５３に示す。マンノースを選択剤として使用すると、ＰＭＩ陽性イベントの再生は、ｐＯｐ６／ＬｈＧ４／ｐＯｐシステムによりＰＭＩ遺伝子のトランス活性化をうまく受ける。ＰＭＩ選択に関するこの条件的側面とは別に、トランスジェニック・サトウダイコンイベントの形質転換、選択、及び再生法は、前記実施例に記載したものと同じであった。
全体として、ｐＨｉＮＫ４９８の形質転換は、陰性〜極めて高いまでの範囲のＰＭＩ発現レベルを示した６２の独立したイベントを与えた。ＰＭＩ発現は、順方向プライマーとしてプライマーＳＥＬＡ２６７（５’−ＣＣＧＧＧＴＧＡＡＴＣＡＧＣＧＴＴＴ−３’；配列番号５１）を、及び逆方向プライマーとしてＳＥＬＡ２６８（５’−ＧＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＴＧＡＣＡＧＴ−３’；配列番号５２）を使用する、（実施例３に記載された）リアルタイムＰＣＲと、ＪＯＥＲＳＢＯ ｅｔ ａｌ．，１９９８に記載の酵素アッセイとの両方により測定した。
構成性発現されたＳｕｐｅｒＭＡＳ：：ＰＭＩについてトランスジェニックな植物中のレベルと比較して、最大４倍のレベルのＰＭＩ酵素活性が、アクチベーターイベントで見つかった。リアルタイムＰＣＲ法を使用すると、ＳｕｐｅｒＭＡＳ：：ＰＭＩ植物で見られたものの最大３５倍のＰＭＩ発現レベルが見つかった。このアクチベーターイベントを４つのクラスに分けた：陰性、低、中、及び高発現物。ハイブリッド・トランス活性化法を評価するために、低、中、及び高発現物の各クラスについて、４つの独立したイベントを選択した。
ベータＦＴホモログの構成性発現についての第２の遺伝子要素は、ｐＯｐ６プロモーターの制御下の１つの又は両方のＦＴ遺伝子の遺伝子カセットからなる。ＢｖＦＴ２の場合、ｐＨｉＮＫ５２５（実施例７参照）として存在する逆方向反復を、ｐＯｐ６プロモーター断片の下流にクローン化し、ＳｕｐｅｒＭＡＳプロモーター（ＮＩ ｅｔ ａｌ．，１９９５）の制御下のＰＭＩ選択マーカー遺伝子と一緒にした。このバイナリーベクターのプラスミド地図を図２１に示す。このベクターの配列を配列番号５４に示す。同様に、バイナリーベクター１７６０３（実施例８参照）に存在するＢｖＦＴ１の完全長コード領域もまた、ｐＯｐ６プロモーターの下流にクローン化した。このバイナリーベクターのプラスミド地図を図２２に示す。このベクターの配列を配列番号５５に示す。これらの２つのバイナリーベクターのサトウダイコンへの形質転換、及び得られたイベントの、ＬｈＧ４ハイブリッド転写因子を発現するｐＨｉＮＫ４９８の「アクチベーター」イベントへの以後の交配は、各ＢｖＦＴ遺伝子カセットの転写を与え、こうして抽薹耐性を提供する。商業的応用のために、両方の遺伝子要素は、典型的にはハイブリッド種子の生産に使用されるいずれかの並行系統中で、ホモ接合性状態で存在する。雄及び雌親系統を交配すると、耐性ハイブリッド種子は、ヘテロ接合性状態で両方の遺伝子要素のコピーを遺伝し、各ＢｖＦＴ遺伝子カセットの良好なトランス活性化、及び抽薹耐性商業的ハイブリッドにつながる。
実施例１０：工業的応用
本発明はさらに、本発明のサトウダイコン植物から生物燃料及び／又は糖を得る方法を含み、ここで、サトウダイコン植物の根は、生物燃料及び／又は糖の主な供給源である。本発明のサトウダイコン植物、及びサトウダイコン植物の根から得られる糖及び生物燃料は、本発明の範囲内である。サトウダイコンのような供給源から糖及び生物燃料を抽出する方法は、当産業界では周知である。
要約すると、エタノール生産は、サトウダイコンをまず洗浄し薄く切って、次に抽出する工程を含む。抽出工程は２つの生成物を生産する：抽出された糖ジュース、及びサトウダイコンスライス。サトウダイコンパルプは、典型的には試験され、ペレット化され、動物飼料として販売される。したがって、本発明のサトウダイコン植物及び根から得られるサトウダイコンパルプ及び動物飼料は、本発明の範囲内である。ショ糖画分は典型的には、微生物汚染を防ぐために洗浄され、滅菌され、又は処理される。次にショ糖画分は発酵される。当業者に既知の多くの発酵方法がある。ある実施形態において及び例として、サッカロミセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、発酵工程で使用される生物である。発酵中に、多量のＣＯ2が産生される。ＣＯ2は、飲料、消化剤を製造するために、及び食品加工で使用される。アルコール含量が８〜１５体積％の発酵生成物は、蒸留ユニットに送られ、そこで９５％まで濃縮される。エタノールから残存水を除去するために、最後の脱水工程が必要である。エタノール生産は産業界で既知であり、種々の異なる方法を使用して最後のエタノール燃料が製造される。エタノールはまた、サトウダイコン糖液、糖ジュース、乾燥サトウダイコン粉末、及び糖の発酵により製造することができる。バイオガスは、産業界で既知の方法を使用して、サトウダイコンから製造することができる。バイオガスは、メタン、二酸化炭素、並びに少量のＨ2Ｓ及びアンモニアからなり、有機物質の嫌気性発酵中に製造される。発酵法は約１ヶ月かかる。多くの場合、バイオガスは、熱と電力発電の組合せに使用される。ガスは直接燃焼され、熱を発生し、これは家屋の暖房や発電に使用することができる。これはまた、乗り物の燃料としても使用することができる。
バイオディーゼルはまた、サトウダイコンから生成され得る。Ｆｉｓｃｈｅｒ−Ｔｒｏｐｓｃｈ合成を使用して、バイオガスは、液体燃料であるＦＴ−ディーゼルに変換することができる。現時点において、バイオマスからの生産はパイロット段階のみであり、そして大規模Ｆｉｓｃｈｅｒ−Ｔｒｏｐｓｃｈ変換装置は、化石燃料のみ（最も一般的には天然ガス）を使用する。ＦＴ−ディーゼルの利点は、その組成をモーターの燃焼挙動のために最適化することができることである。この燃料は硫黄や芳香族化合物を含まず、そして排出ガスは、通常のディーゼルと比較して、８％少ない一酸化窒素、３０％少ない粒状物質、３０％少ない炭化水素（ＨＣ）、７５少ない一酸化炭素、及び９０％少ない汚染化合物を含む。
Figure 2012501172
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Claims (41)

  1. 配列番号５、６、８、若しくは９のいずれかに記載の核酸配列又はその相補体から成る群から選択される核酸配列
    ａ）と少なくとも７０％の配列同一性を有する；或いは
    ｂ）の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む；或いは
    ｃ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸配列、好ましくは単離された核酸分子。
  2. 配列番号５、６、８、又は９のいずれかに記載の核酸配列を含む、請求項１に記載の核酸配列。
  3. 配列番号１又は２に記載の核酸配列によりコードされるポリペプチド、好ましくは単離されたポリペプチド。
  4. 配列番号７又は１０に記載のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のポリペプチド。
  5. 調節エレメントの制御下、好ましくは植物中で機能する調節エレメントの制御下にある、配列番号１又は２に記載の核酸配列を含むキメラ構築物。
  6. 選択工程において、形質転換植物物質と非形質転換植物物質との区別を可能にする選択マーカー遺伝子をさらに含む、請求項５に記載のキメラ構築物。
  7. ａ）サトウダイコン中の内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現のトランスジェニック下方制御若しくは抑制；又は、
    ｂ）サトウダイコン中の内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現のトランスジェニック上方制御のいずれかのために提供される、請求項５又は６に記載のキメラ構築物。
  8. 前記下方制御若しくは抑制が、
    ａ）ｄｓＲＮＡ；
    ｂ）アンチセンス抑制；又は
    ｃ）コサプレッション
    から成る群から選択される手段により達成される、内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現のトランスジェニック下方制御若しくは抑制のための、請求項７に記載のキメラ構築物。
  9. 第１のＲＮＡ鎖及び第２のＲＮＡ鎖をコードし、並びに転写されたときに第１のＲＮＡヌクレオチド配列及び第２のＲＮＡヌクレオチド配列を生じる異種ＤＮＡを含み、ここで、前記第１のＲＮＡ鎖は、サトウダイコン中の内因性ＢｖＦＴ２遺伝子のＲＮＡ鎖の少なくとも一部と十分に相補的であって、前記内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現の下方制御若しくは抑制を引き起こすために、前記内因性ＢｖＦＴ２遺伝子により産生されるＲＮＡ鎖とハイブリダイズ若しくはアニーリングし、並びに、前記第１のＲＮＡヌクレオチド配列及び前記第２のＲＮＡヌクレオチド配列は２本鎖ＲＮＡを形成し、ここで前記２本鎖ＲＮＡは、サトウダイコン植物中での発現時において、前記内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現のＲＮＡ干渉に関与し、それにより、前記内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現の下方制御若しくは抑制を引き起こす、請求項８に記載のキメラ構築物。
  10. 逆方向反復を、好ましくは構成的プロモーターと作動可能に連結された逆方向反復を含み、そしてそれは転写されたときに、前記第１及び第２のＲＮＡ鎖を含む前記サトウダイコン植物細胞中で２本鎖ＲＮＡ分子を形成し、前記２本鎖ＲＮＡ分子はＢｖＦＴ２のサイレンシングを引き起こす、請求項９に記載のキメラ構築物。
  11. 前記異種ＤＮＡが、請求項１又は２に記載の、配列番号８若しくは９に記載の核酸配列
    ａ）と少なくとも７０％の配列同一性を有する；或いは
    ｂ）の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む；或いは
    ｃ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、
    核酸配列を含む、請求項９又は１０に記載のキメラ構築物。
  12. ヌクレオチド配列５’−ＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＣＡＡＴＧ−３’（配列番号４４）を有する順方向プライマーＨｉＮＫ６３８２、及びヌクレオチド配列５’−ＧＴＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＴＡＴＧ−３’（配列番号４５）を有する逆方向プライマーＨｉＮＫ６３８４を使用するＰＣＲ反応で、ＢｖＦＴ２遺伝子のエクソン４からなる、０．２７ＫｂのｃＤＮＡ断片から得られる異種ＤＮＡを含む、請求項１１に記載のキメラ構築物。
  13. 配列番号３３のヌクレオチド８７４７〜９０４６で示される異種ＤＮＡを含む、請求項１２に記載のキメラ構築物。
  14. 前記キメラ構築物中の前記異種ＤＮＡが、プロモーターとターミネーターとの間に挿入され、ここで、
    ａ）ヌクレオチド配列５’−ＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＣＡＡＴＧ−３’（配列番号４４）を有する順方向プライマーＨｉＮＫ６３８２、及びヌクレオチド配列５’−ＧＴＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＴＡＴＧ−３’（配列番号４５）を有する逆方向プライマーＨｉＮＫ６３８４、並びに鋳型としてサトウダイコンｃＤＮＡを使用するＰＣＲ反応で、ＢｖＦＴ２遺伝子のエクソン４から得られる０．２７ＫｂのｃＤＮＡ断片を増幅し、ここで、前記サトウダイコンｃＤＮＡは、ヌクレオチド配列５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴ１２ＶＮ−３’（配列番号３５）を有する３’ＲＡＣＥアダプターをプライマーとして使用する逆転写反応で、サトウダイコンの葉から抽出された総ＲＮＡから得られ；
    ｂ）ヌクレオチド配列５’−ＣＡＴＡＧＣＡＧＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号４６）を有する順方向プライマーＨｉＮＫ６３８３、及びヌクレオチド配列５’−ＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＧＧＡＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡ−３’（配列番号４０）を有する逆方向プライマーＨｉＮＫ５２９、並びに鋳型としてジャガイモＳｔ−ＬＳ１イントロンを含有するジャガイモＤＮＡを使用して、ＳＴ−ＬＳ１イントロン及び隣接するスプライシング部位を含む、０．１９Ｋｂの断片を増幅し；
    ｃ）プライマーＨｉＮＨ６３８２及びＨｉＮＫ５２９、並びに鋳型として工程ａ）及びｂ）で得られた増幅生成物の混合物を使用する２回目のＰＣＲにより、工程ａ）及びｂ）で得られた増幅生成物を互いに融合し、長さ０．４７Ｋｂの融合生成物を得；
    ｄ）ヌクレオチド配列５’−ＴＡＡＡＴＣＣＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＴＡＴＧ−３’（配列番号４７）を有する順方向プライマーＨｉＮＫ６３８５、及びヌクレオチド配列５’−ＣＴＡＴＴＴＧＴＣＧＡＣＧＣＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＣ−３’（配列番号４８）を有する逆方向プライマーＨｉＮＫ６３８６、並びに鋳型として上記サブセクションａ）に記載されたサトウダイコンｃＤＮＡを使用して、０．２７ＫｂのＢｖＦＴ２断片の２回目の増幅を行い；
    ｅ）ＳａｃＩＩ制限部位で両方の断片を融合させて、前記ジャガイモＳＴ−ＬＳ１遺伝子から、イントロンにより分離されたＢｖＦＴ２配列の逆方向反復を作成すること
    により、前記異種ＤＮＡが得られる、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のキメラ構築物。
  15. 配列番号３３に記載のヌクレオチド配列で示される配列を含む、請求項１４に記載のキメラ構築物。
  16. ＢｖＦＴ１遺伝子又はその一部をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ＢｖＦＴ１遺伝子又はその一部をコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号５若しくは６として示される、請求項１又は２に記載の核酸配列と、
    ａ）少なくとも７０％の配列同一性を有するか；又は、
    ｂ）ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
    ヌクレオチド配列を有し、ここで植物中での発現時に、内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現の上方制御が生じるように、ＢｖＦＴ１遺伝子又はその一部をコードする前記ヌクレオチド配列が、制御配列に作動可能に連結される、内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現のトランスジェニック上方制御のための、請求項７に記載のキメラ構築物。
  17. ＢｖＦＴ１遺伝子をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号６に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項１６に記載のキメラ構築物。
  18. 配列番号３４のヌクレオチド２０７６〜２６１５で示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１６又は１７のキメラ構築物。
  19. 配列番号３４で示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載のキメラ構築物。
  20. 前記異種ＤＮＡが、構成的プロモーター、好ましくはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＵｂｉ３プロモーターに作動可能に連結される、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のキメラ構築物。
  21. 請求項５〜２０のいずれか１項に記載のキメラ構築物を含む、植物形質転換ベクター及び／又は植物発現ベクター。
  22. ａ）請求項５〜１５のいずれか１項に記載のキメラ構築物を含むＲＮＡｉ発現ベクター、及び／又は
    ｂ）請求項５〜７及び１６〜２０のいずれか１項に記載のキメラ構築物を含む発現ベクター
    である、請求項２１に記載の植物形質転換ベクター。
  23. 配列番号３３に記載のヌクレオチド配列を有するキメラ構築物を含む、請求項２２に記載のＲＮＡｉ発現ベクター。
  24. 配列番号３４に記載のヌクレオチド配列を有するキメラ構築物を含む、請求項２２に記載の発現ベクター。
  25. （ａ）内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現が、トランスジェニック・サトウダイコン植物中で下方制御若しくは抑制され；及び／又は
    （ｂ）内因性ＢｖＦＴ１遺伝子の発現が、前記トランスジェニック・サトウダイコン植物中で上方制御される、
    内因性ＢｖＦＴ１遺伝子及び／又はＢｖＦＴ２遺伝子が調節される前記トランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子。
  26. 内因性ＢｖＦＴ２遺伝子の発現が、
    ａ）ｄｓＲＮＡ；
    ｂ）アンチセンス抑制；又は
    ｃ）コサプレッション
    から成る群から選択される方法により下方制御若しくは抑制される、請求項２５に記載のトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子。
  27. 請求項５〜１５のいずれか１項に記載のキメラ構築物、又は請求項１若しくは２に記載の核酸配列を含み、抽薹耐性であり、且つ、遅延抽薹の表現型を、好ましくは非抽薹表現型を示す、請求項２６に記載のトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子。
  28. 請求項５〜７及び１６〜２０のいずれか１項に記載のキメラ構築物、又は請求項１若しくは２に記載の核酸配列を含み、ここで内因性ＢｖＦＴ１は、前記トランスジェニック・サトウダイコン植物中で過剰発現され、並びに前記植物は遅延抽薹の表現型を、好ましくは非抽薹表現型を示す、請求項２５に記載のトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子。
  29. 請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の細胞、組織、又は種子から産生される、トランスジェニック・サトウダイコン植物。
  30. 請求項２５〜２９のいずれか１項に記載のトランスジェニック・サトウダイコン植物の根又は後代。
  31. 抽薹耐性の表現型を有するサトウダイコン植物が生長され得るハイブリッド種子を生産する方法であって、以下の工程：
    ａ．抽薹耐性の表現型を有するサトウダイコン系統、特に、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載のトランスジェニック・サトウダイコン植物を、第１の親系統として提供し；
    ｂ．工程ａ）のサトウダイコン系統とは異なる遺伝子型を有するサトウダイコン系統を、第２の親系統として提供し；
    ここで、工程ａ）又は工程ｂ）の親系統の１つは雄性不稔ｃｍｓ系統であり、他の親系統は雄性稔性であり、並びに、
    ｃ．前記雄性稔性親系統の植物を前記雄性不稔親系統の花に受粉させ、種子を生長させ、及びハイブリッド種子を採取し；
    ここで、採取された前記ハイブリッド種子は、遅延抽薹の表現型を有する、好ましくは非抽薹表現型を有するサトウダイコン・ハイブリッド植物の種子であること
    を含む、前記方法。
  32. 雄性不稔ＣＭＳサトウダイコン親系統が、請求項５〜２０のいずれか１項に記載のキメラ構築物を含む同系繁殖系サトウダイコン系統である、請求項３１に記載のサトウダイコン・ハイブリッド種子を生産する方法。
  33. 遅延抽薹の表現型、好ましくは非抽薹表現型を有する、サトウダイコン植物のハイブリッド種子。
  34. 請求項３１又は３２の方法により産生される、請求項３３に記載のハイブリッド種子。
  35. 請求項３３又は３４のハイブリッド種子を生長させることにより産生される、遅延抽薹の表現型、好ましくは非抽薹表現型を有する、ハイブリッド・サトウダイコン植物。
  36. 種子、胚、小胞子、葯、接合子、プロトプラスト、細胞、卵子、胚珠、花粉、主根、子葉、抽出物、又は生物学的試料から成る群から選択される植物の部分であって、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載のトランスジェニック・サトウダイコン植物、又はその細胞、組織、若しくは種子から、或いは請求項３３又は２４に記載のハイブリッド種子から、或いは請求項３５に記載のハイブリッド・サトウダイコン植物から得られる、前記植物の部分。
  37. サトウダイコン植物細胞の形質転換のための、請求項１又は２に記載の核酸配列若しくはその断片、又は請求項５〜２０のいずれか１項に記載のキメラ構築物の使用。
  38. 請求項１若しくは２に記載の核酸配列の使用、又は請求項５〜２０のいずれか１項に記載のキメラ構築物の使用、又は請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のベクターの使用を含む、サトウダイコン植物細胞を形質転換する方法。
  39. 糖生産法、好気性発酵法、及び嫌気性発酵法を含む群から選択される方法、特に糖生産法における、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載のトランスジェニック・サトウダイコン植物の使用、請求項３５に記載のハイブリッド・サトウダイコン植物の使用、又は請求項３６に記載の植物の部分の使用。
  40. 糖を生産するために、請求項２５〜３０、３５、又は３６のいずれか１項に記載のサトウダイコン植物、若しくはその細胞、又は組織が加工される、糖の生産法。
  41. 請求項２５〜３０、３５、又は３６のいずれか１項に記載のサトウダイコン植物、若しくはその細胞、又は組織から生産された糖。
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