MX2012002400A - Procesos para producir materia prima de la seda. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para producir materia prima de la seda que comprende proteínas de seda con una estructura de hélice superenrollada tales como proteínas de seda de abeja. Las proteínas de seda se obtienen de células que las producen, al solubilizar las proteínas al ponerlas en contacto con un tensoactivo o un líquido iónico y concentrar las proteínas para producir materia prima de la seda. Las proteínas puede usarse para una variedad de propósitos tales como en la producción de productos del cuidado personal, plásticos, textiles y productos biomédicos.

Description

PROCESOS PARA PRODUCIR MATERIA PRIMA DE LA SEDA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para producir materia prima de la seda que comprende proteínas de seda con una estructura de hélice superenrollada tales como proteínas de seda de abeja. La materia prima de la seda puede usarse para una variedad de propósitos tales como en la producción de productos del cuidado personal, productos plásticos, textiles, y biomédicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las sedas son fibras de proteína producidas por un intervalo amplio de especies de insectos y arañas. La seda del gusano de seda domesticado, Bombyx mon, se ha usado como un biomaterial de sutura durante siglos. Numerosos esfuerzos para clonar y expresar sedas del gusano de seca o araña en sistemas transgénicos han encontrado que es una tarea hercúlea. Los tamaños grandes y secuencias altamente repetitivas de estos genes de seda los hacen recalcitrantes para expresión de las glándulas de seda especializadas exteriores, y lleva a rendimientos de proteína bajos.

Aunque los capullos del gusano de seda y telarañas son las mejores sedas conocidas, otras especies pueden producir sedas adaptadas mejor a producción transgénica. Las larvas de abejas (Apis melhfera) tejen capullos de seda en los cuales pupan. La seda de 'abeja se codifica por cuatro genes de fibra pequeños (-30kDa cada uno) y no repetitivos (Sutherland et al., 2006). Los conjuntos homólogos de cuatro genes también se han encontrado en los abejorros, hormigas bulldog, hormigas tejedoras, avispones y abejas Asiáticas (Sutherland et al., 2007; Sezutsu et al., 2007; Shi et al, 2008; WO 2007/038837) .

El trabajo de difracción de fibra de rayos x clásico demuestra que la seda de abeja contiene proteínas a-helicoidal ensambladas en una conformación de hélice superenrollada, más probable una estructura de hélice superenrollada tetramérica (Atkins, 1967), con las cuatro hebras probablemente correspondientes a las cuatro proteínas de seda diferentes. Las técnicas bioinformáticas predicen que cada una de las secuencias de proteína de seda de abeja contiene 60-68% de hélice superenrollada (Sutherland et al, 2006) .

Los hilos de seda pueden sacarse a mano de las glándulas de seda de larvas de abeja. Estos hilos son menos fuertes pero más extensibles y más duros que las fibras de seda del gusano de seda (Hepburn et al, 1979) .

Shi et al. (2008) recientemente reporta producción recombinante de seda de abeja Asiática (Apis cerana) . Las cuatro proteínas de seda A. cerana se expresaron en una forma soluble en Escherichia coli con rendimientos de 10-60 mg por litro de fermento. Una variedad de técnicas experimentales se usaron para caracterizar la estructura e interacciones de las proteínas a concentración baja (0.03 hasta 0.2% en peso). Estas demuestran conclusivamente que ni las proteínas individuales ni una mezcla de cuatro proteínas tienen empaque terciario hermético en la solución. Las proteínas existentes como monómeros o dímeros indirectamente asociados y tienen conformación de hélice predominantemente aleatoria con poca estructura a-helicoidal.

Existe una necesidad de métodos adicionales para producir materia prima de la seda de proteínas de seda de hélice superenrollada recombinantemente expresadas que pueden usarse para fabricar una variedad amplia de productos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los inventores actuales han encontrado sorpresivamente que los tensoactivos y líquidos iónicos pueden usarse en un proceso para producir materia prima de la seda que comprende proteínas de seda de hélice superenrollada.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para producir materia prima de la seda, el método que comprende i) lisar células que producen una o más proteínas de seda . ii) solubilizar las proteínas de seda al ponerlas en contacto con un tensoactivo o un líquido iónico, y iii) concentrar las proteínas de seda para producir materia prima de la seda, en donde una o más proteínas de seda son capaces de formar una estructura terciaria que comprende una estructura de hélice superenrollada .

En una modalidad, las proteínas de seda se concentran al a) reducir la cantidad de tensoactivo en solución al agregar un compuesto que precipita el tensoactivo, y b) separar la solución que comprende las proteínas de seda del precipitado formado en la etapa a) para producir la materia prima de la seda.

Los compuestos que pueden usarse para precipitar los tensoactivos se conocen en la técnica e incluyen una sal o un carbohidrato; o una combinación de dos o más de los mismos. Preferiblemente, la sal es una sal de potasio o una sal de sodio. En una modalidad, el carbohidrato es -ciclodextrina .

En otra modalidad, las proteínas de seda se concentran por filtración, más preferiblemente filtración de membrana, y aún más preferiblemente filtración de flujo tangencial.

En una modalidad, el método comprende además incrementar la concentración de proteínas de seda en la materia prima de la seda. Esto puede alcanzarse por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la materia prima de la seda se dializa contra una solución deshidratada tales como solución que comprende un polímero higroscópico. Los ejemplos de polímeros higroscópicos incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol , amilasa y sericina, así como una combinación de dos o más de los mismos.

En una modalidad preferida, la materia prima de la seda comprende al menos alrededor de 0.5% p/v de proteínas de seda. En una modalidad adicional, la materia prima de la seda comprende alrededor de 0.5% hasta alrededor de 15% de proteínas de seda.

La célula puede ser cualquier tipo celular, típicamente una célula recombinante que comprende unos polinucleótidos exógenos que codifican, y son capaces de producir, las proteínas de seda. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan, a células bacterianas, células de levadura, células de insecto, células de planta o células de animal, o una combinación de dos o más de los mismos. En una modalidad preferida, la célula es una célula bacteriana. En una modalidad particularmente preferida, la célula bacteriana es Escherichia coli.

En una modalidad preferida, la etapa i) comprende además aislar cuerpos de inclusión de las células lisadas.

El método también puede comprender cultivar las células antes de la etapa i) .

En una modalidad preferida, la porción de la proteina de seda que es capaz de formar una estructura terciaria que comprende una estructura de hélice superenrollada comprende al menos 10 copias de la secuencia de repetición con 7 aminoácidos "heptad" abcdefg, y en donde al menos 25% de los aminoácidos en posiciones a y d son residuos de alanina. Más preferiblemente, al menos 25% de los aminoácidos en posiciones a, d y e son residuos de alanina.

En una modalidad preferida adicional, la proteina de seda comprende, más preferiblemente consiste esencialmente de, aún más preferiblemente consiste de, una secuencia seleccionada de: a) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 1 hasta 8, 17 hasta 24, 33 hasta 40, 49 hasta 56, 65 hasta 72, 81 hasta 88, 97 o 98, b) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 1 hasta 8, 17 hasta 24, 33 hasta 40, 49 hasta 56, 65 hasta 72, 81 hasta 88, 97 o 98, y c) un fragmento biológicamente activo de a) o b) .

En el aspecto de arriba se prefiere que tan poco como sea posible de las proteínas de seda se secreten de la célula. En consecuencia, se prefiere que las proteínas de seda no comprendan una secuencia de señal de terminal N. Los ejemplos de proteínas de seda particularmente útiles para el aspecto de arriba incluyen, pero no se limitan a, proteínas de seda que comprenden, más preferiblemente consisten esencialmente de, y aún más preferiblemente consisten de, una secuencia seleccionada de: a) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 17, 19, 21, 23, 33, 35, 37, 39, 49, 51, 53, 55, 65, 67, 69, 71, 81, 83, 85, 87 o 97, b) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 17, 19, 21, 23, 33, 35, 37, 39, 49, 51, 53. 55, 65, 67, 69, 71, 81, 83, 85, 87 o 97, y c) un fragmento biológicamente activo de a) o b) .

En una modalidad, las proteínas de seda pueden ser una pluralidad de la misma proteína de seda o una combinación de dos o más proteínas de seda diferentes. En una modalidad preferida, si proteínas de seda diferentes se usan existen cuatro proteínas de seda diferentes.

En una modalidad adicional, las proteínas de seda comprenden una primera proteina de seda que comprende, más preferiblemente consiste esencialmente de, aún más preferiblemente consiste de, a) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 1, 2, 17, 18, 33, 34, 49, 50, 65, 66, 81 o 82; b) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 1, 2, 17, 18, 33, 34, 49, 50, 65, 66, 81 o 82; y c) un fragmento biológicamente activo de a) o b) , una segunda proteina de seda que comprende, más preferiblemente consiste esencialmente de, aún más preferiblemente consiste de, d) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 3, 4, 19, 20, 35, 36, 51, 52, 67, 68, 83 o 84; e) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 3, 4, 19, 20, 35, 36, 51, 52, 67, 68, 83 o 84; y f ) un fragmento biológicamente activo de c) o d) , una tercera proteína de seda que comprende, más preferiblemente consiste esencialmente de, aún más preferiblemente consiste de, g) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 5, 6, 21, 22, 37, 38, 53, 54, 69, 70, 85 o 86; h) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 5, 6, 21, 22, 37, 38, 53, 54, 69, 70, 85 o 86; e i) un fragmento biológicamente activo de g) o h), y/o una cuarta proteina de seda que comprende, más preferiblemente consiste esencialmente de, aún más preferiblemente consiste de, j) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 7, 8, 23, 24, 39, 40, 55, 56, 71, 72, 87 o 88; k) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs7, 8, 23, 24, 39, 40, 55, 56. 71, 72, 87 o 88; y 1) un fragmento biológicamente activo de ) o k) . Más preferiblemente, en relación al aspecto de arriba las proteínas de seda comprenden, o consisten esencialmente de, una primera proteína de seda que comprende, más preferiblemente consiste esencialmente de, aún más preferiblemente consiste de, a) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 1, 17, 33, 49, 65 o 81; b) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 1, 17, 33, 49, 65 o 81; y c) un fragmento biológicamente activo de a) o b) , una segunda proteina de seda que comprende, más preferiblemente consiste esencialmente de, aún más preferiblemente consiste de, d) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 3, 19, 35, 51, 67 o 83; e) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 3, 19, 35, 51, 67 o 83; y f) un fragmento biológicamente activo de d) o e), una tercera proteina de seda que comprende, más preferiblemente consiste esencialmente de, aún más preferiblemente consiste de, g) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 5, 21, 37, 53, 69 o 85; h) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 5, 21, 37, 53, 69 o 85; e i) un fragmento biológicamente activo de g) o h), y/o una cuarta proteina de seda que comprende, más preferiblemente consiste esencialmente de, aún más preferiblemente consiste de, ) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 7, 23, 39, 55, 71 o 87; k) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 7, 23, 39, 55, 71 o 87; y 1) un fragmento biológicamente activo de j ) o k) .

En una modalidad, la primera proteina de seda, segunda proteina de seda, tercera proteina de seda y/o cuarta proteina de seda son producidas por las mismas células.

En una modalidad alternativa, la primera proteina de seda, segunda proteina de seda, tercera proteina de seda y/o cuarta proteina de seda son producidas por células diferentes. En esta modalidad, se prefiere que la etapa ii) comprenda cantidades equimolares aproximadas de la primera proteina de seda, la segunda proteina de seda, la tercera proteina de seda y la cuarta proteina de seda.

En cualquier punto hasta y excluyendo la etapa iii) las proteínas de seda procesadas de acuerdo con la invención pueden prepararse independientemente y combinarse. Las proteínas de seda preparadas separadamente pueden ser las mismas o diferentes. Por ejemplo, una primera proteína de seda como se define en la presente se expresa en una primera célula y procesada como se define en las etapas i) y ii) , una segunda proteína de seda como se define en la presente se expresa en una segunda célula y procesada como se define en las etapas i) y ii) , y luego las dos soluciones combinada antes de la etapa iii) se realizan.

El tensoactivo y liquido iónico solubilizan la proteina precipitada y permite la proteina de seda para permanecer en la solución mientras que permite la formación de una estructura de hélice superenrollada durante las últimas etapas .

En una modalidad preferida, el tensoactivo es un tensoactivo aniónico. Los ejemplos de tensoactivos aniónicos útiles para la invención incluyen, pero no se limitan a, dodecil sulfato de sodio (SDS, por sus siglas en inglés), lauril sulfato de amonio y otras sales de sulfato de alquilo, monohidrato de 1-octansulfonato de sodio, lauroil sarcosinato de sodio, sulfato de éter lauril de sodio (SLES, por sus siglas en inglés) , hidrato taurodesoxicolato de sodio, y sulfonato de alquil benceno; asi como una combinación de dos o más de los mismos. En una modalidad preferida, el tensoactivo aniónico es SDS.

En una modalidad, el liquido iónico comprende i) un anión seleccionado de cloruro, bromuro, yoduro, tiocianato, acetato, alquilsulfonatos C1-C4, metansulfonatos, tosilato, dialquilfosfatos C1-C4, hidrogensulfato y tetracloroaluminato, y ii) un catión seleccionado de 1 , 3-dialquilimidazolio Ci-C4, 3-cloropiridinio, 4-dimetilaminopiridinio, 2-etil-4-ammopiridinio, 2-metilpiridinio, 2-etilpiridinio, 2-etil-6-metilpiridinio, quinolinio, isoquinolinio, piridinio, 1-alquilimidazolio Ci-C4, 1-metilimidazolio, 1,2-dimetilimidazolio, 1-n-butil-imidazolio, 1,4,5-trimetilimidazolio, 1, -dimetilimidazolio, imidazolio, 2-metilimidazolio, l-butil-2-metilimidazolio, 4 metilimidazolio, 1- (2 ' -aminoetil) imidazolio, 1-vinilimidazolio, 2-etilimidazolio y benzotnazolio .

En una modalidad preferida adicional, el método proporciona al menos alrededor de 0.1 g, más preferiblemente al menos alrededor de 1 g, más preferiblemente al menos alrededor de 1.5 g, más preferiblemente al menos alrededor de 2 g, aún más preferiblemente al menos alrededor de 2.5 g. de proteínas de seda por litro de células cultivadas.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir materia prima de la seda, el método que comprende i) obtener el sobrenadante de cultivos celulares, o de un sistema de expresión libre de célula, que produce una o más proteínas de seda, ii) solubilizar las proteínas de seda al ponerlas en contacto con un tensoactivo o un líquido iónico, y iii) concentrar las proteínas de seda para producir la materia prima de la seda, en donde una o más proteínas de seda son capaces de formar una estructura terciaria que comprende una estructura de hélice superenrollada .

En este aspecto, en lugar de las proteínas de seda en la célula que se usan para producir la materia prima de la seda, se usan proteínas de seda que se secreten de las células. Como el destinatario experimentado apreciará, la etapa i) del primer aspecto y etapa i) del aspecto de arriba puede realizarse simultáneamente o secuencialmente . Adicionalmente, en cualquier etapa correspondiente las proteínas de seda derivadas de la célula y el sobrenadante pueden combinarse y al respecto se procesan juntas. Por ejemplo, la etapa ii) del primer aspecto y etapa ii) del aspecto de arriba pueden realizarse separadamente y las proteínas de seda combinadas para procesamiento adicional incluyen las etapas iii) y iv) .

En una modalidad particularmente preferida del aspecto de arriba, la etapa i) comprende además incrementar la concentración de proteínas de seda del sobrenadante. Esto puede alcanzarse por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo al poner en contacto el sobrenadante con un agente que precipita las proteínas de seda tales como, pero no limitadas a, sulfato de amonio, ácido tricloroacético, ácido perclórico y acetona.

En relación al aspecto de arriba se prefiere que tanto como sea posible de las proteínas de seda se secreten de la célula. En consecuencia, se prefiere que las proteínas de seda comprendan una secuencia de señal de terminal N. Los ejemplos de proteínas de seda particularmente útiles para el aspecto de arriba incluyen, pero no se limitan a, proteínas de seda que comprenden, más preferiblemente consisten esencialmente de, y aún más preferiblemente consisten de, una secuencia seleccionada de: a) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 18, 20, 22, 24, 34, 36, 38, 40, 50, 52, 54, 56, 66, 68, 70, 72, 82, 84, 86, 88 o 98, b) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 18, 20, 22, 24, 34, 36, 38, 40, 50, 52, 54. 56, 66, 68, 70, 72, 82, 84, 86, 88 o 98, y c) un fragmento biológicamente activo de a) o b) .

En una modalidad adicional, las proteínas de seda comprenden una primera proteína de seda que comprende, más preferiblemente consiste esencialmente de, aún más preferiblemente consiste de, a) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 2, 18, 34, 50, 66 o 82; b) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 2, 18, 34, 50, 66 o 82; y c) un fragmento biológicamente activo de a) o b) , una segunda proteina de seda que comprende, más preferiblemente consiste esencialmente de, aún más preferiblemente consiste de, d) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 4, 20, 36, 52, 68 o 84; e) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 4, 20, 36, 52, 68 o 84; y f ) un fragmento biológicamente activo de c) o d) , una tercera proteina de seda que comprende, más preferiblemente consiste esencialmente de, aún más preferiblemente consiste de, g) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 6, 22, 38, 54, 70 o 86; h) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 6, 22, 38, 54, 70 o 86; e i) un fragmento biológicamente activo de g) o h), y/o una cuarta proteina de seda que comprende, más preferiblemente consiste esencialmente de, aún más preferiblemente consiste de, j ) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 8, 24, 40, 56, 72 o 88; k) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 8, 24, 40, 56, 72 o 88; y 1) un fragmento biológicamente activo de j ) o k) .

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para producir una fibra de seda, el método que comprende extruir y/o extraer materia prima de la seda producido por un método de la invención.

En una modalidad, la extrusión comprende pasar la materia prima de la seda a través de alrededor de 5µp? hasta alrededor de 500 m del tubo capilar.

En una modalidad particularmente preferida, el método comprende i) lisar células que producen una o más proteínas de seda y aislar cuerpos de inclusión de las células, ii) solubilizar las proteínas de seda en los cuerpos de inclusión al ponerlas en contacto con un tensoactivo o un líquido iónico, iii) concentrar las proteínas de seda para producir materia prima de la seda, iv) incrementar la concentración de proteínas de seda en la materia prima de la seda hasta alrededor de 2% hasta alrededor de 10% en peso(%) de proteínas de seda, más preferiblemente alrededor de 3% hasta alrededor de 6% en peso(%) de proteínas de seda, y vi) extruir la materia prima de la seda en una solución deshidratada .

En relación a la modalidad de arriba, la solución deshidratada preferiblemente comprende un alcohol tales como metanol o etanol, o una concentración alta de sal tales como MgCl2 o NaCl . Extruir las fibras de seda bajo estas condiciones es generalmente conocido en la técnica como hilado húmedo.

Preferiblemente, el alcohol es metanol y la concentración del metanol en la solución es alrededor de 40% hasta alrededor de 80% v/v, más preferiblemente alrededor de 50% hasta alrededor de 70% v/v. En esta modalidad, la materia prima de la seda puede comprender un tipo sencillo de polipéptido de seda como se define en la presente, o dos, o más tipos diferentes tales como cuatro tipos diferentes.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una película de seda, en donde el método que comprende fundir la materia prima de la seda producida por un método de la invención.

En otro aspecto, la presente invención proporciona materia prima de la seda producida por un método de la invención .

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una fibra de seda producida por un método de la invención .

También se proporciona una película de seda producida por un método de la invención.

Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un producto que comprende una fibra de seda y/o película de seda de la invención.

Como será aparente, los rasgos y características preferidas de un aspecto de la invención son aplicables a muchos otros aspectos de la invención.

A lo largo de esta especificación la palabra "comprende", o variaciones tales como "que comprende" o "que comprenden", se entenderán para implicar la inclusión de un elemento establecido, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas, pero sin la exclusión de cualquier otro elemento, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas .

La invención se describe de aquí en adelante a manera de los siguientes Ejemplos no limitantes y con referencia a las figuras acompañantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. SDS-PAGE de cuerpos de inclusión purificados solubilizados en SDS. Los carriles corresponden a proteínas recombinantes AmelFl-4; la escala es peso de proteína en kDa.

Figuras 2A-2B. Auto desconvolución de Fourier de las regiones de amida I y II del espectro infrarrojo de seda de abeja nativa (2A) y seda de abeja recombinante (2B) . Las asignaciones de bandas para las estructuras se encuentran en la Tabla 2.

Figura 3. Microscopía polarizada cruzada de fibras de seda de abeja recombinantes (A) extraídas en el aire, y (B) extraídas en aire luego extraídas una segunda en metanol.

Figuras 4A-4C. Microscopía polarizada cruzada de fibras de seda de abeja recombinantes (4A) extrudidas en baño de metanol, y (4B) secadas con aire luego extraídas una segunda vez en un baño de metanol hasta x2 de longitud o (4C) secadas con aire luego extraídas una segunda vez en un baño de metanol hasta x4 de longitud.

CLAVE PARA EL LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NO:l - Proteína de seda de abeja denominada en la presente Xenospiral (también denominada en la presente AmelFl) (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO: 2 - Proteina de seda de abeja denominada en la presente Xenospiral.

SEQ ID NO: 3 - Proteína de seda de abeja denominada en la presente Xenospira2 (también denominada en la presente AmelF2) (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO: 4 - Proteína de seda de abeja denominada en la presente Xenospira2.

SEQ ID NO: 5 - Proteína de seda de abeja denominada en la presente Xenospira3 (también denominada en la presente AmelF3) (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO: 6 - Proteína de seda de abeja denominada en la presente Xenospira3.

SEQ ID NO: 7 - Proteína de seda de abeja denominada en la presente Xenospira4 (también denominada en la presente AmelF4) (menos péptido de señal).

SEQ ID NO: 8 - Proteína de seda de abeja denominada en la presente Xenospira4.

SEQ ID NO: 9 - Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja Xenospiral (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO: 10 - Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja Xenospiral.

SEQ ID NO: 11 - Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja Xenospira2 (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO: 12 - Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja Xenospira2.

SEQ ID NO: 13 - Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja Xenospira3 (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO: 14 - Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja Xenospira3.

SEQ ID NO: 15 - Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja Xenospira4 (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO: 16 - Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de seda de abeja Xenospira4.

SEQ ID NO: 17 - Proteína de seda de abejorro denominada en la presente BBF1 (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO: 18 - Proteína de seda de abejorro denominada en la presente BBF1.

SEQ ID NO: 19 - Proteína de seda de abejorro denominada en la presente BBF2 (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO: 20 - Proteína de seda de abejorro denominada en la presente BBF2.

SEQ ID NO: 21 - Proteína de seda de abejorro denominada en la presente BBF3 (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO: 22 - Proteína de seda de abejorro denominada en la presente BBF3.

SEQ ID NO 23 - Proteína de seda de abejorro denominada en la presente BBF4 (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO 24 - Proteina de seda de abejorro denominada en la presente BBF4.

SEQ ID NO 25 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteína de seda de abejorro BBFl (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 26 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteína de seda de abejorro BBFl.

SEQ ID NO 27 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteína de seda de abejorro BBF2 (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 28 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteína de seda de abejorro BBF2.

SEQ ID NO 29 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteína de seda de abejorro BBF3 (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 30 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteína de seda de abejorro BBF3.

SEQ ID NO 31 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteína de seda de abejorro BBF4 (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 32 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteína de seda de abejorro BBF .

SEQ ID NO 33 - Proteina de seda de hormiga bulldog denominada en la presente BAFl (menos péptido de señal).

SEQ ID NO 34 - Proteína de seda de hormiga bulldog denominada en la presente BAFl.

SEQ ID NO 35 - Proteína de seda de hormiga bulldog denominada en la presente BAF2 (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO 36 - Proteína de seda de hormiga bulldog denominada en la presente BAF2.

SEQ ID NO 37 - Proteína de seda de hormiga bulldog denominada en la presente BAF3 (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO 38 - Proteína de seda de hormiga bulldog denominada en la presente BAF3.

SEQ ID NO 39 - Proteína de seda de hormiga bulldog denominada en la presente BAF4 (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO 40 - Proteína de seda de hormiga bulldog denominada en la presente BAF4.

SEQ ID NO 41 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteína de seda de hormiga bulldog BAFl (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 42 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteína de seda de hormiga bulldog BAFl.

SEQ ID NO 43 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteína de seda de hormiga bulldog BAF2 (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 44 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de hormiga bulldog BAF2.

SEQ ID NO 45 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de hormiga bulldog BAF3 (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 46 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de hormiga bulldog BAF3.

SEQ ID NO 47 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de hormiga bulldog BAF4 (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 48 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de hormiga bulldog BAF4.

SEQ ID NO 49 - Proteina de seda de hormiga tejedora denominada en la presente GAF1 (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO 50 - Proteina de seda de hormiga tejedora denominada en la presente GAF1.

SEQ ID NO 51 - Proteina de seda de hormiga tejedora denominada en la presente GAF2 (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO 52 - Proteina de seda de hormiga tejedora denominada en la presente GAF2.

SEQ ID NO 53 - Proteina de seda de hormiga tejedora denominada en la presente GAF3 (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO 54 - Proteina de seda de hormiga tejedora denominada en la presente GAF3.

SEQ ID NO 55 - Proteina de seda de hormiga tejedora denominada en la presente GAF4 (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO 56 - Proteina de seda de hormiga tejedora denominada en la presente GAF4.

SEQ ID NO 57 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de hormiga tejedora GAFl (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 58 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de hormiga tejedora GAFl.

SEQ ID NO 59 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de hormiga tejedora GAF2 (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 60 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de hormiga tejedora GAF2.

SEQ ID NO 61 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de hormiga tejedora GAF3 (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 62 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de hormiga tejedora GAF3.

SEQ ID NO 63 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de hormiga tejedora GAF4 (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 64 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de hormiga tejedora GAF4.

SEQ ID NO 65 - Proteina de seda de avispón denominada en la presente Vssilk3 (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO 66 - Proteina de seda de avispón denominada en la presente Vssilk3.

SEQ ID NO 67 - Proteina de seda de avispón denominada en la presente Vssilk4 (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO 68 - Proteina de seda de avispón denominada en la presente Vssilk4.

SEQ ID NO 69 - Proteina de seda de avispón denominada en la presente Vssilk2 (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO 70 - Proteina de seda de avispón denominada en la presente Vssilk2.

SEQ ID NO 71 - Proteina de seda de avispón denominada en la presente Vssilkl (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO 72 - Proteina de seda de avispón denominada en la presente Vssilkl.

SEQ ID NO 73 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de avispón Vssilk3 (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 74 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de avispón Vssilk3.

SEQ ID NO 75 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de avispón Vssilk4 (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 76 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de avispón Vssilk4.

SEQ ID NO 77 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de avispón Vssilk2 (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 78 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de avispón Vssilk2.

SEQ ID NO 79 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de avispón Vssilkl (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 80 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de avispón Vssilkl.

SEQ ID NO 81 - Proteina de seda de abeja Asiática denominada proteina de seda 1 (también denominada ABS1) (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO 82 - Proteina de seda de abeja Asiática denominada proteina de seda 1 (también denominada ABS1).

SEQ ID NO 83 - Proteina de seda de abeja Asiática denominada proteina de seda 2 (también denominada ABS2) (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO 84 - Proteina de seda de abeja Asiática denominada proteina de seda 2 (también denominada ABS2) .

SEQ ID NO 85 - Proteina de seda de abeja Asiática denominada proteina de seda 3 (también denominada ABS3) (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO 86 - Proteina de seda de abeja Asiática denominada proteina de seda 3 (también denominada ABS3) .

SEQ ID NO 87 - Proteina de seda de abeja Asiática denominada proteina de seda 4 (también denominada ABS4) (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO 88 - Proteina de seda de abeja Asiática denominada proteina de seda 4 (también denominada ABS4).

SEQ ID NO 89 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de abeja Asiática ABSl (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 90 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de abeja Asiática ABSl.

SEQ ID NO 91 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de abeja Asiática ABS2 (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 92 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de abeja Asiática ABS2.

SEQ ID NO 93 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de abeja Asiática ABS3 (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 94 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de abeja Asiática ABS3.

SEQ ID NO 95 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de abeja Asiática ABS4 (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 96 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de abeja Asiática ABS .

SEQ ID NO 97 - Proteina de seda de crisopa denominada en la presente MalFl (menos péptido de señal) .

SEQ ID NO 98 - Proteina de seda de crisopa denominada en la presente MalFl.

SEQ ID NO 99 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de crisopa MalFl (menos péptido de señal que codifica la región) .

SEQ ID NO 100 - Secuencia de nucleótidos que codifica proteina de seda de crisopa MalFl.

SEQ ID NOs 101 hasta 108 - Cebadores de oligonucleótido DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Técnicas y Definiciones Generales A menos que se defina específicamente de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente se tomarán para tener el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien de experiencia ordinaria en la técnica (por ejemplo, en cultivo celular, genéticos moleculares, procesamiento de seda, inmunología, inmunohistoquimica, química de proteína, y bioquímica) .

A menos que se indique de otra manera, la proteína recombinante, cultivo celular, y técnicas inmunológicas utilizadas en la presente invención son procedimientos estándares, bien conocidos para aquellos experimentados en la técnica. Tales técnicas se describen y explican a lo largo de la literatura en fuentes tales como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D. M. Glover and B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996). y F. M. Ausubel et al (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and iley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta la actualidad) , Ed Harlow and David Lañe (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), y J E Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta la actualidad).

El término "y/o", por ejemplo, "X y/o Y" se entenderá que significan ya sea "X y Y" o "X o Y" y se tomarán para proporcionar soporte explícito para ambos significados o para cualquier significado.

Como se usa en la presente, los términos "proteina de seda" y "polipéptido de seda" se refieren a una proteina/polipéptido fibroso que puede usarse para producir una fibra de seda, y/o un complejo de proteina fibroso.

Como se usa en la presente, el término "una o más proteínas de seda" se refiere al proceso posiblemente usando dos o más tipos diferentes de proteínas de seda tales como una primera proteína de seda, segunda proteína de seda, etc., como se define en la presente De esta manera, en este contexto una proteína de seda significa una población de moléculas de proteína de seda idénticas suficientes para producir materia prima de la seda.

Como se usa en la presente, el término "capaces de formar una estructura terciaria que comprende una estructura de hélice superenrollada" se refiere a la capacidad de las proteínas para formar las estructuras bajo condiciones adecuadas. Por ejemplo, cuando se procesan para producir fibras de seda las proteínas forman las estructuras. Adicionalmente, este término no significa que la proteína completa sea capaz de formar una estructura de hélice superenrollada, solo una porción de la misma. En una modalidad, alrededor de 45% hasta alrededor de 90%, más preferiblemente alrededor de 55% hasta alrededor de 70%, y aún más preferiblemente alrededor de 60% hasta alrededor de 66%, de la proteina de seda es capaz de formar una estructura terciaria que comprende una estructura de hélice superenrollada .

Como se usa en la presente, el término "materia prima de la seda" se refiere a una solución acuosa que comprende proteínas de seda. Preferiblemente, la materia prima de la seda comprende al menos 0.05% p/v, más preferiblemente al menos 0.1% p/v, y aún más preferiblemente al menos 0.5% p/v, de una proteína de seda como se define en la presente. En una modalidad, la materia prima de la seda producida por un método de la invención comprende alrededor de 0 5% hasta alrededor de 15% (% en peso) proteína de seda. Sin embargo, si la etapa adicional de incrementar la concentración de proteínas de seda en la materia prima de la seda no se realiza el rendimiento más típico es alrededor de 0.5% hasta alrededor de 4% (% en peso) proteína de seda. La materia prima de la seda producida usando un método de la invención es susceptible a extrusión para la formación de una de fibra y/o fusión en una película.

Como se usa en la presente, una "fibra de seda" se refiere a filamentos que comprenden proteínas de seda que pueden tejerse en varios artículos tales como textiles.

Como se usa en la presente, el término "reducir la cantidad de solución de tensoactivo" , o variaciones del mismo incluyendo reducir la cantidad de liquido iónico, significa que la cantidad total de tensoactivo o liquido iónico se disminuye. En una modalidad, la concentración de tensoactivo o liquido iónico después de la reducción es menor que alrededor de lOmM, más preferiblemente menor que 5mM y aún más preferiblemente menor que 1 mM, antes de cualquier etapa que involucra concentración adicional de la solución.

Como se usa en la presente, una "solución deshidratada" es cualquier solución, preferiblemente una solución acuosa, que tiene una concentración de agua inferior en solución que la materia prima de la seda que es para concentrarse.

Como se usa en la presente, el término "solubilizar" cuando se refiere a las proteínas de seda se pone en contacto con un tensoactivo o líquido iónico significa que el tensoactivo o líquido iónico se asocia con las proteínas de seda y las mantiene en solución al prevenir su agregación. Esto es contrario a las proteínas de seda vistas en las células, especialmente en los cuerpos de inclusión.

El término "péptido de señal", "Secuencia de señal de terminal N" y variaciones de los mismos se refieren a una proteína/péptido de terminal amino que precede una proteína madura secretada. El péptido de señal se desdobla de y por lo tanto no se presenta en la proteína madura. Los péptidos de señal tienen la función de dirigir y trans-ubicar proteínas secretadas a través de membranas celulares. El péptido de señal también se refiere como secuencia de señal, y son bien conocidos en la técnica- Proteinas de Seda de, Hélice superenrolladas Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan generalmente de forma intercambiable y se refieren a una cadena de polipéptido sencillo que puede o no puede modificarse por adición de grupos no de aminoácido. Los términos "proteínas" y "polipéptidos" como se usan en la presente también incluyen variantes, mutantes, modificaciones, análogos y/o derivados de las proteínas de seda descritos en la presente. En una modalidad preferida, una proteína de seda usada en la invención sólo está compuesta de aminoácidos que se presentan naturalmente.

El % de identidad de una proteína se determina por análisis GAP (Needleman and Wunsch, 1970) (programa GCG) con un penalización de creación de espacio=5, y una penalización de extensión de espacio=0.3. La secuencia de consulta es al menos 15 aminoácidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 15 aminoácidos. Más preferiblemente, la secuencia de consulta es al menos 50 aminoácidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 50 aminoácidos. Más preferiblemente, la secuencia de consulta es al menos 100 aminoácidos de longitud y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 100 aminoácidos. Aún más preferiblemente, la secuencia de consulta es al menos 250 aminoácidos de longitud y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 250 aminoácidos. Aún más preferiblemente, el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre su longitud completa.

Como se usa en la presente un fragmento "biológicamente activo" es una porción de una proteina de la invención que mantiene una actividad definida de la proteina de longitud completa, particularmente la capacidad para usarse para producir seda. Los fragmentos biológicamente activos pueden ser de cualquier tamaño siempre y cuando mantengan la actividad definida.

El término "consisten esencialmente de", o variaciones del mismo, significa que la secuencia de aminoácidos definida puede tener uno pocos, tales como uno, dos, tres o cuatro, aminoácidos adicionales comparados con aquellos definidos. Por ejemplo, cuando están ausentes de la secuencia definida puede agregarse una metionina de terminal N. El término "consiste de", o variaciones del mismo, significa que la secuencia definida no tiene o tiene menos aminoácidos adicionales cuando se compara con la secuencia definida, particularmente en la terminal N y C.

Con respecto a una proteina definida, se apreciará que las cifras del % de identidad son mayores que aquellos proporcionados arriba que abarcarán modalidades preferidas. De esta manera, donde sea aplicable, en luz de las cifras del % de identidad mínimas, se prefiere que la proteína comprenda una secuencia de aminoácidos que es al menos 40%, más preferiblemente al menos 45%, más preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 55%, más preferiblemente al menos 60%. Más preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 91%, más preferiblemente al menos 92%, más preferiblemente al menos 93%, más preferiblemente al menos 94%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 96%, más preferiblemente al menos 97%, más preferiblemente al menos 98%. Más preferiblemente al menos 99%, más preferiblemente al menos 99.1%, más preferiblemente al menos 99.2%, más preferiblemente al menos 99.3%, más preferiblemente al menos 99.4%, más preferiblemente al menos 99.5%, más preferiblemente al menos 99.6%, más preferiblemente al menos 99.7%. Más preferiblemente al menos 99.8%, y aún más preferiblemente al menos 99.9% idéntica a la SEQ ID NO nombrada relevante.

Los mutantes de la secuencia de aminoácidos de las proteínas de seda que se presentan naturalmente descritos en la presente pueden prepararse al introducir cambios de nucleótido apropiados en un ácido nucleico que codifica la proteína de seda, o por síntesis in vitro de la proteína deseada. Tales mutantes incluyen, por ejemplo, eliminaciones, inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos. Una combinación de eliminación, inserción y sustitución puede hacer para llegar en el constructo final, con la condición de que el producto de proteína final posee las características deseadas.

Las proteínas de mutante (alteradas) pueden prepararse usando cualquier técnica conocida en la técnica. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede someterse a mutagénesis in vitro. Tales técnicas de mutagénesis in vitro incluyen sub-clonar el polinucleótido en un vector adecuado, transformar el vector en una cepa "imitadora" tal como la E. coli XL-1 roja (Stratagene) y propagar las bacterias transformadas para un número adecuado de generaciones. En otro ejemplo, los polinucleótidos de la invención se someten a técnicas de transposición de ADN como se describen ampliamente por Harayama (1998) . Estas técnicas de transposición de ADN pueden incluir genes de la invención posiblemente además de los genes relacionadas con aquellos de la presente invención, tales como genes de seda de especie Himenóptera o Neuroptean diferente de la especie específica caracterizada en la presente. Los productos derivados de ADN mutado/alterado pueden fácilmente separarse por exclusión usando técnicas descritas en la presente para determinar si pueden usarse como proteínas de seda.

Al diseñar mutantes de secuencia de aminoácidos, la ubicación del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerá de las características a modificarse. Los sitios para mutación pueden modificarse individualmente o en serie, por ejemplo, al (1) sustituir primero con elecciones de aminoácido conservado y luego con más selecciones radicales dependiendo de los resultados alcanzados, (2) eliminar el residuo objetivo, o (3) insertar otros residuos adyacentes al sitio localizado.

Las eliminaciones o inserciones de la secuencia de aminoácidos generalmente están en el intervalo desde alrededor de 1 hasta 15 residuos, más preferiblemente alrededor de 1 hasta 10 residuos y típicamente alrededor de 1 hasta 5 residuos contiguos.

Los mutantes de sustitución tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de proteína removida y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para mutagénesis substitutiva incluyen sitios identificados como importante para la función. Otros sitios de interese son aquellos en los cuales los residuos particulares obtenidos de varias cepas o especies son idénticos. Estas posiciones pueden ser importantes para actividad biológica. Estos sitios, especialmente aquellos que caen dentro de una secuencia de al menos tres de otros sitios idénticamente conservados, preferiblemente están sustituidos en una manera relativamente conservada. Tales sustituciones conservadas se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones ejemplares".

Tabla 1. Sustituciones ejemplares Las estructuras de hélice superenrollada de proteínas de seda se caracterizan por repeticiones de repetición con 7 aminoácidos representadas por la secuencia de consenso (abcdefg) n - En una modalidad preferida, la porción de la proteina que tiene una estructura de hélice superenrollada comprende al menos 10 copias de la secuencia de repetición con 7 aminoácidos abcdefg, y al menos 25% de los aminoácidos en posiciones a y d son residuos de alanina.

En una modalidad preferida, la proteina que tiene una estructura de hélice superenrollada comprende al menos 12 copias consecutivas, más preferiblemente al menos 15 copias consecutivas, y aún más preferiblemente al menos 18 copias consecutivas del de repetición con 7 aminoácidos. En modalidades adicionales, la proteina que tiene una estructura de hélice superenrollada puede tener hasta al menos 28 copias del de repetición con 7 aminoácidos. Típicamente, las copias del de repetición con 7 aminoácidos se repetirán en forma de tándem. Sin embarqo, no es necesariamente tienen que ser repeticiones tándem perfectas, por ejemplo, como se muestra en las Figuras 5 y 6 de WO 2007/038837 unos pocos aminoácidos pueden encontrarse entre dos de repetición con 7 aminoácidoss , o unos pocos de repetición con 7 aminoácidoss truncados pueden encontrarse (ver, por ejemplo, Xenospiral en la Figura 5 de WO 2007/038837).

La orientación con respecto a las sustituciones de aminoácidos que pueden hacerse a las proteínas de seda que tienen una estructura de hélice superenrollada se proporciona en las Figuras 5 y 6. Así como Tablas 6 hasta 10, de WO 2007/038837. Donde una sustitución de aminoácido útil predicha basada en los datos experimentales proporcionados en la presente está de cualquier modo en conflicto con las sustituciones ejemplares proporcionadas en la Tabla 1 de WO 2007/038837 se prefiere que se usa una sustitución basada en los datos experimentales.

Las estructuras de hélice superenrollada de las proteínas de seda tienen un contenido alto de residuos de alanina, particularmente en las posiciones de aminoácidos a, d y e del de repetición con 7 aminoácidos. Sin embargo, las posiciones b, c, f y g también tienen una frecuencia alta de residuos de alanina. En una modalidad preferida, al menos 15% de los aminoácidos en posiciones a, d y/o e de las repeticiones con 7 aminoácidos son residuos de alanina, más preferiblemente al menos 25%, más preferiblemente al menos 30%, más preferiblemente al menos 40%, y aún más preferiblemente al menos 50%. En una modalidad preferida adicional, al menos 25% de los aminoácidos en ambas posiciones a y d de las repeticiones con 7 aminoácidos son residuos de alanina, más preferiblemente al menos 30%, más preferiblemente al menos 40%, y aún más preferiblemente al menos 50%. Adicionalmente , se prefiere que al menos 15% de los aminoácidos en posiciones b, c, f y g de las repeticiones con 7 aminoácidos son residuos de alanina, más preferiblemente al menos 20%, y aún más preferiblemente al menos 25%.

Típicamente, las repeticiones con 7 aminoácidos no comprenderán ningunos de los residuos de prolina o histidina. Adicionalmente, las repeticiones con 7 aminoácidos comprenderán pocos (1 o 2), si hubiera, residuos de fenilalanina, metionina, tirosina, cisteína, glicina o triptofano. Aparte de alanina, los aminoácidos comunes (por ejemplo mayores que 5%, más preferiblemente mayores que 10%) en las repeticiones con 7 aminoácidos incluyen leucina (particularmente en posiciones b y d) , serina (particularmente en posiciones b, e y f ) , ácido glutámico (particularmente en posiciones c, e y f ) , lisina (particularmente en posiciones b, c, d, f y g) así como arginina en la posición g.

En una modalidad preferida, las repeticiones con 7 aminoácidos se determinan al usar un programa de reconocimiento de patrón MARCOIL (Delorenzi y Speed. 2002) .

Las proteínas (y polinucleótidos ) útiles para los métodos de la invención pueden purificarse (aislarse) de una variedad amplia de especie himenóptera y Neuropteran. Los ejemplos de himenópteros incluyen, pero no se limitan a, cualquier especie del Suborden Apócrifa (abejas, hormigas y avispas) , que incluyen las siguientes Familias de insectos; Chrysididae (avispas cuco), Formicidae (hormigas), Mutillidae (hormigas aterciopeladas), Pompilidae (avispas de las arañas), Scoliidae, Vespidae (avispas de papel, avispas alfareras, avispones), Agaomdae (avispas de los higos), Chalcididae ( calcididos ) , Eucharitidae (eucarítidos ) , Eupelmidae (eupélmidos ) , Pteromalidae (pteromálidos ) , Evaniidae (avispas parásitas) , Braconidae, Ichneumonidae (icneumonoideos) , Megachilidae, Apidae, Colletidae, Halictidae, y Melittidae (abejas que recolectan aceite) . Los ejemplos de Neurópteros incluyen especies de las siguientes familias de insectos: Mantispidae, Chrysopidae (crisopas), Myrmeleontidae (hormigas león) , y Ascalaphidae (libélulas) . Tales proteínas adicionales (y polinucleótidos ) pueden caracterizarse usando los mismos procedimientos descritos en la presenta para las sedas de Bombus terrestns , Myrmecia forflcata, Oecophylla smaragdma y Mallada signata.

También se incluyen dentro del alcance de la invención proteínas que se modifican diferencialmente durante o después de la síntesis, por ejemplo, por biotinilación, bencilación, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos de protección/bloqueo conocidos, desdoblamiento proteolítico, ligadura a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Estas modificaciones pueden servir para incrementar la estabilidad y/o bioactividad de la protema.

Polinucleótidos El término "polinucleótido" se usa intercambiablemente en la presente con el término "ácido nucleico".

El término "exógeno" en el contexto de un polinucleótido se refiere al polinucleótido cuando se presenta en una célula, o en un sistema de expresión libre de célula, en una cantidad alterada comparada con su estado nativo. En una modalidad, la célula es una célula que no comprende naturalmente el polinucleótido. Sin embargo, la célula puede ser una célula que comprende un polinucleótido no endógeno que resulta en una cantidad alterada, preferiblemente incrementada, de producción de la proteina codificada. Un polinucleótido exógeno de la invención incluye polinucleótidos que no se han separado de otros componentes de la célula transgénica (recombinante) , o sistema de expresión libre de célula, en el cual se presenta, y los polinucleótidos producidos en tales células o sistemas libres de célula que se purifican posteriormente lejos de al menos algunos otros componentes.

El % de identidad de un polinucleótido se determina por análisis GAP (Needleman y Wunsch, 1970) (programa GCG) con una penalización de creación de espacio=5, y una penalización de extensión de espacio=0.3. A menos que establezca de otra manera, la secuencia de consulta es al menos 45 nucleótidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 45 nucleótidos. Preferiblemente, la secuencia de consulta es al menos 150 nucleótidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 150 nucleótidos. Más preferiblemente, la secuencia de consulta es al menos 300 nucleótidos de longitud y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 300 nucleótidos. Aún más preferiblemente, el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre su longitud completa.

Con respecto a los polinucleótidos definidos, se apreciará que las cifras del % de identidad mayores que aquellas proporcionadas arriba abarcarán modalidades preferidas. De esta manera, donde sea aplicable, en luz de la cifras del % de identidad mínimas, se prefiere que un polinucleótido de la invención comprenda una secuencia que es al menos 40%, más preferiblemente al menos 45%, más preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 55%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos 70%. Más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 91%, más preferiblemente al menos 92%, más preferiblemente al menos 93%, más preferiblemente al menos 94%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 96%, más preferiblemente al menos 97%, más preferiblemente al menos 98%, más preferiblemente al menos 99%, más preferiblemente al menos 99.1%. Más preferiblemente al menos 99.2%, más preferiblemente al menos 99.3%, más preferiblemente al menos 99.4%, más preferiblemente al menos 99.5%, más preferiblemente al menos 99.6%, más preferiblemente al menos 99.7%, más preferiblemente al menos 99.8%, y aún más preferiblemente al menos 99.9% idéntica a la SEQ ID NO nombrada relevante.

En una modalidad, un polinucleótido que codifica una proteina de seda útil para la invención comprende, más preferiblemente consiste esencialmente de, aún más preferiblemente consiste de, una secuencia seleccionada de: a) una secuencia de nucleótidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 9 hasta 16, 25 hasta 32, 41 hasta 48, 57 hasta 64, 73 hasta 80, 89 hasta 96, 99 o 100. b) una secuencia de nucleótidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 9 hasta 16, 25 hasta 32, 41 hasta 48, 57 hasta 64. 73 hasta 80, 89 hasta 96, 99 o 100, y c) un fragmento biológicamente activo que codifica la porción de a) o b) .

Cuando se prefiere que tan poco como sea posible de las proteínas de seda sea secretada de la célula, las proteínas de seda codificadas no comprenden una secuencia de señal de terminal N. Los ejemplos de polinucleótidos que codifican tales proteínas de seda incluyen aquellos que comprenden, más preferiblemente consisten esencialmente de, aún más preferiblemente consisten de, una secuencia seleccionada de: a) una secuencia de nucleótidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 9, 11, 13, 15, 25, 27, 29, 31, 41, 43, 45, 47, 57, 59, 61, 63, 73, 75, 77, 79, 89, 91, 93, 95 o 97, b) una secuencia de nucleótidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 9, 11, 13, 15, 25, 27, 29, 31, 41, 43, 45, 47, 57, 59, 61, 63, 73, 75, 77, 79, 89, 91, 93, 95 o 97, y c) un fragmento biológicamente activo de a) o b) .

Otras modalidades de la invención dependen de la expresión de proteínas de seda con una secuencia de señal de terminal N, y/o la co-producción (en la misma o células diferentes) de una primera proteína de seda, segunda proteína de seda, tercera proteína de seda y/o cuarta proteína de seda como se define en la presente. Basado en la información de secuencia proporcionada en el Listado de Secuencias, la persona experimentada puede fácilmente identificar polinucleótidos representativos para expresión para cada modalidad de la invención.

Los polinucleótidos para uso en los métodos de la presente invención pueden poseer, cuando se comparan con moléculas que se presentan naturalmente, una o más mutaciones que son eliminaciones, inserciones, o sustituciones de residuos de nucleótido. Los mutantes pueden ya sea presentarse naturalmente (es decir, aislados de una fuente natural) o sintéticos (por ejemplo, al realizar mutagénesis dirigida al sitio en el ácido nucleico) .

Los polinucleótidos para uso en la invención también pueden hibridizar a una proteina de seda que codifica la secuencia de nucleótidos como se proporciona en la presente, tales como una o más de SEQ ID NOs 9 hasta 16, 25 hasta 32, 41 hasta 48, 57 hasta 64, 73 hasta 80, 89 hasta 96, 99 y 100, bajo condiciones estrictas. El término "condiciones de hibridación estrictas" y similares como se usa en la presente se refiere a parámetros con los cuales la técnica está familiarizada, incluyendo la variación de la temperatura de hibridación con longitud de un oligonucleótido . Los parámetros de hibridación del ácido nucleico pueden encontrarse en referencias que reúnen tales métodos, Sambrook, et al. (supra) , y Ausubel, et al (supra). Por ejemplo, las condiciones de hibridación estrictas, como se usa en la presente, pueden referirse a hibridación a 65°C en solución amortiguadora de hibridación (3.5xSSC, Ficoll al 0.02%, polivinil pirrolidona al 0.02%, Albúmina de Suero Bovino al 0.02% (BSA) , NaH2P04 2.5 mM (pH7), SDS al 0.5%, EDTA 2 mM) , seguido por uno o más lavados en 0.2.xSSC, BSA al 0.01% a 50°C.

Constructos de ácido nucleico Las células para uso en los métodos de la invención típicamente comprenderán los constructos de ácido nucleico que codifican las proteínas de seda. El constructo puede integrarse en el genoma de la célula, o ser extracromosal tales como es un vector recombinante . Tal vector contiene secuencias de polinucleótido heterólogas, que es secuencias polinucleótido que no se encuentran naturalmente adyacentes a la molécula de polinucleótido que codifica la proteína de seda, y que preferiblemente se derivan de una especie diferente de la especie de las cuales las moléculas de polinucleótido se derivan. El vector puede ser ya sea ARN o ADN, ya sea procariótico o eucariótico, y típicamente es un transposon (tal como descrito en US 5,792,294), un virus o un plásmido .

Un tipo de vector recombinante comprende una molécula de polinucleótido que codifica la proteina de seda ligada operativamente a un vector de expresión. La fase ligada operativamente se refiere a inserción de una molécula de polinucleótido en un vector de expresión en una manera tal que la molécula es capaz de expresarse cuando se transforma en una célula hospedera. Como se usa en la presente, un vector de expresión es un vector de ADN o ARN que es capaz de transformar una célula hospedera y de efectuar expresión de una molécula de polinucleótido especifica. Preferiblemente, el vector de expresión también es capaz de replicarse dentro de la célula hospedera. Los vectores de expresión pueden ser ya sea procarióticos o eucarióticos , y típicamente son virus o plásmidos. Los vectores de expresión de la presente invención incluyen cualquiera de los vectores que funcionan (esto es, expresión del gen directa) en células recombinantes de la presente invención, incluidas en células bacterianas, de hongos, endoparásitos , artrópodas, de insectos, animales, y planta. Los vectores de expresión particularmente preferidos de la presente invención pueden dirigir la expresión del gen en células de planta. Los vectores de la invención también pueden usarse para producir la proteína en un sistema de expresión libre de célula, tales sistemas son bien conocidos en la técnica.

En particular, el constructo de ácido nucleico contiene secuencias reguladoras tales como secuencias de control de transcripción, secuencias de control de traducción, orígenes de replicación, y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula recombinante y que controlan la expresión de las moléculas de polinucleótido. Las secuencias de control de transcripción son secuencias que controlan el inicio, prolongación, y terminación de la transcripción. Las secuencias de control de transcripción particularmente importantes son aquellas que controlan el inicio de la transcripción, tales como secuencias promotoras, potenciadoras, operadoras y represoras. Las secuencias de control de transcripción adecuadas incluyen cualquier secuencia de control de transcripción que puede funcionar en al menos una de las células recombinantes de la presente invención. Una variedad de tales secuencias de control de transcripción se conocen para aquellos experimentados en la técnica. Las secuencias de control de transcripción preferidas incluyen aquellas que funcionan en células bacterianas, de levadura, artrópodas, de planta o mamíferas, tales como, pero no limitadas a, tac, lac, trp, trc, oxi-pro, omp/lpp, rmB, bacteriófago lambda, bacteriófago T7. T71ac, bacteriófago T3, bacteriófago SP6, bacteriófago SP01, metalotioneina, factor de unión alfa, oxidasa de alcohol Pichia, promotores subgenómicos de alfavirus (tales como promotores subgenómicos del virus Sindbis), gen de resistencia antibiótica, baculovirus, virus de insecto Hehothis zea, virus de vacuna, virus del herpes, viruela de mapache, otras viruelas, adenovirus, citomegalovirus (tales como promotores tempranos intermediarios) , virus de simio 40, retrovirus, actina, repetición de terminal larga retrovirica, virus del sarcoma de Rous, choque térmico, secuencias de control de transcripción de fosfato y nitrato asi como otras secuencias capaces de controlar la expresión del gen en células procarióticas o eucarióticas .

Como se resume arriba, un aspecto de la invención depende de la proteina de seda que se secreta de la célula, típicamente debido a la presencia de una secuencia de señal de terminal N. Los ejemplos de segmentos de señal adecuados incluyen, pero no se limitan a, activador de plasminógeno de tejido (t-PA) . El interferón, interleucina, hormona de crecimiento, segmentos de señal de glicoproteína de envoltura vírica, péptido de señal de Nicotiana nectarin (US 5,939,288), señal de extensina de tabaco, la señal de proteína enlazada al cuerpo de aceite de oleosina de soya, péptido de señal de quitinasa básica vacuolar Arabidopsis thahana, así como secuencias de señal nativas de los polipéptidos de seda definidos en la presente.

Células La mayoría de los métodos la invención dependen del uso de las células que producen una o más proteínas de seda como se define en la presente. La transformación de una molécula de polinucleótido en una célula puede realizarse por cualquier método por el cual una molécula de polinucleótido puede insertarse en la célula. Las técnicas de transformación incluyen, pero no se limitan a, transíección, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, y fusión de protoplasto. Una célula recombinante puede permanecer unicelular o puede crecer en un tejido, órgano o un organismo multicelular. Las moléculas de polinucleótido transformadas pueden permanecer extracromosomales o pueden integrarse en uno o más sitios dentro de un cromosoma de la célula transformada (esto es, recombinante) de tal manera que su capacidad para expresarse se retiene.

Las células hospederas adecuadas para transformar incluyen cualquier célula que puede transformarse con un polinucleótido que codifica un polipéptido de seda como se define en la presente. Las células hospederas ya sea pueden ser capaces endógenamente (esto es, naturalmente) de producir los polipéptidos de seda o pueden ser capaces de producir tales polipéptidos después de que se transforman con al menos una molécula de polinucleótido como se define en la presente. Las células hospederas pueden ser cualquier célula capaz de producir al menos una proteina de seda como se define en la presente, e incluyen células bacterias, de hongos (incluyendo levadura), de parásitos, artrópodas, de animal y planta. Los ejemplos de células hospederas incluyen Salmonella , Escherichia, Bacillus, Listeria, Saccharomyces, Spodoptera, Mycobacteria , Tnchoplusia , células BHK (riñon de hámster bebé), células MDCK, células CRFK, células CV-1, células COS (por ejemplo, COS-7) , y células Vero. Los ejemplos adicionales de células hospederas son E. coli, incluyendo derivados K-12 de E. coli; Salmonella typhi; Salmonella typhimunum, incluyendo cepas atenuadas; Spodoptera frugiperda; Tríchoplusia ni; y celulasa G8 de mioblasto de ratón no tumorigénico (por ejemplo, ATCC CRL 1246) . Los hospederos de célula mamifera apropiados adicionales incluyen otras lineas celulares de riñon, otras lineas células de fibroblasto (por ejemplo, lineas células de fibroblasto de embrión de humano, murino o gallina) , lineas células de mieloma, células de ovario de hámster Chino, células NIH/3T3 de ratón, células LMTK y/o células HeLa. Las células hospederas particularmente preferidas son células bacterianas.

La persona experimentada puede fácilmente determinar condiciones de cultivo adecuadas tales como medio, temperatura y tiempo para un tipo de célula particular. Por ejemplo, en una modalidad las células son Escherichia coli cultivadas en alrededor de 30°C hasta alrededor de 37°C durante un periodo de alrededor de 24h hasta alrededor de 48h.

Las tecnologías de ADN recombinantes pueden usarse para mejorar la expresión de una molécula de polinucleotido transformada al manipular, por ejemplo, el número de copias del a molécula de polinucleotido dentro de una célula hospedera, la eficiencia con la cual aquellas moléculas de polinucleotido se transcriben, la eficiencia con la cual los transcriptos resultantes se traducen, y la eficiencia de las modificaciones post-traduccionales . Las técnicas recombinantes útiles para incrementar la expresión de moléculas de polinucleotido incluyen, pero no se limitan a, moléculas de polinucleotido ligadas operativamente a plásmidos con número de copias alto, integración de la molécula de polinucleotido en uno o más cromosomas de célula hospedera, adición de secuencias de estabilidad del vector a plásmidos, sustituciones o modificaciones de señales de control de transcripción (por ejemplo, promotores, operadores, potenciadores) , sustituciones o modificaciones de señales de control de traducción (por ejemplo, sitios enlazados a ribosoma, secuencias Shine-Dalgarno) , modificación de moléculas de polinucleótido para corresponder al uso de codón de la célula hospedera, y la eliminación de secuencias que desestabilizan los transcriptos.

Producción de Materia prima de la seda La presente invención se refiere a métodos para producir materia prima de la seda que luego pueden usarse para una variedad amplia de aplicaciones.

Una etapa de un aspecto de la invención se refiere a células Usadas para liberar proteínas de seda producidas y contenidas dentro de las células. Esta etapa puede realizarse por cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, la suspensión celular se centrifuga típicamente para peletizar las células y las células se vuelven a suspender en una solución más concentrada lista para lisis. Las células pueden lisarse, por ejemplo, por pasajes a través de un Prensa Francesa, homogenizada usando un Polytron (Brinkman Instruments) o sonicarse en hielo. Los métodos alternos de células lisadas, tales como células bacterianas, son bien conocidos para aquellos de experiencia en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al, supra) . Varios kits están disponibles para lisis celular y son bien conocidos en la técnica, por ejemplo el Kit Bugbuster (Novagen) y el kit ProteaPrep (Protea Biosciences, Inc) .

Los inventores actuales han identificado que las proteínas de seda como se definen en la presente expresadas en bacterias forman agregados insolubles ("cuerpos de inclusión") . En una modalidad preferida, el método incluye el aislamiento de estos cuerpos de inclusión. Varios protocolos son adecuados para purificación de cuerpos de inclusión de proteína. Por ejemplo, la purificación de cuerpos de inclusión típicamente involucra la extracción, separación y/o purificación de cuerpos de inclusión por interrupción de las células bacterianas por los métodos descritos arriba. En una modalidad, las células se lisan, las membranas celulares se solubilizan, y la fracción insoluble que comprende los cuerpos de inclusión se aisla para procesamiento adicional.

Un aspecto de la invención depende del incremento de la concentración de proteínas de seda del sobrenadante. De nuevo, esto puede alcanzarse por cualquier método conocido en la técnica. En una modalidad, esto se alcanza al poner en contacto el sobrenadante con un agente que precipita las proteínas de seda tales como, pero no limitado a, sulfato de amonio, ácido tricloroacético, ácido perclórico y acetona, o cocteles precipitantes comerciales tales como PlusOne (Amersham Biosciences), o Perfect-Focus (Geno Technology Inc. ) .

Una etapa opcional de la invención para producir materia prima de la seda, pero sin embargo preferido en casos donde el rendimiento de proteina de seda no es suficientemente alto, comprende incrementar la concentración de proteínas de seda en la materia prima de la seda. De nuevo, puede alcanzarse por cualquier método conocido en la técnica para incrementar la concentración de una proteína de una solución acuosa. En una modalidad particularmente útil, la materia prima de la seda se concentra al dializarse contra una solución deshidratada tales como una solución que comprende un polímero higroscópico. Los ejemplos de polímeros higroscópicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG) , amilasa, y sericina, o una combinación de dos o más de los mismos. Las moléculas PEG están disponibles en un intervalo de tamaños moleculares y la selección del PEG se determinará por la membrana elegida por diálisis y la velocidad de concentración requerida. Preferiblemente, el PEG es de un peso molecular de alrededor de 8,000 hasta alrededor de 10,000 g/mol y tiene una concentración de alrededor de 25% hasta alrededor de 50%.

Tensoactivos En una modalidad, una etapa para producir materia prima de la seda como se define en la presente involucra el uso de un tensoactivo. Los inventores actuales se sorprendieron al encontrar tales tensoactivos , tales como SDS, que permiten las proteínas de seda como se define en la presente para permanecer en solución mientras que permiten la formación de una estructura de hélice superenrollada cuando la concentración del tensoactivo se disminuye.

En una modalidad, el tensoactivo es un tensoactivo aniónico. Los ejemplos de tensoactivos aniónicos útiles para la invención incluyen, pero no se limitan a, dodecil sulfato de sodio (SDS), lauril sulfato de amonio y otras sales de sulfato de alquilo, monohidrato de 1-octansulfonato de sodio, lauroil sarcosinato de sodio, sulfato de éter lauril de sodio (SLES) , hidrato taurodesoxicolato de sodio, y sulfonato de alquil benceno; o una combinación de dos o más de los mismos. En una modalidad preferida, el tensoactivo aniónico es SDS.

Cualquier concentración del tensoactivo puede usarse la cual incrementa la solubilidad de las proteínas de seda. Por ejemplo, al menos alrededor de 0.1% v/v del tensoactivo se usa. En una modalidad, alrededor de 0.1% hasta alrededor de 10% v/v, más preferiblemente, alrededor de 0.5% hasta alrededor de 2% v/v o alrededor de 0 5% hasta alrededor de 5% v/v, del tensoactivo se usa.

Una etapa adicional de los métodos de la invención para producir materia prima de la seda comprende reducir la cantidad de tensoactivo en solución al agregar un compuesto que precipita el tensoactivo para ayudar en el pliegue correcto de las proteínas de seda. Cualquier compuesto puede usarse que se asocia, y reduce la solubilidad de, el tensoactivo. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, una sal o un carbohidrato tales como a-ciclodextrina, o una combinación de dos o más de los mismos. Preferiblemente, la sal es una sal de potasio o una sal de sodio. Preferiblemente, la sal de potasio es cloruro de potasio y la sal de sodio es acetato de sodio. Cualquier concentración del compuesto puede usarse lo que resulta en una reducción en la cantidad de tensoactivo en solución. Por ejemplo, el compuesto se agrega a una concentración final de alrededor de 1 m hasta alrededor de 1 M, más preferiblemente alrededor de 40 mM hasta alrededor de 100 mM, o alrededor de 40 mM hasta 400 mM.

Una etapa adicional de los métodos de la invención para producir materia prima de la seda comprende separar la solución del precipitado formado seguido por la adición del compuesto. Esto puede alcanzarse por cualquier método conocido en la técnica tal como usando centrifugación, por ejemplo en 16000g durante 5 minutos, y remover el sobrenadante (solución) que comprende (que es) la materia prima de la seda. Preferiblemente, después de esta etapa las proteínas de seda constituyen al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%. Más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 97%, más preferiblemente al menos 99%, y aún más preferiblemente 100% de la proteína en solución.

Líquidos iónicos Generalmente, los líquidos iónicos pueden definirse como los compuestos que están comprendidos completamente de iones y son líquidos a temperaturas de menor que alrededor de 100°C, preferiblemente menor que alrededor de 85°C. Como se usa en la presente invención, los líquidos iónicos generalmente comprenden uno o más aniones y uno o más cationes. En modalidades preferidas, los líquidos iónicos comprenden cationes orgánicos creados al derivar uno o más compuestos para incluir substituyentes , tales como alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, alquenoxi, alquinoxi, una variedad de aromáticos, tales como fenilo (sustituido o no sustituido), bencilo (sustituido o no sustituido), fenoxi (sustituido o no sustituido), y benzoxi (sustituido o no sustituido) , y una variedad de aromáticos heterocíclicos que tienen uno, dos, o tres heteroátomos en la porción de anillo de los mismos, los heterocíclicos están sustituidos o no sustituidos. Los compuestos derivados incluyen, pero no se limitan a, imidazoles, pirazoles, tlazoles, isotiazoles, azatiozoles, oxotiazoles, oxazinas, oxazolinas, oxazaboroles, ditiozoles, triazoles, delenozoles, oxafosfoles, pirróles, boroles, furanos, tiofenos, fosfoles, pentazoles, índoles, indolinas, oxazoles, isoxazoles, isotetrazoles, tetrazoles, benzofuranos, dibenzofuranos, benzotiofenos, dibenzotiofenos, tiadiazoles, piridinas, pirimidinas, pirazinas, piridazinas, piperazinas, piperidinas, morfolonas, piranos, anolinas, ftalazinas, quinazolinas , guanidinios, quinxalinas, análogos basados en colina, y combinaciones de los mismos. La estructura de catión básica puede ser sencillamente o múltiplemente sustituida o no sustituida.

La porción aniónica del líquido iónico puede comprender una porción inorgánica, una porción orgánica, o combinaciones de los mismos. En modalidades preferidas, la porción aniónica comprende una o más porciones seleccionadas de halógenos, fosfatos, alquilfosfatos, alquenilfosfatos, bis (trifluorometilsulfonil) imida (NTf2) , BF4", PF6~, AsF6~, N03~ , N(CN)2~, N(S03CF3)2~, aminoácidos, carboranos sustituidos o no sustituidos, percloratos, pseudohalógenos tales como tiocianato y cianato, ácidos Lewis basados en cloruro de metal (por ejemplo, cloruros zinc y cloruros de aluminio) , o carboxilatos Ci-6. Los pseudohaluros son monovalentes y tienen propiedades similares a aquellos de haluros. Los ejemplos de pseudohaluros útiles de acuerdo con la invención incluyen cianuros, tiocianatos, cianatos, fulminatos, y azidas. Los carboxilatos ejemplares que contienen 1-6 átomos de carbono son formiato, acetato, propionato, butirato, hexanoato, maleato, fumarato, oxalato, lactato, piruvato y similares.

Una variedad de líquidos iónicos pueden prepararse y usarse de acuerdo con presente invención. En particular, cualquier combinación de los cationes y aniones señalados arriba pueden usarse. Sólo es necesario combinar uno o más cationes (tales como aquellos descritos arriba) con uno o más aniones (tales como aquellos descritos arriba) para formar un material que es liquido bajo las condiciones descritas en la presente. Por ejemplo, un porción de imidazolio de catión puede combinarse con una porción de halógeno aniónica para formar un material que es liquido bajo las condiciones requeridas (por ejemplo, cloruro l-butil-3-metil-imidazolio) y que se forma sustancialmente de forma completa de porciones iónicas. De esta manera, es claro que la presente invención abarca el uso de una gran diversidad de líquidos iónicos. Los ejemplos no limitantes, específicos de líquidos iónicos para uso de acuerdo con la invención incluyen cloruro de 1-butil-3-metil-imidazolio ( "BmimCl" ) ; cloruro de l-alil-3-metil-imidazolio ("AmimCl") : cloruro de l-etil-3-metil-imidazolio; cloruro de l-hidrógeno-3-metil-imidazolio, cloruro de 1-bencil-3-metil-imidazolio ("BencilmimCl"), cloruro de 1-isopropil-3-metil-imidazolio cloruro de l-m-metoxibencil-3-metil-imidazolio (" etoxiBencilmimCl") , cloruro de 1-m-metilbencil-3-metil-imidazolio ( "MetilBencilmimCl" ) ; cloruro de l-bencil-3-metil-imidazolio, y dicianamida de l-metil-3-bencil-imidazolio ( "BencilmimDca" ) .

La invención también abarca el uso de varias mezclas de líquidos iónicos. De hecho, las mezclas de líquido iónico pueden ser útiles para proporcionar líquidos iónicos que tienen propiedades personalizadas, tales como viscosidad. Por ejemplo, BencilmimCl es un líquido iónico relativamente viscoso; sin embargo, la viscosidad puede reducirse significativamente al mezclarse con AmimCl. La viscosidad de la mezcla de líquido iónico de esta manera puede ajustarse al variar la relación entre el componente más viscoso y el componente menos viscoso.

Los líquidos iónicos para uso de acuerdo con la invención pueden sintetizarse de acuerdo con la literatura. Preferiblemente, los líquidos iónicos se secan (por ejemplo, a 100°C) en un horno al vacío durante un periodo de tiempo, tal como alrededor de 48 horas, antes del uso. En una modalidad, el líquido iónico se forma de un material que es sólido (por ejemplo, cristalino) a condiciones ambientales pero es liquido a temperaturas incrementadas (tales como mayor que alrededor de 30°C, mayor que alrededor de 50°C, mayor que alrededor de 75°C, o mayor que alrededor de 100°C). Generalmente, el material cristalino puede colocarse en un recipiente apropiado y calentarse para disolución (ver, por ejemplo, Ionic Liquids in Synthesis, Wasserscheid, P. y Weldon, T. (Eds.), iley Pub.). Por supuesto, el liquido iónico también puede comprende un material que es liquido a condiciones ambientales (por ejemplo, a una temperatura alrededor de 20-25°C) .

Filtración y/o Cromatografía Las proteínas de seda solubilizadas pueden concentrarse y separarse de impurezas, tales como el tensoactivo, líquido iónico y otros componentes celulares basados en carga, hidrofilicidad, afinidad, solubilidad o estabilidad, o tamaño. Los ejemplos no limitantes de técnicas de separación incluyen precipitación de sulfato de amonio, cromatografía, y filtración de membrana (incluyendo filtración de membrana de flujo tangencial) . En modalidades que utilizan cromatografía para separación, los métodos ejemplares intercambio de iones (catiónico o aniónico) , cromatografía de afinidad, interacción hidrofílica, interacción hidrofóbica, exclusión de tamaño y permeación de gel (ver US 6,248,570).

En algunas modalidades, la separación puede conducirse por filtración de membrana, que incluye, pero no se limita a, métodos tales como filtración de flujo directo (DFF) sin salida, de paso sencillo, y flujo cruzado o filtración de flujo tangencial (TFF) . De acuerdo a la invención, la filtración está basada en el principio de separar moléculas de acuerdo al tamaño usando una membrana semi-permeable de un intervalo definido de tamaños de poro. Se conoce para aquellos experimentados en la técnica que las combinaciones de los métodos de filtración y tipos de membrana pueden usarse en separación.

De acuerdo con la invención, la filtración de membrana es la separación de componentes celulares efectuados por membranas poliméricas o inorgánicas. Dentro de la técnica, existen cuatro categorías comúnmente aceptadas de membranas definidas por el tamaño del material que se remueve del líquido portador. Los métodos de filtrado secuencialmente a través de membranas de menor a mayor tamaño de poro son Osmosis Inversa (RO) , Nanofiltración (NF) , Ultrafiltración (UF) , y Microfiltración (MF) .

La filtración con las membranas mencionadas arriba separada moléculas de acuerdo a su peso molecular al usar membranas con tamaños de poro específicos. Por ejemplo, la separación con membranas RO que tienen tamaños de poro menores que 0.001 micrómetros se pretende para separar moléculas que tienen un peso molecular menor que 200 Daltons. La filtración con membranas NF que tienen tamaños de poro desde 0.001-0.008 micrómetros, inclusive, se pretende para separar moléculas que tienen un peso molecular desde 200 Daltons hasta 15 kilodaltons (kDa) inclusive. La filtración con membranas UF que tienen tamaños de poro desde 0.005-0.1 micrómetros, inclusive, se pretende para separar moléculas que tienen un peso molecular desde 5 kDa-300 kDa, inclusive. La filtración con membranas de microfiltracion que tienen tamaños de poro desde 0.05-3.0 micrómetros, inclusive, se pretende para separar moléculas que tienen un peso molecular desde 100 kDa-3000 kDa y más grandes.

De acuerdo con esta invención, la filtración de membrana puede separar las proteínas de seda solubilizadas de otros componentes basados en exclusión de tamaño al utilizar membranas que tienen un Corte de Peso Molecular particular (MQWCO) que se determina por el tamaño de poro de la membrana. El MWCO también nombrado Límite de Peso Molecular Nominal (NMWL) o Corte de Peso Molecular Nominal (NMWCO) , es la designación de tamaño para kilodalton por la filtración de membranas. El MWCO se define como el peso molecular de la molécula que es 90% retenido por la membrana. Debido a que, por ejemplo, las moléculas del mismo peso molecular pueden tener formas significativamente diferentes, el M CO no es una métrica exacta, pero es sin embargo una métrica útil y se emplea comúnmente por fabricantes de filtro. Pueden usarse tanto membranas hidrofóbicas asi como hidrofilicas en la presente invención. Tales membranas pueden usarse como láminas planas o en una configuración de enrollada en espiral. Las fibras huecas también pueden usarse. En relación a las composiciones de membranas UF, cualquier número de materiales de membrana potenciales pueden usarse incluyendo, pero no limitados a, celulosa regenerada, sulfona de poliéter (que puede o no puede modificarse para alterar su hidrofobicidad inherente) , fluoruro de polivinilideno, y agregados de cerámica y óxido de metal. Muchas membranas UF de sulfona de poliéter pueden resistir un pH en el intervalo de 0.5-13, y temperaturas en el intervalo hasta 85°C. Los materiales para membranas MF incluyen todo lo que se usa para membranas UF, asi como policarbonato, polipropileno, polietileno y PTFE (TEFLON™) .

En algunas modalidades, las proteínas de seda solubilizadas pueden filtrarse para la separación de desechos celulares grandes de componentes celulares más pequeños para prevenir que los desechos celulares interfieran con las etapas de purificación y separación de proceso que involucran el uso de membranas o cromatografía. En estas modalidades, el permeado comprende las proteínas de seda y se recupera.

En algunas modalidades, una membrana puede usarse en una etapa de separación que tiene un MWCO adecuado. Por ejemplo, las proteínas de sedas típicas usadas en los métodos de la invención tienen un MW de alrededor de 30kDa. En estas modalidades, el concentrado comprende la proteína de seda y puede recuperarse.

En una modalidad preferida, la filtración de flujo tangencial actúa para tanto diafiltrar y concentrar las proteínas de seda. En TFF, típicamente, la solución fluye en paralelo a la membrana de filtro. Una presión diferencial a través de la membrana provoca fluido y solutos filtrables (cuyo peso molecular es más pequeño que aquellos de las membranas o se comporta como tal, tales como proteínas globulares) para fluir a través del filtro. En HPTFF (la filtración de flujo tangencial de alto desempeño) la membrana se carga, por lo tanto usando tanto tamaño y carga de molecular para separar los contaminantes (ver US 20030229212). De acuerdo con la invención, la diafiltración puede ya sea ser diafiltración discontinua o continua. En diafiltración discontinua, la solución se concentra, y el volumen perdido se reemplaza por una solución amortiguadora nueva. En diafiltración continua, el volumen de solución se mantiene por la afluencia de la nueva solución amortiguadora 2 mientras que la vieja solución amortiguadora se remueve. En algunas modalidades, la separación y purificación de las proteínas de seda pueden realizarse por método de filtración de flujo tangencial usando membranas de ultrafiltración .

Usos La materia prima de la seda producida usando los métodos de la invención puede usarse para una configuración amplia y diversa de aplicaciones médicas, militares, industriales y comerciales. Por ejemplo, la materia prima de la seda se usa para producir fibras de seda que de nuevo puede usarse en la fabricación de dispositivos médicos tales como suturas, injertos de seda, matrices de crecimiento celular, ligamentos de reemplazo, y malla quirúrgica, y en un intervalo amplio de productos industrial y comercial, tales como, por ejemplo, cable, cuerda, redes, sedal, tela de ropa, chaleco revestido a prueba de balas, tela de recipientes, mochilas, mochilas de cordón, correas para bolsas o bolsos, material de unión adhesiva, material de unión no adhesivo, material de refuerzo, tela para tienda de campaña, lonas, cubiertas para piscina, cubiertas para vehículo, material de cerca, sellador, material de construcción, material para exterior, material de división flexible, equipo deportivo, y, de hecho, casi en cualquier uso de fibra o tela para el cual son características deseadas la resistencia a alta tensión y elasticidad. La materia prima de la seda también tiene aplicaciones para uso en la producción de composiciones para productos del cuidado personal tales como cosméticos, cuidado de la piel, cuidado del cabello y coloración de cabello; y en cubiertas de partículas, tales como pigmentos.

Las sedas pueden usarse en su forma nativa o pueden modificarse para formar derivados, que proporcionan un efecto más benéfico. Por ejemplo, las sedas pueden modificarse por conjugación a un polímero para reducir su alergenicidad como se describe en US 5,981,718 y US 5.856,451. Los polímeros modificados apropiados incluyen, pero no se limitan a, óxidos de polialquileno, alcohol polivinílico, poli-carboxilatos, poli (vinilpirolidona) , y dextranos. En otro ejemplo, las sedas pueden modificarse por digestión selectiva y empalme de otros modificadores de proteína. Por ejemplo, las proteínas de seda pueden escindirse en unidades de péptido más pequeñas por tratamiento con ácido a una temperatura elevada de alrededor de 60°C. Los ácidos útiles incluyen, pero no se limitan a, ácidos clorhídrico, sulfúrico o fosfórico diluidos. Alternativamente, la digestión de las proteínas de seda puede darse por tratamiento con una base, tales como hidróxido de sodio, o pueden usarse digestión enzimática usando una proteasa apropiada.

Las proteínas pueden modificarse además para proporcionar características de desempeño que son benéficas en aplicaciones específicas para productos del cuidado personal. La modificación de proteínas para uso en productos del cuidado personal es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, se describen métodos comúnmente usados en US 6,303.752, US 6,284,246, y US 6,358,501. Los ejemplos de modificaciones incluyen, pero no se limitan a, etoxilación para promover aumento de emulsión agua-aceite, siloxilación para proporcionar compatibilidad lipofílica, y esterificación para ayudar en la compatibilidad con composiciones de jabón y detergente. Adicionalmente, las proteínas de seda pueden derivarse con grupos funcionales que incluyen, pero no limitadas a, aminas, oxiranos, cianatos, ésteres de ácido carboxílico, copolioles de silicón, ésteres de siloxano, alifáticos de amina cuaternizados , uretanos, poliacrilamidas, ésteres de ácido dicarboxílico, y ésteres halogenados . Las proteínas de seda también pueden derivarse por reacción con diiminas y por la formación de sales de metal.

Consistente con las definiciones anteriores de "polipéptido" (y "proteína"), tales moléculas derivadas y/o modificadas también se refieren en la presente ampliamente como "polipéptidos" y "proteínas".

La materia prima de la seda puede hilarse en conjunto y/o atarse o trenzarse con otros tipos de fibra. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, fibras poliméricas (por ejemplo, polipropileno, nylon, poliéster) , fibras y sedas de otras fuentes de planta y animal (por ejemplo, algodón, lana, Bombyx morí o seda de telaraña), y fibras de vidrio. Una modalidad preferida es fibra de seda trenzada con fibra de polipropileno al 10%. La presente invención contempla que la producción de tales combinaciones de fibras pueden practicarse fácilmente para aumentar cualquiera de las características deseadas, por ejemplo, apariencia, suavidad, peso, durabilidad, propiedades repelentes al agua, costo de fabricación mejorado, que puede generalmente buscarse en la manufactura y producción de fibras para aplicaciones médicas, industriales, o comerciales.

Productos del cuidado personal Las composiciones cosméticas y de cuidado de la piel pueden ser composiciones anhidras que comprenden una cantidad efectiva de seda en un medio cosméticamente aceptable. Los usos de estas composiciones incluyen, pero no se limitan a, cuidado de la piel, limpieza de la piel, maquillaje, y productos anti-arrugas . Una cantidad efectiva de una seda para las composiciones cosméticas y de cuidado de la piel se define en la presente como una proporción desde alrededor de 10"4 hasta alrededor de 30% en peso, pero preferiblemente desde alrededor de 10"3 hasta 15% en peso, con relación al peso total de la composición. Esta proporción puede variar como una función del tipo de cosmético o composición del cuidado de la piel. Las composiciones apropiadas para un medio cosméticamente aceptable se describen en US 6,280,747. Por ejemplo, el medio cosméticamente aceptable puede contener una sustancia grasa en una proporción generalmente desde alrededor de 10 hasta alrededor de 90% en peso con relación al peso total de la composición, donde la fase ácida que contiene al menos una sustancia grasa liquida, sólida o semi-sólida La sustancia grasa incluye, pero no se limita a, aceites, ceras, gomas, y las llamadas sustancias grasas pastosas. Alternativamente, las composiciones pueden estar en la forma de una dispersión estable tal como una emulsión agua en aceite o aceite en agua. Adicionalmente, las composiciones puede contener uno o más aditivos o adyuvantes cosméticos o dermatológicos convencionales, que incluyen pero no se limitan a, antioxidantes, agentes conservadores, agentes de relleno, tensoactivos , protectores contra UVA y/o UVB, fragancias, espesantes, agentes humectantes y polímeros aniónicos, no iónicos o anfotéricos, y tintes o pigmentos.

Los cosméticos emulsionados y cuasi fármacos que son producibles con el uso de los materiales emulsionados que comprende seda producida por un método de la invención, por ejemplo, cosméticos de limpieza (jabón de belleza, lavado facial, champú, enjuague, y similares) , productos de cuidado del cabello (tinte capilar, cosméticos capilares, y similares) , cosméticos básicos (crema general, emulsión, crema de afeitar, acondicionador, colonia, loción para afeitar, aceite cosmético, maquillaje facial, y similares), cosméticos de maquillaje (base de maquillaje, lápiz de cejas, crema de ojos, sombra de ojos, rimel, y similares), cosméticos aromáticos (perfume y similares), cosméticos bronceadores y de protección solar (crema bronceadora y de protección solar, loción bronceadora y de protección solar, aceite bronceadora y de protección solar, y similares), cosméticos de uñas (crema de uñas y similares) , cosméticos delineadores de ojos (delineador de ojos y similares) , cosméticos de labios (lápiz labial, crema labial, y similares), productos de cuidado bucal (pasta de dientes y similares) cosméticos de baño (productos de baño y similares), y similares.

La composición cosmética también puede estar en la forma de productos para cuidado de uñas, tales como un barniz de uñas. Los barnices de uñas se definen en la presente como composiciones para el tratamiento y coloración de uñas, que comprende una cantidad efectiva de seda en un medio cosméticamente aceptable. Una cantidad efectiva de una seda para uso en una composición de barniz de uñas se define en la presente como una proporción desde alrededor de 10~4 hasta alrededor de 30% en peso con relación al peso total del barniz. Los componentes de un medio cosméticamente aceptable para barnices de uñas se describen en US 6,280,747. El barniz de uñas típicamente contiene un solvente y una sustancia que forma película, tal como derivados de celulosa, derivados de polivinilo, polímeros o copolímeros acrílicos, copolímeros de vinilo y polímeros de poliéster. La composición también puede contener un pigmento orgánico o inorgánico.

Las composiciones del cuidado del cabello se definen en la presente como composiciones para el tratamiento del cabello, que incluyen pero no limitadas a champús, acondicionadores, lociones, aerosoles, geles, y espumas, que comprenden una cantidad efectiva de seda en un medio cosméticamente aceptable. Una cantidad efectiva de una seda para uso en una composición del cuidado del cabello se define en la presente como una proporción desde alrededor de 10"2 hasta alrededor de 90% en peso con relación al peso total de la composición. Los componentes de un medio cosméticamente aceptable para composiciones del cuidado del cabello se describen en US 2004/0170590, US 6,280,747, US 6,139,851, y US 6,013,250 Por ejemplo, estas composiciones del cuidado del cabello pueden ser soluciones acuosas, alcohólicas o acuosas-alcohólicas, el alcohol preferiblemente siendo etanol o isopropanol, en una proporción desde alrededor de 1 hasta alrededor de 75% en peso con relación al peso total, para las soluciones acuosas-alcohólicas . Adicionalmente, las composiciones del cuidado del cabello pueden contener uno o más aditivos o adyuvantes cosméticos o dermatológicos convencionales .

Las composiciones de coloración de cabello se definen en la presente como composiciones para la coloración, entintado, o aclarado del cabello, que comprende una cantidad efectiva de seda en un medio cosméticamente aceptable. Una cantidad efectiva de una seda para uso en una composición de coloración de cabello se define en la presente como una proporción desde alrededor de 10~4 hasta alrededor de 60% en peso con relación al peso total de la composición. Los componentes de un medio cosméticamente aceptable para composiciones de coloración de cabello se describen en US 2004/0170590, US 6,398,821 y US 6,129,770 Por ejemplo, las composiciones de coloración de cabello generalmente contienen una mezcla de agente oxidante de pigmento basado en peroxigeno inorgánico y un agente colorante oxidable. El agente oxidante de pigmento basado en peroxigeno es el peróxido de hidrógeno más común. Los agentes colorantes de cabello oxidantes se forman al acopar de forma oxidante intermediarios primarios (por ejemplo p-fenilendiaminas . p-aminofenoles , p-diaminopiridinas , hidroxiindoles, aminoindoles, aminotimidinas , o cianofenoles ) con intermediarios secundarios (por ejemplo fenoles, resorcinoles , m-aminofenoles , m-fenilendiaminas , naftoles, pirazolones, hidroxiindoles, catecoles o pirazoles) . Adicionalmente, las composiciones de coloración de cabello pueden contener ácidos oxidantes, secuestrantes, estabilizadores, espesantes, portadores amortiguadores, tensoactivos , solventes, antioxidantes, polímeros, tintes no oxidantes y acondicionadores.

Las sedas también pueden usarse para pigmentos de recubrimiento y partículas de cosmético con objeto de mejorar la dispersabilidad de las partículas para uso en cosméticos y composiciones de recubrimiento. Las partículas de cosmético se definen en la presente como materiales en partículas tales como pigmentos o partículas inertes se usan en composiciones cosméticas. Los pigmentos y partículas cosméticas apropiados, incluyen, pero no se limitan a, pigmentos de color inorgánicos, pigmentos orgánicos, y partículas inertes. Los pigmentos de color inorgánicos incluyen, pero no se limitan a, dióxido de titanio, óxido de zinc, y óxidos de hierro, magnesio, cobalto, y aluminio. Los pigmentos orgánicos incluyen, pero no se limitan a, rojo D&C No. 36, anaranjado D&C No. 17, las lacas de calcio de rojo D&C Nos. 7, 11, 31 y 34, la laca de vario de rojo D&C No. 12, la laca de estronio D&C Red No. 13, la laca de aluminio de amarillo FD&C No. 5 y partículas de negro de humo. Las partículas inertes incluyen, pero no se limitan a, carbonato de calcio, silicato de aluminio, silicato de calcio, silicato de magnesio mica, talco, sulfato de bario, sulfato de calcio, Nylon™ en polvo, alcanos perfluorados, y otros plásticos inertes.

Las sedas también pueden usarse en hilo dental (ver, por ejemplo, US 2005/0161058). El hilo dental puede ser hilado en monofilamento o hilado en filamento múltiple, y las fibras pueden o no torcerse. El hilo dental puede empacarse como piezas individuales o en un rodillo con piezas de cortado o un cortador en cualquier longitud deseada. El hilo dental puede proporcionarse en una variedad de formas diferentes a los filamentos, tal como pero no limitado a, tiras y láminas y similares. El hilo dental puede recubrirse con materiales diferentes, tal como pero no se limita a, cera, hilado monofilamento de politetrafluoroetileno para hilo dental.

Las sedas también pueden usarse en jabón (ver, por ejemplo, US 2005/0130857).

Pigmento y Recubrimiento de Partículas Cosméticas La cantidad efectiva de una seda para uso en pigmento y recubrimiento de partículas cosméticas se define en la presente como una proporción desde alrededor de 10~4 hasta alrededor de 50%, pero preferiblemente desde alrededor de 0.25 hasta alrededor de 15% en peso con relación al peso seco de partícula. La cantidad óptima de la seda a usarse depende del tipo de pigmento o partícula de cosmético a recubrirse. Por ejemplo, la cantidad de seda usada con pigmentos de color inorgánicos está preferiblemente entre alrededor de 0.01% y 20% en peso. En el caso de pigmentos orgánicos, la cantidad preferida de seda está entre alrededor de 1% hasta alrededor de 15% en peso, aunque para partículas inertes, la cantidad preferida está entre alrededor de 0.25% hasta alrededor de 3% en peso. Los métodos para la preparación de pigmentos y partículas recubiertos se describen en US 5,643,672. Estos métodos incluyen: agregar una solución acuosa de la seda a las partículas mientras se revuelve o mezcla, formar una mezcla de la seda y las partículas y secar, secar por rocío una solución de la seda sobre las partículas o liofilizar una mezcla espesa de la seda y las partículas. Estos pigmentos y partículas de cosméticos recubiertos pueden usarse en formulaciones de cosmético, pinturas, tintas y similares.

Biomédicos Las sedas pueden usarse como un recubrimiento en una venda para promover la cicatrización de heridas. Para esta aplicación, el material de la venda se recubre con una cantidad efectiva de la seda. Para el propósito de una venda de cicatrización de herida, una cantidad efectiva de seda se define en la presente como una proporción desde alrededor de 10"4 hasta alrededor de 30% en peso con relación al peso del material de la venda. El material a recubrirse puede ser cualquier tela o fibra suave, biológicamente inerte, porosa. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, algodón, seda, rayón, acetato, acrilico, polietileno, poliéster, y combinaciones de los mismos. El recubrimiento de la tela o fibra pueden realizarse por un número de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el material a recubrirse puede remojarse en una solución acuosa que contiene la seda. Alternativamente, la solución que contiene la seda puede rociarse en la superficie del material a recubrirse usando una pistola de rociado. Adicionalmente, la solución que contiene la seda puede recubrirse en la superficie usando un proceso de impresor por recubrimiento en rodillo. La venda para herida puede incluir otros aditivos que incluye.n, pero no limitadas a, desinfectantes tales como yodo, yoduro de potasio, yoduro de povidona, acrinol, peróxido de hidrógeno, cloruro de benzalconio, y clorohexidina; agentes aceleradores de curación tales como alantoina, clorohidrato de dibucaína, y malato de clorofenilamina, agentes vasoconstrictores tales como clorohidrato de nafazolina; agentes astringentes tales como óxido de zinc; y agentes que generan costra tales como ácido borónico.

La materia prima de la seda también puede usarse en la forma de una película como un material de vendaje de herida. El uso de seda, en la forma de una película amorfa, como un material de vendaje de herida se describe en US 6,175,053. La película amorfa comprende una película densa y no porosa de una cristalinidad debajo del 10% que contiene una cantidad efectiva de seda. Para una película para cuidado de herida, una cantidad efectiva de seda se define en la presente como entre alrededor de 1 hasta 99% en peso. La película también puede contener otros componentes que incluyen pero no limitan a otras proteínas tales como sericina, y desinfectantes, agentes aceleradores de curación, agentes vasoconstrictores, agentes astringente, y agentes generadores de costra, como se describe antes. Otras proteínas tales como sericina pueden comprender 1 hasta 99% en peso de la composición. La cantidad de los otros ingredientes enlistados está preferiblemente debajo de un total de alrededor de 30% en peso, más preferiblemente entre alrededor de 0.5 hasta 20% en peso de la composición. La película de vendaje de herida puede prepararse al disolver los materiales antes mencionados en una solución acuosa, remover los insolubles por filtración o centrifugación, y fundir la solución en una superficie sólida lisa tales como una placa acrilica, seguido por secado.

La materia prima de la seda también puede usarse para producir suturas (ver, por ejemplo, US 2005/0055051) . Tales suturas pueden presentar un enchaquetado trenzado hecho de fibras de ultra alto peso molecular y fibras de seda. El polietileno proporciona resistencia. Las fibras de poliéster pueden tejerse con el polietileno de alto peso molecular para proporcionar propiedades de atado mejoradas. La seda puede proporcionarse en un color contrastante para proporcionar un rastro para mejorar el reconocimiento e identificación de sutura mejorado. La seda también es más afín al tejido que otras fibras, permitiendo que los extremos se corten cerca del nudo sin asuntos para interacción prejudicial entre los extremos de la sutura y el tejido circundante. Las propiedades de manejo de la sutura de resistencia superior también pueden aumentarse usando varios materiales para recubrir la sutura. La sutura tiene ventajosamente la resistencia de la sutura No. 5 Ethibond, tiene aún el diámetro, sensación y capacidad de anudar de la sutura No. 2. Como un resultado, la sutura es ideal para la mayoría de los procedimientos ortopédicos tal como reparación del manguito rotador, reparación del tendón de Aquiles, reparación del tendón patelar, reconstrucción ACL/PCL, procedimientos de reconst ucción de cadera y hombro, y reemplazo de sutura usada en o con anclas de sutura. La sutura puede estar no recubierta, o recubierta con cera (cera de abejas, cera de petróleo, cera de poletileno, u otras) silicón (fluido 202A de silicón Dow Corning u otros) , hules de silicón, PBA (ácido polibutilato) , etil celulosa (Filodel) u otros recubrimientos, para mejorar la capacidad de lubricación del trenzado, seguridad del nudo, o resistencia a la abrasión, por ejemplo.

La materia prima de la seda también puede usarse para producir derivaciones cardiovasculares (ver, por ejemplo, US 2004/0199241) . Por ejemplo, se proporciona un injerto de derivación cardiovascular que incluye una derivación cardiovascular endoluminal y un injerto, en donde el injerto de derivación cardiovascular incluye seda. La seda induce una respuesta en un hospedero quien recibe el injerto de derivación cardiovascular, donde la respuesta puede llevar a una adhesión aumentada entre el injerto de derivación cardiovascular de seda y el tejido hospedero que está adyacente a la seda del injerto de derivación cardiovascular de seda. La seda puede enlazarse al injerto por cualquiera de varios medios, por ejemplo, al entretejer la seda en el injerto o al adherir la seda al injerto (por ejemplo, por medio de un adhesivo o por medio de sutura) . La seda puede estar en la forma de un tejido, un trenzado, una lámina, polvo, etc. Conforme a la ubicación de la seda en el injerto de derivación cardiovascular, la seda puede enlazar sólo el exterior de la derivación cardiovascular, y/o la seda puede enlazarse a regiones distales del injerto de derivación cardiovascular, con objeto de ayudar a asegurar aquellas regiones distales a la vecindad del tejido en el hospedero. Una amplia variedad de injertos de derivación cardiovascular pueden utilizarse dentro del contexto de la invención actual, dependiendo del sitio y naturaleza del tratamiento deseado. Los injertos de derivación cardiovascular pueden, por ejemplo, ser injertos bifurcados o de tubo, cilindricos o estrechos, auto-expandibles o expandibles por globo, de unicuerpo o, modulares, etc.

Además de la seda, el injerto de derivación cardiovascular puede contener un revestimiento en algo o toda la seda, donde el revestimiento se degrada durante la inserción del injerto de derivación cardiovascular en el hospedero, el revestimiento por ello retarda el contacto entre la seda y el hospedero. Los revestimientos apropiados incluyen, sin limitación, gelatina, poliésteres degradables (por ejemplo, PLGA, PLA, MePEG-PLGA, PLGA-PEG-PLGA, y copolímeros y mezclas de los mismos), celulosa y derivados de celulosa (por ejemplo, hidroxipropil celulosa) , polisacáridos (por ejemplo, ácido hialurónico, dextrano, sulfato de dextrano, quitosan) , lipidos, ácidos grasos, ésteres de azúcar, ésteres de ácido nucleico, polianhidridos, poliortoésteres y polivinilalcohol (PVA). Los injertos de derivación cardiovascular que contienen seda pueden contener un agente biológicamente activo (fármaco), donde el agente se libre del injerto de derivación cardiovascular y luego induce una respuesta celular aumentada (por ejemplo, deposición de matriz extracelular) y/o respuesta fibrótica en un hospedero al cual se le ha insertado el injerto de derivación cardiovascular .

La materia prima de la seda también puede usarse para producir una matriz para producir ligamentos y tendones ex vivo (ver, por ejemplo, US 2005/0089552). Puede sembrarse una matriz basada en fibra de seda con células pluripotentes , tal como células estromales de médula ósea (BMSCs) . El ligamento o tendón producido por bioingenieria se caracteriza ventajosamente por una orientación celular y/o patrón de ondulado de matriz en la dirección de las fuerzas mecánicas aplicadas, y también por la producción de marcadores específicos de ligamento y tendón que incluyen colágeno tipo I, colágeno tipo III, y proteínas de fibronectina a lo largo del eje de carga mecánica producido por las fuerzas mecánicas o estimulación, su tales fuerzas se aplican. En una modalidad preferida, el ligamento o tendón se caracteriza por la presencia de atados de fibras que se configuran en una organización en hélice. Algunos ejemplos de ligamentos o tendones que pueden producirse incluyen ligamento cruzado anterior, ligamento cruzado posterior, tendones del manguito rotatorio, ligamento colateral medio del codo y rodilla, tendones flexores de la mano, ligamentos laterales del tobillo y tendones y ligamentos de la mandíbula o articulación temporomandibular . Otros tejidos que pueden producirse por los métodos de la presente invención incluyen cartílago (tanto articular como de menisco) , hueso, músculo, piel y vasos sanguíneos.

La materia prima de la seda también puede usarse para producir hidrogeles (ver, por ejemplo, US 2005/0266992) . Los hidrogeles de fibroina de seda pueden caracterizarse por una estructura de poro abierto que permite su uso como andamiajes producidos por ingeniería de tejido, sustrato para cultivo celular, vendajes para heridas y quemaduras, sustitutos de tejido liso, agentes de relleno óseos, y así como soporte para compuestos farmacéuticos o biológicamente activos.

La materia prima de la seda también puede usarse para producir composiciones dermatológicas (ver, por ejemplo, US 2005/0019297). Adicionalmente, el líquido también puede usarse para producir composiciones de liberación sostenida (ver, por ejemplo, US 2004/0005363) .

Textiles La materia prima de la seda también puede usarse para producir un recubrimiento para la superficie de fibras para uso posterior en textiles. Este proporciona una monocapa de la película de proteína en la fibra, lo que resulta en una terminación suave. La US 6,416,558 y US 5.232,611 describe la adición de un recubrimiento de acabado a las fibras. Los métodos descritos en estas descripciones proporcionan ejemplos de la versatilidad del acabado de la fibra para proporcionar una sensación buena y una superficie suave. Para esta aplicación, la fibra se recubre con una cantidad efectiva de la seda. Para el propósito de recubrimiento de fibra para uso en textiles, una cantidad efectiva de seda es en la presente definida como una proporción desde alrededor de 1 hasta alrededor de 99% en peso con relación al peso del material de fibra. Los materiales de fibra incluyen, pero no se limitan a fibras textiles de algodón, poliésteres tales como rayón y Lycra™, nylon, lana, y otras fibras naturales que incluyen seda nativa. Las composiciones apropiadas para aplicar la seda sobre la fibra pueden incluir co-solventes tales como etanol, isopropanol, hexafluoranoles, isotiocianouranatos , y otros solventes polares que pueden mezclarse con agua para formar soluciones o microemulsiones . La solución que contiene seda pueden rociarse en la fibra o la fibra puede aplicarse por rocío sobre la fibra o la fibra puede remojarse en la solución. Aunque no es necesario, se prefiere el secado instantáneo del recubrimiento. Un protocolo alternativo es aplicar la composición de seda sobre fibras tejidas. Una modalidad ideal de esta aplicación es el uso de sedas para recubrir tejidos estirables tales como los usados para medias.

Materiales Compuestos Las fibras de seda pueden agregarse al poliuretano, otras resinas o agentes de relleno termoplásticos para preparar tableros de panel y otro material de construcción o como mobiliario modular y mesas de trabajo que remplaza la madera y tableros en partículas. Las composiciones también pueden usarse en la construcción y fabricación automotriz especialmente en tejados y paneles de puertas. Las fibras de seda refuerzan la resina haciendo al material mucho más fuerte y permitiendo una construcción ligera que es de resistencia igual o superior a los otros paneles en partículas y materiales compuestos. Las fibras de seda pueden aislarse y agregarse a una resina que forma el compuesto sintética o usarse en combinación con proteínas derivadas de plantas, almidón y aceites para producir materiales compuestos basados biológicamente. Los procesos para la producción e tales materiales se describen en JP 2004284246. US 2005175825, US 4,515,737, JP 47020312 y WO 2005/017004.

Aditivos de Papel Las propiedades de fibra de la seda pueden agregar resistencia y calidad de textura a la elaboración de papel. Los papeles de seda se hacen al motear hebras de seda en pulpa de algodón para preparar papel hechos a mano extra suaves que se usan para envoltura de regalos, cubiertas de cuadernos, equipaje de mano. Los procesos para la producción de productos de papel a partir de materia prima de la seda se describen generalmente en JP 2000139755 Materiales Avanzados Las sedas producidas a partir de la materia prima de la seda de la invención tienen dureza considerable y sobresalen entre otras sedas en mantener estas propiedades cuando están húmedas (Hepburn et al., 1979).

Las áreas de crecimiento sustancial en la industria textil de ropa son los textiles técnicos e inteligentes. Hay una demanda creciente por productos textiles saludables, de alto valor funcional, ambientalmente amigables y personalizados. Las fibras, tales como aquellas de la invención, que no cambian las propiedades cuanto están húmedas y mantienen en particular su resistencia y capacidad de extensión son útiles para ropa funcional para deportes y ropa de recreación asi como ropa de trabajo y ropa protectora .

Los desarrollos en las armas y tecnologías de supervivencia son innovaciones prometedoras en equipos de protección individual y sistemas y estructuras relacionados con campos de batalla. Además de los requerimientos convencionales tales como durabilidad de material para prolongar la exposición, la ropa pesada y la protección de ambiente externo, los textiles de seda producidos a partir de la materia prima de la seda de la invención pueden ser procesados para resistir proyectiles balísticos, fuego y químicos. Los procesos para la producción de tales materiales se describen en WO 2005/045122 y US 2005268443.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 - Producción recombinante y purificación de proteínas de seda de abeja Para crear constructos de expresión recombinante, las cuatro secuencias del gen de seda de abeja (Nos. de Acceso al Genbank FJ235088. FJ235089, FJ235090, FJ235091) sin péptidos de señal se amplificaron por PCR a partir de los clones de cADN descritos en Sutherland et al. (2006) usando los siguientes conjuntos de cebador oligonucleotido: AmelFl: GGAATT CTC ATG AGT TTG GAG GGG CCG GGC AAC TCG (SEQ ID NO: 101) y CGGC GGATCC TTA TTA AAA TAC GTT GCT CTT CAA GT (SEQ ID NO: 102) ; AmelF2: GGAATT CTC ATG AGC CGC GTG ATT AAT CAC GAG TCC CTG (SEQ ID NO: 103) y CGGC GGATCC TTA TTA TTC CAA CTT TGC TAC ATG TAT TTT C (SEQ ID NO: 104); AmelF3: GGAATT CCC ATG GGC GTC GAG GAA TTC AAG TCC TCG (SEQ ID NO: 105) y CGGC AGATCT TTA TTA AAA TTT TTT ATC CTC AAT A (SEQ ID NO: 106) ; AmelF4: GGAATT CCC ATG GCA AGG GAA GAG GTG GAG ACA CGG (SEQ ID NO: 107) y CGGC GGATCC TTA TTA CTT CAC CTC CCA TTC TTC ATT C (SEQ ID NO: 108) (los sitios de enzima de restricción de clonación están subrayados y en negrita y las secuencias que alinean la secuencia de cADN se muestran en cursiva) .

Se clonaron los amplicones PCR en los sitios de restricción de enzima (AmelFl y AmelF2: BspHl y Bam HI; AmelF3: Ncol y Bgl II; AmelF4: Ncol y Bam HI) del vector de expresión pET14b (Novagen) y las secuencias verificadas por procesado de secuencia de ADN antes de la expresión.

Se transformaron los constructos en células competentes Rosetta 2 (DE3) (Novagen) y las proteínas de seda se expresaron inicialmente en 50 mL de medio TB de instante que expresa durante la noche (Novagen) en matraces de agitación. Las cuatro proteínas de seda de abeja, AmelFl-4, se sintetizaron en células de E. coli en forma soluble a 20°C y forma insoluble a 30°C y 37°C. Los rendimientos más altos de proteína, como se juzga por intensidad de banda de proteína comparativa después de SDS-PAGE (Figura 1), se obtuvieron cuando se condujo la expresión por periodos extendidos (24-36 h) a temperaturas de >30°C con las proteínas recuperadas de los cuerpos de inclusión. El análisis de intensidad de banda en gel cuatitativo, con identidades de proteína confirmada por espectroscopia de masa, indican que la proteína recuperada de los cuerpos de inclusión fue una proteína de seda esencialmente pura (>95%). El análisis posterior encuentra que las proteína solubilizadas de los cuerpos de inclusión se auto ensamblan en estructura tipo nativa. De esta manera, se condujo toda la expresión posterior bajo condiciones tales que se recuperaron las proteínas recombinantes de los cuerpos de inclusión.

Con objeto de incrementar el rendimiento de proteína se desarrolló un proceso de fermentación de alimentación por lote a gran escala y optimizó para AmelF3. Se llevaron a cabo las fermentaciones en vasos de cultivo Biostat B de 2 litros (Sartorius Stedim, Melsungen, Alemania) usando medio mínimo (volumen de partida 1.6 litro). Se usó glucosa como la fuente de carbono inicial, cambiando a una alimentación de glicerol después de la inducción de la expresión de proteína de seda con IPTG. El medio inicial contiene (por litro): KH2P04, 13.3 g; (NH4 ) 2HP04 , 4 g y ácido cítrico 1.7 g. Se ajustó el pH del medio hasta un valor final de 7.0 usando NaOH 2 M. Se esterilizaron los siguientes componentes, luego se agregaron (por litro de medio final) : 40 mi de glucosa al 50% (p/v) glucosa, 5 mi de MgS04 1M; 130 µ? de clorohidrato de tiamina 0.1 ; 1 mi de 100 mg/ml ampicilina y 5 mi de una solución de vitamina/residuo de metal que contiene (por litro de solución): biotina, 0.2 g; CuS04.5H20, 2.0 g; Nal, 0.08 g; MnS04-H20, 3.0 g; Na2Mo04.2H20, 0.2g; ácido bórico 0.02 g; CoCl2.6H20, 0.5 g; ZnCl2, 7.0 g; FeS04.7H20, 22.0 g; CaS04.2H20, 0.5 g y H2S04, 1 mi.

Se cultivaron inóculos de fermentación para las cuatro cepas por 20 h a 37 °C en el mismo medio como se usa en el fermentador. Una vez que se transfirieron los inoculados a los vasos de fermentación, se ajustó el pH del medio y controla a 7.0 a través de la adición de NHOH al 10% (p/v) o H3P0 al 10% (p/v). Se controló la temperatura a 37 °C, y se mantuvo la concentración de oxigeno disuelto (DO) arriba de saturación del aire al 40% al manipular la velocidad de agitación hasta 1100 rpm y enriquecer el suministro de aire con oxigeno puro cuando se requiere.

Cuando los cultivos crecen hasta una densidad óptica a un valor 600 nm (OD6oonm) de aproximadamente 20 (~10 h después de la inoculación) , se agregó IPTG hasta una concentración final de 1 mM. Se operaron los termentadores en un modo de lote hasta que toda la glucosa se consumió, como se indica por una subida repentina y acelerada en DO (~12 h después de la inoculación) . En la fase de lote de alimentación de glicerol, se alimentó 400 mi de solución de glicerol al 62% (v/v) en el termentador a una velocidad de 50 ml/h. Se hicieron crecer los cultivos por 24 h, después de lo cual se cosecharon las células por centrifugación y almacenan a -80 °C. Bajo estas condiciones el valor OD600nm del fermentado fue 34 y el rendimiento de AmelF3 recombinante purificado después de la solubilización fue aproximadamente 2.5 gramos por litro de fermentado. Se usaron las mismas condiciones de fermentación para expresar las otras proteínas de seda de abeja. Las cepas que expresan proteínas de seda AmelFl, 2 y 4 crecen hasta valores OD60onm de 30, 67, y 57 respectivamente. Los rendimientos de proteínas recombinantes purificadas AmelFl, 2 y 4 después de la solubilización fueron de aproximadamente 0.2, 1.5 y 1.9 gramo por litro de fermentado respectivamente .

El rendimiento de 2.5 g/L de proteina purificada del sistema de fermentación de alimentación de lote optimizado es por mucho los niveles de expresión reportados más altos para cualquier proteina de seda recombinante . Los factores que contribuyen a este alto rendimiento incluyen el tamaño y la naturaleza de los genes de fibroina de abeja y las propiedades estructurales de las proteínas de seda. En contraste con el tamaño grande (>10kbp) y naturaleza altamente repetitiva de los genes que codifican la seda de telaraña bien estudiada de arañas y seda de capullo de gusano de seda, los genes de seda de abeja son pequeños (aproximadamente 1 kbp) con mucha menos repeticiones en sus secuencias de ADN (Sutherland et al., 2006). El tamaño más pequeño y el nivel reducido de repetición significa que los genes de abeja no son propensos a las inestabilidades genéticas que incluyen terminación, traducción y truncamiento prematuro que resulta de la expresión transgénica de secuencias de nucleótido altamente repetitivas.

Se purificaron las proteínas de seda en cuerpos de inclusión a partir de las células de E. coli después de tratar repetidamente con Mezcla Maestra BugBuster (Novagen) , de acuerdo con el protocolo del fabricante para preparación de cuerdo soluble o de inclusión. Se analizaron las soluciones de proteina por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) con gradiente al 4-12% ( Invitrogen) . Se verificó la identificación de proteina de seda por espectrometría de masa en tándem como se describe previamente (Sutherland et al., 2006).

Las proteínas de seda en cuerpos de inclusión se solubilizaron en dodecil sulfato de sodio al 3% (SSDS) con 2 h de incubación a 60°C. Se midió la concentración de proteína en solución usando el kit de ensayo QuantiPro BCA (Sigma) . Donde se requiere, las soluciones de cada una de las cuatro proteínas de seda de abaja recombinantes se mezclaron en relaciones equimolares. Se removió el exceso de SDS de las soluciones de proteína por diálisis contra 5g/L de solución KC1 lo que causa la precipitación de KDS . Se removió el precipitado por centrifugación a 16000g por 5 min.

EJEMPLO 2 - Espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier (FTIR) Se usó espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier para comparar la estructura de la proteína de sedas de abeja nativa y recombinante . Se obtienen láminas de seda de abaje nativa de una colmena comercial, se lava extensivamente en cloroformo para remover la cera y se lava extensivamente en agua caliente para remover los contaminantes solubles en agua. Las soluciones de cada una de las cuatro proteínas de seda de abeja recombinante se mezclaron a relaciones equimolares, se funde y se seca en una película se obtienen los espectros infrarrojos de estas muestras en modo de transmisión usando el espectrómetro de transformada de Fourier Perkin-Elmer System 2000 ajustado con un accesorio de microscopio infrarrojo de formación de imagen serie i. Se colectaron los espectros usando el software Spectrum (versión 5.3.1) y representan el promedio de 256 barridos colectados a una resolución de 4cm_1. Se llevó a cabo la manipulación y análisis de datos después de la colección usando software Grams/AI v5.05. La desconvolución de la región amida I para cada espectro de seda se muestra en la Figura 2. Un resumen de los resultados y las asignaciones de estructura secundaria del componente se presenta en la Tabla 2.

Tabla 2. Resumen de ajuste de curva FT Los resultados FTIR sugieren que la seda de abeja nativa contiene aproximadamente 65% de estructura de hélice superenrollada, que es consistente con predicciones basadas en secuencia previa (Sutherland et al, 2006) . El espectro de seda recombinante es muy similar al espectro de seda nativo, y la seda recombinante se estima que contiene 59% estructura de hélice superenrollada.

EJEMPLO 3 — Empalmado en seco Se solubilizaron los cuerpos de inclusión en SDS al 3% para dar soluciones de fibroina de abeja solubles de generalmente entre 0.5 - 2% en peso proteína y hasta 3% en peso de proteína. Se removió el SDS en exceso de las soluciones de proteína de seda por precipitación KC1. La precipitación de potasio remueve hasta el 95%, tal como el 70-80%, de SDS (en peso del precipitado) pero <10% de proteína (al medir concentraciones de proteína en solución) . Las soluciones de seda se concentraron al extender la diálisis contra 20% en peso de polietilenglicol (PEG, MW 8000, Sigma) o solución de Slide-A-Lyzer concentrada (Pierce), hasta que se obtuvo una viscosidad tipo miel (alrededor 10-15% en peso proteína) . Se suspendió una gotita de materia prima de la seda concentrado entre la punta de un par de pinzas en aire y las pinzas se abrieron para formar un hilo fino (Figure 3A) . Estos hilos de estirado sencillo fueron estables al aire pero se disuelven en agua. Se sumergen entonces las fibras en un baño de 90% metanol y 10% agua, estirando una segunda vez hasta aproximadamente 2x de longitud, y seca al aire, Figura 3B) . Los hilos de doble estirado no fueron solubles en agua. Se examinaron las fibras de estirado sencillo y estirado doble por un microscopio de luz con lentes polarizados, y por un microscopio de electrones de barrido ambiental Zeiss EVO LS15.

Los hilos de seda recombinantes formados en imagen por ESEM (no mostrado) fueron circulares en sección transversal y bastante uniformes en diámetro a lo largo de su longitud. Las fibras de estirado sencillo tienen cuerpos pequeños adheridos a su superficie que pudieran ser cristales de sal, sin embargo las fibras de estirado doble tienen superficies suaves. El microscopio de luz polarizada muestra que las fibras de estirado sencillo no son birrefringentes , pero que las fibras de estirado doble son fuertemente birrefringentes ( Figura 3 ) .

Las fibras de estirado sencillo y de estirado doble y las películas de seda recombinantes se analizaron por barrido de rayos x de ángulo amplio en la línea de haz SAXS/WAXS del Australian Synchrotron. Una longitud de onda de 0.886 A y una longitud de cámara de 0.558 m proporcionan un intervalo q de aproximadamente 0.07 hasta 1.4 A"1, que se calibró usando un estándar de behenato de plata. Los patrones WAXS para la película y para fibras de estirado sencillo se dominaron por una señal fuerte de los cristales SDS, pero esto no fue detectable en las fibras de estirado doble. Los inventores actuales calculan por lo tanto que las hebras de estirado doble contienen <0.1% de los cristales SDS por unidades de longitud encontrados en los hilados de estirado sencillo. Los patrones de barrido de proteína de seda recombinante no se analizarían debido a ya sea que la difracción SDS fuerte limita la sensibilidad de la técnica, o a la relación señal a ruido en el caso de las fibras de estirado doble muy fina.

La resistencia y extensibilidad de hebras de seda de abeja recombinante fueron medidas en un Probador de Tensión Instron modelo 4501 a la relación de 2.5 mm/mm. Se condujeron pruebas en aire a 21 °C y 65% de humedad relativa. Antes de probar cada fibra se colocó a través de una ranura de 3mm en una estructura plástica y se fija con pegamento epóxico. La longitud calculada (Lo) y el diámetro de cada fibra se midieron en un microscopio óptico. La Tabla 3 copara las propiedades mecánicas de fibras de seda recombinantes a las proteínas de fibras nativas estiradas de la glándula de seda de abeja.

Tabla 3. Propiedades de tensión de fibras de seda de abeja recombinantes comparadas con fibras nativas.

Diámetro Tensión de presión de Tensión de (um) ruptura ruptura (%) ruptura real (MPa) (MPa) Fibras de estirado 30 + 5 15 ± 3 225 ± 10 50 ± 12 sencillo Fibras de estirado 13 + 7 150 ± 39 47 ± 26 213 ± 63 Fibras nativas 9 132 204 400 (Hepburn, 1979) EJEMPLO 4 - Hilado en húmedo Se prepararon las proteínas de seda generalmente como describe en el Ejemplo 1. Generalmente la concentración de proteina después de solubilización SDS fue de alrededor de 3% de proteina de seda. Si las soluciones de proteina tienen una concentración menor, se concentraron por diálisis extendida contra polietilenglicol al 20% en peso ( PEG, MW 8000, Sigma) o solución de concentración Slide-A-Lyzer (Pierce), hasta que las soluciones fueron de 3 - 6% de proteina de seda.

Las soluciones de proteina concentradas de ya sea mezclas equimolares de AmelFl-4 o AmelF3 solo se extruyeron a través de tubería capilar de 10cm ???µp? a una velocidad de 10m/min en solución de metanol (50-90% metanol) que causa que se forme un hilo fino y continuo. Los hilos se secaron en el aire y examinan por microscopio de luz con lentes polarizados. Los hilos muestran birrefringencia lo que indica que las proteínas dentro de los hilos se alinearon direccionalmente (Figura 4A) . Las fibras secadas al aire se sumergieron en un baño de 90% de metanol 10% de agua y se sacaron una segunda vez hasta aproximadamente 2x de longitud (Figura 4B) o 4x de longitud (Figura 4C) , y secaron al aire. La resistencia y capacidad de extensión de los hilos de seda de abeja se midieron en un probador de tensión Instron modelo 4501 a una velocidad de 2.5 mm/min. Se condujeron las pruebas en airea a 21 °C y 65% de humedad relativa. Antes de probar se colocó cada fibra a través de una ranura de 3 mm en una estructura plástica y se fija con pegamento epóxico. Se midieron la longitud calculada (Lo) y diámetro de cada fibra en un microscopio óptico.

Las Tablas 4 y 5 describen las propiedades mecánicas de fibras de seda recombinantes sin estirar. El estirado resulta en hilos que fueron más fuertes e insolubles en agua, y altamente birrefringentes .

Tabla 4. Propiedades de tensión de fibras de seda de abeja recombinantes después de extrusión del líquido de proteína de seda en metanol con y sin estirado.

Diámetro Tensión de presión de (um) ruptura ruptura (%) (MPa) Fibras no estiradas (mezcla 22-39 70-78 200-250 equimolar de 4 proteínas) Estirado de fibras X2 de longitud 17-22 50-92 80-160 (mezcla equimolar de 4 proteínas) Estirado de fibras x4 de longitud 19-21 150-161 38-91 (mezcla equimolar de 4 proteínas) Fibras no estiradas (AmelF3) 39-41 39-53 256-275 Estirado de fibras X2 de longitud 32-42 68-80 88-211 (AmelF3) Estirado de fibras X4 de longitud 28-30 99-117 131-154 (AmelF3) Tabla 5. Propiedades mecánicas de las fibras de seda de abeja Proteínas Diámetro Tensión de Presión de Dureza Método de constituyentes (um) ruptura ruptura (%) fabricación (MPa) Extruido en MeOH al AmelFl-4 31 ± 2 70 + 4 190 ± 11 91 ± 7 70% AmelF3 45 + 2 50 + 3 243 ± 10 105 + 6 Extruido en MeOH al AmelFl-4 21 + 1 133 ± 11 94 ± 11 85 ± 9 70% luego estirado AmelF3 34 + 2 97 + 7 129 ± 15 97 ± 10 «100% en MeOH al 90% Extruido en MeOH al AmelFl-4 17 + 1 203 ± 10 51 ± 5 70 ± 8 70% luego estirado AmelF3 23 + 1 178 ± 20 68 ± 9 85 ± 18 «300% en MeOH al 90% Natural3 Nativo 9 132 204 NG ¦"¦Calculado como (d0/di)2 donde do y di son los diámetros de las fibras inicial y estirada EJEMPLO 5 - Dicroismo circular (CP) Se expresó la proteina de seda de abeja AmelF3 en los cuerpos de inclusión de E. coli. Los cuerpos de inclusión AmelF3 fueron no plegados usando peso seco equivalente del detergente de dodecil sulfato de sodio (SDS) para generar soluciones de proteina monomérica al 2-4%. El barrido de luz dinámico (DLS) mide el diámetro hidrodinámico de las partículas en la solución de proteina-detergente diluida diez veces en NaCl lOOmM como 9.2 +/- 0.1 nm (pico que contiene 98.2% de volumen de partícula). El diámetro de los micelos en soluciones SDS al 3% sin proteína bajo las mismas condiciones experimentales fue un pico sencillo a 5.5 +/- 0.2 mm. No se detectaron micelos SDS en las soluciones SDS-proteína lo que confirma que la mayoría del SDS se unió a la proteína.

Se volvieron a plegar las proteínas al remover el SDS usando KC1. El dodecil sulfato de potasio tiene una solubilidad significativamente menor que SDS y se precipita de la solución donde puede removerse por centrifugación. Las soluciones de proteína se dializaron contra agua para reducir los niveles de sal, luego se concentra por diálisis contra PEG8000, lo que resulta en una concentración de 3-4% de proteína y 0.2-0.4% de SDS. Cuando se diluyeron las soluciones AmelF3 diez veces en NaCl 100 mM (comparable a los niveles de sal fisiológicos) , el diámetro de partícula se incrementa hasta 20.3 +/- 0.7 mm (pico que contienen 86.8% de volumen de partícula) , de acuerdo con el diámetro de partícula aproximado calculado para una hélice superenrollada .

Los espectros CD de solución AmelF3 de abeja (0.12%) mantenidos en célula de cuarzo intercalada de longitud de trayectoria 0.01 mm (Nova Biotech, El Cajón, CA) se colectaron usando un espectrofotómetro AVIV modelo 410 (AVIV Biomedical, Inc, Lakewood, NJ) con un controlador de temperatura. Se barrieron todas las muestras a 25°C con un ancho de banda de 1 nm desde 260 nm hasta 180 nm, y los resultados se promediaron de cuatro experimentos repetidos. Los espectros CD de soluciones AmelF3 muestra un espectro fuerte mínimo a 220 y 209 nm y una relación 220 nm/209 nm de 1.02 que soporta la estructura de hélice superenrollada . Una relación de 220 nm/209 nm de uno o más es indicativa de hélices superenrolladas mientras que una relación de menos de 0.86 es indicativa de hélices aisladas. Las mediciones DLS indican que después de la adición de SDS de nuevo a las soluciones AmelF3, se redujo el diámetro de partícula hidrodinámico al tamaño observado en las soluciones monoméricas originales, lo que confirma que la remoción de la mayoría del SDS es un requisito previo para que la proteína se pliegue en una conformación de proteína de seda tipo nativa. En contraste con la proteína AmeilF3, las versiones recombinantes etiquetadas con His de la proteína homologa de Apis cerana se mantienen monoméricas y predominantemente de hélice aleatoria a concentraciones comparables (Shi et al, 2008) . Este resultado muestra que AmelF3 solo, cuando se prepara en presencia de bajos niveles de SDS, se pliega para adoptar una estructura molecular de seda tipo nativa.

Se apreciará por las personas expertas en la técnica que pueden hacerse numerosas variaciones y/o modificaciones a la invención como se muestra en las modalidades específicas sin salirse del espíritu o alcance de la invención como se describe ampliamente. Las modalidades actuales, por lo tanto, se consideran en todos los aspectos como ilustrativas y no restrictivas .

La solicitud actual reivindica prioridad de la US 61/237,156 presentada el 26 de agosto de 2009, y la US 61/315,812 presentada el 19 de marzo de 2010, los contenidos completos de ambas de las cuales se incorporan en la presente para referencia.

Todas las publicaciones discutidas y/o referenciadas en la presente se incorporan en la presente en su totalidad.

Cualquier discusión de documentos, actas, materiales, dispositivos, artículos o similares que se han incluido en la presente especificación es únicamente para el propósito de proporcionar un contexto para la invención actual. No debe tomarse como una admisión de que cualquiera o todas estas materias forman parte de la base de la técnica anterior o fueron del conocimiento general común en el campo relevante a la invención actual como si existiera antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.

REFERENCIAS Atkins (1967) J. Mol. Biol. 24 139-41.

Delorenzi and Speed (2002) Bioinformatics 18:617-625.

Harayama (1998) Trends Biotech. 16: 76-82.

Hepburn et al (1979) Insect Biochem. 9: 69-77.

Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453.

Sezutzu et al (2007) Biosci. Biotechnol . Biochem. 71: 2725-34.

Shi et al. (2008) Biomaterials 29: 2820-8.

Sutherland et al. (2006) Genome Res 16: 1414-21.

Sutherland et al. (2007) Mol Biol Evol 24: 2424-32.

Claims (38)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para producir materia prima de la seda, el método caracterizado porque comprende i) lisar células que producen una o más proteínas de seda, ii) solubilizar las proteínas de seda al ponerlas en contacto con un tensoactivo o un líquido iónico, y iii) concentrar las proteínas de seda para producir materia prima de la seda, en donde una o más proteínas de seda son capaces de formar una estructura terciaria que comprende una estructura de hélice superenrollada .

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las proteínas de seda se concentran al a) reducir la cantidad de tensoactivo en solución al agregar un compuesto que precipita el tensoactivo, y b) separar la solución que comprende las proteínas de seda del precipitado formado en la etapa a) para producir la materia prima de la seda.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto que precipita el tensoactivo es una sal o un carbohidrato; o una combinación de dos o más de los mismos.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la sal es una sal de potasio o una sal de sodio.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las proteínas de seda se concentran por filtración .

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque las proteínas de seda se concentran por filtración de membrana.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la filtración de membrana es filtración de flujo tangencial.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7, caracterizado porque comprende además incrementar la concentración de proteínas de seda en la materia prima de la seda.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8 caracterizado porque comprende dializar la materia prima de la seda contra una solución deshidratada.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la solución deshidratada comprende un polímero higroscópico.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polímero higroscópico se selecciona del grupo que consiste de polietilenglicol, amilasa, y sericina, o una combinación de dos o más de los mismos.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 11, caracterizado porque la materia prima de la seda comprende al menos alrededor de 0.5% p/v de proteínas de seda.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la materia prima de la seda comprende alrededor de 0.5% hasta alrededor de 15% p/v de proteínas de seda.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, caracterizado porque las células son células bacterianas, células de levadura, células de insecto, células de planta o células de animal, o una combinación de dos o más de los mismos.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque las células son células bacterianas.

16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 15, caracterizado porque la etapa i) comprende además aislar cuerpos de inclusión de las células Usadas .

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 16, caracterizado porque comprende además cultivar las células antes de la etapa i) .

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque la porción de la proteina de seda que es capaz de formar una estructura terciaria que comprende una estructura de hélice superenrollada que comprende al menos 10 copias de la secuencia de repetición con 7 aminoácidos abcdefg, y en donde al menos 25% de los aminoácidos en posiciones a y d son residuos de alanina.

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 18, caracterizado porque las proteínas de seda comprenden una secuencia seleccionada de: a) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 17, 19, 21, 23, 33, 35, 37, 39, 49, 51, 53, 55, 65, 67, 69, 71, 81, 83, 85, 87 o 97, b) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 17, 19, 21, 23, 33, 35, 37, 39, 49, 51, 53, 55, 65, 67, 69, 71, 81, 83, 85, 87 o 97, y c) un fragmento biológicamente activo de a) o b) .

20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 19, caracterizado porque las proteínas de seda comprenden una primera proteína de seda que comprende a) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 1, 17, 33, 49, 65 o 81; b) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 1, 17, 33, 49, 65 o 81; y c) un fragmento biológicamente activo de a) o b) , una segunda proteína de seda que comprende d) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 3, 19, 35, 51, 67 o 83; e) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 3, 19, 35, 51, 67 o 83; y f ) un fragmento biológicamente activo de d) o e) , una tercera proteína de seda que comprende g) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 5, 21, 37, 53, 69 o 85; h) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 5, 21, 37, 53, 69 o 85; y i) un fragmento biológicamente activo de g) o h), y/o una cuarta proteina de seda que comprende j ) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en cualquiera de una de SEQ ID NOs 7, 23, 39, 55, 71 o 87; k) una secuencia de aminoácidos que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs 7, 23, 39, 55, 71 o 87; y 1) un fragmento biológicamente activo de j ) o k) .

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la primera proteina de seda, segunda proteina de seda, tercera proteina de seda y/o cuarta proteina de seda son producidas por las mismas células.

22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la primera proteina de seda, segunda proteina de seda, tercera proteina de seda y/o cuarta proteina de seda son producidas por células diferentes.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 hasta 22, caracterizado porque la etapa ii) comprende cantidades equimolares aproximadas de la primera proteina de seda, la segunda proteina de seda, la tercera proteina de seda y la cuarta proteina de seda.

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 23, caracterizado porque el tensoactivo es un tensoactivo aniónico.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el tensoactivo aniónico es dodecil sulfato de sodio (SDS), lauril sulfato de amonio u otras sales de sulfato de alquilo, monohidrato de 1-octansulfonato de sodio, lauroil sarcosinato de sodio, sulfato de éter lauril de sodio (SLES) , hidrato taurodesoxicolato de sodio, sulfonato de alquil benceno; o una combinación de dos o más de los mismos.

. 26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 23, caracterizado porque el liquido iónico comprende i) un anión seleccionado de cloruro, bromuro, yoduro, tiocianato, acetato, alquilsulfonatos C1-C4, metansulfonatos, tosilato, dialquilfosfatos C1-C4, hidrogensulfato y tetracloroaluminato, y ii) un catión seleccionado de 1, 3-dialquilimidazolio-Ci-C4, 3-cloropiridinio, 4-dimetilaminopiridinio, 2-etil-4-aminopiridinio, 2-metilpiridinio, 2-etilpiridinio, 2-etil-6-metilpiridinio, quinolinio, isoquinolinio, piridinio, 1-alquilimidazolio-Ci-C4, 1-metilimidazolio, 1,2-dimetilimidazolio, 1-n-butil-imidazolio, 1,4,5-trimetilimidazolio, 1, -dimetilimidazolio, imidazolio, 2-metilimidazolio, l-butil-2-metilimidazolio, 4 metilimidazolio, 1- (2 ' -aminoetil ) imidazolio, 1-vinilimidazolio, 2-etilimidazolio y benzotriazolio .

27. Un método para producir materia prima de la seda, el método caracterizado porque comprende i) obtener sobrenadante de cultivos celulares, o de un sistema de expresión libre de célula, que producen una o más proteínas de seda, ii) solubilizar las proteínas de seda al ponerlas en contacto con un tensoactivo o un líquido iónico, y iii) concentrar las proteínas de seda para producir la materia prima de la seda, en donde una o más proteínas de seda son capaces de formar una estructura terciaria que comprende una estructura de hélice superenrollada .

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la etapa i) comprende además incrementar la concentración de proteínas de seda del sobrenadante.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la concentración de proteínas de seda se incrementa al poner en contacto el sobrenadante con un agente que precipita las proteínas de la seda.

30. Un método para producir una fibra de seda, el método caracterizado porque comprende extruir y/o sacar materia prima de la seda producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 29.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la extrusión comprende pasar la materia prima de la seda a través de un tubo capilar de alrededor de 5ym hasta alrededor de 500ym.

32. El método de conformidad con la reivindicación 30 o reivindicación 31, caracterizado porque la materia prima de la seda se extruye en una solución que comprende alcohol.

33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el alcohol es metanol y la concentración del metanol en la solución es alrededor de 40% hasta alrededor de 80% v/v.

34. Un método para producir una película de seda, el método caracterizado porque comprende fundir la materia prima de la seda producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 29.

35. Materia prima de la seda, caracterizada porque es producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 29.

36. Una fibra de seda, caracterizada porque es producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 hasta 33.

37. Una película de seda, caracterizada porque es producida por el método de conformidad con la reivindicación 34.

38. Un producto, caracterizado porque comprende una fibra de seda de conformidad con la reivindicación 36 y/o una película de seda de conformidad con la reivindicación 37.