JP2013502438A - 絹ドープを製造するプロセス - Google Patents
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Abstract
Description
i)1種または複数種の絹タンパク質を産生する細胞を溶解するステップ、
ii)絹タンパク質を、それらと、界面活性剤またはイオン液体とを接触させることによって可溶化するステップ、および
iii)絹ドープを製造するために、絹タンパク質を濃縮するステップ、
を含み、1種または複数種の絹タンパク質が、コイルドコイル構造を含む三次構造を形成できる方法を提供する。
a)界面活性剤を沈殿させる化合物を加えることによって、溶液中の界面活性剤の量を減少させるステップ、および
b)ステップa)において形成された沈殿から絹タンパク質を含む溶液を分離して、絹ドープを製造するステップ、
によって絹タンパク質を濃縮する。
a)配列番号1から8、17から24、33から40、49から56、65から72、81から88、97または98の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
b)配列番号1から8、17から24、33から40、49から56、65から72、81から88、97または98の任意の1つまたは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
c)a)またはb)の生物学的に活性な断片、
から選択される配列を含む、より好ましくは本質的に該配列からなる、さらにより好ましくは該配列からなる。
a)配列番号1、3、5、7、17、19、21、23、33、35、37、39、49、51、53、55、65、67、69、71、81、83、85、87もしくは97の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
b)配列番号1、3、5、7、17、19、21、23、33、35、37、39、49、51、53、55、65、67、69、71、81、83、85、87もしくは97の任意の1つもしくは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
c)a)もしくはb)の生物学的に活性な断片、
から選択される配列を含む、より好ましくは本質的に該配列からなる、さらにより好ましくは該配列からなる絹タンパク質を含む。
a)配列番号1、2、17、18、33、34、49、50、65、66、81もしくは82の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
b)配列番号1、2、17、18、33、34、49、50、65、66、81もしくは82の任意の1つもしくは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
c)a)もしくはb)の生物学的に活性な断片、
を含む、より好ましくは本質的にそれらからなる、さらにより好ましくはそれらからなる第1の絹タンパク質、
d)配列番号3、4、19、20、35、36、51、52、67、68、83もしくは84の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
e)配列番号3、4、19、20、35、36、51、52、67、68、83もしくは84の任意の1つもしくは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
f)c)もしくはd)の生物学的に活性な断片、
を含む、より好ましくは本質的にそれらからなる、さらにより好ましくはそれらからなる第2の絹タンパク質、
g)配列番号5、6、21、22、37、38、53、54、69、70、85もしくは86の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
h)配列番号5、6、21、22、37、38、53、54、69、70、85もしくは86の任意の1つもしくは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
i)g)もしくはh)の生物学的に活性な断片、
を含む、より好ましくは本質的にそれらからなる、さらにより好ましくはそれらからなる第3の絹タンパク質、
j)配列番号7、8、23、24、39、40、55、56、71、72、87もしくは88の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
k)配列番号7、8、23、24、39、40、55、56、71、72、87もしくは88の任意の1つもしくは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
l)j)もしくはk)の生物学的に活性な断片、
を含む、より好ましくは本質的にそれらからなる、さらにより好ましくはそれらからなる第4の絹タンパク質、を含む。より好ましくは、上記の態様に関して、絹タンパク質は、
a)配列番号1、17、33、49、65、もしくは81の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
b)配列番号1、17、33、49、65、もしくは81の任意の1つもしくは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
c)a)もしくはb)の生物学的に活性な断片、
を含む、より好ましくは本質的にそれらからなる、さらにより好ましくはそれらからなる第1の絹タンパク質、
d)配列番号3、19、35、51、67もしくは83の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
e)配列番号3、19、35、51、67もしくは83の任意の1つもしくは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
f)d)もしくはe)の生物学的に活性な断片、
を含む、より好ましくは本質的にそれらからなる、さらにより好ましくはそれらからなる第2の絹タンパク質、
g)配列番号5、21、37、53、69、もしくは85の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
h)配列番号5、21、37、53、69、もしくは85の任意の1つもしくは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
i)g)もしくはh)の生物学的に活性な断片、
を含む、より好ましくは本質的にそれらからなる、さらにより好ましくはそれらからなる第3の絹タンパク質、ならびに/あるいは
j)配列番号7、23、39、55、71もしくは87の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
k)配列番号7、23、39、55、71もしくは87の任意の1つもしくは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
l)j)もしくはk)の生物学的に活性な断片、
を含む、より好ましくは本質的にそれらからなる、さらにより好ましくはそれらからなる第4の絹タンパク質を含む、または本質的にそれからなる。
i)塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアネート、アセテート、C1〜C4-アルキル硫酸、メタンスルホン酸、トシレート、C1〜C4-リン酸ジアルキル、硫酸水素およびテトラクロロアルミン酸から選択されるアニオン、ならびに、
ii)1,3-C1〜C4-ジアルキルイミダゾリウム、3-クロロピリジニウム、4-ジメチルアミノピリジニウム、2-エチル-4-アミノピリジニウム、2-メチルピリジニウム、2-エチルピリジニウム、2-エチル-6-メチルピリジニウム、キノリニウム、イソキノリニウム、ピリジニウム、1-C1〜C4-アルキルイミダゾリウム、1-メチルイミダゾリウム、1,2-ジメチルイミダゾリウム、1-n-ブチル-イミダゾリウム、1,4,5-トリメチルイミダゾリウム、1,4-ジメチルイミダゾリウム、イミダゾリウム、2-メチルイミダゾリウム、1-ブチル-2-メチルイミダゾリウム、4メチルイミダゾリウム、1-(2'-アミノエチル)イミダゾリウム、1-ビニルイミダゾリウム、2-エチルイミダゾリウムおよびベンゾトリアゾリウム
から選択されるカチオンを含む。
i)細胞培養物から、または無細胞発現系から上清を得、1種または複数種の絹タンパク質を製造するステップ、
ii)絹タンパク質を、それらと、界面活性剤またはイオン液体とを接触させることによって可溶化するステップ、および
iii)絹タンパク質を濃縮して、絹ドープを製造するステップ、
を含み、1種または複数種の絹タンパク質が、コイルドコイル構造を含む三次構造を形成できる方法を提供する。
a)配列番号2、4、6、8、18、20、22、24、34、36、38、40、50、52、54、56、66、68、70、72、82、84、86、88または98の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
b)配列番号2、4、6、8、18、20、22、24、34、36、38、40、50、52、54、56、66、68、70、72、82、84、86、88または98の任意の1つまたは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
c)a)またはb)の生物学的に活性な断片、
から選択される配列を含む、より好ましくは本質的に該配列からなる、さらにより好ましくは該配列からなる絹タンパク質を含む。
a)配列番号2、18、34、50、66、または82の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
b)配列番号2、18、34、50、66、または82の任意の1つまたは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
c)a)またはb)の生物学的に活性な断片、
を含む、より好ましくは本質的にそれらからなる、さらにより好ましくはそれらからなる第1の絹タンパク質、
d)配列番号4、20、36、52、68または84の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
e)配列番号4、20、36、52、68または84の任意の1つまたは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
f)c)またはd)の生物学的に活性な断片、
を含む、より好ましくは本質的にそれらからなる、さらにより好ましくはそれらからなる第2の絹タンパク質、
g)配列番号6、22、38、54、70、または86の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
h)配列番号6、22、38、54、70、または86の任意の1つまたは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
i)g)またはh)の生物学的に活性な断片、
を含む、より好ましくは本質的にそれらからなる、さらにより好ましくはそれらからなる第3の絹タンパク質、ならびに/または
j)配列番号8、24、40、56、72または88の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
k)配列番号8、24、40、56、72または88の任意の1つまたは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
l)j)またはk)の生物学的に活性な断片、
を含む、より好ましくは本質的にそれらからなる、さらにより好ましくはそれらからなる第4の絹タンパク質を含む。
i)1種または複数種の絹タンパク質を産生する細胞を溶解し、細胞から封入体を単離するステップ、
ii)封入体の中の絹タンパク質を、それらと、界面活性剤またはイオン液体とを接触させることによって可溶化するステップ、
iii)絹ドープを製造するために、絹タンパク質を濃縮するステップ、
iv)絹ドープ中の絹タンパク質の濃度を、約2%から約10%の絹タンパク質wt(%)、より好ましくは約3%から約6%の絹タンパク質wt(%)に上昇させるステップ、および
v)脱水溶液中に絹ドープを押し出すステップ、
を含む。
配列番号1-本明細書においてXenospira1と呼ばれるミツバチの絹タンパク質(本明細書においてAmelF1とも呼ばれる)(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号2-本明細書においてXenospira1と呼ばれるミツバチの絹タンパク質。
配列番号3-本明細書においてXenospira2と呼ばれるミツバチの絹タンパク質(本明細書においてAmelF2とも呼ばれる)(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号4-本明細書においてXenospira2と呼ばれるミツバチの絹タンパク質。
配列番号5-本明細書においてXenospira3と呼ばれるミツバチの絹タンパク質(本明細書においてAmelF3とも呼ばれる)(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号6-本明細書においてXenospiral3と呼ばれるミツバチの絹タンパク質。
配列番号7-本明細書においてXenospiral4と呼ばれるミツバチの絹タンパク質(本明細書においてAmelF4とも呼ばれる)(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号8-本明細書においてXenospiral4と呼ばれるミツバチの絹タンパク質。
配列番号9-ミツバチの絹タンパク質のXenospira1をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号10-ミツバチの絹タンパク質のXenospira1をコードするヌクレオチド配列。
配列番号11-ミツバチの絹タンパク質のXenospira2をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号12-ミツバチの絹タンパク質のXenospira2をコードするヌクレオチド配列。
配列番号13-ミツバチの絹タンパク質のXenospira3をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号14-ミツバチの絹タンパク質のXenospira3をコードするヌクレオチド配列。
配列番号15-ミツバチの絹タンパク質のXenospira4をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号16-ミツバチの絹タンパク質のXenospira4をコードするヌクレオチド配列。
配列番号17-本明細書においてBBF1と呼ばれるマルハナバチの絹タンパク質(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号18-本明細書においてBBF1と呼ばれるマルハナバチの絹タンパク質。
配列番号19-本明細書においてBBF2と呼ばれるマルハナバチの絹タンパク質(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号20-本明細書においてBBF2と呼ばれるマルハナバチの絹タンパク質。
配列番号21-本明細書においてBBF3と呼ばれるマルハナバチの絹タンパク質(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号22-本明細書においてBBF3と呼ばれるマルハナバチの絹タンパク質。
配列番号23-本明細書においてBBF4と呼ばれるマルハナバチの絹タンパク質(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号24-本明細書においてBBF4と呼ばれるマルハナバチの絹タンパク質。
配列番号25-マルハナバチの絹タンパク質BBF1をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号26-マルハナバチの絹タンパク質BBF1をコードするヌクレオチド配列。
配列番号27-マルハナバチの絹タンパク質BBF2をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号28-マルハナバチの絹タンパク質BBF2をコードするヌクレオチド配列。
配列番号29-マルハナバチの絹タンパク質BBF3をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号30-マルハナバチの絹タンパク質BBF3をコードするヌクレオチド配列。
配列番号31-マルハナバチの絹タンパク質BBF4をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号32-マルハナバチの絹タンパク質BBF4をコードするヌクレオチド配列。
配列番号33-本明細書においてBAF1と呼ばれるブルドックアリの絹タンパク質(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号34-本明細書においてBAF1と呼ばれるブルドックアリの絹タンパク質。
配列番号35-本明細書においてBAF2と呼ばれるブルドックアリの絹タンパク質(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号36-本明細書においてBAF2と呼ばれるブルドックアリの絹タンパク質。
配列番号37-本明細書においてBAF3と呼ばれるブルドックアリの絹タンパク質(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号38-本明細書においてBAF3と呼ばれるブルドックアリの絹タンパク質。
配列番号39-本明細書においてBAF4と呼ばれるブルドックアリの絹タンパク質(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号40-本明細書においてBAF4と呼ばれるブルドックアリの絹タンパク質。
配列番号41-ブルドックアリの絹タンパク質BAF1をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号42-ブルドックアリの絹タンパク質BAF1をコードするヌクレオチド配列。
配列番号43-ブルドックアリの絹タンパク質BAF2をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号44-ブルドックアリの絹タンパク質BAF2をコードするヌクレオチド配列。
配列番号45-ブルドックアリの絹タンパク質BAF3をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号46-ブルドックアリの絹タンパク質BAF3をコードするヌクレオチド配列。
配列番号47-ブルドックアリの絹タンパク質BAF4をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号48-ブルドックアリの絹タンパク質BAF4をコードするヌクレオチド配列。
配列番号49-本明細書においてGAF1と呼ばれるツムギアリの絹タンパク質(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号50-本明細書においてGAF1と呼ばれるツムギアリの絹タンパク質。
配列番号51-本明細書においてGAF2と呼ばれるツムギアリの絹タンパク質(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号52-本明細書においてGAF2と呼ばれるツムギアリの絹タンパク質。
配列番号53-本明細書においてGAF3と呼ばれるツムギアリの絹タンパク質(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号54-本明細書においてGAF3と呼ばれるツムギアリの絹タンパク質。
配列番号55-本明細書においてGAF4と呼ばれるツムギアリの絹タンパク質(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号56-本明細書においてGAF4と呼ばれるツムギアリの絹タンパク質。
配列番号57-ツムギアリの絹タンパク質GAF1をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号58-ツムギアリの絹タンパク質GAF1をコードするヌクレオチド配列。
配列番号59-ツムギアリの絹タンパク質GAF2をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号60-ツムギアリの絹タンパク質GAF2をコードするヌクレオチド配列。
配列番号61-ツムギアリの絹タンパク質GAF3をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号62-ツムギアリの絹タンパク質GAF3をコードするヌクレオチド配列。
配列番号63-ツムギアリの絹タンパク質GAF4をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号64-ツムギアリの絹タンパク質GAF4をコードするヌクレオチド配列。
配列番号65-本明細書においてVssilk3と呼ばれるスズメバチの絹タンパク質(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号66-本明細書においてVssilk3と呼ばれるスズメバチの絹タンパク質。
配列番号67-本明細書においてVssilk4と呼ばれるスズメバチの絹タンパク質(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号68-本明細書においてVssilk4と呼ばれるスズメバチの絹タンパク質。
配列番号69-本明細書においてVssilk2と呼ばれるスズメバチの絹タンパク質(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号70-本明細書においてVssilk2と呼ばれるスズメバチの絹タンパク質。
配列番号71-本明細書においてVssilk1と呼ばれるスズメバチの絹タンパク質(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号72-本明細書においてVssilk1と呼ばれるスズメバチの絹タンパク質。
配列番号73-スズメバチの絹タンパク質Vssilk3をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号74-スズメバチの絹タンパク質Vssilk3をコードするヌクレオチド配列。
配列番号75-スズメバチの絹タンパク質Vssilk4をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号76-スズメバチの絹タンパク質Vssilk4をコードするヌクレオチド配列。
配列番号77-スズメバチの絹タンパク質Vssilk2をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号78-スズメバチの絹タンパク質Vssilk2をコードするヌクレオチド配列。
配列番号79-スズメバチの絹タンパク質Vssilk1をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号80-スズメバチの絹タンパク質Vssilk1をコードするヌクレオチド配列。
配列番号81-絹タンパク質1と呼ばれるニホンミツバチの絹タンパク質(ABS1とも呼ばれる)(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号82-絹タンパク質1と呼ばれるニホンミツバチの絹タンパク質(ABS1とも呼ばれる)。
配列番号83-絹タンパク質2と呼ばれるニホンミツバチの絹タンパク質(ABS2とも呼ばれる)(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号84-絹タンパク質2と呼ばれるニホンミツバチの絹タンパク質(ABS2とも呼ばれる)。
配列番号85-絹タンパク質3と呼ばれるニホンミツバチの絹タンパク質(ABS3とも呼ばれる)(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号86-絹タンパク質3と呼ばれるニホンミツバチの絹タンパク質(ABS3とも呼ばれる)。
配列番号87-絹タンパク質4と呼ばれるニホンミツバチの絹タンパク質(ABS4とも呼ばれる)(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号88-絹タンパク質4と呼ばれるニホンミツバチの絹タンパク質(ABS4とも呼ばれる)。
配列番号89-ニホンミツバチの絹タンパク質ABS1をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号90-ニホンミツバチの絹タンパク質ABS1をコードするヌクレオチド配列。
配列番号91-ニホンミツバチの絹タンパク質ABS2をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号92-ニホンミツバチの絹タンパク質ABS2をコードするヌクレオチド配列。
配列番号93-ニホンミツバチの絹タンパク質ABS3をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号94-ニホンミツバチの絹タンパク質ABS3をコードするヌクレオチド配列。
配列番号95-ニホンミツバチの絹タンパク質ABS4をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号96-ニホンミツバチの絹タンパク質ABS4をコードするヌクレオチド配列。
配列番号97-本明細書においてMalF1と呼ばれるクサカゲロウの絹タンパク質(マイナスのシグナルペプチド)。
配列番号98-本明細書においてMalF1と呼ばれるクサカゲロウの絹タンパク質。
配列番号99-クサカゲロウの絹タンパク質MalF1をコードするヌクレオチド配列(シグナルペプチドをコードするマイナス領域)。
配列番号100-クサカゲロウの絹タンパク質MalF1をコードするヌクレオチド配列。
配列番号101から108-オリゴヌクレオチドプライマー。
特に明記しない限り、本明細書において使用するすべての技術用語および科学用語は、当業者(細胞培養、分子遺伝学、絹加工、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学および生化学)により通常理解されるものと同じ意味を有すると解釈されるべきである。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、一般的に交換可能に使用され、非アミノ酸基の付加によって修飾されても、またはされなくてもよい、一本鎖ポリペプチド鎖を指す。本明細書において使用する場合、「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、本明細書に記載の絹タンパク質の変異体、突然変異体、修飾体、アナログおよび/または誘導体もまた含む。好ましい実施形態において、本発明において使用する絹タンパク質は、天然のアミノ酸だけから成っている。
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において「核酸」と交換可能に使用される。
a)配列番号9から16、25から32、41から48、57から64、73から80、89から96、99または100の任意の1つで提供されるヌクレオチド配列、
b)配列番号9から16、25から32、41から48、57から64、73から80、89から96、99または100の任意の1つまたは複数と、少なくとも30%同一であるヌクレオチド、ならびに
c)a)またはb)の一部をコードする生物学的に活性な断片、
から選択される配列を含む、より好ましくは本質的に該配列からなる、さらにより好ましくは該配列からなる。
a)配列番号9、11、13、15、25、27、29、31、41、43、45、47、57、59、61、63、73、75、77、79、89、91、93、95または97の任意の1つで提供されるヌクレオチド配列、
b)配列番号9、11、13、15、25、27、29、31、41、43、45、47、57、59、61、63、73、75、77、79、89、91、93、95または97の任意の1つまたは複数と、少なくとも30%同一であるヌクレオチド配列、ならびに
c)a)またはb)の生物学的に活性な断片、
から選択される配列を含む、より好ましくは本質的に該配列からなる、さらにより好ましくは該配列からなるポリヌクレオチドを含む。
本発明の方法における使用のための細胞は、通常、絹タンパク質をコードする核酸構築体を含むと思われる。構築体は、細胞のゲノムに統合されても、または組み換えベクターなどの染色体外であってもよい。このようなベクターは、非相同ポリヌクレオチド配列、すなわち、絹タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子に隣接して天然には見出されることがなく、ポリクレオチド分子が由来する種以外の種に由来することが好ましいポリヌクレオチドを含有する。ベクターは、RNAまたはDNAのどちらであってもよく、原核性または真核性であってもよく、通常、(米国特許第5,792,294号に記載されるような)トランスポゾン、ウイルスまたはプラスミドである。
本発明の方法の大部分は、本明細書において定義された1種または複数種の、絹タンパク質を産生する細胞の使用による。ポリヌクレオチド分子の細胞への形質転換は、ポリヌクレオチド分子を細胞内へ挿入できる任意の方法によって達成できる。形質転換技術は、限定するものではないが、形質移入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着およびプロトプラスト融合を含む。組み換え細胞は、単細胞を維持できる、または組織、器官もしくは多細胞生物へ成長できる。形質転換されたポリヌクレオチド分子は、染色体外を維持できる、または発現されるべきそれらの能力が維持されるような様式で、形質転換された(すなわち組み換え)細胞の染色体内の1つまたは複数の部位に統合できる。
本発明は、その後広範囲な用途に使用できる絹ドープを製造する方法に関する。
一実施形態において、本明細書において定義された絹ドープを製造するステップは、界面活性剤の使用を伴う。本発明者らは、SDSなどの界面活性剤が、界面活性剤の濃度が低い場合、本明細書において定義された絹タンパク質を、コイルドコイル構造を形成させながら、溶液中に留まらせることができるという発見に驚かされた。
一般的に、イオン液体は、完全にイオンから成っており、約100℃未満、好ましくは約85℃未満の温度において液体である化合物として定義できる。本発明において使用する場合、イオン液体は一般的に、1種または複数種のアニオンおよび1種または複数種のカチオンを含む。好ましい実施形態において、イオン液体は、置換基、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルケノキシ、アルキノキシ、さまざまな芳香族化合物、例えば、(置換または非置換の)フェニル、(置換または非置換の)ベンジル、(置換または非置換の)フェノキシおよび(置換または非置換の)ベンゾキシ、ならびに置換または非置換された、それらの環状部分に1個、2個または3個のヘテロ原子を有するさまざまな複素環芳香族化合物を含むように、1種または複数種の化合物を誘導体化することによって作製された有機カチオンを含む。誘導体化された化合物は、限定するものではないが、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、イソチアゾール、アザチアゾール、オキソチアゾール、オキサジン、オキサゾリン、オキサザボロール、ジチアゾール、トリアゾール、デレノゾール(delenozoles)、オキサホスホール、ピロール、ボロール、フラン、チオフェン、ホスホロール、ペンタゾール、インドール、インドリン、オキサゾール、イソオキサゾール、イソテトラゾール、テトラゾール、ベンゾフラン、ジベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェン、チアジアゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピラジン、ピリダジン、ピペラジン、ピペリジン、モルホリン、ピラン、アノリン(annolines)、フタラジン、キナゾリン、グアニジン、キノキサリン(quinxalines)、コリン系アナログおよびそれらの組合せを含む。塩基性カチオン構造は、1つずつまたは多数が置換されていても、または非置換であってもよい。
可溶化絹タンパク質は濃縮され、電荷、親水性、親和性、溶解度もしくは安定性またはサイズに基づき、界面活性剤、イオン液体および他の細胞成分などの不純物から分離され得る。分離技術の限定されない例は、硫酸アンモニウム沈殿、クロマトグラフィーおよび膜ろ過(タンジェンシャル・フロー膜ろ過を含む)を含む。分離のためにクロマトグラフィーを利用する実施形態において、例示的方法は、イオン交換(カチオン性またはアニオン性)、アフィニティークロマトグラフィー、親水性相互作用、疎水性相互作用、サイズ排除およびゲル透過を含む(米国特許第6,248,570号を参照されたい)。
本発明の方法を使用して製造された絹ドープは、多種多様な医学的、軍事的、工業的および商業的な用途に使用できる。絹ドープは、例えば、順に医療用具、例えば、縫合糸、皮膚移植片、細胞成長マトリックス、代替靭帯および外科用メッシュ、ならびに広範囲の工業製品および商業製品、例えば、ケーブル、ロープ、網、釣り糸、生地、防弾チョッキの裏張り、コンテナ用織物、バックパック、ナップザック、かばんもしくはハンドバックのストラップ、接着性結合材料、非接着性結合材料、ストラップ材料、テント用生地、ターポリン、プールカバー、乗り物カバー、フェンシング材料、シーラント、建築材料、耐候性材料、柔軟性仕切り材料、スポーツ用品などの製造、ならびに実際に、伸張強度および弾力性の高さが所望の特性である繊維または織物のほぼすべての使用において使用できる絹繊維を製造するために使用できる。絹ドープは、パーソナルケア製品、例えば、化粧品、スキンケア、ヘアケアおよびヘアカラーのための組成物の製造、ならびに粒子のコーティング、例えば顔料における使用のための用途もさらに有する。
化粧品およびスキンケア組成物は、化粧品として許容可能な媒質中に有効量の絹を含む無水組成物であってよい。これらの組成物の使用は、限定するものではないが、スキンケア、スキンクレンジング、メイクアップおよびしわ取りの製品を含む。化粧品およびスキンケア組成物のための絹の有効量は、組成物の合計重量に対して約10-4から約30重量%、好ましくは約10-3から15重量%の割合として、本明細書において定義される。この割合は、化粧品またはスキンケア組成物の型の機能として変動し得る。化粧品として許容可能な媒質として適切な組成物は、米国特許第6,280,747号に記載されている。例えば、化粧品として許容可能な媒質は、一般的に組成物の合計重量に対して約10重量%から約90重量%の割合で脂肪物質を含有でき、この場合、脂肪相が少なくとも1種の液体、固体または半固体の脂肪物質を含有する。脂肪物質は、限定するものではないが、油、ワックス、ゴムおよびいわゆるペースト状脂肪物質を含む。あるいは、組成物は、油中水エマルジョンまたは水中油エマルジョンなどの安定な分散系の形態であってもよい。さらに、組成物は、限定するものではないが、酸化防止剤、保存剤、充填剤、界面活性剤、UVAおよび/またはUVB日焼け止め剤、香料、増粘剤、湿潤剤およびアニオン性、非イオン性または両性のポリマーならびに染料または顔料を含む、1種または複数種の従来の化粧品または皮膚科の添加物またはアジュバントを含有してもよい。
顔料および化粧品粒子のコーティングにおける使用のための絹の有効量は、粒子の乾燥重量に対して約10-4から約50重量%、好ましくは約0.25から約15重量%の割合として、本明細書において定義される。使用される絹の最適量は、コーティングされる顔料または化粧品粒子の型に依存する。例えば、無機着色顔料に使用される絹の量は、好ましくは約0.01%重量および20%重量の間である。有機顔料の場合、絹の好ましい量は、約1重量%から約15重量%の間であり、一方、不活性粒子に関しては、好ましい量は、約0.25重量%から約3重量%の間である。コーティングされた顔料および粒子の調製方法は、米国特許第5,643,672号に記載されている。これらの方法は、回転ドラムにかけながら、または混合しながら、絹の水溶液を粒子に加えるステップ、絹と粒子とのスラリーを形成し、乾燥させるステップ、絹の溶液を粒子状にスプレー乾燥させるステップ、または絹と粒子とのスラリーを凍結乾燥するステップを含む。これらのコーティングされた顔料および化粧品粒子は、化粧品処方、塗料、インクなどに使用することができる。
絹は、創傷治癒を促進するための包帯上のコーティングとして使用できる。この用途のために、包帯材料は、有効量の絹でコーティングされる。創傷治癒用包帯の目的に関して、有効量の絹は、包帯材料の重量に対して約10-4から約30重量%の割合として、本明細書において定義される。コーティングされる材料は、任意の、柔らかく、生物学的に不活性な、多孔質の布または繊維であってよい。例としては、限定するものではないが、綿、絹、レーヨン、アセテート、アクリル、ポリエチレン、ポリエステルおよびそれらの組合せが挙げられる。布または繊維のコーティングは、当分野において公知の多くの方法によって達成され得る。例えば、コーティングされる材料を、絹をコーティングする水溶液に浸漬してもよい。あるいは、絹を含有する溶液を、スプレーガンを使用して、コーティングされる材料の表面にスプレーしてもよい。さらに、絹を含有する溶液を、ローラーコートプリンティングプロセスを使用して表面にコーティングしてもよい。創傷用の包帯は、限定するものではないが、殺菌剤、例えば、ヨウ素、ヨウ化カリウム、ポピドンヨード、アクリノール、過酸化水素、塩化ベンザルコニウムおよびクロルヒキシジン;回復促進剤、例えば、アラントイン、塩酸ジブカインおよびマレイン酸クロロフェニルアミン(chlorophenylamine malate)ならびに血管収縮剤、例えば塩酸ナファゾリン;収れん剤、例えば酸化亜鉛;痂皮生成剤、例えばホウ酸、を含む他の添加物を含んでもよい。
絹ドープは、繊維製品におけるその後の使用のために、繊維表面用のコーティングを製造するために使用することもできる。このことにより、繊維上にタンパク質フィルムの単層が提供され、滑らかな仕上がりをもたらす。米国特許第6,416,558号および米国特許第5,232,611号は、繊維に対する仕上げコーティングの添加を記載している。これらの開示に記載の方法は、繊維を多様に仕上げる例を提供し、優れた感触および滑らかな表面を提供する。この適用のために、繊維は有効量の絹を用いてコーティングされる。繊維製品における使用のための繊維コーティングの目的のために、有効量の絹は、繊維材料の重量に対して約1から約99重量%の割合として本明細書において定義される。繊維材料は、限定するものではないが、綿、ポリエステル、例えば、レーヨンおよびLycra(商標)、ナイロン、毛ならびに天然の絹を含む他の天然繊維の織物繊維を含む。繊維上に絹を適用するための適切な組成物は、共溶媒、例えば、エタノール、イソプロパノール、ヘキサフルオラノール(hexafluoranols)、イソチオチアノウラネート(isothiocyanouranates)および溶液またはミクロエマルジョンを形成するために水と混合できる他の極性溶媒を含むことができる。絹含有溶液は繊維上にスプレーすることができ、または繊維を溶液に浸漬することができる。必ずしも必要ではないが、コーティングされた材料の気流乾燥が好ましい。別のプロトコルは、絹組成物の織り繊維への適用である。この適用の理想的な実施形態は、ストッキングなどの伸縮可能な織物をコーティングするための絹の使用である。
絹繊維を、ポリウレタン、他の樹脂または熱可塑性充填剤に加え、パネルボードおよび他の建築材料または木およびパーティクルボードに取って代わる成形家具およびベンチトップとして作製できる。複合材料はさらに、ビルおよび自動車の建造、特にルーフトップおよびドアパネルに使用できる。絹繊維は樹脂を再強化し、材料をより強くし、他のパーティクルボードおよび複合材料と同等または非常に強い、軽量の建造物を可能にする。絹繊維を単離し、合成の複合形成樹脂に加え、または植物由来タンパク質、デンプンおよび油と組み合わせて使用し、生物学に基づく複合材料を製造できる。このような材料の製造に関するプロセスは、特開2004284246号、米国特許第2005175825号、米国特許第4,515,737号、JP47020312および国際公開番号WO 2005/017004に記載されている。
絹の繊維特性は、製紙に強度および良質の質感を加えることができる。絹の紙は、綿パルプに絹糸をまだらにすることによって作られ、非常に滑らかなハンドメイドの紙を作製し、ギフトのラッピング、ノートのカバー、キャリーバッグに使用される。絹ドープから紙製品を製造するプロセスは、全般に特開2000139755号に記載されている。
本発明の絹ドープから製造される絹は、かなりの靭性を有し、濡れた場合、これらの特性の維持において他の絹の中でも目立つ(Hepburnら、1979年)。
組み換え型発現構築体を作製するために、シグナルペプチドを含まない4種のミツバチの絹遺伝子配列(Genbank受託番号: FJ235088、FJ235089、FJ235090、FJ235091)を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーセットを使用して、Sutherlandら(2006年)に記載のcDNAクローンからPCRによって増幅した。:
AmelF1: GGAATT CTC ATG AGT TTG GAG GGG CCG GGC AAC TCG (配列番号101)およびCGGC GGATCC TTA TTA AAA TAC GTT GCT CTT CAA GT (配列番号102);
AmelF2: GGAATT CTC ATG AGC CGC GTG ATT AAT CAC GAG TCC CTG (配列番号103)およびCGGC GGATCC TTA TTA TTC CAA CTT TGC TAC ATG TAT TTT C (配列番号104);
AmelF3: GGAATT CCC ATG GGC GTC GAG GAA TTC AAG TCC TCG (配列番号105)およびCGGC AGATCT TTA TTA AAA TTT TTT ATC CTC AAT A (配列番号106);
AmelF4: GGAATT CCC ATG GCA AGG GAA GAG GTG GAG ACA CGG (配列番号107)およびCGGC GGATCC TTA TTA CTT CAC CTC CCA TTC TTC ATT C (配列番号108)
(クローニング制限酵素部位に下線を引き、太字で示し、cDNA配列が一致する配列をイタリックで示す)。
フーリエ変換赤外分光法を使用して、天然および組み換えのミツバチの絹のタンパク質構造を比較した。天然のミツバチの絹シートを市販の巣箱から入手し、ワックスを除去するためにクロロホルム中で広範囲にわたって洗浄し、水溶性の混入物を除去するために温水で広範囲にわたって洗浄した。個々の4種の組み換えミツバチの絹タンパク質の溶液を等モルの比で混合し、フィルムにキャスティングし乾燥させた。これらの試料からの赤外線スペクトルを、i-シリーズイメージング赤外線顕微鏡アクセサリを備えたPerkin-Elmer System 2000フーリエ変換分光器を使用して、透過様式で得た。スペクトルを、Spectrumソフトウェア(version 5.3.1)を使用して回収し、分解能4cm-1において回収した平均256スキャンを表した。回収後のデータ操作および分析を、Grams/AIソフトウェアv5.05を使用して実施した。個々の絹のスペクトルに関するアミドI領域のデコンボリューションを、図2に示す。結果の要約および成分の二次構造の割り当てをTable 2(表2)に表す。
封入体を3% SDS中で可溶化し、全般に0.5〜2wt%の間のタンパク質、最大3wt%のタンパク質の可溶性ミツバチフィブロリン溶液を得た。過剰なSDSを、KCl沈殿によって絹タンパク質溶液から除去した。カリウム沈殿は、最大95%、例えば70〜80%のSDSを除去するが(沈殿の秤量による)、<10%のタンパク質も除去した(溶液中のタンパク質濃度の測定による)。絹溶液を、蜂蜜様の粘度(ほぼ10〜15wt%のタンパク質)が得られるまで、20wt%ポリエチレングリコール(PEG、MW 8000、Sigma)またはSlide-A-Lyzer濃縮溶液(Pierce)に対して長期透析によって濃縮した。濃縮された絹ドープの液滴を1対のピンセットの先端の間に空中浮遊させ、ピンセットを広げ、細い糸を形成させた(図3A)。これらの単一に引き出した糸は空気中で安定であるが、水に溶解した。繊維をその後90%メタノール、10%水のバスに浸し、2回、およそ2倍の長さまで引き出し、風乾させた(図3B)。2倍引き出した(double-drawn)糸は、水に可溶ではなかった。単一に引き出した(single-drawn)繊維および2倍に引き出した繊維を、偏光レンズを備えた光学顕微鏡によって、およびZeiss EVO LS 15環境制御形走査電子顕微鏡によって確認した。
絹タンパク質を、通常実施例1のように調製した。SDS可溶化後のタンパク質の濃度は、大抵の場合ほぼ3%絹タンパク質であった。タンパク質溶液が低い濃度を有した場合、それらを、20wt%ポリエチレングリコール(PEG、MW 8000、Sigma)またはSlide-A-Lyzer濃縮溶液(Pierce)に対して長期透析によって、溶液が3〜6%絹タンパク質であるまで濃縮した。
AmelF3のミツバチの絹タンパク質を、大腸菌の封入体内で発現させた。AmelF3封入体を、同等の乾燥重量の界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を使用してフォールディングを展開し、2〜4%単量体タンパク質溶液を作製した。動的光散乱(DLS)により、100mMのNaClで10倍に希釈されたタンパク質-界面活性剤溶液中の粒子の流体力学的直径が9.2+/-0.1nmと測定された(ピークが粒子体積の98.2%を含有)。同じ実験条件下でタンパク質を含まない3%SDS溶液中のSDSミセルの直径は、5.5+/-0.2nmの単一のピークであった。SDS-タンパク質溶液中にSDSミセルは検出されず、SDSの大部分がタンパク質と結合したことが確認される。
Claims (38)
- 絹ドープを製造する方法であって、
i)1種または複数種の絹タンパク質を産生する細胞を溶解するステップ、
ii)絹タンパク質を、それらと、界面活性剤またはイオン液体とを接触させることによって可溶化するステップ、および
iii)絹ドープを製造するために、絹タンパク質を濃縮するステップ、
を含み、1種または複数種の絹タンパク質が、コイルドコイル構造を含む三次構造を形成できる方法。 - a)界面活性剤を沈殿させる化合物を加えることによって、溶液中の界面活性剤の量を減少させるステップ、および
b)ステップa)において形成された沈殿から絹タンパク質を含む溶液を分離して、絹ドープを製造するステップ、
によって絹タンパク質を濃縮する、請求項1に記載の方法。 - 界面活性剤を沈殿させる化合物が、塩もしくは炭水化物またはそれら2種以上の組合せである、請求項1に記載の方法。
- 塩がカリウム塩またはナトリウム塩である、請求項3に記載の方法。
- 絹タンパク質が、ろ過によって濃縮される、請求項1に記載の方法。
- 絹タンパク質が、膜ろ過によって濃縮される、請求項5に記載の方法。
- 膜ろ過が、タンジェンシャルフローろ過である、請求項6に記載の方法。
- 絹ドープ中の絹タンパク質の濃度を上昇させるステップをさらに含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 絹ドープを、脱水溶液に対して透析するステップを含む、請求項8に記載の方法。
- 脱水溶液が吸湿性ポリマーを含む、請求項9に記載の方法。
- 吸湿性ポリマーが、ポリエチレングリコール、アミラーゼおよびセリシンまたはそれらの2種以上の組合せからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 絹ドープが、少なくとも約0.5%w/vの絹タンパク質を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 絹ドープが、約0.5%から約15%w/vの絹タンパク質を含む、請求項12に記載の方法。
- 細胞が、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞もしくは動物細胞またはそれらの2種以上の組合せである、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が細菌細胞である、請求項14に記載の方法。
- ステップi)が、溶解した細胞から封入体を単離するステップをさらに含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- ステップi)の前に、細胞を培養するステップをさらに含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- コイルドコイル構造を含む三次構造を形成できる絹タンパク質の一部が、7アミノ酸配列abcdefgの少なくとも10コピーを含み、aおよびdの位置のアミノ酸の少なくとも25%がアラニン残基である、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 絹タンパク質が、
a)配列番号1、3、5、7、17、19、21、23、33、35、37、39、49、51、53、55、65、67、69、71、81、83、85、87または97の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
b)配列番号1、3、5、7、17、19、21、23、33、35、37、39、49、51、53、55、65、67、69、71、81、83、85、87または97の任意の1つまたは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
c)a)またはb)の生物学的に活性な断片、
から選択される配列を含む、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。 - 絹タンパク質が、
a)配列番号1、17、33、49、65もしくは81の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
b)配列番号1、17、33、49、65もしくは81の任意の1つもしくは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
c)a)もしくはb)の生物学的に活性な断片、
を含む第1の絹タンパク質、
d)配列番号3、19、35、51、67もしくは83の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
e)配列番号3、19、35、51、67もしくは83の任意の1つもしくは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
f)d)もしくはe)の生物学的に活性な断片、
を含む第2の絹タンパク質、
g)配列番号5、21、37、53、69もしくは85の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
h)配列番号5、21、37、53、69もしくは85の任意の1つもしくは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
i)g)もしくはh)の生物学的に活性な断片、
を含む第3の絹タンパク質、ならびに/あるいは
j)配列番号7、23、39、55、71もしくは87の任意の1つで提供されるアミノ酸配列、
k)配列番号7、23、39、55、71もしくは87の任意の1つもしくは複数と少なくとも30%同一であるアミノ酸配列、および
l)j)もしくはk)の生物学的に活性な断片、
を含む第4の絹タンパク質、
を含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。 - 第1の絹タンパク質、第2の絹タンパク質、第3の絹タンパク質および/または第4の絹タンパク質が、同じ細胞によって産生される、請求項20に記載の方法。
- 第1の絹タンパク質、第2の絹タンパク質、第3の絹タンパク質および/または第4の絹タンパク質が、異なる細胞によって産生される、請求項20に記載の方法。
- ステップii)が、ほぼ等モル量の第1の絹タンパク質、第2の絹タンパク質、第3の絹タンパク質および第4の絹タンパク質を含む、請求項20から22のいずれか一項に記載の方法。
- 界面活性剤が、アニオン性界面活性剤である請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ラウリル硫酸アンモニウムもしくは他のアルキル硫酸塩、1-オクタンスルホン酸ナトリウム一水和物、ラウロイルサルコシンナトリウム、ナトリウムラウリルエーテル硫酸(SLES)、タウロデオキシコール酸ナトリウム水和物、アルキルベンゼンスルホン酸またはそれらの2種以上の組合せを含む、請求項24に記載の方法。
- イオン液体が、
i)塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアネート、アセテート、C1〜C4-アルキル硫酸、メタンスルホン酸、トシレート、C1〜C4-リン酸ジアルキル、硫酸水素およびテトラクロロアルミン酸から選択されるアニオン、ならびに、
ii)1,3-C1〜C4-ジアルキルイミダゾリウム、3-クロロピリジニウム、4-ジメチルアミノピリジニウム、2-エチル-4-アミノピリジニウム、2-メチルピリジニウム、2-エチルピリジニウム、2-エチル-6-メチルピリジニウム、キノリニウム、イソキノリニウム、ピリジニウム、1-C1〜C4-アルキルイミダゾリウム、1-メチルイミダゾリウム、1,2-ジメチルイミダゾリウム、1-n-ブチル-イミダゾリウム、1,4,5-トリメチルイミダゾリウム、1,4-ジメチルイミダゾリウム、イミダゾリウム、2-メチルイミダゾリウム、1-ブチル-2-メチルイミダゾリウム、4-メチルイミダゾリウム、1-(2'-アミノエチル)イミダゾリウム、1-ビニルイミダゾリウム、2-エチルイミダゾリウムおよびベンゾトリアゾリウムから選択されるカチオン、
を含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。 - 絹ドープを製造するための方法であって、
i)細胞培養物から、または無細胞発現系から上清を得、1種または複数種の絹タンパク質を製造するステップ、
ii)絹タンパク質を、それらと、界面活性剤またはイオン液体とを接触させることによって可溶化するステップ、および
iii)絹タンパク質を濃縮して、絹ドープを製造するステップ、
を含み、1種または複数種の絹タンパク質が、コイルドコイル構造を含む三次構造を形成できる方法。 - ステップi)が、上清由来の絹タンパク質の濃度を上昇させるステップをさらに含む、請求項27に記載の方法。
- 絹タンパク質の濃度を、上清と、絹タンパク質を沈殿させる薬剤とを接触させることによって上昇させる、請求項28に記載の方法。
- 絹繊維を製造するための方法であって、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法によって製造された絹ドープを押し出す、および/または引き出すステップを含む方法。
- 押し出すステップが、絹ドープを、約5μmから約500μmのキャピラリーチューブに通すステップを含む、請求項30に記載の方法。
- 絹ドープが、アルコールを含む溶液内に押し出される、請求項30または31に記載の方法。
- アルコールがメタノールであり、溶液中のメタノール濃度が約40%から約80%v/vである、請求項32に記載の方法。
- 絹フィルムを製造する方法であって、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法によって製造される絹ドープをキャスティングするステップを含む方法。
- 請求項1から29のいずれか一項に記載の方法によって製造された絹ドープ。
- 請求項30から33のいずれか一項に記載の方法によって製造された絹繊維。
- 請求項34に記載の方法によって製造された絹フィルム。
- 請求項36に記載の絹繊維および/または請求項37に記載の絹フィルムを含む製品。
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