MX2011004308A - Dispositivo y metodo para la deteccion de cintas de prueba de orina comprometidas por humedad. - Google Patents

Abstract

El tiempo de la reacción de los reactivos sensibles a humedad para reducir la presencia de analitos, por ejemplo, leucocitos en muestras de orina, se utilizan para detectar cuándo los reactivos se han comprometido por el exceso de humedad. La relación de reflectancia de luz en longitudes de onda características de los productos de reacción entre los reactivos y el analito y un tinte de referencia infrarrojo se miden en dos tiempos preestablecidos después de que una muestra de orina se ha aplicado a cinta de prueba y se utiliza para determinar si los reactivos se han comprometido por el exceso de humedad. La presencia de muestras inusualmente oscuras se determina a partir de la luz reflejada en 470 y 625 nm para confirmar que las cintas de prueba se comprometen por humedad.

Description

DISPOSITIVO Y MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE CINTAS DE PRUEBA DE ORINA COMPROMETIDAS POR HUMEDAD CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere generalmente para mejorar el rendimiento y conflabilidad de cintas de prueba que emplean reactivos sensibles a humedad, particularmente aquellos utilizados para determinar la presencia de analitos en muestras de orina, tales como albúmina, proteína, creatinina, nitrato, olistatina, esterasa leucocitaria (glóbulos blancos), hemoglobina (glóbulos rojos), acetonas, glucosa, bilirrubina, urobilógeno y otros conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. La medición de proteasas e inhibidores de proteasa tales como esterasa leucocitaria (elastasa humana) o inhibidor de tripsina urinaria (Bicunina, Uristatina) especialmente son importantes ya que pueden indicar infecciones de riñon o el tracto urogenital. Estas proteasas y cintas inhibidoras de proteasa se basan en la hidrólisis de sustratos proteolíticos por las proteasas para generar señales detectables . Puesto que las reacciones bioquímicas requieren agua para que se presenten la hidrólisis enzimática, tienden a ser sensibles a la humedad y pueden interferir con las señales detectables a través de reacciones de fondo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La Patente Estadounidense 5 , 663 , 044 se incorpora en la presente para referencia. Esta patente describe la técnica antecedente en el campo de la detección de leucocitos, esterasa, o proteasa y para enseñar generalmente el uso de una composición que incluye una sal de diazonio, uno de un grupo de ásteres sometidos a hidrólisis en presencia de leucocitos, esterasa o proteasa y un metal alcalinoterreo. La patente 1044 enseña la medición de reflectancia de luz en aproximadamente 570 nm para determinar la cantidad de leucocitos en la muestra de orina. La reflectancia en 570 nm se compara con una medición estándar de reflectancia en 690 nm. La patente indica que la presencia de metal alcalinotérreo promueve la estabilidad de la sal de diazonio. También sugiere que el metal alcalinotérreo absorbe la humedad lo cual puede provocar un cambio de color de fondo . La experiencia ha demostrado que este sistema reactivo es sensible a la humedad y que las cintas de prueba deben mantenerse en un ambiente seco antes de su uso. El contenido de humedad de las cintas de prueba deben mantenerse por debajo del 2 % en peso para evitar degradar el rendimiento. Sin embargo, medir la humedad en cintas de prueba no es muy precisa. Existe una necesidad particular de medir el contenido de humedad de manera muy precisa para asegurar que las cintas de prueba sean estables en un recipiente seco cerrado durante varios años .

Otro ejemplo del uso de reactivos sensibles a la humedad se describe en las Patentes Estadounidenses 6,770,764; 6,955,921 y 7,001,737 incorporadas en la presente para referencia. En las reacciones descritas, la presencia de inhibidores de tripsina urinaria en una muestra de orina se detecta al agregar una muestra a las cintas de prueba que contienen una cantidad conocida de tripsina, un sustrato de tripsina, es decir, esteres de arginina hidrolizados por tripsina para producir una alcohol y una sal de diazonio. Cuando los inhibidores de tripsina se encuentran presentes, inhiben la reacción entre la tripsina y el sustrato. Esto reduce el color producido por la sal de diazonio a partir de su reacción con el fenol producido cuando el sustrato de tripsina reacciona con la cantidad conocida de tripsina. Al medir el color producido, la presencia de inhibidores de tripsina puede determinarse.

En la Patente Estadounidense 6,316,264, un tinte infrarrojo (IR) se agrega a una ubicación predeterminada en las cintas reactivas para asegurar que las cintas se alineen de manera adecuada en el instrumento utilizado para detectar y/o medir la presencia de analitos en una muestra aplicada a la cinta. El margen de IR para los tintes se encontraba ampliamente entre 700 y 2500 nm, pero los tintes que tenían una fuerte absorción en el margen de 825-855 nm se preferían con absorción en el margen visible de (400-700) menor que 20%.

Como se sugiere en lo anterior, sería ventajoso si las cintas de prueba de orina que se comprometen por humedad pudieran identificarse con una precisión mejorada para evitar el uso inseguro y corregir los resultados afectados por la humedad. Puesto que los reactivos que implican hidrólisis de sustratos proteolíticos son especialmente sensibles a la humedad, si los reactivos mismos pudieran utilizarse para indicar la presencia de humedad indeseable, se habría obtenido una mejora significativa. La presente invención proporciona tal método, el cual se describirá en detalle en lo siguiente.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención tiene aplicación a cintas de pruebas sensibles a humedad que se utilizan para medir hidrólisis de sustratos proteolíticos utilizados para detectar proteasa o inhibidores de proteasa. Un ejemplo, se encuentra en la detección de leucocito, esterasa o proteasa, como se describe en la Patente Estadounidense 5,663,044. Otro ejemplo se encuentra en la detección de inhibidores de tripsina urinaria descritos en las Patentes Estadounidenses 6,770,764; 6,955,921; y 7,001,737.

En general, la invención es un método para detectar humedad excesiva en cintas de prueba que emplean reactivos sensibles a humedad. Al medir el color u otra respuesta desarrollada por los reactivos sensibles a humedad justo después de aplicar una muestra y comparar el resultado con un tinte de referencia infrarrojo conocido, los reactivos comprometidos por humedad se identifican y el resultado entonces puede etiquetarse o descartarse.

Cuando el color desarrollado se mide por reflectancia de luz, el valor de la relación de reflectancia (es decir, la relación de la reflectancia de los reactivos con la reflectancia del tinte de referencia) inmediatamente después de aplicar una muestra se compara con el valor de la relación de reflectancia, tomada poco tiempo después y se utiliza para determinar el efecto de humedad excesiva y para rechazar los reactivos si se comprometen por la humedad. Una segunda relación de reflectancia puede medirse para determinar si la muestra tiene un color inusual y puede afectar los resultados.

En una modalidad preferida, para detectar los reactivos de leucocitos comprometidos por humedad los reactivos incluyen una sal de diazonio, por ejemplo, DNSA (ácido l-diazo-2-naftol-4-sulfónico) , que reacciona con un éster hidrolizable, por ejemplo, PPTA (éster de 2-hidroxi-5-fenil-pirrol-N-tosil-L-alanina) . Cuando se encuentra presente esterasa leucocitaria en la muestra de orina, se produce un color en proporción con la cantidad de leucocitos presentes. En esta modalidad, la reflectancia en la longitud de onda de luz de 520-570 nm se compara con la reflectancia de aproximadamente 825 nm característica del tinte de referencia .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La única figura es un diagrama de flujo para determinar el contenido de leucocitos de una muestra o rechazar el resultado cuando se compromete por la humedad.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención incluye un método mejorado para medir hidrólisis de sustratos proteolíticos en muestras de orina aplicados a cintas de prueba. En general, los reactivos basados en sustratos proteolíticos pueden utilizarse para detectar cualquier proteasa. La secuencia de aminoácidos de los reactivos se correlaciona con el tipo preferido por la proteasa que se detecta y la secuencia de aminoácidos se conecta a una porción de generación de señales que con la hidrólisis forma la señal. Un ejemplo de este principio es la detección de esterasa leucocitaria, la cual se utiliza para detectar la presencia de leucocitos en una muestra, como se describe en la Patente Estadounidense 5,663,044. La presencia de leucocitos se correlaciona con la reflectancia de luz en la longitud de onda característica de los reactivos con referencia a la reflectancia de luz en una longitud de onda característica de un tinte de referencia infrarrojo. La comparación de reflectancia medida se correlaciona con la presencia de leucocitos después de un tiempo de incubación de aproximadamente 20 segundos a 3 minutos después de la aplicación de una muestra de orina a los reactivos. Tales cintas de prueba pueden comprometerse por el exceso de humedad que puede reducir la actividad del reactivo y muestra falsamente el desarrollo de color indicativo de la presencia de leucocitos en una muestra de orina. Al medir la relación de reflectancia a partir de los reactivos con el tinte de referencia infrarrojo durante el primer minuto después de que se ha aplicado una muestra de orina a los reactivos, el método de la invención determina si los reactivos se han comprometido por el exceso de humedad.

Los reactivos basados en sustratos proteolíticos también pueden utilizarse para detectar un inhibidor de proteasa. Nuevamente la secuencia de aminoácidos se correlaciona con el tipo preferido por el inhibidor de proteasa, la secuencia que se conecta a una porción de generación de señal que con la hidrólisis forma la señal. La proteasa se agrega al reactivo y por lo tanto genera una señal cuando el inhibidor no se encuentra presente en la muestra. La ausencia de una señal se utiliza para determinar la presencia de inhibidor de proteasa en una muestra. Un ejemplo de este principio es la detección de inhibidor de tripsina urinaria como se describe en las Patentes Estadounidenses 6 , 770 , 764 ; 6 , 955 , 921 y 7 , 001 , 737 .

La hidrólisis de un sustrato proteolítico no alcanza el punto final de la reacción en el intervalo de poco menos de algunos minutos, necesarios para las cintas utilizadas en aplicaciones de punto de atención. Las reacciones de hidrólisis continúan creando una señal con tiempo y típicamente se miden de manera cinética para permitir que las lecturas no dependan del tiempo por parte del operador. Por ejemplo, el color desarrollado por la reacción para leucocitos en la orina puede medirse en 20 y 60 segundos y la relación de las señales en ambos tiempos utilizados como resultado cinético, es decir, que muestran el índice de cambio de color. Esto evita que el usuario tenga que esperar 3 minutos para obtener el resultado.

La invención se puede aplicar a muchos formatos en los cuales los reactivos son sensibles a humedad. Es decir, los reactivos pueden reaccionar en presencia de humedad e indicar falsamente la presencia de un analito, el cual no se encuentra realmente en la muestra que se mide. Ejemplos de tales reactivos sensibles a humedad se han mencionado en lo anterior. De importancia particular para la presente invención fue la sensibilidad de humedad de los reactivos utilizados para detectar leucocitos en muestras de orina por la esterasa en los leucocitos, como se discute en lo siguiente con referencia a una modalidad preferida. Sin embargo, será evidente que los métodos de la invención tienen aplicación a otros reactivos sensibles a la humedad, que incluyen, pero no se limitan a, otros reactivos que pueden utilizarse para medir la presencia de leucocitos. Se entiende que las cintas de prueba pueden tener muchos formatos , que incluyen, pero no se limitan a, varillas graduadas y cartuchos de flujo lateral.

Química del Reactivo de Leucocito Los reactivos de leucocito útiles en la invención que pueden proporcionar un método para medir el contenido de leucocitos de las muestras de orina se discuten en la Patente Es adounidense 5,663,044 mencionada en lo anterior. Una composición preferida de la invención se describió en la Tabla 4 de la patente '044. Un compuesto de alanina (PPTA; éster de 2-hidroxi-5-fenil-pirrol-N- osil-L-alanina) sirvió como sustrato para esterasa leucocitaria, la cual hidroliza PPTA después de lo cual el producto hidrolizado reacciona con el indicador de diazonio (DNSA; ácido l-diazo-2-naftol-4-sulfónico) para producir color. El color se midió por el grado de reflectancia cuando se examinó en una longitud de onda de luz de 520-570 nm, (570 nm en la patente (044) . La reflectancia en 520-570 nm se relacionó con una longitud de onda estándar en 690 nm. Esta comparación se utilizó para compensar las diferencias en el color de fondo blanco del sustrato de cinta, el cual era celulosa blanca, en un poliestireno blanco que tiene una reflectancia mayor que 60%, y que se aproxima a incoloro en longitudes de onda > ~690 nm. El color de fondo blanco particularmente es sensible a la humedad y una pequeña cantidad puede provocar un gran cambio en la relación de reflectancia. El fondo blanco también es sensible al color de la orina y pequeñas cantidades pueden provocar grandes cambios en la relación de reflectancia. Como resultado, tal relación de reflectancia no puede utilizarse para medir con precisión la humedad después de sumergir la cinta en orina.

En la presente invención, un tinte de referencia infrarrojo se agrega, que tiene una respuesta característica a la luz en una longitud de onda de por lo menos 120 nm mayor que el margen de 520-570 nm. Se ha encontrado que la longitud de onda del tinte de IR y la cantidad utilizada afecta la precisión de las mediciones al reducir la interferencia de fondo. La adición de un tinte de IR a los reactivos de leucocitos proporciona un color de fondo inferior de <=60% de reflectancia >=700 y 2500 nm. Este fondo inferior reduce el efecto del color de la orina en la relación de reflectancia, pero no el efecto de la humedad. De este modo la relación de reflectancia puede utilizarse para medir con precisión la humedad después de sumergir una muestra en la orina.

Sin embargo, este color de fondo inferior de <=60% de reflectancia >=700 y 2500 nm pueden reducir la capacidad de los reactivos para detectar la hidrólisis de los sustratos proteolíticos . Este efecto se muestra en la siguiente tabla, donde el efecto del color de fondo del sustrato reactivo se reduce cuando la cantidad de tinte de IR se incrementa. La cantidad de tinte de IR que un reactivo puede tolerar depende de la longitud de onda de referencia utilizada para medir el fondo, la longitud de onda de señal del sustrato, la sensibilidad del sustrato para la humedad, y la sensibilidad del sustrato para la hidrólisis de proteasa y la cantidad de señal de tinte de fondo < 700 nm. La tolerancia de cualquier sustrato de hidrólisis determinado puede determinarse como se muestra en la Tabla 1 donde la reducción deseada de la interferencia de fondo con respecto al color en la muestra se presenta en más de 0.2 mg/dL, o aproximadamente 0.5% en peso con respecto al tinte de referencia. Sin embargo, cuando la cantidad de tinte se eleva tan alto como 20 mg/dL, la relación de reflectancia se incrementa en 1.6 y la señal se reduce ~ 1.0 de la señal esperada. De este modo, la cantidad de tinte utilizado debe limitarse a aquella necesaria para reducir la interferencia de fondo.

DTO 141 el cual es el Tinte 3 en la Tabla la U.S. 6,316,264 y tiene el nombre químico 3-(5-carboxipentil) -2- [2- [3- [ [3- ( 5-carboxipentil ) -1, 3-dihidro-l, 1-dimentil-2H-benz [e] indol-2-iliden] etiliden) -2- (n-hexiltio) -1-ciclohexen-l-il] etenil] -1, 1-dimetil-lH-benz [e] indolio, sal interna. (2) La reacción a leucocitos de 42 células /uL en orina de gravedad específica media y medida utilizando el instrumento CLINITEK Status® (Siemens Healthcare Diagnostics) . (3) Diferencia entre la orina clínica de color café muy elevado y una orina de color amarillo típico. Ambas orinas carecían de leucocitos y se midieron utilizando el instrumento CLINITEK Status®.

En el experimento anterior, el reactivo de leucocitos se preparó a partir de dos saturaciones secuenciales de papel filtro. La primera saturación fue con una mezcla acuosa que contenía ácido bórico, Bio-Terge AS40, polímero PVP y NaCl para controlar la resistencia iónica. La mezcla de pH se ajustó de 8.8 a 9.3 utilizando hidróxido de sodio o ácido clorhídrico. La segunda saturación fue una mezcla de acetona/solvente DMSO que contenía DNSA, PPTA, decanol y ácido bórico. Las funciones de cada ingrediente, la concentración preferida y el margen admisible se proporcionan en la tabla siguiente. Las soluciones de la mezcla se utilizaron para saturar el papel filtro, en este caso papel filtro Ahlstrom grado 205C, y el papel se secó en 121°C durante 9 minutos después de la primera saturación, y a 100°C durante 7 minutos después de la segunda saturación. El reactivo seco resultante se proceso en cintas reactivas, las cuales se sometieron a prueba utilizando el instrumento CLINITEK Status®.

Tabla 2 Varios tintes podrían utilizarse, incluyendo aquellos descritos en la Patente Estadounidense 6,316,264 incorporada en la presente para referencia y que tiene absorbancia característica en la región infrarroja de aproximadamente 700 a aproximadamente 2500 nm. Ejemplos incluyen compuestos de ftalocianina y naf talocianina, tintes complejos de metal (por ejemplo, tintes complejos de metal de ditioleno) y tintes de polimetina, que incluyen tintes de cianina. Otros tintes incluyen tintes de di y trif enilmetano, tintes de quinona, tintes azo, y tintes de transferencia de carga y resonancia de carga. Su característica común es que la reflectancia de luz en una longitud de onda única se mide por lo menos en 120 nm por encima de aquella de la longitud de onda del reactivo. Junto con los reactivos de leucocitos discutidos en lo anterior, el tinte debe tener una reflectancia característica de por lo menos 700 nm, de preferencia por encima de 700 y menos de 2500 nm.

Aunque se incluye el tinte de referencia con los reactivos de leucocitos en una modalidad preferida, también es posible colocar el tinte de referencia en otra ubicación, como se hizo para propósitos de alinear la cinta de prueba (U.S. 6,316,264). Los cambios debido a la humedad que se presenta cuando el tinte hace contacto con la muestra pueden diferir de aquellos que se presentan cuando el tinte se encuentra dentro de los reactivos. Sin embargo, tales diferencias pueden acomodarse por aquellos familiarizados en la técnica.

Detección de Contaminación con Humedad en una Cinta de Prueba de Leucocitos Como se discute en lo anterior, la humedad provoca que los reactivos de leucocitos se degraden y produzcan un cambio de color falso. Las enzimas en los leucocitos no se necesitan para hidrolizar el sustrato proteolítico, por ejemplo, PPTA. Se ha encontrado que los reactivos son sensibles a tan sólo 0.1% de humedad en una almohadilla de reactivo de leucocito. El índice de cambio de color es esencial y directamente proporcional a la cantidad de agua presente. La importancia del control de humedad es evidente cuando después de una exposición de 10 minutos a >60 de Humedad Relativa, la prueba proporciona resultados falsos positivos .

Esta sensibilidad a la humedad se utiliza en la invención para determinar si una almohadilla de reactivo se ha contaminado con humedad. El cambio de color se determina primero en aproximadamente 20 segundos después de que se ha aplicado una muestra de orina. Si el color se detecta después de 20 segundos, entonces se sospecha de contaminación por humedad. Esto se confirma si el color no se ha incrementado significativamente después de 60 segundos, es decir, la actividad de los reactivos se ha reducido. Este método se confirmó en un experimento en el cual las cintas de pruebas se expusieron a 30°C en 80% de humedad durante 10 minutos, condiciones conocidas para probar fallas de los reactivos. Veintitrés de veinticuatro cintas se encontró que habían fallado cuando la relación de la reflectancia en 520 nm con la reflectancia en 820 nm se utilizó. La cantidad del tinte DTO 141 aplicado fue de 0.2 mg/dL, con respecto a 42 mg/dL de PPTA de los reactivos de leucocitos. Un experimento paralelo en el cual sólo la reflectancia en 520 nm se midió, es decir, sin el tinte presente, no detectó las cintas contaminadas con humedad en 42% de las cintas, esto también fue verdadero cuando una relación de reflectancia de 520 nm/870 nm se utilizó, pero sin el tinte presente.

La influencia del color en la muestra de orina también se justifica en el método de la invención. El color de muestra se mide por la absorbancia de luz en aproximadamente 460 nm (dentro del margen visible) . Para afectar la medición del color desarrollado por los reactivos de leucocitos, se determina una nueva relación, es decir, la reflectancia en aproximadamente 460 nm (para el color de muestra) dividido por la reflectancia en aproximadamente 625 nm. Esta relación evita que muestras de orina oscuras se consideren como comprometidas por humedad. Si la relación (1000 veces) se encuentra por encima de 600, el color de muestra es claro y la reflectancia es alta. Si es así, entonces la cinta que se somete a prueba se confirmará como comprometida por humedad si las relaciones de reflectancia en 20 y 60 segundos han indicado que la cinta responde en una forma anormal. Si la relación se encuentra por debajo de 600, la muestra tiene un color oscuro el cual puede haber afectado los resultados y la cinta no se rechaza si los resultados en 20 y 60 segundos han sido satisfactorios.

La diferencia entre la relación de reflectancia en 525 nm con la reflectancia en 825 nm tomada en 20 y 60 segundos después de aplicar una muestra se utiliza para determinar si los reactivos se han degradado por la humedad. En general, si la primera lectura (20 segundos) proporciona una relación de menos de aproximadamente 700 (relación ? 1000) , entonces el exceso de humedad se indica puesto que la reflectancia en 525 indica que el color significativo se ha desarrollado ya. Si la segunda lectura se toma en 60 segundos y se compara con la primera lectura y la diferencia en las lecturas es menor que aproximadamente 50 (relación x 1000) , entonces la presencia de exceso de humedad se confirma puesto que los reactivos han perdido su actividad normal .

Por ejemplo, se miden tres valores cuando los reactivos incluyen PPTA y DNSA y el tinte de referencia es DTO 141.

Tabla 3 Relación, Tiempo Relación de significado nm valor crítico x 1000 L>20 525/845 20 < 700 Probablemente segundos exceso de humedad de alta absorción ^60 525/845 60 L2o - L6o < 50 Humedad que reduce segundos la actividad del reactivo H 470/625 40 y 60 > 600 Muestra de alta segundos reflectancia con color claro Aplicar aquellos valores a las lecturas de acuerdo con el procedimiento mostrado en la Figura 1 proporciona el rechazo de los resultados como comprometidos por humedad o para informar el leucocito medido en la muestra. En un ejemplo, un instrumento de CLINITEK Status® se utiliza para analizar la muestra de orina para obtener presencia de leucocitos. Una cinta absorbente (por ejemplo, papel filtro) saturada con las soluciones de reactivo como se describe en lo anterior en la Tabla 2 tiene una muestra de orina aplicada a la misma y los cambios de color resultantes se miden por la reflectancia de luz en el instrumento CLINITEK Status® de acuerdo con el procedimiento inventivo.

Si el valor medido de L2o-L6o es menor que 50, es posible que el exceso de humedad haya reducido la actividad del reactivo de leucocito. Si se encuentra por encima de 50, entonces el valor de L2o-L<6o puede utilizarse para calcular la concentración de leucocitos en la muestra. Sin embargo, incluso si se encuentra por debajo de 50, la relación 525/845 nm aún puede ser capaz de proporcionar una concentración de leucocitos. Se considera el valor inicial de la relación 525/845 nm (L20) . Si el valor se encuentra por debajo de 700 (relación x 1000) , entonces la alta absorción de la luz en 525 nm se indica, sugiriendo que el exceso de humedad puede haber estado presente en la almohadilla de prueba. Combinado con el resultado de L2o-L60, entonces es probable que los reactivos de leucocitos se hayan comprometido por el exceso de humedad. Sin embargo, puesto que los resultados pueden haberse influenciado por una muestra inusualmente obscura, la relación H, 470/625 nm, se mide. Si el resultado se encuentra por encima de 600 (relación x 1000) se indica alta reflectancia, significando que la muestra no es de color elevado. Si es así, entonces los reactivos de leucocitos se considera que se han comprometido por el alto contenido de humedad. Si la muestra es obscura, es decir, la relación crítica H se encuentra por debajo de 600, pero los valores previamente determinados de L20-L6o y L20 eran aceptables, entonces la muestra se considera que no se compromete y que se calcula en contenido de leucocitos .

Debe entenderse que las longitudes de onda de luz especificas y los tiempos de medición recién descritos son útiles para determinar la presencia de leucocitos en muestras de orina con las cantidades de los reactivos descritos. El método, sin embargo, tiene aplicación de manera más general a muchos otros reactivos que son sensibles a humedad y aún se utilizan para detectar muestras que contienen agua. Protocolos de detección adecuados deben establecerse fácilmente por aquellos con experiencia en la técnica después de haber revisado la invención descrita por la presente invención .

Como se ilustra en lo anterior, el instrumento Clinitek Status® es útil para llevar a cabo el método de la invención. Aspectos del instrumento se describen en las Patentes Estadounidenses 6,239,445; 5,877,863, 5,477,326; y 5,408,535, las cuales se incorporan en la presente para referencia. El instrumento Clinitek Status® es un espectroscopio de reflectancia en el cual una cinta de prueba que lleva una muestra se ilumina por una fuente de luz y la luz reflejada de la cinta de prueba se detecta y se utiliza para determinar la presencia y cantidad de analito en la muestra. La operación de los espectrofotómetros también se discute en la Patente Estadounidense 6,316,264, mencionada en lo anterior. Como se observa en la presente, un instrumento tipo cámara, el cual crea una imagen de varios píxeles también puede utilizarse para llevar a cabo el método de la invención .

Claims (27)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo descrito en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar reactivos sensibles a humedad comprometidos por la humedad, los reactivos se ponen en contacto con una muestra que contiene agua y detecta la presencia de un analito en la muestra por su reacción con reactivos sensibles a humedad, el método caracterizado porque comprende : (a) medir la reflectancia de luz en la longitud de onda de los productos de la reacción y los reactivos sensibles a humedad con el analito en dos tiempo predeterminados después de poner en contacto los reactivos con la muestra; (b) medir en los dos tiempos predeterminados de la muestra la reflectancia de luz en la longitud de onda de un tinte de referencia infrarrojo, el tinte tiene una longitud de onda característica separada de la longitud de onda medida en (a) por al menos 120 nm; (c) calcular la relación de las longitudes de onda medidas en (a) y (b) y concluir que los reactivos tienen una actividad menor que la esperada a partir del cambio en la relación entre los dos tiempos predeterminados .

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, se caracteriza porque la relación de longitudes de onda medidas en (a) y (b) en el primero de los dos tiempos predeterminados se utiliza para indicar reactivos sensibles a humedad potencialmente comprometidos por humedad.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, se caracteriza porque en combinación con la relación de longitudes de onda medidas en el primero de los dos tiempos predeterminados y el cambio en la relación entre el primer y segundo tiempos predeterminados se utilizan para determinar si los reactivos sensibles a humedad se comprometen por humedad.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, se caracteriza además porque comprende la etapa de medir la reflectancia de luz en dos longitudes de onda predeterminadas para indicar la posibilidad de interferencia de color de muestra con los resultados determinados.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, se caracteriza porque los reactivos sensibles a humedad se basan en sustratos proteolíticos utilizados para detectar enzimas de proteasa.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, se caracteriza porque los reactivos sensibles a humedad se basan en sustratos proteolíticos utilizados para detectar inhibidores de proteasa.

7. El método de conformidad con la reivindicación 5, se caracteriza porque la muestra es orina y el analito es leucocitos .

8. El método de conformidad con la reivindicación 6, se caracteriza porque la muestra es orina y el analito es inhibidores de tripsina urinaria.

9. El método de conformidad con la reivindicación 7, se caracteriza porque los reactivos sensibles a humedad incluyen una sal de diazonio y un éster sujeto a hidrólisis en presencia de leucocitos.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, se caracteriza porque el tinte de referencia se combina con los reactivos sensibles a humedad.

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, se caracteriza porque el tinte de referencia se ubica por separado de los reactivos sensibles a humedad.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, se caracteriza además porque comprende rechazar los reactivos sensibles a humedad comprometidos por humedad.

13. Un método para medir leucocitos en muestras de orina con cintas de prueba, las cintas de prueba contienen reactivos que incluyen una sal de diazonio y un éster sometido a hidrólisis en presencia de leucocitos, el método caracterizado porque comprende calcular la cantidad de leucocitos en una muestra de orina como una función de reflexión de luz en una longitud de onda característica del producto de reacción de la sal de diazonio, con el éster hidrolizado y con referencia a la reflexión de luz en una longitud de onda de referencia pre-seleccionada, la luz reflejada se mide entre aproximadamente 1 a 3 minutos después de aplicar una muestra de orina a los reactivos, la mejora comprende detectar lo reactivos comprometidos por humedad al: (a) Agregar un tinte de referencia infrarrojo a las cintas de prueba, el tinte de referencia tiene una longitud de onda de reflectancia característica separada de la longitud de onda característica del producto de reacción por al menos 120 nm; (b) medir la reflectancia de luz en la longitud de onda del producto de reacción y la longitud de onda característica del tinte de referencia en aproximadamente 20 segundos y aproximadamente 60 segundos después de aplicar la muestra de orina a los reactivos; (c) calcular la relación de la reflectancia medida en la longitud de onda del producto de reacción en la longitud de onda medida del tinte de referencia determinado en (b) por cada uno de los tiempos de 20 y 60 segundos y designar las relaciones como L20 y L60; (d) cuando L2o-L6o es menor que un primer valor predeterminado y L20 se encuentra por debajo de un segundo valor predeterminado concluyendo que el sustrato que contiene la composición se comprometió por humedad; (e) medir la reflectancia de luz en longitudes de onda de aproximadamente 470 y aproximadamente 625 nm y calcular la relación 470/625 nm; (f) si la relación 470/625 nm se encuentra por encima de un tercer valor predeterminado que concluye que la muestra de orina no tiene un color suficiente para afectar la conclusión alcanzada en la etapa (d) ; y (g) rechazar el valor calculado para la concentración de leucocitos.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, se caracteriza porque la reflectancia de luz del producto de reacción es de aproximadamente 520-570 nm.

15. El método de conformidad con la reivindicación 13, se caracteriza porque la reflectancia de luz del tinte de referencia es de aproximadamente 825 nm.

16. El método de conformidad con la reivindicación 13, se caracteriza porque la relación del tinte de referencia con el éster hidrolizable es mayor que aproximadamente 0.5%, por lo que reduce la interferencia de fondo del color de la muestra y la cinta de prueba.

17. El método de conformidad con la reivindicación 13, se caracteriza porque el tinte de referencia se selecciona del grupo que consiste de compuestos de ftalocianina y naftalocianina, tintes de complejo de metal, tintes de polimetina, tintes de di y trifenilmetanó , tintes de quinina, tintes azo, tintes de transferencia de carga y tintes de resonancia de carga.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, se caracteriza porque el tinte de referencia es DTO 141.

19. El método de conformidad con la reivindicación 13, se caracteriza porque el éster hidrolizable es PPTA y la sal de diazonio es DSNA.

20. El método de conformidad con la reivindicación 13, se caracteriza porque el primer valor predeterminado es la relación de reflectancia 520-570/825 nm veces 1000 de 50.

21. El método de conformidad con la reivindicación 13, se caracteriza porque la segunda relación predeterminada es la relación de reflectancia 520-570 nm/825 nm veces 1000 de 700.

22. El método de conformidad con la reivindicación 13, se caracteriza porque la tercera relación predeterminada es la relación de reflectancia 470 nm/625 nm veces 1000 de 600 .

23 . El método de conformidad con la reivindicación 13 , se caracteriza además porque comprende la etapa de: (h) Reportar en la etapa de rechazo de (g) al usuario del método.

24 . El método de conformidad con la reivindicación 13 , se caracteriza porque el tinte de referencia se combina con los reactivos .

25 . El método de conformidad con la reivindicación 13 , se caracteriza porque el tinte de referencia se ubica por separado de los reactivos .

26 . El instrumento espectroscopico de reflectancia se caracteriza porque lleva a cabo el método de conformidad con la reivindicación 1 .

27. El instrumento espectroscopico de reflectancia se caracteriza porque lleva a cabo el método de conformidad con la reivindicación 13 .