ES2573804T3 - Método de detección de tiras reactivas para análisis de orina comprometidas por la humedad ambiental - Google Patents

Método de detección de tiras reactivas para análisis de orina comprometidas por la humedad ambiental Download PDF

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Abstract

Uso de un colorante infrarrojo como referencia en un método de detección de un reactivo sensible a la humedad comprometido por la humedad ambiental dispuesto en una tira reactiva, en el que el reactivo sensible a la humedad se basa en sustratos proteolíticos para detectar enzimas de proteasa o inhibidores de proteasa, incluyendo dicho reactivo sensible a la humedad una sal de diazonio y desarrollando color u otra respuesta justo después de aplicar una muestra, color u otra respuesta que se mide y se compara con el colorante infrarrojo de referencia.

Description

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METODO DE DETECCION DE TIRAS REACTIVAS PARA ANALISIS DE ORINA COMPROMETIDAS POR LA
HUMEDAD AMBIENTAL
descripciOn
Antecedentes de la invencion
Esta invencion se refiere de manera general a mejorar el rendimiento y la fiabilidad de tiras reactivas que emplean reactivos sensibles a la humedad, particularmente los usados para determinar la presencia de analitos en muestras de orina, tales como albumina, protema, creatinina, nitrato, uristatina, esterasa leucocitaria (globulos blancos), sangre oculta (globulos rojos), cetonas, glucosa, bilirrubina, urobilinogeno y otros que resultan familiares para los expertos en la tecnica. La medicion de proteasas e inhibidores de proteasa tales como esterasa leucocitaria (elastasa humana) o inhibidor de tripsina urinaria (bicunina, uristatina) son especialmente importantes porque pueden indicar infecciones del rinon o tracto urogenital. Estas tiras para detectar proteasas e inhibidores de proteasa se basan en la hidrolisis de sustratos proteoltticos mediante proteasas para generar senales detectables. Dado que las reacciones bioqmmicas requieren agua para que se produzca hidrolisis enzimatica, tienden a ser sensibles a la humedad y pueden interferir con las senales detectables a traves de las reacciones de fondo.
La patente estadounidense 5.663.044 describe la tecnica anterior en el campo de detectar leucocito, esterasa o proteasa y de ensenar de manera general el uso de una composicion que incluye una sal de diazonio, uno de un grupo de esteres propenso a hidrolisis en presencia de leucocito, esterasa o proteasa y un metal alcalinoterreo. La patente '044 ensena la medicion de la reflectancia de luz a aproximadamente 570 nm para determinar la cantidad de leucocitos en la muestra de orina. Se compara la reflectancia a 570 nm con una medicion de patron de reflectancia a 690 nm. La patente indica que la presencia de metal alcalinoterreo fomenta la estabilidad de la sal de diazonio. Tambien sugiere que el metal alcalinoterreo absorbe humedad lo que puede provocar cambio de color de fondo. La experiencia ha mostrado que este sistema de reactivos es sensible a la humedad y que las tiras reactivas deben guardarse en un entorno seco antes de su uso. El contenido en humedad de tiras reactivas debe mantenerse por debajo del 2% en peso para evitar degradar el rendimiento. Sin embargo, la medicion de la humedad en tiras reactivas no es muy precisa. Existe una necesidad particular para medir el contenido en humedad de manera muy precisa para garantizar que las tiras reactivas son estables en un recipiente seco cerrado a lo largo de varios anos.
Otro ejemplo del uso de reactivos sensibles a la humedad se trata en las patentes estadounidenses 6.770.764; 6.955.921; y 7.001.737. En las reacciones descritas, se detecta la presencia de inhibidores de tripsina urinaria en una muestra de orina anadiendo una muestra a tiras reactivas que contienen una cantidad conocida de tripsina, un sustrato de tripsina, es decir esteres de arginina hidrolizados mediante tripsina para producir un alcohol, y una sal de diazonio. Cuando estan presentes inhibidores de tripsina, inhiben la reaccion entre tripsina y el sustrato. Esto reduce el color producido mediante una sal de diazonio a partir de su reaccion con el fenol producido cuando el sustrato de tripsina reacciona con la cantidad conocida de tripsina. Mediante la medicion del color producido, puede determinarse la presencia de inhibidores de tripsina.
En la patente estadounidense 6.316.264 se anade un colorante infrarrojo (IR) a una ubicacion predeterminada sobre las tiras reactivas con el fin de garantizar que las tiras estan alineadas de manera apropiada en el instrumento usado para detectar y/o medir la presencia de analitos en una muestra aplicada a la tira. El rango de IR para los colorantes era ampliamente de entre 700 y 2500 nm, pero se dijo que se prefenan colorantes que tienen una fuerte absorbancia en el intervalo de 825-855 nm, con absorbancia en el rango visible (400-700 nm) de menos del 20%. La publicacion de solicitud de patente estadounidense 2005/0123441 A1 da a conocer un sistema de reactivos para el control integrado de elementos de analisis, en particular de tiras reactivas. El sistema de reactivos comprende un N-oxido organico o un compuesto nitroso y, opcionalmente, un agente reductor tal como glicina o glucosa. El estres del elemento de analisis, por ejemplo provocado por la humedad ambiental, da como resultado un cambio (normalmente irreversible) en el sistema de reactivos del control integrado. El cambio puede detectarse por ejemplo mediante metodos electroqmmicos u opticos.
Como se sugirio anteriormente, sena ventajoso si las tiras reactivas para analisis de orina que estan comprometidas por la humedad pudieran identificarse con mejor precision para prevenir su uso inseguro y para corregir los resultados afectados por la humedad. Dado que los reactivos que implican hidrolisis de sustratos proteoltticos son especialmente sensibles a la humedad, si pudieran usarse los propios reactivos para indicar la presencia de humedad indeseable, se obtendna una mejora significativa. La presente invencion proporciona un metodo de este tipo, que se describira en detalle a continuacion.
Sumario de la invencion
La invencion tiene aplicacion para tiras reactivas sensibles a la humedad que se usan para medir hidrolisis de sustratos proteoltticos usados para detectar proteasa o inhibidores de proteasa. Se encuentra un ejemplo en la deteccion de leucocito, esterasa o proteasa, tal como se describe en la patente estadounidense 5.663.044. Se encuentra otro ejemplo en la deteccion de inhibidores de tripsina urinaria tal como se describe en la patentes estadounidenses 6.770.764; 6.955.921; y 7.001.737.
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En general, la invencion es un metodo de detectar humedad en exceso en tiras reactivas que emplean reactivos sensibles a la humedad. Midiendo el color u otra respuesta desarrollada mediante reactivos sensibles a la humedad justo despues de aplicar una muestra y comparando el resultado con un colorante de referencia infrarrojo conocido, se identifican reactivos comprometidos por la humedad y entonces puede marcarse o desecharse el resultado.
Espedficamente, la invencion proporciona el uso de un colorante infrarrojo como referencia en un metodo de deteccion de un reactivo sensible a la humedad comprometido por la humedad ambiental dispuesto sobre una tira reactiva, en el que el reactivo sensible a la humedad se basa en sustratos proteoltticos para detectar enzimas de proteasa o inhibidores de proteasa, incluyendo dicho reactivo sensible a la humedad una sal de diazonio y desarrollando color u otra respuesta justo despues de aplicar una muestra, color u otra respuesta que se mide y se compara con el colorante infrarrojo. En una realizacion preferida, se combina el colorante infrarrojo con el reactivo sensible a la humedad. En otra realizacion preferida, el colorante infrarrojo se ubica de forma separada del reactivo sensible a la humedad. El colorante infrarrojo se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en ftalocianina, naftalocianina, colorantes de complejos metalicos, preferiblemente colorantes de complejos metalicos de ditioleno, colorantes de polimetino, colorantes de cianina, colorantes de difenilmetano, colorantes de trifenilmetano, colorantes de quinona, colorantes de tipo azo, colorantes de transferencia de carga y colorantes de resonancia de carga. Preferiblemente tiene una absorbancia caractenstica en la region de infrarrojo de aproximadamente 700 a aproximadamente 2500 nm.
Cuando se mide el color desarrollado mediante reflectancia de la luz, se compara el valor de la razon de reflectancia (es decir la razon de la reflectancia de los reactivos con respecto a la reflectancia del colorante de referencia) inmediatamente tras aplicar una muestra con el valor de la razon de reflectancia tomada poco tiempo despues y se usa para determinar el efecto de humedad ambiental en exceso y para rechazar los reactivos si estan comprometidos por la humedad ambiental. Puede medirse una segunda razon de reflectancia para determinar si la muestra se colorea de forma no habitual y puede afectar a los resultados.
Para detectar reactivos de leucocitos comprometidos por la humedad ambiental, los reactivos incluyen una sal de diazonio, por ejemplo DNSA (acido 1-diazo-2-naftol-4-sulfonico), que reacciona con un ester hidrolizable, por ejemplo PPTA (ester de 2-hidroxi-5-fenil-pirrol-N-tosil-L-alanina). Cuando esta presente esterasa leucocitaria en la muestra de orina, se produce un color en proporcion con la cantidad de leucocitos presente. En esta realizacion, se compara la reflectancia a longitud de onda luminosa de 520-570 nm con la reflectancia a aproximadamente 825 nm caractenstica del colorante de referencia.
Breve descripcion de los dibujos
La unica figura es un diagrama de flujo para o bien determinar el contenido en leucocitos de una muestra o bien rechazar el resultado por estar comprometidos por la humedad ambiental.
Descripcion de realizaciones preferidas
La invencion incluye un metodo mejorado de medicion de la hidrolisis de sustratos proteoltticos en muestras de orina aplicadas a tiras reactivas. En general, los reactivos basados en sustratos proteoltticos pueden usarse para detectar cualquier proteasa. La secuencia de aminoacidos de los reactivos se adapta al tipo preferido por la proteasa que esta detectandose y la secuencia de aminoacidos se fija un resto de generacion de senal que, tras la hidrolisis, forma la senal. Un ejemplo de este principio es la deteccion de esterasa leucocitaria, que se usa para detectar la presencia de leucocitos en una muestra, tal como se describe en la patente estadounidense 5.663.044. La presencia de leucocitos se correlaciona con la reflectancia de luz a la longitud de onda caractenstica de los reactivos con referencia a la reflectancia de luz a una longitud de onda caractenstica de un colorante infrarrojo de referencia. La comparacion de reflectancia medida se correlaciona con la presencia de leucocitos tras un tiempo de incubacion de aproximadamente 20 segundos a 3 minutos tras la aplicacion de una muestra de orina a los reactivos. Tales tiras reactivas pueden comprometerse por humedad ambiental en exceso, que puede reducir la actividad de reactivo y mostrar de forma falsa desarrollo de color indicativo de la presencia de leucocitos en una muestra de orina. Midiendo la razon de reflectancia a partir de los reactivos con respecto al colorante infrarrojo de referencia durante el primer minuto tras haberse aplicado una muestra de orina a los reactivos, el metodo de la invencion determina si los reactivos se han comprometido por humedad ambiental en exceso.
Tambien pueden usarse reactivos basados en sustratos proteolfticos para detectar un inhibidor de proteasa. De nuevo la secuencia de aminoacidos se adapta al tipo preferido por el inhibidor de proteasa, fijandose la secuencia a un resto de generacion de senal que, tras la hidrolisis, forma la senal. La proteasa se anade al reactivo y por tanto genera una senal cuando no esta presente el inhibidor en la muestra. Se usa la ausencia de una senal para determinar la presencia de inhibidor de proteasa en una muestra. Un ejemplo de este principio es la deteccion de inhibidor de tripsina urinaria tal como se describe en las patente estadounidenses 6.770.764; 6.955.921; y 7.001.737.
La hidrolisis de un sustrato proteolftico no alcanza el punto final de reaccion en el corto plazo de tiempo de menos de unos pocos minutos necesario para tiras usadas en aplicaciones junto al paciente. Las reacciones de hidrolisis
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siguen creando una senal con el tiempo y se miden normalmente de forma cinetica para permitir lecturas que no dependen del control del tiempo por parte del operario. Por ejemplo, el color desarrollado mediante la reaccion para detectar leucocitos en orina puede medirse a 20 y 60 segundos y usarse la razon de las senales a ambos tiempos como resultado cinetico, es decir, mostrando la velocidad de cambio de color. Esto evita que el usuario tenga que esperar durante 3 minutos para obtener un resultado.
La invencion es aplicable a muchos formatos en los que los reactivos son sensibles a la humedad. Es decir, los reactivos pueden reaccionar en presencia de humedad e indicar de forma falsa la presencia de un analito, que no esta realmente presente en la muestra que esta midiendose. Anteriormente se han mencionado ejemplos de tales reactivos sensibles a la humedad se han mencionado anteriormente. De particular importancia para los presentes inventores fue la sensibilidad de humedad de reactivos usados para detectar leucocitos en muestras de orina mediante esterasa en los leucocitos, tal como se trata a continuacion con referencia a una realizacion preferida. Sin embargo, sera evidente que los metodos de la invencion tienen aplicacion a otros reactivos sensibles a la humedad, incluyendo, pero sin limitarse a, otros reactivos que pueden usarse para medir la presencia de leucocitos. Se entiende que las tiras reactivas pueden tener muchos formatos, incluyendo, pero sin limitarse a, tiras de ensayo y cartuchos de flujo lateral.
Qmmica de reactivo de leucocitos
En la patente estadounidense 5.663.044 mencionada anteriormente se tratan reactivos de leucocitos utiles en la invencion que pueden proporcionar un metodo de medicion del contenido en leucocitos de muestras de orina. En la tabla 4 de la patente '044 se describio una composicion preferida de la invencion. Un compuesto de alanina (PPTA; ester de 2-hidroxilo-5-fenil-pirrol-N-tosil-L-alanina) sirvio como sustrato para esterasa leucocitaria, que hidroliza PPTA, tras lo cual el producto hidrolizado reacciona con el indicador de diazonio (DNSA; acido 1-diazo-2-naftol-4- sulfonico) para producir color. Se midio el color mediante el grado de reflectancia cuando se examino a una longitud de onda luminosa de 520-570 nm (570 nm en la patente '044). Se relaciono la reflectancia a 520-570 nm con una longitud de onda convencional a 690 nm. Se uso esta comparacion para compensar diferencias en el color de fondo blanco del sustrato de tira, que era celulosa blanca sobre un poliestireno blanco que tema una reflectancia >60%, y que se aproximaba a un estado incoloro a longitudes de onda >~690 nm. El color de fondo blanco es particularmente sensible a la humedad y una pequena cantidad puede provocar un gran cambio en la razon de reflectancia. El fondo blanco tambien es sensible al color de orina y pequenas cantidades pueden provocar grandes cambios en la razon de reflectancia. Como resultado, tal razon de reflectancia no puede usarse para medir de manera precisa la humedad tras la inmersion de la tira en orina.
En la presente invencion, se anade un colorante infrarrojo de referencia que tiene una respuesta caractenstica a la luz a una longitud de onda al menos 120 nm mayor que el intervalo de 520-570 nm. Se ha encontrado que la longitud de onda del colorante IR y la cantidad usada afectan a la precision de mediciones reduciendo la interferencia de fondo. La adicion de un colorante IR a los reactivos de leucocitos proporciona un color de fondo menor de < = 60% de reflectancia a >=700 y 2500 nm. Este fondo menor reduce el efecto del color de orina sobre la razon de reflectancia, pero no el efecto de la humedad. Por tanto, la razon de reflectancia puede usarse para medir de manera precisa la humedad tras la inmersion de una muestra en orina.
Sin embargo, este color de fondo menor de < = 60% de reflectancia a >=700 y 2500 nm puede reducir la capacidad de los reactivos para detectar la hidrolisis de sustratos proteolfticos. Este efecto se muestra en la siguiente tabla, en la que el efecto del color de fondo del sustrato de reactivo se reduce a medida que se reduce la cantidad del colorante IR. La cantidad de colorante IR que puede tolerar un reactivo depende de la longitud de onda de referencia usada para medir el fondo, la longitud de onda de la senal de los sustratos, la sensibilidad del sustrato a la humedad, y la sensibilidad del sustrato a la hidrolisis de proteasa y la cantidad de senal de colorante de fondo < 700 nm. La tolerancia de cualquier sustrato de hidrolisis dado puede determinarse tal como se muestra en la tabla 1 en la que la reduccion deseada de interferencia de fondo con relacion al color en la muestra se produce a mas de 0,2 mg/dl, o aproximadamente al 0,5% en peso con relacion al colorante de referencia. Sin embargo, cuando se aumenta la cantidad de colorante hasta 20 mg/dl, la razon de reflectancia se aumenta hasta 1,6 y la senal se reduce desde la senal de ~1,0 esperada. Por tanto la cantidad de colorante usada debe limitarse a la que se necesita para minimizar la interferencia de fondo.
Tabla 1
Colorante (1) mg/dl
Razon de reflectancia 570/690 nm (2) Interferencia de fondo (3)
20
1,649 3%
2
1,042 4%
0,2
0,976 5%
0,02
0,967 22%
0
0,964 45%
(1) DTO 141 que es el colorante 3 en la tabla 2 del documento U.S. 6.316.264 y tiene el nombre qmmico 3-(5-
carboxipentil)-2-[2-[3-[[3-(5-carboxipentil)-1,3-dihidro-1,1-dimentil-2H-benzo[e]indol-2-iliden]etilideno)-2-(n-
hexiltio)-1-ciclohexen-1-il]etenil]-1,1-dimetil-1H-benzo[e]indolio, sal interna.
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(2) Reaccion con respecto a leucocitos 42 celulas/|il en orina, en orina de densidad relativa media y medida usando el instrumento CLINITEK Status® (Siemens Healthcare Diagnositics).
(3) Diferencia entre una orina clmica marron muy coloreada y una orina amarilla coloreada de forma normal.
Ambas orinas carecian de leucocitos y se midieron usando el instrumento CLINITEK Status®_____________
En el experimento anterior, se preparo el reactivo de leucocitos a partir de dos saturaciones secuenciales de papel de filtro. La primera saturacion fue con una mezcla acuosa que contema acido borico, Bio-Terge AS40, polfmero PVP y NaCl para controlar la resistencia ionica. Se ajusto el pH de la mezcla a de 8,8 a 9,3 usando hidroxido de sodio o acido clorlmdrico. La segunda saturacion fue una mezcla de disolventes de acetona/DMSO que contema DNSA, PPTA, decanol y acido borico. En la tabla siguiente se facilitan las funciones de cada componente, la concentracion preferida y el intervalo permitido. Se usaron las disoluciones de la mezcla para saturar el papel de filtro, en este caso papel de filtro Ahlstrom de calidad 205C, y se seco el papel a 121°C durante 9 minutos tras la primera saturacion, y a 100°C durante 7 minutos tras la segunda saturacion. Se proceso el reactivo seco resultante para dar tiras de reactivos que se sometieron a prueba usando el instrumento CLINITEK Status®.
Tabla 2
Componente
Funcion Concentracion pref. usada Intervalo permitido
1a aplicacion
Agua
Disolvente 1000 ml —
NaCl
Agente de resistencia ionica 14,6 g 1-30 g/l
Bio-Terge AS40
Tensioactivo 2 g 0-4 g/l
Acido borico
Tampon 24,7 g 5-35 g/l
PVP
Polfmero 20,0 g 5-50 g/l
2a aplicacion
Acetona
Disolvente 955 ml —
DMSO
Disolvente 30 ml 10-60 ml
DNSA
Indicador de diazonio 0,174 g 0,050-0,5 g/l
PPTA
Sustrato de enzima 0,422 g 0,10-0,8 g/l
Decanol
Activador de enzima 15 ml 5-40 ml/l
Acido borico
Tampon 0,5 g 0-3,0 g/l
DNSA = acido 1-diazo-2-naftol-4-sulfonico
PPTA = ester de 2-hidroxi-5-fenil-pirrol-N-tosil-L-alanina
Pueden usarse diversos colorantes, incluyendo los descritos en la patente estadounidense 6.316.264 incorporada en el presente documento como referencia y que tienen absorbancia caractenstica en la region de infrarrojo de aproximadamente 700 a aproximadamente 2500 nm. Los ejemplos incluyen compuestos de ftalocianina y naftalocianina, colorantes de complejos metalicos (por ejemplo colorantes de complejos metalicos de ditioleno) y colorantes de polimetino, incluyendo colorantes de cianina. Otros colorantes incluyen colorantes de di y trifenilmetano, colorantes de quinona, colorantes de tipo azo, y colorantes de transferencia de carga y de resonancia de carga. Siendo su caractenstica comun que la reflectancia de luz a una unica longitud de onda se mide al menos 120 nm por encima que de la longitud de onda de reactivo. En relacion con los reactivos de leucocitos tratados anteriormente, el colorante debe tener una reflectancia caractenstica de al menos 700 nm, preferiblemente por encima de 700 y de menos de 2500 nm.
Aunque incluir el colorante de referencia con los reactivos de leucocitos es una realizacion preferida, tambien es posible colocar el colorante de referencia en otra ubicacion, como se hizo para fines de alinear una tira reactiva (documento U.S. 6.316.264). Los cambios debidos a la humedad que se producen cuando el colorante entra en contacto con la muestra pueden diferenciarse de los que se producen cuando el colorante esta dentro de los reactivos. Sin embargo, los expertos en la tecnica pueden adaptarse a tales diferencias.
Deteccion de contaminacion por humedad en una tira reactiva de leucocito
Tal como se trato anteriormente, la humedad provoca que los reactivos de leucocitos degraden y produzcan un cambio de color falso. Las enzimas en los leucocitos no se necesitan para hidrolizar el sustrato proteolftico, por ejemplo PPTA. Se ha encontrado que los reactivos son sensibles a una humedad de tan solo el 0,1% en una almohadilla de reactivo de leucocitos. La velocidad de cambio de color es de manera esencial directamente proporcional a la cantidad de agua presente. La importancia del control de humedad ambiental resulta evidente cuando, tras 10 minutos de exposicion a >60% de humedad relativa, la prueba proporciona resultados falsos positivos.
Esta sensibilidad a la humedad se usa en la invencion para determinar si una almohadilla de reactivo se ha contaminado con humedad. El cambio de color se determina primero a aproximadamente 20 segundos despues de aplicarse una muestra de orina. Si se detecta color tras 20 segundos, entonces se sospecha contaminacion por humedad. Esto se confirma si el color no ha aumentado significativamente tras 60 segundos, es decir, se ha
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reducido la actividad de los reactivos. Este metodo se confirmo en un experimento en el que se expusieron tiras reactivas a 30°C al 80% de humedad ambiental durante 10 minutos, condiciones que se sabe que provocan el fallo de los reactivos. Se encontro que veintitres de veinticuatro tiras habfan fallado cuando se uso la razon de la reflectancia a 520 nm con respecto a la reflectancia a 820 nm. La cantidad del colorante DTO 141 aplicado fue de 0,2 mg/dl, con relacion a 42 mg/dl de PPTA de los reactivos de leucocitos. Un experimento paralelo en el que solo se midio la reflectancia a 520 nm, es decir sin colorante presente, no logro detectar tiras contaminadas por humedad en el 42% de las tiras, esto tambien fue verdad cuando se uso una razon de reflectancia de 520 nm/870 nm, pero sin colorante presente.
En el metodo de la invencion tambien se tiene en cuenta la influencia del color en la muestra de orina. Se mide el color de muestra mediante la absorbancia de luz a aproximadamente 460 nm (dentro del rango visible). Con el fin de afectar a la medicion de color desarrollado mediante los reactivos de leucocitos, se determina una nueva razon, es decir se divide la reflectancia a aproximadamente 460 nm (por color de muestra) entre la reflectancia a aproximadamente 625 nm. Esta razon evita que se considere que muestras de orina oscuras estan comprometidas por la humedad ambiental. Si la razon (multiplicada por 1000) esta por encima de 600, el color de muestra es claro y la reflectancia es alta. Si es asf, entonces se confirmara que la tira que esta sometiendose a prueba esta comprometida por la humedad ambiental si las razones de reflectancia a 20 y 60 segundos han indicado que la tira esta respondiendo de una manera anomala. Si la razon esta por debajo de 600, la muestra tiene un color oscuro que puede haber afectado a los resultados y no se rechaza la tira si los resultados a 20 y 60 segundos han sido satisfactorios.
La diferencia entre la razon de reflectancia a 525 nm con respecto a la reflectancia a 825 nm tomadas a 20 y 60 segundos tras aplicar una muestra, se usa para determinar si los reactivos se han degradado por la humedad. En general, si la primera lectura (20 s) da una razon de menos de aproximadamente 700 (razon x 1000), entonces se indica humedad ambiental en exceso ya que la reflectancia a 525 indica que ya se habfa desarrollado un color significativo. Si la segunda lectura se toma a 60 segundos y se compara con la primera lectura y la diferencia en las lecturas es de menos de aproximadamente 50 (razon x 1000), entonces se confirma la presencia de humedad ambiental en exceso ya que los reactivos han perdido su actividad normal.
Por ejemplo, se miden tres valores cuando los reactivos incluyen PPTA y DNSA y el colorante de referencia es DTO 141.
Tabla 3
Razon, nm Tiempo Razon de valor cntico x 1000 significado
L20
525/845 20 s < 700 Humedad ambiental de en exceso absorcion alta probable
L60
525/845 60 s L20 - L60 <50 Humedad ambiental que reduce actividad de reactivo
H
470/625 40 y 60 segundos > 600 Muestra de alta reflectancia de color claro
Aplicar estos valores a las lecturas segun el procedimiento mostrado en la figura 1 proporciona el rechazo de resultados por estar comprometidos por la humedad ambiental o la notificacion de leucocitos medidos en la muestra. En un ejemplo, se usa un instrumento CLINITEK Status® para analizar la muestra de orina para determinar la presencia de leucocitos. En una tira absorbente (por ejemplo papel de filtro) saturada con disoluciones de reactivo tal como se describio anteriormente en la tabla 2 se aplica una muestra de orina y se miden los cambios de color resultantes mediante reflectancia luminosa en el instrumento CLINITEK Status® segun el procedimiento de la invencion.
Si el valor medido de L20-L60 es de menos de 50, es posible que la humedad ambiental en exceso haya reducido la actividad de reactivo de leucocitos. Si esta por encima de 50, entonces puede usarse el valor de L20-L60 para calcular la concentracion de leucocitos en la muestra. Sin embargo aunque este por debajo de 50, todavfa es posible que la razon 525/845 nm pueda proporcionar una concentracion de leucocitos. Se considera el valor inicial de la razon 525/845 nm (L20). Si el valor esta por debajo de 700 (razon x 1000) entonces se indica una alta absorcion de luz a 525 nm, lo que sugiere que puede haber estado presente humedad ambiental en exceso en la almohadilla de prueba. Entonces, en combinacion con el resultado de L20-L60, es probable que los reactivos de leucocitos se hayan visto comprometidos por humedad ambiental en exceso. Pero, ya que los resultados pueden haberse visto influidos por una muestra inusualmente oscura, se mide la razon H, 470/625 nm. Si el resultado esta por encima de 600 (razon x 1000), se indica una alta reflectancia, lo que significa que la muestra no se ha coloreado mucho. Si es asf, entonces se considera que los reactivos de leucocitos se han visto comprometidos por alta humedad ambiental. Si la muestra es oscura, es decir la razon cntica H esta por debajo de 600, pero los valores anteriormente determinados de L20-L60 y L20 eran aceptables, entonces se considera que la muestra no se ha visto comprometida y se calcula el contenido en leucocitos.
Debe entenderse que las longitudes de onda luminosas espedficas y los tiempos de medicion que acaban de describirse son utiles para determinar la presencia de leucocitos en muestras de orina con las cantidades de los reactivos descritas. Sin embargo, el metodo tiene aplicacion mas generalmente a muchos otros reactivos que son 5 sensibles a la humedad y aun asf se usan para detectar muestras que contienen agua. Los expertos en la tecnica deben establecer facilmente protocolos de deteccion apropiados tras haber revisado la invencion dada a conocer por los presentes inventores.
Tal como se ilustro anteriormente, el instrumento Clinitek Status® aparato es util para llevar a cabo el metodo de la 10 invencion. Se describen aspectos de este instrumento en las patentes estadounidenses 6.239.445; 5.877.863; 5.477.326; y 5.408.535, que se incorporan en el presente documento como referencia. El instrumento Clinitek Status® es un espectroscopio de reflectancia en el que se ilumina una tira reactiva que porta una muestra mediante una fuente de luz y se detecta y se usa la luz reflejada a partir de la tira reactiva para determinar la presencia y cantidad del analito en la muestra. El funcionamiento de espectrofotometros tambien se trata en la patente 15 estadounidense 6.316.264, citada anteriormente. Tal como se indica en ese documento, tambien puede usarse un aparato de tipo camara, que crea una imagen de multipfxeles para llevar a cabo el metodo de la invencion.

Claims (5)

  1. 10 2.
  2. 3. 15
  3. 4.
    20
  4. 5.
    25 6.
  5. 7.
    REIVINDICACIONES
    Uso de un colorante infrarrojo como referencia en un metodo de deteccion de un reactivo sensible a la humedad comprometido por la humedad ambiental dispuesto en una tira reactiva, en el que el reactivo sensible a la humedad se basa en sustratos proteolfticos para detectar enzimas de proteasa o inhibidores de proteasa, incluyendo dicho reactivo sensible a la humedad una sal de diazonio y desarrollando color u otra respuesta justo despues de aplicar una muestra, color u otra respuesta que se mide y se compara con el colorante infrarrojo de referencia.
    Uso segun la reivindicacion 1, en el que el colorante infrarrojo se combina con dicho reactivo sensible a la humedad.
    Uso segun la reivindicacion 1, en el que el colorante infrarrojo se ubica de forma separada de dicho reactivo sensible a la humedad.
    Uso segun una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el colorante infrarrojo se selecciona del grupo que consiste en ftalocianina, naftalocianina, colorantes de complejos metalicos, preferiblemente colorantes de complejos metalicos de ditioleno, colorantes de polimetino, colorantes de cianina, colorantes de difenilmetano, colorantes de trifenilmetano, colorantes de quinona, colorantes de tipo azo, colorantes de transferencia de carga y colorantes de resonancia de carga.
    Uso segun una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el colorante infrarrojo tiene una absorbancia caractenstica en la region de infrarrojo de aproximadamente 700 a aproximadamente 2500 nm.
    Uso segun una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el reactivo sensible a la humedad es un reactivo para detectar leucocitos en muestras de orina.
    Uso segun la reivindicacion 6 en el que la sal de diazonio es acido 1-diazo-2-naftol-4-sulfonico.
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