JPS62206432A - 酵素活性の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野］ 本発明は液体試料中の被検物質の濃度または酵素活性を
、被検物質の存在下に生成する有色物質の光学的測定に
よって定量する方法の改良に関する。

「従来技術」 血液等の液体中の特定成分の濃度または活性値を測定す
ることは、特に臨床検査において重要である。例えば血
液中の酵素活性値は疾患部の所在と病変の程度を推定す
るのに利用されている。

被検物質の存在下に生成する有色物質の光学的測定によ
り液体試料中の被検物質の濃度または酵素活性を定量す
る方法は広く利用されている。

被検物質の存在下に有色物質を生成する試薬−−いわゆ
る呈色指示薬−−とじては、有色物質を生成する反応の
種類により種々の系統のものがある。それらの中て、被
検物質の存在下に生成される過酸化水耕１により呈色す
るロイコ色素は、分子吸光係数が比教的大きく、特に体
液中の酵素のごとく正常値の低い被検物質く以下アナラ
イ１〜と言うことがある）の定量において有用なもので
ある。

しかしこの種の呈色指示薬は、生成した色素の安定性が
悪く、測定中に目立って退色する欠点かある。反応速度
法により酵素活性などを測定する場合には、この色素の
退色のために負の誤差が生じ、分析の精度を損なう。

反応速度法とは、反応の結果生ずる変化、例えば呈色指
示薬の光学濃度をある時間間隔でｍ−例えば１０秒おき
にｍ−測定し、単位時間（例えば１分）あたりの濃度変
化を測定し、既知濃度（または活性）のアナライトを含
む液を用いて、あらかじめ作成しておいた検量線より、
濃度または活性値を得る方法である。

生物体液中の成分、特に酵素活性の定量には、一般に反
応速度法が用いられる。対象とされる酵素には　リパー
ゼ、アミラーゼ、ガンマグルタミルトランスペプチダー
ゼ（ＧＧＴ）　、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）
、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アス
パラギンアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレア
チニンキナーゼ（ＣＰＫ）、ラクテートデヒドロゲナー
ゼ（ＬＤＨ）、コリンエステラーゼ（ＣＬＥ）等がある
。酵素以外にも、反応速度法を利用した例があり、米国
エイムズ社セラライザーではグルコースや尿素窒素に用
いられる。例えば、アラニンアミントランスフェラーゼ
（ＡＬＴ）やアスパラギンアミノトランスフェラーゼ（
ＡＳＴ）の血中濃度は、肝疾患の診断にあたって重要で
ある。

例えばＡＬＴの活性を測定するには、基質にＡＬＴを作
用させてピルビン酸を生成さぜ、生成したピルビン酸と
ピルビン酸オキシダーゼの作用により過酸化水素を発生
させ、過酸化水素に感応する呈色指示薬の発色（通常ペ
ルオキシダーゼの存在下で）を測定する方法がある。

同様に、ＡＳＴの活性を測定するには、α−ケトゲルタ
ール酸を基質として生成するオキザロ酢酸を、オキザロ
酢酸脱炭酸酵素によってピルビン酸に変換し、以下ＡＬ
Ｔと同様の過程て呈色指示薬の発色を測定する方法があ
る。

これらの分析方法を用いる場合、血液等にはピルビン酸
（いわゆる内因性ピルビン酸）が存在するため、このピ
ルビン酸に相当する分だけ最終的に検出される呈色に（
＝１加される。内因性ピルビン酸による発色は、ＡＬＴ
に由来する発色に先立つて終了しており、その点では、
ＡＬＴに由来する発色速度には余り影響しないはずであ
るが、実際には影響かあり、発色速度を見掛は上減少さ
せる。

それは、色素の退色の大きさは生成した色素の総量に依
存するため、色素の絶対量が内因性ピルビン酸由来の分
たけ多いと、内因性ピルビン酸がないとき、または少な
いときに比べて、反応速度測定中における退色か大きい
からである。

「発明の目的］ 本発明の目的は被検物質の存在下に少なくとも２段階の
反応を経て生成する有色物質の光学的測定により、反応
速度法にもとすいて液体試料中の被検物質の濃度または
酵素活性を定量する方法において、該有色物質が時間的
に変色、退色または分解するために起きる負の分析誤差
を除去することにある。

本発明の目的は、特に、酵素の存在下に、ピルビン酸か
中間生成物として介在する少なくとも２段階の反応を経
て生成する有色物質の光学的測定により、反応速度法に
もとすいて液体試料中の酵素話性を定量する方法におい
て、試料液体中に内因性ピルビン酸が存在する場合に、
該有色物質が時間的に退色するために起きる負の分析誤
差を除去することにある。

［発明の構成］ 本発明の上記目的は、被検物質の存在下に少なくとも２
段階の反応を経て生成する有色物質の光学的測定により
、反応速度法にもとすいて液体試料中の被検物質の濃度
または酵素活性を定量する方法において、 ｊ）分析に利用される反応の中間生成物を既知の濃度ま
たは活性値で含む少なくとも二つの標準溶液を用い、反
応開始後時間Ｔ。て測定した前記有色物質の光学濃度値
とそれから一定時間Ｔ後の間の光学濃度値の減少量また
は単位時間当たりの平均減少量との間の相関式を求める
工程と、 ｉｉ〉前記被検物質を含む液体試料から生成した有色物
質の光学濃度を反応開始後１１４間ｔ。およびそれから
時間を後に測定し、時間ｔ。における光学濃度値を前記
相関式に代入し、時間ｔ。と時間ｔ。＋ｔの間における
光学濃度値の変化量Δを算出する工程と を含み、前記Δを前記工程ｉｉ）における２回の測定の
間、ずなわち時間ｔ。から時間ｔ。＋ｔの間における光
学濃度変化の補正値として、反応速度法により液体試料
中の被検物質の濃度または酵素活性を定量する方法によ
って達成された。

本発明の上記目的は、さらに、被検物質の存在下に少な
くとも２段階の反応を経て生成する有色物質の光学的測
定により、液体試料中の被検物質の濃度または酵素活性
を定量する方法において、ｉ）利用される反応の中間生
成物を既知の濃度または活性値で含む少なくとも二つの
標準溶液を用い、反応開始後時間Ｔ０て測定した前記有
色物質の光学濃度値と、それから時間Ｔ後の間の光学濃
度値の減少量または単位時間当たりの平均減少量との間
の相関式を求める工程と、ｉｉ）前記被検物質を含む液
体試料から生成した有色物質の光学濃度を反応開始後時
間Ｔ。およびそれから時間を後に測定し、時間Ｔ。にお
ける光学濃度値を前記相関式に代入し、時間Ｔ。と時間
Ｔ。＋ｔの間における光学濃度値の変化量Δを算出する
工程と を含み、前記Δを時間Ｔ。と時間Ｔ。＋ｔの間における
光学濃度値の変化ｌ、の補正値として、反応速度法によ
り液体試料中の被検物質の濃度または酵素活性を定量す
る方法によって、好ましく達成された。

本発明は例えば、基質にＡＬＴを作用させてピルビン酸
を生成させ、生成したピルビン酸とピルビン酸オキシダ
ーゼの作用により過酸化水素を発生させ、過酸化水素に
感応する呈色指示薬の発色（通常ペルオキシダーゼの存
在下で〉を測定してＡＬＴの活性を定量する方法や、α
−ケトゲルタール酸を基質として生成するオキザロ酢酸
を、オキザロ酢酸脱炭酸酵素によってピルビン酸に変換
し、以下ＡＬＴと同様の過程で呈色指示薬の発色を測定
してＡＳＴの活性を測定する方法に、適用することがで
きる。

少なくとも２段階の反応とは例えば、前記Ａ、　ＬＴの
活性定量方法において １）アラニンにＡＬＴを作用させてピルビン酸を生成さ
せ、 ２）生成したピルビン酸とピルビン酸オキシダーゼの作
用により過酸化水素を発生させ、３〉ペルオキシダーゼ
の存在下で過酸化水素に感応する呈色指示薬を発色させ
る 反応てあり、前記ＡＳＴの活性定量方法において１）α
−ケトゲルタール酸を基質としてオキザロ酢酸を生成さ
せ、 ２）オキザロ酢酸脱炭酸酵素によってピルビン酸に変換
し、 ３）生成したピルビン酸とピルビン酸オキシダーゼの作
用により過酸化水素を発生させ、４）ペルオキシダーゼ
の存在下で過酸化水素に感応する呈色指示薬を発色させ
る 反応である。

前記のＡＬＴまたはＡＳＴの活性測定の場合、前記工程
ｊ）に用いる（標準溶液に含まれる）反応中間生成物と
しては、ピルビン酸または過酸化水素を利用することが
出来る。しかし、安定な結晶状層て入手できるピルビン
酸が好ましい。

前記工程ｊ）に用いる標準溶液は、粘度等が被検液に類
似するように調製することが好ましい。

例えば、被検液が生物体液であれば、アルブミン等のた
ん白質のン容液とする。

前記工程ｉ）において、標準溶液は少なくとも２通りの
濃度のものを用いるが、工程ｉ）て得られる相関式の信
頼性を高めるためには、出来るだけ多種の濃度の標準溶
液について実施することが好ましい。

前記工程ｉ）の測定において、乾式分析要素に」１記標
準溶液を点着する場合には、点着量は乾式分析要素が要
求する液体試料の点着量の範囲、好ましくは実際の分析
に採用する点着量と同一とするのが好ましい。また測定
は、実際の分析の場合と同し条件（温度、測定機器等）
で行うのが好ましい。

前記工程ｉ）において、時間ＴＯとしては、実際の分析
において最初に有色物質の光学濃度測定を行う時間を選
ぶのが好ましい。工程ｉ）で作成する相関式の形式は特
に制限されないが、時間Ｔ、における光学濃度値（ＯＤ
）と、その後の時間Ｔの間における光学濃度の単位時間
当たり平均減少量（例えばΔＯＤ／ｍ１ｎ）との間の関
数、好ましくは代数関数の形であることが好ましい。特
に、２ないし５次の多次式が好ましい。指数関数あるい
は対数関数であってもよい。

前記工程ｉｉ）のための測定は、反応液または乾式分析
要素を、例えばインキュベーター中で、一定温度（好ま
しくは五〇、２℃）に保ち、反応開始後時間ｔ。と時間
ｔ。＋ｔにおける光学濃度（透過または反射）を測定す
る。光学濃度計はインキュベーターと一体になっていて
もよい。

被検液または被検物質を含む標準溶液（例えば管理血清
）を添加または点着した後時間ｔ。における透過または
反射光学濃度値を前記の相関式に代入し、時間ｔ。＋先
における光学濃度の減少量を求める。相関式が、時間Ｔ
。における光学濃度−１２＝ ［（ＯＤ）と、時間Ｔの間における光学濃度の単位時間
当たり平均減少量（例えば八〇Ｄ／ｍ１ｎ）との間の関
数の形である場合には、 （ΔＯＤ／ｍ１ｎ）　Ｘ　ｔ　　　により算出する。

工程ｉ）におけるＴ。と工程ｉｉ）におけるｔ。とは同
じでなくてもよいが、 Ｔｏ≦ｔｏ＜Ｔｏ＋Ｔ であることが好ましく、また工程ｉ）におけるＴｏ十Ｔ
と工程ｉｉ）におけるｔ。＋ｔとはｔ　ｏ　＋　ｔ≦Ｔ
、十Ｔ であることが好ましい。

Ｔｏ−ｔｏ、　　Ｔｏ＋Ｔ＝ｔｏ＋ｔ であることが特に好ましい。

酵素活性の測定においては一般に、酵素活性値と有色物
質（例えば、染料）にもとすく光学濃度とを対応させて
、検量線を作成する。検量線の作成には、基準分析法（
例えば、用手湿式法）により酵素活性値の検定されてい
る２以上の標準液を用いて、試薬溶液の（への）添加ま
たは乾式分析要素への点着後、適当な時間ｔを隔てて少
なくとも２回、光学濃度を測定し、光学濃度の変化量ま
たは単位時間当たりの平均変化量を求める。本発明を適
用するためには、前記工程ｉ）によって求めた相関式に
より、前記各光学濃度測定値に対する補正値を定め、前
記光学濃度の変化量または単位時間当たりの平均変化量
を補正する。そして、標準液の酵素活性値と、前記のよ
うに補正された光学濃度の変化量または単位時間当たり
の平均変化量の間の検量線を作成する。この工程におい
て、標準溶液は少なくとも２通りの濃度のものを用いる
が、ｔｚられる検量線の信頼性を高めるためには、出来
るたけ多種の濃度の標準溶液について実施することが好
ましい。検量線の作成に用いる標準溶液は、粘度等が被
検液に類似するように調製することが好ましい。例えば
、被検液が生物体液であれば、アルブミン等のたん白質
の溶液とする。標準液は市販の標準酵素ザンプルを用い
て容易に調製てきる。またヒＩ・血清を用いることもで
きる。

検量線を作成するための測定には、反応液または乾式分
析要素を、例えばインキュベーク中で、一定温度（好ま
しくは±０．２℃）に保ち、反応開始後時間ｔ。と時間
ｔ。＋ｔにおける透過または反射光学濃度を測定する。

光学濃度計はインキュベータと一体になっていてもよい
。検量線を作成するための測定において、乾式分析要素
に上記標準溶液を点着する場合に、点着量は乾式分析要
素が要求する液体試料の点着量の範囲、好ましくは実際
の分析に採用する点着量と同一とするのが好ましい。ま
た測定は、実際の分析の場合と同じ条件（温度、測定機
器等）で行うのが好ましい。

また、検量線を作成するための少なくとも２回の光学濃
度測定のうち最初の測定の時間としては、実際の分析に
おいて最初に有色物質の光学濃度測定を行う時間を選ぶ
のが好ましい。かつ、前記工程ｉ〉で用いた時間Ｔ。と
も一致していることが好ましい。

検量線を相関式で表す場合、作成する相関式の形式は特
に制限されないが、酵素活性値と、時間ｔｏとｔ　ｏ　
＋　ｔの間における光学濃度の単位時間当たり平均変化
量（例えばΔＯＤ／ｍ１ｎ）の本発明により補正された
値との間の関数、好ましくは代数関数の形であることが
好ましい。特に、２ないし５次の多次式が好ましい。指
数関数あるいは対数関数であってもよい。

前記工程ｉ）の相関式及び／または検量線は、測定機（
いわゆるアナライザー）の中に記憶させておくことがで
きる。

以下に、本発明の方法を、実施例によりさらに詳細に説
明する。

［実施例１コ ゼラチン下塗りされている厚さ１８０μｍのポリエチレ
ンテレフタレート無色透明平泪フィルム上に下記の組成
（ａ）の水溶液を乾燥後の厚さが１５μｍになるように
塗布（１５６ｃｃ／ｍ２）　Ｌ、乾燥した（試薬層）。

（ａ） ゼラチン　　　　　　　　　　　１９０ｇ界面活性剤　
　　　　　　　　　　　８ｇ（オリン社製５ｕｒｆａｃ
ｔａｎｔ　ＬＯＧ　）ペルオキシダーゼ　　　　　　　
１５万ＩＵＦＡＤ　　　　　　　　　　　　　２４０ｍ
ｇＴＰＰ　　　　　　　　　　　　１０００ｍｇピルビ
ン酸オキシダーゼ　　　　　１５万ＩＵ色素（下記構造
）　　　　　　　　　　３．０ｇ水　　　　　　　　　
　　　　　　　　１３６０ｇ（希ＮａＯＨ溶液てｐＨを
７．０に調整する）色素： ２−（３，５−ｄｉｍｅｔｌ＋ｏｘｙ−４−ｈｙｄｒｏ
ｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４−ｐｌ＋ｅｎｅｔｈｙ　ｌ　−
５−（４−ｄ　ｉｍｅ　Ｌｌ＋ｙａ＋ｎ　ｉ　ｎｏｐｂ
ｅｎｙ　ｌ　）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ 次に上記試薬層上に下記の組成（ｂ）の水溶液を乾燥後
の厚さが３μｍになるように塗布しく６０ｃｃ／ｒｎ２
）、乾燥する。（接着層）（ｂ） ゼラチン　　　　　　　　　　　４０ｇ界面活性剤　　
　　　　　　　　　　１．６ｇ（オリン社製５ｕｒｆａ
ｃｔａｎｔ　１．０Ｇ　）水　　　　　　　’　　　　
　　　　　　　　６００ｇ（希ＮａＯＨ溶液でｐＨを７
．０に調整する）次に上記ゼラチン層（接着層）上に約
３０　ｇ７ｍ２の割合で水を全面に供給して湿潤させた
後、ポリニスデル製のブロード織ｅＪ　（空げき体積９
．８μＩ／ｍ２）を軽く圧力をかけてラミネー１へし、
乾燥させたく展開層）。

次にこの布（展開層）に下記の組成（ｃ）の水溶液を１
．００　ｃｃ／　ｍ　２の割合でほぼ均一に塗布し、乾
燥させ、ＡＬＴ活性測定用一体型多層分析要素を作製し
た。

（ｃ） トリスヒドロキシメチルアミノメタン ２．２ｇ リン酸１カリウム　　　　　　　　　　４．５ｇα−ケ
トゲルタール酸す１−リウム　　４．Ｏｇヒドロキシプ
ロピルメヂルセルロース＊８．７ｇ 界面活性剤＊＊　　　　　　　　　　　２７ｇ酸化チタ
ン（ルヂル型＞　　　　　　　７０ｇ塩化マグネシウム
　　　　　　　　　２．４ｇ水　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　８８０　　ｇ（希Ｎ　ａ　ＯＨ溶液て
ｐ　Ｈを７．５に調整する）＊信越化学（株）製　メＩ
〜ローズ９０　ＳＨ１００＊＊ポリオキシエチレンオク
チルフェニルエーテル上記の分析要素に第１表に示すご
とき濃度のピルビン酸リチウムを含む７％ヒト血清アル
ブミン（ＨＳΔ）を、１０μβ点着し、分析要素を密閉
容器中で３７℃に保った際の、２．５分後の光学濃度、
および２．５分後から３．５分後までの１分間の光学濃
度変化を波長６４．０　ｎ　ｍで測定し、この両者の関
係を２次式で近似した。測定結果を第１表および第１図
に、求めた近似式を下記（Ａ）に示す。

第１表 Δ／ｍ１ｎ＝　　０．２１３４７５［：○Ｄ　（２，５
’　）］？−０，０９３０３１［ＯＤ　（２，５°）］
＋０．００４０８８　　（Ａ　）前記のＡＬＴ活性分析
要素に、既知の異なるＡＬＴ活性値を有する管理血清を
１０μｐ点着し、密閉容器中で３７℃に保った際の、２
．５分後の光学濃度値ＯＤ　（２，５’　）および２．
５分後がら３．５分後までの１分間の光学濃度（波長６
４．　Ｏｎ　ｍ　）変化を測定し、第２図中に■として
示す仮の検量線を作成した。

測定した２、５分後の光学濃度値ＯＤ　（２，５”）を
式（Ａ）に代入することによりΔ／　ｍ　ｉ　ｎを算出
した。ＯＤ　（２，５°）およびΔ／　ｍ　ｉ　ｎの値
は第２表に示す通りであった。

第２表 このΔ／　＋ｎ　ｉ　ｎの値を補正量として、検量線作
成の際に用いた２、５分後から３．５分後までの１分間
の光学濃度変化の値を補正すると、第２図■に示す補正
済検量線が得られた。

［実施例２］ ６０　Ｕ／ＬのＡＬＴとともに第２表に示す濃度のピル
ビン酸を含む管理血清を、実施例１において作製したＡ
ＬＴ活性分析要素に各１０μβ点着し、密閉容器中て３
７℃に保った際の、２．５分後から３．５分後までの１
分間の光学濃度（波長６４０　ｎ　ｍ　）変化を測定し
、検量線によってＡＬＴ活性を算出した。その際、実施
例１において得た仮の検量線（第二図の■）および補正
済検量線（第２図の■）をそれぞれ用いた場合の測定結
果を、第３表に示す。

第３表 補正をしない場合はピルビン酸濃度（内因性ピルビン酸
に相当）の増加とともにＡＬＴ活性の測定値に負の誤差
が生じているが、補正をした場合はピルビン酸の影響を
受けていないことが、第３表から明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で作成したＯ　Ｄ　＜２．５’　）と
Δ／　ｍ　ｉ　ｎとの相関図、第２図は実施例１て作成
した検量線を示すグラフである。 出願人　　富士写真フィルム株式会社 第１図 、”Ｌｌ　　＊Ｌ１４　　、ｔＪ８　．１ン　、１ｂ、
７６０　　ａ−ｂ　　２”３０” 第２図 ｄ６Ｄ＋、／ｍｌｎ 手続補正書

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）被検物質の存在下に少なくとも２段階の反応を経て
   生成する有色物質の光学的測定により液体試料中の被検
   物質の濃度または酵素活性を定量する方法において ｉ）分析に利用される反応の出発物質または中間生成物
   を既知の濃度または活性値で含む少なくとも二つの標準
   溶液を用い、反応開始後時間Ｔ＿０で測定した前記有色
   物質の光学濃度値と、それから一定時間Ｔ後の間の光学
   濃度値の減少量または単位時間当たりの平均減少量との
   間の相関式を求める工程と、 ｉｉ）前記被検物質を含む液体試料から生成した有色物
   質の光学濃度を反応開始後時間ｔ＿０およびそれからさ
   らに時間ｔ後に測定し、時間ｔ＿０における光学濃度値
   を前記相関式に代入し、時間を後における光学濃度値の
   変化量Δを算出する工程と を含み、前記Δを前記工程ｉｉ）における２回の測定の
   間、すなわちｔ＿０からｔ＿０＋ｔの間における光学濃
   度変化の補正値として、反応速度法により液体試料中の
   被検物質の濃度または酵素活性を定量する方法。 ２）前記工程ｉｉ）における時間ｔ＿０が前記工程ｉ）
   における時間Ｔ＿０と一致していることを特徴とする、
   特許請求の範囲１）の方法。 ３）前記工程ｉｉ）における時間ｔ＿０が前記工程ｉ）
   における時間Ｔ＿０と一致し、前記工程ｉｉ）における
   時間ｔが前記工程ｉ）における時間Ｔと一致しているこ
   とを特徴とする特許請求の範囲１）の方法。 ４）乾式分析要素に液体試料の一定量を点着して光学濃
   度の測定により該液体試料中の被検物質の濃度または酵
   素活性を測定する方法において、該乾式分析要素に前記
   標準溶液を点着して前記工程ｉ）により前記相関式を求
   め、前記被検物質を含む液体試料を該乾式分析要素に点
   着して前記工程ｉｉ）により前記相関式から光学濃度の
   変化量Δを算出し、時間ｔ＿０からｔ＿０＋ｔの間にお
   ける光学濃度変化の補正値とする事を特徴とする特許請
   求の範囲１）、２）または３）の方法。 ５）少なくとも２つの異なる既知の酵素活性値を有する
   標準液を用いて検量線を作成する際に、前記ｉ）の工程
   において求めた相関式を用いて、時間ｔ＿０とｔ＿０＋
   ｔの間における光学濃度の単位時間当たりの変化量を補
   正し、補正された検量線を用いて酵素活性を決定するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲１）、２）、３）または
   ４）の方法。