JPH0481438B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
［発明の分野］
本発明は、乾式分析要素を用いる酵素活性測定
方法に関する。さらに詳しくは本発明は、液体試
料中の酵素活性を、乾式分析要素を用い、反応速
度法を利用して測定する方法に関する。 ［発明の背景］ 臨床検査上、ヒトの血清等の液体試料中の酵素
活性を測定することは極めて重要である。すなわ
ち体液中の酵素活性値は、疾患部を推定し、患部
の損傷程度を推定する場合等において重要な知見
を与える。一方、臨床検査の領域においては診断
に関与する医師等の医療関係から、簡便な操作に
よる迅速な測定を求める強い要請がある。 これに答える方向として、従来用いられてきた
透過光学系を基本とする通常の溶液法に代えて、
反射光学系を基本とする乾式分析法が開発され、
近年その実用化が進められている。乾式分析方法
は、検出反応に必要な試薬類が乾燥状態でシート
上の要素内に保存されている乾式分折要素を使用
するものであり、この乾式分析要素に点着した液
体試料と上記試薬類と発色反応により形成される
染料の濃度を検出、測定するものである。特に乾
式分析要素のうち、取り扱いの簡便性および分析
精度がさらに向上した一体型多層分析要素は、
様々な種類のものが既に市販されている。 液体試料中の被検成分濃度の測定に一体型多層
分析要素等の乾式分析要素を用いる場合には、従
来より用いられている終点比点法で並行光源を用
いて直接測光される反射光学濃度（以下ODRと略
記）と染料濃度との対応づけをした検量線を作成
しておけば、通常の測定には何らの問題も生じな
かつた。 しかしながら、酵素の存在下で形成される染料
の濃度変化と反射光学濃度の変化とは直線性が成
立しない。一方、乾式分析要素による酵素活性測
定には多点反射測光による反応速度法の解析法が
必須であるところから、反所光学濃度（ODR）か
ら、直線性が成立する透過光学濃度（OTT）への
変換が必要で、その研究は古くからなされてい
る。理論的にはウイリアムズ（Williams）とク
ラツパー（Clapper）の提唱した変換式で、ODR
をODTに変換できることが明らかになつている
（ジヤーナル・オプテイカル・ソサエテイ・オ
ブ・アメリカ ［J.Optical Society of
America］Vol 43 No.７ 595〜599（1953）参
照）。しかし上記の変換式は各種のパラメーター
が複雑であるため、実用上においては、経験的に
定められた反射光学濃度値と透過光学濃度値との
相関式を利用して、反射光学濃度値の変化から透
過光学濃度値（形成された染料の濃度値に対応す
る値）の変化を算出し、その形成された染料の濃
度値の変化に基づき試験液体試料の酵素活性が測
定していた。 しかし、上記のような経験的に定められた反射
光学濃度値と透過光学濃度値との相関式は、その
適用可能範囲があいまいであり、所望の測定系に
おいて従来の変換式の信頼性が充分であるかの点
は明確でないとの欠点がある。 ［発明の目的］ 本発明は、簡単で、かつ信頼性の高い、液体試
料中の酵素活性を乾式分析要素を用い反応速度法
を利用して測定する方法を提供することを主な目
的とする。 本発明は、特に、測定機器を用い、液体試料中
の酵素活性を乾式分析要素を用い反応速度法を利
用して自動的に測定する際に特に有利な測定法を
提供することを主な目的とする。 ［発明の要旨］ 本発明は、測定対象の酵素に基質、及び酵素と
基質の反応に基づいて発色し、染料を形成する試
薬を含有する乾式分析要素に、酵素を含有する液
体試料を点着し、一定時間経過後に形成された染
料の濃度と、その後の一定時間経過後に形成され
た染料の濃度のそれぞれを反射光学濃度値として
測定し、その反射光学濃度の変化と、別に相関式
として形成した検量線とから上記液体試料の酸素
活性を測定する方法において、 () 別に用意した上記染料または共役反応を通
して上記染料を与えうる化学種を異なる濃度値
で含む二以上の標準溶液を、上記と同一種の二
以上の乾式分析要素にそれぞれ点着して、乾式
分析要素上に形成された染料面の反射光学濃度
値を測定し、次いで測定された反射光学濃度値
と上記標準溶液中の染料または上記化学種の濃
度値とから、染料または上記化学種の濃度値と
反射光学濃度値との相関式(1)を求める工程； () 別に用意した酵素活性値が既知の二以上の
標準液を上記乾式分析要素と同一種の乾式分析
要素にそれぞれ点着し、各々について一定時間
経過後に形成された染料の濃度と、その後の一
定時間経過後に形成された染料の濃度のそれぞ
れを反射光学濃度値として測定し、その反射光
学濃度値の変化と酵素活性値との関係、そして
上記の相関式(1)から、染料又は上記化学種の濃
度値の時間変動と酵素活性値との関係を示す相
関式(2)を作成する工程； () 乾式分析要素に被検液体試料を点着し、一
定時間経過後に形成された染料の濃度と、その
後の一定時間経過後に形成された染料の濃度の
それぞれを反射光学濃度値として測定し、その
反射光学濃度の変化を、相関式(1)を利用して、
染料または上記化学種の濃度値の変化として算
出する工程；そして ()上記（）の工程で得られた染料または上記
化学種の濃度値の変化を、相関式(2)を利用して
酵素活性値に変換する工程 を含むことを特徴とする反射光学系を用いる酵素
活性測定方法にある。 ［発明の効果］ 本発明の酵素活性測定方法によれば、液体試料
中の酵素活性を乾式分析要素を用い反応速度法を
利用して測定する際に、複雑な変換式を用いる必
要がなく、また測定された酵素活性値への信頼性
も高い。従つて、本発明は、特に、測定機器を用
いて、自動的に液体試料中の酵素活性を測定する
際に特に有利となる。 ［発明の詳細な記述］ 本発明にて使用する乾式分析要素は、酵素活性
測定用であれば特に他の制限はなく、公知のもの
を用いることができる。乾式分析要素の具体例と
しては、試験紙タイプのものとして、米国エイム
ズ（Ames）社より「セラライザー」及び西独国
ベーリンガー・マンハイム（Boehringer
Mannheim）社より「レフロトロン」の商品名で
それぞれ市販されているものを挙げることができ
る。また一体型多層分析要素としては、米国イー
ストマン・コダツク社より「エクタケム」、富士
写真フイルム株式会社より「ドライケム」の商品
名でそれぞれ市販されているものを挙げることが
できる。特に他に乾式分析要素の種類を限定する
条件がない場合には、取り扱いの簡便性および分
析精度の点から一体型多層分析要素を奏すること
が好ましい。またこれらの市販品の代りに各種文
献を参考にして、分析目的、検査項目等の条件に
対応した乾式分析要素を作成することもできる。 乾式分析要素の酵素活性検査項目としては、リ
パーゼ、アミラーゼ、GGT（γ−グルタミルトラ
ンスフエラーゼ）、ALP（アルカリ性フオスフア
ターゼ）、ALT（アラニン・アミノトランスフエ
ラーゼ）およびAST（アスパルテート・アミノト
ランスフエラーゼ）等のアミノトランスフエラー
ゼ、クレアチンキナーゼ（CK）、乳酸脱水素酵素
（LDH）、コリンエステラーゼ（ChE）等が挙げ
られるが、本発明の方法は一般に全ての酵素活性
の測定に適用することができる。 上記の酵素活性測定用乾式分析要素には、液体
試料中の酵素活性に基づいて染料（色素、発色生
成物）が生成されるために必要な試薬類が、他の
検出反応に必要な試薬類と共に保存されている。
よつて本発明における『染料』は、具体的には本
発明の実施において使用する乾式分析要素の種類
に対応して決定される。例えば、γ−グルタミル
−ｐ−ニトロアニリドとグリシルグリシンおよび
トリス塩を展開層中に含有するGGT活性測定用
一体型多層分析要素を用いる場合には、本発明に
おける『染料』は、GGT活性によりγ−グルタ
ミル−ｐ−ニトロアニリドより遊離するｐ−ニト
ロアニリンとなる。 また本発明において『共役反応を通して染料を
与えうる化学種』とは、活性測定対象の酵素反応
またはそれに共役する化学反応の生成物あるいは
生成する補酵素で、酵素反応と共役する化学反応
により化学量論に従つて上記染料を形成しうる化
合物を意味する。本発明の各工程において上記化
学種を染料に代えて使用することは、生成する染
料が水に難溶性で染料の標準溶液の調製が困難な
場合に特に有効である。 たとえば、LDH測定等でＬ→Ｐ型反応として
公知の反応例では、補酵素NADH（ニコチン酸ア
ミド・ジヌクレオチド（還元型）が系に生成して
来るので、本反応に電子伝達系を関与させてテト
ラゾリウム塩を還元し、生成するホルマザン色素
の生成速度でLDH活性を可視スペクトル域で定
量する方法が提案されている（A.L.BABSON et
al.CLINICA ACTA 12（1965）210〜215頁参
照）。この様な系では生成するホルマザン染料が
難溶性であり、染料標準液を作成するのが困難で
ある。この様な時には、比較的安定性が高く、高
純度試薬が人手し易いNADHが共役反応を通し
て染料を与えうる化学種として選択される。 他の『化学種』の例としては、特公昭59−
15637号公報または米国特許4246342号明細書で既
に公知化されているPOP（ピルビン酸オキシダー
ゼ）酵素を用いたALTまたはASTの分析用乾式
酵素分析要素においても、生成させる色素の反応
時間拡散を防止し、分析精度を挙げるために難溶
性染料を形成することが好ましいが、この様な系
では、過酸化水素またはピルビン酸を染料を与え
る化学種として選定できる。上記の場合は、結晶
状態で安定したサンプルが人手できるビルビン酸
が特に好ましい。 本発明の（）の工程は、標準染料溶液を用い
て反射光学濃度値を測定し、その反射濃度値と上
記標準溶液中の染料または上記化学種の濃度値と
から、染料または上記化学種の濃度値と反射光学
濃度値と相関式(1)を求める工程である。 （）の工程で使用する上記染料または上記化
学種を含む標準溶液は、粘度等の条件が液体試料
に類似するように調製することが好ましい。この
ため液体試料が生体液である場合には、一般にア
ルブミン等の蛋白質の溶液を用いて調製する。 上記標準溶液は染料または化学種を異なる濃度
値で含むものを少なくとも二以上用いるが、乾式
分析要素の反射光学濃度値と上記染料または化学
種の濃度値との相関式(1)の信頼性を向上させるた
めには可能な限り多数の標準溶液について実施す
ることが好ましい。 乾式分析要素に上記標準溶液を点着（付着等の
他の試料付与態様も含む）する場合、使用する乾
式分析要素が必要とする液体試料の点着量の範囲
内の点着量、好ましくは液体試料の点着量と同一
量で実施する。乾式分析要素が液体試料計量作用
（メータリング効果）を有していない場合には、
上記標準溶液の点着量は、液体試料の点着量と同
一量でなければならない。 染料濃度値または化学種濃度値に対応する反射
光学濃度値の測定は、乾式分析要素に標準溶液を
点着し、一定時間後の反射濃度を反射濃度計を用
いて実施する。なお上記測定は、以下において説
明する液体試料を点着した乾式分析要素の測定条
件（測定機材、インキユベーシヨン等）と同一の
条件下で実施することが好ましい。 以上のように測定された標準溶液の反射光学濃
度値と上記染料濃度値または化学種濃度値から相
関式(1)を作成する。相関式(1)の形式には特に制限
はないが、上記染料濃度値又は化学種濃度値
（［Ｐ］）が上記反射光学濃度値（ODR）の関数
｛（［Ｐ］＝ｆ（ODR）｝として表されることがデータ
の処理上好ましい。特にデータをコンピユーター
等で自動処理する場合には、上記関数は代数関数
｛［Ｐ］＝o 〓n=0 Ao（ODR）n；ただしｎは０以上の整数、
そしてAoはパラメーターである｝であることが
好ましい。 本発明の（）の工程は、別に用意した酵素活
性値が既知の二以上の標準液を用い、これを上記
乾式分析要素と同一種の乾式分析要素にそれぞれ
点着し、各々について一定時間経過後に形成され
た染料の濃度と、その後の一定時間経過後に形成
された染料の濃度のそれぞれを反射光学濃度値と
して測定し、その反射光学濃度値の変化と酵素活
性値との関係、そして上記の相関式(1)から、染料
又は上記化学種の濃度値の時間変動と酵素活性値
との関係を示す相関式(2)を作成する工程である。 （）の工程で使用する酵素標準液も粘度等の
条件が液体試料に類似するように調製することが
好ましい。そのような酵素標準液は、市販の標準
酵素試料を用いて容易に調製することができる。 酵素標準液は酵素活性を異なる値で有するもの
を少なくとも二以上用いるが、染料濃度の時間変
動または化学種濃度の時間変動と該酵素活性値と
の検量線（相関式(2)）の信頼性を向上させるため
には可能な限り多数の酵素標準液について実施す
ることが好ましい。 （）の工程において、反射光学濃度値の測定
は、被検液体試料の測定条件（測定機材、インキ
ユベーシヨン等）と同一の条件下で実施すること
が好ましい。 上記（）の工程は、上記酵素標準液を点着し
た上記乾式分析要素の反射光学濃度値を時間を隔
てた二以上の点で測定するが、一般には時間当り
の染料生成量または化学量が一定値（酵素反応の
初速度に相当する値）を示す範囲内の二点で測定
する。染料濃度値または化学種濃度値の測定を二
点において行なう場合は、一般に単位時間当りの
染料濃度値または化学種濃度値の差を単位時間当
りの染料濃度変動値とする。 以上のように測定された酵素標準液の染料濃度
値または化学種濃度値の単位時間当りの変動値と
酵素活性値から検量線を相関式(2)として作成す
る。 相関式(2)の形式には特に制限はないが、酵素活
性値（［Ｅ］）が染料濃度値または化学種濃度値の
単位時間当りの変動値（△［Ｐ］）の関数｛［Ｅ］
＝ｆ（Δ［Ｐ］）｝として表されることがデータの処
理上好ましい。特に、データをコンピユーター等
で処理する場合には、上記関数は代数関数｛［Ｅ］
＝o 〓n=0 Bo（Δ［Ｐ］）n；ただしｎは０以上の整数、Bo
はパラメーターである｝であることが好ましい。 本発明の（）の工程は、乾式分析要素に被検
対象の液体試料を点着し、一定時間経過後に形成
された染料の濃度と、その後の一定時間経過後に
形成された染料の濃度のそれぞれを反射光学濃度
値として測定し、次いでその反射光学濃度の変化
を、相関式(1)を利用して、染料または上記化学種
の濃度値の変化として算出する工程である。 （）の工程において液体試料を点着した乾式
分析要素は一般にインキユーベーター内で一定温
度に均一加熱され、次いで予め定められている二
以上の時間経過後に乾式分析要素上の反射光学濃
度が反射光学系を用いて測定される。上記測定は
インキユベーターに付設した反射濃度計を用いて
実施することができるが、インキユベーターと反
射濃度計が一体に組み込まれていなくても測定は
可能である。 インキユベーシヨン中の温度としては、一般に
25℃、30℃、37℃等で実施されるが、特に限定す
る必要はない。ただし反応時間内での温度変動は
±0.2℃以内の制御することが好ましい。 反射光学濃度測定値は、次に相関式(1)により染
料濃度値または化学種濃度値に変換される。 なお、上記液体試料を点着した上記乾式分析要
素の反射光学濃度値は時間を隔てた二以上の点で
測定するが、一般には時間当りの染料生成量が一
定値（酵素反応の初速度に相当する値）を示す範
囲内の二点で測定する。染料濃度値の測定を二点
において行なう場合は、一般に単位時間当りの染
料濃度値の単位時間当りの染料濃度変動値とす
る。 本発明の（）の工程は、上記（）の工程で
算出された染料または上記化学種の濃度値の変化
を、相関式(2)を利用して酵素活性値に変換する工
程である。 具体的には例えば、予めアナライザーに上記の
（）の工程により得られた相関式(1)および上記
（）の工程により得られた相関式(2)を内在させ、
液体試料を乾式分析要素上に点着し、時間を隔て
た二点以上の反射光学濃度を測光することにより
酵素活性を算出することができる。 以下に、本発明の酵素活性測定方法を実施例に
従つて、さらに詳細に説明するが、本発明はこれ
らに限定されるものではない。 実施例で使用した乾式分析要素（一体型多層分
析要素）は、以下のように製造したものである。 ［GGT活性測定用一体型多層分析要素］ 透明ポリエチレンテレフタレート支持体（厚
さ：180μｍ）の表面を親水化処理し、その処理
表面上に下記の組成の塗布液を塗布、乾燥して乾
燥膜厚15μｍの吸水層を形成した。 吸水層形成用塗布液： アルカリ処理 脱イオンゼラチン 10ｇ オクチルフエノキシ・ポリエトキシエタノール
0.5ｇ 水 100ml １，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）
エタン 0.15ｇ 次いで吸水層上に下記の塗布液を塗布し、乾燥
膜厚3μｍの接着層を形成した。 接着層形成用塗布液： ゼラチン 12ｇ 水 290ｇ ノニルフエノキシ・ポリグリシドール 1.3ｇ 上記接着層上に0.4％ノニルフエノキシポリグ
リシドール水溶液を塗布し、次いでポリエチレン
テレフタレート紡績糸（36ゲージ、50デニール）
からなるトリコツト編物を上記接着層に圧着して
展開層とした。 上記展開層に下記の基質塗布液を、塗布量が
120ml／m2になるように塗布、乾燥した。 基質塗布液の調製： 下記均一液に、γ−グルタミル−ｐ−ニトロア
ニリド2.28ｇを2N塩酸１mlおよびエタノール１
mlに溶解したものを添加し、次いで、6N塩酸約
1.3mlを用いてPH8.3に調製し、基質塗布液とし
た。 ［均一液］ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン3.03ｇ グリシルグリシン 0.651ｇ セチルトリメチルアンモニウムブロマイド
0.500ｇ 水 20.0ｇ 10％ポリアクリルアミド 25ｇ さらに上記展開層に下記の二酸化チタン塗布液
を塗布量が112ml／m2になるように塗布した後、
乾燥した。 二酸化チタン塗布液： アナターゼ型二酸化チタン 2.5ｇ 0.5％メチルセルロース 50ml 以上の方法によりGGT活性測定用一体型多層
分析要素を作成した。 ［ALP活性測定用一体型多層分析要素］ 透明ポリエチレンテレフタレート支持体（厚
さ：180μｍ）の表面を親水化処理し、その処理
表面上に下記の組成の塗布液を塗布、乾燥して乾
燥膜厚15μｍの緩衝層を形成した。 緩衝層形成用塗布液： アルカリ処理脱イオンゼラチン 24ｇ 水 240ｇ ノニルフエノキシ・ポリグリシドール 1.6ｇ ポリ（Ｎ−［（ジメチルアミノ）プロピル］アクリ
ルアミド）18％水溶液（平均分子量約10万）30ｇ Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン
−Ｎ，N′，N′−三酢酸 ２ミリモル Zn（CH3COO）2・2H2O １ミリモル MgSO4・7H2O ２ミリモル 以上の溶液に5NのNaOH水溶液を加えてPHを
11.0に調整した。 上記緩衝層の上に、下記の塗布液を乾燥膜厚が
3.6μｍになるように塗布、乾燥して硬膜層を形成
した。 硬膜層形成用塗布液： ゼラチン 12ｇ 水 268ｇ ノニルフエノキシ・ポリグリシドール 1.3ｇ １，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）
エタン 0.72ｇ 水／アセトン（混合比＝１：１） 18ｇ 上記の硬膜層の上に、下記組成の塗布液を乾燥
膜厚が3μｍになるように塗布し、接着層を形成
した。 接着層形成用塗布液： ゼラチン 12ｇ 水 286.7ｇ ノニルフエノキシ・ポリグリシドール 1.3ｇ 上記接着層の上に、0.4％ノニルフエノキシ・
ポリグリシドール水溶液を塗布し、次に36ゲージ
50Dポリエチレンテレフタレート紡績糸からなる
トリコツト編物を圧着して展開層とした。 上記展開層に、下記の組成の塗布液を120ml／
m2となるように塗布、乾燥した。 自己顕色性基質含有塗布液： ｐ−ニトロフエニルホスフエートビス［トリス
（ヒドロメキシメチル）アミノメタン］塩
50ミリモル ポリビニルピロリドン（平均分子量10万） ６ｇ エタノール 22ｇ アセトン 22ｇ 以上の方法によりALP活性測定用一体型多層
分析要素を作成した。 実施例 １ ｐ−ニトロアニリン（上記GGT活性測定用一
体型多層分析要素で生成する染料に相当）を下記
第１表に示す各種濃度で含む７％ヒトアルブミン
水溶液を上記GGT活性測定用一体型多層分析要
素に10μづつ点着し、一定時間後の反射濃度を
400nｍ干渉フイルターを介して測光した。 上記ｐ−ニトロアニリンの濃度［Ｐ］および反
射光学濃度（ODR）の相関関係を下記相関式
（11）で近似した。 ［Ｐ］＝A0＋A1（ODR）＋A2（ODR）2 ＋A3（ODR）3 （11） 相関式（11）における各パラメーターA0、A1、
A2およびA3は、下記の値であつた。 A0＝−3.3646013 A1＝10.26816957 A2＝−11.290208 A3＝7.45991396 上記相関式を用いて反射光学濃度（ODR）から
計算した染料濃度を、ODRおよび実際に点着した
染料濃度と共に下記第１表に記載する。
方法に関する。さらに詳しくは本発明は、液体試
料中の酵素活性を、乾式分析要素を用い、反応速
度法を利用して測定する方法に関する。 ［発明の背景］ 臨床検査上、ヒトの血清等の液体試料中の酵素
活性を測定することは極めて重要である。すなわ
ち体液中の酵素活性値は、疾患部を推定し、患部
の損傷程度を推定する場合等において重要な知見
を与える。一方、臨床検査の領域においては診断
に関与する医師等の医療関係から、簡便な操作に
よる迅速な測定を求める強い要請がある。 これに答える方向として、従来用いられてきた
透過光学系を基本とする通常の溶液法に代えて、
反射光学系を基本とする乾式分析法が開発され、
近年その実用化が進められている。乾式分析方法
は、検出反応に必要な試薬類が乾燥状態でシート
上の要素内に保存されている乾式分折要素を使用
するものであり、この乾式分析要素に点着した液
体試料と上記試薬類と発色反応により形成される
染料の濃度を検出、測定するものである。特に乾
式分析要素のうち、取り扱いの簡便性および分析
精度がさらに向上した一体型多層分析要素は、
様々な種類のものが既に市販されている。 液体試料中の被検成分濃度の測定に一体型多層
分析要素等の乾式分析要素を用いる場合には、従
来より用いられている終点比点法で並行光源を用
いて直接測光される反射光学濃度（以下ODRと略
記）と染料濃度との対応づけをした検量線を作成
しておけば、通常の測定には何らの問題も生じな
かつた。 しかしながら、酵素の存在下で形成される染料
の濃度変化と反射光学濃度の変化とは直線性が成
立しない。一方、乾式分析要素による酵素活性測
定には多点反射測光による反応速度法の解析法が
必須であるところから、反所光学濃度（ODR）か
ら、直線性が成立する透過光学濃度（OTT）への
変換が必要で、その研究は古くからなされてい
る。理論的にはウイリアムズ（Williams）とク
ラツパー（Clapper）の提唱した変換式で、ODR
をODTに変換できることが明らかになつている
（ジヤーナル・オプテイカル・ソサエテイ・オ
ブ・アメリカ ［J.Optical Society of
America］Vol 43 No.７ 595〜599（1953）参
照）。しかし上記の変換式は各種のパラメーター
が複雑であるため、実用上においては、経験的に
定められた反射光学濃度値と透過光学濃度値との
相関式を利用して、反射光学濃度値の変化から透
過光学濃度値（形成された染料の濃度値に対応す
る値）の変化を算出し、その形成された染料の濃
度値の変化に基づき試験液体試料の酵素活性が測
定していた。 しかし、上記のような経験的に定められた反射
光学濃度値と透過光学濃度値との相関式は、その
適用可能範囲があいまいであり、所望の測定系に
おいて従来の変換式の信頼性が充分であるかの点
は明確でないとの欠点がある。 ［発明の目的］ 本発明は、簡単で、かつ信頼性の高い、液体試
料中の酵素活性を乾式分析要素を用い反応速度法
を利用して測定する方法を提供することを主な目
的とする。 本発明は、特に、測定機器を用い、液体試料中
の酵素活性を乾式分析要素を用い反応速度法を利
用して自動的に測定する際に特に有利な測定法を
提供することを主な目的とする。 ［発明の要旨］ 本発明は、測定対象の酵素に基質、及び酵素と
基質の反応に基づいて発色し、染料を形成する試
薬を含有する乾式分析要素に、酵素を含有する液
体試料を点着し、一定時間経過後に形成された染
料の濃度と、その後の一定時間経過後に形成され
た染料の濃度のそれぞれを反射光学濃度値として
測定し、その反射光学濃度の変化と、別に相関式
として形成した検量線とから上記液体試料の酸素
活性を測定する方法において、 () 別に用意した上記染料または共役反応を通
して上記染料を与えうる化学種を異なる濃度値
で含む二以上の標準溶液を、上記と同一種の二
以上の乾式分析要素にそれぞれ点着して、乾式
分析要素上に形成された染料面の反射光学濃度
値を測定し、次いで測定された反射光学濃度値
と上記標準溶液中の染料または上記化学種の濃
度値とから、染料または上記化学種の濃度値と
反射光学濃度値との相関式(1)を求める工程； () 別に用意した酵素活性値が既知の二以上の
標準液を上記乾式分析要素と同一種の乾式分析
要素にそれぞれ点着し、各々について一定時間
経過後に形成された染料の濃度と、その後の一
定時間経過後に形成された染料の濃度のそれぞ
れを反射光学濃度値として測定し、その反射光
学濃度値の変化と酵素活性値との関係、そして
上記の相関式(1)から、染料又は上記化学種の濃
度値の時間変動と酵素活性値との関係を示す相
関式(2)を作成する工程； () 乾式分析要素に被検液体試料を点着し、一
定時間経過後に形成された染料の濃度と、その
後の一定時間経過後に形成された染料の濃度の
それぞれを反射光学濃度値として測定し、その
反射光学濃度の変化を、相関式(1)を利用して、
染料または上記化学種の濃度値の変化として算
出する工程；そして ()上記（）の工程で得られた染料または上記
化学種の濃度値の変化を、相関式(2)を利用して
酵素活性値に変換する工程 を含むことを特徴とする反射光学系を用いる酵素
活性測定方法にある。 ［発明の効果］ 本発明の酵素活性測定方法によれば、液体試料
中の酵素活性を乾式分析要素を用い反応速度法を
利用して測定する際に、複雑な変換式を用いる必
要がなく、また測定された酵素活性値への信頼性
も高い。従つて、本発明は、特に、測定機器を用
いて、自動的に液体試料中の酵素活性を測定する
際に特に有利となる。 ［発明の詳細な記述］ 本発明にて使用する乾式分析要素は、酵素活性
測定用であれば特に他の制限はなく、公知のもの
を用いることができる。乾式分析要素の具体例と
しては、試験紙タイプのものとして、米国エイム
ズ（Ames）社より「セラライザー」及び西独国
ベーリンガー・マンハイム（Boehringer
Mannheim）社より「レフロトロン」の商品名で
それぞれ市販されているものを挙げることができ
る。また一体型多層分析要素としては、米国イー
ストマン・コダツク社より「エクタケム」、富士
写真フイルム株式会社より「ドライケム」の商品
名でそれぞれ市販されているものを挙げることが
できる。特に他に乾式分析要素の種類を限定する
条件がない場合には、取り扱いの簡便性および分
析精度の点から一体型多層分析要素を奏すること
が好ましい。またこれらの市販品の代りに各種文
献を参考にして、分析目的、検査項目等の条件に
対応した乾式分析要素を作成することもできる。 乾式分析要素の酵素活性検査項目としては、リ
パーゼ、アミラーゼ、GGT（γ−グルタミルトラ
ンスフエラーゼ）、ALP（アルカリ性フオスフア
ターゼ）、ALT（アラニン・アミノトランスフエ
ラーゼ）およびAST（アスパルテート・アミノト
ランスフエラーゼ）等のアミノトランスフエラー
ゼ、クレアチンキナーゼ（CK）、乳酸脱水素酵素
（LDH）、コリンエステラーゼ（ChE）等が挙げ
られるが、本発明の方法は一般に全ての酵素活性
の測定に適用することができる。 上記の酵素活性測定用乾式分析要素には、液体
試料中の酵素活性に基づいて染料（色素、発色生
成物）が生成されるために必要な試薬類が、他の
検出反応に必要な試薬類と共に保存されている。
よつて本発明における『染料』は、具体的には本
発明の実施において使用する乾式分析要素の種類
に対応して決定される。例えば、γ−グルタミル
−ｐ−ニトロアニリドとグリシルグリシンおよび
トリス塩を展開層中に含有するGGT活性測定用
一体型多層分析要素を用いる場合には、本発明に
おける『染料』は、GGT活性によりγ−グルタ
ミル−ｐ−ニトロアニリドより遊離するｐ−ニト
ロアニリンとなる。 また本発明において『共役反応を通して染料を
与えうる化学種』とは、活性測定対象の酵素反応
またはそれに共役する化学反応の生成物あるいは
生成する補酵素で、酵素反応と共役する化学反応
により化学量論に従つて上記染料を形成しうる化
合物を意味する。本発明の各工程において上記化
学種を染料に代えて使用することは、生成する染
料が水に難溶性で染料の標準溶液の調製が困難な
場合に特に有効である。 たとえば、LDH測定等でＬ→Ｐ型反応として
公知の反応例では、補酵素NADH（ニコチン酸ア
ミド・ジヌクレオチド（還元型）が系に生成して
来るので、本反応に電子伝達系を関与させてテト
ラゾリウム塩を還元し、生成するホルマザン色素
の生成速度でLDH活性を可視スペクトル域で定
量する方法が提案されている（A.L.BABSON et
al.CLINICA ACTA 12（1965）210〜215頁参
照）。この様な系では生成するホルマザン染料が
難溶性であり、染料標準液を作成するのが困難で
ある。この様な時には、比較的安定性が高く、高
純度試薬が人手し易いNADHが共役反応を通し
て染料を与えうる化学種として選択される。 他の『化学種』の例としては、特公昭59−
15637号公報または米国特許4246342号明細書で既
に公知化されているPOP（ピルビン酸オキシダー
ゼ）酵素を用いたALTまたはASTの分析用乾式
酵素分析要素においても、生成させる色素の反応
時間拡散を防止し、分析精度を挙げるために難溶
性染料を形成することが好ましいが、この様な系
では、過酸化水素またはピルビン酸を染料を与え
る化学種として選定できる。上記の場合は、結晶
状態で安定したサンプルが人手できるビルビン酸
が特に好ましい。 本発明の（）の工程は、標準染料溶液を用い
て反射光学濃度値を測定し、その反射濃度値と上
記標準溶液中の染料または上記化学種の濃度値と
から、染料または上記化学種の濃度値と反射光学
濃度値と相関式(1)を求める工程である。 （）の工程で使用する上記染料または上記化
学種を含む標準溶液は、粘度等の条件が液体試料
に類似するように調製することが好ましい。この
ため液体試料が生体液である場合には、一般にア
ルブミン等の蛋白質の溶液を用いて調製する。 上記標準溶液は染料または化学種を異なる濃度
値で含むものを少なくとも二以上用いるが、乾式
分析要素の反射光学濃度値と上記染料または化学
種の濃度値との相関式(1)の信頼性を向上させるた
めには可能な限り多数の標準溶液について実施す
ることが好ましい。 乾式分析要素に上記標準溶液を点着（付着等の
他の試料付与態様も含む）する場合、使用する乾
式分析要素が必要とする液体試料の点着量の範囲
内の点着量、好ましくは液体試料の点着量と同一
量で実施する。乾式分析要素が液体試料計量作用
（メータリング効果）を有していない場合には、
上記標準溶液の点着量は、液体試料の点着量と同
一量でなければならない。 染料濃度値または化学種濃度値に対応する反射
光学濃度値の測定は、乾式分析要素に標準溶液を
点着し、一定時間後の反射濃度を反射濃度計を用
いて実施する。なお上記測定は、以下において説
明する液体試料を点着した乾式分析要素の測定条
件（測定機材、インキユベーシヨン等）と同一の
条件下で実施することが好ましい。 以上のように測定された標準溶液の反射光学濃
度値と上記染料濃度値または化学種濃度値から相
関式(1)を作成する。相関式(1)の形式には特に制限
はないが、上記染料濃度値又は化学種濃度値
（［Ｐ］）が上記反射光学濃度値（ODR）の関数
｛（［Ｐ］＝ｆ（ODR）｝として表されることがデータ
の処理上好ましい。特にデータをコンピユーター
等で自動処理する場合には、上記関数は代数関数
｛［Ｐ］＝o 〓n=0 Ao（ODR）n；ただしｎは０以上の整数、
そしてAoはパラメーターである｝であることが
好ましい。 本発明の（）の工程は、別に用意した酵素活
性値が既知の二以上の標準液を用い、これを上記
乾式分析要素と同一種の乾式分析要素にそれぞれ
点着し、各々について一定時間経過後に形成され
た染料の濃度と、その後の一定時間経過後に形成
された染料の濃度のそれぞれを反射光学濃度値と
して測定し、その反射光学濃度値の変化と酵素活
性値との関係、そして上記の相関式(1)から、染料
又は上記化学種の濃度値の時間変動と酵素活性値
との関係を示す相関式(2)を作成する工程である。 （）の工程で使用する酵素標準液も粘度等の
条件が液体試料に類似するように調製することが
好ましい。そのような酵素標準液は、市販の標準
酵素試料を用いて容易に調製することができる。 酵素標準液は酵素活性を異なる値で有するもの
を少なくとも二以上用いるが、染料濃度の時間変
動または化学種濃度の時間変動と該酵素活性値と
の検量線（相関式(2)）の信頼性を向上させるため
には可能な限り多数の酵素標準液について実施す
ることが好ましい。 （）の工程において、反射光学濃度値の測定
は、被検液体試料の測定条件（測定機材、インキ
ユベーシヨン等）と同一の条件下で実施すること
が好ましい。 上記（）の工程は、上記酵素標準液を点着し
た上記乾式分析要素の反射光学濃度値を時間を隔
てた二以上の点で測定するが、一般には時間当り
の染料生成量または化学量が一定値（酵素反応の
初速度に相当する値）を示す範囲内の二点で測定
する。染料濃度値または化学種濃度値の測定を二
点において行なう場合は、一般に単位時間当りの
染料濃度値または化学種濃度値の差を単位時間当
りの染料濃度変動値とする。 以上のように測定された酵素標準液の染料濃度
値または化学種濃度値の単位時間当りの変動値と
酵素活性値から検量線を相関式(2)として作成す
る。 相関式(2)の形式には特に制限はないが、酵素活
性値（［Ｅ］）が染料濃度値または化学種濃度値の
単位時間当りの変動値（△［Ｐ］）の関数｛［Ｅ］
＝ｆ（Δ［Ｐ］）｝として表されることがデータの処
理上好ましい。特に、データをコンピユーター等
で処理する場合には、上記関数は代数関数｛［Ｅ］
＝o 〓n=0 Bo（Δ［Ｐ］）n；ただしｎは０以上の整数、Bo
はパラメーターである｝であることが好ましい。 本発明の（）の工程は、乾式分析要素に被検
対象の液体試料を点着し、一定時間経過後に形成
された染料の濃度と、その後の一定時間経過後に
形成された染料の濃度のそれぞれを反射光学濃度
値として測定し、次いでその反射光学濃度の変化
を、相関式(1)を利用して、染料または上記化学種
の濃度値の変化として算出する工程である。 （）の工程において液体試料を点着した乾式
分析要素は一般にインキユーベーター内で一定温
度に均一加熱され、次いで予め定められている二
以上の時間経過後に乾式分析要素上の反射光学濃
度が反射光学系を用いて測定される。上記測定は
インキユベーターに付設した反射濃度計を用いて
実施することができるが、インキユベーターと反
射濃度計が一体に組み込まれていなくても測定は
可能である。 インキユベーシヨン中の温度としては、一般に
25℃、30℃、37℃等で実施されるが、特に限定す
る必要はない。ただし反応時間内での温度変動は
±0.2℃以内の制御することが好ましい。 反射光学濃度測定値は、次に相関式(1)により染
料濃度値または化学種濃度値に変換される。 なお、上記液体試料を点着した上記乾式分析要
素の反射光学濃度値は時間を隔てた二以上の点で
測定するが、一般には時間当りの染料生成量が一
定値（酵素反応の初速度に相当する値）を示す範
囲内の二点で測定する。染料濃度値の測定を二点
において行なう場合は、一般に単位時間当りの染
料濃度値の単位時間当りの染料濃度変動値とす
る。 本発明の（）の工程は、上記（）の工程で
算出された染料または上記化学種の濃度値の変化
を、相関式(2)を利用して酵素活性値に変換する工
程である。 具体的には例えば、予めアナライザーに上記の
（）の工程により得られた相関式(1)および上記
（）の工程により得られた相関式(2)を内在させ、
液体試料を乾式分析要素上に点着し、時間を隔て
た二点以上の反射光学濃度を測光することにより
酵素活性を算出することができる。 以下に、本発明の酵素活性測定方法を実施例に
従つて、さらに詳細に説明するが、本発明はこれ
らに限定されるものではない。 実施例で使用した乾式分析要素（一体型多層分
析要素）は、以下のように製造したものである。 ［GGT活性測定用一体型多層分析要素］ 透明ポリエチレンテレフタレート支持体（厚
さ：180μｍ）の表面を親水化処理し、その処理
表面上に下記の組成の塗布液を塗布、乾燥して乾
燥膜厚15μｍの吸水層を形成した。 吸水層形成用塗布液： アルカリ処理 脱イオンゼラチン 10ｇ オクチルフエノキシ・ポリエトキシエタノール
0.5ｇ 水 100ml １，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）
エタン 0.15ｇ 次いで吸水層上に下記の塗布液を塗布し、乾燥
膜厚3μｍの接着層を形成した。 接着層形成用塗布液： ゼラチン 12ｇ 水 290ｇ ノニルフエノキシ・ポリグリシドール 1.3ｇ 上記接着層上に0.4％ノニルフエノキシポリグ
リシドール水溶液を塗布し、次いでポリエチレン
テレフタレート紡績糸（36ゲージ、50デニール）
からなるトリコツト編物を上記接着層に圧着して
展開層とした。 上記展開層に下記の基質塗布液を、塗布量が
120ml／m2になるように塗布、乾燥した。 基質塗布液の調製： 下記均一液に、γ−グルタミル−ｐ−ニトロア
ニリド2.28ｇを2N塩酸１mlおよびエタノール１
mlに溶解したものを添加し、次いで、6N塩酸約
1.3mlを用いてPH8.3に調製し、基質塗布液とし
た。 ［均一液］ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン3.03ｇ グリシルグリシン 0.651ｇ セチルトリメチルアンモニウムブロマイド
0.500ｇ 水 20.0ｇ 10％ポリアクリルアミド 25ｇ さらに上記展開層に下記の二酸化チタン塗布液
を塗布量が112ml／m2になるように塗布した後、
乾燥した。 二酸化チタン塗布液： アナターゼ型二酸化チタン 2.5ｇ 0.5％メチルセルロース 50ml 以上の方法によりGGT活性測定用一体型多層
分析要素を作成した。 ［ALP活性測定用一体型多層分析要素］ 透明ポリエチレンテレフタレート支持体（厚
さ：180μｍ）の表面を親水化処理し、その処理
表面上に下記の組成の塗布液を塗布、乾燥して乾
燥膜厚15μｍの緩衝層を形成した。 緩衝層形成用塗布液： アルカリ処理脱イオンゼラチン 24ｇ 水 240ｇ ノニルフエノキシ・ポリグリシドール 1.6ｇ ポリ（Ｎ−［（ジメチルアミノ）プロピル］アクリ
ルアミド）18％水溶液（平均分子量約10万）30ｇ Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン
−Ｎ，N′，N′−三酢酸 ２ミリモル Zn（CH3COO）2・2H2O １ミリモル MgSO4・7H2O ２ミリモル 以上の溶液に5NのNaOH水溶液を加えてPHを
11.0に調整した。 上記緩衝層の上に、下記の塗布液を乾燥膜厚が
3.6μｍになるように塗布、乾燥して硬膜層を形成
した。 硬膜層形成用塗布液： ゼラチン 12ｇ 水 268ｇ ノニルフエノキシ・ポリグリシドール 1.3ｇ １，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）
エタン 0.72ｇ 水／アセトン（混合比＝１：１） 18ｇ 上記の硬膜層の上に、下記組成の塗布液を乾燥
膜厚が3μｍになるように塗布し、接着層を形成
した。 接着層形成用塗布液： ゼラチン 12ｇ 水 286.7ｇ ノニルフエノキシ・ポリグリシドール 1.3ｇ 上記接着層の上に、0.4％ノニルフエノキシ・
ポリグリシドール水溶液を塗布し、次に36ゲージ
50Dポリエチレンテレフタレート紡績糸からなる
トリコツト編物を圧着して展開層とした。 上記展開層に、下記の組成の塗布液を120ml／
m2となるように塗布、乾燥した。 自己顕色性基質含有塗布液： ｐ−ニトロフエニルホスフエートビス［トリス
（ヒドロメキシメチル）アミノメタン］塩
50ミリモル ポリビニルピロリドン（平均分子量10万） ６ｇ エタノール 22ｇ アセトン 22ｇ 以上の方法によりALP活性測定用一体型多層
分析要素を作成した。 実施例 １ ｐ−ニトロアニリン（上記GGT活性測定用一
体型多層分析要素で生成する染料に相当）を下記
第１表に示す各種濃度で含む７％ヒトアルブミン
水溶液を上記GGT活性測定用一体型多層分析要
素に10μづつ点着し、一定時間後の反射濃度を
400nｍ干渉フイルターを介して測光した。 上記ｐ−ニトロアニリンの濃度［Ｐ］および反
射光学濃度（ODR）の相関関係を下記相関式
（11）で近似した。 ［Ｐ］＝A0＋A1（ODR）＋A2（ODR）2 ＋A3（ODR）3 （11） 相関式（11）における各パラメーターA0、A1、
A2およびA3は、下記の値であつた。 A0＝−3.3646013 A1＝10.26816957 A2＝−11.290208 A3＝7.45991396 上記相関式を用いて反射光学濃度（ODR）から
計算した染料濃度を、ODRおよび実際に点着した
染料濃度と共に下記第１表に記載する。
【表】
次いでウシ腎臓由来GGTをバーサトール
ENPlusに添加した６レベルのサンプル（下記第
２表に示す）を用いて、点着インキユベート後２
分および５分後の各反射濃度値を測定し、二分後
および５分後に生成したｐ−ニトロアニリン染料
の生成量を上記変換式（11）を用いて算出した。 各標準液についてのGGT活性と点着インキユ
ベート時間２分〜５分の間に生成したｐ−ニトロ
アニリン染料の生成量（Δ［Ｐ］）との相関式を下
記の多次式（21）として近似した。 GGT活性（Ｕ／Ｌ） ＝5 〓n=1 B2（Δ［Ｐ］）n （21） 上記相関式（21）における各パラメーターB0、
B1、B2、B3、B4およびB5は、下記の値であつ
た。 B0＝−23.610628 B1＝381.1602245 B2＝−36.60469387 B3＝321.289498 B4＝−206.7962678 B5＝42.7391708 上記相関式（21）を用いて計算したGGT活性
値を、２分〜５分の間に生成したｐ−ニトロアニ
リン染料の生成量（Δ［Ｐ］）および各コントロー
ル中のGGT活性値を溶液法で実際に測定した値
（RA1000にて測定）と共に下記第２表に記載す
る。
ENPlusに添加した６レベルのサンプル（下記第
２表に示す）を用いて、点着インキユベート後２
分および５分後の各反射濃度値を測定し、二分後
および５分後に生成したｐ−ニトロアニリン染料
の生成量を上記変換式（11）を用いて算出した。 各標準液についてのGGT活性と点着インキユ
ベート時間２分〜５分の間に生成したｐ−ニトロ
アニリン染料の生成量（Δ［Ｐ］）との相関式を下
記の多次式（21）として近似した。 GGT活性（Ｕ／Ｌ） ＝5 〓n=1 B2（Δ［Ｐ］）n （21） 上記相関式（21）における各パラメーターB0、
B1、B2、B3、B4およびB5は、下記の値であつ
た。 B0＝−23.610628 B1＝381.1602245 B2＝−36.60469387 B3＝321.289498 B4＝−206.7962678 B5＝42.7391708 上記相関式（21）を用いて計算したGGT活性
値を、２分〜５分の間に生成したｐ−ニトロアニ
リン染料の生成量（Δ［Ｐ］）および各コントロー
ル中のGGT活性値を溶液法で実際に測定した値
（RA1000にて測定）と共に下記第２表に記載す
る。
【表】
上記GGT活性測定用分析要素を用いて患者血
清85例についてGGT活性の測定を実施し、各反
射光学濃度の測定値を上記相関式（11）および
（21）を用いて処理することで各例のGGT活性を
定量した。またRA−1000（テクニコン社）を用
いたGGT活性の溶液法による測定を行ない、上
記測定値との相関式を検討した。両者の測定値
は、Ｙを本発明の方法、ＺをRA1000法の測定値
とすると下記の良好な相関性が得られた。 Ｙ＝0.968X＋4.9（ｎ＝85） γ＝0.999 Syx＝7.5 よつて本発明の方法は反射光学系を用いるもの
であるが、透過光学系を用いる溶液法に匹敵する
分析精度が得られることがわかつた。 実施例 ２ 実施例１における標準溶液をｐ−ニトロアニリ
ンに代えて、ｐ−ニトロフエノール（上記ALP
活性測定用一体型多層分析要素で生成する染料に
相当）を用いて作成し、ALP活性測定用一体型
多層分析要素を用いて反射光学濃度値（ODR）と
上記染料（ｐ−ニトロフエノール）濃度値との相
関式（下記12）を作成した。 ［Ｐ］＝C0＋C1（ODR）＋C2（ODR）2 ＋C3（ODR）3＋C4（ODR）4 ＋C5（ODR）5＋C6（ODR）6 ＋C7（ODR）7＋C8（ODR）8 （12） 上記相関式（12）における各パラメーターC0
〜C8は下記の値であつた。 C0＝−23.72762631 C1＝88.67719551 C2＝−87.66953215 C3＝−51.5097621 C4＝119.3958341 C5＝2.993599581 C6＝−89.33292527 C7＝50.35986471 C8＝−7.765508396 次いでヒト胎盤由来ALPをバーサトールENプ
ラスに添加した６レベルのサンプルを用いて、点
着インキユベート後２分および５分後の各反射濃
度値を測定し、二分後および５分後に生成したｐ
−ニトロフエノール染料の生成量を上記変換式
（12）を用いて算出した。 各標準液についてのALP活性［Ｅ］と点着イ
ンキユベート時間２分〜５分の間に生成したｐ−
ニトロフエノール染料の生成量（Δ［Ｐ］）との相
関式（22）を以下に示す。 ［Ｅ］＝D0＋D1（Δ［Ｐ］） （22） 上記相関式（22）における各パラメーターD0
およびD1は、下記の値であつた。 D0＝−８ D1＝667 上記ALP活性測定用分析要素を用いて患者血
清101例についてALP活性の測定を実施し、各反
射光学濃度の測定値を上記相関式（11）および
（22）を用いて処理することで各例のALP活性を
定量した。またRA−1000ALP法（テクニコン
社）を用いた溶液法による測定を行ない、上記測
定値との相関性を検討した。両者の測定値は、Ｙ
を本発明の方法、ＺをRC1000法の測定値とする
と下記の良好な相関性が得られた。 Ｙ＝1.148X＋19.1（ｎ＝85） γ＝0.994 Syx＝10.7 よつて上記実施例における本発明の方法も、透
過光学系を用いる溶液法に匹敵する分析精度が得
られることがわかつた。
清85例についてGGT活性の測定を実施し、各反
射光学濃度の測定値を上記相関式（11）および
（21）を用いて処理することで各例のGGT活性を
定量した。またRA−1000（テクニコン社）を用
いたGGT活性の溶液法による測定を行ない、上
記測定値との相関式を検討した。両者の測定値
は、Ｙを本発明の方法、ＺをRA1000法の測定値
とすると下記の良好な相関性が得られた。 Ｙ＝0.968X＋4.9（ｎ＝85） γ＝0.999 Syx＝7.5 よつて本発明の方法は反射光学系を用いるもの
であるが、透過光学系を用いる溶液法に匹敵する
分析精度が得られることがわかつた。 実施例 ２ 実施例１における標準溶液をｐ−ニトロアニリ
ンに代えて、ｐ−ニトロフエノール（上記ALP
活性測定用一体型多層分析要素で生成する染料に
相当）を用いて作成し、ALP活性測定用一体型
多層分析要素を用いて反射光学濃度値（ODR）と
上記染料（ｐ−ニトロフエノール）濃度値との相
関式（下記12）を作成した。 ［Ｐ］＝C0＋C1（ODR）＋C2（ODR）2 ＋C3（ODR）3＋C4（ODR）4 ＋C5（ODR）5＋C6（ODR）6 ＋C7（ODR）7＋C8（ODR）8 （12） 上記相関式（12）における各パラメーターC0
〜C8は下記の値であつた。 C0＝−23.72762631 C1＝88.67719551 C2＝−87.66953215 C3＝−51.5097621 C4＝119.3958341 C5＝2.993599581 C6＝−89.33292527 C7＝50.35986471 C8＝−7.765508396 次いでヒト胎盤由来ALPをバーサトールENプ
ラスに添加した６レベルのサンプルを用いて、点
着インキユベート後２分および５分後の各反射濃
度値を測定し、二分後および５分後に生成したｐ
−ニトロフエノール染料の生成量を上記変換式
（12）を用いて算出した。 各標準液についてのALP活性［Ｅ］と点着イ
ンキユベート時間２分〜５分の間に生成したｐ−
ニトロフエノール染料の生成量（Δ［Ｐ］）との相
関式（22）を以下に示す。 ［Ｅ］＝D0＋D1（Δ［Ｐ］） （22） 上記相関式（22）における各パラメーターD0
およびD1は、下記の値であつた。 D0＝−８ D1＝667 上記ALP活性測定用分析要素を用いて患者血
清101例についてALP活性の測定を実施し、各反
射光学濃度の測定値を上記相関式（11）および
（22）を用いて処理することで各例のALP活性を
定量した。またRA−1000ALP法（テクニコン
社）を用いた溶液法による測定を行ない、上記測
定値との相関性を検討した。両者の測定値は、Ｙ
を本発明の方法、ＺをRC1000法の測定値とする
と下記の良好な相関性が得られた。 Ｙ＝1.148X＋19.1（ｎ＝85） γ＝0.994 Syx＝10.7 よつて上記実施例における本発明の方法も、透
過光学系を用いる溶液法に匹敵する分析精度が得
られることがわかつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 測定対象の酵素の基質、及び酵素と基質の反
応に基づいて発色し、染料を形成する試薬を含有
する乾式分析要素に、酵素を含有する液体試料を
点着し、一定時間経過後に形成された染料の濃度
と、その後の一定時間経過後に形成された染料の
濃度のそれぞれを反射光学濃度値として測定し、
その反射光学濃度の変化と、別に相関式として作
成した検量線とから上記液体試料の酵素活性を測
定する方法において、 () 別に用意した上記染料または共役反応を通
して上記染料を与えうる化学種を異なる濃度値
で含む二以上の標準溶液を、上記と同一種の二
以上の乾式分析要素にそれぞれ点着して、乾式
分析要素上に形成された染料面の反射光学濃度
値を測定し、次いで測定された反射光学濃度値
と上記標準溶液中の染料または上記化学種の濃
度値とから、染料または上記化学種の濃度値と
反射光学濃度値との相関式(1)を求める工程； () 別に用意した酵素活性値が既知の二以上の
標準液を上記乾式分析要素と同一種の乾式分析
要素にそれぞれ点着し、各々について一定時間
経過後に形成された染料の濃度と、その後の一
定時間経過後に形成された染料の濃度のそれぞ
れを反射光学濃度値として測定し、その反射光
学濃度値の変化と酵素活性値との関係、そして
上記の相関式(1)から、染料又は上記化学種の濃
度値の時間変動と酵素活性値との関係を示す相
関式(2)を作成する工程； () 乾式分析要素に被検液体試料を点着し、一
定時間経過後に形成された染料の濃度と、その
後の一定時間経過後に形成された染料の濃度の
それぞれを反射光学濃度値として測定し、その
反射光学濃度の変化を、相関式(1)を利用して、
染料または上記化学種の濃度値の変化として算
出する工程；そして () 上記（）の工程で得られた染料または上
記化学種の濃度値の変化を、相関式(2)を利用し
て酵素活性値に変換する工程 を含むことを特徴とする反射光学系を用いる酵素
活性測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17083285A JPS6232344A (ja) | 1985-08-02 | 1985-08-02 | 乾式分析要素を用いる酵素活性測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17083285A JPS6232344A (ja) | 1985-08-02 | 1985-08-02 | 乾式分析要素を用いる酵素活性測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6232344A JPS6232344A (ja) | 1987-02-12 |
| JPH0481438B2 true JPH0481438B2 (ja) | 1992-12-24 |
Family
ID=15912157
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17083285A Granted JPS6232344A (ja) | 1985-08-02 | 1985-08-02 | 乾式分析要素を用いる酵素活性測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6232344A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01124751A (ja) * | 1987-11-10 | 1989-05-17 | Konica Corp | 変換式の作成方法 |
| JP2552166B2 (ja) * | 1988-03-02 | 1996-11-06 | 富士通テン株式会社 | バッテリ電圧のａｄ変換方法 |
-
1985
- 1985-08-02 JP JP17083285A patent/JPS6232344A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6232344A (ja) | 1987-02-12 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |