MX2010012353A - Composicion emoliente para el tratamiento preventivo de la dermatitis atopica. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de la atopía y del tratamiento de afecciones las cuales están relacionadas con ésta.

Description

COMPOSICIÓN EMOLIENTE PARA EL TRATAMIENTO PREVENTIVO DE LA DERMATITIS ATÓPICA La presente invención se relaciona con el campo de la atopia y del tratamiento de afecciones las cuales están relacionadas con esta. 1 La atopia se define como- una predisposición hereditaria a reaccionar en una forma sintomática (enfermedad) a varios alérgenos, como el polvo doméstico, termitas, polen, pelo de animales, etc. Las afecciones calificadas como atópicas comprenden la dermatitis atópica (AD) , asma bronquial alérgica y rinitis alérgica o "fiebre del heno" .

La dermatitis atópica (o eczema atópico) es una enfermedad dermatológica frecuente, que afecta a 10-15% de infantes en Francia, con un incremento durante las últimas décadas .

La dermatitis atópica es una enfermedad crónica la cual se desarrolla con erupciones, periodos interrumpidos con remisión durante los cuales las lesiones están siempre presentes pero son mínimas, esencialmente expresadas por xerosis (resequedad de la piel) y pruritis.

La inflamación de la piel es 'característica de las erupciones, las cuales son expresadas por signos inflamatorios y síntomas que comprenden parches rojos (eritema), vesículas, costras, exudación y comezón.

La enfermedad generalmente comienza entre la edad de 3 meses y de 2 años, pero puede comenzar aún más temprano desde un mes de edad. Su desarrollo es con frecuencia favorable con una remisión completa ocurriendo entre los 5 y 8 años de edad en la mayoría de los casos. Es posible el resurgimiento en la adolescencia o en adultos jóvenes. La enfermedad puede persistir durante la edad adulta en 15-20% de los casos.

También es posible el desarrollo hacia otra afección atópica. La presencia de AD durante la niñez incrementa el riesgo de desarrollar asma y existe una clara correlación entre la frecuencia de la AD y la frecuencia del asma. Se: estima que el riesgo de ocurrencia de asma en un niño afectado con AD es de entre 30 y 40%.

El riesgo de ocurrencia de una alergia a alimentos, con mucha frecuencia antes de los 3 años de edad, o de rinitis alérgica, que ocurre posteriormente, varía de acuerdo con los estudios.

Con respecto a la dermatitis atópica, existe una predisposición genética marcada con un 30-50% de riesgo de desarrollar la enfermedad si uno de los padres está afectado y un riesgo de cerca del 80% si ambos padres están afectados. La predisposición genética implica muchos genes, ya sea que codifiquen determinantes de la función de barrera de la epidermis, o por actores de la inmunidad innata o adoptada. Tomando en cuenta muchas investigaciones recientes, puede suponerse que la AD (o aún otras enfermedades atópicas) están relacionadas con una anormalidad primitiva de la función de barrera :de la epidermis, responsable del incremento de la permeabilidad a agentes ambientales (alérgenos y microorganismos) , responsable de la activación inmunológica y síntomas alérgicos.

Esta anormalidad epidérmica es expresada por xerosis cutánea y por un incremento en la pérdida de agua imperceptible y por la demostración de polimorfismo de los genes que codifican para proteínas epidérmicas como la filagrina (FLG) , que participa en la función de barrera de la epidermis (Palmer, 2006) . Un estudio reciente en Francia confirma la asociación del polimorfismo del gen FLG con la AD, con un riesgo relativo superior a 3 (Hubiche, 2007).

La atopía puede ser considerada como una reacción de hipersensibilidad retardada al contacto con alérgenos del ambiente. Esta generalmente aparece en dos fases. Una primera fase de sensibilización químicamente silenciosa genera linfocitps T específicos para la piel.; Esta sensibilización ocurre por penetración de los alérgenos del ambiente en la piel facilitada por xerosis. Una segunda fase de activación de linfocitos T específicos da como resultado la producción de citocinas proinflamatorias .

Globalmente, los signos hacia fuera de la dermatitis atópica resultan de interacciones complejas entre factores ambientales, anormalidades farmacológicas, disfunciones o alteraciones de las funciones de barrera de la piel, fenómenos inmunológicos y susceptibilidad genética.

¦ Entre los numerosos factores-, la hiperreactividad de la piel, respuesta inmune inadecuada a varios microorganismos asi como infecciones secundarias parecen jugar un papel en el carácter crónico de la patología.

El papel de la flora de la piel en la ocurrencia y/o el mantenimiento de la activación inmune que favorece el desarrollo de lesiones eczematicas · es cada vez mejor conocido. La alteración de la función de barrera de la piel asociada con alguna inmunodeficiencia en pacientes afectados con dermatitis atópica causa la colonización por Staphylococcus aureus el cual coloniza la piel del 90% de los pacientes que tienen AD, aún fuera de las erupciones progresivas de la enfermedad. (Current Opinión in Allergy and Clinical 1 Immunol. 2007, 7, 413).

Existe una correlación entre la seriedad de la enfermedad y la densidad de colonización por estafilococos por un lado, y la frecuencia positiva de IgE específica dirigidas contra toxinas estafilocócicas por otro lado (J. Allergy Clin. Immunol. 2006, 117, 1141; Am. J. Clin. Dermatol., 2006, 7, 273; Clin. Rev. Allergy Immunol., 2007, 33, 167; Current Opinión Allergy and Clinical Immunol. 2004, 4, 373).

Esos hechos dan lugar a sugerir que el staphylococcus dorado tiene un papel en el desarrollo de la activación inmune local responsable de los signos cutáneos hacia afuera de la dermatitis atópica y quizá de las sensibilizaciones alérgicas.

Además de rascarse, existen muchos factores que promueven la colonización por Staphylococcus aureus vía la alteración del sistema de defensa primario de la piel y en primer lugar la alteración de la composición de lipidos del estrato córneo. Esta alteración de la función de barrera de la piel es responsable de la colonización por los estafilococos y también el incremento en la pérdida de agua en la piel, causando xerosis, irritación, comezón, dando por lo tanto un tipo de circulo vicioso fisiopatológico .

El manejo terapéutico de la dermatitis atópica puede ser considerada a varios niveles, esencialmente niveles sintomáticos pero también los niveles preventivos. Hoy en dia no existe un tratamiento curativo de la enfermedad .

Además del desalojo de los alérgenos identificados, lo cual es deseable tanto como sea posible, la humectación de la piel como medio para reestablecer o mantener su papel de barrera se adiciona al tratamiento sintomático de las erupciones por corticoterapia local, la cual es la terapia estándar de esta enfermedad. Otros agentes antiinflamatorios no esteroideos tópicos (especialmente inhibidores de calcineurina ) también pueden ser usados para tratar las erupciones. Finalmente, la fototerapia, inmunosupresores per os u otras terapias sistémicas exhaustivas están reservadas para las' formas severas.

Sin embargo, el uso de corticoides, de agentes antiinflamatorios y/o inmunosupresores, aún una vía o ruta tópica, en particular en infantes o en : niños que comienzan a caminar, los expone a efectos indeseables y es únicamente un tratamiento sintomático.

Por otro lado, existe la fobia hacia el uso de corticoides, lo cual le facilita el manejo de esta enfermedad y el cumplimiento de los pacientes, el cual con frecuencia es pobre.

' Finalmente, el Staphylococcus aureus puede inducir resistencia a los corticoides (Clin. Rev.- Allergy Immunol . 2007 33 167) .

De este modo existe la necesidad y una fuerte demanda de alternativas terapéuticas y de manera más particular de alternativas de tratamientos preventivos. Esos tratamientos tienen como propósito reducir la frecuencia y/o intensidad de las erupciones eczemáticas observadas en pacientes afectados con dermatitis atópica. Este método es un acto preventivo terciario de acuerdo con la definición de la O S puesto que tiende a evitar complicaciones (erupciones inflamatorias de la enfermedad) (dermatitis atópica) ya presente .

La solicitud WO2008048076 describe el uso de glucosamina o uno de sus derivados para tratar la dermatitis atópica.

La solicitud WO2007023226 describe el uso de un probiótico combinado con un prebiótico para tratar la dermatitis atópica en niños.

Ahora, se ha notado de manera muy sorprendente e inesperada que una combinación de glicerol, vaseline® y un tipo de parafina liquida en forma de una emulsión aceite en agua o agua en aceite permitió la prevención de la dermatitis atópica.

La invención ha mostrado un efecto inhibidor de esta combinación sobre la adhesión de S'taphylococcus aureus a los queratinocitos en cultivo. La combinación de glicerol, vaselina' y parafina liquida por lo tanto permite la prevención del papel infeccioso de Stpahylococcus aureus en pacientes atópicos asi como su papel sobre el sostenimiento de la reacción inflamatoria por la producción de IgE especificas que inhiben la colonización de la piel por Staphylococcus aureus.

Además, los inventores han mostrado que esta combinación reestablece el papel de barrera protectora y funcional de la piel. Por esto, los inventores han usado un modelo de piel ex vivo de deshidratación de piel inducida. Además, siguiendo la expresión de marcadores epidérmicos y actividad de serina proteasa.

El objetivo de la presente, invención es por lo tanto una composición para uso tópico que comprende, como un ingrediente activo, una combinación de glicerol como base de una parafina liquida, como la emulsión ' aceite en agua o agua en aceite para usarse para prevenir la dermatitis atópica.

Preferiblemente, la prevención es de tipo primario.

En el sentido de la presente invención, los términos "previenen", "prevención" o "tratamiento preventivo" significan que evita la ocurrencia de una enfermedad, de un trastorno o de uno o varios signos y/o síntomas.

En el sentido de la presente invención, el término de "prevención primaria" o "tratamiento preventivo primario" significa que previene la ocurrencia de enfermedades atópicas (dermatitis atópica y/o asma bronquial alérgica y/o rinitis alérgica comúnmente llamada "fiebre del heno") y/o sensibilizaciones alérgicas por actuar antes de los primeros signos químicos de la atopía es decir de la aparición.

En el sentido de la presente invención, la combinación de glicerol, vaselina y parafina líquida como una emulsión aceite en agua o agua en aceite será llamada "combinación activa".

De manera ventajosa, el glicerol, vaselina y parafina- liquida tienen un criterio descrito y controlado de acuerdo con la "Farmacopea Europea", 6a edición.

De manera ventajosa, la vaselina de la combinación activa tiene una temperatura de fusión comprendida entre 35 y 70°C, de manera preferible comprendida entre 51 y 57°C, de manera más preferible de aproximadamente 54 °C. La temperatura de fusión es medida de acuerdo con el método 2.2.17 descrito en la "Farmacopea Europea", 6a edición.

De manera ventajosa, la vaselina de la combinación activa tiene una consistencia comprendida entre 175 y 195 1/10 mm, de manera preferible de aproximadamente 185 1/10 mm (penetración del cono a 25°C) .

De manera ventajosa, la combinación de vaselina del ingrediente activo tiene una viscosidad comprendida entre 4 y 5 cSt a 100°C, de manera preferible de aproximadamente 4.8 cSt a 100°C.

En la composición de acuerdo'- con la invención, la combinación activa está presente de acuerdo con una proporción comprendida entre 10 y 50% y preferiblemente entre 20 y 30% en peso sobre la base del peso total de la composición; la concentración de glicerol está comprendida entre 5 y 30%, preferiblemente entre 10 y 20% y, de manera más preferible es de aproximadamente 15% en peso, sobre la base del peso total de la composición, la concentración de vaselina está comprendida entre 3 y 20%, preferiblemente entre 5 y 10% y, de manera más preferible es de aproximadamente 8% en peso, sobre la base del peso total de la composición y la concentración de parafina liquida está comprendida entre 0.5 y 5%, preferiblemente entre 1 y 3% y, de manera más preferible es de aproximadamente 2% en peso, sobre la base del peso total de la composición.

En la fase acuosa, el agua está comprendida entre 30 y 80%, en peso, sobre la base del peso total de la composición.

De manera ventajosa, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 15% de glicerol, aproximadamente 8% de vaselina y aproximadamente 2% en peso de parafina liquida sobre la base del peso total de la composición .

¦ La composición dermatológica de acuerdo con la invención comprende además los excipientes dermatológicos compatibles de costumbre.

La composición dermatológica de- acuerdo "con la presente invención puede ser preparada como una emulsión agua en aceite (W/O) o aceite en agua (O/W) , como una emulsión múltiple, por ejemplo una emulsión agua en aceite en agua (W/O/W) o una emulsión aceite en agua en aceite (O/W/O) , o además como una hidrodispersión o lipodispersión, una gel o un aerosol.

Los excipientes dermatológicamente compatibles pueden ser cualesquier excipientes entre aquellos conocidos por los expertos en la técnica para obtener una composición para la 'aplicación tópica como una crema, una loción, un gel, un ungüento, una emulsión, una microemulsión, un rocío, etc.

La composición de acuerdo con la invención puede en particular contener aditivos y auxiliares de formulación, como emulsificantes , espesantes, agentes gelificantes , agentes fijadores de agua, agentes de propagación, estabilizadores, tintes, perfumes y preservativos.

Los emulsificantes adecuados comprenden ácido esteárico, trolamina, estearato de PEG 40.

Preferiblemente, composición de acuerdo con la invención tiene aproximadamente 5% en peso de emulsificante sobre la base del peso total de la composición.

De manera ventajosa, la composición de acuerdo con la invención tiene entre un 5% de ácido esteárico, de manera preferible aproximadamente 3% en peso sobre la base del peso total de la composición.

De manera ventajosa, la composición de acuerdo con la invención tiene entre 0 y 2% de trolamina, de manera preferible aproximadamente 0.5% en peso sobre la base del peso total de la composición.

De manera ventajosa, la composición de acuerdo con la invención tiene entre 0 y 2% de estearato de PEG 40, de manera preferible aproximadamente 0.5% en peso sobre la base del peso total de la composición.

Los espesantes adecuados comprenden monoestearato de glicero, PEG.

Preferiblemente, la composición de acuerdo con la invención tiene aproximadamente 5% en peso de espesantes sobre la base del peso total de la composición.

De manera ventajosa, la composición de acuerdo con la invención tiene entre 2 y 10% '· de monoestearato de glicerol, de manera preferible entre aproximadamente 5% en peso sobre la base del peso total de la composición.

Los preservativos adecuados comprenden parahidroxibenzoato de propilo, clorocresol.

Preferiblemente, la composición de acuerdo con la invención tiene aproximadamente 0.1% en peso de preservativos, sobre la base del peso total de la composición.

De manera ventajosa, la composición de acuerdo con la invención tiene entre 0.05 y 1% de parahidroxibenzoato de propilo, de manera preferible aproximadamente 0.1% sobre la base del' peso total de la composición. : Los agentes de dispersión adecuados comprenden dimeticona, polidimetilciclosiloxano .

Preferiblemente, la composición de acuerdo con la invención tiene aproximadamente 2% en peso de agentes de dispersión de propagación, sobre la base del peso total de la composición.

De manera ventajosa, la composición de acuerdo con la invención tiene entre 0.2 y 2% de dimeticona, de manera preferible aproximadamente 0.5% sobre la base del peso total de la composición.

De manera ventajosa, la composición de acuerdo con la invención tiene entre 1 y un 3% de polidimetilciclosiloxano, de manera preferible aproximadamente 2.5% en peso sobre la base del peso total de la composición.

Los agentes fijadores de agua adecuados comprenden polietilenglicol , preferiblemente polietilenglicol 600.

Preferiblemente, la composición de acuerdo con la invención tiene aproximadamente 8% ;en peso de agentes fijadores de agua sobre la base del peso total de la composición .

De manera ventajosa, la composición de acuerdo con la invención tiene entre 2 y 10% de polietilenglicol, de manera preferible aproximadamente 5% en peso sobre la base del peso' total de la composición.

El agua usada para la fase acuosa de la emulsión puede ser agua destilada o agua térmica que tenga propiedades dermatocosméticas .

De manera ventajosa, la composición de acuerdo con la invención comprende: - aproximadamente 15% de glicerol, - aproximadamente 8% de vaselina, - aproximadamente 2% de paráfina liquida, y como excipientes: - de aproximadamente 1 a 5% de ácido esteárico, - de aproximadamente 2 a 10% de monoestearato de glicerol, de aproximadamente 1 a 3% de polidimetilciclosiloxano, - de aproximadamente 0.2% a 1% de dimeticona, - de aproximadamente a 2 a 10% de polietilen glicol 60.0, - de aproximadamente 0 a 2% de trolamina, de aproximadamente 0.05 a 1% de parahidroxibenzoato de propilo. - agua hasta 100%.

El objetivo de la presente invención es también el uso de una composición de acuerdo con la invención para producir un fármaco que se pretende prevenga la dermatitis atópica.

La presente invención es ilustrada por los siguientes e emplos .

EJEMPLOS Ejemplo 1: Formulaciones Composición A - 15 g de glicerol, - 8 g de vaselina, - 2 g de parafina liquida, - 0.5 g de trolamina y como excipientes, ácido estéarico, monoestearato de glicerilo, polidimetilciclosiloxano, dimeticona, polietilenglicol (PEG) 600, parahidroxibenzoato de propilo agua hasta 100 g.

Composición A' - 15 g de glicerol, - 8 g de vaselina, - 2 g de parafina liquida, - 1.5 g de ácido esteárico - 5 g de monoestearato de glicerol - 1.5 g de polidimetilciclosiloxano, - 0.5 g de dimeticona, - 5 g de polietilen glicol 600 - 0.15 g de trolamina, - 0.1 g de parahidroxibenzoato de propilo - agua hasta 100 g.

Composición B - 15 g de glicerol, - 8 g de vaselina, - 2 g de parafina liquida, - 0.5 g de estearato de PEG 40 y como excipientes, , ácido estéarico, monoestearato de glicerilo, polidimetilciclosiloxano, dimeticona, polietilenglicol (PEG) 600, clorocresol . agua hasta 100 g.

Composición ?' - 15 g de glicerol, - 8 g de vaselina, - 2 g de parafina liquida, - 3 g de ácido esteárico - 5 g de monoestearato de glicerol - 2 g de polidimetilciclosiloxano, - 0.5 g de dimeticona, - 0.15 g de trolamina, - 3 g de polietilen glicol 600 - 0.5 g de estearato de PEG 40 - 0.075 g de clorocresol ' - agua hasta 100 g.

Ejemplo 2: Prueba de Citotoxicidad Principio El principio de la prueba se basa en la transformación enzimática de una sal de tetrasodio "hidrato de sodio 3, 3- [1 [ (fenialmino) carbonil] -3-4-tetrazolio bis (4-metoxi-6-nitro) ] bencen sulfónico" es decir XTT, en un producto coloreado, formazan.

El XTT es reducido por la deshidrogenasa mitocondrial de células vivas en presencia de un agente acoplador de electrones, la coenzima Q, en un compuesto soluble 'en agua amarillo/anaran ado grisáceo, formazan, el cual puede ser ensayado por espectrofotometria a 450 nm.

Tratamiento con el producto Microplacas de 96 pozos son sembradas con 105 células/mL después de 24 h de incubación, el medio de cultivo removido y las microplacas son ensayadas con PBS. 100 µ?, de las diferentes diluciones del producto de prueba son agregadas a cada pozo de las microplacas. Los controles sin ningún producto se hacen bajo las mismas condiciones.

Las microplacas son colocadas para incubación durante 2 horas a 37°C bajo 5% de C02.

Revelación de citotoxicidad Después de la incubación, las microplacas son lavadas dos veces con PBS. A continuación, se agregan 100 pL de una mezcla de XTT (1 mg/mL) /coenzima Q (0.2 mg/mL) en cada pozo de la placa de 96 pozos.

Después de 3 horas de incubación, se agregan 100 pL de una solución de SDS al 10% en cada pozo.

Se lleva a cabo la lectura inmediata de la densidad óptica a 450 nm con el espectrofotómetro POLARstar (BMG, Francia) .

Expresión de los resultados La densidad óptica medida es proporcional a la población de células viables.

Con esta prueba, es posible para nosotros analizar a partir de una densidad óptica correspondiente al control, la toxicidad celular cuando la densidad óptica es menor que la del lote control: % de viabilidad = (OD Tratado - OD control) /OD Control x 10 El producto se considera citotóxico si el por ciento de viabilidad es < 30%.

Las pruebas intramanipulación se llevan a cabo 8 veces .

Resultados Dependiendo del grado de ausencia de toxicidad de los productos, las concentraciones seleccionadas para la prueba de adhesión son las siguientes: - Composición A: 6%, 3%, 1.5%, 0.8% y 0.4% - Atopiclair®: 0.8%, 0.4%, 0.2%, 0.1% y 0.05% ¦ - Physiogel®: 6%, 3%, 1.5, 0.8% y 0.4% - Composición B: 3%, 1.5%, 0.8%, 0.4% y 0.2% Ejemplo 3 : Prueba de adhesión Principio Marcación de las bacterias con adenina tritiada (sigma) y determinación de la proporción de las bacterias adheridas a la superficie de los queratinocitos evaluando el nivel de radioactividad.

Marcación de las bacterias con adenina tritiada La marcación de las bacterias se lleva a cabo en presencia de 3 Ci de adenina tritiada en un medio de cultivo adecuado. Después de cultivar durante 18h a 37 °Cf los microorganismos son lavados tres veces en PBS para remover la radioactividad no incorporada.

• Las suspensiones son ajustadas a 2xl08 microorganismos/mL en el medio de sustentación.

' Efecto inhibidor de la adhesión 500 pL de las bacterias marcadas en presencia de cada dilución de prueba del producto son depositadas en la superficie de la capa celular.

Después de 2 horas de incubación (37°C, 5% de C02) , se llevan a cabo 3 lavados con PBS.

Lisis de las células Las bacterias adheridas a los queratinocitos son Usadas con 500 iL de una solución de hidróxido de sodio 0.5N con 0.1% de dodecil sulfato de sodio durante 18 horas a 37°C.

El lisado de cada pozo es muestreado y colocado en tubos de conteo. Se agregan 2 mL de destellador en estado liquido en cada tubo.

Expresión de los resultados La lectura se lleva a cabo con un contador ß el cual expresa el nivel de radioactividad en cpm (conteos por minuto) .

- El porcentaje de inhibición de la adhesión es calculado de acuerdo con la fórmula: % de inhibición = ( (cpm de prueba - cpm de control) /cpm de control) x 100 El porcentaje de inhibición de la adhesión es significátivo si su valor es < 30%.

Las pruebas son conducidas por cuadruplicado.

Conclusión - La composición A inhibe significativamente la adhesión de S. aureus a los queratinocitos después de 2 horas de incubación a 6% y 3% .

- El producto Fisiogel inhibe significativamente la adhesión de S. aureus a los queratinocitos después de 2 horas de incubación a 6% pero no a 3%.

- El producto Atopiclair no1 tiene ningún efecto sobre la' adhesión de S. aureus a los queratinocitos.

- En presencia de la composición B, la adhesión de S. aureus a los queratinocitos se incrementó de manera anormal .

Ejemplo 4: análisis de la regulación de deshidratación de piel inducida Evaluamos aquí la actividad humectante de la composición A y la mejora posterior en la función de barrera de la piel usando un modelo de piel ex vivo de deshidratación de piel inducida.

Observamos la expresión de marcadores epidérmicos moleculares diferenciales por PCR cuantitativa e inmunohistoquimica .

' También seguimos la actividad de las enzimas serina proteasa-por zimografia in situ y la degradación de proteínas corneodesmosomales por Western blotting.

La funcionalidad de la barrera de la piel es analizada usando sonda o pruebas fluorescentes.

Equipo y métodos I . Modelos de Tejido 1. Preparación de explantes de piel El laboratorio recupera' muestras de piel de residuos de operación de cirugía plástica (reducciones mamarias) . El uso de esas muestras dentro el alcance de "la declaración de una actividad para preservar y preparar elementos de cuerpo humano para las necesidades de un programa de investigación del grupo de Pierre Fabre" efectuada en el Ministerio Francés de Educación Superior e Investigación.

Esas muestras son lavadas con 10 baños de PBS y entonces cortadas con matriz en discos con un diámetro de 2 cm. Los explantes de piel son extendidos sobre una rejilla en una caja de Petri y un anillo con un diámetro de 1 cm es sellado sobre la piel para delimitar el área de tratamiento. 2. Cinética de los modelos Para el modelo de deshidratación inducida, la piel es secada durante 2 horas bajo una campana de cultivo celular en un disco sin ninguna tapa y entonces colocada en el horno para tratamiento tópico con o sin ninguna combinación activa durante 2 horas. El control negativo de esfuerzo de deshidratación es sometido a la misma cinética en una caja de petri cerrada. 3. Muestras para análisis Después del tratamiento, son muestreadas dos biopsias con un diámetro de 6 mm para analizar la expresión de ARN y una biopsia con un diámetro de 4 mm incluida en un bloque de resina Tissue Tek® (Sakura Finetek) para histología. Para analizar la proteína, la piel es expuesta a un choque térmico en un baño de agua a 60°C durante 5 minutos y entonces a 4°C durante 2 minutos para separar la epidermis de la dermis.

Las biopsias y epidermis : son congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a -80°C antes de ser analizadas.

II . Análisis del transcriptoma por PCR cuantitativa Las biopsias de piel son molidas en un mortero enfriado de antemano con nitrógeno líquido y los ARNs son extraídos por medio de un equipo de RNeasy® (QIAGEN) de acuerdo con las recomendaciones del distribuidor. El ARN es entonces ensayado con un Bioanalizer 2100® (Agilent Technologies) sobre placas de RNA 6000 Nano LabChip®. El ADNc es obtenido de 1 g de ARN por una reacción de retrotranscripción enzimática llevada a cabo con un equipo Access RT-PCR Core Reagents® (Promega) con cebadores de oligo DT. Los niveles de expresión genética son analizados por PCR cuantitativa sobre un termociclador de fluorescencia IClicler iQ® (Biorad) con equipos PCR iQMRSYBR® Green Super Mix (Bioard) de acuerdo con un procedimiento de 40 ciclos que comprende desnaturalización a 95°C (15 s) y alargamiento a 60°C (1 rom) . La acumulación del producto de la PCR, proporcional a la emisión de la fluorescencia (intercalante SYBR® Green) es observado ciclo tras ciclo por medio del programa iCycler.

El programa de análisis iClycler versión 3.1 proporciona valores sin tratar de CT (Umbral de Ciclo) : el ciclo del cual comienza con la amplificación de ADNc. La expresión de varios genes de referencia es analizado en paralelo' por medio del programa Genorm versión 3.4 el cual permite la selección del gen de referencia más estable de una muestra a otra. Este gen es entonces usado como referencia para la normalización de los resultados por el cálculo de ACT= CT del gen de interés - CT del gen de referencia.

El factor de inducción (FI) es entonces calculado para cada tratamiento con relación a lá condición de control correspondiente. FI = 2~??et donde AACT ' = ACT tratado - ñCT control. La expresión de los ARNm es evaluada por duplicado para cinco experimentos de 5 diferentes individuos. Cuando el factor de inducción con relación al control es mayor que 2, se considera que la expresión del gen es inducida cuando es menor de 0.5, se considera que la expresión es reprimida. El efecto del ingrediente activo sobre la respuesta del esfuerzo causado en el modelo es evaluado por el porcentaje de inhibición calculado por la siguiente fórmula: % de inhibición de la respuesta de esfuerzo = 100* [(FI. sometido a esfuerzo - FI control libre de esfuerzo) - (FI tratado - FI control libre de esfuerzo) ]/[ (FI sometido a esfuerzo - FI libre de esfuerzo) ] Comparado con el modelo de estudio, la condición "control libre de esfuerzo" corresponde a un control no sécela condición "sometida a esfuerzo" corresponde a una biopsia de piel la cual ha sidó secada durante 2 horas y que ha estado dos horas adicionales bajo las condiciones control (es decir, sin ningún tratamiento tópico) ; finalmente, la condición "tratada" el la piel que ha sido sometida a 2 horas de secado seguidas por 2 horas de tratamiento tópico con un emoliente.

III. Análisis de la expresión de proteina por Western Blotting Las epidermis tratadas son molidas en un mortero enfriado con nitrógeno liquido y las proteínas son extraídas en un amortiguador de análisis ROPA (Tris HC1 pH 8 50 mM; NaCl 150 mM; Tritón X 100 IX; 1% de Na+desoxicolato; 0.1% de SDS; EDTA 5 mM; DTT 100 mM; un cóctel de inhibidores de proteasa (referencia P8340, SIG A) Las proteínas son entonces ensayadas por el método de ensayo de proteína DC-DC (Biorad) y analizadas por Western blotting. Para cada condición, se depositan de 25 a 40 µ? de proteínas totales sobre geles de Tris-Glicina con 7.5% de poliacrilamida . La mezcla de proteína es separada por electrofóresis con el sistema Mini Protean II (Biorad) y las proteínas son transferidas en una membrana de PVDF (hybond-P, Amersham) . La proteína de interés es revelada por un anticuerpo específico y un equipo ECL+ (Amersham) . La cantidad de proteína y la proporción degradada de la misma son calculadas por medio del programa Image Master TotalLab versión 1.11 (Amersham) después de 'la normalización con relación a la ß-actina (proteína de referencia) .

IV. Técnicas histológicas Las biopsias de piel son cortadas con el Criotomo (Leica CM) 3050 s) en cortes con un espesor de 5µ?? y depositadas sobre portaobjetos de observación (Starfrost®) . 1. Iranunohistoquímica Los criocortes son fijados durante 10 minutos con acetona a 20°C y entonces rehidratados con PBS antes de ser analizados por marcado inmunoquímico . Después de la fijación y rehidratación, los cortes de piel son saturados con una solución de BSA al 3% e incubados durante 1 hora con el anticuerpo primario dirigido contra la proteina de interés. En una segunda fase, se incuban durante 1 hora con el anticuerpo secundario acoplado con un fluorocromo Alexa-488 o Alexa-555 y finalmente montadas en owiol que contiene DAPI para marcar los núcleos. 2. Zimografia In situ Después de fijar durante 10 minutos en acetona a -20°C, los cortes son enjuagados en una solución de lavado (1% de T een 20 en agua) e incubados durante 2 horas a 37 °C con una solución que contiene el sustrato especifico de las enzimas de interés acopladas con un fluoróforo (auxiliar) . Cuando la enzima es activada, el fluoróforo es escindido, liberando la señal fluorescente que puede ser observada bajo el microscopio. Los portaobjetos marcados son entonces observados bajo un microscopio con epifluorescencia (Nikon Eclipse 50i) o bajo un microscopio confocal invertido Zeiss Axiovert' 100. 3. Sonda fluorescente Después del tratamiento de deshidratación , los explantes de piel son incubados adicionalmente durante una hora en el horno a 3 °C con una sonda fluorescente de sal de carboxihidrazida de dilitio amarilla Lucifer (Invitrogen) a 1 mM en amortiguador HBSS. La piel es entonces enjuagada en el baño de HBSS durante 1 minuto y entonces se muestrean biopsias con un diámetro de 4 mm y se incluyen en la resina Tissue TekR® (Sakura Finetek) (Matsuki et al., 1998). La piel es entonces cortada, los núcleos son marcados con DAPI y los portaobjetos son observados bajo ¦ un microscopio de fluorescencia con una longitud de onda de 450 nm como se describió anteriormente.

Resultados 1. Modelo de falla de función de barrera por secado inducido 1. Medición de permeabilidad de la piel con una sonda fluorescente El primer análisis consistió de un estudio de un parámetro funcional fundamental en la función de barrera de la piel: la permeabilidad de las capas superiores de la epidermis. La incubación de la piel con una sonda fluorescente (Amarillo Lucifer) después del experimento de secado permitió la caracterización de la modulación de la permeabilidad de la piel. Bajo condiciones de control, el marcado es muy lento y superficial, la sonda no penetra mucho a través de estrato córneo y se remueve durante el enjuague. Después de dos horas de secado, la marca es observable en los estratos más profundos del estrato córneo. El secado hace la piel más permeable, su función de barrera se deteriora. El tratamiento tópico por la composición A después de dos horas del secado reestablece la impermeabilidad de SC con relación a la sonda, la marcación es nuevamente : superficial , al igual que bajo las condiciones control. Entonces puede concluirse que el tratamiento humectante tiene un efecto reparador sobre la piel seca y sobre la función de barrera de la piel que es observable sobre el modelo tisular. 2. Efectos sobre la regulación del transcriptoma y del proteoma La expresión de diferentes ' genes potencialmente implicados en la homeostasis de la función de la barrera epidérmica fue medida por PCR cuantitativa bajo diferentes condiciones de esfuerzo o tratamiento del modelo de secado. El análisis por inmunohistoquimica dio la posibilidad de mostrar · la reorganización de la expresión de ciertas proteínas en términos de localización," por ejemplo cerca de uniones. La degradación de las proteínas corneodesmosomales fue analizada por Western blotting.

Los blancos estudiados por medio de esos diferentes métodos ' fueron agrupados juntos de acuerdo a su papel fisiológico (véase la Tabla 1) . La meta del estudio es observar una respuesta de esfuerzo observable y una corrección del efecto de esfuerzo por aplicación tópica de la composición A.

En el trabajo efectuado también fue posible mostrar los diferentes niveles de regulación de ciertos blancos. De este modo, pudimos notar que las enzimas de descamación no eran reguladas a nivel transcripcional sino más particularmente en su nivel de actividad (véanse los resultados 3 ) .

Tabla 1 : Resumen de los blancos y de la respuesta farmacológica estudiada en el modelo de resequedad Y = El blanco reacciona en el -modelo; S = Si X = El blanco no reacciona en el modelo; N = No KLK7 X X KLK8 X X Serina proteasas Y Y Catepsina D X X ABCA12 Y Y ABCG1 X X B-GC X X DES 2 X X Filagrina Y Y Involucrina X X TG1 X X TG3 X X Caspase .14 X X ElYx-3 . Y X 12R-LYX X X HAS 2 Y X CD4 4 X X AQP 3 Y Y NHE1 Y Y IL-la Y Y Ocludina Y Y Claudina 1 Y Y Claudina 4 Y Y ZO-1 X X E-Cadherina X X ß-Catenina X X 3. Medición de la actividad enzimática relacionada con la descamación La actividad de la serina proteasa fue evaluada por zimograf'ia in situ en el modelo de deshidratación y observada bajo un microscopio confocal bajo condiciones de control después de dos horas de secado y después de dos horas de secado seguidas por incubación durante dos horas con la composición A. La marcación es más intensa bajo las condiciones control, corresponde a una fuerte actividad normal. Esta marcación disminuyó y se volvió irregular a lo largo de estrato córneo después de dos horas de secado mientras que su intensidad se incrementó y la localización de la actividad es reorganizada después de dos horas de incubación con la composición A. El secado tiene el efecto de hacer disminuir y perturbar la actividad enzimática. Esos resultados son consistentes con la reducción y la degradación de proteínas corneodesmosomales las cuales observamos con resequedad y confirman el efecto del secado o resequedad sobre la reducción en la descamación observada en el modelo desarrollado. La composición A es capaz de reestablecer la actividad enzimática de la piel deshidratada, lo cual confirma el efecto de esta composición sobre el retorno de la hemostasia de la descamación.

Esos resultados muestran que la composición A permite el reestablecimiento del nivel de expresión de los blancos moleculares, la expresión de los cuales es incrementada por la reducción del esfuerzo de deshidratación de la piel. Con la composición A también es posible reestablecer la actividad de la serina proteasa. Además, la aplicación tópica de la composición A permite la supresión de la inflamación inducida por esfuerzo.

Todos esos resultados sugieren que la composición A como una' aplicación tópica permite el reestablecimiento de la función de barrera de la piel, limitación o aún prevención de la colonización por el estafilococo dorado y de este modo es un "tratamiento preventivo primario" que previene la ocurrencia de enfermedades atópicas (dermatitis atópica y/o asma bronquial alérgica y/o rinitis- alérgica comúnmente llamada fiebre del heno)' y/o sensibilizaciones alérgicas.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una composición para uso tópico, caracterizada porque comprende, como un ingrediente activo, una combinación de glicerol, vaselina y parafina liquida como una emulsión aceite en agua o agua en aceite para usarse en la prevención de la dermatitis atópica.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, para su uso en la prevención primaria de la dermatitis atópica.

' 3. La composición de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque la vaselina tiene una temperatura de fusión comprendida entre 35 y 70°C.

4. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la vaselina tiene una temperatura de fusión comprendida ¦ entre 51 y 57°C, especialmente 54°C.

5. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la vaselina tiene una consistencia comprendida entre 175 y 195 1/10 mm (penetración del cono a 25°C) .

6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la vaselina tiene una consistencia de aproximadamente 185 1/10 mm (penetración del cono a 25°C) .

7. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la vaselina tiene una viscosidad comprendida entre 4 y 5 cSt a 100°C.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la vaselina tiene una viscosidad de aproximadamente 4.8 cSt a 100°C.

9. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende aproximadamente 15% de glicerol, aproximadamente 8% de vaselina y aproximadamente 2% de parafina liquida.

10. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende' uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste de ácido esteárico, monoestearato de glicerol, polidimetilciclosiloxano, dimeticona, polietilenglicol 600, trolamina, parahidroxibenzoato de propilo, agua destilada.

11. El uso de una composición que comprende como el ingrediente activo, una combinación de glicerol, vaselina y parafina liquida como una emulsión aceite en agua o agua en aceite p'ara preparar un fármaco que se pretende prevenga la dermatitis atópica. ;

12. El uso de una composición como se describe en las reivindicaciones 3 a 10 para preparar un fármaco que se pretende prevenga la dermatitis atópica.