EP2296639A1 - Composition emolliente pour le traitement preventif de la dermatite atopique - Google Patents
Composition emolliente pour le traitement preventif de la dermatite atopiqueInfo
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- EP2296639A1 EP2296639A1 EP09745847A EP09745847A EP2296639A1 EP 2296639 A1 EP2296639 A1 EP 2296639A1 EP 09745847 A EP09745847 A EP 09745847A EP 09745847 A EP09745847 A EP 09745847A EP 2296639 A1 EP2296639 A1 EP 2296639A1
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Definitions
- the present invention relates to the field of atopy and the treatment of conditions associated therewith.
- Atopy is defined as a hereditary predisposition to respond symptomatically (illness) to various allergens, such as house dust, mites, pollen, animal hair, etc.
- Atopic conditions include atopic dermatitis (AD), allergic bronchial asthma and allergic rhinitis or "hay fever”.
- Atopic dermatitis (or atopic eczema) is a common dermatological disease, affecting 10 to 15% of infants in France, increasing in recent decades.
- Atopic dermatitis is a chronic disease that evolves in relapses, interspersed with periods of remission during which the lesions are still present but minimal manifested primarily by xerosis (dry skin) and pruritus.
- Inflammation of the skin is characteristic of flares that result in inflammatory signs and symptoms including redness (erythema), vesicles, scabs, oozing and itching.
- the disease usually starts between the ages of 3 months and 2 years, but can start even earlier at the age of 1 month. Its evolution is often good with a complete remission intervening between 5 and 8 years in the majority of the cases. Resurgence in adolescence or in young adults is possible. The disease can persist in adulthood in 15 to 20% of cases.
- the risk of developing asthma in a child with AD is estimated to be between 30 and 40%.
- atopic dermatitis there is a marked genetic predisposition, with a risk of 30 to 50% of developing the disease if one of the parents is affected, and about 80% if both parents are affected.
- Genetic predisposition involves many genes, coding either for determinants of the epidermis barrier function, or for actors of innate or adaptive immunity. Taking into account many recent works, it can be hypothesized that AD (or other atopic diseases) are related to a primitive abnormality of the epidermal barrier function, responsible for increased permeability to environmental agents (allergens and microorganisms) responsible for the immunological activation and allergic manifestations.
- the anomaly of the epidermal permeability results in cutaneous xerosis and an increase in the insensible loss of water and in the demonstration of a polymorphism of genes coding for epidermal proteins such as fibaggrin (FLG), participating in the barrier function of the epidermis (Palmer, 2006).
- FLG fibaggrin
- a recent study confirms in France the association of a polymorphism of the FLG gene with DA, with a relative risk higher than 3 (Hubiche, 2007).
- Atopy can be considered as a delayed hypersensitivity reaction of contact to environmental allergens. It usually comes in two phases. A first phase of clinically silent sensitization and generating specific T lymphocytes at the cutaneous level. This sensitization is done by penetration of allergens from the environment to the skin level facilitated by xerosis. A second phase of activation of specific T lymphocytes results in the production of pro-inflammatory cytokines.
- staphylococcus aureus may play a role in the development of local immune activation responsible for cutaneous manifestations of atopic dermatitis and possibly allergic sensitization.
- atopic dermatitis can be considered at different levels, which are essentially symptomatic but also preventive. To date, there is no cure for the disease.
- hydration of the skin as a means of restoring or maintaining its barrier role is complementary to the symptomatic treatment of relapses. by local corticosteroids which is the reference therapy for this disease.
- Other topical non-steroidal anti-inflammatory drugs including calcineurin inhibitors may also be used to treat relapses.
- phototherapy, oral immunosuppressants or other heavy systemic therapies are reserved for severe forms.
- Staphylococcus aureus may induce resistance to corticosteroids (Clin Rev Allergy Immunol 2007 33 167)
- WO2008048076 discloses the use of glucosamine or a derivative thereof for treating atopic dermatitis.
- WO2007023226 discloses the use of a probiotic combined with a prebiotic for treating atopic dermatitis in children.
- the inventors have shown that this combination restores the protective and functional barrier role of the skin.
- the inventors used an ex vivo skin model of induced skin dehydration.
- they followed the expression of epidermal markers and serine protease activity.
- composition for topical use comprising, as active principle, a combination of glycerol, petrolatum and liquid paraffin, in the form of an oil-in-water or water-in-oil emulsion for its use for the prevention of atopic dermatitis.
- the prevention is of the primary type.
- prevent means to avoid the appearance of a disease, a disorder or one or more signs and / or symptoms.
- primary prevention means preventing the appearance of atopic diseases (atopic dermatitis and / or allergic bronchial asthma and / or allergic rhinitis commonly known as "hay fever") and / or allergic sensitization by acting before the first clinical manifestations of atopy ie from birth.
- atopic diseases atopic dermatitis and / or allergic bronchial asthma and / or allergic rhinitis commonly known as "hay fever
- active combination will be used to designate the combination of glycerol, petrolatum and liquid paraffin in the form of an oil-in-water or water-in-oil emulsion.
- glycerol, petrolatum and liquid paraffin have the criteria described and controlled according to "European Pharmacopeia", 6th Edition.
- the vaseline of the active combination has a dropping point of between 35 and 70 ° C., preferably between 51 and 57 ° C., particularly preferred about 54 ° C.
- the drop point is measured according to the method 2.2.17 described in "European Pharmacopeia", 6th Edition.
- the vaseline of the active combination has a consistency of between 175 and 195 1/10 mm, preferably about 185 1/10 mm (cone penetration at 25 ° C).
- the vaseline of the active combination has a viscosity of between 4 and 5 cSt at 100 ° C., preferably about 4.8 cSt at 100 ° C.
- the active combination is present in a proportion of between 10 and 50% and preferably between 20 and 30% by weight relative to the total weight of the composition; the concentration of glycerol is between 5 and 30%, preferably between 10 and 20% and particularly preferably is about 15% by weight relative to the total weight of the composition, the petrolatum concentration is between 3 and 20%. %, preferably between 5 and 10% and particularly preferably is about 8% by weight relative to the total weight of the composition and the liquid paraffin concentration is between 0.5 and 5%, preferably between 1 and 3 % and particularly preferably is about 2% by weight relative to the total weight of the composition.
- the water is between 30 and 80% by weight relative to the total weight of the composition.
- the composition according to the invention comprises approximately 15% of glycerol, approximately 8% of petrolatum and approximately 2% of liquid paraffin by weight relative to the total weight of the composition.
- the dermatological composition according to the invention further comprises conventional dermatologically compatible excipients.
- the dermatological composition according to the present invention may be prepared in the form of a water-in-oil (W / O) or oil-in-water (O / W) emulsion, a multiple emulsion such as, for example, a water-in-oil emulsion.
- W / O water-in-oil
- O / W oil-in-water
- a multiple emulsion such as, for example, a water-in-oil emulsion.
- the dermatologically compatible excipients may be any excipient among those known to those skilled in the art to obtain a composition for topical application in the form of a cream, a lotion, a gel or an ointment. , an emulsion, a microemulsion, a spray, etc.
- the composition according to the invention may in particular contain additives and formulation aids, such as emulsifiers, thickeners, gelling agents, fixing agents and the like. water, leveling agents, stabilizers, dyes, perfumes and preservatives.
- Suitable emulsifiers include stearic acid, trolamine, PEG-40-stearate.
- the composition according to the invention has about 5% emulsifiers by weight relative to the total weight of the composition.
- the composition according to the invention has between 1 and 5% of stearic acid, preferably about 3% by weight relative to the total weight of the composition.
- the composition according to the invention has between 0 and 2% of trolamine, preferably about 0.5% by weight relative to the total weight of the composition.
- the composition according to the invention has between 0 and 2% of PEG-40-stearate, preferably about 0.5% by weight relative to the total weight of the composition.
- Suitable thickeners include glycerol monostearate, PEG.
- the composition according to the invention has about 5% thickeners by weight relative to the total weight of the composition.
- the composition according to the invention has between 2 and 10% of glycerol monostearate, preferably about 5% by weight relative to the total weight of the composition.
- Suitable preservatives include propyl parahydroxybenzoate, chlorocresol.
- the composition according to the invention has about 0.1% preservatives by weight relative to the total weight of the composition.
- the composition according to the invention has between 0.05 and 1% of propyl parahydroxybenzoate, preferably about 0.1% by weight relative to the total weight of the composition.
- Suitable leveling agents include dimethicone, polydimethylcyclosiloxane.
- the composition according to the invention has about 2% spreading agents by weight relative to the total weight of the composition.
- the composition according to the invention has between 0.2 and 2% dimethicone, preferably about 0.5% by weight relative to the total weight of the composition.
- the composition according to the invention has between 1 and 3% of polydimethylcyclosiloxane, preferably about 2.5% by weight relative to the total weight of the composition.
- Suitable water fixatives include polyethylene glycol, preferably polyethylene glycol 600.
- the composition according to the invention has about 8% water fixers by weight relative to the total weight of the composition.
- the composition according to the invention has between 2 and 10% of polyethylene glycol, preferably about 5% by weight relative to the total weight of the composition.
- the water used for the aqueous phase of the emulsion may be distilled water or thermal water having dermato-cosmetic properties.
- the composition according to the invention comprises:
- glycerol about 15% glycerol, about 8% petrolatum, about 2% liquid paraffin, and as excipients: about 1 to 5% stearic acid, about 2 to 10% glycerol monostearate, about 1% 3% polydimethylcyclosiloxane, about 0.2 to 2% of dimethicone,
- polyethylene glycol 600 about 0 to 2% trolamine, about 0.05 to 1% propyl parahydroxybenzoate - up to 100% water.
- the present invention also relates to the use of a composition according to the invention for the manufacture of a medicament for preventing atopic dermatitis.
- composition A Composition A
- composition A stearic acid, glycerol monostearate, polydimethylcyclosiloxane, dimethicone, polyethylene glycol (PEG) 600, propyl parahydroxybenzoate water up to 100 g.
- Composition A '
- composition B stearic acid, glycerol monostearate, polydimethylcyclosiloxane, dimethicone, polyethylene glycol 600, chlorocresol, water up to 100 g.
- Composition B ' stearic acid, glycerol monostearate, polydimethylcyclosiloxane, dimethicone, polyethylene glycol 600, chlorocresol, water up to 100 g.
- the principle of the test is based on the enzymatic transformation of a tetrazolium salt, sodium 3,3 [1 [(phenylamino) carbonyl] -3-4-tetrazolium bis (4- methoxy- ⁇ nitro)] benzene sulfonic acid hydrates "or XTT, into a colored product, formazan.
- XTT is reduced by the mitochondrial dehydrogenase of living cells in the presence of an electron coupling agent, coenzyme Q, to a water-soluble yellow / orange compound, formazan, measurable by spectrophotometry at 450 nm.
- the 96-well microplates are inoculated at 10 5 cells / ml, after 24 hours of incubation the culture medium is removed and the microplates are rinsed with PBS. 100 ⁇ l of the different dilutions of the test product are added to each well of microplates. Controls without product are made under the same conditions. The microplates are incubated for 2 hours at 37 ° C. under 5% CO 2 .
- microplates are washed twice with PBS. Then, 100 ⁇ l of XTT mixture (1 mg / ml) / coenzyme Q (0.2 mg / ml) are added to each well of the 96-well plate.
- optical density recorded is proportional to the viable cell population. This test therefore allows us to analyze from an optical density corresponding to the control, a cellular cytotoxicity when the optical density is lower than that of the control group:
- Viability% (OD Treaty - OD Control) / OD Control X 10
- the product is considered cytotoxic if the percentage of viability ⁇ 30%. Intra-manipulation tests are performed 8 times. Results
- the concentrations chosen for the adhesion test are as follows:
- composition A 6%, 3%, 1.5%, 0.8% and 0.4% - Atopiclair®: 0.8%, 0.4%, 0.2%, 0.1% and 0, 05%
- composition B 3%, 1.5%, 0.8%, 0.4% and 0.2%
- the bacteria are labeled in the presence of 30 ⁇ Ci of tritiated adenine in suitable culture medium. After incubation for 18 hours at 37 ° C, the microorganisms are washed three times in PBS to remove unincorporated radioactivity. The suspensions are adjusted to 2x10 8 microorganisms / ml in the holding medium.
- 500 ⁇ l of labeled bacteria in the presence of each test dilution of the product are deposited on the surface of the cell layer.
- Lyse cells The bacteria adhered to the keratinocytes are lysed with 500 ⁇ l of a 0.5 N sodium hydroxide solution at 0.1% sodium dodecyl sulfate for 18 hours at 37 ° C.
- the lysate of each well is taken and placed in the counting tubes. 2 ml of scintillation fluid are added to each tube.
- the reading is done on the counter ⁇ which expresses the rate of radioactivity in cpm (counts per minute).
- Composition A significantly inhibits the adhesion of S. aureus to keratinocytes after 2 hours of incubation at 6% and 3%.
- the product Physiogel significantly inhibits S. aureus adhesion to keratinocytes after 2 hours of incubation at 6% and not at 3%. - The product Atopiclair has no effect on the adhesion of S. aureus to keratinocytes
- composition B In the presence of composition B, the adhesion of S. aureus to keratinocytes is abnormally increased.
- Example 4 Analysis of the regulation of induced cutaneous dehydration
- the laboratory retrieves skin samples from plastic surgery surgical waste (breast reduction).
- the use of these samples comes within the framework of "the declaration of activity of conservation and preparation of elements of the human body for the research program needs of the Pierre Fabre group" made to the Ministry of Higher Education and the research.
- the skin is dried for 2 hours under the cell culture hood in a box without lid and then put in the oven for a topical treatment with or without active association for 2 hours.
- the negative control of the dehydration stress undergoes the same kinetics in a closed petri dish.
- Biopsies and epidemics are frozen in liquid nitrogen and stored at - 80 0 C before being analyzed.
- RNA 6000 Nano LabChip® chips The skin biopsies are ground in a mortar previously cooled with liquid nitrogen and the RNAs are extracted using an RNeasy® kit (QIAGEN) according to the supplier's recommendations. The RNA is then assayed using a Bio analysesr 2100® (Agilent Technologies) on RNA 6000 Nano LabChip® chips. The cDNA is obtained from 1 ⁇ g of RNA by retro-transcription enzymatic reaction carried out with a Core Reagents® Access RT-PCR kit (Promega), using oligo dT primers. The levels of gene expression are analyzed by quantitative PCR on a thermocycler.
- ICycler iQ® fluorescence (Biorad) with iQ TM SYBR® Green Super Mix PCR kits (Biorad) following a 40-cycle protocol comprising denaturation at 95 ° C (15 sec) and elongation at 60 ° C (1 mm).
- the iCycler version 3.1 analysis software delivers raw values of C T
- FI 2 " ⁇ Cr
- ⁇ C T ⁇ CT treated - ⁇ CT control
- % inhibition 100 * (stressed FI - non-stressful control IF) - (FI treated - stress-free control IF) stress response (stressed FI - non-stressful control IF)
- control without stress corresponds to the control not desiccated
- stressed corresponds to a skin biopsy that was dried for 2 hours and then spent 2 additional hours in a control condition (ie without topical treatment)
- condition "treated” is the skin which has undergone 2 hours of drying followed by 2 hours of topical treatment with an emollient.
- the treated epidemics are ground in a mortar cooled with liquid nitrogen and the proteins are extracted in a lysis buffer RIPA (Tris HCl pH8 50mM, NaCl 15OmM, Triton X 100 IX, Na + Desoxycholate 1%, SDS 0.1% 5mM EDTA, 10mM DTT, protease inhibitor cocktail (reference P8340, SIGMA).
- RIPA Tris HCl pH8 50mM, NaCl 15OmM, Triton X 100 IX, Na + Desoxycholate 1%, SDS 0.1% 5mM EDTA, 10mM DTT, protease inhibitor cocktail (reference P8340, SIGMA).
- the proteins are then assayed by the DC-DC Protein Assay method (Biorad) and analyzed by Western Blot. For each condition, 25 to 40 ⁇ g of total protein are deposited on tris-glycine gels at 7.5% polyacrylamide. The protein mixture is separated by electrophoresis using the Mini Protean II system (Biorad) and the proteins are transferred to a PVDF membrane (Hybond-P, Amersham). The protein of interest is revealed by a specific antibody and an ECL + kit (Amersham). The amount of protein and the proportion of degraded form are calculated using Image Master TotalLab software version 1.11 (Amersham) after normalization with respect to ⁇ - actin (reference protein).
- Skin biopsies are sectioned with cryotome (Leica CM 3050s) in sections of 5 ⁇ m thickness and deposited on observation slides (Starfrost®).
- Cryocuts are fixed for 10 minutes with acetone at 20 ° C. and then rehydrated with PBS before being analyzed by immunochemical staining. After fixation and rehydration, the skin sections are saturated with a 3% BSA solution and incubated for 1 hour with the primary antibody directed against the protein of interest. In a second time, they are incubated for 1 hour with the secondary antibody coupled to a fluorochrome Alexa-488 or Alexa-555 and finally mounted in Mowiol containing DAPI to mark the nuclei.
- the sections are rinsed in a washing solution (Tween 20 1% in water) and incubated for 2 hours at 37 ° C. with a solution containing the specific substrate.
- enzymes of interest coupled to a fluorophore (annex).
- annex a solution containing the specific substrate.
- enzymes of interest coupled to a fluorophore (annex).
- the fluorophore is cleaved, releasing a fluorescent signal observable under a microscope.
- the labeled slides are then observed using an epifluorescence microscope (Nikon Eclipse 5Oi) or a Zeiss Axiovert 100 inverted confocal microscope.
- the skin explants are incubated for an additional hour in an oven at 37 ° C with a fluorescent probe
- HBSS HBSS
- the skin is then rinsed in an HBSS bath for 1 minute and then 4mm diameter biopsies are taken and included in Tissue TekR® resin (Sakura Finetek) (Matsuki et al 1998).
- Tissue TekR® resin Sakura Finetek
- the skin is then cut, the nuclei are labeled with DAPI and the slides are observed under a fluorescence microscope at a wavelength of 450 nm as described above.
- the first analysis consisted in studying a fundamental functional parameter in the cutaneous barrier function: the permeability of the upper layers of the epidemic. Incubation of the skin with a fluorescent probe
- the marking is again weak and superficial, as in the control condition.
- Immunohistochemical analysis has shown the reorganization of the expression of certain proteins in terms of localization, for example the tight junctions. Degradation of corneodesmosomal proteins was analyzed by Western-Blot.
- the targets studied using these different approaches have been grouped according to their physiological role (see Table 1).
- the objective of this study is to observe a visualizable stress response and a correction of the effect of stress by the topical application of composition A.
- Table 1 Summary of Targets and Pharmacological Response Considered in the Desiccation Model.
- the activity of the serine proteases was evaluated by in situ zymography on the dehydration model and observed under a confocal microscope in the control condition after two hours of drying and after two hours of drying followed by a two-hour incubation with the composition A
- the marking is the most intense in the control condition, it corresponds to a strong normal activity. This marking decreases and becomes irregular along the stratum corneum after two hours of drying while its intensity is increased and the location of the activity reorganized after the two hours of incubation with the composition A.
- the drying has the effect of reducing and disrupt enzymatic activity.
- composition A is capable of restoring the enzymatic activity of the dehydrated skin, which confirms the effect of this composition for a return of the homeostasis of the desquamation.
- composition A makes it possible to restore the level of expression of the molecular targets whose expression is increased by the stress of cutaneous dehydration induced.
- Composition A also makes it possible to restore the serine protease activity.
- topical application of the composition A makes it possible to eliminate the inflammation induced by the stress. All these results suggest that composition A in topical application makes it possible to restore the skin barrier function, to limit or even to prevent colonization by staphylococcus aureus and thus constitutes a "primary preventive treatment” preventing the appearance of atopic diseases (atopic dermatitis and / or allergic bronchial asthma and / or allergic rhinitis commonly referred to as "hay fever”) and / or allergic sensitization.
- hay fever atopic diseases
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Abstract
L'invention concerne une composition à usage topique comprenant, en tant que principe actif, une association de glycérol, vaseline et paraffine liquide sous forme d'une émulsion huile dans eau ou eau dans huile pour utilisation pour la prévention de la dermatite atopique.
Description
COMPOSITION EMOLLIENTE POUR LE TRAITEMENT PREVENTIF DE LA DERMATITE ATOPIQUE
La présente invention concerne le domaine de l'atopie et du traitement des affections qui y sont associées.
L'atopie est définie comme une prédisposition héréditaire à réagir de manière symptomatique (maladie) à divers allergènes, tels que la poussière de maison, les acariens, les pollens, les poils d'animaux, etc. Les affections réputées atopiques comprennent la dermatite atopique (DA), l'asthme bronchique allergique et la rhinite allergique ou « rhume des foins ».
La dermatite atopique (ou eczéma atopique) est une maladie dermatologique fréquente, touchant 10 à 15% des nourrissons en France, en augmentation au cours des dernières décennies.
La dermatite atopique est une maladie chronique qui évolue par poussées, entrecoupées de périodes de rémission durant lesquelles les lésions sont toujours présentes mais minimes se manifestant essentiellement par une xérose (sécheresse cutanée) et un prurit.
L'inflammation de la peau est caractéristique des poussées qui se traduisent par des signes et symptômes inflammatoires comprenant des rougeurs (érythème), des vésicules, des croûtes, un suintement et des démangeaisons.
La maladie débute généralement entre l'âge de 3 mois et 2 ans mais peut commencer encore plus tôt dès l'âge de 1 mois. Son évolution est souvent bonne avec une rémission complète intervenant entre 5 et 8 ans dans la majorité des cas. La résurgence à l'adolescence ou chez l'adulte jeune est possible. La maladie peut persister à l'âge adulte dans 15 à 20 % des cas.
L'évolution vers une autre affection atopique est également possible. La présence d'une DA dans l'enfance augmente le risque de développer un asthme et il existe une corrélation nette entre la fréquence de la DA et la fréquence de l'asthme.
Le risque de survenue d'un asthme chez un enfant porteur d'une DA est estimé entre 30 et 40%.
Le risque de survenue d'une allergie alimentaire, le plus souvent avant 3 ans, ou d'une rhinite allergique, d'apparition plus tardive, varie selon les études.
Concernant la dermatite atopique, il existe une prédisposition génétique marquée, avec un risque de 30 à 50% de développer la maladie si l'un des parents est atteint, et de près de 80% si les deux parents sont atteints. La prédisposition génétique implique de nombreux gènes, codant soit pour des déterminants de la fonction barrière de l'épiderme, soit pour des acteurs de l'immunité innée ou adaptative. Tenant compte de nombreux travaux récents, on peut émettre l'hypothèse que la DA (voire les autres maladies atopiques) soient liées à une anomalie primitive de la fonction barrière de l'épiderme, responsable d'une perméabilité accrue aux agents environnementaux (allergènes et micro-organismes) responsables de l'activation immuno logique et des manifestations allergiques.
L'anomalie de la perméabilité épidermique se traduit par une xérose cutanée et une augmentation de la perte insensible en eau et par la mise en évidence d'un polymorphisme de gènes codant pour des protéines épidermiques telles que la fïlaggrine (FLG), participant à la fonction barrière de l'épiderme (Palmer, 2006). Une étude récente confirme en France l'association d'un polymorphisme du gène FLG à la DA, avec un risque relatif supérieur à 3 (Hubiche, 2007).
L'atopie peut être considérée comme une réaction d'hypersensibilité retardée de contact aux allergènes de l'environnement. Elle se présente généralement en deux phases. Une première phase de sensibilisation cliniquement muette et génératrice de lymphocytes T spécifiques au niveau cutané. Cette sensibilisation se fait par pénétration des allergènes de l'environnement au niveau cutané facilitée par la xérose. Une seconde phase d'activation des lymphocytes T spécifiques aboutit à la production de cytokines pro -inflammatoires.
Globalement, les manifestations de dermatite atopique résultent d'interactions complexes entre facteurs environnementaux, anormalités pharmacologiques, disfonctionnements ou altérations des fonctions barrière de la peau, phénomènes immunologiques et susceptibilité génétique.
Parmi les nombreux facteurs, l'hyper réactivité cutanée, la réponse immunitaire inappropriée à divers micro -organismes ainsi que des infections secondaires semblent jouer un rôle dans la chronicité de la pathologie.
Le rôle de la flore cutanée dans l'apparition et/ou le maintien d'une activation immunitaire favorisant le développement de lésions d'eczéma est de mieux en mieux connu. L'altération de la fonction barrière de la peau associée à une certaine immunodéfîcience chez les patients atteints de dermatite atopique entraîne une colonisation par Staphylococcus aureus qui colonise la peau de 90% des patients ayant une DA, même en dehors des poussées évolutives de la maladie. (Current Opinion in Allergy and Clinical Immunol 2007, 7, 413).
Il existe une corrélation entre la sévérité de la maladie et, d'une part la densité de colonisation staphylococcique, et d'autre part la fréquence de positivité des IgE spécifiques anti-toxines staphylococciques (J Allergy Clin Immunol 2006 117, 1141 ;
Am J Clin Dermatol, 2006, 7, 273 ; Clin rev Allergy Immunol, 2007, 33, 167 ; Current Opinion Allergy and Clinical Immunol 2004, 4, 373).
Ces éléments font suspecter pour le staphylocoque doré un rôle dans le développement d'une activation immunitaire locale responsable des manifestations cutanées de la dermatite atopique et peut-être des sensibilisations allergiques.
Outre le grattage, il existe de nombreux facteurs favorisant la colonisation par Staphylococcus aureus via l'altération du système primaire de défense cutané et en premier lieu l'altération de la composition lipidique du Stratum Corneum. Cette altération de la fonction barrière de la peau est ainsi responsable de la colonisation par le staphylocoque et aussi d'un accroissement de la perte en eau au niveau cutané, entraînant xérose, irritation, démangeaisons créant ainsi une sorte de cercle vicieux physiopathologique.
La prise en charge thérapeutique de la dermatite atopique peut s'envisager à différents niveaux essentiellement symptomatique mais aussi préventif. Il n'existe à ce jour aucun traitement curatif de la maladie.
Outre l'éviction des allergènes identifiés qui est souhaitable autant que faire se peut, l'hydratation de la peau en tant que moyen de restauration ou de maintien de son rôle barrière vient en complément du traitement symptomatique des poussées
par la corticothérapie locale qui constitue la thérapeutique de référence de cette maladie. D'autres anti- inflammatoires topiques non stéroïdiens (notamment les inhibiteurs de la calcineurine) peuvent aussi être utilisés pour traiter les poussées. Enfin la photothérapie, les immunosuppresseurs per os ou d'autres thérapeutiques systémiques lourdes sont réservées aux formes sévères.
Cependant l'utilisation de corticoïdes, d'anti-inflammatoires et/ou d'immunosuppresseurs même par voie topique, en particulier chez des nourrissons ou de jeunes enfants, n'est pas anodine, expose à des effets indésirables et ne constituent qu'un traitement symptomatique. .
D'autre part, une phobie existe vis à vis de l'utilisation des corticoïdes ce qui ne facilite pas la prise en charge de cette maladie ni la compliance des patients, souvent mauvaise.
Enfin, Staphylococcus aureus pourrait induire une résistance aux corticoïdes (Clin Rev Allergy Immunol 2007 33 167)
II existe ainsi un besoin et une forte demande pour des alternatives thérapeutiques et plus particulièrement pour des traitements préventifs. Ces traitements visent à diminuer la fréquence et/ou l'intensité des poussées eczémateuses que l'on observe chez les patients atteints de dermatite atopique. Cette approche constitue un acte de prévention tertiaire selon la définition de l'OMS puisqu'elle tend à éviter les complications (poussées inflammatoires) d'une maladie (dermatite atopique) déjà présente.
La demande WO2008048076 divulgue l'utilisation de glucosamine ou un de ses dérivés pour traiter la dermatite atopique. La demande WO2007023226 divulgue l'utilisation d'un probiotique combiné à un prébiotique pour traiter la dermatite atopique chez les enfants.
On a maintenant constaté de manière tout à fait surprenante et inattendue qu'une association de type glycérol, vaseline et paraffine liquide sous forme d'une émulsion huile dans eau ou eau dans huile permettait de prévenir la dermatite atopique.
Les inventeurs ont mis en évidence un effet inhibiteur de cette association sur l'adhésion de Staphylococcus aureus à des kératinocytes en culture. L'association glycérol, vaseline et paraffine liquide permet donc de prévenir le rôle infectieux de Staphylococcus aureus chez le patient atopique ainsi que son rôle sur l'entretien de la réaction inflammatoire par la production d'IgE spécifiques en inhibant la colonisation de la peau par Staphylococcus aureus.
En outre, les inventeurs ont montré que cette association restaure le rôle de barrière protectrice et fonctionnelle de la peau. Pour cela, les inventeurs ont utilisé un modèle de peau ex vivo de déshydratation cutanée induite. De plus, ils ont suivi l'expression de marqueurs épidermiques et l'activité serine protéase.
La présente invention a ainsi pour objet une composition à usage topique comprenant, en tant que principe actif, une association de glycérol, vaseline et paraffine liquide, sous forme d'une émulsion huile dans eau ou eau dans huile pour son utilisation pour la prévention de la dermatite atopique. De préférence, la prévention est de type primaire.
Au sens de la présente invention, « prévenir », « prévention » ou « traitement préventif » signifie éviter l'apparition d'une maladie, d'un trouble ou d'un ou plusieurs signes et/ou symptômes.
Au sens de la présente invention, « prévention primaire » ou « traitement préventif primaire » signifie empêcher l'apparition des maladies atopiques (dermatite atopique et/ou asthme bronchique allergique et/ou rhinite allergique communément appelé « rhume des foins ») et/ou des sensibilisations allergiques en agissant avant les premières manifestations cliniques de l'atopie c'est à dire dès la naissance.
Au sens de la présente invention, on appellera « association active » l'association glycérol, vaseline et paraffine liquide sous forme d'une émulsion huile dans eau ou eau dans huile.
Avantageusement, le glycérol, la vaseline et la paraffine liquide présentent les critères décrits et contrôlés selon « European Pharmacopeia », 6ème Edition.
Avantageusement, la vaseline de l'association active présente un point de goutte compris entre 35 et 700C, de préférence compris entre 51 et 57°C, de manière
particulièrement préférée d'environ 54°C. Le point de goutte est mesuré selon le procédé 2.2.17 décrit dans « European Pharmacopeia », 6ème Edition.
Avantageusement, la vaseline de l'association active présente une consistance comprise entre 175 et 195 1/10 mm, de préférence d'environ 185 1/10 mm (pénétration au cône à 25°C).
Avantageusement, la vaseline de l'association active présente une viscosité comprise entre 4 et 5 cSt à 1000C, de préférence d'environ 4,8 cSt à 1000C.
Dans la composition selon l'invention, l'association active est présente selon une proportion comprise entre 10 et 50 % et préférentiellement entre 20 et 30 % en poids par rapport au poids total de la composition ; la concentration en glycérol est comprise entre 5 et 30 %, préférentiellement entre 10 et 20 % et de manière particulièrement préférée est d'environ 15% en poids par rapport au poids total de la composition, la concentration en vaseline est comprise entre 3 et 20 %, préférentiellement entre 5 et 10 % et de manière particulièrement préférée est d'environ 8% en poids par rapport au poids total de la composition et la concentration en paraffine liquide est comprise entre 0,5 et 5 %, préférentiellement entre 1 et 3 % et de manière particulièrement préférée est d'environ 2% en poids par rapport au poids total de la composition.
Dans la phase aqueuse, l'eau est comprise entre 30 et 80 % en poids par rapport au poids total de la composition.
Avantageusement, la composition selon l'invention comprend environ 15% de glycérol, environ 8% de vaseline et environ 2% de paraffine liquide en poids par rapport au poids total de la composition.
La composition dermatologique selon l'invention comprend, en outre, des excipients usuels dermatologiquement compatibles.
La composition dermatologique selon la présente invention peut être préparée sous la forme d'une émulsion eau dans huile (E/H) ou huile dans eau (H/E), d'une émulsion multiple comme par exemple, une émulsion eau dans huile dans eau
(E/H/E) ou une émulsion huile dans eau dans huile (H/E/H), ou encore sous la forme d'une hydrodispersion ou une lipodispersion, un gel ou un aérosol.
Les excipients dermatologiquement compatibles peuvent être tout excipient parmi ceux connus de l'homme de l'art en vue d'obtenir une composition pour l'application topique sous forme de crème, d'une lotion, d'un gel, d'une pommade, d'une émulsion, d'une microémulsion, d'un spray, etc La composition selon l'invention peut en particulier contenir des additifs et aides à la formulation, tels que des émulsionnants, des épaississants, des gélifiants, des fixateurs d'eau, des agents d'étalement, des stabilisants, des colorants, des parfums et des conservateurs.
Des émulsionnants appropriés comprennent l'acide stéarique, la trolamine, le PEG-40-stéarate.
De préférence, la composition selon l'invention présente environ 5% d'émulsionnants en poids par rapport au poids total de la composition.
Avantageusement, la composition selon l'invention présente entre 1 et 5% d'acide stéarique, de préférence environ 3% en poids par rapport au poids total de la composition.
Avantageusement, la composition selon l'invention présente entre 0 et 2% de trolamine, de préférence environ 0,5% en poids par rapport au poids total de la composition.
Avantageusement, la composition selon l'invention présente entre 0 et 2% de PEG-40-stéarate, de préférence environ 0,5% en poids par rapport au poids total de la composition.
Des épaississants appropriés comprennent le monostéarate de glycérol, le PEG.
De préférence, la composition selon l'invention présente environ 5% d'épaississants en poids par rapport au poids total de la composition.
Avantageusement, la composition selon l'invention présente entre 2 et 10% de monostéarate de glycérol, de préférence environ 5% en poids par rapport au poids total de la composition.
Des conservateurs appropriés comprennent le parahydroxybenzoate de propyle, le chlorocrésol.
De préférence, la composition selon l'invention présente environ 0,1% de conservateurs en poids par rapport au poids total de la composition.
Avantageusement, la composition selon l'invention présente entre 0,05 et 1% de parahydroxybenzoate de propyle, de préférence environ 0,1% en poids par rapport au poids total de la composition.
Des agents d'étalement appropriés comprennent la diméthicone, le polydiméthylcyclosiloxane.
De préférence, la composition selon l'invention présente environ 2% d'agents d'étalement en poids par rapport au poids total de la composition. Avantageusement, la composition selon l'invention présente entre 0,2 et 2% de diméthicone, de préférence environ 0,5% en poids par rapport au poids total de la composition.
Avantageusement, la composition selon l'invention présente entre 1 et 3% de polydiméthylcyclosiloxane, de préférence environ 2,5% en poids par rapport au poids total de la composition.
Des fixateurs d'eau appropriés comprennent le polyéthylène glycol, de préférence le polyéthylène glycol 600.
De préférence, la composition selon l'invention présente environ 8% de fixateurs d'eau en poids par rapport au poids total de la composition. Avantageusement, la composition selon l'invention présente entre 2 et 10% de polyéthylène glycol, de préférence environ 5% en poids par rapport au poids total de la composition.
L'eau utilisée pour la phase aqueuse de l'émulsion peut être une eau distillée ou une eau thermale ayant des propriétés dermato-cosmétique. Avantageusement, la composition selon l'invention comprend :
- environ 15 % de glycérol, environ 8% de vaseline, environ 2% de paraffine liquide, et à titre d'excipients : environ 1 à 5% d'acide stéarique, - environ 2 à 10% de monostéarate de glycérol, environ 1 à 3% de polydiméthylcyclosiloxane,
environ 0,2 à 2% de diméthicone,
- environ 2 à 10% de polyéthylène glycol 600, environ 0 à 2% de trolamine, environ 0,05 à 1% de parahydroxybenzoate de propyle - jusqu'à 100% en eau.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une composition selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir la dermatite atopique.
La présente invention est illustrée par les exemples suivants.
EXEMPLES
Exemple 1 : Formulations
Composition A
15 g de glycérol, - 8 g de vaseline,
- 2 g de paraffine liquide,
- 0,5 g de trolamine,
- et à titre d'excipients acide stéarique, monostéarate de glycérol, polydiméthylcyclosiloxane, diméthicone, polyéthylène glycol (PEG) 600, parahydroxybenzoate de propyle eau jusqu'à 100 g. Composition A'
15 g de glycérol,
8 g de vaseline, - 2 g de paraffine liquide,
1,5 g d'acide stéarique,
- 5 g de monostéarate de glycérol, 1,5 g de polydiméthylcyclosiloxane, 0,5 g de diméthicone, 5 g de polyéthylène glycol 600,
0,15 g de trolamine,
- 0,1 g de parahydroxybenzoate de propyle
- eau jusqu'à 100 g.
Composition B - 15 g de glycérol,
8 g de vaseline,
2 g de paraffine liquide,
- 0,5 g de PEG-40-stéarate,
- et à titre d'excipients acide stéarique, monostéarate de glycérol, polydiméthylcyclosiloxane, diméthicone, polyéthylène glycol 600, chlorocrésol, eau jusqu'à 100 g. Composition B'
15 g de glycérol, - 8 g de vaseline,
- 2 g de paraffine liquide,
- 3 g d'acide stéarique,
- 5 g de monostéarate de glycérol,
- 2 g de polydiméthylcyclosiloxane, - 0,5 g de diméthicone,
0,1 g de tro lamine,
3 g de polyéthylène glycol 600,
- 0,5 g de PEG-40-stéarate,
- 0,075 g de chlorocrésol, - eau jusqu'à 100 g.
Exemple 2 : Test de cytotoxicité Principe
Le principe du test est basé sur la transformation enzymatique d'un sel de tétrazolium, le « sodium 3,3 [l[(phenyl amino) carbonyl]-3-4-tetrazolium bis (4-
methoxy-βnitro)] benzène sulfonic acid hydrate » soit XTT, en un produit coloré, le formazan.
Le XTT est réduit par la déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes en présence d'un agent couplant d'électrons, le coenzyme Q, en un composé hydrosoluble jaune/orangé, le formazan, dosable par spectrophotométrie à 450 nm.
Traitement par le produit
Les microplaques de 96 puits sont ensemencées à 105 cellules/ml, après 24 heures d'incubation le milieu de culture est éliminé et les microplaques sont rincées au PBS. 100 μl des différentes dilutions de produit test sont ajoutés dans chaque cupule de microplaques. Des témoins sans produit sont réalisés dans les mêmes conditions. Les microplaques sont mises à incuber pendant 2 heures à 37°C sous 5 % de CO2.
Révélation de la cytotoxicité Après incubation, les microplaques sont lavées 2 fois au PBS. Ensuite, 100 μl d'un mélange XTT (lmg/ml)/coenzyme Q (0,2 mg/ml) sont ajoutés dans chaque puits de la plaque 96 puits.
Après 3 heures d'incubation, 100 μl d'une solution de SDS à 10% sont ajoutés dans chaque puits. La lecture immédiate de la densité optique à 450 nm est effectuée au spectrophotomètre POLARstar (BMG, France).
Expression des résultats
La densité optique relevée est proportionnelle à la population cellulaire viable. Ce test nous permet donc d'analyser à partir d'une densité optique correspondante au témoin, une cytotoxicité cellulaire lorsque la densité optique est inférieure à celle du lot témoin :
% de viabilité = (DO Traité - DO Témoin)/DO Témoin X 10
Le produit est considéré cytotoxique si le pourcentage de viabilité <30%. Les essais intra-manipulation sont réalisés 8 fois.
Résultats
En fonction du degré de non cytotoxicité des produits les concentrations choisies pour le test d'adhésion sont les suivantes :
- Composition A : 6%, 3%, 1,5%, 0,8% et 0,4% - Atopiclair® : 0,8%, 0,4%, 0,2%, 0,1% et 0,05%
- Physiogel® : 6%, 3%, 1,5%, 0,8% et 0,4%
- Composition B : 3%, 1,5%, 0,8%, 0,4% et 0,2%
Exemple 3 : Test d'adhésion Principe
Marquage des bactéries par l'adénine tritiée (sigma) et détermination du taux de bactéries adhérées à la surface des kératinocytes par évaluation du taux de la radioactivité.
Marquage des bactéries par l'adénine tritiée
Le marquage des bactéries s'effectue en présence de 30 μCi d'adénine tritiée dans du milieu de culture adéquat. Après une incubation de 18 heures à 37°C, les microorganismes sont lavés trois fois dans du PBS pour éliminer la radioactivité non incorporée. Les suspensions sont ajustées à 2x108 microorganismes/ml dans le milieu de maintien.
Effet inhibiteur d'adhésion
500 μl de bactéries marquées en présence de chaque dilution test du produit sont déposés à la surface du tapis cellulaire.
Après une incubation de 2 heures (37°C, 5% de CO2), 3 lavages au PBS sont réalisés.
Lyse des cellules
Les bactéries adhérées aux kératinocytes sont lysées par 500 μl d'une solution d'hydroxyde de sodium 0,5 N à 0,1% de sodium dodécyl sulfate pendant 18 heures à 37°C.
Le lysat de chaque puits est prélevé et placé dans les tubes de comptage. 2 ml de liquide de scintillation sont ajoutés dans chaque tube.
Expression des résultats
La lecture se fait au compteur β qui exprime le taux de radioactivité en cpm (coups par minutes). - Le pourcentage d'inhibition d'adhésion est calculé selon la formule : % inhibition = ((cpm Essai - cpm Contrôle)/cpm Contrôle) X 100 Le pourcentage d'inhibition d'adhésion est significatif si sa valeur <-30%. Les essais sont réalisés en quadriplate.
Conclusion
- La composition A inhibe signifîcativement l'adhésion du S. aureus aux kératinocytes après 2 heures d'incubation à 6% et 3%.
- Le produit Physiogel inhibe signifîcativement l'adhésion du S. aureus aux kératinocytes après 2 heures d'incubation à 6% et pas à 3%. - Le produit Atopiclair n'a aucun effet sur l'adhésion du S. aureus aux kératinocytes
- En présence de la composition B l'adhésion du S. aureus aux kératinocytes est anormalement augmentée.
Exemple 4 : analyse de la régulation de la déshydratation cutanée induite Nous évaluons ici l'activité hydratante de la composition A et l'amélioration subséquente de la fonction barrière de la peau en utilisant un modèle de peau ex vivo de déshydratation cutanée induite.
Nous observons l'expression des marqueurs épidermiques moléculaires différentiels par PCR quantitative et immuno-histochimie. Nous suivons également l'activité des enzymes à serine protéase par zymographie in situ et la dégradation de protéines cornéodesmosomales par western blotting.
La fonctionnalité de la barrière de la peau est analysée en utilisant des sondes fluorescentes.
Matériel et méthodes
I. Modèles tissulaires
1. Préparation des explants cutanés
Le laboratoire récupère des prélèvements de peau provenant de déchets opératoires de chirurgie plastique (diminutions mammaires). L'utilisation de ces prélèvements rentre dans le cadre de « la déclaration d'activité de conservation et de préparation d'éléments du corps humain pour les besoins de programme de recherche du groupe Pierre Fabre » faite au Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche.
Ces prélèvements sont lavés dans 10 bains de PBS puis découpés à l' emporte- pièce en disques de 2 cm de diamètre. Les explants cutanés sont étalés sur une grille dans une boîte de Pétri et un anneau de 1 cm de diamètre est scellé sur la peau pour délimiter la zone de traitement.
2. Cinétique des modèles
Pour le modèle de déshydratation induite, la peau est desséchée pendant 2 heures sous la hotte de culture cellulaire dans une boîte sans couvercle puis est mise à l'étuve pour un traitement topique avec ou sans association active pendant 2 heures. Le témoin négatif du stress de déshydratation subit la même cinétique dans une boîte de Pétri fermée.
3. Prélèvements pour l'analyse
Après le traitement, 2 biopsies de 6 mm de diamètre sont prélevées pour l'analyse de l'expression des ARN et une biopsie de 4 mm de diamètre incluse dans un bloc de résine Tissue Tek® (Sakura Finetek) pour l'histologie. Pour l'analyse des protéines, la peau est exposée à un choc thermique dans un bain d'eau à 600C pendant 5 minutes puis à 4°C pendant 2 minutes afin de séparer l'épiderme du derme.
Les biopsies et les épidémies sont congelés dans l'azote liquide et stockés à - 800C avant d'être analysés.
II. Analyse du transcriptome par PCR quantitative
Les biopsies de peau sont broyées dans un mortier préalablement refroidi à l'azote liquide et les ARNs sont extraits grâce à un kit RNeasy® (QIAGEN) selon les recommandations du fournisseur. L 'ARN est ensuite dosé à l'aide d'un Bioanalyser 2100® (Agilent Technologies) sur puces RNA 6000 Nano LabChip®. L 'ADNc est obtenu à partir d'1 μg d'ARN par réaction enzymatique de rétro- transcription réalisée avec un kit Accès RT-PCR Core Reagents® (Promega), à l'aide d'amorces oligo dT. Les niveaux d'expression génique sont analysés par PCR quantitative sur un thermocycleur à. fluorescence ICycler iQ® (Biorad) avec des kits PCR iQ™SYBR® Green Super Mix (Biorad) suivant un protocole de 40 cycles comprenant une dénaturation à 95°C (15 sec) et une élongation à 600C (1 mm).
L'accumulation du produit de PCR proportionnelle à l'émission de fluorescence
(intercalant SYBR®Green) est visualisée cycle après cycle grâce au logiciel iCycler.
Le logiciel d'analyse iCycler version 3.1 délivre des valeurs brutes de CT
(Cycle Threshold): cycle à partir duquel l'amplification d'ADNc débute. L'expression de plusieurs gènes de référence est analysée en parallèle à l'aide du programme Genorm version 3.4 qui permet de choisir le gène de référence le plus stable d'un échantillon à l'autre. Ce gène sert ensuite de référence pour la normalisation des résultats par le calcul du ΔCT = CT gène d'intérêt — CT gène de référence.
Le facteur d'induction (FI) est ensuite calculé pour chaque traitement par rapport à la condition contrôle correspondante. FI = 2 "ΔΔCr où ΔΔCT = ΔCT traité - ΔCT contrôle L'expression des ARNm est évaluée en duplicate pour cinq expériences provenant de 5 individus différents. Lorsque le facteur d'induction par rapport au contrôle est supérieur à 2, on considère que l'expression du gène est induite et lorsqu'il est inférieur à 0,5, on considère que l'expression est réprimée. L'effet du principe actif sur la réponse au stress causée dans le modèle est évalué par le pourcentage d'inhibition calculé avec la formule suivante:
% d'inhibition = 100 * (FI stressé — FI témoin sans stress) — (FI traité — FI témoin sans stress) de réponse au stress (FI stressé — FI témoin sans stress)
Par rapport au modèle d'étude, la condition « témoin sans stress» correspond au contrôle non desséché; la condition «stressé» correspond à une biopsie de peau qui a été desséchée 2 heures puis qui a passé 2 heures supplémentaire en condition contrôle (c'est-à-dire sans traitement topique); enfin la condition «traité » est la peau qui a subi 2 heures de dessèchement suivies de 2 heures de traitement topique par un émollient.
III. Analyse de l'expression protéique par Western Blot
Les épidémies traités sont broyés dans un mortier refroidi à l'azote liquide et les protéines sont extraites dans un tampon de lyse RIPA (Tris HCI pH8 5OmM; NaCL 15OmM; Triton X 100 IX; Na+Desoxycholate 1%; SDS 0,1%; EDTA 5mM ; DTT 10OmM; cocktail d'inhibiteur de protéases (référence P8340, SIGMA).
Les protéines sont ensuite dosées par la méthode DC-DC Protein Assay (Biorad) et analysées par Western Blot. Pour chaque condition, 25 à 40μg de protéines totales sont déposées sur des gels Tris-Glycine à 7,5% de polyacrylamide. Le mélange protéique est séparé par électrophorèse à l'aide du système Mini Protean II (Biorad) et les protéines sont transférées sur une membrane de PVDF (Hybond-P, Amersham). La protéine d'intérêt est révélée par un anticorps spécifique et un kit ECL+ (Amersham). La quantité de protéines et la proportion de forme dégradée sont
calculées grâce au logiciel Image Master TotalLab version 1.11 (Amersham) après normalisation par rapport à la β — actine (protéine de référence).
IV. Techniques histologiques
Les biopsies de peau sont sectionnées au cryotome (Leica CM 3050s) en coupes de 5μm d'épaisseur et déposées sur des lames d'observation (Starfrost®).
1. Immunohistochimie
Les cryocoupes sont fixées 10 minutes à l'acétone à 200C puis réhydratées au PBS avant d'être analysées par marquage immunochimique. Après fixation et réhydratation, les coupes de peau sont saturées avec une solution de BSA 3% et incubées 1 heure avec l'anticorps primaire dirigé contre la protéine d'intérêt. Dans un deuxième temps, elles sont incubées pendant 1 heure avec l'anticorps secondaire couplé à un fluorochrome Alexa-488 ou Alexa-555 et enfin montées dans du Mowiol contenant du DAPI pour marquer les noyaux.
2 Zymographie in situ
Après une fixation de 10 minutes dans l'acétone à -200C, les coupes sont rincées dans une solution de lavage (Tween 20 1% dans l'eau) et incubées 2 heures à 37°C avec une solution contenant le substrat spécifique des enzymes d'intérêt couplé à un fluorophore (annexe). Lorsque l'enzyme est active, le fluorophore est clivé, libérant un signal fluorescent observable au microscope. Les lames marquées sont ensuite observées au microscope à épifluorescence (Nikon Eclipse 5Oi) ou au microscope confocal inversé Zeiss Axiovert 100.
3 Sonde fluorescente
Après le traitement de déshydratation, les explants cutanés sont incubés pendant une heure supplémentaire à l'étuve à 37°C avec une sonde fluorescente
Lucifer Yellow Carboxyhydrazide dilithium sait (Invitrogen) à ImM dans du tampon
HBSS. La peau est ensuite rincée dans un bain d'HBSS pendant 1 minute puis des
biopsies de 4mm de diamètre sont prélevées et incluses dans de la résine Tissue TekR® (Sakura Finetek) (Matsuki et al 1998). La peau est ensuite coupée, les noyaux sont marqués au DAPI et les lames sont observées au microscope à fluorescence à une longueur d'onde de 450 nm comme décrit ci-dessus.
Résultats
I. Modèle de rupture de la fonction barrière par dessèchement induit
1. Mesure de la perméabilité cutanée par une sonde fluorescente
La première analyse a consisté à étudier un paramètre fonctionnel fondamental dans la fonction barrière cutanée : la perméabilité des couches supérieures de l'épidémie. L'incubation de la peau avec une sonde fluorescente
(Lucifer Yellow) après l'expérience de dessèchement a permis de caractériser la modulation de la perméabilité cutanée. En condition contrôle, le marquage est très faible et superficiel, la sonde pénètre peu à travers la couche cornée et est éliminée lors du rinçage. Après deux heures de dessèchement, le marquage est observable dans les strates plus profondes de la couche cornée. Le dessèchement rend la peau plus perméable, sa fonction barrière est détériorée. Le traitement topique par la composition A suite aux deux heures de dessèchement restaure l'imperméabilité du
SC vis à vis de la sonde, le marquage est à nouveau faible et superficiel, comme dans la condition contrôle. On peut alors conclure que le traitement hydratant a un effet réparateur sur la peau desséchée et sur la fonction barrière cutanée observable sur le modèle tissulaire.
2. Effets sur la régulation du transcriptome et du protéome
L'expression de différents gènes potentiellement impliqués dans l'homéostasie de la fonction barrière épidermique a été mesurée par PCR quantitative dans les différentes conditions de stress ou de traitement du modèle de dessèchement.
L'analyse par immunohistochimie a permis de montrer la réorganisation de l'expression de certaines protéines en termes de localisation, par exemple les
jonctions serrées. La dégradation des protéines cornéodesmosomales a été analysée par Western-Blot.
Les cibles étudiées à l'aide de ces différentes approches ont été regroupées selon leur rôle physiologique (voir tableau 1). L'objectif de cette étude est d'observer une réponse au stress visualisable et une correction de l'effet du stress par l'application topique de la composition A.
Le travail réalisé a également permis de mettre en évidence les différents niveaux de régulation de certaines cibles. Nous avons ainsi pu constater que les enzymes de la desquamation n'étaient pas régulées au niveau transcriptionnel mais plus spécialement au niveau de leur activité (Cf. Résultats 3.)
Tableau 1 : Récapitulatif des cibles et de la réponse pharmacologique étudiées dans le modèle de dessèchement.
O=La cible réagit dans le modèle ; O=Oui X=La cible ne réagit pas dans le modèle N=Non
3. Mesure de l'activité enzymatique liée à la desquamation
L'activité des protéases à serine a été évaluée par zymographie in Situ sur le modèle de déshydratation et observée au microscope confocal dans la condition contrôle après deux heures de dessèchement et après deux heures de dessèchement suivies par une incubation de deux heures avec la composition A. Le marquage est le plus intense dans la condition contrôle, il correspond à une activité forte normale. Ce marquage diminue et devient irrégulier le long de la couche cornée après deux heures de dessèchement alors que son intensité est augmentée et la localisation de l'activité réorganisée après les deux heures d'incubation avec la composition A. Le dessèchement a pour effet de diminuer et perturber l'activité enzymatique. Ces résultats sont cohérents avec la diminution de la dégradation des protéines cornéodesmosomales que nous observons avec le dessèchement et confirme l'effet du dessèchement sur la diminution de la desquamation observée sur le modèle mis au point. La composition A est capable de restaurer l'activité enzymatique de la peau déshydratée ce qui confirme l'effet de cette composition pour un retour de l'homéostasie de la desquamation.
Ces résultats montrent que la composition A permet de restaurer le niveau d'expression des cibles moléculaires dont l'expression est accrue par le stress de déshydratation cutané induit. La composition A permet également de restaurer l'activité serine protéase. En outre, l'application topique de la composition A permet de supprimer l'inflammation induite par le stress.
L'ensemble de ces résultats suggère que la composition A en application topique permet de restaurer la fonction barrière de la peau, de limiter voire d'empêcher la colonisation par le staphylocoque doré et constitue ainsi un « traitement préventif primaire » empêchant l'apparition des maladies atopiques (dermatite atopique et/ou asthme bronchique allergique et/ou rhinite allergique communément appelé « rhume des foins ») et/ou des sensibilisations allergiques.
Claims
1. Composition à usage topique comprenant, en tant que principe actif, une association de glycérol, vaseline et paraffine liquide sous forme d'une émulsion huile dans eau ou eau dans huile pour utilisation pour la prévention de la dermatite atopique.
2. Composition selon la revendication 1 pour utilisation pour la prévention primaire de la dermatite atopique.
3. Composition selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle la vaseline présente un point de goutte compris entre 35 et 700C.
4. Composition selon la revendication 3 dans laquelle la vaseline présente un point de goutte compris entre 51 et 57°C, notamment 54°C.
5. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle la vaseline présente une consistance comprise entre 175 et 195 1/10 mm (pénétration au cône à 25°C).
6. Composition selon la revendication 5 dans laquelle la vaseline présente une consistance d'environ 185 1/10 mm (pénétration au cône à 25°C).
7. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle la vaseline présente une viscosité comprise entre 4 et 5 cSt à 1000C.
8. Composition selon la revendication 7 dans laquelle la vaseline présente une viscosité d'environ 4,8 cSt à 1000C.
9. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant environ 15% de glycérol, environ 8% de vaseline et environ 2% de paraffine liquide.
10. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant un ou plusieurs excipients choisis dans le groupe constitué de acide stéarique, monostéarate de glycérol, polydiméthylcyclosiloxane, diméthicone, polyéthylène glycol 600, trolamine, parahydroxybenzoate de propyle, eau distillée.
11. Utilisation d'une composition comprenant, en tant que principe actif, une association de glycérol, vaseline et paraffine liquide sous forme d'une émulsion huile dans eau ou eau dans huile pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir la dermatite atopique.
12. Utilisation d'une composition telle que décrite dans les revendications 3 à 10 pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir la dermatite atopique.
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