MX2010010476A - Alelos menoscabados de genes involucrados en rutas metabolicas y metodos para detectar y usar los mismos. - Google Patents

Alelos menoscabados de genes involucrados en rutas metabolicas y metodos para detectar y usar los mismos.

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Abstract

La invención es concerniente con variantes de enzimas, sensibilidad de las mismas a cofactores con análisis in vivo para probar la actividad de variantes de enzimas, también como la sensibilidad de las mismas a cofactores.

Description

ALELOS MENOSCABADOS DE GENES INVOLUCRADOS EN RUTAS METABOLICAS Y METODOS PARA DETECTAR Y USAR LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención es concerniente con variantes de enzima que impactan del metabolismo, sensibilidad funcional de las mismas a cofactores y análisis para detectar alelos deteriorados que codifican tales variantes de enzimas y que determinan la sensibilidad de los mismos a cofactores.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La ruta metabólica de foliato/homocisteina constituye una red de enzimas y rutas enzimáticas que metabolizan foliato y/o afectan la homocisteina . Las rutas están enlazadas vía la reacción de metionina sintasa y deficiencias de foliato marginales en cultivos celulares, sistemas de modelos de animales y en humanos deterioran la remetilación de homocisteina (véase, por ejemplo Stover PJ. 2004. Physiology of foíate and vitam.in B12 in health and disease. Nutr Rev 62: S3-12) . La insuficiencia de foliato ha sido enlazada a defectos del tubo neural ("NTD") también como otros defectos de nacimiento y resultados de embarazo adversos, tales como escisiones orofaciales, preeclampsia, parto a corto plazo/bajo peso de nacimiento y aborto prematuro espontáneo recurrente (véase, por ejemplo Mills et al., 1995. Homocysteine metabolism in pregnancies complicated by neural tube defects. Lancet 345: 149-1151). La insuficiencia de foliato también ha sido asociada con enfermedad cardiovascular, enfermedad de arteria coronaria, accidente isquémico, arteriosclerosis , trombosis, oclusión de arteria retinal, síndrome de Down, cáncer colorrectal, cáncer de pecho, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, depresión, esquizofrenia, .enfermedad de Alzheimer/demencia, degeneración macular relacionada con la edad y glaucoma. Todas las etapas metabólicas en la ruta metabólica de foliato/homocisteína son potencialmente relevantes a condiciones y enfermedades asociadas con la insuficiencia de foliato y/o metabolismo de homocisteína . Las enzimas involucradas en el metabolismo de folitato/homocisteina están implicadas e incluyen, por ejemplo, la enzima bifuncional AICAR transíormilasa e IMP ciclohidrolasa (ATIC, glicinamida ribonucleótido transformilasa (GART) , metionina adenosil transferasa I alfa (MAT1A) , metionina adenosil transferasa II, alfa (MAT2A) , metilentetrahidrofoliato reductasa (MTHFR) y metenil tetrahidrofoliato sintetasa ( THFS) . La insuficiencia de foliato también deteriora la metilación moderada por S-adenosil-metionina ("SAM"), que es un inhibidor alostérico tanto de MTHFR como CBS (véase, por ejemplo, Kraus et al., 1999. Cystathionine ß-synthase mutations in homocystinuria . Hum Mut 13: 362-375; Daubner et al., 1982. In Flavins and Flavoproteins , eds . Massey, V. y Williams, C. H. (Elsevier Nueva York), pp. 165-172). Las elevaciones en las proporciones de S-adenosil-homocisteina : S-adenosil-metionina (SAH/SAM) han sido propuestas en el mecanismo del desarrollo de NTD. La 5, 10-metilentetrahidrofoliato reductasa (MTHFR) está involucrada en la ruta de multietapas foliato-dependiente en la cual la homocisteina es convertida a metionina. La conversión disminuida de homocisteina puede conducir a hiperhomocisteineria . Varias mutaciones raras de MTHFR han sido identificadas que- están asociadas con la deficiencia de MTHFR clínica y alteración regresiva autosomal. Los síntomas clínicos de deficiencia de MTHFR son altamente variables e incluyen retardo de desarrollo, ' anormalidades motrices y de marcha, ataques y enfermedad vascular prematura. Polimorfismos comunes de MTHFR también han sido descritos, que incluyen el alelo funcionalmente deteriorado A222V. La asociación genética de polimorfismos comunes con enfermedad no ha sido consistente. Esto puede ser debido en parte a efectos compensatorios de disponibilidad de foliato que enmascaran un riesgo subyacente de enfermedad, también como la contribución de alelos deteriorados de baja frecuencia todavía sin identificar' a tales enfermedades. Interesantemente, polimorfismos comunes han sido asociados con variación individual en la eficacia y toxicidad de quimioterapéuticos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo .
Un análisis para la complementación funcional del gen de levadura metll ha sido descrito (Shan et al., JBC, 274: 32613-32618, 1999) . En este análisis, se mostró que MTHFR humano tipo silvestre complementa una mutación metll en S. cerévisiae . Sin embargo, este análisis no fue sensible a cambios cuantitativos en actividad debido a mutaciones de MTHFR, tal como se demuestra por la habilidad similar del alelo deteriorado funcionalmente A222V para complementar la mutación de levadura en comparación con la enzima tipo silvestre y este análisis fue sensible a los efectos de disponibilidad de foliato. Además de enzimas que utilizan foliato, muchas enzimas dependientes de vitamina Bs y Bi2 y rutas enzimáticas .son relevantes al metabolismo de homocisteina, MTD y otros defectos de nacimiento y resultados de embarazo adversos. Por ejemplo, los efectos en la enzima que utiliza Bs cistationina-ß-sintasa ("CBS") condujo a la acumulación de homocisteina (Kraus et al., 1999. Cystathionine ß-synthase mutations in homocystinuria . Hum Mut 13: 362-375) . También, polimorfismos de un solo nucleótido ("SNP") de la enzima que utiliza E cistationina-y-liasa ("CTH") también han sido asociados con homocisteinemia (Wang et al., 2004. Single nucleotide polymorphism in CTH associated with variation in plasma homocysteine concentration. Clin Genet 65: 483-486).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se deriva en parte del desarrollo de nuevos análisis in vivo para identificar alelos menoscabados de genes que codifican la enzima dentro de rutas metabólicas y determinar su sensibilidad a la remediación de cofactor. Mutantes de levadura compuestos, que comprenden una primera mutación que permite la complementación por una enzima funcionalmente homologa de interés y una segunda mutación (o grupo de mutaciones) que vuelve a la cepa dependiente después de la complementación con un cofactor, provee el estudio de complementación de enzima como función de disponibilidad del cofactor. Los alelos deteriorados sensibles al cofactor, en los que se incluyen alelos recuperables, pueden ser identificados y la relación de disponibilidad de cofactor : actividad de enzima puede ser analizada utilizando análisis revelados en la presente. Los resultados obtenidos pueden ser usados para informar a procedimientos de complementación de nutrientes profilácticos y terapéuticos para impedir el tratar condiciones y enfermedades asociadas con disfunción de enzima metabólica y metabolismo aberrante. La presente invención también se deriva en parte de la ' demostración por primera vez en la presente que Ta remediación del cofactor de alelos menoscabados de baja frecuencia en genes que codifican enzimas es sorprendentemente común. Como se ejemplifica en la presente, múltiples genes sensibles a cofactor en una' ruta metabólica pueden cada uno tener múltiples mutaciones de baja frecuencia en la población. Tomadas conjuntamente, estas mutaciones tienen colectivamente un impacto más significativo sobre la ruta metabólica que seria evidente del examen de un sólo alelo menoscabado de baja frecuencia de un solo gen. Además, puesto que las células heterocigotos para una pluralidad de tales alelos menoscabados de aja frecuencia muestran defectos cuantitativos, las frecuencias agregadas de tales alelos individualmente raros pueden contribuir a fenotipos comunes aún en ausencia de más polimorfismo ( s ) común. Tales alelos menoscabados de baja frecuencia que tienen impacto sobre la ruta pueden también contribuir a la variación fenotipica que es observada con polimorfismos comunes. Asi, la presente invención contempla métodos de diagnóstico y pronóstico enfocados en particular en la detección y caracterización de tales alelos menoscabados de baja frecuencia en genes que codifican enzimas y la determinación de su remediación efectiva. La presente invención también' se deriva en parte de la aplicación especifica de estos análisis para identificar y caracterizar nuevos alelos menoscabados de baja frecuencia en genes que codifican enzimas involucrados en el metabolismo de foliato-homocisteina en particular. Como se demuestra en la presente con respecto a MTHFR, existen un número de alelos menoscabados de baja frecuencia que pueden contribuir acumulativamente a la deficiencia de enzimas pero pueden también ser resueltos mediante complementación de cofactor. La invención también se deriva en parte del hallazgo de que los alelos menoscabados de MTHFR comprenden cambios de secuencia que se mapean a la secuencia de codificación . del dominio catalítico N-terminal de la enzima. Por consiguiente, la invención provee nuevos análisis in vivo para detectar alelos menoscabados pero remediables de genes que codifican enzimas involucrados en el metabolismo de foliato/homocisteina, en los que se incluyen, por ejemplo, ATIC, GART, MAT1A, MAT2A, MTHFR y MTHFS . Aunque el- arte previo describe un análisis de complementación en el cual la deficiencia de metll complementada de actividad MTHFR humana tipo silvestre (Shan et al., JBC, 274: 32613-32618, 1999), este análisis no fue altamente sensible y podría no detectar todos los alelos de MTHFR humanos funcionalmente menoscabados. Por ejemplo, el análisis no fue apto de distinguir entre MTHFR tipo silvestre y el polimorfismo común funcionalmente menoscabado A222V. Además, este análisis no reveló nada acerca de la región entre los niveles de foliato y actividad de enzima. En contraste con el arte previo, los análisis in vivo revelados actualmente son altamente sensibles y aptos de desenmascarar alelos menoscabados de genes involucrados en el metabolismo de foliato/homocisteina, tal como se demuestra en la presente con respecto a MTHFR, en tanto que se determina simultáneamente la sensibilidad de los mismos a fpliato. Los alelos identificados incluyen alelos de baja frecuencia, alelos dominantes o codominantes que exhiben fenotipos como heterocigotos, alelos que son sensibles a foliato, en los que se incluyen alelos que son remediables por foliato y alelos que poseen combinaciones de estas características. Importantemente, estos alelos menoscabados están asociados con el riesgo de una variedad de condiciones y enfermedades, también como la eficacia y toxicidad variada de agentes quimioterapéuticos . La deficiencia de estos alelos menoscabados puede no manifestarse como una condición, enfermedad o respuesta variada a quimioterapia en algunos individuos debido al efecto combinatorio de la disponibilidad de foliato. La habilidad para desenmascarar alelos funcionalmente menoscabados de MTHFR proveen métodos de selección por un riesgo de tales condiciones y enfermedades, también como por la eficacia y toxicidad terapéutica potencial de quimioterapéuticos. La invención también provee nuevos análisis in vivo para detectar alelos menoscabados de CPH y CBS. La habilidad para desenmascarar alelos opcionalmente menoscabados de estos genes provee similarmente métodos para seleccionar el riesgo de enfermedades y condiciones asociadas. Así, en un aspecto, la invención provee análisis in vivo para detectar alelos menoscabados de genes que codifican enzimas en rutas metabólicas y determinar su sensibilidad a cofactores. Los análisis comprenden el uso de cepas de levadura que comprenden una primera mutación en un primer gen que puede ser complementado por el gen que codifica la enzima tipo silvestre y una segunda mutación en un segundo gen (o grupo de genes) que vuelve a la cepa de levadura dependiente en la complementacion con el cofactor (o precursor del mismo) para un fenotipo analizable relacionado con la función del primer gen . Los métodos comprenden (i) introducir a una célula de levadura un alelo de prueba de un gen que codifica enzimas, en donde la célula de levadura comprende una primera mutación en un primer gen que es funcionalmente homologa al gen que codifica la enzima y una segunda mutación en un segundo gen (o grupo de genes) que vuelve a la célula de levadura dependiente después de la complementacion con un cofactor requerido para la función enzimática, en donde la primera mutación altera una característica mensurable de la levadura concerniente con la función del primer gen; (ii) complementar el medio de cultivo con el cofactor y (iii) detectar menos restauración de la característica mensurable en presencia del .alelo de prueba en presencia de la enzima tipo ' silvestre, detectando mediante esto la complementacion incompleta dé la primera mutación genética por el alelo de prueba e identificación del alelo de prueba como un alelo menoscabado. Al titular la cantidad de cofactor complementado, se determina la sensibilidad del alelo menoscabado a la disponibilidad del cofactor. En una modalidad, se usa levadura diploide. La levadura diploide puede ser homóciga o heterociga para un alelo de prueba. La levadura diploide puede comprender un gen tipo silvestre y un alelo de prueba. La levadura diploide puede comprender una combinación de alelos de prueba. En una modalidad preferida, el gen que codifica enzima corresponde en secuencia a un alelo que se presenta de manera estable en la naturaleza o a una compilación de alelos que se presentan de manera estable en la naturaleza individual. En una modalidad preferida, el gen que codifica enzima comprende un alelo de un gen que codifica enzima humano o una compilación de alelos humanos individuales. En una modalidad preferida, la levadura es S. cerevisiae . En una modalidad, el primer gen de levadura es metl3 y el segundo gen de levadura es fol3. Tal cepa de levadura puede ser usada para determinar la actividad de alelo MTHFR y la respuesta de los mismos al estatus de foliato. Asi, en una modalidad, la invención provee análisis in vivo para determinar la actividad de alelos MTHFR, que son aptos además de determinar la actividad como función del estatus de foliato. En una modalidad preferida, el gen que codifica enzima comprende un alelo de MTHFR humano que se presenta de manera estable en la naturaleza. En otra modalidad preferida, el gen que codifica enzima comprende una compilación de alelos de MTHFR humanos individuales. En una modalidad preferida, el método de análisis comprende comparar la actividad de un alelo de MTHFR de interés con aquel de MTHFR tipo silvestre. En una modalidad preferida, el método de análisis comprende titular la cantidad de foliato para determinar si una enzima de MTHFR es sensible a la disponibilidad.de foliato. En una modalidad, la levadura es diploide. En una modalidad, la levadura diploide es héteróciga con respecto al alelo de MTHFR que es probado en cuanto a complementación . En una modalidad, la levadura diploide comprende MTHFR de tipo silvestre y un alelo de MTHFR mutante. En una modalidad preferida, el resultado medido de análisis es cultivado. En una modalidad, el primer gen de levadura es adel6 o adell y el segundo gen de levadura fol3. Tal cepa de levadura puede ser usada para determinar la actividad de la enzima bifuncional AICAR transíormilasa y alelos de IMP ciclohidrolasa (ATIC) y la respuesta de los mismos al estatus de foliato. Asi, en una modalidad, la invención provee análisis in vivo para determinar la actividad -de alelos de ATIC, que son aptos además de determinar la actividad como función del estatus de foliato. En una modalidad preferida, el gen que codifica enzima comprende un alelo de ATIC humano que se presenta de manera estable en la naturaleza. En otra modalidad preferida, el gen que codifica enzima comprende una compilación de alelos de ATIC humanos individuales. En una modalidad, el primer gen de levadura es ade7 y el segundo gen de levadura es fol3. Tal cepa de levadura puede ser usada para determinar la actividad de alelos de glicinamida ribonucleótido transformilasa (GART) y la respuesta del mismo al estatus de foliato. Asi, en una modalidad, la invención provee análisis in vivo para determinar la actividad de alelos de GART, que son aptos además de determinar la actividad como función del estatus de foliato. En una modalidad preferida, el gen que codifica enzima comprende un alelo de GART humano que se presenta de manera estable en la naturaleza. . En otra modalidad preferida, el gen que codifica enzima comprende una combinación de alelos de GART humanos individuales. En una modalidad, el primer gen de levadura es' saml o sam2 y el segundo gen de levadura es fol3. Tal cepa de levadura puede ser usada para determinar la actividad de alelos de metionina adenosintransferasa I, alfa (MAT1A) y la respuesta de los mismos al estatus de foliato. Asi, en una modalidad, la invención provee análisis in vivo para determinar la actividad de alelos de MAT1A, que son . aptos además de determinar la actividad como función del estatus de foliato. En una modalidad preferida, el gen que codifica enzima comprende un alelo de AT1A humano que se presenta de manera estable en la naturaleza. En otra modalidad preferida, el gen que codifica enzima comprende una compilación de alelos de MAT1A individuales. En una modalidad, el primer gen de levadura' es sáml o san¡2 y el segundo gen de levadura es fol3. Tal cepa de levadura puede ser usada para determinar la actividad de alelos de metionina adenosintransferasa II, alfa (MAT2A) y la respuesa de los mismos al estatus de foliato. Asi, en una modalidad, la invención provee análisis in vivo para determinar la actividad de alelos de MAT2A, que son aptos además de determinar la actividad como función del estatus de foliato. En una modalidad preferida, el gen que codifica enzimas comprende un alelo de MAT2A humano que se presenta de manera estable en la naturaleza. En otra modalidad preferida, el gen que codifica enzimas comprende una combinación de alelos de MAT2A humanos individuales. En una modalidad, el primer gen de levadura es faul y el segundo gen de levadura es fol3. Tal cepa de levadura puede ser usada para determinar la actividad de alelos de meteniltetrahidrofolato sintetasa (MTHFS) y la respuesta de los mismos al estatus de foliato.. Asi, en una modalidad, la invención provee análisis in vivo para determinar la actividad de alelos de MTHFS, que son aptos además de determinar la actividad como función del estatus de foliato. En una modalidad preferida, el gen que codifica enzima comprende un alelo de MTHFS humano que se presenta de manera estable en la naturaleza. En otra modalidad preferida, el gen que codifica enzima comprende una compilación de alelos de MTHFS humanos individuales . En otra modalidad, el primer gen de levadura es cys3 y el segundo grupo de genes de levadura es sextuplete-cancelación snolA, sno2A, sno3A, snzlA, snz2A, snz3A. Tal cepa de' levadura puede ser usada para determinar la actividad de alelos de CTH y las respuesta de los mismos al estatus de vitamina B&. Asi, en una modalidad, la invención provee análisis in vivo para determinar la actividad de alelos de CTH, que son aptos además de determinar la actividad como función del estatus de vitamina B6. En una modalidad preferida, el gen que codifica la enzima comprende un alelo de CTH humano que se presenta de manera estable en la naturaleza. En otra modalidad preferida, el gen que codifica enzima comprende una combinación de alelos de CTH humanos individuales. En otra modalidad, el primer gen de levadura es cys4 y el segundo grupo de genes de levaduras es sextuplete-cancelación snolA, sno2A, sno3A, snzlA, snz2A, snz3A. Tal cepa de levadura puede ser usada para determinar la actividad de alelos de CBS y la respuesta de los mismos al estatus de vitamina ??. Asi, en una modalidad,' la invención provee análisis in vivo para determinar la actividad de alelos de CBS, que son aptos además de determinar la actividad como función del estatus de vitamina BQ. En una. modalidad preferida, el gen que codifica enzima comprende un alelo de CBS humano que se' presenta de manera estable en la naturaleza. En otra modalidad preferida, el gen que codifica enzima comprende una combinación de alelos de CBS humanos individuales. En un aspecto, la invención provee cepas de levadura aptas de detectar alelos deteriorados en genes involucrados en el metabolismo de foliato/homocisteína y la sensibilidad de los mismos a cofactores. En una modalidad, la invención provee cepas de levadura aptas de detectar alelos deteriorados de genes que codifican enzima seleccionados del grupo que consiste de ATIC, GART, . MAT1A, MAT2AMTHFR y MTHFS y determinar la sensibilidad de los mismos . a foliato. En modalidades -preferidas, la levadura comprende las mutaciones y adiciones respectivas descritas anteriormente en la presente para cada uno de tales genes que codifican enzimas. En una modalidad, la . invención provee cepas de levadura aptas de detectar alelos deteriorados de CTH y determinar la sensibilidad de los mismos a vitamina ??. En una modalidad, la invención provee cepas de levadura aptas de detectar alelos deteriorados de CBS y determinar la sensibilidad de los mismos a vitamina B6. En un aspecto, la invención provee métodos para detectar un alelo deteriorado de un gen que codifica enzima en una ruta metabólica tal como por ejemplo, metabolismo de foliato/homocisteina . En una modalidad, el (los) alelo(s) deteriorado (s) son ATICGART, MAT1A, MAT2A, MTHFR y/o MTHFS que se presentan de manera estable en la naturaleza. En una modalidad, el alelo deteriorado es un alelo de CBS. En una modalidad, el alelo deteriorado es un alelo de CTH. En modalidades preferidas, los métodos comprenden detectar un alelo deteriorado en un gen que codifica enzima metabólica que ha mostrado ser co actor-remediable utilizando los análisis in vivo y métodos provistos en la presente. En otro aspecto, la invención provee métodos para identificar y/o caracterizar una deficiencia de enzima metabólica en un sujeto, que comprende obtener una muestra del sujeto y detectar la presencia o ausencia de una pluralidad de alelos deteriorados en dicha muestra, en donde la presencia de por lo menos un alelo deteriorado indica que el sujeto está en riesgo de una deficiencia de enzimas. La naturalidad de alelos deteriorados pueden ser del mismo gen que codifica enzima en la ruta metabólica o pueden ser alelos de múltiples genes en la misma ruta. En modalidades preferidas, uno o más alelos deteriorados son alelos de baja frecuencia, por ejemplo, expresados en general en menos del 4% de la población general, más en general en menos de 3% de la población general, preferiblemente' menos de 2.55 a 2% y más preferiblemente en menos de 1% de la población general. En modalidades preferidas, uno o más de los alelos deteriorados son alelos cofactor-remediables . En modalidades particularmente preferidas, los alelos deteriorados cofactor-remediables son identificados mediante los análisis in vivo y métodos provistos en la presente. En otro aspecto, se proveen métodos para detectar una predisposición a una deficiencia de -enzima dependiente de cofactor en un sujeto, que comprende obtener una muestra del sujeto y detectar la presencia o ausencia de una pluralidad de alelos deteriorados en dicha muestra, en donde la presencia de por lo menos un alelo deteriorado indica que el sujeto puede tener una deficiencia de enzima remediable. La pluralidad de alelos deteriorados pueden ser del mismo gen que codifica enzima en la ruta metabólica o pueden ser alelos de múltiples genes en la misma ruta. En modalidades preferidas, uno o más de los alelos deteriorados son alelos de baja · frecuencia, por ejemplo, expresados en general en menos del 4% de la población general, más en general, en menos de 3% de' la población general, preferiblemente menos de 2.5% a 2% y más preferiblemente en menos del 1% de la población general. En modalidades preferidas, uno o más de los alelos deteriorados son alelos cofactor-remediables . En modalidades particularmente preferidas, . los alelos deteriorados cofactor-remedables son identificados mediante los análisis in vivo y métodos provistos en la presente. La detección de alelos específicos en muestras es común en el arte y cualquier- protocolo de detección convencional puede ser' usado ventajosamente en los métodos presentes en los que se incluyen protocolos a base de, por ejemplo, tiibridización, amplificación, secuenciación, análisis de RFLP y los semejantes, como se describe en la presente. También contemplados para uso en la presente se encuentran protocolos y/o materiales desarrollados en el futuro que tienen utilidad particular en la detección de alelos en muestras de ácido nucleico. En un aspecto adicional, se proveen métodos para ) tratar una deficiencia de enzima metabólica en un sujeto, que comprenden obtener una muestra de un sujeto que tiene o . que se sospecha que tiene una deficiencia, detectar la presencia o ausencia de una pluralidad de alelos deteriorados cofactor-remedables en la muestra y administrar un complemento de cofactor apropiado al sujeto en base al número y tipo de alelo (s) deteriorado ( s ) detectado (s) en la muestra, como se describe en la presente. En una modalidad, los métodos comprenden además el uso de un análisis in vivo para determinar la actividad de enzima, como se describe en la presente. · En una modalidad, los métodos comprenden, además el uso de un análisis in vivo para determinar la actividad enzimática, como se describe en la presente y detectar una mutación en. un ácido nucleico que codifica enzima. En una modalidad, los métodos comprenden además ' el uso de un análisis in vivo para determinar la actividad de enzima, como se describe en la presente y un análisis de sensibilidad a la temperatura para determinar la estabilidad de la enzima a una temperatura elevada. En . una modalidad, los métodos comprenden además el uso de un análisis in vivo para determinar la actividad de enzima, como se describe en la presente y un análisis in vitro para determinar la actividad especifica de la enzima. i En un aspecto> la invención provee métodos para seleccionar el riesgo de una enfermedad o condición asociada con metabolismo de homocisteina aberrante. Los métodos comprenden la selección de un alelo deteriorado de un gen involucrado en metabolismo de homocisteina, como se revela en la presente. En una modalidad preferida, los métodos comprenden detectar un alelo deteriorado que ha sido caracterizado como tal utilizando un análisis in vivo descrito en la presente. En una modalidad preferida, la enfermedad o condición es seleccionada del grupo que consiste de enfermedad cardiovascular, enfermedad de arteria coronaria, accidente isquémico, aterisclerosis, defectos de tubo neural, escisiones orofaciales, preeclampsia, parto a corto plazo/nacimiento de bajo peso, . aborto prematuramente espontáneo recurrente, trombosis, oclusión de arteria retinal, síndrome de Down, cáncer colorrectal, cáncer de pecho, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, depresión, esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer/demencia, degeneración macular relacionada con la edad y glaucoma. En una modalidad, los métodos comprenden selección de un alelo deteriorado de ATIC, GART, MAT1A, MAT2A, MTHRF y/o MTHFS como se describe en la presente. En una modalidad, los métodos comprenden la selección de un alelo deteriorado de CBS, como se describe en la presente. En una modalidad, los métodos comprenden selección de un alelo deteriorado de CTH, como se describe en la presente. En un aspecto, la invención provee métodos para determinar el potencial de respuesta quimioterapéutico de un individuo. Los métodos comprenden el uso de un método para detectar un alelo deteriorado de un gen involucrado en el metabolismo de foliato/homocisteína, como se describe en la presente. En una modalidad preferida, el gen es seleccionado del grupo que consiste de MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A y GART. La detección de un alelo deteriorado en el individuo mediante los métodos de análisis ih vivo descritos en la presente y/o mediante aplicación de métodos de detección por alelos específicos indica un potencial de respuesta disminuido.
En un aspecto, la invención provee métodos para determinar toxicidad quimioterapéutica potencial para un individuo. Los métodos comprenden el uso de un método para detectar un alelo deteriorado de un gen involucrado en el metabolismo de foliato/homocisteínk, como se describe en la presente. En una modalidad preferida, el gen es seleccionado del grupo que consiste de MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A y GART. La detección de un alelo deteriorado en el individuo mediante los métodos de análisis in vivo descritos en la presente y/o mediante aplicación en el método de detección por alelos específicos indica un potencial de toxicidad incrementado . En un aspecto, la invención provee ácidos nucleicos aislados correspondientes en secuencia a alelos de un gen que codifica enzima seleccionado del grupo que consiste de MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A Ygart . En una modalidad, el ácido nucleico aislado tiene y/o comprende una secuencia de un alelo de un gen de MTHFR, por ejemplo, un SNP revelado en la Tabla A.' En una modalidad, el ácido nucleico aislado tiene y/o comprende una secuencia de un alelo de un gen de ATIC, por ejemplo, un SNP revelado en la Tabla B. En una modalidad, el ácido nucleico aislado tiene y/o comprende una secuencia de un alelo de un gen de MTHFS, por ejemplo, un SNP revelado en' la Tabla- C. En una modalidad, el ácido nucleico aislado tiene y/o comprende una secuencia de un alelo de un gen de MAT1A, por ejemplo, un SNP revelado en la Tabla D. En una modalidad, el ácido nucleico aislado tiene y/o comprende una secuencia de un alelo de un gen de MAT2A, por ejemplo, un SNP revelado en la Tabla E. En una modalidad, el ácido nucleico aislado tiene y/o comprende una secuencia de un alelo de un gen de GART, por ejemplo, un SNP revelado en la Tabla F. En una modalidad, el ácido nucleico corresponde a una secuencia de un alelo de MTHFR y comprende una secuencia que codifica una mutación no sinónima en la proteina de MTHFR seleccionada del grupo que consiste de MllOl, H213R, D223N, D291N, R519C, R519L y Q648P. En un aspecto, la invención provee arreglos para detectar arreglos deteriorados de genes involucrados en el metabolismo de foliato/homocisteina . En una modalidad, la invención provee arreglos para detectar un alelo deteriorado de un gen seleccionado del grupo que consiste de ATIC, GART, MAT1A, MAT2A, MTHFR y MTHFS. En una modalidad preferida, el arreglo es apto de detectar más de un alelo deteriorado por un gen seleccionado del grupo. En una modalidad preferida, el arreglo es capaz de detectar más de un alelo deteriorado de una pluralidad de genes seleccionados del grupo. En una modalidad, el alelo es capaz de detectar más de un alelo deteriorado de cada uno de una pluralidad de genes seleccionados del grupo. En una modalidad preferida, el arreglo es capaz de detectar tal alelo deteriorado que es un alelo deteriorado remediable. En una modalidad preferida, el arreglo es capaz de detectar una pluralidad de tales alelos deteriorados que son alelos deteriorados remediables. En modalidades preferidas, por lo menos uno de los alelos deteriorados es un alelo de baja frecuencia. En una modalidad, la invención provee arreglos para detectar un alelo de MTHFR deteriorado. En una modalidad, el arreglo comprende uno o más ácidos nucleicos aptos de hibridización a un alelo de MTHFR que comprende una mutación no sinónima seleccionada del grupo que consiste de aquellos que codifican M1101, H213R, D223N, D291N, R519C, R519L y Q648P. En una modalidad, la invención provee arreglos para detectar alelos deteriorados de CBS. Los arreglos comprenden uno o más ácidos nucleicos aptos de hibridización a un alelo deteriorado de CBS. En una modalidad, la invención provee arreglos para detectar alelos deteriorados de CTH. Los arreglos comprenden uno o más ácidos nucleicos aptos de hibridización a un alelo deteriorado de CTH. En una modalidad preferida, la invención provee arreglos para detectar alelos deteriorados de una pluralidad de genes involucrados en el metabolismo de foliato/homocisteina . Los arreglos de la invención pueden usar cualquiera de los muchos arreglos, tecnologías de sonda y lectura conocidas en el arte. En un aspecto, la invención provee un método para prevenir uña condición o enfermedad asociada con metabolismo de foliato/homocisteína aberrante en un individuo que alberga un alelo deteriorado remediable de un gen involucrado en el metabolismo de foliato/homocisteína . En una modalidad, el método comprende incrementar la ingestión de foliato del individuo. En una modalidad, el método comprende incrementar la ingestión de vitamina B& del individuo. En una modalidad preferida, el método comprende un método de selección por riesgo de una enfermedad o condición asociada con metabolismo de foliato/homocisteína aberrante, como se describe en la presente. En un aspecto, _ la invención provee un método de tratamiento de una condición o enfermedad asociada con metabolismo de foliato/homocisteína aberrante en donde el paciente alberga un alelo deteriorado remediable de un gen involucrado en el metabolismo de foliato/homocisteína . En una modalidad, el método comprende incrementar la ingestión de foliato del paciente. En una modalidad, el método comprende incrementar la ingestión de vitamina B6 del individuo. En una modalidad preferida, el método comprende un método de selección por riesgo de enfermedad o condición asociada con metabolismo de foliato/homocisteína aberrante, como se describe en la-presente. En un aspecto, la invención provee un método para incrementar el potencial de respuesta quimioterapéutica de un individuo que alberga un alelo deteriorado remediable de un gen involucrado en el metabolismo de foliato/homocisteina . El método comprende incrementar la ingestión de foliato del r individuo. En una modalidad preferida, el método comprende un método de selección o riesgo de una enfermedad o condición asociada con metabolismo de foliato/homocisteina aberrante, como se describe en la presente. En una modalidad preferida, el gen es seleccionado del grupo que consiste de MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A y GART . En un aspecto, la invención provee un método para disminuir la toxicidad de un quimioterapéutico para un individuo que alberga un alelo deteriorado remediable de un gen involucrado en. el metabolismo de foliato/homocisteina . El método comprende incrementar la ingestión de foliato del individuo. En una modalidad preferida, el método comprende un método de selección por riesgo de una enfermedad o condición asociada con metabolismo de foliato/homocisteina aberrante, como se describe en la presente. En "una modalidad preferida, el gen es seleccionado del grupo que consiste de MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A y GART.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Efectos de complementación de ácido folinico sobre la velocidad de crecimiento de células fol3A:KanMX y actividad celular de MTHFR humano, (a) El cultivo de levadura haploide fol3A:KanMX fue medida en placas de 96 cavidades como se describe en la sección de materiales y métodos. Los medios fueron complementados con ácido folinico a las concentraciones indicadas. La curva marcada F0L3 (F0L3 MET3) del- crecimiento en medio sin ácido folinico. (b) Cultivo de levadura haploide fol3A:KanMX transformada con phMTHFR en medios que carecen de metionina y complementados con ácido folinico a las concentraciones indicadas. Se probaron tres transformantes independientes a cada concentración de ácido folinico para probar la reproducibilidad . La curva marcada metl3A representa un solo aislado de células, transformadas con vector vacio, cultivadas a 50 mg/ml de ácido folinico. Figura 2. Impacto funcional y capacidad de remediación de foliato y variantes de población de MTHFR no sinónimas, (a) Se probaron seis variantes de MTHFR en cuanto a la habilidad de rescatar células fol3A:KanMX met3A : KanMX en medios que carecen de metionina a tres concentraciones de ácido folinico diferentes. El alelo M1101 y el alelo doblemente sustituido M1101 A222V fueron probados solamente a 50 y 25 g/ml de ácido' folinico. La curva marcada como principal corresponde al alelo de MTHFR más común en la población. Cada curva es de un fondo de 3-6 transformantes independientes, (b) El esquema de la proteina de MTHFR (656 aminoácidos) dividida en un dominio catalítico N-terminal y un dominio regulatorio C-terminal de tamaño casi igual (35) . Las posiciones de todos los cambios no sinónimos son indicadas. Los cambios benignos están en verde. Los cambios generados de 1 á 4 representan alelos de remediación de foliato. indicados en orden incrementado de severidad. El cambio #5 (R134C) fue casi pérdida de función y no designado como remediación de foliato (véanse resultados) pero son un tanto aumentable de foliato. Figura 3. Actividad enzimática de variantes de MTHFR. El extracto de levadura crudo de células transformadas con los constructos de MTHFR indicados fue preparado y analizado en cuanto a actividad de MTHFR como se describe en la presente. El tratamiento térmico por los tiempos indicados se hizo en reacciones antes de la adición del - sustrato radiomarcado . Las mediciones fueron promedios de dos conjuntos independientes de. análisis por triplicado; las barras de error son la desviación estándar para los seis puntos de datos. Figura 4. Fenotipos de heterocigoto para variantes de MTHFR tal como son recapituladas en levadura. La homocigocidad o heterocigocidad de los alelos de MTHFR fue recreada en levadura diploide para los alelos principal, R134C y A222V como se describe en la presente. Los diploides fueron obtenidos del apareamiento de cepas haploides que cada una expresan un solo alelo de MTHFR integrado en el genoma. El crecimiento como función de complementación de ácido folinico fue analizado exactamente como para haploides. Figura 5. Inmunoabsorción de variantes de MTHFR humanas expresadas en levadura, (a) Se realizaron extractos de células de levadura que portan diferentes alelos de THFR y detectados con anticuerpos anti-HA como se describe en la presente. A222V M1101 fue un alelo doblemente sustituido; Principal indica el alelo de MTHFR más común en la población. Los dos carriles más al lado derecho fueron, lado a lado, el alelo principal y el alelo T34A no fosforilable (37). (b) La proporción de las intensidades de señal de la banda inferior sin fosforilar a la banda superior fosforilada para todas las variantes de MTHFR identificadas en este estudio graficadas como ' función de severidad incrementada de impacto funcional. Los alelos en el eje X fueron clasificados como benignos u ordenados en el rango con respecto a la actividad. Todos los alelos benignos (en los que se incluyen el alelo principal y todos los cambios de dominio regulatorio) fueron graficados y muestran proporciones casi idénticas de las dos especies de MTHFR, así los símbolos están traslapados. Figura 6. Análisis en cuanto a sensibilidad de B6 (piridoxina) en dos enzimas de B6. humanas: CBS y CTH.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Como se indica anteriormente la presente invención provee nuevos análisis in vivo para identificar alelos deteriorados de genes que codifican enzimas dentro de rutas metabólicas y determinar su sensibilidad a la remediación de co-factor. utantes de levadura compuestos, que comprenden una primera mutación que permita complementación mediante una enzima funcionalmente homologa de interés y una segunda mutación (o grupo de mutaciones) que vuelven a la cepa dependiente después de la combinación con un co-factor proveen el estudio de complementación de enzima como- función de disponibilidad del co-factor. Significativamente, la presente invención también demuestra que la revelación de co-factor de alelos deteriorados de baja frecuencia en genes que codifican enzimas es sorprendentemente común y que éstos alelos pueden tener colectivamente un impacto significativo sobre la ruta metabólica. Asi, la presente invención contempla métodos de diagnóstico y pronóstico enfocados en particular en la detección y caracterización de tales alelos deteriorados de baja frecuencia en genes que codifican enzimas y la determinación de su remediación efectiva. El "dominio catalítico N-terminal" de MTHFR se refiere a los aminoácidos 1-359 en MTHFR humano. Lá secuencia de mARN de MTHFR humano de referencia se encuentra en Genbank número de acceso NM_005957, en donde la secuencia de aminoácidos codificada 656 es encontrada en número de acceso de Genbank NP_005958. Por disfunción de MTHFR significa una desviación de la actividad de MTHFR tipo silvestre. La disfunción de enzima y condiciones y enfermedades asociadas pueden surgir por medio de por ejemplo cambios en la actividad especifica de una enzima, mala colocación de una enzima, cambios en el nivel de una enzima y otros cambios. Análisis in vivo para medir la actividad de enzima y sensibilidad de la misma a co-factores Los análisis provistos de la presente* pueden ser usados para probar la habilidad de alelos de genes que codifican enzimas para complementar mutaciones ' en genes de levadura funcionalmente homologas, también como para medir la sensibilidad de éstas enzimas a co-factores. Los análisis comprenden medir un resultado o fenotipo que está asociado con la función normal del gen de levadura y alterado por su disfunción. Los análisis comprenden el uso de cepas de levadura que comprenden una primera mutación que permite la complementación por una enzima funcionalmente homologa de interés y una segunda mutación que vuelve a la cepa dependiente después de la complementación . con co-factor por un fenotipo analizable relacionado con la función del primer gen. Los métodos comprenden i) Introducir a una célula de levadura de un alelo de prueba de un gen que codifica enzima, en donde la célula de levadura comprende una primera mutación en un primer gen que es funcionalmente homólogo al gen que codifica enzima y una segunda mutación en un segundo gen (o grupo de genes) que vuelve a la célula de levadura dependiente después de la complementación con un co-factor requerido para la función de enzima, en donde la primera mutación altera una característica mensurable de la levadura relacionada con la función del primer gen; (ii) complementario en el medio de cultivo con el co-factor y (iii) detectar menos restauración de la característica mensurable en presencia del alelo de prueba que en presencia de la enzima tipo silvestre, detectando mediante este la complementación incompleta de la primera mutación genética por el alelo de prueba al identificar el alelo de prueba como un alelo deteriorado. Al hacer variar la cantidad de co-factor complementario se determina la sensibilidad del alelo deteriorado a- la disponibilidad del co-factor . En una modalidad preferida, el alelo de prueba de un gen que codifica enzima corresponde en secuencia a un alelo que se presenta de manera estable en la naturaleza o a una compi'lación de polimorfismos que se presentan de manera estable en la naturaleza individuales. En una modalidad preferida, el alelo de prueba corresponde en secuencia a un alelo de un gen humano o a una combinación de polimorfismos individuales en una pluralidad de alelos humanos. En una modalidad preferida, la levadura es Saccharomycescerevisiae ("S. cerevisiae" ) , aunque otras especies de levadura pueden ser usadas. En una modalidad, se usa levadura diploide. La levadura diploide puede ser homociga o heteróciga para un alelo de prueba. La levadura diploide puede comprender un gen tipo silvestre y un alelo de prueba. La levadura diploide puede comprender una combinación de .alelos de prueba. Como se demuestra en la presente, los alelos deteriorados funcionalmente pueden incluir alelos que tienen un fenotipo heterócigo. En una modalidad, la levadura diploide es heteróciga con respecto al alelo que es probado por complementación . En una modalidad, la levadura diploide comprende un alelo tipo silvestre y un alelo deteriorado de un gen que codifica enzimas. En una modalidad preferida, el resultado medido del análisis es cultivado. En una modalidad preferida, el método de análisis comprende comparar la actividad de un alelo de prueba de interés con aquella de un alelo tipo silvestre correspondiente. En una modalidad, la invención provee análisis in vivo para determinar la actividad de un alelo de prueba, por ejemplo un alelo de un gen que codifica enzima. En una modalidad, el gen que codifica enzima está involucrado en o relacionado con el metabolismo de foliato/homocisteina . En otra modalidad, el alelo de prueba es seleccionado del grupo del grupo que consiste de un alelo de THFR, alelo de ATIC, alelo de GART, un alelo de MAT1A, un alelo de MAT2A y un alelo de MTHFS, tales análisis son aptos además de determinar la actividad como función del estatus de foliato. En otra modalidad, el alelo que codifica enzima es seleccionado del grupo que consiste de un alelo de CTH y una alelo de CBS. En una modalidad el alelo de prueba es un alelo de MTHFR y comprende por lo menos una sustitución en el dominio catalítico del termino N y por lo menos una mutación en la región reguladora de término C. En tanto que las sustituciones en la región de término C solas comúnmente no deterioran la función, se pueden combinar con otras sustituciones para deteriorar funcionalmente un alelo. En una modalidad preferida, la primera mutación está en el gen de levadura metl3, que puede ser complementado funcionalmente por MTHFR humano tipo silvestre. En otra modalidad, el primer gen de levadura es ade 16 o ade 17, que puede ser complementado funcionalmente por el ATIC humano tipo silvestre., En una modalidad, el primer gen de levadura es ade 7, que puede ser complementado funcionalmente por GART humano tipo silvestre. En una modalidad, el primer gen de levadura es sam 1 o sam 2, que pueden ser complementados funcionalmente por el MATIA humano silvestre o MAT2A humano tipo silvestre. En una modalidad, el primer gen de levadura es faul, que puede ser complementado funcionalmente por MTHFS humano tipo silvestre. En una modalidad preferida, la segunda mutación está en el gen de levadura fol3, que vuelve a la levadura dependiente de foliato en medio complementado. Tal cepa de levadura puede ser usada para determinar la actividad de un alelo de prueba, el alelo de prueba dependiendo de la primera mutación y la respuesta del mismo al estatus de foliato. Por ejemplo, una levadura compuesta que tiene una primera mutación en el gen de levadura metí y una segunda mutación en el gen de mutación fol3, puede ser usado para determinar la actividad de un alelo de METHFR y la respuesta del mismo al estatus del foliato. En una modalidad preferida, el método de análisis comprende hacer variar la cantidad de foliato para determinar si la enzima codificada por el alelo de prueba es sensible a la disponibilidad de foliato. En una modalidad preferida, el método dé análisis incluye medir la salida o resultado en presencia de menos de 50ug/ml de foliato. En una modalidad preferida, el método de análisis incluye medir la salida o resultado en presencia de aproximadamente 50ug/ml de foliato. En una modalidad preferida, el método de análisis incluye medir la salida en presencia de más de 50 g/ml de foliato. En una modalidad, el foliato se hace variar para determinar si un alelo deteriorado de un gen que codifica enzima es remediable por foliato. En otra modalidad, el primer gen de levadura es cys3 y el segundo gen de levadura es sextuplete-cancelación snolñ sno2A sno3A snzlA snz2A snz3A. Tal cepa de levadura puede ser usada para determinar la actividad de alelos de CTH y la respuesta a los mismos al estatus de vitamina Asi, en una modalidad, la invención provee análisis in vivo para determinar la actividad de alelos de CTH, que son aptos además de determinar la actividad como función del estatus de vitamina ??. En una modalidad preferida, el alelo de CTH comprende un alelo humano que se presenta de manera estable en la naturaleza. En otra modalidad preferida, el alelo de CTH comprende una combinación de alelos de CTH humanos individuales. En otra modalidad, el primer gen de levadura cys4 y el segundo gen de levadura es sextuplete-cancelación snolA sno2A sno3ñ snzlA snz2A snz3A. Tal cepa de levadura puede ser usada para determinar la actividad de alelos de CBS y la respuesta de los mismos al estatus de vitamina B6. Asi, en una modalidad, la invención provee análisis in vivo para determinar la actividad de alelos de CBS, que son aptos . además de determinar la actividad como función del estatus de vitamina B6. En una modalidad preferida, el ' alelo de CBS comprende un alelo humano que se presenta de manera estable en la naturaleza. En otra modalidad preferida, el alelo de CBS comprende una compilación de alelos de CBS humanos individuales . La tabla 1 a continuación enlista genes que codifican enzimas y provee mutaciones de levadura compuestas ejemplares que pueden ser usadas para determinar la actividad de un alelo del gen que codifica enzima.
Las cepa¾s de levadura pueden ser generadas mediante métodos bien conocidos en el arte. Por ejemplo, véase Shan et al., JBC, 274:32613-32618, 1999. La introducción de ácidos nucleicos a cepas de levadura se puede hacer utilizando métodos bien conocidos en- el arte. Por ejemplo, véase Shan et al., JBC, '274:32613-32618, 1999.
Nuevos alelos de genes que codifican enzimas Como se describe en la sección de ejemplos, polimorfismos de un solo nucleótido que afectan sutilmente enzimas, por ejemplo, que dan como resultado un alelo deteriorado de un gen que codifica enzima puede ser caracterizado utilizando el análisis in vivo revelando en la presente sin consideración de la frecuencia del alelo. Por ejemplo, los métodos revelados en la presente fueron usados para determinar si un alelo es un alelo deteriorado y si es asi, si el alelo deteriorado es co-factor-remediable . Se proporcionan en la tabla 3 y tablas A-F polimorfismos de un solo nucleótido para los genes que codifican enzimas THFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A y GART que han sido caracterizados (tabla 3) o pueden ser caracterizados (Tablas A-F) mediante el análisis descrito en la presente. Estas- tablas también proveen los SNP para esos genes que no han . sido identificados previamente. Asi, se revelan en la presente nuevos alelos para un gen que codifica enzima seleccionada del grupo que consiste de MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A y GART. Estos alelos pueden ser caracterizados utilizando el análisis revelado en la presente y pueden ser detectados ventajosamente en los métodos de selección, prevención y tratamiento como se revelan en la presente. El experimentado en el arte, reconocerá y apreciará que la caracterización de un alelo deteriorado como remediable por co-factor informa los métodos de selección, prevención y tratamiento como se revelan en la presente. ¦Como se usa en la presente, un "alelo" es una secuencia de nucleótidos, tal como un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), presente en más de una forma en un genoma. Un "alelo" como se usa en la presente no está limitado a la secuencia que se' presenta de manera estable en la naturaleza de un sitio genómico. "Alelo" . incluye transcriptos y secuencia empalmada derivada de la misma (por ejemplo, secuencia de mARN, secuencia de cADN) . Un "alelo" puede ser un alelo que se presenta de manera estable en la naturaleza o un alelo sintético. Estos pueden incluir mutaciones en el dominio catalítico N-terminal, también como mutaciones en la región reguladora C-terminal. "Homocigo", de acuerdo con la presente invención, indica que las dos copias del código SNP son . idénticas en secuencia al otro alelo. Por ejemplo, un sujeto homocigo para el alelo tipo silvestre de un gen que codifica enzima contiene por lo menos dos copias idénticas de la secuencia. Tal sujeto no sería predispuesto a una deficiencia de enzima co-factor dependiente dentro de una ruta metabólica. "Heterócigo" como se usa en la presente, indica que dos copias diferentes del alelo están presentes en el genoma, por ejemplo, una copia del alelo tipo silvestre y una copia del alelo variante, que puede ser un alelo deteriorado. Un sujeto que tiene tal genoma es heterócigo y puede estar predispuesto a una deficiencia de enzima co-factor dependiente dentro de una enfermedád metabólica. "Heterócigo" también abarca un sujeto que tiene dos mutaciones diferentes en sus alelos. "Alelo deteriorado" significa un alelo de un gen que codifica una enzima metabólica que está funcionalmente deteriorada, tal deterioro funcional puede o no puede ser co- factor-remediable . Una "mutación de alelo deteriorado" se refiere a la ' mutación de ácidos nucleicos particular que está subyacente al deterioro funcional de un alelo deteriorado y distingue un alelo deteriorado de la secuencia tipo silvestre en el sitio de la mutación. Comúnmente, una mutación de alelo deteriorado es una mutación puntual no sinónima de un solo codón. "Co-factor-remediable" se refiere a la habilidad de nivel de co-factor alterado para compensar el deterioro funcional de una enzima metabólica deteriorada. La complementación con un co-factor incluye complementación con un precursor de un co-factor que puede ser convertido al co-factor. "Co-factor" se refiere a factores que son co-factores directos de enzimas de interés (por ejemplo, foliato para MTHFR, ATIC, GART, MAT1A, MAT2A yMTHFS) , también con factores que son co-factores indirectos para enzimas de interés. Asi, los co-factores pueden impactar directa o indirectamente la función enzimática. Las medidas de frecuencia conocidas en el arte incluyen "frecuencia de alelo", es decir la fracción de genes en una población que tienen un SNP. Las frecuencias de alelos para cualquier gen debe sumar 1. Otra medida de frecuencia conocida en el arte es la "frecuencia de heterocigoto", es decir, la fracción de individuos en una población reportan dos alelos o dos formas de un SNP de un gen, uno heredado de cada padre. Alternativamente, el número de individuos que son homocigos para un alelo particular de un gen puede ser , una medida útil. La relación entre frecuencia de alelo, frecuencia heterocigoto y frecuencia homocigoto es descrita para muchos fines por la ecuación de Hardy-Weinberg que provee la relación entre frecuencia de alelo, frecuencia de heterocigoto y ¦frecuencia de homocigoto en una población criada libremente al equilibrio. La mayoría de varianzas humanas están sustancialmente en equilibrio de Hardy-Weinberg. Como se usa en la presente, un "alelo de baja frecuencia" tiene una frecuencia de alelo de menos de 4%. Se revelan en la presente nuevos alelos para genes que codifican enzima humanos involucrados en o relevantes al metabolismo de poliato/homocisteína . "Metabolismo de foliato/homocisteina" significa metabolismo de foliato y/o homocisteína . Tales genes que codifican enzimas incluyen MTHFR, ATIC, GART, MAT1A, MAT2A yMTHFS . Los símbolos del comité de nomenclatura de gen de Hugo (HGNC) , id de gen, números de acceso de nucleótidos NCBI (NC_) , números de acceso de polipéptidos NCBI (NB_) y nombres de genes que codifican enzimas involucrados en o relevantes al metabolismo de foliato/homocisteina son provistos en la tabla 2.
Tabla 2 Nucleotido Polipéptido HGNC GeneID NCBI Nombre NCBI aminoimidazol-4-carboxamida ATIC 471 NC_000002.10 NM_004044 ribonucleotido formiltransferasa/IMP ciclohidroiasa GART 2618 NC_000021.7 NM_000819 glicinamida ribonucleotido transformilasa MAT1A 4143 NC_000010.9 NM_000429 metionina adenosiltransferasa I, alfa MAT2A 4144 NC_000002.10 NM_005911 metionina adenosiltransferasa II, alfa THFR 4524 NC_000001.9 NM 005957 metilentetrahidrofoliato reductasa THFS 10588 NC 000015.8 NM 006441 meteniltetrahidrofoliato sintetasa En un aspecto, la invención provee ácidos nucleicos aislados correspondientes en secuencia a nuevos alelos que codifican enzima humanos involucrados en el metabolismo de foliato/homocisteína . Por ejemplo, la invención provee ácido nucleicos aislados correspondientes en secuencia a un alelo que codifica enzima seleccionado del grupo que consiste en un alelo de MTHFR, un alelo de ATIC, un alelo de GART, un alelo de MAT1A, un alelo de MAT2A y un alelo de MTHFS, que puede o no puede ser co-factor-remediable . Estos nuevos alelos incluyen alelos de baja frecuencia. Estos nuevos alelos incluyen alelos deteriorados. Así, se proporciona en la presente un ácido nucleico aislado correspondiente en secuencia a un alelo de un gen de MTHFR, en donde dicho ácido nucleico comprende un SNP encontrado en un nucleotido seleccionado del grupo que consiste del nucleotido' 4078 del gen de MTHFR; nucleotido 4234 del gen de MTHFR; nucleotido 5733 del gen de MTHFR; nucleotido 5872 del nucleotido de MTHFR; nucleotido 6642 del gen de MTHFR; nucleótido 6657 del gen de MTHFR; nucleótido 6681 del. gen de MTHFR; nucleótido 6674 del gen de MTHFR; nucleótido 10906del gen de MTHFR; nucleótido 11656 del gen de MTHFR; nucleótido 11668 del gen de MTHFR; nucleótido 11902 del gen de MTHFR; nucleótido 112232 del gen de MTHFR; nucleótido 2622 del gen de MTHFR; nucleótido 12757 del gen de MTHFR; nucleótido 13040 del gen de MTHFR; nucleótido 14593 del gen de MTHFR; nucleótido 14612 del gen de MTHFR; nucleótido 14705 del gen de MTHFR; nucleótido 13170 del gen de MTHFR; nucleótido 116401 del gen de MTHFR y nucleótido 116451 del gen de MTHF. La secuencia de los SNP en esas posiciones son provistas en la tabla A. También se provee en la presente un ácido nucleico aislado correspondiente en secuencia a un alelo de un gen de ATIC, en donde el ácido nucleico comprende un SNP encontrado en un nucleótido seleccionado del grupo que del nucleótido 1100 del gen de ATIC; el nucleótido 1114 del gen de ATIC; el nucleótido 1179 del gen ATIC; el nucleótido 1244 del gen de ATIC; el nucleótido 1270 del gen de ATIC; el nucleótido 1288 del gen de ATIC; el nucleótido 1301 del gen de ATIC; el nucleótido 1380 del gen de ATIC; el nucleótido 1396 del gen de ATIC; el nucleótido 1453 del gen de ATIC; el nucleótido 1506 del gen de ATIC; el nucleótido 1689 del gen de ATIC; el nucleótido 7227 del gen de ATIC; el nucleótido 7232 del gen de ATIC; el nucleótido 7388 del gen de ATIC; el nucleótido 8756 del gen de ATIC; el nucleótido 8808 del gen de ATIC; el nucleótido 14099 del gen de ATIC; el nucleótido 14140 del gen de ATIC; el nucleótido 14144 del gen de ATIC; el nucleótido 14183 del gen de ATIC; el nucleótido 14229 del gen de ATIC; el nucleótido 14238 del gen de ATIC; el nucleótido 14245 del gen de ATIC; el nucleótido 14260 del gen de ATIC; el nucleótido 14489 del gen de ATIC; el ' nucleótido 14970 del gen de ATIC; el nucleótido 15003 del gen de ATIC; el nucleótido 15040 del gen de ATIC; el nucleótido 15043 del gen de ATIC; el nucleótido 15149 del gen de ATIC; el nucleótido 15240 del gen de ATIC; el nucleótido 15844 del gen de ATIC; el nucleótido 16063 del gen de ATIC; el nucleótido 21363 del gen de ATIC; el nucleótido 21372 del gen de ATIC; el nucleótido 21400 del gen de ATIC; el nucleótido 21521 del gen de ATIC; el nucleótido 21611 del gen de ATIC; el nucleótido 22187 del gen de ATIC; el nucleótido 22273 del gen de ATIC; el nucleótido 22282 del gen de ATIC; el nucleótido 22291 del gen de ATIC; el nucleótido 22342 del gen de ATIC; el nucleótido 22512 del gen de ATIC; el nucleótido 22519 del gen de ATIC; el nucleótido 22538 del gen de ATIC; el nucleótido 22564 del gen de ATIC; el nucleótido 22589 del gen de ATIC; el nucleótido 22737 del gen de ATIC; el nucleótido 24992 del gen de ATIC; el nucleótido 25009 del gen de ATIC; el nucleótido 27757 del gen de ATIC; el nucleótido 27855 del gen de ATIC; el nucleótido 27985 del gen de ATIC; el nucleótido 28015 del gen de ATIC; el nucleótido 33901 del gen de ATIC; el nucleótido 33919 del gen de ATIC; el nucleótido 33920 del gen de ATIC; el nucleótido 33933 del gen de ATIC; el nucleótido 35723 del gen de ATIC; el nucleótido 35737 del gen de ATIC; el nucleótido 35742 del gen de ATIC; el nucleótido 35840 del gen de ATIC; el nucleótido 35917 del gen de ATIC; el nucleótido 35968 del gen. de ATIC; el nucleótido 35973 del gen de ATIC; el nucleótido 38338 del gen de ATIC; el nucleótido 38342 del gen de ATIC; el nucleótido 38437 del gen de ATIC; el nucleótido 38342 del gen de ATIC; el nucleótido 38582 del gen de ATIC; el nucleótido 38627 del gen de ATIC; el nucleótido 38667 del gen de ATIC y el nucleótido 38725 del gen de ATIC. Las secuencias de los SNP son provistas en la tabla B. También provisto en la presente es un ácido nucleico aislado correspondiente en secuencia a un alelo a un gen de MTHFS, en donde el ácido nucleico comprende un SNP encontrado en un nucleótido seleccionado del grupo que consiste de un nucleótido 8808 del gen de MTHFS; nucleótido 8912 del gen de MTHFS; nucleótido 89.57 del gen de MTHFS; nucleótido 8998 del gen de MTHFS; nucleótido 52560 del gen de MTHFS; nucleótido 52878 del gen de MTHFS y nucleótido 52902del gen de MTHFS. Las secuencias de los SNP en esas posiciones son provistas en la tabla C. También se provee en la presente un ácido nucleico aislado correspondiente en secuencia a un alelo de un gen de MAT1A, en donde el ácido nucleico comprende un SNP encontrado en un nucleótido seleccionado del grupo que consiste de nucleótido 5045 del gen de MATIA; nucleótido 5181 del gen de MATIA; nucleótido 5233 del gen de MATIA; nucleótido 6739 del gen de MATIA; nucleótido 6795 del gen de MATIA; nucleótido 9833 del gen de MATIA; nucleótido 10006 del gen de MATIA; nucleótido 10312 del gen de MATIA; nucleótido 10339 del gen de MATIA; nucleótido- 10374 del gen de MATIA; nucleótido 10484 del gen de MATIA; nucleótido 10555 del. gen de MATIA; nucleótido 14038 del gen de MATIA; nucleótido 14114 del gen de MATIA; nucleótido 14177 .del gen de MATIA; nucleótido 15424 del gen de MATIA; nucleótido 15500 del gen de MATIA; nucleótido 15646 del gen de MATIA; nucleótido 15706 del gen de MATIA; nucleótido 15715 del gen de MATIA; nucleótido 15730 del gen de MATIA; nucleótido 15758 del gen de MATIA; nucleótido 16133 del gen de MATIA; nucleótido 16174 del gen de MATIA; nucleótido 15706 del gen de MATIA; nucleótido 15715 del gen de MATIA; nucleótido 15730 del gen de MATIA; nucleótido 15758 del gen de MATIA; nucleótido 16133 del gen de MATIA; nucleótido 16174 del gen de MATIA; nucleótido 16218 del gen de MATIA y nucleótidol6971 del gen de MATIA. La secuencia de los SNP en estas posiciones son provistas en la tabla D. También provisto en la presente se encuentra un ácido nucleico aislado correspondiente en secuencia a un alelo de un gen de MAT2A, en donde el ácido nucleico comprende un SNP encontrado en un nucleótido seleccionado del grupo que consiste del nucleótido 2871 del gen de MAT2A; . nucleótido 2873 del gen de MAT2A; nucleótido 2939 del gen de MAT2A; nucleótido 3287 del gen de MAT2A; nucleótido 3394 del gen de MAT2A; nucleótido 3466 del gen de MAT2A; nucleótido 3498 del gen de MAT2A; nucleótido 3650 del gen de MAT2A; nucleótido 3704 del gen de MAT2A; nucleótido 4174 del gen de AT2A nucleótido 4449 del gen de AT2A; nucleótido 4476 del gen de MAT2A; nucleótido 4608 del gen de AT2A; nucleótido 4660 del gen de MAT2A; nucleótido 4692 del gen de MAT2A; nucleótido 4931 del. gen de MAT2A; nucleótido 5313 del gen de AT2A; nucleótido 54·60 del gen de MAT2A y nucleótido 5480 del gen de MAT2A. Las secuencias de los SNP en estas disposiciones son provistas en la tabla E. También provisto en la presente se encuentra un ácido nucleico aislado correspondiente en secuencia a un alelo de un gen de GART, en donde el ácido nucleico comprende un SNP ' encontrado en un nucleótido en el gen de GART seleccionado del grupo que consiste de nucleótido 3782 del gen de GART; nucleótido 3842 del gen de GART; nucleótido 7745 del gen de GART; nucleótido 7984 del gen de GART; nucleótido 10775 del gen de GART; nucleótido 11521 del gen de GART; nucleótido 11522 del gen de GART; nucleótido 11541 del gen de GART; nucleótido 12356' del gen de GART; nucleótido 14200 del gen de GART; nucleótido 14273 del gen de GART; nucleótido 14282 del gen de GART; nucleótido 14739 del gen de GART; nucleótido 14781 del gen de GART; nucleótido 18055 del gen de GART; nucleótido 18064 del gen de GART; nucleótido 18130 del gen de GART; nucleótido 18142 del' gen de GART; nucleótido 18197 del gen de GART; nucleótido 18232 del gen de GART; nucleótido 18401 del gen de GART; nucleótido 20812 del gen de GART; nucleótido 20825 del gen de GART; nucleótido 16174 del gen de GART; nucleótido 15706 del gen de GART; nucleótido 20862 del gen de GART; nucleótido 22481 del gen de GART; nucleótido 22521 del gen de GART; nucleótido 25425 del gen de GART; nucleótido 25433 del gen de GART; nucleótido 25601 del gen de GART; nucleótido 25867 del gen de GART; nucleótido 25912 del gen de GART; nucleótido 25951 del gen de GART; nucleótido 25956 del gen de GART; nucleótido 26127 del gen de GART; nucleótido .26195 del gen de GART; nucleótido 31627 del gen de GART; nucleótido 31641 del gen de GART; nucleótido 31887 del gen de GART; nucleótido 31902 del gen de GART; nucleótido 31933 del gen de GART; nucleótido 33173 del gen de GART; nucleótido 33264 del gen de GART; nucleótido 31933 del gen de GART; nucleótido 33173 del gen de GART; nucleótido 33264 del gen de GART; nucleótido 31933 del gen de GART; nucleótido 33173 del gen de GART; nucleótido 33264 del gen de GART; nucleótido 31933 del gen de GART; nucleótido 33173 del gen de GART; nucleótido 33264 del gen de GART; nucleótido 33286 del gen de GART; nucleótido 36963 del gen de GART; nucleótido 36964 del gen de GART; nucleótido 37428 del gen de GART; nucleótido 37433 del gen de GART; nucleótido 38762 del gen de GART; nucleótido 38914 del gen de GART y nucleótido 38989 del gen de GART. La secuencia de los SNP en estas disposiciones son provistas en la tabla F. En una modalidad, la invención provee ácidos nucleicos aislados correspondientes en secuencia a alelos de MTHFR humanos que comprenden una secuencia que codifica una mutación no sinónima en la proteina de MTHFR seleccionada del grupo que consiste de M1101, H213R, D223N, D291N, R519C, R519L y Q648P. En una modalidad, la invención provee ácidos nucleicos correspondientes en secuencia a dos o más alelos de MTHFR humanos que comprenden .una secuencia que codifica una mutación no sinónima en la proteina de MTHFR seleccionada del grupo que consiste de M1101, H213R, D223N, D291N, R519C, R519L y Q648P. El término "aislado" como se usa en la presente incluye polinucleótidos sustancialmente libres de otros ácidos nucleicos, proteínas, lipidos, carbohidratos u otros materiales con los cuales están asociados naturalmente. Las secuencias de polinucleótidos de la invención incluyen secuencias de ADN y ARN'. Los ácidos nucleicos provistos- en la presente pueden ser útiles como son las (por ejemplo, sondas de oligonucleótidos alelo específicas) o cebadores en los métodos de detección revelados . en la presente. El diseño de las sondas o cebadores apropiados para este propósito requiere consideración de una diversidad de factores. Por ejemplo, fragmentos que tienen una longitud de 10, 15 o 18 nucleótidos , a aproximadamente 20 o a aproximadamente 30 . nucleótidos, encontrarán utilidad particular. Secuencias más largas, por ejemplo 40, 50, 80, 90, 100, aun hasta plena longitud son aun más preferidas para ciertas modalidades. Las longitudes de oligonucleótidos de por lo menos aproximadamente 18 a 20 nucleótidos son bien aceptadas por aquellos de habilidad en el arte como suficientes para permitir una hibridización suficientemente especifica para ser útil como una sonda de oligonucleótido alélo especifica. Además, dependiendo de la aplicación contemplada, se deseará emplear condiciones variables de hibridación para obtener grados variables de selectividad de sonda hacia la secuencia objetivo. Para aplicaciones que requieren alta selectividad, comúnmente se desea emplear condiciones relativamente severas para formar los híbridos. Por ejemplo, condiciones de relativamente bajo contenido de sal y/o alta temperatura, tal como provistas por 0.02 M- 0.15M NaCl a temperaturas de aproximadamente 50°C a aproximadamente 70°c. Tales condiciones selectivas pueden tolerar poco, si lo hay, desajuste entre la sonda y la plantilla o fragmentos de polinucleótidos objetivo. También provistos en la presente se encuentran vectores que comprenden ácidos nucleicos de la invención. Estos vectores incluyen vectores de expresión qu proveen la expresión de ácidos nucleicos de la invención en - células •huésped apropiadas. Adicionalmente provistas se encuentran células huésped que comprenden ácidos nucleicos de la invención. También se proveen células huésped que comprenden vectores de la invención. La invención también provee métodos para producir enzimas codificadas por ácidos nucléicos de la invención, tales métodos comprenden cultivar células de la invención. También se proveen enzimas aisladas codificadas por ácidos nucleicos de la invención.
Detección de alelos deteriorados Los métodos revelados en la presente (por ejemplo, método de selección, prevención y/o tratamiento de una condición o enfermedad asociada con alelos deteriorados de genes involucrados en rutas metabólicas) requieren en general detección de la presencia o ausencia de una pluralidad de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en por lo menos un gen que codifica enzima dentro de una ruta metabólica que puede dar como resultado un alelo deteriorado; preferiblemente una dualidad de SNP conocidos en el gen de prueba. Alelos y/o SNP de secuencia predeterminada pueden ser detectados mediante hibridación especifica de alelo, una técnica basada en secuencia-dependiente que permite discriminación entre alelos normales y alelos deteriorados. Un análisis específico de alelo es dependiente de la capacidad diferencial de secuencias de nucleótidos desajustadas (por ejemplo, normal : deteriorado) para hibridizarse entre sí, en comparación con secuencias de ajuste (por ejemplo, normal : normal o deteriorado : deteriorado) . Una variedad de métodos están disponibles para detectar la presencia de uno o más polimórficos de nucleótidos individuales en un individuo. Avances en este campo han provisto la genotipado de SNP a gran escala exacta, fácil y no cara. Más recientemente, por ejemplo, varias técnicas nuevas han sido descritas que incluyen hibridización alelo-especifica dinámica (DASH), electroforesis de gen/de arreglo de microplaca (MADGE) , ¦' pirosecuenciación, ligación oligonucleótido-especifica, el sistema de TaqMan también como varias tecnologías de "chip" de ADN tales como los chips de SNP de Affymetrix. Estos métodos pueden requerir amplificación del gen de prueba, comúnmente mediante PCR. Todavía otros métodos recién desarrollados, basados en la generación de moléculas de señal de pequeñas mediante escisión invasiva seguida por espectrometría de masas o sondas de candado inmovilizadas y amplificación de círculo rodante, podrían inevitablemente eliminar la cantidad por PCR. Varios de los métodos conocidos en el arte para detectar polimorfismos de un solo nucleótido específico son resumidos a continuación. Se comprenderá que el método de la presente invención incluye todos los métodos disponibles. Varios métodos han sido desarrollados para facilitar el análisis de polimorfismos de un solo nucleótido. En una modalidad, el polimorfismo de una sola base puede ser detectado al utilizar · un ¦ nucleótido resistente · a exonucleasa especializado, como se . revela, por ejemplo en Mundy, C. R. (Patente estadounidense No. 4,656,127). De acuerdo con el método, un cebador complementario con la secuencia alélica inmediatamente 3' a los alelos se permite que se hibridice a una molécula objetivo obtenida de un animal o humano particular. Si el alelo sobre la molécula objetivo contiene un nucleótido que es complementario con el derivado de nucleótido resistente a exonucleasa particular presente, entonces aquel derivado será incorporado sobre el extremo del cebador hibridizado. Tal incorporación vuelve al cebador resistente a exonucleasa y mediante esto permite su detección. Puesto que la identidad del derivado resistente a exonucleasa de la muestra es conocida, un hallazgo de que el cebador se ha vuelto resistente a exonucleasa revela que el oligonucleótido presente en el alelo de la molécula objetivo fue complementario a aquel del derivado del nucleótido usado en la reacción. Este método tiene la ventaja de que no requiere la determinación de cantidades grandes de datos de secuencia extraños. En otra modalidad de la invención, se usa un método a base de solución para determinar la identidad del nucleótido de un alelo. Cohén, D. et al. (French Paten-t 2, 650, 840; PCT Appln. No. WO91/02087) . Como en el método de Mundy de la patente estadounidense No. 4,656,127, se emplea un cebador que es complementario a secuencias- alélicas inmediatamente 3' a un sitio polimórfico. El método determina la identidad del nucleótido ¦ de aquel sitio utilizando derivados de diseoxinucleótidos marcados que, si son complementarios con el nucleótido del alelo serán incorporados sobre el término de el cebador. Un método alternativo, conocido como análisis de bit genético o GBA™ es descrito por Goelet, P. et al. (PCT Appln. No. 92/15712) . El método de Goelet, P. et al., utiliza mezclas de terminsdores marcados y un cebador que es complementario a la secúencia 3' á un alelo. El terminador marcado que es incorporado es asi determinado y complementario al nucleótido presente en el alelo del gen de prueba. En contraste con el método de Cohén et al. (patente francesa 2,650,840; PCT Appln. No. WO91/02087) ; el método de Goelet, P. et al., es preferiblemente un análisis de fase heterogénea, en el cual el cebador o la molécula objetivo es inmovilizada a una fase sólida. Recientemente, varios procedimientos de incorporación de nucleótido cebador-guiados para analizar alelos en ADN han sido descritos (Komher, J. S. et al., Nucí. Acids . Res. 17:7779-778.4 (1989); Sokolov, B. P., Nucí. Acids Res. 18:3671 (1990); Syvanen, A. -C, et al., Genomics -8:684-692 (1990); Kuppuswamy, M. N. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S. A.) 88:1143-1147 (1991); Prezant, T. R. et al., Hum. Mutat. 1:159-164 (1992); Ugozzoli, L. et al., GATA 9:107-112 (1992); Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208:171-175 (1993)).' Estos métodos difieren de GBA™ en que dependen de la incorporación de desoxinucleótidos marcados para discriminar entre bases en un alelo. En tal formato, puesto que la señal es proporcional al número de desoxinucleótidos incorporados, los polimorfismos de un solo nucleótido que se presentan en corridas del mismo nucleótido pueden dar como resultado señales que son proporcionales a la longitud de la corrida (Syvanen, A. -C, et al., Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993)). Cualquier tipo de célula o tejido puede ser utilizado para obtener muestras de ácidos nucleicos para uso en los diagnósticos descritos en la presente. En una modalidad preferida, la muestra de ADN es obtenida de un fluido corporal, por ejemplo, sangré obtenida mediante técnicas conocidas (por ejemplo, venipunción) o saliva. Alternativamente, se pueden efectuar pruebas de ácido nucleico sobre muestras . secas (por ejemplo, vello o piel) . Cuando se usa ARN o proteina, las células o tejidos que pueden ser utilizados deben expresar un gen que codifica enzima. Métodos de detección pueden también ser efectuados in situ directamente sobre secciones de tejido (fija y/o ¦congelada) de tejidos de pacientes obtenidos de biopsias o resecciones, de tal manera que no es necesaria ninguna purificación de ácido nucleico. Los reactivos de ácido nucleico pueden ser usados como sondas · y/o cebadores para tales procedimientos in situ (véase, por ejemplo, Nuovo, G. J., 1992, PCR in situ hybridization : protocols and applications , RavenPress, NY) . Además de los métodos que se enfocan principalmente en la detección de una secuencia de ácido nucleico, los perfiles pueden también ser determinados en tales esquemas de detección. Los perfiles de huella pueden ser. generados, por ejemplo, al utilizar un procedimiento de . despliegue diferencial, · análisis de Northern y/o RT-PCR. Un método de detección preferido es hibridización alelo-específica utilizando sondas que se traslapan a una región de por lo menos un alelo de un gen que codifica enzima.
Detección de alelos deteriorados utilizando hibridización alelo especifica Una variedad de métodos bien conocidos en el ' arte pueden ser usados para la detección de alelos deteriorados mediante la hibridización especifica de alelos. Preferiblemente, el alelo de prueba es probado con oligonucleótidos específicos de alelo (ASO) y cada ASO comprende la secuencia de un alelo conocido. El análisis de ASO detecta sustituciones de secuencia específicas en un fragmento de polinucleótido objetivo al probar la habilidad de una sonda de oligonucleótido específica de alelo para hibridizarse al fragmento de polinucleótido objetivo. Preferiblemente, la sonda de oligonucleótido alelo-especí fica contiene la secuencia (o su complemento) de un alelo deteriorado. La presencia de un alelo deteriorado en el fragmento de polinucleótido objetivo es implicada, por hibridización entre la sonda de oligonucleótido alelo-especifica y el fragmento de polinucleótido especifico bajo condiciones en las cuales una sonda de oligonucleótido que contiene la secuencia de un alelo tipo silvestre no se hibridiza al fragmento de polinucleótido objetivo. Una carencia de hibridización entre la sonda de oligonucleótido alelo-especifica que tiene la secuencia del alelo deteriorado y el fragmento de polinucleótido objetivo indica la ausencia del alelo deteriorado en el fragmento objetivo. En una modalidad, el (los) gen (es) puede (n) ser probado (s) en un formato de inmunoabsorción puntual estándar. Cada región dentro del gen de prueba que contiene la secuencia correspondiente al ASO es aplicada individualmente a una superficie sólida, por ejemplo como un punto individual sobre una membrana. Cada región individual puede ser producida, por ejemplo, como un producto de amplificación de PCR separado utilizando métodos bien conocidos en el arte (véase, por ejemplo la modalidad, experimental resumida en Mullís, K. B., 1987, U. S. Pat. No. 4,683,202) . Formatos a base de membrana que pueden ser usados como alternativas al formato de ' inmunoabsorción puntual para efectuar análisis de ASO incluyen pero no están limitados a inmunoabsorción puntual inversa (análisis de amplificación multiplex) y análisis de diagnóstico alelo-especifico de multiplex (MASDA) . En un formato de inmunoabsorción puntual inverso, sondas de oligonucleótido o polinucleótido, por ejemplo que tienen secuencia conocida son inmovilizadas sobre la superficie sólida y son subsecuentemente hibridizadas con la muestra que comprende fragmentos de polinucleótidos de prueba marcados. En esta situación, los cebadores pueden ser marcados o los NTP quizás marcados antes de la amplificación para preparar una muestra que comprende fragmentos de polinucleótidos de prueba marcados. Alternativamente, los fragmentos de polinucleótidos de prueba pueden ser marcados subsecuentes al aislamiento y/o síntesis en un formato multiplex, muestras individuales contienen múltiples secuencias objetivo dentro del gen de prueba, en lugar de solo una sola secuencia objetivo. Por ejemplo, múltiples productos de PCR, cada uno que contiene por lo menos una de las secuencias objetivo de ASO fueron aplicadas dentro del mismo punto de muestra. Múltiples productos de PCR pueden ser producidos simultáneamente en una sola reacción de amplificación utilizando los métodos de Caskey et al., patente estadounidense No. 5,582,989. La misma inmunoabsorción, por consiguiente, puede ser sondeada para cada ASO cuya secuenciá correspondiente es representada en los puntos de muestra. Un formato de MASDA expande el nivel de complejidad del formato multiplex al utilizar múltiples ASO para probar cada inmunoabsorción (que contienen puntos con múltiples secuencias objetivo) . Este procedimiento es descrito en detalle en la patente estadounidense No. 5,589,330 de A. P. Shuber y en Mickalowsky et al., American Journal of H man Genetics, 59(4): A272, poster 1573 (October 1996) , cada una de las cuales es incorporada a la presente por referencia en su totalidad. En primer lugar, se detecta la hibridización entre la sonda de ASO múltiple y muestra inmovilizada. Este método depende de la predicción de que la presencia de una mutación entre las múltiples secuencias objetivo en un' punto dado es suficientemente rara que cualquier señal de hibridización positiva resulta de un solo ASO dentro de la mezcla de sonda que se hibridiza con el alelo deteriorado correspondiente. La hibridización de ASO es luego -identificada al aislarlo del sitio de hibridización y determinar su secuencia de nucleótidos . Materiales apropiados que pueden ser usados en la inmunoabsorción puntual, inmunoabsorción puntual inversa, multiplex y formatos de MASDA son bien conocidos en el arte e incluyen pero no están limitados a membranas de nylon y nitrocelulosa . Cuando las secuencias objetivo son. producidas mediante amplificación de PCR, el material de partida puede ser ADN cromosomal, en cuyo caso el ADN es amplificado directamente. Alternativamente, el material de partida puede ser mARN, en cuyo caso el mARN es primero transcrito inversamente a cADN y luego amplificado de acuerdo con la técnica bien conocida de RT-PCR (véase, por ejemplo patente estadounidense No. 5,561,058 de Gelfand et al.). Los métodos descritos anteriormente son apropiados para selección moderada de un número limitado de variaciones de secuencia (por ejemplo, alelos deteriorados) . Sin embargo, con la necesidad en diagnosis molecular por una selección a gran escala efectiva en el costo rápida, se han desarrollado tecnologías que integran el concepto básico de ASO, pero exceden en mucho la capacidad por detección de mutación y número de muestras. Estos métodos alternativos a los descritos anteriormente incluyen pero no están limitados a técnicas a base de secuencia de arreglo de chip a gran escala. El uso de arreglos a gran escala permite el análisis rápido de muchas variantes de secuencia. Una revisión de las diferencias en la aplicación y desarrollo de arreglos de chips es cubierto por Southern, E. M . , Trends in Genetics, 12: 110-115 (March 1996) and Cheng et al.., Molecular Diagnosis, .1:183-200 (September 1996). Varios procedimientos que involucran la · manufactura de arreglos de chips. Las diferencias incluyen pero no están restringidas a: tipo de soporte sólido para anexar los oligonucleótidos inmovilizados, técnicas de marcación para identificación de variantes y cambios en las técnicas a base de secuencia del polinucleótido objetivo a la sonda. Una metodología promisoria para el análisis, a gran escala sobre "chips.de ADN", es descrita en detalle en Hacia et al., .NatureGenetics, 14:441-447 (1996), que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Como se describe en Hacia et al.,- arreglos de alta densidad de más de 96, 000 oligonucleótidos, cada uno de 20 nucleótidos de longitud, son inmovilizados sobre un solo chip de vidrio o silicio utilizando síntesis química dirigida por luz. Contingente sobre el número y diseño de la sonda de oligonucleótido alelo-específica, potencialmente cada base en una secuencia puede ser interrogada en cuanto a alteraciones. Las sondas de oligonucleótidos alelo-específicas aplicadas al chip, por consiguiente, pueden contener variaciones de secuencia, por ejemplo SNP, que todavía no se sabe que se presenten en la población o pueden ser limitados a SNP que son conocidos que se presentan en la población. Antes de la hibridización con sondas de oligonucleótidos alelo-específicas sobre el chip, la muestra de prueba es aislada, . amplificada y marcada (por ejemplo, marcadores fluorescentes) por medios bien conocidos para aquellos experimentados en el arte. La muestra de polinucleótidos de prueba es luego hibridizada a las sondas de oligonucleótidos alelo-específicas inmovili-zadas . La intensidad de técnicas a base de secuencia del fragmento de polinucleótidos objetivo a la sonda de oligonucleótidos alelo-específicas inmovilizadas es cuantificada y comparada con una secuencia de referencia. La información genética resultante puede ser usada en diagnosis molecular. Una utilidad común pero no limitante del "chip de ADN" en diagnosis molecular es selección en cuanto a SNP conocidos. Sin embargo esto puede imponer una limitación a la técnica al solamente mirar en mutaciones que han sido descritas en el campo. La presente invención permite que análisis de hibridización alelo-específicos sean efectuados con un número bastante mayor de mutaciones que los previamente disponibles. Así, la eficiencia y extensión de análisis de ASO a gran escala será ampliada, reduciendo la análisis secuencia de extremo a. extremo molesta, no solamente con mutaciones conocidas, sino de manera extensa a todas las mutaciones que podrían ocurrir, tal como se predice por los principios aceptados y el costo y tiempo asociados con estas pruebas molestas serán disminuidos. Así, en un aspecto, la invención provee métodos para detectar alelos deteriorados de genes que codifican enzimas o ácidos nucleicos que codifican enzimas. Por ejemplo, se proporcionan en la presente métodos para detectar alelos de MTHFR, ATIC, CBS, CTH, GART, MAT1A, MAT2A y THFS. En una modalidad, la detección de un SNP en un ácido nucleico que codifica enzima' involucra secuenciación de ácido nucleico. En una modalidad, la detección de una mutación en un ácido nucleico que codifica enzima involucra PCR. En una modalidad, la detección de una mutación en un ácido nucleico que codifica enzima involucra análisis' de RFLP. En una modalidad, la detección de una mutación en un ácido nucleico que codifica enzima involucra hibridización de ácido nucleico. La detección de amutación de SNP por medio de hibridización se puede hacer,', por ejemplo, utilizando un arreglo de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que se hibridizará bajo condiciones severas a un ácido nucleico que codifica enzima o un fragmento del mismo, que comprende tal SNP. En una modalidad, los métodos comprenden el uso de un análisis in vivo para determinar la actividad de un alelo de un gen que codifica enzima como se describe en la presente. ¦ Combinaciones de métodos pueden también ser usadas para detectar y caracterizar un alelo deteriorado de un gen que codifica enzima. En una modalidad, los métodos comprenden el uso de un análisis in vivo para determinar la actividad de un gen que codifica enzima, como se describe en la presente y detección de un SNP en un ácido nucleico que codifica, enzima. En una modalidad, los métodos comprenden el uso de un análisis in vivo para determinar la actividad enzimática, como se describe en la presente y un análisis de sensibilidad a la temperatura para determinar la estabilidad de la enzima a una temperatura elevada. En una modalidad, los métodos comprenden el uso de un análisis in vivo para determinar la actividad enzimática, como se describe en la presente y un análisis in vitro para determinar la actividad especifica de la enzima. En una modalidad preferida, un alelo deteriorado de MTHFR comprende una sustitución no sinónima que codifica por una mutación en la proteina de MTHFR seleccionado del grupo que consiste de M1101, H213R, D223N, D291N, R519C, R519L y Q648P. En una modalidad especialmente p'referida, un alelo deteriorado que comprende una sustitución no sinónima que codifica por una mutación en la proteina de MTHFR seleccionada del grupo que consiste de M1101, H213R, D223N y D291N.
Cepas de levadura En un aspecto, la invención provee cepas de levadura aptas de detectar alelos deteriorados de enzimas involucradas en el metabolismo de foliato/homocisteina . Tales cepas de levadura son útiles en los métodos revelados en la presente. Las cepas de levadura comprenden una primera mutación que permite la complementación por una encima funcionalmente homologa de interés y una · segunda mutación (o grupo de mutaciones) que vuelven a la cepa dependiente después de la complementación con un co-factor por un fenotipo analizable relacionado con la función del primer gen. En una modalidad, la invención provee cepas de levadura aptas de detectar alelos deteriorados de CTH y determinar la sensibilidad de los mismos a vitamina ??. En una modalidad preferida, la cepa de levadura comprende una mutación en cys3 y un sextuplete-cancelacion snolA, sno2A, sno3A, snzlA, snz2A, snz3A. En una modalidad la invención provee cepas de levadura aptas de detectar alelos deteriorados de CBS y determinar la sensibilidad de los mismos a vitamina ??. En una modalidad preferida, la cepa de levadura comprende una mutación en cys4 y en sextuplete-cancelacion snolA, sno2A, sno3A, snzlA, snz2A, snz3A. En una modalidad, la invención .provee cepas de levadura aptas de detectar alelos deteriorados de MTHFR y determinar la sensibilidad de los mismos a foliato. En una modalidad preferida, la cepa de levadura comprende una mutación en metl3 y fol3.
Selección por riesgo de enfermedad En un aspecto, la invención provee métodos de selección por riesgo de una condición de enfermedad anunciada con metabolismo de foliato/homocisteína aberrante. Los métodos involucran selección por un alelo deteriorado de" un gen involucrado en el metabolismo de foliato/homocisteina, · como se describe en la presente. En una modalidad, la invención provee métodos de selección por un riesgo de una enfermedad o condición asociada con una disfunción de enzima, en donde la enzima es seleccionada del grupo que consiste de MTHFR, ATIC, THFS, MAT1A, MAT2A y GART . En una modalidad preferida, la enfermedad o condición es seleccionada del grupo que consiste de enfermedad cardiovascular, enfermedad de arteria coronaria, accidente isquémico, arterosclerosis , defecto del tubo neural, escisiones orofaciales, pre-eclamsia, parto a corto plazo/nacimiento de bajo peso, aborto espontáneo . prematuro recurrente, trombosis, oclusión de arteria retinal, síndrome de Down, cáncer colorectal, cáncer de pecho, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, depresión, esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer/demencia, degeneración ocular relacionada con la edad y glaucoma. Los métodos comprenden el uso de un método para detectar un alelo deficiente dado seleccionado del grupo que consiste de un alelo deteriorado de MTHFR, un alelo deteriorado de ATIC, un alelo deteriorado de MTHFS, un alelo deteriorado de MTA1A, un alelo deteriorado de MTA2A y un alelo deteriorado de GART, como se describe en la presente. En una modalidad, la invención provee métodos de selección por un riesgo de una enfermedad o condición asociada con disfunción de CBS. En una modalidad preferida, la enfermedad o condición es seleccionada del grupo que consiste de enfermedad cardiovascular, enfermedad de arteria coronaria, accidente isquémico, arterosclerosis, defecto del tubo neural, escisiones orofaciales, pre-eclamsia, parto a corto plazo/nacimiento de bajo peso, aborto espontáneo prematuro recurrente, trombosis, oclusión de arteria retinal, síndrome de Down, cáncer colorectal, - cáncer de pecho, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, depresión, esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer/demencia, degeneración ocular relacionada con la edad y glaucoma. Los métodos comprenden el uso de un método para detectar un alelo- de CBS deteriorado, como se describe en la presente. En una modalidad, la invención provee métodos de selección por un riesgo de una enfermedad o condición asociada con .disfunción de CTH . En una modalidad preferida, la enfermedad o condición es seleccionada del grupo que consiste de enfermedad cardiovascular, enfermedad de arteria coronaria, accidente isquémico, arterosclerosis, defecto del tubo neural, escisiones orofaciales, pre-eclamsia, parto a corto plazo/nacimiento de bajo peso, aborto espontáneo prematuro recurrente, trombosis, oclusión de arteria retinal, síndrome de Down, cáncer colorectal, cáncer de pecho, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, depresión, esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer/demencia, degeneración ocular relacionada con la edad y glaucoma. Los métodos comprenden el 'uso de un método para detectar un alelo de CTH deteriorado, como se describe en la presente.
Selección en cuanto a potencial de respuesta qu m oterapéutica En un aspecto la invención provee métodos para determinar el' potencial de respuesta quimioterapéutica de un individuo. Los métodos comprenden el uso de un método para detectar un alelo deteriorado de un gen involucrado en el metabolismo de foliato/homocisteina, como se describe en la presente. En una modalidad preferida, el gen es seleccionado del grupo que consiste de MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A y GART . La detección -de un alelo deteriorado en un individuo indica un potencial de respuesta disminuido. En una modalidad preferida, el quimioterapéutico es metotrexato o 5-fluorouracilo .
Selección en cuanto a toxicidad quimioterapéutica En un aspecto, la invención provee métodos para determinar la toxicidad quimioterapéutica para un individuo. Los métodos comprenden el uso de un método para detectar un alelo deteriorado de un gen involucrado en el metabolismo de foliato/homocisteina, como se describe en la presente. En una modalidad preferida, el gen es seleccionado del grupo que consiste de MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A y GART. La detección de un alelo deteriorado en un individuo indica un potencial de toxicidad incrementado. En una modalidad preferida, el quimioterapéutico es metotrexato o 5-fluorouracilo .
Profilaxis y tratamiento En un aspecto, la invención provee métodos para impedir una condición o enfermedad asociada con deficiencia de enzima metabólica. Los métodos comprenden incrementar la ingestión de un individuo de un co-factor basado en información obtenida de los análisis y métodos anteriores, que forman en cuanto a la presencia de alelos deteriorados co-factor-sensibles. En una modalidad preferida, los métodos comprenden detectar un alelo „ deteriorado co-factor-remediable de un gen metabólico, como se describe en la presente. En una modalidad, la intención provee métodos para prevenir la colisión o enfermedad asociada con el metabolismo de foliato/homocisteina aberrante. Los métodos comprenden incrementar la ingestión de un individuo de foliato/vitamina Be. En una modalidad preferida, los métodos comprenden detectar un alelo deteriorado de un gen involucrado en el metabolismo de foliato/homocisteina, como se describe en la presente. En una modalidad, la invención provee un método para impedir una condición o enfermedad asociada con disfunción enzimática en un individuo que tiene un alelo deteriorado de un gen de codificación de enzima que es co-factor remediable, en donde el gen de codificación de enzima es seleccionado del grupo que consiste de MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A y GART . El método comprende incrementar la ingestión del individuo de foliato.
En una modalidad, la invención provee un método para impedir una condición o enfermedad asociada con disfunción de CBS en un individuo que tiene un alelo de CBS deteriorado. El método comprende incrementar la ingestión del individuo de vitamina En una modalidad, la invención provee un método para impedir una condición o enfermedad asociada con disfunción de CTH en un individuo que tiene un alelo de CTH deteriorado. El método comprende incrementar la ingestión del individuo de vitamina B6.' En un aspecto, la invención provee métodos de tratamiento de una condición o enfermedad asociada con metabolismo de foliato/homocisteína aberrante. Los métodos comprenden incrementar la . ingestión del individuo de foliato y/o vitamina Be. En una modalidad preferida, los métodos comprenden detectar un alelo deteriorado de un gen involucrado en el metabolismo de foliato/homocisteína, como se describe en la presente. En una modalidad, la invención provee un método para el tratamiento de una condición o enfermedad asociada con disfunción enzimática en ¦ un individuo que tiene un alelo deteriorado de un gen que codifica enzima que es co-factor remediable, en donde el gen que codifica enzima es seleccionado del grupo que consiste de MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A y GART y remediable mediante co-factor. El método comprende incrementar la ingestión del individuo de foliato. En una modalidad, la invención provee un método para el tratamiento de una condición o enfermedad asociada con disfunción de CBS en un individuo que tiene un alelo de CBS deteriorado. El método comprende incrementar la ingestión del individuo de Vitamina En una modalidad, la invención provee un método para el tratamiento de una condición o enfermedad asociada con disfünción de CTH en un individuo que tiene un alelo de CTH deteriorado. El método comprende incrementar la ingestión del individuo de Vitamina EJEMPLOS EJEMPLO 1: FRECUENCIA DE VARIANTES DE ENZIMA DE MTHFR DE REMEDIACION DE FOLIATO EN HUMANOS La frecuencia de ' variantes de enzima de MTHFR foliato/remediables de una gran población para determinar la incidencia e impacto de variación de baja frecuencia y- explorar el fenómeno de remediación de vitamina. De más de 500 individuos, 14 diferentes sustituciones no sinónimas fueron identificadas, 5 de las cuales deterioraron la función enzimática. En tanto que todos los a'lelos per udiciales fueron por lo menos un tanto sensibles a foliato, 4 de las 5 proteínas mutantes podrían ser plenamente restauradas a niveles normales al elevar los niveles de foliato intracelulares .
Ejemplo 1.1: Métodos Población de muestra de ADN. Las muestras de ADN fueron del Depósito Celular del instituto Coriell (Camden, New Jersey, USA) . Secuenciación de Exon de MTHFR. 11 exones de codificación de MTHFR fueron secuenciados en las muestras anteriores mediante secuenciación de PCR utilizando pares de cebadores disponibles comercialmente de la linea de producto Variant SeqR (Applied Biosystems, Foster City, CA) y de acuerdo con los protocolos suministrados. Las · regiones de exon secuenciadas correspondieron a las secuencias de referencia de MTHFR de NCBI para mARN (NM_005957) y la proteina correspondiente (NM_005958) de 656 aminoácidos. La información de secuenciación de amplicón y sonda está disponible http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/probe en para los siguientes amplicones objetivo: Exon 1 . (RSA000045684) ; Exon 2 (RSA000045680) ; Exon 3 (RSA000577249) ; Exon 4 (RSA000045678) ; Exon 5 (RSA000045676) ; Exon 6 (RSA001308795) ; Exon 7 (RSA001253193) ; Exon 8 (RSA000045669) ; Exon 9 (RSA000580767 ) ; Exon 10 ( RSA000580766 ) ; Exon 11 (RSA000580765, RSA000027240) . Solamente la porción de Exon 11 que abarcó la región de codificación fue secuenciada. Para asegurar alta confianza en el llamado de base, solamentelecturas de alta calidad fueron usadas para el análisis (promedio QV puntuaciones>40 para la región que abarcaba el exon objetivo; todos los exones fueron cubiertos por lecturas de doble hebra) . En base a estos criterios- de filtración, las proporciones de éxito fluctuaron de 89.9% a 95% para cada exon (Véase Tabla I) . Toda la información de secuencia fue analizada utilizando el conjunto de elementos de programación SeqScape (Applied Biosystems). Como medida de control de calidad, un subconjunto de llamadas de base fueron verificadas directamente mediante análisis de discriminación alélica de (Applied Biosystems) y comparadas con datos de genotipo disponibles públicamente como se describe posteriormente en la presente. Plásmldos. El plásmido phMTHFR, que porta el cuadro de lectura abierta de MTHFR humano epitopo-marcado de HA (Hemaglutinina A) del extremo 5' (secuencia de proteina de referencia NP_005948) bajo el control del promotor de GALl de levadura inducible y el marcador seleccionable URA3, fue una donación generosa de Warren Kruger (Shan et al., 1999, supra) . Este plásmido sirvió como la cadena fundamental para reconstruir todas las variantes de MTHFR mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando el kit de QuickChange (estratagene) .Variantes de MTHFR galactosa-inducibles que contienen' plásmidos integrantes fueron creadas .mediante clonación de PCR del fragmento que contiene URA3, el promotor de GALl y región de codificación de MTHFR del plásmido a base de phMTHFR a pHO-poly-HO (Voth et al., 2001, Nucleic Acids .Res. 29:e59), lo que permite la integración apuntada de este cassette en el sitio HO. Cepas. Todas las cepas de levadura aploides fueron MATa his3 leu2 ura3 lys2 en el fondo de S288c (Brachman et al., 1998, Yest 14:115-32). Las cepas diploides MATa/MAToí fueron creadas al acoplar cepas MATa y MATa isogénicas. Las cepas fol3A::KanMX y fol3A::KanMX metl'3A : : KanMx fueron obtenidas mediante técnicas de . apareamiento/espurulación estándar utilizando cepas de la colección de gen bloqueado de S. cerevisiae (Invitrogen) . Los diploides (homocigos o heterócigos para las variantes de MTHFR) fueron creados "al aparear aploides de fol3A::KanMX metl3A : : KanMx que cada uno contienen' una variación integrada del cassette de variantes en GAL1:MTHFR. Condiciones de cultivo. El medio de cultivo científico que carece de foliato fue el medio mínimo (Sherman, 2002, Genetics & Molecular Biol . , eds . Guthrie and Fink (Academic New York), pp. 3-41) con base de nitrógeno de levadura sin vitaminas (Qbiogene)y todas las vitaminas excepto foliato vueltos a agregar individualmente . Todas las células fol3A::KanMX fueron complementadas con 50 ug/ml de ácido folínico (Sigma) . Para mediciones de cultivo cinético, las células de fol3A::KanMX metl3A : : KanMx fueron transformadas con variantes de MTHFR impulsadas por promotor de GALl y cultivadas a fase logarítmica en un medio de galactosa sintética (2% de galactosa, 0.1% de glucosa) complementado con ácido folínico (50 µ?/p??) y metionina (20 g'/ml) . Las células fueron lavadas 3 veces y sometidas a alícuotas a placas de 96 cavidades que contienen medio de galactosa nuevo con cantidades variables de ácido folínico, pero carecían de metionina. El volumen por cavidad fue de 200 µ? con una densidad celular repartida de OD595=0.01. La 'absorbancia fue rastreada cada 15-30 minutos por al menos .60 horas en un lector de placas GENIos Tecan a 30°C sin agitación. Las células de MET13 usadas en la Figura a fueron tratadas de la misma manera excepto que todo el cultivo se hizo en ausencia de metionina. Análisis de activad enzimatica de MTHFR. El análisis, que mide la reacción inversa de aquella catalizada por MTHFR bajo condiciones fisiológicas, fue como se describe (Shan et al., 1999, supra) con las siguientes modificaciones: Se crearon extractos ' de levadura mediante lisis de perla de 40 equivalentes de células de OD595 (células fol3 metl3 complementadas con ácido folínico y metionina como se describe anteriormente) en 350 50 µ? de solución reguladora de pH de lisis (sacarosa 100 mM, KHP04 50 mM (pH 6.3), cocktail inhibidor de proteasa) . Los extractos fueron clarificados mediante una breve microcentrifugación y 10-200 µg de extracto usados para determinar el intervalo lineal de actividad. El sustrato radiomarcado (5- [14C] MeTHF) fue de GE Healthcare Life Sciences. Para el tratamiento térmico, las mezclas de reacción sin (5- [14C] MeTHF) fueron calentadas a 55°C por los tiempos indicados, punto en el cual el (5- [14C] MeTHF) fue vuelto a agregar y la reacción procedió. Análisis de inmunoabsorción ' de MTHFR. 10 equivalentes de célula de OD595 (células fol3Ametl3A complementadas con ácido ' folinico y metionina como . describe anteriormente) fueron extraídos en 200 µ? de NaOH 0.1 M durante 15 minutos. Se agregaron 50 de solución reguladora de pH muestra SDS (0.5M Tris 6.8, SDS al 0.4%) se agregó a los sobrenadantes, que fueron luego sometidos a ebullición, clarificados y sometidos a SDS-PAGE. Las variantes de MTHFR HA-marcadas fueron detectadas sobre un dispositivo de formación de imagen infrarrojo LI-COR. El anticuerpo anti-HA monoclonal de ratón fue de SIGMA. La 3- ' fosfoglicerato quinasa de levadura (Pgklp) , un control de carga, fue detectada por anticuerpos de ratón donados generosamente por Jeremy Thorner ' (Universidad de Califonia, Berkeley, CA) .
EJEMPLO 1.2: RESULTADOS Variantes de MTHFR en humanos. Toda la región de codificación de MTHFR humano fue secuenciada mediante amplificación de la porción de codificación en cada uno de 11 exones de 564 individuos de diversa etnicidad. Las longitudes de las regiones de codificación, el número de alelos interrogados y todas las sustituciones no sinónimas son enlistadas en la Tabla 3. En todos, 2,081,116 pares de base de ADN de codificación y muestreados cada exon a una profundidad de más de 1000 alelos fueron analizados. Estos datos revelaron 14 cambios no sinónimos, 11 de los cuales mostraron una frecuencia de alelo menor (MAF)<1%, con 7 alelos vistos solo una vez. Algunos alelos de baja frecuencia fueron vistos previamente (Véase Tabla 3) . El número de subdivisiones no sinónimas dé baja frecuencia estuvo' en buen acuerdo con otros-estudios que muestrearon más profundamente a poblaciones aleatorias (Martin et al., 2006, Pharmacogenet Genomics 16:256-77; Livingston, 2004, Genome Res 14:1821-31; Glatt et al., 2001, Nat . Genet. 27:435-38). Además, 3 sustituciones comunes bien estudiadas fueron observadas que mostraron las frecuencias de población global esperadas (A222V-29.3%, E429A-23.6%, R594Q-4.4%). Como verificación de control de calidad en cuanto a la exactitud del llamado de base, 8 variantes (que incluyen 4 singletones) fueron reanalizadas mediante análisis de discriminación alélica de TaqMan en 100 muestras que fueron amplificadas por PCR independiente y dieron 100% de concordancia de los datos. Además, los datos de genotipado de población del proyecto de Genoma Mediamental (http : //www. niehs . nih . gov/envgenom/ ) y Perlegen (Mountain View, CA) , que ambos usaron muestra de Coriell que superponen algo en ese estudio (dbSNP construcción 127) estuvieron en concordancia en 814 y 817 llamadas de genotipo (99.6%). Para 2 de los 3 sitios discordantes, los datos de secuencia fueron no ambiguos y aparecieron correctos. Secuencias de región de codificación completas fueron obtenidas para 480 individuos. 18 (4%) fueron portadores de una variante no sinónima de baja frecuencia. Significativamente, la combinación de los 3 polimorfismos comunes (A222V, E429A, R594Q) con el intervalo de cambio de baja frecuencia condujo a mucha heterogeneidad individual. 28 diferentes genotipos no sinónimos fueron observados en este grupo cuyo haplotipo, en la mayoría de los casos, no podría ser detectado de los datos. Interacción de MTHF -foliato in vivo. Debido a que el significado clínico de variantes genéticas radica en su consecuencia funcional, todos los cambios no sinónimos fueron probados en cuanto a su efecto sobre la función de MTHFR e importantemente, si los alelos deteriorados mostraron o no 'sensibilidad a foliato. La auxotrofía de foliato (fol3) fue introducida a una cepa de metl3, permitiendo la titulación de concentraciones de foliato intracelular para hacer variar el ácido folínico en el medio de cultivo. El ácido folínico (5- formil-tetrahidrofoliato) puede ser metabolizado en levadura a metenil-tetrahidrofoliato, que a su vez puede ser convertido a otras co-enzimas de foliato (Cherest et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:14056-63). De esta manera, la funcionalidad de MTHFR humano (crecimiento en ausencia de metionina) fue medida como función del estatus de foliato celular incrementadamente limitante . Bajo estas condiciones, la comunicación de ácido folinico por encima de 50^g/mL no confirió ninguna ventaja de crecimiento significativa (Figura la) . Sin embargo, a concentraciones menores de 50 g/mL, el crecimiento se correlacionó claramente con el ácido folinico disponible en el medio. Asi, los niveles de foliato intracelulares fueron limitantes de la velocidad en .este intervalo. Cuando se compara con el crecimiento de células de F0L3, la complementación con ácido folinico no compensó completamente la carencia ' de biosintesis de foliato endógeno. Sin embargo, este espacio fue reflejado en su mayoría en la densidad a la cual las células entraron a la fase estacionaria en lugar de la velocidad de crecimiento, quizás reflejando limitaciones en ' la solución de ácido folinico o en la utilización de ácido folinico como la única fuente de foliato. La habilidad de MTHFR humano para complementar las células fol3 met3 fue función de la complementación de ácido folinico en el medio (Figura Ib) . En cuanto a la complementación de foliato, la expresión de MTHFR humano del8 promotor de GAL1 no compensó completamente la prueba de Metl3b (compárese Figura b con células de fol3 METI3 a dosis de foliato equivalentes en la Figura a) . Así, por debajo de 50 g/ml de ácido folinico, tanto el foliato como MTHFR füeron limitantes de la velocidad para el crecimiento, permitiendo que aún cambios sutiles en la actividad de MTHFR sean reflejados en la lectura de crecimiento. Nótese que la complementacion de ácido folinico por encima de 50 g/ml no confirió una ventaja de crecimiento significativo a las células que expresan ya sea el MTHFR de levadura endógena (METI3 ; Figura la) o el alelo humano mayor (Figura Ib), pero fue benéfico para los alelos deteriorados de METHFR (Véase a continuación) . Impacto funcional de variantes de MTHFR. 5 alelos no sinónimos probados en un intervalo de concentraciones de foliato ilustran el intervalo de efectos funcionales observados (Figura 2a) . Hubo una restauración casi completa de función de la variante de A222V a 100 g/ml de ácido folinico y significativamente menos actividad (en relación con el arreglo mayor) a un nivel 4 veces más bajo de complementacion (25 µg/ml) . Asi, bajo estas condiciones, la remediabilidad de foliato conocida del defecto de A222V fue recapitulada. Las concentraciones intracelulares exactas de foliatos reducidos en levadura bajo esas condiciones fueron desconocidas. No obstante, el comportamiento del alelo de A222V calibró efectivamente las concentraciones intracelulares en levadura y células humanas'. La enzima de A222V tiene aproximadamente 50% la actividad intrínseca el alelo común (Martin, 2006, Pharmacogenet . Genomics 16:265-77; Rozen, 1997, Thromb. Haemost. 78:523-26) y 50% , de reducción en velocidad de crecimiento fue observada a 50 g/ml de complementacion de foliato. Además, se observó la misma caída del 50% en la actividad enzimática de A222V en análisis libres de células de células cultivadas a 50 g/ml de ácido folinico (Figura 3, a continuación) . Así, el comportamiento de A222V en levadura recapituló su comportamiento en células humanas. Cuatro alelos de baja frecuencia fueron probados de la misma manera (Figura 2a) . R519C pareció benigno puesto que el cultivo no fue aceptado a todas las concentraciones de foliato. R134C fue · severamente deteriorado a todas las concentraciones de foliato, aunque la actividad fue un tanto sensible a foliato. Los alelos D223N y M110I mostraron actividad de remediación de foliato similar a A222V (aunque menos severamente deteriorado) en que el crecimiento fue similar al alelo mayor" a una concentración o mayor de 50 g/ml de ácido folinico, pero funcionó deficientemente por debajo de 50 µg/ml de ácido folinico. La enzima de MTHFR tiene un dominio catalítico N-terminal y un dominio regulatorio C-terminal que se enlaza al inhibidor aloesférico S-adenosilmetionina (AdoMet; Sumner et al., 1986, J. Biol. Chem. 261 ; 7697-7700 ) . De los 6 alelos que cayeron dentro del dominio catalítico (M110I, A222V, D223N y D291N) solamente H213R fue benigno (Figura 2b) . M110I, R134C, H213R, A222V, D223N y D291N mostraron comportamiento de remediación de foliato en que estas variantes de enzima fueron similares al alelo mayor a concentraciones más alta de complementación de foliato (50 µ?/p?? de ácido folinico) , pero fueron considerablemente debilitados a medida que el foliato se volvió más limitante de la velocidad. La variante de R134C nunca se aproximó a la capacidad del alelo mayor para apoyar el cultivo a cualquier nivel de complementación de foliato y asi fue clasificado como sensible pero no un alelo de remediación. Todas las subdivisiones dentro del dominio regulatorio (de G422R a T653M) se comportaron similarmente al alelo mayor (2b) . Interacciones sinergiticas entre sustituciones de aminoácidos. La distribución de variantes implicó la existencia de alelos compuestos que contienen dos (o más) sustituciones. Por consiguiente, varios alelos compuestos (basados en su presencia en muestras individuales) fueron creados para probar si las combinaciones de alelos conducían a efectos sinergíticos o supresores. Para combinaciones de A222V con variantes comunes (A222V E429A y A222V R594Q) , se observaron homocigotos de alelos menores para por lo menos uno de los alelos y por consiguiente se asegura de que tales variantes existen. Sin embargo, para las variantes de baja frecuencia, tanto la variante de A222V como las nuevas variantes siempre ocurrieron como heterocigotos . Puesto que el haplotipo es desconocido, estos individuos podrían albergar ya sea los dos alelos de una sola subdivisión o un alelo compuesto. Por consiguiente, todos los alelos de doble sustitución posibles fueron creados y probados en cuanto a su función (por ejemplo, M110I, A222V, Figura 2a) . A las dos concentraciones de ácido folinico probadas, la variante de M110I A222V funcionó más eficientemente que la suma de los alelos individuales, indicando defectos sinegisticos en alelos compuestos. A 50 µg/ml de ácido folinico, la variante de M110I fue casi indistinguible del alelo mayor, todavía mejoró significativamente el defecto de A222V. Para todas las combinaciones probadas, los alelos que afectaron la función individualmente (M110I y D291N) tuvieron un efecto sinegístico cuando fueron combinados con A222V, mientras que los cambios benignos no mejoraron el. efecto de A222V. Función in vivo recapitulada de análisis bioquímicos . Para evaluar la conflabilidad del análisis de cultivo, se efectuaron análisis de enzima de MTHFR libres de células para todas las variantes en lisados de levadura crudos (Véase materiales y métodos) . Además de medir la actividad específica, las variantes fueron probadas en cuanto a termolabilidad (una medida de estabilidad de la enzima) mediante tratamiento térmico a 55°C por varios tiempos. Hubo una buena correlación entre actividad intrínseca y velocidad de crecimiento (Figura 3; componénse las actividades 'de las muestras no tratadas térmicamente para el alelo de MTHFR mayor, A222V y R134C con las curvas de crecimiento en la Figura 2) . Otra vez, la variante de A222V mostró aproximadamente 50% de la actividad enzimática del alelo mayor, como se reporta previamente (20, 25, 34). Como en el análisis de cultivo, la variante de R519C exhibió actividad similar al alelo mayor y fue representativa de todos los cambios en el domino regulatorio incluyendo la variante de E429A común (datos no mostrados) . Aunque ha habido reportes que E429A afecta la función enzimática (27), nuestros datos están de acuerdo con otros (10, 20, 25) de que este cambio fue benigno. La enzima mutante A222V es menos estable y más termolábil que la forma mayor (Guenter et al., 1999, Nat . Struct. Biol. 6:359-65; Yamada et al., 2001, Proc. Nati. Acad. Sci. 98:14853-58) y la remediación de foliato de esta variante que piensa que ocurre al promover la estabilización de la proteina. Bajo las condiciones usadas en la presente (55°C, 20 m) A222V perdió casi toda la actividad en tanto que el alelo mayor retuvo aproximadamente el 30% de su actividad original, en acuerdo con estudios previos (20) . El nuevo alelo de D223N también mostró termolabilidad incrementada que puede explicar similarmente la remediabilidad de foliato en este caso, aunque el efecto de enzima no fue tan grande. Fenotipos de heterocigoto . Puesto que los alelos de aja frecuencia se presentan usualmente como heterocigotos, su significado tiende a ser disminuido. Para entender mejor el significado funcional de la heterocigocidad de los alelos de MTHFR, levadura diploide con dos copias de MTHFR humano fueron creadas al aparear cepas haploides que cada una tienen ya sea el mismo alelo expresado de un cassette de expresión integrado (homocigoto) o diferentes ' alelos para crear heterocigotos (véanse métodos) . Como antes, estas cepas fueron probadas en cuanto a crecimiento como función de complementación de foliato (Figura 4). Los heterocigotos mostraron un fenotipo de crecimiento en este análisis que fue exacerbado bajo condiciones de foliato limitante, indicando que los alelos de función reducida fueron co-dominantes con el tipo silvestre. La actividad de MTHFR celular tal como es medida en el análisis de' cultivo pareció .reflejar efectos aditivos de alelos. Además, experimentos adicionales con hemicigotos (diploides con un solo alelo expresado integrado; datos no mostrados) demostraron que la formación de heterodimeros entre alelos mayores y menores en heterocigotos ofrecen poco o ningún rescate de alelos mutantes. Por ejemplo, el alelo mayor, de MTHFR diploide/células nulas (hemicigoto) se · comportaron similarmente a los heterocigotos de alelo mayor/Rl34C bajo todas las condiciones y similarmente a los heterocigotos de alelo mayor/A222V en los medios de bajo contenido de foliato (en donde A222V es desactivado) . Asi, la contribución fenotipica de alelos perjudiciales en células heterocigotas fue fácilmente observado, haciendo surgir la posibilidad de consecuencias fenotipicas más extendidas de heterocigocidad en el genoma humano. ' Modificación de variantes de MTHFR en levadura mediante fosforilación. La. abundancia de proteínas variantes de MTHFR fue determinada mediante inmunoabsorción utilizando anticuerpos dirigidos contra la etiqueta de epítopo de hemaglutinina A (HA) N-terminal (Figura 5a) . En todas las muestras, la proteína corrió como un doblete de aproximadamente-72kD y 78 kD. Este patrón se asemejaba estrechamente a aquel observado para MTHFR humano expresado en células de insectos (37), en donde la banda superior representa MTHFR múltiplemente-fosforilado cerca del término N. La fosforilación de MTHFR en células de insectos es dependiente de un residuo de treonina en función 34 y sustitución de ésta treonina a alanina (T34A) da como resultado- una enzima que es incapaz de ser fosforilada (37). Esta mutación tuvo el mismo efecto sobre MTHFR humana expresada en S. cerevisiae e indicó, como en las células de insectos, la banda superior fue MTHFR fosforilado (Figura 5a) . Se sugiere que el papel de fosforilación de MTHFR está involucrada en regulación negativa (37). En apoyo de ésta hipótesis, el patrón de .fosforilación observado en la presente se correlacionó directamente con la actividad de MTHFR celular. Específicamente, la proporción de la abundancia de las formas sin fosforilar: fosforiladas se incrementó con la actividad disminuida (Figura 5b) . Interesantemente, la abundancia global de todas las variantes (formas fosforiladas más formas sin fosforilar) no pareció ser sorprendentemente diferente. Esto no se podría esperar sin las subdivisiones pe judiciales afectaran la estabilidad de enzima intrínseca, a no ser que otros factores estén involucrados en determinados niveles de proteína. Todos los alelos funcionalmente deteriorados agrupados en la mitad catalítica N-terminal de MTHFR (36) que contiene los sitios de enlace de foliato de FAD. Por otra parte, otras sustituciones no sinónimas en el dominio regulatorio C-terminal de MTHFR fueron identificadas y todos los 8 parecieron benignos tanto en la complementación como los análisis de enzimas libres de células. Además, no se observó ninguna sinergia entre sustituciones de dominio regulatorio y A222V en alelos compuestos (Figura 2). Ya sea una u otra de estas alteraciones fueron neutrales, como se ha reportado para E429A (10, 20, 25) o el análisis fue insensible a su defecto. Sin embargo, este hallazgo fue consistente con la observación de que la mayoría de las. mutaciones en MTHFR que resultan en fenotipos clínicos severos ocurren en el dominio catalítico (http : //www. hgmd. cf . ac . uk/ac/índex. php) . El dominio regulatorio ha sido propuesto para jugar un papel en la estabilización del dominio catalítico (20) . Si es así, este papel puede ser un tanto tolerante a sustituciones de aminoácidos y puede explicar cómo un MTHFR quimérico compuesto del dominio N-terminal de S. cerevisiae fusionado al dominio C-terminal de Arabidopsis (equivalente a aproximadamente 50 subdivisiones no sinónimas de la enzima de levadura en el dominio regulatorio) no daña la actividad enzimática (38). Se debe notar que Martin et al (25) reportaron que la variante de R594Q común en el dominio C-terminal afectó la actividad enzimática cuando es expresada en células COS-1. Este cambio pareció benigno, sin embargo el análisis a base de células y análisis libre de células de la enzima expresada en levadura. Aunque la razón por esta discrepancia es incierta, puede ser reflejante de sistemas de expresión huésped, puesto que estos autores observaron solo una especie de MTHFR (estatus de fosforilación desconocido) en sus análisis de inmunoabsorción . Los fenotipos de heterocigotos. El comportamiento de heterócigos en . levaduras diploides por · alelos de MTHFR funcionalmente deteriorados demostró que los fenotipos de heterocigotos fueron claramente observables, especialmente bajo condiciones de foliato limitante (Figura 4). La aparición de fenotipos en heterocigotos fue significativa puesto que la mayoría de la validación genética ocurre ya que la heterocigocidad y alelos de baja frecuencia existen principalmente como heterocigotos en la población. Este resultado es consistente con las observaciones de que la actividad de MTHFR celular en extractos de linfocito está directamente correlacionada con el genotipo: heterócigos individuales para A222V (A/V) tienen aproximadamente 65% de la actividad total observada para homocigotos de alelo mayor (A/A) , en donde los homocigotos de A222V (V/V) retienen 30% de la actividad de los homocigotos (7) de A/A. En un estudio reciente que examina el pleno espectro de alelos en la adipoquina ANGPTL4 que afecta los niveles de triglicéridos en el suero, la heterocigocidad para el alelo E40K no sinónimo fue asociada significativamente con niveles de triglicéridos en el plasma más bajo (18), Asi, en casos en los cuales la heterocigocidad es detectable fenotipicamente incrementa el significado de la contribución de variantes de baja frecuencia, puesto que pueden haber órdenes de magnitud más portadores que homocigotos. Nótese que los fenotipos de heterocigotos fueron observados bajo condiciones en las cuales la actividad de MTHFR fue limitante de la velocidad para el crecimiento celular. Si las etapas enzimáticas son o no limitantes de la velocidad en una ruta particular en humanos depende tanto de factores genéticos como ambientales. Mutaciones y fosforilación de MTHFR y abundancia. La remediación de foliato de cambios no sinónimos en el dominio catalítico puede ocurrir mediante estabilización de proteína (en cuanto a A222V; 9, 10) o al superar otros aspectos de función molecular tales como Km de cofactor (2,5). Por lo menos un alelo perjudicial D223N, mostró termolabilidad incrementada (Figura 3) análoga . a A222V, que argumentó por un defecto de estabilidad. La hipótesis de que alelos de remediación de foliato de METHFR son aquellos en los cuales una especie de foliato estabiliza las formas inestables de la enzima sugerirla que el nivel de proteina de MTHFR sea proporcional a la actividad intrínseca de las variantes, como se ha sugerido (25). Sin embargo, nuestras observaciones indicaron que mientras que el estatus de fosforilación se correlacionó con la actividad enzimática (Figura 5), la abundancia global (formas fosforiladas más formas sin fosforilar) no pareció cambiar sorprendentemente (dentro de un intervalo de dos veces) . Es improbable que el MTHFR fosforilado sea 1ß· forma activa de la enzima puesto que Yamada et al (37) demostró un efecto inhibidor de la fosforilación sobre la actividad intrínseca. Consistente con esto, el comportamiento de la variante T34A no fosforilable tanto en el cultivo como análisis de enzima fue similar a aquel del alelo mayor (datos no mostrados) . Además, puesto que los bajos niveles de foliato intracelulares disminuyen la estabilidad de MTHFR (tal como es medida por abundancia) , este efecto no es mejorado en variantes que deterioran la función. Debido a; que estos resultados están en variación con la desestabilización de proteína esperada de cambios perjudiciales, se dedujo que debe haber una respuesta reguladora compensatoria que está actualmente bajo investigación. De esta manera, la actividad de las variantes podría ser sorprendentemente diferente (Figura 2), mientras que la abundancia de proteína global no (Figura 5). En ¦ tanto que los resultados son consistentes con la regulación de ' retroalimentación mediante fosforilación (37), el papel de la fosforilación en la producción es desconocida. En este sentido, será interesante determinar el efecto de cambio de T34A en combinación con otros alelos deteriorados.
Ruta metabólica de foliato/homocisteina La base de datos de rutas de referencia de Kyoto Enciclopedia de Genes y Genomas (KEGG) (www.genome.jp/kegg) ilustra etapas en el metabolismo de foliato y homocisteina . Las rutas están enlazadas vía la reacción de metionina sintasa y deficiencias de foliato marginales en cultivos celulares, sistemas de modelos . de animales y humanos deterioran la remetilación de homocisteina (véase, por ejemplo Stover" PJ. 2004. Physiology of foíate and vitamin Bi2 in health and disease. Nutr Rev 62:S3-12.). Se tiene la hipótesis de que la homocisteina es un factor de riesgo por NTD (véase, por ejemplo Mills et al., 1995. Homocysteine metabolism in pregnancies complicated by neural tube defects. Lancet 345:149-1151). La deficiencia de foliato también deteriora la metilación moderada por S-adenosil-metioriina (SAM; véase, por ejemplo Stover, supra), que es un inhibidor alostérico tanto de MTHFR y CBS (véase, por ejemplo Kraus et al., 1999. Cystathionine-ß- synthase mutations in homocystinurie . Hum Mut 13:362-375; Daubner et' al., 1982. In Flavins and Flavoproteins, eds . Massey, V. & Williams, C. H . (Elsevier - New York), pp. 165-172).
Además, las elevaciones en las proporciones de S-adenosil-homocisteína : S-adenosil-metionina (SAH/SA ) han sido , propuestas en" el mecanismo de desarrollo de NTD (Stover, supra; Scott, 2001. Evidence of folie acid and folate in the prevention of neural tube defeets. Bibi Nutr Dieta 55:192-195. van der Put et al., 2001. Folate, Homocysteine and Neural Tube Defeets: An Overview. Exptl Biol Med 226:243-270.1,5,6).
Enzimas que no utilizan foliato involucradas en el metabolismo de homocisteína Los defectos de citationa-p-sintasa . (CBNS) den como resultado niveles elevados de homocisteína y citationa-(3-liasa (CTH) . Las SNP han sido similarmente asociadas con homocisteína elevada (véase, por ejemplo, Kraus et al., supra); Wang et al., 2004.· Single Nucleotida polymorphism in CTH associated with variation in plasma homocysteine concentration. Clin Genet 65:483-488). Aunque las enzimas que no utilizan foliato, tanto CBS como CTH, dependen del cofactor de Vitamina E¿ y los alelos deteriorados poseen un riesgo de metabolismo de foliato/homocisteína disfuncional. Los alelos deteriorados de CBS y CTH son objetivos para terapia de ßß, análogos a la terapia de foliato para alelos deteriorados de MFHFR como se describe en la presente. La función y sensibilidad a vitamina de CBS y CTH son recapitulados en el análisis de complementación de levadura (Figura 6) .
Remediación de vitamina B6 de enzimas mutantes de CBS que es recapitulada en S . Cerevisiae Cepas de levadura fueron diseñadas para analizar CTH y CBS como función de la concentración de vitamina Be intracelular (piridoxina) (Figura 6) .. Los ortólogos de S. Cerevisae para CTH y CBS son cys3 y cys4, respectivamente, cuyo defecto da como resultado auxotropia de cisteina. Las enzimas fueron probadas como función de concentración de piridoxina de manera similar a aquella descrita en la presente para MTHFR excepto - que el fondo de cepa es defectuoso para biosintesis de piridoxina* ( sextuplete-cancelación snolA sno2A sno3A snzlñ snz2A snz3\; Stolz et al., 2003. Tpnlp, el transportador de vitamina de vitamin B6 de membrana del plasma de Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 278:18990-18996) también como ya sea un defecto de cys3 o cys4. La Figura 6 muestra análisis de cultivo de levadura cualitativos sobre medios sólidos y demuestra que ambas enzimas rescatan el defecto de levadura cognato como función de complemen-tación de piridoxina y que la sensibilidad a vitamina de dos alelos homocistinúricos de CBS (1278T, R266K) , es recapitulada en este análisis de complementación . Estos alelos se vuelven más sensibles que la enzima tipo silvestre a niveles de Be limitantes y muestran defectos de crecimiento correspondientemente mayores. El rescate de auxotropia de cisteína en el mutante de cys4 por CBS humano ha sido demostrado previamente (Kruger et al., 1985. A yeast assay for functional detection of mutations in the human cystathionine-ß-synthase . gene . Hum Mol Genet 4:1155-1161; Kruger et al., 1994. A yeast system for expression of human cysthationine beta-synthase: structural and functional, conservation of the human and yeast genes. Proc Nati Acad Sel 91:8614-6618) .
EJEMPLO 2: IDENTIFICACIÓN DE ADN VARIANTE DE MTHFR ADICIONAL. Población de muestra. El ADN . genómico fue aislado de inmunoabsorciones secas (Guthrie Cards) de cada uno de 250 neonatos afectados con un defecto de tubo neural o cada uno de 250 neonatos no afectados con un defecto de tubo neural. Los exones de MTHFR en las muestras de ADN genómico aisladas fueron secuenciados como se indica en el Ejemplo 1. Las mutaciones que afectaron la estructura de enzima fueron identificadas de datos de. secuencia como desajustes contra la secuencia de genoma humano de consenso (NM_005957) . Todas las sustituciones son enlistadas en la Tabla A.
Tabla A: Variantes de MTHFR adicionales <3EN!_|to3ttl)asi Tipo Función Ubicación aIS SNP tá Cambio MTHFR.3821 2 SNP sin codificación S'-UTIR en MTHF L40W 2 SNP Sinónimo ?3T? «2086470 en MTHF .4078 2 SNP Sin sinónimo R46W en MTHFR_4145 2 SNP Sin sinónimo R68Q A/G MTHFRjMl 2 SNP sin codificación IVS2+3 1*1413355 A G MTHFR_4234 2 SNP sin codificación 1VS+56 ??3 MTHFR_5689 3 SNP Sinónimo D92 Rf4554?035 en MTHFFL5733 3 SNP Sin sinónimo 0104Y G/T THFR_5840 3 SNP Sinónimo T139T A/G MTHFR5872 3 SNP Sin sinónimo L150P C/T THFR_66½ 4 SNP sin codificación IVS3^5 c/r MTH R.6661 4 SNP sin codificación IVS3-66 fSl3306567 C G MTHFR JS657 4 SNP sin codificación ¡VS3^0 C/T MTHFH_e858 4 SNP sin codificación IVS3-79 G3208ß471 A/G WTHFR_6661 4 SNP sin codificación IVS3-76 rs2066 69 A/G Tabla A: Variantes de MTHFR adicionales GENE_position Exon Tipo Función Ubicación dB SNP id Cambio MTHFR_6681 4 indel IVS3-56 -/+ canee- sin codificación AG lación MTHFR_6774 4 SNP Sinónimo G1 1G A/C THFR_10738 5 SNP Sin sinónimo A222V rs59514310 C/T MTHFR.10906 5 SNP sin codificación IVS5+53 C/T THFR_11656 6 SNP sin codificación IVS5-55 C/T THFRJ 1668 6 SNP sin codificación IVS5-43 C/T THFR_11836 6 SNP Sinónimo A302A rs13306555 C T MTHFRJ 1902 6 SNP Sinónimo N324N C/T THFR_12044 6 SNP sin codificación IVS6+83 rs2066467 A/G MTHFRJ 2190 7 SNP sin codificación IVS6-6 rs2066464 A/G THFR_12220 7 SNP Sinónimo S352S rs2066462 C/T THFR_12232 7 SNP Sinónimo K356K A/G MTHFR_12361 7 SNP sin codificación IVS7+31 rs1994798 C T MTHFRJ 2445 8 SNP sin codificación IVS7-76 rs12121543 G/T MTHFRJ 2618 8 SNP Sin sinónimo G422R rs4557 736 A/G MTHFRJ 2622 8 indel desp de cuadro E423fs -/+ inserción G MTHFR_12641 8 SNP Sin sinónimo E429A rs1801131 A/C MTHFR .12660 8 SNP Sinónimo F435F rs57431061 C/T MTHFR_12759 8 SNP sin codificación IVS8+57 A/G MTHFR_13040 9 SNP Sin sinónimo R473W C/T MTHFR_13099 9 SNP Sinónimo P492P rs35653697 A/G MTHFR_13192 9 SNP sin codificación IVS9+39 rs45515693 C/T MTHFR_1 593 10 SNP sin codificación IV9-88 G/T MTHFR_14601 10 SNP sin codificación IVS9-80 rs17375901 A/G MTHFR_ 4612 10 SNP sin codificación IVS9-69 A/G MTHFR_14705 10 SNP Sin sinónimo R519C rs45496998 C T MTHFR_14814 10 SNP sin codificación IVS10+32 rs45497396 C T MTHFR_14817 10 SNP sin codificación IVS10+35 rs58018465 A/G MTHFRJ 6114 12 SNP sin codificación IVS11-48 rs56932901 C/G MTHFR_16136 12 SNP sin codificación IVS11-26 rs45622739 A/G MTHFR_16170 12 SNP Sinónimo A587A C T MTHFRJ 6190 12 SNP Sin sinónimo R594Q rs58316272 A/G MTHFR_16367 12 SNP Sin sinónimo T653M rs35737219 C/T MTHFR_16368 12 SNP Sinónimo T653T rs45572531 A/G MTHFR_16401 12 SNP sin codificación 3'UTR C T THFR_16451 12 SNP sin codificación 3'UTR C/T El impacto funcional de las variantes de MTHFR es probado utilizando el análisis de levadura in vivo revelado en la presente en un intervalo de concentraciones de foliato para observar, efectos funcionales como se describe en el Ejemplo 1.
EJEMPLO 3. IDENTIFICACIÓN DE VARIANTES DE ATIC, THFS, MAT1A, MAT2A Y GART Población de muestra de ADN. El ADN genómico fue aislado de inmunoabsorclones secas (Guthrie Cards) de cada uno de 250 neonatos afectados con defecto de tubo neural o cada uno de 250 neonatos no afectados con un defecto de tubo neural. Un total de 234 exones en 18 genes candidatos de la ruta metabólica de foliato/homocisteina fueron secuenciados . La secuenciación en mutaciones de amplicon que afectan la estructura de enzima fueron identificados de datos de secuencia como desajustes contra las secuencias de genoma humano de consenso enlistadas en la Tabla 2 para ATIC, MTHFS, MAT1A, AT2A y GART . Todas las sustituciones para ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A y GART son enlistadas respectivamente en las Tablas B, C, D, E y F.
Tabla B: Variantes ATIC Posición Gen Exon Tipo Función Ubicación dB SNP id Cambio 1089 1 SNP sin codificación 5'UTR rs28366034 en 1100 1 SNP sin codificación 5'UTR en 1 114 1 SNP sin codificación 5'UTR en 1116 1 SNP sin codificación 5"UTR rs4535042 T/C C G/ 1 133 1 SNP sin codificación 5'UTR rs28366035 (TRIALELO) 1 152 1 SNP sin codificación 5'UTR rs1 1550205 en 1 160 1 SNP sin codificación 5'UTR rs11550203 en 1 179 1 SNP Sin sinónimo A2V en -/+ inserción 1244 1 indel sin codificación IVS1+50 c 1270 1 SNP sin codificación IVS1+76 en 1286 1 SNP sin codificación IVS1+94 G/A 1301 1 SNP sin codificación IVS1+107 G/A 1380 2 SNP sin codificación IVS1-151 A/G 1396 2 SNP sin codificación IVS1-135 G/C 1453 2 SNP sin codificación IVS1-78 en 1506 2 SNP sin codificación IVS1-2S T/C 689 2 SNP sin codificación IVS2+32 T/A 7227 3 SNP Sin sinónimo G62R G/C -/+ inserción 7232 3 indel Sin sinónimo G63ÍS G 7388 3 SNP sin codificación IVS3+121 T/A 8756 4 SNP Sin sinónimo N94S A G 8793 4 SNP sin codificación IVS4+28 rs16853782 A G 8808 4 SNP sin codificación IVS4+43 G/A 1 099 5 SNP sin codificación IVS4-1 6 en 14136 5 SNP sin codificación IVS4-139 rs3772077 A G 14140 5 SNP sin codificación IVS4-135 C/A 14144 5 SNP sin codificación IVS4-131 en 14156 5 SNP sin codificación IVS4-119 rs3772078 A/G 14183 5 SNP sin codificación IVS4-92 C T 1 229 5 SN sin codificación IVS4-46 A/G 14238 5 SNP sin codificación IVS4-37 C/T 14245 5 SNP sin codificación IVS4-30 A C 14260 5 SNP sin codificación .IVS4-15 G/T 14331 5 SNP Sin sinónimo T116S rs2372536 G/C 14489 5 SNP sin codificación IVS5+126 G/A 14965 6 SNP sin codificación IVS5-56 rs7563206 C/T 14970 6 SNP sin codificación IVS5-51 C T 150O3 6 SNP sin codificación IVS5-18 G/A 15040 6 SNP Sinónimo R133R A/G 15043 6 SNP Sinónimo A134A T/C Tabla B: Variantes ATIC Posición Gen Exon Tipo Función Ubicación dB SNP id Cambio 15149 6 SNP Sin sinónimo T1 0A A/G 15240 6 SNP sin codificación IVS6+68 A/G 15826 7 SNP sin codificación IVS6-30 rs6751557 en 15844 7 SNP sin codificación IVS6-12 C/T 16063 7 SNP sin codificación IVS7+51 G/A 21363 8 SNP sin codificación IVS7-53 A/G 21372 8 SNP sin codificación IVS7-44 T/G 21400 8 SNP sin codificación IVS7-16 A/G -/+ canee- 21521 8 indel Sin sinónimo F265fs T lación 21611 8 SNP sin codificación IVS8+70 T/A 22187 9 SNP sin codificación IVS8-197 G/A 22273 9 SNP sin codificación IVS8-111 A/G sin codificación -/+ inser- 22282 9 Indel IVS8-103 A ción 22283 9 SNP sin codificación IVS8-102 rs12995526 C/T 22291 9 SNP sin codificación IVS8-94 G/A 22342 9 SNP sin codificación IVS8-43 A/G 22361 9 SNP sin codificación IVS8-24 rs10179873 A/G 22512 9 SNP sin codificación IVS9+20 T/G 22519 9 SNP sin codificación IVS9+27 G T 22538 9 SNP sin codificación . IVS9+46 A/G -/+ canee- 22564 9 indel sin codificación IVS9+72 GGA lación 22589 9 SNP sin codificación IVS9+97 G T 22686 9 SNP sin codificación IVS9+194 rs10932606 C/T 22737 9 SNP sin codificación IVS9+245 A/G -/+ inser- 24992 11 indel sin codificación IVS10-79 G ción 25009 11 SNP sin codificación IVS10-62 A/G 25220 11 SNP sin codificación IVS11+60 rs13002576 G/C IVS11- 27609 12 SNP sin codificación 206 rs16853823 A/G 27739 12 SNP sin codificación IVS 11-76 rs6721444 C/A 27757 12 SNP sin codificación IVS11-58 A/G 27855 12 SNP Sin sinónimo T380I C T 27985 12 SNP sin codificación IVS12+42 T/C 28015 12 SNP sin codificación IVS12+72 A/G 33785 13 SNP sin codificación IVS12-30 rs13010249 A/G 33901 13 SNP Sinónimo N438N C/T 33919 13 SNP sin codificación IVS13+12 G/A 33920 13 SNP sin codificación IVS13+13 T/C 33933 13 SNP sin codificación IVS13+26 C/T 35723 14 SNP sin codificación IVS13-72 G/A 35737 14 SNP sin codificación IVS13-58 C/A 35742 14 SNP sin codificación IVS13-53 G/C 35840 14 SNP Sin sinónimo R456S C/A 35885 14 SNP Sin sinónimo P471S rs56117859 C T 35917 14 SNP Sinónimo G481G A/G 35968 14 SNP Sinónimo T498T G/C Tabla B: Variantes ATIC Posición Gen Exon Tipo Función Ubicación dB SNP id Cambio 35973 14 SNP Sin sinónimo G500D G/A -/+ deletion 38338 15 indel sin codificación IVS15+53 GT 38342 15 SNP sin codificación IVS15+57 C/G IVS15- 38437 16 SNP sin codificación 135 rs4672768 G/A 38582 16 SNP Sin sinónimo A557V C/T 38627 16 SNP Sin sinónimo I572T T/C 38667 16 SNP Sinónimo T585T G/A 38725 16 SNP sin codificación 3'UTR T/C Tabla C: Variantes MTHFS Posición Gen Exon Tipo Función Ubicación dB SNP id Cambio THFS_8636 2 SNP sin codificación IVS1-39 rs16971502 C T MTHFS_8808 2 SNP Sin sinónimo R84Q A/G MTHFS_8912 2 SNP Sin sinónimo V 19L C//G MTHFS_8957 2 SNP sin codificación IVS2+21 A G THFS_8998 2 SNP sin codificación IVS2+62 A G MTHFS_52560 3 SNP sin codificación IVS2-27 C/T MTHFS_52811 3 SNP Sin sinónimo T202A rs8923 A/G H280D A/G MTHFS_52878 3 SNP sin codificación 3'UTR G/T MTHFS_52902 3 SNP sin codificación 3*UTR Cambio Tabla D: Variantes MAT1 A Posición_Gen Exon Tipo Función Ubicación dB SNP id Cambio MAT1A_5045 2 SNP sin codificación IVS1-45 A/T MAT1A_5081 2 SNP sin codificación IVS1-9 rs10887721 C/G MAT1A_5181 2 SNP sin codificación IVS2+14 A/G AT1A_5233 2 SNP sin codificación IVS2+66 A/G AT1A_6739 3 SNP Sin sinónimo I90V A/G AT1A_6795 3 SNP sin codificación IVS3+32 G/T AT1A_9833 4 SNP sin codificación IVS3-54 at AT1AJ0006 4 SNP sin codificación IVS4+7 C T MAT1A_10089 4 SNP sin codificación IVS4+90 rs2282367 C/T MAT1A 10312 5 SNP sin codificación IVS4-51 C T AT1A_10339 5 SNP sin codificación IVS4-24 A/G AT1A_10374 5 SNP Sinónimo F139F C/T MAT1A_10383 5 SNP Sinónimo A142A rs11 3694 C/T MAT1A_10484 5 SNP Sin sinónimo L176R G/T MAT1A 10555 5 SNP sin codificación IVS5+49 A/C MAT1A_ 14038 6 SNP sin codificación IVS5-47 A/G MAT1A_14114 6 SNP Sinónimo G193G C/T MAT1A_ 4 7 6 SN Sinónimo T214T A/G Tabla D: Variantes MAT1 A Posición Gen Exon Tipo Función Ubicación dB SNP Id Cambio MAT1A_15424 7 SNP sin codificación IVS6-56 A/C MAT1A 15500 7 SNP Sinónimo G263G C/T MAT1A.J5581 7 SNP Sinónimo V290V ?360582388 A G AT1A_15593 7 SNP Sinónimo A294A rs59923268 C/T MAT1A_15596 7 SNP Sinónimo A295A rs17851642 A/T AT1A.15646 7 SNP Sin sinónimo R312Q A G MAT1A_15706 7 SNP sin codificación IVS7+44 C/T MAT1A_15715 7 SNP sin codificación IVS7+53 AG -/+ cancelación MAT1A_15730 7 indel sin codificación IVS7+68 A MAT1A_15758 7 SNP sin codificación IVS7+96 C T MAT1A 15760 7 SNP sin codificación IVS7+98 rs10788545 C/T MAT1A_16133 8 SNP Sinónimo F353F C/T MAT1A_161 3 8 SNP sin codificación IVS8+14 rs2994388 C T AT1A_161 4 8 SNP sin codificación IVS8+15 A/G MAT1A_16218 8 SNP sin codificación IVS8+59 A/T MAT1A_16752 9 SNP sin codificación IVS8-44 rs57820177 C T MAT1A_16841 9 SNP Sinónimo Y377Y rs57257983 C T MAT1A 16965 9 SNP sin codificación 3' UTR rs7087728 C T MAT1A 16971 9 SNP sin codificación 3' UTR G/T Tabla E: Variantes MAT2A Posición Gen Exon Tipo Función Ubicación dB SNP id Cambio MAT2A_2871 2 SNP sin codificación IVS1-48 A/C -/+ inserción MAT2A 2873 2 indel sin codificación IVS1-50 ATAC MAT2A 2939 2 SNP Sinónimo Q36Q A/G AT2A 3047 3 SNP IVS2-48 rs58507836 A/G MAT2A 3287 3 SNP sin codificación IVS3+70 A/G AT2A_3394 4 SNP sin codificación IVS3-79 C/T MAT2A 3466 4 SNP sin codificación IVS3-7 C/G MAT2A_3498 4 SNP Sinónimo V106V G/T MAT2A_3617 4 SNP sin codificación IVS4+32 S62620249 C T MAT2A_3650 5 SNP sin codificación IVS4-19 A/G MAT2A_3704 5 SNP Sinónimo E147E A/G AT2A_3963 6 SNP sin codificación IVS5-32 rs1078005 A/G MAT2A_4174 6 SNP Sinónimo H243H ' C/T MAT2A 4428 7 SNP Sinónimo R264R rs1078004 C G AT2A 4449 7 SNP Sinónimo Y271Y C/T MAT2A. 476 7 SNP Sinónimo G280G C/T AT2A_4608 7 SNP sin codificación IVS7+21 C/G MAT2A_4660 8 SNP sin codificación i IVS7-81 C/G AT2A 4692 8 SNP sin codificación j IVS7-49 A/G -/+ inserción AT2A 4931 8 indel sin codificación IVS8+53 GT AT2A_5313 9 SNP sin codificación IVS8-199 C/T -/+ inserción MAT2A 5460 ? indel 9ln codificación IVS8-54 T MAT2A 5480 9 SNP sin codificación IVS8-33 C/T Tabla F: Variantes de GART Posición Gen Exon Tipo Función Ubicación dB SNP id Cambio GART_3782 2 SNP sin codificación 5'UTR G/T GART 3842 2 SNP Sin sinónimo T16M C T GART_7745 3 SNP sin codificación IVS2-46 G/T GART_7984 3 SNP sin codificación IVS3+98 C T GARTJ0720 5 SNP Sin sinónimo A161G rs35035222 C/G GART 10775 5 SNP sin codificación IVS5+9 A G GART_11521 6 SNP sin codificación IVS5-33 A T GART_1 522 6 SNP sin codificación IVS5-32 A T GART 1 1541 6 SNP sin codificación IVS5-13 A C GART 12356 7 SNP sin codificación IVS7+4 C T GART 14200 8 SNP Sinónimo I250I C T GART_14273 8 SNP sin codificación IVS8+12 C T GART J4282 8 SNP sin codificación IVS8+21 A G GARTJ4739 10 SNP sin codificación IVS9-37 A C GARTJ4781 10 SNP Sinónimo 13011 C T GART 18055 11 SNP sin codificación IVS10-55 C T GART 18064 11 SNP sin codificación IVS10-46 A/G GARTJ8130 11 SNP Sin sinónimo L363I A/C GART 18142 11 SNP Sin sinónimo V367M A/G GART_18197 11 SNP Sin sinónimo R385K A/G GART 18232 1 1 SNP Sin sinónimo I397V A/G GART 18304 11 SNP Sin sinónimo V421 I rs60421747 A/G GART 18401 11 SNP sin codificación IVS11+60 A/T GART_20794 12 SNP sin codificación IVS1 1-34 rs2834234 A/G GART_20812 12 SNP sin codificación IVS11-16 A/G GART_20825 12 SNP sin codificación IVS11-3 C/T GART 20862 12 SNP Sin sinónimo A445T A/G GART 22073 13 SNP sin codificación IVS12-22 rs2834232 C/T GART .22481 14 SNP sin codificación IVS13-67 A/G GART .22521 14 SNP sin codificación IVS13-27 rs2834232 A/G GART 22573 14 SNP Sin sinónimo D510G rs35927582 A/G GART_25425 15 SNP sin codificación IVS1 -77 A/G GART_25433 15 SNP sin codificación IVS14-69 C/G GART_25601 15 SNP Sin sinónimo H601 R A/G GART 25694 15 SNP Sin sinónimo , A632V rs59920090 C T GART_25720 15 SNP Sin sinónimo P641A rs34588874 C/G IVS15- GART_25867 16 SNP sin codificación 102 C/T GART .25912 16 SNP sin codificación IVS 15-57 C/T GART_25951 16 SNP sin codificación IVS15-18 C/T -/+ cancelación GART .25956 16 indel sin codificación IVS15-13 CT GART_26127 16 SNP sin codificación IVS16+6 A/G GART„261 5 16 SNP sin codificación IVS16+74 C/G GART_31619 17 SNP sin codificación IVS16-33 rs7281488 A/G GART_31627 17 SNP sin codificación IVS16-25 A/T GART_31641 17 SNP sin codificación IVS16-11 A/G GART_31799 17 SNP Sin sinónimo D752G rs8971 A/G GART_31887 17 SNP sin codificación IVS 17+29 C T GART_31902 17 SNP sin codificación IVS17+44 A G GART 31933 17 SNP sin codificación IVS17+75 A/C GART_33173 18 SNP sin codificación IVS 17-17 A/G GART_33264 18 SNP Sin sinónimo L797M A C GART_33286 18 SNP Sin sinónimo E804A A/C GART_36963 19 SNP sin codificación IVS18-43 A/G GART_36964 19 SNP sin codificación IVS18-42 A/T GART_36967 19 SNP sin codificación IVS18-39 rs2070390 A/T GART_37428 20 SNP Sinónimo Y868Y en GART 37433 20 SNP Sin sinónimo N870S A/G GART_38709 21 SNP sin codificación IVS21+11 rs2070388 C/G GART_38762 22 SNP sin codificación IVS21-33 A/G GART_38914 22 SNP Sinónimo A987A A/C GART_38989 22 SNP sin codificación 3* UTR C/G El impacto funcional de las variantes de ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A y GART es probado en un intervalo de concentraciones de foliato utilizando el análisis de levadura in vivo revelado para observar efectos funcionales como se describe en el Ejemplo 1 y utilizando los fondos de cepa de levadura apropiados como se describe en la Tabla 1. Todas las citas son incorporadas expresamente en la presente en su totalidad por referencia.
Tabla 3. Espectro de alelos MTHFR sin sinónimo observados de la toma de muestras de más de 500 individuos sin seleccionar de diversa etnicidad.
Exon Longitud (pb) Alelos secuenciados Variante(codon) Presencias* Referencia 1 236*' 1070 Ninguna 2 239 1016 110I (atg^atc) 1 nuevo R134C (cgc-Mgc) 1 25 3 111 1068 Ninguna 4 194 1050 A222V (gcc-»gtc) 308 26 H213R (cac-»cgc) 1 nuevo D223N (gat^aat) 1 nuevo 5 251 1056 D291N (gaBaat) 1 nuevo 6 135 1042 Ninguno 7 181 1062 E429A (gaa-»gca) 251 27 G422R (ggg-»agg) 3 28 8 183 1058 Ninguno 9 102 1072 R519C (cgc-»tgc) 2 nuevo R519L (cgc-»ctc) 2 nuevo 10 120 1072 581 l (atg->ata) 1 29 11 219* 1076 R594Q (cgg-»cag) 47 30 T653 (acg-»atg) 4 31 Q648P (cag-»ccg) 1 nuevo para exones 1 y 11 solamente se da la longitud de la porción de codificación del exón.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método in vivo para la selección de un alelo deteriorado de un gen que codifica enzima remediable mediante administración de co-factor, caracterizado porque comprende: i) introducir a una célula de levadura un alelo de prueba del gen de codificación de enzima, en donde la célula de levadura comprende una primera mutación en un primer gen que es funcionalmeñte homologa al gen de codificación de enzima y una segunda mutación en un segundo gen del grupo de genes que vuelve a la célula de levadura dependiente después de la comnplementación con un co-factor requerido para la función enzimática en donde la primera mutación altera una característica mesurable de la levadura relacionada con la función del primer gen; ii) complementar el medio de cultivo con el co-factor y iii) detectar menos restauración de la característica mesurable en presencia del alelo de prueba que en presencia de la enzima tipo silvestre, detectando mediante esto la complementación incompleta de la mutación del primer gen por el alelo de prueba e identificar el alelo de prueba como un alelo deteriorado . 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además titular la cantidad del co-factor complementado para determinar si el alelo de prueba es sensible al co-factor. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la levadura es diploide. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la levadura diploide es heteróciga para el alelo de prueba de un gen que codifica enzima. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer gen es metl3, fol3, el co-factor es foliato, la característica es mesurable es crecimiento y el gen que codifica enzima es seleccionado del grupo que consiste de MTHFR, MAT1A, MAT2A, GART, MTHFS y ATIC. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer gen es cys3, el segundo grupo de genes es sextuplete-cancelación snolA sno2A sno3A snzlA snz2A snz3A, el gen que codifica enzima es CTH, el co-factor es vitamina B6 y la característica mesurable es crecimiento. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer gen es cys4, el segundo grupo de genes es sextuplete-cancelación . snolñ sno2A sno3A snzlñ snz2A snz3A, el gen que codifica enzima es CBS , el co-factor es vitamina B6 y . la característica mesurable es crecimiento. 8. Un método para detectar una predisposición a una deficiencia de enzima dependiente de co-factor, caracterizado porque comprende: i) detectar una muestra del sujeto; ii) detectar la presencia o ausencia de una pluralidad de alelos deteriorados remediables por co-factor de por lo menos un gen que codifica enzima; en donde la presencia de por lo menos un alelo deteriorado indica que el sujeto está en riesgo de una deficiencia de enzima dependiente del co-factor. 9. Un método para identificar y/o caracterizar una deficiencia enzimática dentro de una ruta metabólica en el sujeto, caracterizado porque comprende: i) obtener una muestra del sujeto; ii) detectar la presencia o ausencia de una pluralidad de alelos deteriorados de por lo menos un gen que codifica enzima .en dicha rutaen donde la presencia de un alelo deteriorado indica que el sujeto tiene una deficiencia enzimática remediable. 10. El método de conformidad con la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque los alelos deteriorados son alelos de baja frecuencia. 11. El método de conformidad con. la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque los alelos deteriorados son de múltiples genes que codifican enzima en dicha ruta. 12. El método de conformidad con la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque la pluralidad de alelos deteriorados son identificados por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a . 13. Un método para el tratamiento de una deficiencia enzimática metabólica en un sujeto, caracterizado porque comprende: i) obtener una muestra del sujeto; ii) detectar la presencia o ausencia de una pluralidad de alelos deteriorados de por lo menos un gen que codifica enzima y iii) administrar un complemento de co-factor al sujeto en base a la presencia de por lo menos un alelo deteriorado . 14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-13, caracterizado porque la ruta metabólica es homocisteina, la vitamina es foliato y los alelos deteriorados son seleccionados del grupo que consiste de M110I,' H213R, D223N, D291N, R519C, R519L y Q648P en MTHFR humano. 15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-13, caracterizado porque la ruta metabólica es homocisteina, la vitamina es foliato y los alelos deteriorados son seleccionados del grupo que consiste de R84Q, V1119L y T202A en MTHFS humano. 16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-13, caracterizado porque la ruta metabólica es homocisteina, la vitamina es foliato y los alelos deteriorados son seleccionados del grupo que consiste de 190V, L176R y R312Q en MATIA humano. 17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones -8-13, caracterizado porque la ruta metabólica es homocisteina, la vitamina es foliato y los alelos deteriorados son seleccionados del grupo que consiste de T16 , A161G, L363I, V367M, R385K, I397V, V421I, A445T, D510G, H601R, A632V, P641A, D752G L797M, E804A y N870S en GART humano. 18. Un kit para evaluar deficiencias enzimáticas remediables n una ruta metabólica, caracterizado . porque comprende una pluralidad de sondas de ácido nucleico para detectar alelos deteriorados remediables de baja frecuencia en genes que codifican enzima en dicha ruta metabólica. 19. El kit de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque los alelos deteriorados son identificados mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7. 2Q. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque ¦ comprende una mutación' de alelo deteriorado o el complemento del mismo, en donde la mutación de alelo deteriorado es seleccionada del grupo que consiste de nucleótido 4078 del gen de MTHFR; nucleótido 4234 del gen de MTHFR; nucleótido 5733 del gen de MTHFR; nucleótido 5872 del gen de MTHFR; nucleótido 6642 del gen de MTHFR; nucleótido 6657 del gen de MTHFR; nucleótido 6681 del gen de MTHFR; nucleótido 6774 del gen de MTHFR; nucleótido 1.0906 del gen de MTHFR; nucleótido 11656 del gen de MTHFR; nucleótido 11668 del gen de MTHFR; nucleótido 11902 del gen de MTHFR; nucleótido 12232 del gen -de MTHFR; nucleótido 2622 del gen de MTHFR; nucleótido 12759 del gen de MTHFR; . nucleótido 13040 del gen de MTHFR; nucleótido 14593 del gen de MTHFR; nucleótido 14612 del gen de MTHFR; nucleótido 14705 del ' gen de MTHFR; nucleótido 13170 del gen de MTHFR; nucleótido 116401 del gen de MTHFR; en donde la secuencia del SNP es provista en la Tabla A. 21. Un ácido nucleico aislado que comprende una mutación de alelo deteriorado o el complemento del mismo, caracterizado porque la mutación de alelo deteriorado es seleccionada del grupo que consiste de nucleótido 1100 del gen de ATIC; nucleótido 1114 del gen de ATIC; nucleótido 1179 del gen de ATIC; nucleótido 1244 del gen de ATIC; nucleótido 1270 del gen de ATIC; nucleótido 1288 del gen de ATIC; nucleótido 1301 del gen de ATIC; nucleótido 1380 del gen de ATIC; nucleótido 1396 del gen de ATIC; nucleótido 1453 del gen de ATIC; nucleótido 1506 del gen de ATIC; nucleótido 1689 del gen de ATIC; nucleótido 7227 del gen de ATIC; nucleótido 7232 del gen de ATIC; nucleótido 7388 del gen de ATIC; nucleótido 8756 del gen de ATIC; nucleótido 8808 del gen de ATIC; nucleótido ' 14099 del gen de ATIC; nucleótido 14140 del gen de ATIC; nucleótido 14144 del gen de ATIC; nucleótido 14183 del gen de ATIC; nucleótido 14229 del gen de ATIC; nucleótido 14238 del gen de ATIC; nucleótido 14245 del gen de ATIC; nucleótido 14260 del gen de ATIC; nucleótido 14489 del gen de ATIC; nucleótido 14970 del gen de ATIC; nucleótido 15003 del gen de ATIC; nucleótido 15040 del gen de ATIC; nucleótido 15043 del gen de ATIC; nucleótido 15149 del gen de ATIC; nucleótido , 15240 del gen de ATIC; nucleótido 15844 del gen de ATIC; nucleótido 16063 del gen de ATIC; nucleótido 21363 del gen de ATIC; nucleótido 21372 del gen de ATIC; nucleótido 21400 del gen de ATIC; nucleótido 21521 del gen de ATIC; nucleótido 21611 del gen de ATIC; nucleótido 22187 del gen de ATIC; nucleótido 22273 del gen de ATIC; nucleótido 22282 del gen de ATIC; nucleótido 22291 del gen de ATIC; nucleótido 22342 del gen de ATIC; nucleótido 22512 del gen de ATIC; nucleótido 22519 del gen de ATIC; nucleótido 22538 del gen de ATIC; nucleótido 22564 del gen de ATIC; nucleótido 22589 del gen de ATIC; nucleótido 22737 del gen de ATIC; nucleótido 24992 del gen de ATIC; nucleótido 25009 del gen de ATIC; nucleótido 27757 del gen de ATIC; nucleótido 27855 del gen de ATIC; nucleótido 27985 del gen de ATIC; nucleótido 28015 del gen de ATIC; nucleótido 33901 del gen de ATIC; nucleótido 33919 del gen de ATIC; nucleótido 33920 del gen de ATIC; nucleótido 33933 del gen de ATIC; nucleótido 35723 del gen de ATIC; nucleótido 35737 del gen de ATIC; nucleótido 35742 del gen de ATIC; nucleótido 35840 del gen de ATIC; nucleótido 35917 del gen de ATIC; nucleótido 36968 del gen de ATIC; nucleótido 35973 del gen de ATIC; nucleótido 38338 del gen de ATIC; nucleótido 38342 del gen de ATIC; nucleótido 38437 del gen de ATIC; nucleótido 38342 del gen de ATIC; nucleótido 38582 del gen de ATIC; nucleótido 38627 del gen de ATIC; nucleótido 38667 del gen de ATIC; nucleótido 38725 del gen de ATIC; en donde la secuencia del nucleótido es provista en la Tabla B. 22. Un ácido nucleico aislado que comprende una mutaciónd e alelo deteriorado o el complemento del mismo, caracterizado porque la mutación de alelo deteriorado es seleccionada del grupo que consiste nucleótido 8808 del gen de MTHFS; nucleótido 8912 del gen de MTHFS; nucleótido 8957 del gen de MTHFS; nucleótido 8998 del gen de MTHFS; nucleótido 52560 del gen de MTHFS; nucleótido 52878. del gen de MTHFS; nucleótido 52902 del gen de MTHFS; en donde la secuencia del SNP es provista en la Tabla C. 23. Un ácido nucleico aislado que comprende una mutación de alelo deteriorado o el complemento del mismo, caracterizado porque la mutación de alelo deteriorado es seleccionada del grupo que consiste de nucleótido 5045 del gen de MATIA; nucleótido 5181 del gen de MATIA; nucleótido 5233 del gen de MATIA; nucleótido 6739 del gen de MATIA; nucleótido 6795 del gen de MATIA; nucleótido 9833 del gen de MATIA; nucleótido ¦ 10006 del gen de MATIA; nucleótido 10312 del gen de MATIA; nucleótido 10339 del gen de MATIA; nucleótido 10374 del gen de MATIA; nucleótido 10484 del gen de MATIA; nucleótido 10555 del gen de MATIA; nucleótido 14038 del gen de MATIA; nucleótido 14114 del gen de MATIA; nucleótido 14177 del gen de MATIA; nucleótido 15424 del gen de MAT1A; nucleótido 15500 del gen de MAT1A; nucleótido 15646 del- gen de MAT1A; nucleótido 15706 del gen de AT1A; nucleótido 15715 del gen de MAT1A; nucleótido 15730 del gen de AT1A; nucleótido 15758 del gen de MATIA; nucleótido 16133 del gen de MAT1A; nucleótido 16174 del gen de MAT1A; nucleótido- 15706 del gen de MAT1A; nucleótido 15715 del gen de MAT1A; . nucleótido 15730 del gen de MAT1A; nucleótido 15758 del gen de MAT1 ; nucleótido 16133 del gen de MATIA; nucleótido 16174 del gen de MATIA; nucleótido 16218 del gen de MATIA; en donde la secuencia del SNP es provista en la Tabla D. 24. Un . ácido nucleico aislado que comprende una mutación de alelo deteriorado o el complemento del mismo, caracterizado porque la mutación de alelo deteriorado es seleccionado del grupo que consiste de nucleótido 2871 del gen o de MAT2A; nucleótido 2873 del gen de MAT2A; nucleótido 2939 dél gen de MAT2A; nucleótido 3287 del gen de MAT2A; nucleótido 3394 del gen de MAT2A; nucleótido 3466 del gen de MAT2A; nucleótido 3650 del gen de MAT2A; nucleótido 3704 del gen de MAT2A; nucleótido 4174 del gen de MAT2A; nucleótido 4449 del gen de MAT2A; nucleótido 4476 del gen de MAT2A; nucleótido 4608 del gen de MAT2A; nucleótido 4660 del gen de MAT2A; nucleótido 4692 del gen de MAT2A; nucleótido 4931 del gen de MAT2A; nucleótido 5313 del gen de MAT2A; nucleótido 5460 del gen dé MAT2A; nucleótido 5480 del gen de MAT2A; en donde la secuencia del SNP es provista en la Tabla E. 25. Un ácido nucleico aislado que comprende una mutación de alelo deteriorado o .el complemento del mismo, caracterizado porque la mutación de alelo deteriorado es seleccionada del grupo que consiste de nucleótido 3782 del gen de GART; nucleótido 3842 del gen de GART; nucleótido 7745 del gen de GART; nucleótido 798·4 del gen de GART; nucleótido 10775 del gen de GART; nucleótido 11521 del gen de GART; nucleótido 11522 del gen de GART; nucleótido 11541 del gen de GART; nucleótido 12356 del gen de GART; nucleótido 14200 del gen de GART; nucleótido 14273 del gen de GART; nucleótido 14282 del gen de GART; nucleótido 14739 del gen de GART; nucleótido 14781 del gen de GART; nucleótido 18055 del gen de GART; nucleótido 18064 del gen de GART; nucleótido 18130 del gen de GART; nucleótido 18142 del gen de GART; nucleótido 18197 del gen de GART'; nucleótido 18232 del gen de GART; nucleótido 18401 del gen de GART; nucleótido 20812 del gen de GART; nucleótido 20825 del gen de GART; nucleótido 16174 del gen de GART; nucleótido 15706 del gen de GART; nucleótido 20862 del gen de GART; nucleótido 22481 del gen de GART; nucleótido 22521 del gen de GART; nucleótido 25425 del gen de GART; nucleótido 25433 del gen de GART; nucleótido 25601 del gen de GART; .nucleótido 25867 del gen de GART; nucleótido 25912 del gen de GART; nucleótido 25951 del gen de GART; nucleótido 25956 del gen de GART; nucleótido 26127 del gen de GART; nucleótido 26195 del gen de GART; nucleótido 31627 del gen de GART; nucleótido 31641 del gen de GART; nucleótido 31887 del gen de GART; nucleótido 31902 del gen de GART; nucleótido 31933 del gen de GART; nucleótido 33173 del gen de GART; nucleótido .33264 del gen de GART; nucleótido '31933 del gen- de GART; nucleótido 33173 del gen de GART; nucleótido 33264 del gen de GART; nucleótido 33286. del gen de GART; nucleótido 36963 del gen de GART; nucleótido 36964 del gen de GART; nucleótido 37428 del gen de GART; nucleótido · 37433 del gen de GART; nucleótido 38762 del ge,n de GART; nucleótido 38914 del gen de GART; nucleótido 38989 del gen de GART; en donde la secuencia del SNP es . provista en la Tabla F . - 26. Un ácido nucleico aislado que comprende una mutación de alelo deteriorado o el complemento del mismo, caracterizado porque la mutación de alelo deteriorado es seleccionada del grupo que consiste de M110I, H213R, D223N, D291N, R519C, R519L y Q648P. 27. Un método de selección por un riesgo de una condición o enfermedad asociada " con metabolismo de foliato/homocisteína aberrante caracterizado porque comprende detectar un alelo deteriorado utilizando el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-13. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la enfermedad o condición es seleccionada del grupo que consiste de enfermedad cardiovascular, enfermedad de arteria coronaria, accidente cerebro-vascular isquémico, arterioesclerosis, defecto de tubo neural, escisiones orofaciales, pre-eclamsia, parto a corto plazo/nacimiento de bajo peso, aborto espontáneo prematuro recurrente, trombosis, oclusión de arteria retinal, síndrome de Down, cáncer colorectal, cáncer de pecho, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, depresión, esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer/demencia, degeneración ocular relacionada con la edad y glaucoma. 28. Un método de selección por potencial de respuesta terapéutica, caracterizado porque comprende detectar un alelo deteriorado de un gen seleccionado del grupo que consiste de MTHFR y GART. 29. Un método de selección por toxicidad quimioterapéutica, caracterizado porque comprende detectar un alelo deteriorado de un gen seleccionado del grupo que consiste de MTHFR y GART. 30. Un arreglo para detectar un alelo deteriorado de un gen en la ruta metabólica de foliato/homocisteína, caracterizado porque comprende un ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-25.
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