CN102027134A - 参与代谢途径的基因的受损等位基因以及用于检测和使用其的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及酶变体、其对辅因子的反应性以及用于测试酶变体的活性和其对辅因子的反应性的体内测定。

Description

参与代谢途径的基因的受损等位基因以及用于检测和使用其的方法
政府资助
本发明是在Defense Advanced Research Projects Agency和U.S. Army Research Office(#W911NF-06-1-0166)和National Institutes for Health(GM072859)的政府支助下进行的。美国政府确实具有本发明的某些权利。
发明领域
本发明涉及影响代谢的酶变体、其对辅因子的功能敏感度以及用于检测编码此类酶变体的受损等位基因和测定其对辅因子的敏感度的测定。
背景
叶酸/高半胱氨酸代谢途径构成代谢叶酸和/或影响高半胱氨酸的酶和酶途径的网络。所述途径通过甲硫氨酸合酶反应相联系，并且细胞培养物、动物模型系统中和人中的边缘性叶酸缺乏削弱高半胱氨酸再甲基化(参见，例如，Stover PJ.2004.Physiology of folate and vitamin B12 in health and disease.Nutr Rev 62：S3-12)。
已将叶酸不足与神经管缺陷(“NTD”)以及其他出生缺陷和不利的怀孕结果例如口面裂(orofacial cleft)、先兆子痫、早产/低出生体重和反复早期自发性流产相关联(参见，例如，Mills等人，1995.Homocysteine metabolism in pregnancies complicated by neural tube defects.Lancet 345：149-1151)。叶酸不足还与心血管疾病、冠状动脉疾病、缺血性中风、动脉粥样硬化、血栓形成、视网膜动脉闭塞、唐氏综合征(Down′s Syndrome)、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、抑郁症、精神分裂症、阿尔茨海默病/痴呆、年龄相关性黄斑变性和青光眼关联。
叶酸/高半胱氨酸代谢途径中的所有代谢步骤都潜在地与和叶酸不足和/或高半胱氨酸代谢相关的状况和疾病相关。涉及的参与叶酸/高半胱氨酸代谢的酶包括例如双功能酶AICAR转甲酰酶和IMP环水解酶(ATIC)、甘氨酰胺核糖核苷酸转甲酰基酶(GART)、甲硫氨酸腺苷转移酶I，α(MAT1A)、甲硫氨酸腺苷转移酶II，α(MAT2A)、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和次甲基四氢叶酸合成酶(MTHFS)。叶酸不足还削弱由S-腺苷-甲硫氨酸(“SAM”)介导的甲基化，其是MTHFR和CBS的变构抑制剂(参见，例如，Kraus等人，1999.Cystathionine β-synthase mutations in homocystinuria.Hum Mut 13：362-375；Daubner等人，1982.In Flavins and Flavoproteins，eds.Massey，V.& Williams，C.H.(Elsevier，New York)，pp.165-172)。在NTD发育的机制中已提及S-腺苷-高半胱氨酸：S-腺苷-甲硫氨酸(SAH/SAM)的比升高。
5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)参与其中将高半胱氨酸转化成甲硫氨酸的叶酸依赖性多步骤途径。高半胱氨酸的减少的转化可导致高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia)。
已鉴定了与临床MTHFR缺陷(一种常染色体隐性遗传病症)相关的MTHFR的几个罕见突变。MTHFR缺陷的临床症状是高度可变的，其包括发育延迟、运动和步态异常、癫痫发作(seizure)和早期血管疾病(premature vascular disease)。
MTHFR的常见多态性也已得到描述，包括功能受损的等位基因A222V。常见多态性与疾病的遗传关联性不是始终一致的。这可能部分因为掩盖疾病的潜在风险的叶酸可获得性的补偿效应以及迄今仍未鉴定到的低频受损等位基因对此类疾病的贡献。有趣地，已将常见多态性与化疗剂例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶的功效和毒性的个体差异相关联。
已描述了酵母基因met11的功能互补测定(Shan等人，JBC，274：32613-32618，1999)。在该测定中显示，野生型人MTHFR与酿酒酵母(S.cerevisiae.)中的met11突变互补。然而，该测定对由MTHFR突变引起的活性的量的变化不敏感，如由与野生型酶相比较功能受损的等位基因A222V互补酵母突变的相似能力所证明的；该测定对叶酸可获得性的作用也不敏感。
除了利用叶酸的酶外，少数维生素B6-和B12-依赖性酶和酶途径与高半胱氨酸代谢、NTD和其他出生缺陷和不利的怀孕结果相关。例如，利用B6的酶胱硫醚-β-合酶(“CBS”)的缺陷导致高半胱氨酸的积累(Kraus等人，1999.Cystathionine β-synthase mutations in homocystinuria.Hum Mut 13：362-375)。同样地，利用B6的酶胱硫醚-γ-裂解酶(“CTH”)的单核苷酸多态性(“SNP”)也与高半胱氨酸血症相关联(Wang等人，2004.Single nucleotide polymorphism in CTH associated with variation in plasma homocysteine concentration.Clin Genet 65：483-486)。
发明概述
本发明部分地来源于用于鉴定代谢途径中的编码酶的基因的受损等位基因和测定它们对辅因子补救(cofactor remediation)的敏感度的新型体内测定的开发。复合酵母突变体(其包括允许由功能同源的目的酶互补的第一突变和使得菌株依赖于辅因子的补充的第二突变(或突变群))提供了作为辅因子可获得性的函数的酶互补作用的研究。使用本文中公开的测定，可鉴定辅因子敏感性受损等位基因包括可补救的等位基因(remediable allele)，并且可分析辅因子可获得性：酶活性的关系。获得的结果可用于为预防性和治疗性营养补充法提供信息，以预防和治疗与代谢酶功能障碍和异常代谢相关的状况和疾病。
本发明还部分地来源于在本文中首次证明，编码酶的基因的低频受损等位基因的辅因子补救令人惊讶地普遍。如本文中举例说明的，代谢途径中多个辅因子敏感性基因各自在群体中可具有多个低频突变。结合起来看，此类突变共同地对代谢途径具有更显著的影响(与单个基因的单个低频受损等位基因的影响相比)。此外，因为对于多个此类低频受损等位基因是杂合的细胞展示数量性缺陷(quantitative defects)，此类各自罕见的等位基因的合计频率可以甚至在更常见的多态性不存在的情况下促成常见表型。此类对途径具有影响的低频受损等位基因还可促成对于常见多态性观察到的表型变异。因此，本发明涉及诊断和预后方法，所述方法特别地聚焦于编码酶的基因的此类低频受损等位基因的检测和表征以及它们的有效补救的测定。
本发明还部分地来源于此类测定用于鉴定和表征特别地参与叶酸/高半胱氨酸代谢的编码酶的基因的新型低频受损等位基因的特殊应用。如本文中对于MTHFR所证明的，存在许多低频受损等位基因，其可累积性地促成酶缺陷且也能通过辅因子补充来解决。本发明也部分地来源于这样的发现，MTHFR的受损等位基因包括定位至酶的N端催化结构域的编码序列的序列改变。
因此本发明提供了用于检测参与叶酸/高半胱氨酸代谢的编码酶的基因(包括例如ATIC、GART、MAT1A、MAT2A、MTHFR和MTHFS)的受损但可补救的等位基因的新型体内测定。虽然现有技术描述了其中野生型人MTHFR活性互补met11缺陷的互补测定(Shah等人，JBC，274：32613-32618，1999)，但该测定不是高灵敏的并且不能检测所有功能受损的人MTHFR等位基因。例如，该测定不能区分野生型MTHFR与功能受损的常见多态性A222V。此外，该测定没有揭示叶酸水平与酶活性之间的关系。
与现有技术相反，本申请公开的体内测定是高度灵敏的并且能够显示参与叶酸/高半胱氨酸代谢的基因的受损等位基因(如本文中对于MTHFR所证明的)，同时测定其对叶酸的敏感性。鉴定到的等位基因包括低频等位基因、以杂合子形式展示表型的显性或共显性等位基因、叶酸敏感性等位基因(包括叶酸可补救的等位基因)以及具有这些特征的组合的等位基因。重要地，此类受损等位基因与多种状况和疾病的风险以及化疗剂的不同功效和毒性相关联。此类受损等位基因的缺陷在一些个体中可能因为叶酸可获得性的补偿效应而不表现为状况、疾病或对化疗剂的不同响应。揭示MTHFR的功能受损等位基因的能力提供了筛查此类状况和疾病的风险以及化疗剂的潜在治疗功效和毒性的方法。
本发明还提供了用于检测CTH和CBS的受损等位基因的新型体内测定。揭示这些基因的功能受损等位基因的能力类似地提供了筛查相关疾病和状况的风险的方法。
因此，在一个方面，本发明提供了用于检测代谢途径中编码酶的基因的受损等位基因和测定它们对辅因子的敏感度的体内测定。所述测定包括使用酵母菌株，所述酵母菌株包含可由编码野生型酶的基因互补的第一基因中的第一突变和使得酵母菌株在与第一基因的功能相关的可测定的表型方面依赖于辅因子(或其前体)的补充的第二基因(或基因群)中的第二突变。
该方法包括(i)将编码酶的基因的受试等位基因引入酵母细胞，其中酵母细胞包含功能上与编码酶的基因同源的第一基因中的第一突变和第二基因(或基因群)中的第二突变，所述第二突变使得酵母细胞依赖于酶功能所需的辅因子的补充，其中第一突变改变与第一基因的功能相关的酵母的可测量的特征；(ii)给生长培养基补充辅因子；和(iii)检测与在野生型酶存在的情况下相比，在受试等位基因存在的情况下更少的可测量的特征的恢复，从而检测受试等位基因对第一基因突变的不完全互补作用，并且将受试等位基因鉴定为受损等位基因。通过滴定补充的辅因子的量，测定受损等位基因对辅因子可获得性的敏感度。
在一个实施方案中，使用二倍体酵母。二倍体酵母对于受试等位基因可以是纯合的或杂合的。二倍体酵母可包含野生型基因和受试等位基因。二倍体酵母可包含受试等位基因的组合。
在优选实施方案中，编码酶的基因在序列上相应于天然发生的等位基因，或相应于个体天然发生的等位基因的汇编(compilation)。在优选实施方案中，编码酶的基因包括人编码酶的基因的等位基因，或个体人等位基因的汇编。
在优选实施方案中，酵母是酿酒酵母。
在一个实施方案中，第一酵母基因是met13并且第二酵母基因是fol3。这样的酵母菌株可用于确定MTHFR等位基因的活性和其对叶酸状态的响应。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于测定MTHFR等位基因的活性的体内测定，其还能够测定作为叶酸状态的函数的活性。在优选实施方案中，编码酶的基因包括天然发生的人MTHFR等位基因。在另一个优选实施方案中，编码酶的基因包括个体人MTHFR等位基因的汇编。
在优选实施方案中，测定方法包括将目的MTHFR等位基因的活性与野生型MTHFR的活性相比较。
在优选实施方案中，测定方法包括滴定叶酸的量以确定MTHFR酶对叶酸可获得性是否敏感。
在一个实施方案中，酵母是二倍体。在一个实施方案中，二倍体酵母对于将就互补作用进行测试的MTHFR等位基因是杂合的。在一个实施方案中，二倍体酵母包含野生型MTHFR和突变的MTHFR等位基因。
在优选实施方案中，测定的测量输出(output)是生长。
在一个实施方案中，第一酵母基因是ade16或ade17并且第二酵母基因是fol3。这样的酵母菌株可用于测定双功能酶AICAR转甲酰酶和IMP环水解酶(ATIC)等位基因的活性和其对叶酸状态的响应。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于测定ATIC等位基因的活性的体内测定，其还能够测定作为叶酸状态的函数的活性。在优选实施方案中，编码酶的基因包括天然发生的人ATIC等位基因。在另一个优选实施方案中，编码酶的基因包括个体人ATIC等位基因的汇编。
在一个实施方案中，第一酵母基因是ade7并且第二酵母基因是fol3。这样的酵母菌株可用于测定甘氨酰胺核糖核苷酸转甲酰基酶(GART)等位基因的活性和其对叶酸状态的响应。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于测定GART等位基因的活性的体内测定，其还能够测定作为叶酸状态的函数的活性。在优选实施方案中，编码酶的基因包括天然发生的人GART等位基因。在另一个优选实施方案中，编码酶的基因包括个体人GART等位基因的汇编。
在一个实施方案中，第一酵母基因是sam1或sam2并且第二酵母基因是fol3。这样的酵母菌株可用于测定甲硫氨酸腺苷转移酶I，α(MAT1A)等位基因的活性和其对叶酸状态的响应。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于测定MAT1A等位基因的活性的体内测定，其还能够测定作为叶酸状态的函数的活性。在优选实施方案中，编码酶的基因包括天然发生的人MAT1A等位基因。在另一个优选实施方案中，编码酶的基因包括个体人MAT1A等位基因的汇编。
在一个实施方案中，第一酵母基因是sam1或sam2并且第二酵母基因是fol3。这样的酵母菌株可用于测定甲硫氨酸腺苷转移酶II，α(MAT2A)等位基因的活性以及其对叶酸状态的响应。因此，在一个实施方案中，本发明提供用于测定MAT2A等位基因的活性的体内测定，其还能够测定作为叶酸状态的函数的活性。在优选实施方案中，编码酶的基因包括天然发生的人MAT2A等位基因。在另一个优选实施方案中，编码酶的基因包括个体人MAT2A等位基因的汇编。
在一个实施方案中，第一酵母基因是fau1并且第二酵母基因是fol3。这样的酵母菌株可用于测定次甲基四氢叶酸合成酶(MTHFS)等位基因的活性和其对叶酸状态的响应。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于测定MTHFS等位基因的活性的体内测定，其还能够测定作为叶酸状态的函数的活性。在优选实施方案中，编码酶的基因包括天然发生的人MTHFS等位基因。在另一个优选实施方案中，编码酶的基因包括个体人MTHFS等位基因的汇编。
在另一个实施方案中，第一酵母基因是cys3并且第二酵母基因群是六重缺失(sextuple-delete)sno1Δsno2Δsno3Δsnz1Δsnz2Δsnz3Δ。这样的菌株可用于测定CTH等位基因的活性和其对维生素B6状态的响应。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于测定CTH等位基因的活性的体内测定，其还能够测定作为维生素B6状态的函数的活性。在优选实施方案中，编码酶的基因包括天然发生的人CTH等位基因。在另一个优选实施方案中，编码酶的基因包括个体人CTH等位基因的汇编。
在另一个实施方案中，第一酵母基因是cys4并且第二酵母基因群是六重缺失sno1Δsno2Δsno3Δsnz1Δsnz2Δsnz3Δ。这样的酵母菌株可用于测定CBS等位基因的活性和其对维生素B6状态的响应。因此，在一个实施方案中，本发明提供了测定CBS等位基因的活性的体内测定，其还能够测定作为维生素B6状态的函数的活性。在优选实施方案中，编码酶的基因包括天然发生的人CBS等位基因。在另一个优选实施方案中，编码酶的基因包括个体人CBS等位基因的汇编。
在一个方面，本发明提供了能够检测参与叶酸/高半胱氨酸代谢的基因的受损等位基因和其对辅因子的敏感度的酵母菌株。
在一个实施方案中，本发明提供了能够检测选自ATIC、GART、MAT1A、MAT2A、MTHFR和MTHFS的编码酶的基因的受损等位基因和测定其对叶酸的反应性的酵母菌株。在优选实施方案中，酵母包括上文中对于每一个这样的编码酶的基因描述的各自的突变和添加。
在一个实施方案中，本发明提供了能够检测CTH的受损等位基因和测定其对维生素B6的反应性的酵母菌株。
在一个实施方案中，本发明提供了能够检测CBS的受损等位基因和测定其对维生素B6的反应性的酵母菌株。
在一个方面，本发明提供了用于检测代谢途径例如叶酸/高半胱氨酸代谢中的编码酶的基因的受损等位基因的方法。在一个实施方案中，受损等位基因在人ATIC、GART、MAT1A、MAT2A、MTHFR和/或MTHFS中天然发生。在一个实施方案中，受损等位基因是CBS等位基因。在一个实施方案中，受损等位基因是CTH等位基因。在优选实施方案中，该方法包括使用本文中提供的体内测定和方法来检测已显示为辅因子可补救的编码代谢酶的基因的受损等位基因。
在另一个方面，本发明提供了鉴定和/或表征受试者的代谢酶缺陷的方法，其包括从受试者获得样品，然后检测多个受损等位基因在所述样品中的存在或不存在，其中至少一个受损等位基因的存在表示受试者处于酶缺陷的风险中。多个受损等位基因可来自代谢途径中相同的编码酶的基因，或可以是来自相同途径中多个基因的等位基因。
在优选实施方案中，一个或多个受损等位基因是例如通常在低于4％的一般群体中，更通常地在低于3％的一般群体中，优选低于2.5％至2％和最优选在低于1％的一般群体中表达的低频等位基因。在优选实施方案中，一个或多个受损等位基因是辅因子可补救的等位基因。在特别优选的实施方案中，通过本文中提供的体内测定和方法来鉴定辅因子可补救的受损等位基因。
在另一个方面，提供了用于检测受试者对辅因子依赖性酶缺陷的易感性的方法，其包括从受试者获得样品，然后检测多个受损等位基因在所述样品中的存在或不存在，其中至少一个受损等位基因的存在表示受试者可能具有可补救的酶缺陷。多个受损等位基因可来自代谢途径中相同的编码酶的基因或可以是来自相同途径中的多个基因的等位基因。
在优选实施方案中，一个或多个受损等位基因是例如通常在低于4％的一般群体中，更通常地在低于3％的一般群体中，优选低于2.5％至2％和最优选在低于1％的一般群体中表达的低频等位基因。在优选实施方案中，一个或多个受损等位基因是辅因子可补救的等位基因。在特别优选的实施方案中，通过本文中提供的体内测定和方法来鉴定辅因子可补救的受损等位基因。
在样品中检测特定等位基因在本领域内是很普通的，任何常规检测方案都可有利地用于所述方法，包括基于例如杂交、扩增、测序、RFLP分析等的方案，如本文中所描述的。还预期用于本文中的是将来开发的在检测核酸样品中的等位基因中具有特珠功用的方案和/或材料。
在另外的方面，提供了用于治疗受试者的代谢酶缺陷的方法，其包括从具有或怀疑具有这样的缺陷的受试者获得样品，检测辅因子可补救的多个受损等位基因在样品中的存在或不存在，然后基于样品中检测到的受损等位基因的数目和类型给受试者施用适当的辅因子补充物，如本文中所描述的。
在一个实施方案中，该方法还包括使用本文中描述的用于测定酶活性的体内测定。
在一个实施方案中，该方法还包括使用测定酶活性(如本文中所描述的)和检测编码酶的核酸中的突变的体内测定。
在一个实施方案中，该方法还包括使用本文中描述的用于测定酶活性的体内测定和用于测定在升高的温度下的酶稳定性的温度敏感性测定。
在一个实施方案中，该方法还包括使用本文中描述的用于测定酶活性的体内测定和用于测定酶的比活性(specific activity)的体外测定。
在一个方面，本发明提供了筛查与异常高半胱氨酸代谢相关的疾病或状况的风险的方法。该方法包括筛查参与高半胱氨酸代谢的基因的受损等位基因，如本中所公开的。在优选实施方案中，该方法包括检测已使用本文中描述的体内测定进行表征的受损等位基因。在优选实施方案中，疾病或状况选自心血管疾病、冠状动脉疾病、缺血性中风、动脉粥样硬化、神经管缺陷、口面裂、先兆子痫、早产/低出生体重、反复早期自发性流产、血栓形成、视网膜动脉闭塞、唐氏综合征、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、抑郁症、精神分裂症、阿尔茨海默病/痴呆、年龄相关性黄斑变性和青光眼。
在一个实施方案中，该方法包括筛查ATIC、GART、MAT1A、MAT2A、MTHFR和/或MTHFS的受损等位基因，如本文中所描述的。
在一个实施方案中，该方法包括筛查CBS的受损等位基因，如本文中所描述的。
在一个实施方案中，该方法包括筛查CTH的受损等位基因，如本文中所描述的。
在一个方面，本发明提供了确定个体的化疗剂响应潜能的方法。该方法包括使用本文中描述的用于检测参与叶酸/高半胱氨酸代谢的基因的受损等位基因的方法。在优选实施方案中，基因选自MTHFR、ATIC、MTHFS、MAT1A、MAT2A和GART。通过本文中描述的体内测定法和/或通过用于特定等位基因的检测方法的应用在个体中检测到受损等位基因表示减少的响应潜能。
在一个方面，本发明提供了测定对于个体的潜在化疗剂毒性的方法。该方法包括使用本文中描述的用于检测参与叶酸/高半胱氨酸代谢的基因的受损等位基因的方法。在优选实施方案中，基因选自MTHFR、ATIC、MTHFS、MAT1A、MAT2A和GART。通过本文中描述的体内测定法和/或通过用于特定等位基因的检测方法的应用在个体中检测到受损等位基因表示增加的毒性潜能。
在一个方面，本发明提供了在序列上相应于选自MTHFR、ATIC、MTHFS、MAT1A、MAT2A和GART的编码酶的基因的等位基因的分离的核酸。在一个实施方案中，分离的核酸具有和/或包含MTHFR基因的等位基因的序列，例如表A中公开的SNP。在一个实施方案中，分离的核酸具有和/或包含ATIC基因的等位基因的序列，例如表B中公开的SNP。在一个实施方案中，分离的核酸具有和/或包含MTHFS基因的等位基因的序列，例如表C中公开的SNP。在一个实施方案中，分离的核酸具有和/或包含MAT1A基因的等位基因的序列，例如表D中公开的SNP。在一个实施方案中，分离的核酸具有和/或包含MAT2A基因的等位基因的序列，例如表E中公开的SNP。在一个实施方案中，分离的核酸具有和/或包含GART基因的等位基因的序列，例如表F中公开的SNP。在一个实施方案中，核酸相应于MTHFR等位基因的序列并且包含编码选自M110I、H213R、D223N、D291N、R519C、R519L和Q648P的MTHFR蛋白的非同义突变的序列。
在一个方面，本发明提供了用于检测参与叶酸/高半胱氨酸代谢的基因的受损等位基因的阵列。
在一个实施方案中，本发明提供了用于检测选自ATIC、GART、MAT1A、MAT2A、MTHFR和MTHFS的基因的受损等位基因的阵列。在优选实施方案中，阵列能够检测选自该群体的基因的多于一个的受损等位基因。在优选实施方案中，阵列能够检测选自该群体的多个基因的多于一个的受损等位基因。在一个实施方案中，阵列能够检测选自该群体的多个基因的每一个基因的多于一个的受损等位基因。在优选实施方案中，阵列能够检测这样的为可补救的受损等位基因的受损等位基因。在优选实施方案中，阵列能够检测多个这样的为可补救的受损等位基因的受损等位基因。在优选实施方案中，至少一个受损等位基因是低频等位基因。
在一个实施方案中，本发明提供了用于检测受损MTHFR等位基因的阵列。在一个实施方案中，阵列包含一个或多个能够与MTHFR等位基因杂交的核酸，所述MTHFR等位基因包含选自编码M110I、H213R、D223N、D291N、R519C、R519L和Q648P的突变的非同义突变。
在一个实施方案中，本发明提供了用于检测CBS的受损等位基因的阵列。阵列包含一个或多个能够与CBS的受损等位基因杂交的核酸。
在一个实施方案中，本发明提供了用于检测CTH的受损等位基因的阵列。阵列包含一个或多个能够与CTH的受损等位基因杂交的核酸。
在优选实施方案中，本发明提供了用于检测参与叶酸/高半胱氨酸代谢的多个基因的受损等位基因的阵列。本发明的阵列可使用本领域内已知的许多阵列、探针和读出技术中的任一个。
在一个方面，本发明提供了预防个体的与异常叶酸/高半胱氨酸代谢相关的状况或疾病的方法，所述个体具有参与叶酸/高半胱氨酸代谢的基因的可补救的受损等位基因。在一个实施方案中，该方法包括增加个体对叶酸的摄取。在一个实施方案中，该方法包括增加个体对维生素B6的摄取。在优选实施方案中，该方法包括筛查与异常叶酸/高半胱氨酸代谢相关的疾病或状况的风险的方法，如本文中所描述的。
在一个方面，本发明提供了治疗与异常叶酸/高半胱氨酸代谢相关的状况或疾病的方法，其中患者具有参与叶酸/高半胱氨酸代谢的基因的可补救的受损等位基因。在一个实施方案中，该方法包括增加患者对叶酸的摄取。在一个实施方案中，该方法包括增加个体对维生素B6的摄取。在优选实施方案中，该方法包括筛查与异常叶酸/高半胱氨酸代谢相关的疾病或状况的风险的方法，如本文中所描述的。
在一个方面，本发明提供了增加具有参与叶酸/高半胱氨酸代谢的基因的可补救的受损等位基因的个体的化疗剂响应潜能的方法。该方法包括增加个体对叶酸的摄取。在优选实施方案中，该方法包括筛查与异常叶酸/高半胱氨酸代谢相关的疾病或状况的风险的方法，如本文中所描述的。在优选实施方案中，基因选自MTHFR、ATIC、MTHFS、MAT1A、MAT2A和GART。
在一个方面，本发明提供了减少化疗剂对具有参与叶酸/高半胱氨酸代谢的基因的可补救的受损等位基因的个体的毒性的方法。该方法包括增加个体对叶酸的摄取。在优选实施方案中，该方法包括筛查与异常叶酸/高半胱氨酸代谢相关的疾病或状况的风险的方法，如本文中所描述的。在优选实施方案中，基因选自MTHFR、ATIC、MTHFS、MAT1A、MAT2A和GART。
附图概述
图1.亚叶酸补充对fol3Δ::KanMX细胞的生长速率和人MTHFR的细胞活性的影响。(a)如材料和方法中所述在96孔板中测量fol3Δ::KanMX MET13二倍体酵母的生长。用指定浓度的亚叶酸补充培养基。标记有FOL3的曲线(FOL3 MET13)来自无亚叶酸的培养基中的生长。(b)用phMTHFR转化的fol3Δ::KanMXmet13Δ::KanMX二倍体酵母在缺乏甲硫氨酸和补充有指定浓度的亚叶酸的培养基中的生长。在各亚叶酸浓度上测试3个独立的转化体以测试重现性。标记有met13Δ的曲线代表在50μg/ml亚叶酸上生长的、用空载体转化的单个细胞分离株。
图2.非同义MTHFR群体变体的功能影响和叶酸可补救性(folate-remediability)。(a)在3个不同亚叶酸浓度上在缺乏甲硫氨酸的培养基中就拯救fol3Δ::KanMX met13Δ::KanMX细胞的能力测试6个MTHFR变体。只在50和25μg/ml亚叶酸上测试M110I等位基因和M110I A222V双置换等位基因。标记有“主要的”的曲线相应于群体中最常见的MTHFR等位基因。各曲线来自3至6个独立的转化体的库。(b)分成几乎相同大小的N端催化结构域和C端调节结构域的MTHFR蛋白(656个氨基酸)的示意图(35)。标示出所有非同义变化的位置。良性变化以绿色表示。编号为1至4的变化代表按严重度的递增顺序标示的叶酸可补救的等位基因。变化#5(R134C)几乎丧失功能并且不被称为叶酸可补救的(参见结果)，但其在一定程度上是叶酸可改善的(folate-augmentable)。
图3.MTHFR变体的酶活性。如本文中所述，制备来自用指定的MTHFR构建体转化的细胞的粗酵母提取物并且就MTHFR活性对其进行测定。在加入放射性标记的底物之前对反应物进行热处理，进行指定的时间。测量是两组独立的一式三份测定的平均值；误差棒是6个数据点的标准差。
图4.在酵母中重现的MTHFR变体的杂合子表型。如本文中所描述的，就主要的、R134C和A222V等位基因在二倍体酵母中重建MTHFR等位基因的纯合性或杂合性。通过将各自表达整合在基因组中的MTHFR的单个等位基因的单倍体菌株交配来获得二倍体。准确地测定作为亚叶酸补充的函数的生长，如对于单倍体的。
图5.酵母中表达的人MTHFR变体的免疫印迹。(a)如本文中所描述的，从携带不同MTHFR等位基因的酵母细胞制备提取物并且用抗HA抗体进行检测。A222V M110I是双置换的等位基因；“主要的”表示群体中最常见的MTHFR等位基因。最右边的两个泳道并排地是主要的等位基因和不可磷酸化的T34A等位基因(37)。(b)将本研究中鉴定的所有MTHFR变体的未磷酸化的下方条带对磷酸化的上方条带的信号强度的比作为不断增加的功能影响的严重度的函数作图。X轴上的等位基因被分类为良性的或按照活性进行排序。对所有良性等位基因(包括主要的等位基因和所有调节结构域变化)作图，其显示几乎相同的两种MTHFR的比，从而显示重叠的符号。
图6.两个人B6酶：CBS和CTH的B6(吡多辛)-反应性的测定。
发明详述
如上文中所指出的，本发明提供了用于鉴定代谢途径中的编码酶的基因的受损等位基因和测定它们对辅因子补救的敏感性的新型体内测定。复合酵母突变体提供了作为辅因子可获得性的函数的酶互补作用的研究，所述复合酵母突变体包含允许通过功能上同源的目的酶互补的第一突变和使得菌株依赖于辅因子的补充的第二突变(或突变群)。显著地，本发明还显示编码酶的基因的低频受损等位基因的辅因子补救令人惊讶地普遍，并且此类等位基因共同地可对代谢途径具有显著的影响。因此，本发明涉及诊断和预后方法，所述方法特别地聚焦于编码酶的基因的此类低频受损等位基因的检测和表征以及它们的有效补救的测定。
MTHFR的“N端催化结构域”是指人MTHFR的氨基酸1至359。参照人MTHFR mRNA序列见于Genbank登录号NM_005957，而编码的656个氨基酸的序列见于Genbank登录号NP_005958。
MTHFR功能障碍是指与野生型MTHFR活性的偏差。酶功能障碍以及相关的状况和疾病可由于例如酶的比活性的改变、酶的错误定位(mislocalization)、酶的水平的改变和其他改变而发生。
测量酶活性和其对辅因子的敏感性的体内测定
本文中提供的测定可用于测试编码酶的基因的等位基因补偿功能上同源的酵母基因中的突变的能力以及测量此类酶对辅因子的反应性。测定包括测量与酵母基因的正常功能相关且因其功能障碍而改变的输出或表型。
测定包括使用酵母菌株，所述酵母菌株包含允许通过功能上同源的目的酶互补的第一突变和使得菌株在与第一基因的功能相关的可测定的表型方面依赖于辅因子的补充的第二突变。
该方法包括(i)将编码酶的基因的受试等位基因引入酵母细胞，其中酵母细胞包含功能上与编码酶的基因同源的第一基因中的第一突变和使得酵母细胞依赖于酶功能所需的辅因子的补充的第二基因(或基因群)中的第二突变，其中第一突变改变与第一基因的功能相关的酵母的可测量的特征；(ii)给生长培养基补充辅因子；和(iii)检测与在野生型酶存在的情况下相比，在受试等位基因存在的情况下更少的可测量的特征的恢复，从而检测受试等位基因对第一基因突变的不完全互补作用和将受试等位基因鉴定为受损等位基因。通过改变补充的辅因子的量，测定受损等位基因对辅因子可获得性的敏感度。
在优选实施方案中，编码酶的基因的受试等位基因在序列上相应于天然发生的等位基因，或相应于个体天然发生的多态性的汇编。在优选实施方案中，受试等位基因在序列上相应于人基因的等位基因或相应于多个人等位基因的个体多态性的汇编。
在优选实施方案中，酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，“S.cerevisiae”)，虽然可使用其他种类的酵母。
在一个实施方案中，使用二倍体酵母。二倍体酵母对于受试等位基因可以是纯合的或杂合的。二倍体酵母可包含野生型基因和受试等位基因。二倍体酵母可包含受试等位基因的组合。如本文中所证明的，功能受损等位基因可包括具有杂合表型的等位基因。在一个实施方案中，二倍体酵母对于将就互补作用进行测试的等位基因是杂合的。在一个实施方案中，二倍体酵母包含编码酶的基因的野生型等位基因和受损等位基因。
在优选实施方案中，测定的测量的输出是生长。
在优选实施方案中，测定方法包括将目的受试等位基因的活性与相应的野生型等位基因的活性相比较。
在一个实施方案中，本发明提供了用于测定受试等位基因例如编码酶的基因的等位基因的活性的体内测定。在一个实施方案中，编码酶的基因参与或涉及叶酸/高半胱氨酸代谢。在另一个实施方案中，受试等位基因选自MTHFR等位基因、ATIC等位基因、GART等位基因、MAT1A等位基因、MAT2A等位基因和MTHFS等位基因，所述测定还能够测定作为叶酸状态的函数的活性。在另一个实施方案中，编码酶的等位基因选自CTH等位基因和CBS等位基因。
在一个实施方案中，受试等位基因是MTHFR等位基因，其包含N端催化结构域中的至少一个置换和C端调节区中的至少一个突变。虽然C端区域中的置换单独通常不削弱功能，但它们可与其他置换组合来在功能上损伤等位基因。
在优选实施方案中，第一突变存在于酵母基因met13中，其在功能上可被野生型人MTHFR互补。在另一个实施方案中，第一酵母基因是ade16或ade17，其在功能上可被野生型人ATIC互补。在一个实施方案中，第一酵母基因是ade7，其在功能上可被野生型人GART互补。在一个实施方案中，第一酵母基因是sam1或sam2，其在功能上可被野生型人MAT1A或野生型人MAT2A互补。在一个实施方案中，第一酵母基因是fau1，其在功能上可被野生型人MTHFS互补。
在优选实施方案中，第二突变存在于酵母基因fol3中，其使得酵母依赖于补充培养基中的叶酸。这样的酵母菌株可用于测定受试等位基因(该受试等位基因依赖于第一突变)的活性和其对叶酸状态的响应。例如，在酵母基因met1中具有第一突变且在酵母基因fol3中具有第二突变的复合酵母可用于测定MTHFR等位基因的活性和其对叶酸状态的响应。
在优选实施方案中，测试方法包括改变叶酸的量以确定由受试等位基因编码的酶是否对叶酸可获得性敏感。在优选实施方案中，测定方法包括在低于50μg/ml的叶酸存在的情况下测量输出。在优选实施方案中，测试方法包括在大约50μg/m1叶酸存在的情况下测量输出。在优选实施方案中，测定方法包括在高于50μg/ml的叶酸存在的情况下测量输出。
在一个实施方案中，改变叶酸以确定编码酶的基因的受损等位基因是否可被叶酸补救。
在另一个实施方案中，第一酵母基因是cys3并且第二酵母基因是六重缺失sno1Δsno2Δsno3Δsnz1Δsnz2Δsnz3Δ。这样的酵母菌株可用于测定CTH等位基因的活性和其对维生素B6状态的响应。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于测定CTH等位基因的活性的体内测定，其还能够测定作为维生素B6状态的函数的活性。在优选实施方案中，CTH等位基因包括天然发生的人等位基因。在另一个优选实施方案中，CTH等位基因包括个体人CTH等位基因的汇编。
在另一个实施方案中，第一酵母基因是cys4并且第二酵母基因是六重缺失sno1Δsno2Δsno3Δsnz1Δsnz2Δsnz3Δ。这样的酵母菌株可用于测定CBS等位基因的活性和其对维生素B6状态的敏感性。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于测定CBS等位基因的活性的体内测定，其还能够测定作为维生素B6状态的函数的活性。在优选实施方案中，CBS等位基因包括天然发生的人等位基因。在另一个优选实施方案中，CBS等位基因包括个体人CBS等位基因的汇编。
下面的表1列出了编码酶的基因并且提供了可用于测定编码酶的基因的等位基因的活性的示例性复合酵母突变。
  HGNC   酵母筛选菌株背景
  ATIC   fol3 ade16 ade17
  CBS   sno/snz1 sno/snz2 sno/snz3 cys4
  GTH   sno/snz1 sno/snz2 sno/snz3 cys3
  GART   fol3 ade8
  MAT1A   fol3 sam1 sam2
  MAT2A   fol3 sam1 sam2
  MTHFR   fol3 met13
  MTHFS   fol3 fau1
可通过本领域内熟知的方法产生酵母菌株。例如，参见Shan等人，JBC，274：32613-32618，1999。
可使用本领域内熟知的方法将核酸引入酵母菌株。例如，参见Shan等人，JBC，274：32613-32618，1999。
编码酶的基因的新型等位基因
如实施例部分中所描述的，精细地影响酶(例如导致编码酶的基因的受损等位基因)的单核苷酸多态性可使用本文中公开的体内测定来表征而不论等位基因的频率。例如，本文中公开的方法用于确定等位基因是否是受损等位基因，并且如果是，那么受损等位基因是否是辅因子可补救的。表3和表A-F中提供的是已表征的(表3)或可通过本文中描述的测定表征的(表A-F)的编码酶的基因MTHFR、ATIC、MTHFS、MAT1A、MAT2A和GART的单核苷酸多态性。这些表还提供了这些基因的之前未曾被鉴定的SNP。因此，本文中公开的是选自MTHFR、ATIC、MTHFS、MAT1A、MAT2A和GART的编码酶的基因的新型等位基因。这些等位基因可使用本文中公开的测定来表征，并且可以有利地在本文中公开的筛查、预防和治疗的方法中进行检测。本领域技术人员将理解和认识到，将受损等位基因表征为辅因子可补救的为本文中公开的筛查、预防和治疗方法提供了信息。
如本文中所使用的，“等位基因”是以多于一种的形式存在于基因组中的核苷酸序列，例如单核苷酸多态性(SNP)。本文中使用的“等位基因”不限于天然发生的基因组基因座的序列。“等位基因”包括转录物和来源于其的剪接序列(例如，mRNA序列、cDNA序列)。“等位基因”可以是天然发生的等位基因或合成的等位基因。此类等位基因可包含N端催化结构域中的突变以及C端调节区中的突变。
“纯合的”，根据本发明，表示SNP或基因的两个拷贝在序列上与另一个等位基因相同。例如，对于编码酶的基因的野生型等位基因是纯合的受试者包含相同的至少两个拷贝的序列。这样的受试者对代谢途径中的辅因子依赖性酶缺陷不易感。
“杂合的”，如本文中所使用的，表示不同的两个拷贝的等位基因(例如一个拷贝的野生型等位基因和一个拷贝的变体等位基因(其可以是受损等位基因))存在于基因组中。具有这样的基因组的受试者是杂合的，并且可能对代谢疾病中的辅因子依赖性酶缺陷易感。“杂合的”还包括在其等位基因中具有两个不同的突变的受试者。
“受损等位基因”是指编码代谢酶的基因的功能上受损的等位基因，该功能缺损可以是或可以不是辅因子可补救的。
“受损等位基因突变”是指造成受损等位基因的功能缺损且在突变的位置上区分受损等位基因与野生型序列的特定核酸突变。通常，受损等位基因突变是单个密码子的非同义点突变。
“辅因子可补救的”是指改变的辅因子水平补偿受损代谢酶的功能缺损的能力。
辅因子的补充包括可转化成辅因子的辅因子前体的补充。
“辅因子”是指作为目的酶的直接辅因子的因子(例如，对于MTHFR、ATIC、GART、MAT1A、MAT2A和MTHFS，其为叶酸)以及作为目的酶的间接辅因子的因子。因此，辅因子可直接或间接影响酶功能。
本领域内已知的频率的量度包括“等位基因频率”，即群体中具有特定SNP的基因的分数。任何基因的等位基因频率应当总和为1。本领域内已知的频率的另一种量度是“杂合子频率”，即，群体中携带2个等位基因或两种形式的基因SNP(各从一个亲本继承)的个体的分数。备选地，对于基因的特定等位基因是纯合的个体的数目可以是有用的量度。利用Hardy-Weinberg等式(其提供了平衡时自由繁殖种群中等位基因频率、杂合子频率与纯合子频率之间的关系)来描述许多基因的等位基因频率、杂合子频率与纯合子频率之间的关系。大多数人变异基本上处于Hardy-Weinberg平衡中。如本文中所使用的，“低频等位基因”具有低于4％的等位基因频率。
本文中公开了参与或涉及叶酸/高半胱氨酸代谢的人编码酶的基因的新型等位基因。“叶酸/高半胱氨酸代谢”是指叶酸和/或高半胱氨酸的代谢。此类编码酶的基因包括MTHFR、ATIC、GART、MAT1A、MAT2A、MTHFS。表2中提供了参与或涉及叶酸/高半胱氨酸代谢的编码酶的基因的Hugo Gene Nomenclature Committee(HGNC)符号、GeneID、NCBI核苷酸登录号(NC_)、NCBI多肽登录号(NB_)和名称。
Figure BPA00001255218800201
在一个方面，本发明提供了在序列上相应于参与叶酸/高半胱氨酸代谢的新型人编码酶的等位基因的分离的核酸。例如，本发明提供了在序列上相应于选自MTHFR等位基因、ATIC等位基因、GART等位基因、MAT1A等位基因、MAT2A等位基因和MTHFS等位基因的编码酶的等位基因的分离的核酸，所述等位基因可以是或可以不是辅因子可补救的。此类新型等位基因包括低频等位基因。此类新型等位基因包括受损等位基因。
因此，本文中提供了在序列上相应于MTHFR基因的等位基因的分离的核酸，其中所述核酸包含在选自下列的核苷酸上发现的SNP：MTHFR基因的核苷酸4078；MTHFR基因的核苷酸4234；MTHFR基因的核苷酸5733；MTHFR基因的核苷酸5872；MTHFR基因的核苷酸6642；MTHFR基因的核苷酸6657；MTHFR基因的核苷酸6681；MTHFR基因的核苷酸6774；MTHFR基因的核苷酸10906；MTHFR基因的核苷酸11656；MTHFR基因的核苷酸11668；MTHFR基因的核苷酸11902；MTHFR基因的核苷酸12232；MTHFR基因的核苷酸2622；MTHFR基因的核苷酸12759；MTHFR基因的核苷酸13040；MTHFR基因的核苷酸14593；MTHFR基因的核苷酸14612；MTHFR基因的核苷酸14705；MTHFR基因的核苷酸13170；MTHFR基因的核苷酸116401和MTHFR基因的核苷酸116451。表A中提供了这些位点上的SNP的序列。
本文中还提供了在序列上相应于ATIC基因的等位基因的分离的核酸，其中所述核酸包含在选自下列的核苷酸上发现的SNP：ATIC基因的核苷酸1100；ATIC基因的核苷酸1114；ATIC基因的核苷酸1179；ATIC基因的核苷酸1244；ATIC基因的核苷酸1270；ATIC基因的核苷酸1288；ATIC基因的核苷酸1301；ATIC基因的核苷酸1380；ATIC基因的核苷酸1396；ATIC基因的核苷酸1453；ATIC基因的核苷酸1506；ATIC基因的核苷酸1689；ATIC基因的核苷酸7227；ATIC基因的核苷酸7232；ATIC基因的核苷酸7388；ATIC基因的核苷酸8756；ATIC基因的核苷酸8808；ATIC基因的核苷酸14099；ATIC基因的核苷酸14140；ATIC基因的核苷酸14144；ATIC基因的核苷酸14183；ATIC基因的核苷酸14229；ATIC基因的核苷酸14238；ATIC基因的核苷酸14245；ATIC基因的核苷酸14260；ATIC基因的核苷酸14489；ATIC基因的核苷酸14970；ATIC基因的核苷酸15003；ATIC基因的核苷酸15040；ATIC基因的核苷酸15043；ATIC基因的核苷酸15149；ATIC基因的核苷酸15240；ATIC基因的核苷酸15844；ATIC基因的核苷酸16063；ATIC基因的核苷酸21363；ATIC基因的核苷酸21372；ATIC基因的核苷酸21400；ATIC基因的核苷酸21521；ATIC基因的核苷酸21611；ATIC基因的核苷酸22187；ATIC基因的核苷酸22273；ATIC基因的核苷酸22282；ATIC基因的核苷酸22291；ATIC基因的核苷酸22342；ATIC基因的核苷酸22512；ATIC基因的核苷酸22519；ATIC基因的核苷酸22538；ATIC基因的核苷酸22564；ATIC基因的核苷酸22589；ATIC基因的核苷酸22737；ATIC基因的核苷酸24992；ATIC基因的核苷酸25009；ATIC基因的核苷酸27757；ATIC基因的核苷酸27855；ATIC基因的核苷酸27985；ATIC基因的核苷酸28015；ATIC基因的核苷酸33901；ATIC基因的核苷酸33919；ATIC基因的核苷酸33920；ATIC基因的核苷酸33933；ATIC基因的核苷酸35723；ATIC基因的核苷酸35737；ATIC基因的核苷酸35742；ATIC基因的核苷酸35840；ATIC基因的核苷酸35917；ATIC基因的核苷酸35968；ATIC基因的核苷酸35973；ATIC基因的核苷酸38338；ATIC基因的核苷酸38342；ATIC基因的核苷酸38437；ATIC基因的核苷酸38342；ATIC基因的核苷酸38582；ATIC基因的核苷酸38627；ATIC基因的核苷酸38667和ATIC基因的核苷酸38725。表B中提供了在这些位点上的SNP的序列。
本文中还提供了在序列上相应于MTHFS基因的等位基因的分离的核酸，其中所述核酸包含在选自下列的核苷酸上发现的SNP：MTHFS基因的核苷酸8808；MTHFS基因的核苷酸8912；MTHFS基因的核苷酸8957；MTHFS基因的核苷酸8998；MTHFS基因的核苷酸52560；MTHFS基因的核苷酸52878和MTHFS基因的核苷酸52902。表C中提供了在这些位点上的SNP的序列。
本文中还提供了在序列上相应于MAT1A基因的等位基因的分离的核酸，其中所述核酸包含在选自下列的核苷酸上发现的SNP：MAT1A基因的核苷酸5045；MAT1A基因的核苷酸5181；MAT1A基因的核苷酸5233；MAT1A基因的核苷酸6739；MAT1A基因的核苷酸6795；MAT1A基因的核苷酸9833；MAT1A基因的核苷酸10006；MAT1A基因的核苷酸10312；MAT1A基因的核苷酸10339；MAT1A基因的核苷酸10374；MAT1A基因的核苷酸10484；MAT1A基因的核苷酸10555；MAT1A基因的核苷酸14038；MAT1A基因的核苷酸14114；MAT1A基因的核苷酸14177；MAT1A基因的核苷酸15424；MAT1A基因的核苷酸15500；MAT1A基因的核苷酸15646；MAT1A基因的核苷酸15706；MAT1A基因的核苷酸15715；MAT1A基因的核苷酸15730；MAT1A基因的核苷酸15758；MAT1A基因的核苷酸16133；MAT1A基因的核苷酸16174；MAT1A基因的核苷酸15706；MAT1A基因的核苷酸15715；MAT1A基因的核苷酸15730；MAT1A基因的核苷酸15758；MAT1A基因的核苷酸16133；MAT1A基因的核苷酸16174；MAT1A基因的核苷酸16218和MAT1A基因的核苷酸16971。表D中提供了在这些位点上的SNP的序列。
本文中还提供了在序列上相应于MAT2A基因的等位基因的分离的核酸，其中所述核酸包含在选自下列的核苷酸上发现的SNP：MAT2A基因的核苷酸2871；MAT2A基因的核苷酸2873；MAT2A基因的核苷酸2939；MAT2A基因的核苷酸3287；MAT2A基因的核苷酸3394；MAT2A基因的核苷酸3466；MAT2A基因的核苷酸3498；MAT2A基因的核苷酸3650；MAT2A基因的核苷酸3704；MAT2A基因的核苷酸4174；MAT2A基因的核苷酸4449；MAT2A基因的核苷酸4476；MAT2A基因的核苷酸4608；MAT2A基因的核苷酸4660；MAT2A基因的核苷酸4692；MAT2A基因的核苷酸4931；MAT2A基因的核苷酸5313；MAT2A基因的核苷酸5460；和MAT2A基因的核苷酸5480。表E中提供了在这些位点上的SNP的序列。
本文中还提供了在序列上相应于GART基因的等位基因的分离的核酸，其中所述核酸包含在GART基因中选自下列的核苷酸上发现的SNP：GART基因的核苷酸3782；GART基因的核苷酸3842；GART基因的核苷酸7745；GART基因的核苷酸7984；GART基因的核苷酸10775；GART基因的核苷酸11521；GART基因的核苷酸11522；GART基因的核苷酸11541；GART基因的核苷酸12356；GART基因的核苷酸14200；GART基因的核苷酸14273；GART基因的核苷酸14282；GART基因的核苷酸14739；GART基因的核苷酸14781；GART基因的核苷酸18055；GART基因的核苷酸18064；GART基因的核苷酸18130；GART基因的核苷酸18142；GART基因的核苷酸18197；GART基因的核苷酸18232；GART基因的核苷酸18401；GART基因的核苷酸20812；GART基因的核苷酸20825；GART基因的核苷酸16174；GART基因的核苷酸15706；GART基因的核苷酸20862；GART基因的核苷酸22481；GART基因的核苷酸22521；GART基因的核苷酸25425；GART基因的核苷酸25433；GART基因的核苷酸25601；GART基因的核苷酸25867；GART基因的核苷酸25912；GART基因的核苷酸25951；GART基因的核苷酸25956；GART基因的核苷酸26127；GART基因的核苷酸26195；GART基因的核苷酸31627；GART基因的核苷酸31641；GART基因的核苷酸31887；GART基因的核苷酸31902；GART基因的核苷酸31933；GART基因的核苷酸33173；GART基因的核苷酸33264；GART基因的核苷酸31933；GART基因的核苷酸33173；GART基因的核苷酸33264；GART基因的核苷酸33286；GART基因的核苷酸36963；GART基因的核苷酸36964；GART基因的核苷酸37428；GART基因的核苷酸37433；GART基因的核苷酸38762；GART基因的核苷酸38914和GART基因的核苷酸38989。表F中提供了在这些位点上的SNP的序列。
在一个实施方案中，本发明提供了在序列上相应于人MTHFR等位基因的分离的核酸，所述等位基因包含编码选自M110I、H213R、D223N、D291N、R519C、R519L和Q648P的MTHFR蛋白的非同义突变的序列。在一个实施方案中，本发明提供了在序列上相应于两个或更多个人MTHFR等位基因的核酸，所述等位基因包含编码选自M110I，H213R，D223N，D291N，R519C，R519L和Q648P的MTHFR蛋白的非同义突变的序列。
术语“分离的”，如本文中所使用的，包括基本上不含与其天然结合的其他核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或其他物质的多核苷酸。本发明的多核苷酸序列包括DNA和RNA序列。
本文中提供的核酸可在本文中公开的检测方法中用作探针(例如，等位基因特异性寡核苷酸探针)或引物。用于该目的适当的探针或引物的设计需要考虑许多因素。例如，长度在10、15或18个核苷酸至大约20或至大约30个核苷酸之间的片段将特别有用。更长的序列，例如40、50、80、90、100个核苷酸，甚至达到全长，对于某些实施方案甚至是更优选的。至少大约18至20个核苷酸的寡核苷酸长度完全为本领域技术人员所接受，因为其足以允许充分特异性的杂交，从而可用作等位基因特异性寡核苷酸探针。此外，取决于预期的应用，人们将期望使用不同的杂交条件来获得不同程度的探针对靶序列的选择性。对于需要高选择性的应用，人们通常期望使用相对严格的条件来形成杂交物。例如，相对低的盐和/或相对高的温度的条件，例如由0.02M-0.15M NaCl在大约50℃至大约70℃的温度下提供的条件。此类选择性条件可耐受探针与模板或靶多核苷酸片段之间的极少的(如果有的话)错配。
还提供的是包含本发明的核酸的载体。此类载体包括在适当的宿主细胞中提供本发明的核酸的表达的表达载体。
此外还提供的是包含本发明的核酸的宿主细胞。还提供的是包含本发明的载体的宿主细胞。本发明还提供了产生由本发明的核酸编码的酶的方法，该方法包括培养本发明的宿主细胞。
还提供的是由本发明的核酸编码的分离的酶。
受损等位基因的检测
本文中公开的方法(例如，筛查、预防和/或治疗与参与代谢途径的基因的受损等位基因相关的状况或疾病的方法)通常需要检测多个单核苷酸多态性(SNP)在代谢途径中的至少一个编码酶的基因中的存在或不存在，所述单核苷酸多态性可导致受损等位基因；优选多个已知的SNP在受试基因中的存在或不存在。等位基因和/或预先确定的序列SNP可通过等位基因特异性杂交(允许区分正常与受损等位基因的基于序列依赖性的技术)来检测。等位基因特异性测定依赖于与匹配的(例如，正常：正常或受损的：受损的)序列相比较，错配核苷酸序列(例如，正常：受损的)彼此杂交的差异能力。
用于检测一个或多个单核苷酸多态性在个体中的存在的多个方法是可获得的。该领域中的进步已提供了准确、容易且便宜的大规模SNP基因分型。最近，例如，已描述了几种新的技术，包括动态等位基因特异性杂交(dynamic allele-specific hybridization，DASH)、微板阵列斜凝胶电泳(microplate array diagonal gel electrophoresis，MADGE)、焦磷酸测序、寡核苷酸特异性连接、TaqMan系统以及各种DNA“芯片”技术例如Affymetrix SNP芯片。这些方法可能需要受试基因的扩增(通常利用PCR进行)。然而基于小信号分子的产生(通过侵入性切割，然后利用质谱法或固定的锁式探针(padlock probe)和滚环扩增)的其他新近开发的方法可能最终消除对PCR的需要。下面概述了本领域内已知的用于检测特定单核苷酸多态性的几个方法。应理解本发明的方法包括所有可获得的方法。
已开发了几个方法来促进单核苷酸多态性的分析。在一个实施方案中，可通过使用专门的抗核酸外切酶的核苷酸来检测单碱基多态性，如例如在Mundy，C.R.(美国专利4,656,127)中公开的。根据所述方法，与紧邻等位基因的3′的等位基因序列互补的引物允许与从特定动物或人获得的靶分子杂交。如果靶分子上的等位基因包含与存在的特定抗核酸外切酶的核苷酸衍生物互补的核苷酸，那么该衍生物将被整合入已杂交的引物的末端。这样的整合使得引物抗核酸外切酶，从而允许其被检测。因为样品的抗核酸外切酶的衍生物的身份(identity)是已知的，因此引物变得抗核酸外切酶的发现揭示，存在于靶分子的等位基因中的核苷酸与反应中使用的核苷酸衍生物互补。该方法具有有利方面：其不需要测定大量的无关序列数据。
在本发明的另一个实施方案中，基于溶液的方法用于确定等位基因的核苷酸的身份。Cohen，D.等人(法国专利2,650,840；PCT申请WO91/02087)。如美国专利4,656,127的Mundy法中的一样，使用与紧邻多态性位点的3′的等位基因序列互补的引物。该方法通过使用标记的双脱氧核苷酸衍生物来确定该位点的核苷酸的身份，所述双脱氧核苷酸衍生物，如果与等位基因的核苷酸互补，将被整合入引物的末端。
称为Genetic Bit Analysis或GBATM的备选方法由Goelet，P.等人(PCT申请案92/15712)描述。Goelet，P.等人的方法使用与等位基因的3′的序列互补的引物和标记的终止子(terminator)的混合物。因此被整合的标记的终止子可通过存在于测试基因的等位基因中的核苷酸来确定，并且其与所述核苷酸互补。与Cohen等人的方法(法国专利2,650,840；PCT申请案WO91/02087)相反，Goelet，P.等人的方法优选是非均相测定，其中引物或靶分子被固定至固相。
最近，已描述了几个用于测定DNA中的等位基因的引物指导的核苷酸整合法(Komher，J.S.等人，Nucl.Acids.Res.17：7779-7784(1989)；Sokolov，B.P.，Nucl.Acids Res.18：3671(1990)；Syvanen，A.-C.，等人，Genomics 8：684-692(1990)；Kuppuswamy，M.N.等人，ProG.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88：1143-1147(1991)；Prezant，T.R.等人，Hum.Mutat.1：159-164(1992)；Ugozzoli，L.等人，GATA 9：107-112(1992)；Nyren，P.等人，Anal.Biochem.208：171-175(1993))。此类方法与GBATM的不同在于它们全都依赖于标记的脱氧核苷酸的整合来区分等位基因上的碱基。在这样的形式中，因为信号与整合的脱氧核苷酸的数目成比例，所以在相同核苷酸轮次中发生的单核苷酸多态性可导致与轮次的长度成比例的信号(Syvanen，A.-C.，等人，Amer.J.Hum.Genet.52：46-59(1993))。
所有细胞类型或组织可用于获得用于本文中描述的诊断的核酸样品。在优选实施方案中，从体液，例如通过已知的技术(例如静脉穿刺术)获得的血液或唾液获得DNA样品。备选地，可对干样品(例如头发或皮肤)进行核酸测试。当使用RNA或蛋白质时，可使用的细胞或组织必须表达编码酶的基因。
还可直接在通过活组织检查或切除术获得的患者组织的组织切片(固定的和/或冷冻的)上原位进行检测方法，以便不必进行核酸纯化。核酸试剂可用作用于此类原位方法的探针和/或引物(参见，例如，Nuovo，G.J.，1992，PCR in situ hybridization：protocols and applications，Raven Press，NY)。
除了主要聚焦在一个核酸序列的检测上的方法外，还可在这样的检测方案中评估特征谱。可以例如通过利用差异显示法、Northern分析和/或RT-PCR来产生指纹特征谱。
优选的检测法是使用与编码酶的基因的至少一个等位基因的区域重叠的探针进行的等位基因特异性杂交。
使用等位基因特异性杂交进行的受损等位基因的检测
可将本领域内已知的多个方法用于通过等位基因特异性杂交来检测受损等位基因。优选，使用等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探测受试等位基因；并且各ASO包含已知的等位基因的序列。ASO分析通过测试等位基因特异性寡核苷酸探针与靶多核苷酸片段杂交的能力来检测靶多核苷酸片段中特定的序列置换。优选，等位基因特异性寡核苷酸探针包含受损等位基因的序列(或其互补序列)。通过等位基因特异性寡核苷酸探针与靶多核苷酸片段之间的杂交(在其中包含野生型等位基因的序列的寡核苷酸探针不与靶多核苷酸片段杂交的条件下)来指示靶多核苷酸片段中受损等位基因的存在。具有受损等位基因的序列的等位基因特异性寡核苷酸探针与靶多核苷酸片段之间缺乏杂交表示在靶片段中不存在受损等位基因。
在一个实施方案中，可在标准斑点印迹格式中探测受试基因。单独地将包含相应于ASO的序列的受试基因内的各区域施加至固体表面，例如以单个的斑点施加在膜上。可以例如使用本领域内熟知的方法以分开的PCR扩增产物的形式产生各单独的区域(参见，例如，Mullis，K.B.，1987，美国专利4,683,202中所示的实验方案)。
可用作进行ASO分析的斑点印迹格式的另一选择的基于膜的格式包括但不限于反向斑点印迹(多重扩增测定)和多重等位基因特异性诊断测定(MASDA)。
在反向斑点印迹格式中，将例如具有已知序列的寡核苷酸或多核苷酸探针固定在固体表面，随后与包含标记的受试多核苷酸片段的样品杂交。在该情况下，可标记引物或可在扩增以制备包含标记的受试多核苷酸片段的样品之前标记NTP。备选地，可在分离和/或合成后标记受试多核苷酸片段。在多重格式中，个体样品包含受试基因内的多个靶序列而非只包含单个靶序列。例如，将各自包含至少一个ASO靶序列的多个PCR产物用于相同的样品点内。可使用Caskey等人，美国专利5,582,989的方法在单个扩增反应中同时产生多个PCR产物。因此，可利用其相应的序列存在于样品点中的各ASO探测相同的印迹。
MASDA格式通过使用多个ASO探测各印迹(包含具有多个靶序列的斑点)扩展了多重格式的复杂性水平。该方法详细地描述于属于A.P.Shuber的美国专利5,589,330和Michalowsky等人，American Journal of Human Genetics，59(4)：A272，poster 1573(1996年10月)中(其各自以其全文通过引用合并入本文)。首先，检测多个ASO探针与固定的样品之间的杂交。该方法依赖于预测：突变在给定的斑点中的多个靶序列中的存在十分罕见以至于任何阳性杂交信号都由与相应的受损等位基因杂交的探针混合物中的单个ASO产生。然后通过从杂交的位点分离其并且测定其核苷酸序列来鉴定杂交的ASO。
可用于斑点印迹、反向斑点印迹、多重和MASDA格式的合适材料在本领域内是熟知的并且包括但不限于尼龙和硝酸纤维素膜。
当通过PCR扩增产生靶序列时，起始材料可以是染色体DNA，在该情况下直接扩增DNA。备选地，起始材料可以是mRNA，在该情况下首先将mRNA逆转录成cDNA，然后按照熟知的RT-PCR技术(参见，例如，属于Gelfand等人的美国专利5,561,058)进行扩增。
上述方法适合于有限数目的序列变异(例如，受损等位基因)的适度筛查。然而，由于在分子诊断中需要快速、具有成本效益的大规模筛查，因此已开发了整合ASO的基本概念但远远超过样品数目和突变检测的能力的技术。上述方法的此类备选方法包括但不限于基于大规模芯片阵列测序的技术。大规模阵列的使用允许快速分析许多序列变体。芯片阵列的应用和发展中的差异的综述涵盖于Southern，E.M.，Trends In Genetics，12：110-115(March 1996)和Cheng等人，Molecular Diagnosis，1：183-200(September 1996)。存在涉及芯片阵列的制造的几个方法。差异包括但不限于：连接固定的寡核苷酸的固体支持物的类型、用于鉴定变体的标记技术和靶多核苷酸对探针的基于序列的技术中的变化。
用于在‘DNA芯片’上进行大规模分析的具有前景的方法详细地描述于Hacia等人，Nature Genetics，14：441-447(1996)中，其以其全文通过引用合并入本文。如Hacia等人中描述的，通过使用光指导的化学合成，将96,000多个各自长度为20个核苷酸的寡核苷酸的高密度阵列固定至单个玻璃或硅芯片。取决于等位基因特异性寡核苷酸探针的数目和设计，潜在地可就变化质询序列中的每一个碱基。因此，用于芯片的等位基因特异性寡核苷酸探针可包含在群体中发生的仍然未知的序列变异例如SNP，或可将它们限定于已知在群体中发生的SNP。
在与芯片上的等位基因特异性寡核苷酸探针杂交之前，通过本领域内技术人员熟知的方法分离、扩增和标记(例如荧光标记)受试样品。然后将受试多核苷酸样品与固定的等位基因特异性寡核苷酸探针杂交。定量靶多核苷酸片段对固定的等位基因特异性寡核苷酸探针的基于序列的技术的强度并且将其与参照序列进行比较。所得的基因信息可用于分子诊断。‘DNA芯片’在分子诊断中的常见但非限定性用途是筛查已知的SNP。然而，这可因只观察本领域内已描述过的突变而对技术产生限制。本发明允许使用比之前可获得的多得多的突变进行等位基因特异性杂交分析。因此，通过不仅使用已知的突变而且还以全面的方式使用可能发生的所有突变(如通过接受的原理预测的)，大规模ASO分析的效率和全面性将得到扩展，从而减少对繁重的端对端(end-to-end)序列分析的需要，并且减少与此类繁重的测试相关的费用和时间。
因此，在一个方面，本发明提供了用于检测编码酶的核酸或编码酶的基因的受损等位基因的方法。例如，本文中提供的是用于检测MTHFR、ATIC、CBS、CTH、GART、MAT1A、MAT2A和MTHFS的等位基因的方法。
在一个实施方案中，检测编码酶的核酸中的SNP包括核酸测序。在一个实施方案中，检测编码酶的核酸中的突变包括PCR。在一个实施方案中，检测编码酶的核酸中的突变包括RFLP分析。在一个实施方案中，检测编码酶的核酸中的突变包括核酸杂交。可以例如使用核酸阵列通过杂交检测突变SNP，所述核酸阵列包含在严格条件下与包含这样的SNP的编码酶的核酸或其片段杂交的核酸。
在一个实施方案中，该方法包括使用本文中描述的测定编码酶的基因的等位基因的活性的体内测定。
还可将方法的组合用于检测和表征编码酶的基因的受损等位基因。在一个实施方案中，该方法包括使用本文中描述的用于测定编码酶的基因的活性和检测编码酶的核酸中的SNP的体内测定。
在一个实施方案中，该方法包括使用本文中描述的用于测定酶活性的体内测定和用于测定在升高的温度下的酶稳定性的温度敏感度测定。
在一个实施方案中，该方法包括使用本文中描述的用于测定酶活性的体内测定和用于测定酶的比活性的体外测定。
在优选实施方案中，MTHFR的受损等位基因包含编码选自M110I、H213R、D223N、D291N、R519C、R519L和Q648P的MTHFR蛋白的突变的非同义置换。在特别的优选实施方案中，受损等位基因包含编码选自M110I、H213R、D223N和D291N的MTHFR蛋白的突变的非同义置换。
酵母菌株
在一个方面，本发明提供了能够检测参与叶酸/高半胱氨酸代谢的酶的受损等位基因的酵母菌株。此类酵母菌株可用于本文中公开的方法。酵母菌株包含允许通过功能同源的目的酶来互补的第一突变，和使得菌株在与第一基因的功能相关的可测定的表型方面依赖于辅因子的补充的第二突变(或突变群)。
在一个实施方案中，本发明提供了能够检测CTH的受损等位基因和测定其对维生素B6的反应性的酵母菌株。在优选实施方案中，酵母菌株包含cys3中和六重缺失sno1Δsno2Δsno3Δsnz1Δsnz2Δsnz3Δ中的突变。
在一个实施方案中，本发明提供了能够检测CBS的受损等位基因和测定其对维生素B6的反应性的酵母菌株。在优选实施方案中，酵母菌株包含cys4中和六重缺失sno1Δsno2Δsno3Δsnz1Δsnz2Δsnz3Δ中的突变。
在一个实施方案中，本发明提供了能够检测MTHFR的受损等位基因和测定其对叶酸的反应性的酵母菌株。在优选实施方案中，酵母菌株包含met13和fol3中的突变。
筛查疾病的风险
在一个方面，本发明提供了筛查与异常叶酸/高半胱氨酸代谢相关的状况或疾病的风险的方法。该方法包括筛查参与叶酸/高半胱氨酸代谢的基因的受损等位基因，如本文中所描述的。
在一个实施方案中，本发明提供了筛查与酶功能障碍相关的疾病或状况的风险的方法，其中所述酶选自MTHFR、ATIC、MTHFS、MAT1A、MAT2A和GART。在优选实施方案中，疾病或状况选自心血管疾病、冠状动脉疾病、缺血性中风、动脉粥样硬化、神经管缺陷、口面裂、先兆子痫、早产/低出生体重、反复早期自发性流产、血栓形成、视网膜动脉闭塞、唐氏综合征、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、抑郁症、精神分裂症、阿尔茨海默病/痴呆、年龄相关性黄斑变性和青光眼。该方法包括使用本文中描述的用于检测选自MTHFR的受损等位基因、ATIC的受损等位基因、MTHFS的受损等位基因、MAT1A的受损等位基因、MAT2A的受损等位基因和GART的受损等位基因的受损等位基因的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了筛查与CBS功能障碍相关的疾病或状况的风险的方法。在优选实施方案中，疾病或状况选自心血管疾病、冠状动脉疾病、缺血性中风、动脉粥样硬化、神经管缺陷、口面裂、先兆子痫、早产/低出生体重、反复早期自发性流产、血栓形成、视网膜动脉闭塞、唐氏综合征、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、抑郁症、精神分裂症、阿尔茨海默病/痴呆、年龄相关性黄斑变性和青光眼。该方法包括使用本文中描述的用于检测受损CBS等位基因的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了筛查与CTH功能障碍相关的疾病或状况的风险的方法。在优选实施方案中，疾病或状况选自心血管疾病、冠状动脉疾病、缺血性中风、动脉粥样硬化、神经管缺陷、口面裂、先兆子痫、早产/低出生体重、反复早期自发性流产、血栓形成、视网膜动脉闭塞、唐氏综合征、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、抑郁症、精神分裂症、阿尔茨海默病/痴呆、年龄相关性黄斑变性和青光眼。该方法包括使用本文中描述的用于检测受损CTH等位基因的方法。
筛查化疗剂响应潜能
在一个方面，本发明提供了测定个体的化疗剂响应潜能的方法。该方法包括使用本文中描述的用于检测参与叶酸/高半胱氨酸代谢的基因的受损等位基因的方法。在优选实施方案中，基因选自MTHFR、ATIC、MTHFS、MAT1A、MAT2A和GART。在个体中检测到受损等位基因表示减少的响应潜能。
在优选实施方案中，化疗剂是甲氨蝶呤或5-氟尿嘧啶。
筛查化疗剂毒性
在一个方面，本发明提供了测定化疗剂对个体的毒性的方法。该方法包括使用本文中描述的用于检测参与叶酸/高半胱氨酸代谢的基因的受损等位基因的方法。在优选实施方案中，基因选自MTHFR、ATIC、MTHFS、MAT1A、MAT2A和GART。在个体中检测到受损等位基因表示增加的毒性可能性。
在优选实施方案中，化疗剂是甲氨蝶呤或5-氟尿嘧啶。
预防和治疗
在一个方面，本发明提供了预防与代谢酶缺陷相关的状况或疾病的方法。该方法包括基于从上述测定和方法获得的信息(所述信息报告了辅因子敏感性受损等位基因的存在)增加个体对辅因子的摄取。在优选实施方案中，该方法包括检测代谢基因的辅因子可补救的受损等位基因，如本文中所描述的。
在一个实施方案中，本发明提供了预防与异常叶酸/高半胱氨酸代谢相关的状况或疾病的方法。该方法包括增加个体对叶酸和/或维生素B6的摄取。在优选实施方案中，该方法包括检测参与叶酸/高半胱氨酸代谢的基因的受损等位基因，如本文中所描述的。
在一个实施方案中，本发明提供了预防个体中与酶功能障碍相关的状况或疾病的方法，所述个体具有辅因子可补救的编码酶的基因的受损等位基因，其中编码酶的基因选自MTHFR、ATIC、MTHFS、MAT1A、MAT2A和GART。该方法包括增加个体对叶酸的摄取。
在一个实施方案中，本发明提供了预防具有受损CBS等位基因的个体中与CBS功能障碍相关的状况或疾病的方法。该方法包括增加个体对维生素B6的摄取。
在一个实施方案中，本发明提供了预防具有受损CTH等位基因的个体中与CTH功能障碍相关的状况或疾病的方法。该方法包括增加个体对维生素B6的摄取。
在一个方面，本发明提供了治疗与异常叶酸/高半胱氨酸代谢相关的状况或疾病的方法。该方法包括增加个体对叶酸和/或维生素B6的摄取。在优选实施方案中，该方法包括检测参与叶酸/高半胱氨酸代谢的基因的受损等位基因，如本文中所描述的。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗个体中与酶功能障碍相关的状况或疾病的方法，所述个体具有辅因子可补救的编码酶的基因的受损等位基因，其中编码酶的基因选自可由辅因子补救的MTHFR、ATIC、MTHFS、MAT1A、MAT2A和GART。该方法包括增加个体对叶酸的摄取。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗具有受损CBS等位基因的个体的与CBS功能障碍相关的状况或疾病的方法。该方法包括增加个体对维生素B6的摄取。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗具有受损CTH等位基因的个体的与CTH功能障碍相关的状况或疾病的方法。该方法包括增加个体对维生素B6的摄取。
实施例
实施例1：叶酸可补救的MTHFR酶变体在人中的普遍性
来自大群体的叶酸可补救的MTHFR酶变体的普遍性用于测定低频变异的发生率和影响以及探索维生素补救的现象。从500多个个体鉴定到14个不同的非同义置换，其中的5个削弱了酶的功能。所有有害的等位基因至少在一定程度上是叶酸反应性的，可通过提高细胞内叶酸水平使5个突变蛋白质中的4个完全恢复至正常水平。
实施例1.1：方法
DNA样品群体。DNA样品来自Coriell Institute Cell Repository(Camden，New Jersey，USA)。
MTHFR外显子测序。使用可从Variant SeqR product line(Applied Biosystems，Foster City，CA)商购获得的引物对并且按照提供的方案通过PCR测序测定所述样品中的11个MTHFR编码外显子的序列。进行测序的外显子区域相应于mRNA的NCBI MTHFR参照序列(NM_005957)和656个氨基酸的相应蛋白质(NP_005958)。对于下列靶扩增子，可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/probe上获得测序扩增子和探针信息：
外显子1(RSA000045684)；外显子2(RSA000045680)；外显子3(RSA000577249)；外显子4(RSA000045678)；外显子5(RSA000045676)；外显子6(RSA001308795)；外显子7(RSA001253193)；外显子8(RSA000045669)；外显子9(RSA000580767)；外显子10(RSA000580766)；外显子11(RSA000580765，RSA000027240)。只测定横跨编码区的外显子11的部分的序列。为了确保碱基判定(base-calling)的高置信度，只将高质量的读取用于分析(对于横跨靶外显子的区域，平均QV评分＞40；所有外显子由双链读取涵盖)。基于这些滤过标准，对于每一个外显子，成功率在89.9％至95％的范围内(参见表I)。使用SeqScape软件组(Applied Biosystems)分析所有序列信息。3作为质量控制量度，利用TaqMan(Applied Biosystems)等位基因鉴别测定直接验证一个亚组的碱基判定，并且如下所述将其与公众可获得的基因型数据相比较。
质粒。携带在诱导型酵母GAL1启动子控制下的5′-末端HA(血凝素A)表位标记的人MTHFR开放阅读框架(参照蛋白质序列NP_005948)和URA3选择标记的质粒phMTHFR是Warren Kruger的慷慨赠礼(Shan等人，1999，同上)。该质粒用作主链来通过使用QuikChange试剂盒(Stratagene)通过定点诱变重建所有MTHFR变体。通过将来自基于phMTHFR的质粒的包含URA3、GAL1启动子和MTHFR编码区的片段PCR克隆入pHO-poly-HO来产生包含半乳糖诱导型MTHFR变体的整合质粒(Voth等人，2001，Nucleic Acids Res.29：e59)，所述整合质粒使得该盒能够靶向整合在HO基因座上。
菌株。所有单倍体酵母菌株是S288c背景中的MATa his3 leu2 ura3lys2(Brachman等人，1998，Yest 14：115-32)。通过将同基因MATa与MATα菌株交配来产生MATa/MATα二倍体菌株。使用来自酿酒酵母基因敲除集合(Invitrogen)的菌株，利用标准交配/芽孢形成技术获得fol3Δ::KanMX和fol3Δ::KanMXmet13Δ::KanMX菌株。通过交配各自包含GAL1：MTHFR变体盒的整合形式的fol3Δ::KanMXmet13Δ::KanMX单倍体来产生二倍体(对于MTHFR变体是纯合的或杂合的)。
生长条件。缺乏叶酸的合成生长培养基是具有Yeast Nitrogen Base without Vitamins(Qbiogene)并且单独地加回除了叶酸外的所有维生素的基本培养基(Sherman，2002，Genetics & Molecular Biol.，eds.Guthrie and Fink(Academic，New York)，pp.3-41)。给所有fol3Δ::KanMX细胞补充50μg/ml亚叶酸(Sigma)。为了进行动力学生长测量，用GAL1启动子驱动的MTHFR变体转化fol3Δ::KanMXmet13Δ::KanMX细胞，然后将其在补充有亚叶酸(50μg/ml)和甲硫氨酸(20μg/ml)的合成半乳糖培养基(2％半乳糖，0.1％葡萄糖)中培养至对数期。清洗细胞3次，将其等分入装有具有不同量的亚叶酸但缺乏甲硫氨酸的新鲜半乳糖培养基的96孔板。每孔的体积为200μl，起始细胞的密度为OD595＝0.01。在无振荡的条件下于30℃下在Tecan GENios板阅读器中每15-30分钟描记吸光度，进行至少60小时。除了在甲硫氨酸不存在的情况下进行所有生长外，以相同的方式处理图1a中使用的MET13细胞。
MTHFR酶活性测定。测量在生理条件下由MTHFR催化的反应的逆反应的测定如所描述的(Shan等人，1999，同上)，且具有下列改进：通过在350μl裂解缓冲液(100mM蔗糖，50mM KHPO4(pH 6.3)，蛋白酶抑制剂混合物)中珠裂解40 OD595细胞等价物(如上补充了亚叶酸和甲硫氨酸的fol3 met13细胞)来产生酵母提取物。通过短暂离心澄清提取物，然后将10-200μg提取物用于确定活性的线性范围。放射性标记的底物(5-[14C]MeTHF)来自GE Healthcare Life Sciences。关于加热处理，将不含5-[14C]MeTHF的反应混合物加热至55℃，进行指定的时间，然后在该时间点上加回5-[14C]MeTHF，并进行反应。
MTHFR免疫印迹分析。在200μl 0.1M NaOH中提取10 OD595细胞等价物(如上补充了亚叶酸和甲硫氨酸的fol3Δ met13Δ细胞)，进行15分钟。向上清液中加入50μl SDS样品缓冲液(0.5M Tris 6.8，0.4％SDS)，然后将其煮沸，澄清，经历SDS-PAGE。在LI-COR红外成像仪上检测HA标记的MTHFR变体。小鼠单克隆抗HA抗体来自Sigma。使用由Jeremy Thorner(University of California，Berkeley，CA)慷慨赠予的小鼠抗体检测酵母3-磷酸甘油酸激酶(Pgklp)(上样对照)。
实施例1.2：结果
人中的MTHFR变体。通过扩增来自不同种族的564个个体的11个外显子的每一个中的编码部分来测定人MTHFR的完整编码区的序列。编码区的长度、质询的等位基因的数目和所有非同义置换列于表3中。总共分析了2,081,106bp的编码DNA和取样的每一个外显子(至超过1,000个等位基因的深度)。这些数据揭示了14个非同义改变，其中的11个显示＜1％的小等位基因频率(MAF)，7个等位基因只被观察到1次。一些低频等位基因是之前观察到的(参见表3)。低频非同义置换的数目与深入随机群体取样的其他研究非常相符(Martin等人，2006，Pharmacogenet Genomics 16：265-77；Livingston，2004，Genome Res14：1821-31；Glatt等人，2001，Nat.Genet.27：435-38)。此外，观察到3个已充分研究的常见置换展示预期的总群体频率(A222V-29.3％，E429A-23.6％，R594Q-4.4％)。
作为对碱基判定的准确性的质量控制检查，利用TaqMan等位基因鉴别测定在单独PCR扩增的100个样品中重新分析了8个变体(包括4个单碱基差异)，并且看到100％的数据一致性。此外，来自Environmental Genome Project(http://www.niehs.nih.gov/envgenom/)和Perlegen(Mountain View，CA)(这两者都使用与本研究中的一些样品重叠的Coriell样品(dbSNP build 127))的群体基因分型数据在817个基因型判定的814个(99.6％)中是一致的。对于3个不一致的基因座中的2个，我们的序列数据是明确的并且显示是正确的。
获得了480个个体的完整编码区序列。18个(4％)是低频非同义变体的载体。令人惊讶地，3个具有低频变化范围的常见多态性(A222V、E429A和R594Q)的组合导致大量的个体异质性(heterogeneity)。在其单倍体型(haplotype)在大多数情况下不能从数据推导得出的该组中观察到28个不同的非同义基因型。
MTHFR-叶酸体内相互作用。因为基因变体的临床意义在于它们的功能结果，因此就它们对MTHFR功能的影响和重要地受损等位基因是否展示叶酸反应性检测所有非同义改变。将叶酸营养缺陷型(fol3)引入met13菌株，从而允许通过改变培养基中的亚叶酸来滴定细胞内叶酸浓度。亚叶酸(5-甲酰基-四氢叶酸)可在酵母中被代谢成次甲基-四氢叶酸酯，其进一步可被转化成其他叶酸辅酶(Cherest等人(2000)J.Biol.Chem.275：14056-63)。这样，可将人MTHFR功能性(在甲硫氨酸不存在的情况下生长)测量为逐渐增强限制的细胞叶酸状态的函数。
在这些条件下，高于50μg/ml的亚叶酸补充不提供任何显著的生长优势(图1a)。然而，在低于50μg/ml的浓度上，生长明确地与培养基中可获得的亚叶酸相关。因此细胞内叶酸水平在该范围内是限制速率的。当与FOL3细胞的生长相比较时，亚叶酸补充不能完全补偿内源叶酸生物合成的缺乏。然而，该缺口在细胞进入静止期时所处的密度而非生长速率上最能够得到反映，这可能反映亚叶酸摄取的限制或亚叶酸作为唯一叶酸来源的利用的限制。
人MTHFR补偿fol3 met13细胞的能力是培养基中亚叶酸补充的函数(图1b)。关于叶酸补充，从GAL1启动子表达人MTHFR不能完全补偿Met 13p的丧失(比较图1b与图1a中相同的叶酸剂量下的fol3 MET13细胞)。因此，在低于50μg/ml的亚叶酸下，叶酸和MTHFR都限制生长速率，从而使得MTHFR活性的甚至精细的变化能够在生长读出中得到反映。注意，高于50μg/ml的亚叶酸补充不给表达内源酵母MTHFR(MET13；图1a)或主要的人等位基因(图1b)的细胞提供显著的生长优势，但对MTHFR的受损等位基因是有益的(参见下文)。
MTHFR变体的功能影响。在一系列叶酸浓度上测试的5个非同义等位基因举例说明了观察到的功能影响的范围(图2a)。在100μg/ml亚叶酸下A222V变体的功能几乎完全恢复，在四分之一水平的补充(25μg/ml)下存在显著更低的活性(相对于主要的等位基因)。因此，在这些条件下，重现了A222V缺陷的已知的叶酸可补救性。在这些条件下酵母中减少的叶酸的确切细胞内浓度是未知的。然而，A222V等位基因的行为有效地标定(calibrate)了酵母和人细胞中的细胞内浓度。A222V酶具有大约50％的常见等位基因的内在活性(Martin，2006，Pharmacogenet.Genomics 16：265-77；Rozen，1997，Thromb.Haemost.78：523-26)并且在50μg/ml叶酸补充下观察到50％的生长速率的降低。此外，观察到与在50μg/ml亚叶酸下生长的细胞相比较，无细胞测定中A222V酶活性的相同的50％的下降(图3，下文)。因此，A222V在酵母中的行为重现了其在人细胞中的行为。
以相同的方式测试4个低频等位基因(图2a)。R519C表现良好，因为生长在所有叶酸浓度下都不受影响。R134C在所有叶酸浓度下都是严重受损的，虽然活性在一定程度上是叶酸反应性的。D223N和M110I等位基因展示与A222V相似的叶酸可补救的活性(虽然受损较不严重)，因为在50μg/ml或高于50μg/ml亚叶酸下生长与主要的等位基因相似，但在低于50μg/ml亚叶酸下生长较差。
MTHFR酶具有N端催化结构域和C端调节结构域，其结合变构抑制剂S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet；Sumner等人，1986，J.Biol.Chem.261：7697-7700)。在位于催化结构域内的6个等位基因(M110I、R134C、H213R、A222V、D223N和D291N)中，只有H213R是良性的(图2b)。M110I、A222V、D223N和D291N展示叶酸可补救的行为，因为这些酶变体在较高的叶酸补充浓度(50-200μg/ml亚叶酸)下与主要的等位基因相似，但当叶酸变得更加限速时被大大削弱。R134C变体在任何水平的叶酸补充上从未达到主要的等位基因支持生长的能力，因此被分类为反应性但不可补救的等位基因。调节结构域内的所有置换(从G422R至T653M)的表现与主要的等位基因相似(图2b)。
氨基酸置换之间的协同相互作用。变体的分布暗示着含有两个(或更多个)置换的复合等位基因的存在。因此产生几个复合等位基因(基于它们在个体样品中的发生频率)来测试等位基因组合是否导致协同或抑制作用。对于与常见变体组合的A222V(A222V E429A和A222V R594Q)，对于至少一个等位基因观察到少量等位基因纯合子，从而确信存在这样的变体。然而，对于低频变体，A222V变体和新型变体都总是以杂合子的形式发生。因为单倍体型是未知的，因此这些个体可具有两个单置换等位基因或具有复合等位基因。因此产生所有可能的双置换等位基因并且测试它们的功能(例如M110I A222V，图2a)。在两个测试的亚叶酸浓度上，M110I A222V变体的功能比个体等位基因的和更差，这表明复合等位基因的协同缺陷。在50μg/ml的亚叶酸下，M110I变体几乎不能与主要的等位基因区分，然而其显著增强A222V缺陷。对于所有测试的组合，单独地影响功能的等位基因(M110I和D291N)，当与A222V组合时协同作用，然而良性变化不增强A222V缺陷。
重现体内功能的生物化学测定。为了评估生长测定的可靠性，在粗酵母裂解物中对所有变体进行无细胞MTHFR酶测定(参见材料和方法)。除了测量比活性外，通过在55℃下热处理不同时间来就热稳定性(酶稳定性的量度)测试变体。内在活性与生长速率之间存在良好的相关性(图3；利用图2中的生长曲线比较主要的MTHFR等位基因、A222V和R134C的无加热处理的样品的活性)。再次地，A222V变体展示大约50％的主要的等位基因的酶促活性，如之前所报导的(20，25，34)。如在生长测定中的一样，R519C变体展示与主要的等位基因相似的活性并且代表了调节结构域中的所有变化，包括常见的E429A变体(数据未显示)。虽然已报导E429A影响酶功能(27)，但我们的数据与该变化是良性的其他报道(10，20，25)相一致。
A222V突变体酶比主要的形式更不稳定和更不耐热(Guenther等人，1999，Nat.Struct.Biol.6：359-65；Yamada等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.98：14853-58)，从而该变体的叶酸补救据认为通过促进蛋白质的稳定而发生。在此处使用的条件(55℃，20m)下，A222V几乎丧失了所有活性，然而主要的等位基因保持大约30％的原始活性，这与之前的研究(20)相符。新型D223N等位基因还展示增加的热不稳定性，这可类似地解释在该情况下的叶酸可补救性，尽管酶缺陷不是那么大。
杂合子表型。因为低频等位基因通常作为杂合子发生，因此它们的重要性易于被忽略。为了更好地理解MTHFR等位基因的杂合性的功能意义，通过将各自具有从整合的表达盒表达的相同等位基因(纯合子)或不同等位基因(以产生杂合子)的单倍体菌株交配来产生具有两个拷贝的人MTHFR的二倍体酵母(参见方法)。如上所述，就生长(作为叶酸补充的函数)测试这些菌株(图4)。杂合子在该测定中展示生长表型，所述表型在限制叶酸的条件下恶化，这表明功能减弱的等位基因与野生型共显性。
在生长测定中测量的细胞MTHFR活性似乎反映了等位基因的累加效应。此外，使用半合子(具有单个整合的表达的等位基因的二倍体；数据未显示)的另外的实验显示，杂合子中主要的等位基因与次要的等位基因之间异二聚体的形成几乎不或不为突变等位基因提供拯救。例如，二倍体MTHFR主要的等位基因/裸细胞(null cell)(半合子)在所有条件下的表现与主要的等位基因/R134C杂合子相似，并且在低叶酸培养基中(其中A222V被灭活)与主要的等位基因/A222V杂合子相似。因此，杂合子细胞中有害的等位基因的表型贡献可容易地被观察到，从而提高了来自人基因组的杂合性的更广泛表型结果的可能性。
磷酸化对酵母中MTHFR变体的修饰。使用抗N末端血凝素A(HA)表位标签的抗体通过免疫印迹测定MTHFR变体蛋白的丰度(图5a)。在所有样品中，蛋白质以大约72kD和78kD的双联体形式进行电泳。该模式与对于昆虫细胞中表达的人MTHFR观察到的模式十分相似(37)，其中上方条带代表在N末端附近多磷酸化的MTHFR。昆虫细胞中MTHFR的磷酸化依赖于位点34上的苏氨酸残基并且该苏氨酸至丙氨酸的置换(T34A)导致不能够被磷酸化的酶(37)。该突变对酿酒酵母中表达的人MTHFR具有相同的作用并且表明，如在昆虫细胞中的一样，上方条带是磷酸化的MTHFR(图5a)。
已暗示，MTHFR的磷酸化的作用牵涉负调控(37)。本文观察到的磷酸化模式与细胞MTHFR活性直接相关，这支持了该假设。特别地，未磷酸化形式：磷酸化形式的丰度比随活性减小而增加(图5b)。有趣地，所有变体的总体丰度(磷酸化形式+未磷酸化形式)未表现出显著不同。除非其他因素参与确定蛋白质水平，否则如果有害的置换影响内在酶稳定性，那么这不可能被预期。
所有功能受损等位基因集簇在N端(MTHFR的催化部分(36)，其包含叶酸和FAD结合部位)。在另一方面，鉴定到在MTHFR的C端调节结构域中的8个非同义置换，所有8个置换在互补和无细胞酶测定中都表现为良性。此外，在复合等位基因中在调节结构域置换与A222V之间未看到协同作用(图2)。这些改变是中性的，如对于E429A所报导的(10，20，25)，或者测定对它们的缺陷不敏感。然而该发现与这样的观察相符：导致严重临床表型的MTHFR中的大多数突变在催化结构域中发生(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)。已提出，调节结构域在催化结构域的稳定中起着重要作用(20)。如果是这样，那么该作用可在一定程度上耐受氨基酸置换并且可解释嵌合MTHFR(其由融合至拟南芥C端结构域的酿酒酵母N端结构域组成(相当于酵母酶在调节结构域中的大约50个非同义置换))不损害酶活性的原因(38)。应当指出，Martin等人(25)报导，C端结构域中的常见R594Q变体当在COS-1细胞中表达时影响酶活性。然而，该变化在于酵母中表达的酶的基于细胞的测定和无细胞测定中表现为良性。虽然该差异的原因不清楚，但其可反映宿主表达系统，因为这些作者在他们的免疫印迹分析中只观察了单个类别的MTHFR(未知的磷酸化状态)。
杂合子的表型。对于功能受损的MTHFR等位基因为杂合的二倍体酵母的行为显示，可清晰地观察到杂合子的表型，特别是在限制叶酸的条件下(图4)。杂合子表型的表现是明显的，因为大多数遗传变异以杂合性的方式发生并且低频等位基因在群体中主要以杂合子的形式存在。该结果与这样的观察相符：淋巴细胞提取物中细胞MTHFR活性与基因型直接相关：对于A222V(A/V)是杂合的个体具有大约65％的对于主要的等位基因(A/A)纯合子所观察到的总活性，而A222V纯合子(V/V)保留30％的A/A纯合子的活性(7)。在检查影响血清甘油三酯水平的脂肪细胞因子(adipokine)ANGPTL4的等位基因的完全谱的最近的研究中，非同义E40K等位基因的杂合性与低血浆甘油三酯水平显著相关(18)。因此，其中杂合性是表型上可检测的案例增加了低频变体的贡献的重要性，因为与纯合子相比，可存在更多(以数量级计)的携带者。应注意，杂合子表型是在其中MTHFR活性限制细胞生长速率的条件下观察到的。酶促步骤在人的特定途径中是否是限速的取决于遗传和环境因素。
突变和MTHFR磷酸化和丰度。催化结构域中非同义变化的叶酸补救可通过蛋白质稳定作用(关于A222V；9，10)或通过克服分子功能的其他方面例如辅因子Km(2，5)来发生。至少一个有害的等位基因D223N显示与A222V类似的增加的热不稳定性(图3)，这支持稳定性缺陷。MTHFR的叶酸可补救的等位基因是其中叶酸种类稳定酶的不稳定形式的等位基因的假说暗示，MTHFR蛋白的水平与变体的内在活性成比例，如已表明的(25)。然而，我们的观察表明，虽然磷酸化状态与酶活性相关(图5)，但总体丰度(磷酸化的+未磷酸化的形式)未表现出显著的改变(在2倍的范围内)。磷酸化的MTHFR不可能是酶的活性形式，因为Yamada等人(37)证明了磷酸化对内在活性的抑制作用。与此相一致，生长测定和酶测定中不可磷酸化的T34A变体的行为与主要的等位基因的行为相似(数据未显示)。此外，虽然低细胞内叶酸水平降低MTHFR的稳定性(如通过丰度测量的)，但该作用在损害功能的变体中未得到增强。因为这些结果与有害变化的预期的蛋白质去稳定化不符，因此推断必定存在目前处于研究中的补偿调节应答。这样，变体的活性可以显著不同(图2)，然而总蛋白质丰度可以不是如此(图5)。虽然我们的结果与通过磷酸化进行的反馈调节相符(37)，但磷酸化在周转(turnover)中的作用仍不清楚。在该情形下，确定T 34A变化与其他受损等位基因的组合的作用将是令人感兴趣的。
叶酸/高半胱氨酸代谢途径
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)参考途径数据库(www.genome.jp/kegg)描述了叶酸和高半胱氨酸代谢的步骤。该途径通过甲硫氨酸合酶反应而连接，并且细胞培养物、动物模型系统中和人中的边缘性叶酸缺乏削弱了高半胱氨酸的再甲基化(参见，例如，Stover PJ.2004.Physiology of folate and vitamin B12 in health and disease.Nutr Rev 62：S3-12.)。高半胱氨酸是NTD的假定的风险因子(参见，例如，Mills等人，1995.Homocysteine metabolism in pregnancies complicated by neural tube defects.Lancet 345：149-1151)。叶酸缺乏还削弱由S-腺苷-甲硫氨酸介导的甲基化(SAM；参见，例如，Stover，同上)，所述S-腺苷-甲硫氨酸是MTHFR和CBS的变构抑制剂(参见，例如，Kraus等人，1999.Cystathionine-β-synthase mutations in homocystinuria.Hum Mut 13：362-375；Daubner等人，1982.In Flavins and Flavoproteins，eds.Massey，V.& Williams，C.H.(Elsevier，New York)，pp.165-172)。此外，在NTD发生的机制中已提及S-腺苷-高半胱氨酸：S-腺苷-甲硫氨酸(SAH/SAM)的比升高(参见，例如，Stover，同上；Scott，2001.Evidence of folic acid and folate in the prevention of neural tube defects.Bibl Nutr Dieta 55：192-195.van der Put等人，2001.Folate，Homocysteine and Neural Tube Defects：An Overview.Exptl Biol Med 226：243-270.1，5，6)。
参与高半胱氨酸代谢的不利用叶酸的酶
胱硫醚-β-合酶(CBS)缺陷导致升高的高半胱氨酸水平并且胱硫醚-β-裂解酶(CTH)SNP类似地与升高的高半胱氨酸相关(参见，例如，Kraus等人，同上；Wang等人，2004.Single nucleotide polymorphism in CTH associated with variation in plasma Homocysteine concentration.Clin Genet 65：483-486)。虽然不是利用叶酸的酶，但CBS和CTH都依赖于维生素B6-辅因子，并且受损等位基因具有使叶酸/高半胱氨酸代谢功能失调的风险。与本文中描述的用于MTHFR受损等位基因的叶酸治疗类似，CBS和CTH的受损等位基因是B6治疗的靶。在酵母互补测定中重现了CBS和CTH的功能和维生素应答性。(图6)。
在酿酒酵母中重现CBS突变体酶的维生素B6-补救
对酵母菌株进行工程改造以测定作为细胞内维生素B6(吡多辛)浓度的函数的CTH和CBS(图6)。CTH和CBS的酿酒酵母直系同源物分别是cys3和cys4，其缺陷导致半胱氨酸营养缺陷体。除了菌株背景对于吡多辛生物合成是缺陷的(六重缺失sno1Δsno2Δsno3Δsnz1Δsnz2Δsnz3Δ；Stolz等人，2003.Tpnlp，the plasma membrane vitamin B6 transporter of Saccharomyces cerevisiae.J Biol Chem278：18990-18996)并且具有cys3或cys4缺陷外，以与本文中对于MTHFR所描述的方式类似的方式将酶测试为吡多辛浓度的函数。
图6显示在固体培养基上进行的定性酵母生长测定并且证明，两种酶都拯救相应酵母缺陷(作为吡多辛补充的函数)，并且CBS的两个高半胱氨酸尿等位基因(I278T，R266K)的维生素反应性在该互补测定中重现：这些等位基因对受限的B6水平比野生型酶更敏感并且显示相应更大的生长缺陷。之前已证明cys4突变体中的半胱氨酸营养缺陷可被人CBS拯救(Kruger等人，1995.A yeast assay for functional detection of mutations in the human cys tathionine-β-synthase gene.Hum Mol Genet 4：1155-1161；Kruger等人，1994.A yeast system for expression of human cystathionine beta-synthase：structural and functional conservation of the human and yeast genes.Proc Natl Acad Sci 91：6614-6618)。
实施例2：另外的MTHFR变体的鉴定
DNA样品群体。从250个患神经管缺陷的新生儿中的每一个或250个不患有神经管缺陷的新生儿中的每一个的干血斑(Guthrie Cards)分离基因组DNA。如实施例1中所示，测定分离的基因组DNA样品中的MTHFR外显子的序列。根据序列数据将影响酶结构的突变鉴定为针对共有人基因组序列(NM_005957)的错配。所有置换列于表A中。
Figure BPA00001255218800451
Figure BPA00001255218800461
使用本文中公开的体内酵母测定在一系列叶酸浓度上测试MTHFR变体的功能影响以观察实施例1中描述的功能效应。
实施例3：ATIC，MTHFS，MAT1A，MAT2A和GART变体的鉴定
DNA样品群体。从250个患神经管缺陷的新生儿中的每一个或250个不患有神经管缺陷的新生儿中的每一个的干血斑(Guthrie Cards)分离基因组DNA。测定来自叶酸/高半胱氨酸代谢途径的18个候选基因的总共234个外显子的序列。根据序列数据将影响酶结构的测序和扩增子突变鉴定为针对ATIC、MTHFS、MAT1A、MAT2A和GART的共有人基因组序列(列于表2中)的错配。ATIC、MTHFS、MAT1A、MAT2A和GART的所有置换分别列于表B、C、D、E和F。
Figure BPA00001255218800481
Figure BPA00001255218800491
Figure BPA00001255218800501
Figure BPA00001255218800502
Figure BPA00001255218800503
Figure BPA00001255218800511
Figure BPA00001255218800512
Figure BPA00001255218800521
Figure BPA00001255218800522
Figure BPA00001255218800531
如实施例1中所述，使用公开的体内酵母测定(以观察功能效应)并且使用表1中描述的适当的酵母菌株背景，在一系列叶酸浓度上测试ATI C、MTHFS、MAT1A、MAT2A和GART变体的功能影响。
所有文献明确地以其全文通过引用合并入本文。
表3.通过500多个不同种族的未选择的个体的取样观察到的非同义MTHFR等位基因的谱
Figure BPA00001255218800541
**对于外显子1和11，只给出外显子的编码部分的长度。

Claims (30)

1.筛查可通过辅因子施用补救的编码酶的基因的受损等位基因的体内方法，其包括：
i)将编码酶的基因的受试等位基因引入酵母细胞，其中所述酵母细胞包含功能上与编码酶的基因同源的第一基因中的第一突变以及使得所述酵母细胞依赖于酶功能所需的辅因子的补充的第二基因或基因群中的第二突变，其中所述第一突变改变与所述第一基因的功能相关的酵母的可测量的特征；
(ii)给生长培养基补充辅因子；和
(iii)检测与在野生型酶存在的情况下相比，在受试等位基因存在的情况下更少的可测量的特征的恢复，从而检测受试等位基因对第一基因突变的不完全互补作用，并且将受试等位基因鉴定为受损等位基因。
2.权利要求1的方法，其还包括滴定补充的辅因子的量以确定受试等位基因是否是辅因子敏感性的。
3.权利要求1的方法，其中所述酵母是二倍体。
4.权利要求1的方法，其中二倍体酵母对于编码酶的基因的受试等位基因是杂合的。
5.权利要求1的方法，其中所述第一基因是met13，所述第二基因是fol3，所述辅因子是叶酸，所述可测量的特征是生长，以及所述编码酶的基因选自MTHFR、MAT1A、MAT2A、GART、MTHFS和ATIC。
6.权利要求1的方法，其中所述第一基因是cys3，所述第二基因群是六重缺失sno1Δsno2Δsno 3Δsnz1Δsnz2Δsnz3Δ，所述编码酶的基因是CTH，所述辅因子是维生素B6，以及所述可测量的特征是生长。
7.权利要求1的方法，其中所述第一基因是cys4，所述第二基因群是六重缺失sno1Δsno2Δsno 3Δsnz1Δsnz2Δsnz3Δ，所述编码酶的基因是CBS，所述辅因子是维生素B6，以及所述可测量的特征是生长。
8.用于检测对辅因子依赖性酶缺陷的易感性的方法，其包括：
i)从所述受试者获得样品；
ii)检测至少一个编码酶的基因的多个辅因子可补救的受损等位基因的存在或不存在；
其中至少一个受损等位基因的存在表示受试者处于辅因子依赖性酶缺陷的风险中。
9.用于鉴定和/或表征受试者的代谢途径中的酶缺陷的方法，其包括
i)从所述受试者获得样品；
ii)检测所述途径中至少一个编码酶的基因的多个受损等位基因的存在或不存在；
其中受损等位基因的存在表示受试者具有可补救的酶缺陷。
10.权利要求8或9的方法，其中所述受损等位基因是低频等位基因。
11.权利要求8或9的方法，其中所述受损等位基因来自所述途径中的多个编码酶的基因。
12.权利要求8或9的方法，其中利用权利要求1至7的任一项的方法鉴定所述多个受损等位基因。
13.用于治疗受试者的代谢酶缺陷的方法，其包括：
i)从所述受试者获得样品；
ii)检测至少一个编码酶的基因的多个受损等位基因的存在或不存在；以及
iii)基于至少一个受损等位基因的存在给所述受试者施用辅因子补充物。
14.权利要求8至13的任一项的方法，其中所述代谢途径是高半胱氨酸，所述维生素是叶酸，并且所述受损等位基因选自人MTHFR的M110I、H213R、D223N、D291N、R519C、R519L和Q648P。
15.权利要求8至13的任一项的方法，其中所述代谢途径是高半胱氨酸，所述维生素是叶酸，并且所述受损等位基因选自人MTHFS的R84Q、V119L和T202A。
16.权利要求8至13的任一项的方法，其中所述代谢途径是高半胱氨酸，所述维生素是叶酸，并且所述受损等位基因选自人MAT1A的I90V、L176R和R312Q。
17.权利要求8至13的任一项的方法，其中所述代谢途径是高半胱氨酸，所述维生素是叶酸，并且所述受损等位基因选自人GART的T16M、A161G、L363I、V367M、R385K、I 397V、V421I、A445T、D510G、H601R、A632V、P641A、D752G、L797M、E804A和N870S。
18.用于评估代谢途径中的可补救的酶缺陷的试剂盒，其包含多个
用于检测所述代谢途径中的编码酶的基因的低频可补救的受损等位基因的核酸探针。
19.权利要求18的试剂盒，其中利用权利要求1至7的任一项的方法鉴定所述受损等位基因。
20.包含受损等位基因突变或其互补序列的分离的核酸，其中所述受损等位基因突变选自MTHFR基因的核苷酸4078；MTHFR基因的核苷酸4234；MTHFR基因的核苷酸5733；MTHFR基因的核苷酸5872；MTHFR基因的核苷酸6642；MTHFR基因的核苷酸6657；MTHFR基因的核苷酸6681；MTHFR基因的核苷酸6774；MTHFR基因的核苷酸10906；MTHFR基因的核苷酸11656；MTHFR基因的核苷酸11668；MTHFR基因的核苷酸11902；MTHFR基因的核苷酸12232；MTHFR基因的核苷酸2622；MTHFR基因的核苷酸12759；MTHFR基因的核苷酸13040；MTHFR基因的核苷酸14593；MTHFR基因的核苷酸14612；MTHFR基因的核苷酸14705；MTHFR基因的核苷酸13170；MTHFR基因的核苷酸116401；其中表A中提供了SNP的序列。
21.包含受损等位基因突变或其互补序列的分离的核酸，其中所述受损等位基因突变选自ATIC基因的核苷酸1100；ATIC基因的核苷酸1114；ATIC基因的核苷酸1179；ATIC基因的核苷酸1244；ATIC基因的核苷酸1270；ATIC基因的核苷酸1288；ATIC基因的核苷酸1301；ATIC基因的核苷酸1380；ATIC基因的核苷酸1396；ATIC基因的核苷酸1453；ATIC基因的核苷酸1506；ATIC基因的核苷酸1689；ATIC基因的核苷酸7227；ATIC基因的核苷酸7232；ATIC基因的核苷酸7388；ATIC基因的核苷酸8756；ATIC基因的核苷酸8808；ATIC基因的核苷酸14099；ATIC基因的核苷酸14140；ATIC基因的核苷酸14144；ATIC基因的核苷酸14183；ATIC基因的核苷酸14229；ATIC基因的核苷酸14238；ATIC基因的核苷酸14245；ATIC基因的核苷酸14260；ATIC基因的核苷酸14489；ATIC基因的核苷酸14970；ATIC基因的核苷酸15003；ATIC基因的核苷酸15040；ATIC基因的核苷酸15043；ATIC基因的核苷酸15149；ATIC基因的核苷酸15240；ATIC基因的核苷酸15844；ATIC基因的核苷酸16063；ATIC基因的核苷酸21363；ATIC基因的核苷酸21372；ATI C基因的核苷酸21400；ATIC基因的核苷酸21521；ATIC基因的核苷酸21611；ATIC基因的核苷酸22187；ATIC基因的核苷酸22273；ATIC基因的核苷酸22282；ATIC基因的核苷酸22291；ATIC基因的核苷酸22342；ATIC基因的核苷酸22512；ATIC基因的核苷酸22519；ATIC基因的核苷酸22538；ATIC基因的核苷酸22564；ATIC基因的核苷酸22589；ATIC基因的核苷酸22737；ATIC基因的核苷酸24992；ATIC基因的核苷酸25009；ATIC基因的核苷酸27757；ATIC基因的核苷酸27855；ATIC基因的核苷酸27985；ATIC基因的核苷酸28015；ATIC基因的核苷酸33901；ATIC基因的核苷酸33919；ATIC基因的核苷酸33920；ATIC基因的核苷酸33933；ATIC基因的核苷酸35723；ATIC基因的核苷酸35737；ATIC基因的核苷酸35742；ATIC基因的核苷酸35840；ATIC基因的核苷酸35917；ATIC基因的核苷酸35968；ATIC基因的核苷酸35973；ATIC基因的核苷酸38338；ATIC基因的核苷酸38342；ATIC基因的核苷酸38437；ATIC基因的核苷酸38342；ATIC基因的核苷酸38582；ATIC基因的核苷酸38627；ATIC基因的核苷酸38667和ATIC基因的核苷酸38725；其中表B中提供了核苷酸的序列。
22.包含受损等位基因突变或其互补序列的分离的核酸，其中所述受损等位基因突变选自MTHFS基因的核苷酸8808；MTHFS基因的核苷酸8912；MTHFS基因的核苷酸8957；MTHFS基因的核苷酸8998；MTHFS基因的核苷酸52560；MTHFS基因的核苷酸52878和MTHFS基因的核苷酸52902；其中表C中提供了SNP的序列。
23.包含受损等位基因突变或其互补序列的分离的核酸，其中所述受损等位基因突变选自MAT1A基因的核苷酸5045；MAT1A基因的核苷酸5181；MAT1A基因的核苷酸5233；MAT1A基因的核苷酸6739；MAT1A基因的核苷酸6795；MAT1A基因的核苷酸9833；MAT1A基因的核苷酸10006；MAT1A基因的核苷酸10312；MAT1A基因的核苷酸10339；MAT1A基因的核苷酸10374；MAT1A基因的核苷酸10484；MAT1A基因的核苷酸10555；MAT1A基因的核苷酸14038；MAT1A基因的核苷酸14114；MAT1A基因的核苷酸14177；MAT1A基因的核苷酸15424；MAT1A基因的核苷酸15500；MAT1A基因的核苷酸15646；MAT1A基因的核苷酸15706；MAT1A基因的核苷酸15715；MAT1A基因的核苷酸15730；MAT1A基因的核苷酸15758；MAT1A基因的核苷酸16133；MAT1A基因的核苷酸16174；MAT1A基因的核苷酸15706；MAT1A基因的核苷酸15715；MAT1A基因的核苷酸15730；MAT1A基因的核苷酸15758；MAT1A基因的核苷酸16133；MAT1A基因的核苷酸16174；MAT1A基因的核苷酸16218；其中表D中提供了SNP的序列。
24.包含受损等位基因突变或其互补序列的分离的核酸，其中所述受损等位基因突变选自MAT2A基因的核苷酸2871；MAT2A基因的核苷酸2873；MAT2A基因的核苷酸2939；MAT2A基因的核苷酸3287；MAT2A基因的核苷酸3394；MAT2A基因的核苷酸3466；MAT2A基因的核苷酸3498；MAT2A基因的核苷酸3650；MAT2A基因的核苷酸3704；MAT2A基因的核苷酸4174；MAT2A基因的核苷酸4449；MAT2A基因的核苷酸4476；MAT2A基因的核苷酸4608；MAT2A基因的核苷酸4660；MAT2A基因的核苷酸4692；MAT2A基因的核苷酸4931；MAT2A基因的核苷酸5313；MAT2A基因的核苷酸5460；和MAT2A基因的核苷酸5480；其中表E中提供了SNP的序列。
25.包含受损等位基因突变或其互补序列的分离的核酸，其中所述受损等位基因突变选自GART基因的核苷酸3782；GART基因的核苷酸3842；GART基因的核苷酸7745；GART基因的核苷酸7984；GART基因的核苷酸10775；GART基因的核苷酸11521；GART基因的核苷酸11522；GART基因的核苷酸11541；GART基因的核苷酸12356；GART基因的核苷酸14200；GART基因的核苷酸14273；GART基因的核苷酸14282；GART基因的核苷酸14739；GART基因的核苷酸14781；GART基因的核苷酸18055；GART基因的核苷酸18064；GART基因的核苷酸18130；GART基因的核苷酸18142；GART基因的核苷酸18197；GART基因的核苷酸18232；GART基因的核苷酸18401；GART基因的核苷酸20812；GART基因的核苷酸20825；GART基因的核苷酸16174；GART基因的核苷酸15706；GART基因的核苷酸20862；GART基因的核苷酸22481；GART基因的核苷酸22521；GART基因的核苷酸25425；GART基因的核苷酸25433；GART基因的核苷酸25601；GART基因的核苷酸25867；GART基因的核苷酸25912；GART基因的核苷酸25951；GART基因的核苷酸25956；GART基因的核苷酸26127；GART基因的核苷酸26195；GART基因的核苷酸31627；GART基因的核苷酸31641；GART基因的核苷酸31887；GART基因的核苷酸31902；GART基因的核苷酸31933；GART基因的核苷酸33173；GART基因的核苷酸33264；GART基因的核苷酸31933；GART基因的核苷酸33173；GART基因的核苷酸33264；GART基因的核苷酸33286；GART基因的核苷酸36963；GART基因的核苷酸36964；GART基因的核苷酸37428；GART基因的核苷酸37433；GART基因的核苷酸38762；GART基因的核苷酸38914和GART基因的核苷酸38989；其中表F中提供了SNP的序列。
26.包含受损等位基因突变或其互补序列的分离的核酸，其中所述受损等位基因突变选自M110I、H213R、D223N、D291N、R519C、R519L和Q648P。
27.筛查与异常叶酸/高半胱氨酸代谢相关的状况或疾病的风险的方法，其包括使用权利要求8至13的方法检测受损等位基因。
28.权利要求27的方法，其中所述疾病或状况选自心血管疾病、冠状动脉疾病、缺血性中风、动脉粥样硬化、神经管缺陷、口面裂、先兆子痫、早产/低出生体重、反复早期自发性流产、血栓形成、视网膜动脉闭塞、唐氏综合征、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、抑郁症、精神分裂症、阿尔茨海默病/痴呆、年龄相关性黄斑变性和青光眼。
28.筛查化疗剂响应潜能的方法，其包括检测选自MTHFR和GART的基因的受损等位基因。
29.筛查化疗剂毒性的方法，其包括检测选自MTHFR和GART的基因的受损等位基因。
30.用于检测叶酸/高半胱氨酸代谢途径中的基因的受损等位基因的阵列，其包含权利要求20至25的任一项的分离的核酸。
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