KR20100134067A - 대사 경로에 연관된 유전자의 손상된 대립유전자 및 이의 검출 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 효소 변이체, 보조인자에 대한 이의 반응성, 및 효소 변이체의 활성 뿐 아니라 보조인자에 대한 이의 반응성을 시험하기 위한 생체 내 어세이에 관한 것이다.

Description

대사 경로에 연관된 유전자의 손상된 대립유전자 및 이의 검출 및 사용 방법 {IMPAIRED ALLELES OF GENES INVOLVED IN METABOLIC PATHWAYS AND METHODS FOR DETECTING AND USING THE SAME}
정부 기금
본 발명은 미국 국방부 리서치 프로젝트 에이전시 (Defense Advanced Research Projects Agency) 및 미 국군 연구청 (U.S. Army Research Office) (#W911NF-06-1-0166) 및 미 국립 건강기구 (National Institutes for Health) (GM072859) 로부터 정부 지원을 받았다. 미국 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
기술 분야
본 발명은 대사작용에 영향을 주는 효소 변이체, 보조인자에 대한 이의 작용 민감성, 및 이러한 효소 변이체를 인코딩하는 손상된 대립유전자를 검출하고 보조인자에 대한 이의 민감성을 측정하기 위한 어세이에 관한 것이다.
엽산/호모시스테인 대사 경로는 엽산을 대사하고/하거나 호모시스테인에 영향을 주는 효소 및 효소 경로의 네트워크로 구성되어 있다. 경로는 메티오닌 신타아제 반응을 통해 연결되고, 세포 배양물, 동물 모델 시스템 및 인간에서의 변연 엽산 결핍은 호모시스테인 재-매틸화를 손상시킨다 (예를 들어, Stover PJ. 2004. Physiology of folate and vitamin B12 in health and disease. Nutr Rev 62:S3-12 참조).
엽산 부족은 신경관 결손 ("NTD") 뿐 아니라 기타 출생 결함 및 부정적인 임신 결과, 예컨대 구안지 구열, 전-자간증, 조산/저체중 출생, 및 재발성 초기 자발적 유산과 연결되어 있다 (예를 들어, Mills et al., 1995. Homocysteine metabolism in pregnancies complicated by neural tube defects. Lancet 345:149-1151 참조). 엽산 부족은 또한 심혈관 질환, 관상동맥병, 허혈성 뇌졸중, 죽상동맥경화증, 혈전증, 망막동맥폐색, 다운 신드롬, 결장직장암, 유방암, 폐암, 전립선암, 우울증, 정신분열병, 알쯔하이머 질환/치매, 노인성 황반 변성, 및 녹내장과 관련이 있다.
엽산/호모시스테인 대사 경로 내의 모든 대사 단계는 엽산 부족 및/또는 호모시스테인 대사작용과 연관된 상태 및 질환과 잠재적으로 관련된다. 연루된 엽산/호모시스테인 대사작용에 관계되는 효소에는 예를 들어, 2-기능적 효소 AICAR 트랜스포르밀라아제 및 IMP 시클로히드롤라아제 (ATIC), 글리신나미드 리보뉴클레오티드 트랜스포르밀라아제 (GART), 메티오닌 아데노실트랜스페라아제 I, 알파 (MAT1A), 메티오닌 아데노실트랜스페라아제 II, 알파 (MAT2A), 메틸렌테트라히드로엽산 리덕타아제 (MTHFR), 및 메테닐테트라히드로엽산 신테타아제 (MTHFS) 가 포함된다. 엽산 부족은 또한 MTHFR 및 CBS 모두의 알로스테릭 저해제인 S-아데노실-메티오닌 ("SAM") 에 의해 매개되는 메틸화를 손상시킨다 (예를 들어, Kraus et al., 1999. Cystathionine β-synthase mutations in homocystinuria. Hum Mut 13:362-375; Daubner et al., 1982, In Flavins and Flavoproteins, eds. Massey, V. & Williams, C. H. (Elsevier, New York), pp. 165-172 참조). S-아데노실-호모시스테인:S-아데노실-메티오닌 (SAH/SAM) 비의 증가는 NTD 발달 메카니즘에서 제안되어 왔다.
5,10-메틸렌테트라히드로엽산 리덕타아제 (MTHFR) 는 호모시스테인이 메티오닌으로 전환되는 엽산-의존성 다단계 경로에 관련되어 있다. 호모시스테인 전환 감소는 과호모시스테인증 (hyperhomocysteinemia) 을 야기할 수 있다.
임상적 MTHFR 결핍증과 관련되어 있는 몇몇의 MTHFR 의 희귀한 돌연변이 (상염색체 열성 장애) 가 확인되었다. MTHFR 결핍증의 임상적 증상은 매우 다양하며, 발달 지연, 이동 및 보행 이상, 발작, 및 미성숙 혈관 질환이 포함된다.
기능적으로 손상된 대립유전자 A222V 를 비롯한 MTHFR 의 공통의 다형성이 또한 기재되어 있다. 공통의 다형성과 질환과의 유전적 연관성에는 일관성이 없다. 이것은 일부는, 질환의 근본적인 위험을 차폐하는 엽산 가용성의 상보성 효과 뿐 아니라, 이러한 질환에 대한 아직 미확인된 저-빈도 손상된 대립유전자의 기여로 인한 것일 것이다. 흥미롭게도, 공통의 다형성은 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실과 같은 화학요법의 효능 및 독성에서의 개별적인 변이와 관련이 있다.
효모 유전자 met11 의 기능적 상보성에 대한 어세이가 기재되어 있다 (Shan et al., JBC, 274:32613-32618, 1999). 상기 어세이에서, 야생형 인간 MTHFR 은 S. 세레비지아에 (S. cerevisiae) 내 met11 돌연변이를 상호보완하는 것으로 제시되었다. 그러나, 상기 어세이는 야생형 효소와 비교하여 효모 돌연변이를 상호보완하는 기능적으로 손상된 대립유전자 A222V 의 유사한 능력에 의해 입증되는 바와 같은, MTHFR 돌연변이로 인한 활성의 양적 변화에 대해 민감하지 않았고; 엽산 가용성의 효과에 대해서도 상기 어세이는 민감하지 않았다.
엽산 이용 효소 외에도, 소수의 비타민 B6- 및 B12-의존성 효소 및 효소 경로가 호모시스테인 대사작용, NTD 및 기타 출생 결함 및 부정적인 임신 결과와 관련이 있다. 예를 들어, B6 이용 효소 시스타티오닌-β-신타아제 ("CBS") 의 결함은 호모시스테인의 축적을 야기한다 (Kraus et al., 1999. Cystathionine β-synthase mutations in homocystinuria. Hum Mut 13:362-375). 또한, B6 이용 효소 시스타티오닌-γ-리아제 ("CTH") 의 단독 뉴클레오티드 다형성 ("SNP") 이 또한 호모시스테인증과 관련이 있다 (Wang et al., 2004. Single nucleotide polymorphism in CTH associated with variation in plasma homocysteine concentration. Clin Genet 65:483-486).
발명의 요약
본 발명은 일부분, 대사 경로 내 효소-인코딩 유전자의 손상된 대립유전자를 확인하고 보조인자 치유에 대한 이들의 민감성을 측정하기 위한 신규 생체 내 어세이의 개발로부터 유래한다. 관심의 기능적 상동 효소에 의한 상보성을 가능하게 하는 1 차 돌연변이, 및 보조인자의 보충에 의존하는 균주가 되게 하는 2 차 돌연변이 (또는 돌연변이 그룹) 를 포함하는 복합 효모 돌연변이체는 보조인자 가용성의 기능으로서 효소 상보성 연구를 제공한다. 치유가능한 대립유전자를 포함하는 보조인자-민감성 손상된 대립유전자가 확인될 수 있고, 보조인자-가용성:효소-활성 관련성은 본원에 기재된 어세이를 사용하여 분석될 수 있다. 수득된 결과는 대사성 효소 기능장애 및 일탈 대사작용과 관련된 상태 및 질환을 예방 및 치료하기 위한 예방적 및 치료적 영양분 보충물에 대한 정보를 주기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 일부분, 효소-인코딩 유전자 내의 저-빈도 손상된 대립유전자의 보조인자 치유가 놀랍게도 공통적이라는 것을 본원에서 처음으로 증명한 것으로부터 유래된다. 본원에 설명된 바와 같이, 대사 경로 내 다중 보조인자-민감성 유전자는 각각 집단 내 다중 저-빈도 돌연변이를 가질 수 있다. 함께, 상기 돌연변이는 집합적으로, 단일 유전자의 단일 저-빈도 손상된 대립유전자의 시험으로부터 명백할 것보다 대사 경로에 대해 더욱 유의한 효과를 갖는다. 게다가, 다수의, 이러한 저-빈도 손상된 대립유전자에 대하여 이종접합인 세포가 양적 결함을 나타내므로, 이러한 개별적으로 희귀한 대립유전자의 총 빈도가 더욱 공통의 다형성(들) 의 부재하에서 공통의 표현형에 기여할 수 있다. 경로에 영향을 주는 이러한 저-빈도 손상된 대립유전자는 또한 공통의 다형성으로 관찰되는 표현형 변이에 기여할 수 있다. 따라서, 본 발명은 효소-인코딩 유전자 내 이러한 저-빈도 손상된 대립유전자의 검출 및 특징화, 및 효과적인 치유의 결정에 특히 초점을 둔 진단 및 예후 방법을 고려한다.
본 발명은 또한 일부분, 특히 엽산/호모시스테인 대사작용에 관련된 효소-인코딩 유전자 내 신규 저-빈도 손상된 대립유전자를 확인하고 특징화하기 위한 상기 어세이의 특정 적용으로부터 유래된다. MTHFR 과 관련하여 본원에서 증명되는 바와 같이, 점증적으로 효소 결핍증에 기여할 수 있으나, 또한 보조인자 보충에 의해 해소될 수 있는 다수의 저-빈도 손상된 대립유전자가 존재한다. 본 발명은 또한 일부분, MTHFR 의 손상된 대립유전자가 효소의 N-말단 촉매성 도메인의 코딩 서열에 대한 맵을 변화시키는 서열을 포함한다는 발견으로부터 유래된다.
그러므로 본 발명은 예를 들어, ATIC, GART, MAT1A, MAT2A, MTHFR, 및 MTHFS 를 포함하는 엽산/호모시스테인 대사작용에 관련된 효소-인코딩 유전자의 손상된, 그러나 치유가능한 대립유전자를 검출하기 위한 신규 생체 내 어세이를 제공한다. 종래 기술에서는 야생형 인간 MTHFR 활성이 met11 결핍증을 보완한다는 상보성 어세이를 기술하고 있으나 (Shan et al., JBC, 274:32613-32618, 1999), 상기 어세이는 고도로 민감하지 않으며, 모든 기능적으로 손상된 인간 MTHFR 대립유전자를 검출할 수 없었다. 예를 들어, 상기 어세이는 야생형 MTHFR 과 기능적으로 손상된 공통의 다형성 A222V 사이를 구별할 수 없었다. 추가로, 상기 어세이는 엽산 수준과 효소 활성 간의 관련성에 대해서는 아무것도 밝히지 못했다.
종래 기술과는 반대로, 본원에 기재되는 생체 내 어세이는 고도로 민감하며, MTHFR 과 관련하여 본원에서 증명된 바와 같이 엽산/호모시스테인 대사작용에 관련된 유전자의 손상된 대립유전자를 차폐하지 않는 동시에, 엽산에 대한 이의 민감성을 측정할 수 있다. 확인된 대립유전자에는 저-빈도 대립유전자, 이형접합체로서 표현형을 나타내는 우성 또는 공우성 대립유전자, 엽산-치유가능한 대립유전자, 및 상기 특성의 조합을 갖는 대립유전자를 포함하는 엽산-민감성인 대립유전자가 포함된다. 중요하게는, 상기 손상된 대립유전자는 다양한 상태 및 질환의 위험 뿐 아니라, 화학요법제의 다양한 효능 및 독성과 연관되어 있다. 상기 손상된 대립유전자의 결핍증은 상태, 질환, 또는 엽산 가용성의 보상 효과로 인한 일부 개인에서의 화학요법에 대한 다양한 반응으로서는 나타날 수 없다. MTHFR 의 기능적으로 손상된 대립유전자를 차폐하지 않는 능력은 이러한 상태 및 질환의 위험 뿐 아니라, 화학요법의 잠재적인 치료적 효능 및 독성에 대한 스크리닝 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 CTH 및 CBS 의 손상된 대립유전자를 검출하기 위한 신규 생체 내 어세이를 제공한다. 상기 유전자의 기능적으로 손상된 대립유전자를 차폐하지 않는 능력은 유사하게, 연관 질환 및 상태의 위험에 대한 스크리닝 방법을 제공한다.
따라서, 하나의 양상에서, 본 발명은 대사 경로 내 효소-인코딩 유전자의 손상된 대립유전자의 검출, 및 보조인자에 대한 이들의 민감성을 측정하기 위한 생체 내 어세이를 제공한다. 어세이는 야생형 효소-인코딩 유전자에 의해 보상될 수 있는 첫번째 유전자 중에 1 차 돌연변이, 및 첫번째 유전자의 기능과 관련된 검정가능한 표현형에 대한 보조인자 (또는 이의 전구체) 의 보충에 의존하는 효모 균주가 되게 하는 두번째 유전자 (또는 유전자 그룹) 중에 2 차 돌연변이를 포함하는 효모 균주의 사용을 포함한다.
방법은 (i) 효모 세포 내에 효소-인코딩 유전자의 시험 대립유전자를 도입하는 단계, 상기 효모 세포는 효소-인코딩 유전자에 대해 기능적으로 상동인 첫번째 유전자 중에 1 차 돌연변이, 및 효소 기능에 필요한 보조인자의 보충에 의존하는 효모 세포가 되게 하는 두번째 유전자 (또는 유전자 그룹) 중에 2 차 돌연변이를 포함하고, 상기 1 차 돌연변이는 첫번째 유전자의 기능과 관련된 효모의 측정가능한 특성을 변경함; (ii) 성장 배지에 보조인자를 보충하는 단계; 및 (iii) 야생형 효소의 존재보다는 시험 대립유전자의 존재하에서 측정가능한 특성의 복원이 덜 검출되므로, 시험 대립유전자에 의해 첫번째 유전자 돌연변이의 불완전 상보성을 검출하고 시험 대립유전자를 손상된 대립유전자로서 확인하는 단계를 포함한다. 보충된 보조인자의 양을 적정함으로써, 보조인자 가용성에 대한 손상된 대립유전자의 민감성을 측정한다.
하나의 구현예에서, 2배체 효모가 사용된다. 2배체 효모는 시험 대립유전자에 대해 동형접합 또는 이종접합일 수 있다. 2배체 효모는 야생형 유전자 및 시험 대립유전자를 포함할 수 있다. 2배체 효모는 시험 대립유전자의 조합을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 자연 발생적 대립유전자, 또는 개별적 자연 발생적 대립유전자의 복합체에 서열이 상응한다. 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 인간 효소-인코딩 유전자의 대립유전자, 또는 개별적 인간 대립유전자의 복합체를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 효모는 S. 세레비지아에이다.
하나의 구현예에서, 첫번째 효모 유전자는 met13 이고, 두번째 효모 유전자는 fol3 이다. 이러한 효모 균주는 MTHFR 대립유전자의 활성, 및 엽산 상태에 대한 이의 반응을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 엽산 상태의 기능으로서 활성을 추가로 측정할 수 있는, MTHFR 대립유전자의 활성을 측정하기 위한 생체 내 어세이를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 자연 발생적 인간 MTHFR 대립유전자를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 개별적 인간 MTHFR 대립유전자의 복합체를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 어세이 방법은 야생형 MTHFR 의 활성을 관심의 MTHFR 대립유전자의 활성과 비교하는 것을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 어세이 방법은 MTHFR 효소가 엽산 가용성에 민감한지의 여부를 측정하기 위해 엽산의 양을 적정하는 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, 효모는 2배체이다. 하나의 구현예에서, 2배체 효모는 상보성에 대해 시험되는 MTHFR 대립유전자에 대하여 이종접합이다. 하나의 구현예에서, 2배체 효모는 야생형 MTHFR 및 돌연변이체 MTHFR 대립유전자를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 어세이의 측정된 산출량은 성장이다.
하나의 구현예에서, 첫번째 효모 유전자는 ade16 또는 ade17 이고, 두번째 효모 유전자는 fol3 이다. 이러한 효모 균주는 2-기능적 효소 AICAR 트랜스포르밀라아제 및 IMP 시클로히드롤라아제 (ATIC) 대립유전자의 활성, 및 엽산 상태에 대한 이의 반응을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 엽산 상태의 기능으로서 활성을 추가로 측정할 수 있는, ATIC 대립유전자의 활성을 측정하기 위한 생체 내 어세이를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 자연 발생적 인간 ATIC 대립유전자를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 개별적 인간 ATIC 대립유전자의 복합체를 포함한다.
하나의 구현예에서, 첫번째 효모 유전자는 ade7 이고, 두번째 효모 유전자는 fol3 이다. 이러한 효모 균주는 글리시나미드 리보뉴클레오티드 트랜스포르밀라아제 (GART) 대립유전자의 활성, 및 엽산 상태에 대한 이의 반응을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 엽산 상태의 기능으로서 활성을 추가로 측정할 수 있는, GART 대립유전자의 활성을 측정하기 위한 생체 내 어세이를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 자연 발생적 인간 GART 대립유전자를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 개별적 인간 GART 대립유전자의 복합체를 포함한다.
하나의 구현예에서, 첫번째 효모 유전자는 sam1 또는 sam2 이고, 두번째 효모 유전자는 fol3 이다. 이러한 효모 균주는 메티오닌 아데노실트랜스페라아제 I, 알파 (MAT1A) 대립유전자의 활성, 및 엽산 상태에 대한 이의 반응을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 엽산 상태의 기능으로서 활성을 추가로 측정할 수 있는, MAT1A 대립유전자의 활성을 측정하기 위한 생체 내 어세이를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 자연 발생적 인간 MAT1A 대립유전자를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 개별적 인간 MAT1A 대립유전자의 복합체를 포함한다.
하나의 구현예에서, 첫번째 효모 유전자는 sam1 또는 sam2 이고, 두번째 효모 유전자는 fol3 이다. 이러한 효모 균주는 메티오닌 아데노실트랜스페라아제 II, 알파 (MAT2A) 대립유전자의 활성, 및 엽산 상태에 대한 이의 반응을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 엽산 상태의 기능으로서 활성을 추가로 측정할 수 있는, MAT2A 대립유전자의 활성을 측정하기 위한 생체 내 어세이를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 자연 발생적 인간 MAT2A 대립유전자를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 개별적 인간 MAT2A 대립유전자의 복합체를 포함한다.
하나의 구현예에서, 첫번째 효모 유전자는 fau1 이고, 두번째 효모 유전자는 fol3 이다. 이러한 효모 균주는 메테닐테트라히드로엽산 신테타아제 (MTHFS) 대립유전자의 활성, 및 엽산 상태에 대한 이의 반응을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 엽산 상태의 기능으로서 활성을 추가로 측정할 수 있는, MTHFS 대립유전자의 활성을 측정하기 위한 생체 내 어세이를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 자연 발생적 인간 MTHFS 대립유전자를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 개별적 인간 MTHFS 대립유전자의 복합체를 포함한다.
또다른 구현예에서, 첫번째 효모 유전자는 cys3 이고, 두번째 효모 유전자 그룹은 6 자리 (sextuple)-결실 sno1Δ sno2Δ sno3Δ snz1Δ snz2Δ snz3Δ 이다. 이러한 효모 균주는 CTH 대립유전자의 활성, 및 비타민 B6 상태에 대한 이의 반응을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 비타민 B6 상태의 기능으로서 활성을 추가로 측정할 수 있는, CTH 대립유전자의 활성을 측정하기 위한 생체 내 어세이를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 자연 발생적 인간 CTH 대립유전자를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 개별적 인간 CTH 대립유전자의 복합체를 포함한다.
또다른 구현예에서, 첫번째 효모 유전자는 cys4 이고, 두번째 효모 유전자 그룹은 6 자리-결실 sno1Δ sno2Δ sno3Δ snz1Δ snz2Δ snz3Δ 이다. 이러한 효모 균주는 CBS 대립유전자의 활성, 및 비타민 B6 상태에 대한 이의 반응을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 비타민 B6 상태의 기능으로서 활성을 추가로 측정할 수 있는, CBS 대립유전자의 활성을 측정하기 위한 생체 내 어세이를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 자연 발생적 인간 CBS 대립유전자를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 개별적 인간 CBS 대립유전자의 복합체를 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 엽산/호모시스테인 대사작용에 관련된 유전자의 손상된 대립유전자 및 보조인자에 대한 이의 민감성을 검출할 수 있는 효모 균주를 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 ATIC, GART, MAT1A, MAT2A, MTHFR, 및 MTHFS 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소-인코딩 유전자의 손상된 대립유전자를 검출하고, 엽산에 대한 이의 반응성을 측정할 수 있는 효모 균주를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 효모는 각각 이러한 효소-인코딩 유전자에 대해 본원에 상기 기재된 각각의 돌연변이 및 첨가를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 CTH 의 손상된 대립유전자를 검출하고, 비타민 B6 에 대한 이의 반응성을 측정할 수 있는 효모 균주를 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 CBS 의 손상된 대립유전자를 검출하고, 비타민 B6 에 대한 이의 반응성을 측정할 수 있는 효모 균주를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 대사 경로, 예를 들어, 엽산/호모시스테인 대사작용 내에서 효소-인코딩 유전자의 손상된 대립유전자를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 손상된 대립유전자(들) 은 인간 ATICGART, MAT1A, MAT2A, MTHFR, 및/또는 MTHFS 에서 자연적으로 발생한다. 하나의 구현예에서, 손상된 대립유전자는 CBS 대립유전자이다. 하나의 구현예에서, 손상된 대립유전자는 CTH 대립유전자이다. 바람직한 구현예에서, 방법은 본원에서 제공된 생체 내 어세이 및 방법을 사용하는, 보조인자-치유가능한 것으로 보이는 대사 효소-인코딩 유전자 내 손상된 대립유전자를 검출하는 것을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 대상으로부터 샘플을 수득하는 단계 및 상기 샘플 내에서 다수의 손상된 대립유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하며, 하나 이상의 손상된 대립유전자의 존재가 대상에게 효소 결핍증의 위험이 있다는 것을 나타내는, 대상에서의 대사 효소 결핍증을 확인 및/또는 특징화하기 위한 방법을 제공한다. 다수의 손상된 대립유전자는 대사 경로 내 동일한 효소-인코딩 유전자로부터일 수 있거나, 동일한 경로 내 다중 유전자 유래의 대립유전자일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 손상된 대립유전자 중 하나 이상이 저-빈도 대립유전자이고, 예를 들어, 일반적으로는 일반 집단의 4% 미만으로, 더욱 일반적으로는 일반 집단의 3% 미만으로, 바람직하게는 일반 집단의 2.5% 내지 2% 미만으로, 가장 바람직하게는 일반 집단의 1% 미만으로 발현된다. 바람직한 구현예에서, 손상된 대립유전자 중 하나 이상이 보조인자-치유가능한 대립유전자이다. 특히 바람직한 구현예에서, 보조인자-치유가능한 손상된 대립유전자는 본원에서 제공된 생체 내 어세이 및 방법에 의해 확인된다.
또다른 양상에서, 대상으로부터 샘플을 수득하는 단계 및 상기 샘플 내에서 다수의 손상된 대립유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하며, 하나 이상의 손상된 대립유전자의 존재가 대상이 치유가능한 효소 결핍증을 가질 수 있다는 것을 나타내는, 대상에서의 보조인자-의존성 효소 결핍증에 대한 소인을 검출하기 위한 방법이 제공된다. 다수의 손상된 대립유전자는 대사 경로 내의 동일한 효소-인코딩 유전자로부터일 수 있거나, 동일한 경로 내 다중 유전자로부터의 대립유전자일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 손상된 대립유전자 중 하나 이상이 저-빈도 대립유전자이고, 예를 들어, 일반적으로는 일반 집단의 4% 미만으로, 더욱 일반적으로는 일반 집단의 3% 미만으로, 바람직하게는 일반 집단의 2.5% 내지 2% 미만으로, 가장 바람직하게는 일반 집단의 1% 미만으로 발현된다. 바람직한 구현예에서, 손상된 대립유전자 중 하나 이상이 보조인자-치유가능한 대립유전자이다. 특히 바람직한 구현예에서, 보조인자-치유가능한 손상된 대립유전자는 본원에서 제공된 생체 내 어세이 및 방법에 의해 확인된다.
샘플 내 특정 대립유전자의 검출은 당업계에서 흔하며, 임의의 통상적인 검출 프로토콜이 본원에 기재되는 바와 같은 예를 들어, 혼성화, 증폭, 서열분석, RFLP 분석 등에 기초하는 프로토콜을 비롯한 주제 방법에서 유리하게 사용될 수 있다. 또한 본원에는 핵산 샘플 내에서의 대립유전자의 검출에 특정 유용성을 갖는 미래에 개발될 프로토콜 및/또는 물질을 사용하는 것이 계획된다.
추가 양상에서, 결핍증을 갖는 또는 갖는 것으로 의심되는 대상으로부터 샘플을 수득하는 단계, 샘플 내에서 다수의 보조인자-치유가능한 손상된 대립유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 단계 및 본원에 기재된 바와 같은 샘플에서 검출된 손상된 대립유전자(들) 의 수 및 유형에 기반하여 상기 대상에게 적합한 보조인자 보충제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서의 대사 효소 결핍증의 치료 방법이 제공된다.
하나의 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은 효소 활성을 측정하기 위한 생체 내 어세이의 용도를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은 효소 활성을 측정하고, 효소-인코딩 핵산 내 돌연변이를 검출하기 위한 생체 내 어세이의 용도를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은 효소 활성을 측정하기 위한 생체 내 어세이, 및 승온에서의 효소 안정성을 측정하기 위한 온도 민감성 어세이의 용도를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은 효소 활성을 측정하기 위한 생체 내 어세이, 및 효소의 특이적 활성을 측정하기 위한 시험관 내 어세이의 용도를 추가로 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 일탈 호모시스테인 대사작용과 연관된 질환 또는 상태의 위험을 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은 호모시스테인 대사작용에 관여된 유전자의 손상된 대립유전자에 대한 스크리닝을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 생체 내 어세이를 사용하는 식으로 특징화된 손상된 대립유전자를 검출하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 질환 또는 상태는 심혈관 질환, 관상동맥병, 허혈성 뇌졸중, 죽상동맥경화증, 신경관 결손, 구안지 구열, 전-자간증, 조산/저체중 출생, 재발성 초기 자발적 유산, 혈전증, 망막동맥폐색, 다운 신드롬, 결장직장암, 유방암, 폐암, 전립선암, 우울증, 정신분열병, 알쯔하이머 질환/치매, 노인성 황반 변성, 및 녹내장으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은 ATIC, GART, MAT1A, MAT2A, MTHFR, 및/또는 MTHFS 의 손상된 대립유전자에 대한 스크리닝을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은 CBS 의 손상된 대립유전자에 대한 스크리닝을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은 CTH 의 손상된 대립유전자에 대한 스크리닝을 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 개인의 화학요법 반응 잠재성을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은 엽산/호모시스테인 대사작용에 관련된 유전자의 손상된 대립유전자를 검출하기 위한 방법의 용도를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 유전자는 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A, 및 GART 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특이적 대립유전자에 대한 본원에 기재된 생체 내 어세이 방법 및/또는 검출 방법 적용에 의한 개인에서의 손상된 대립유전자의 검출은 감소된 반응 잠재성을 나타낸다.
하나의 양상에서, 본 발명은 개인에 대한 잠재적 화학요법 독성을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은 엽산/호모시스테인 대사작용에 관련된 유전자의 손상된 대립유전자를 검출하기 위한 방법의 용도를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 유전자는 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A, 및 GART 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특이적 대립유전자에 대한 본원에 기재된 생체 내 어세이 방법 및/또는 검출 방법 적용에 의한 개인에서의 손상된 대립유전자의 검출은 증가된 독소 잠재성을 나타낸다.
하나의 양상에서, 본 발명은 MTHFR ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A, 및 GART 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소-인코딩 유전자의 대립유전자에 대한 서열에 상응하는 단리된 핵산을 제공한다. 하나의 구현예에서, 단리된 핵산은 MTHFR 유전자의 대립유전자의 서열, 예를 들어, 표 A 에 기재된 SNP 를 갖고/거나 포함한다. 하나의 구현예에서, 단리된 핵산은 ATIC 유전자의 대립유전자의 서열, 예를 들어, 표 B 에 기재된 SNP 를 갖고/거나 포함한다. 하나의 구현예에서, 단리된 핵산은 MTHFS 유전자의 대립유전자의 서열, 예를 들어, 표 C 에 기재된 SNP 를 갖고/거나 포함한다. 하나의 구현예에서, 단리된 핵산은 MAT1A 유전자의 대립유전자의 서열, 예를 들어, 표 D 에 기재된 SNP 를 갖고/거나 포함한다. 하나의 구현예에서, 단리된 핵산은 MAT2A 유전자의 대립유전자의 서열, 예를 들어, 표 E 에 기재된 SNP 를 갖고/거나 포함한다. 하나의 구현예에서, 단리된 핵산은 GART 유전자의 대립유전자의 서열, 예를 들어, 표 F 에 기재된 SNP 를 갖고/거나 포함한다. 하나의 구현예에서, 핵산은 MTHFR 대립유전자의 서열에 상응하고, M110I, H213R, D223N, D291N, R519C, R519L, 및 Q648P 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 MTHFR 단백질 내 비-동의적 돌연변이를 인코딩하는 서열을 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 엽산/호모시스테인 대사작용에 관여하는 유전자의 손상된 대립유전자를 검출하기 위한 어레이를 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 ATIC, GART, MAT1A, MAT2A, MTHFR 및 MTHFS 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자의 손상된 대립유전자를 검출하기 위한 어레이를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 어레이는 그룹으로부터 선택되는 유전자에 대해 하나 초과의 손상된 대립유전자를 검출할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 어레이는 그룹으로부터 선택되는 다수의 유전자에 대해 하나 초과의 손상된 대립유전자를 검출할 수 있다. 하나의 구현예에서, 어레이는 그룹으로부터 선택되는 다수의 유전자 각각으로부터 하나 초과의 손상된 대립유전자를 검출할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 어레이는 치유가능한 손상된 대립유전자인 그러한 손상된 대립유전자를 검출할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 어레이는 치유가능한 손상된 대립유전자인 다수의 그러한 손상된 대립유전자를 검출할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 손상된 대립유전자 중 하나 이상이 저-빈도 대립유전자이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 손상된 MTHFR 대립유전자를 검출하기 위한 어레이를 제공한다. 하나의 구현예에서, 어레이는 이들 인코팅 M110I, H213R, D223N, D291N, R519C, R519L, 및 Q648P 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비-동의적 돌연변이를 포함하는 MTHFR 대립유전자에 혼성화할 수 있는 하나 이상의 핵산을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 CBS 의 손상된 대립유전자를 검출하기 위한 어레이를 제공한다. 어레이는 CBS 의 손상된 대립유전자에 혼성화할 수 있는 하나 이상의 핵산을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 CTH 의 손상된 대립유전자를 검출하기 위한 어레이를 제공한다. 어레이는 CTH 의 손상된 대립유전자에 혼성화할 수 있는 하나 이상의 핵산을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 엽산/호모시스테인 대사작용에 관련된 다수의 유전자의 손상된 대립유전자를 검출하기 위한 어레이를 제공한다. 본 발명의 어레이는 당업계에 공지된 많은 어레이, 탐침 및 판독 기술 중 임의의 것을 사용할 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 엽산/호모시스테인 대사작용에 관련된 유전자의 치유가능한 손상된 대립유전자를 가지고 있는 개인에서 일탈 엽산/호모시스테인 대사작용과 연관된 상태 또는 질환을 예방하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 방법은 개인의 엽산의 섭취를 증가시키는 것을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 방법은 개인의 비타민 B6 의 섭취를 증가시키는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같이 일탈 엽산/호모시스테인 대사작용과 연관된 질환 또는 상태의 위험을 스크리닝하는 방법을 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 환자가 엽산/호모시스테인 대사작용에 관련된 유전자의 치유가능한 손상된 대립유전자를 가지고 있는, 일탈 엽산/호모시스테인 대사작용과 연관된 상태 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 방법은 환자의 엽산의 섭취를 증가시키는 것을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 방법은 개인의 비타민 B6 의 섭취를 증가시키는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같이 일탈 엽산/호모시스테인 대사작용과 연관된 질환 또는 상태의 위험을 스크리닝하는 방법을 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 엽산/호모시스테인 대사작용에 관련된 유전자의 치유가능한 손상된 대립유전자를 가지고 있는 개인의 화학요법 반응 잠재성을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 개인의 엽산의 섭취를 증가시키는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같이 일탈 엽산/호모시스테인 대사작용과 연관된 질환 또는 상태의 위험을 스크리닝하는 방법을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 유전자는 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A, 및 GART 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
하나의 양상에서, 본 발명은 엽산/호모시스테인 대사작용에 관련된 유전자의 치유가능한 손상된 대립유전자를 가지고 있는 개인을 위한 화학요법의 독성을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 개인의 엽산의 섭취를 증가시키는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같이 일탈 엽산/호모시스테인 대사작용과 연관된 질환 또는 상태의 위험을 스크리닝하는 방법을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 유전자는 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A, 및 GART 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
도 1. fol3Δ::KanMX 세포의 성장 속도 및 인간 MTHFR 의 세포 활성에 대한 폴린산 보충의 효과. (a) 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 96 웰 플레이트에서 fol3Δ::KanMX MET13 반수체 효모의 성장을 측정하였다. 배지에 폴린산을 지시된 농도로 보충하였다. 곡선 표지 FOL3 (FOL3 MET13) 은 폴린산이 없는 배지 내 성장으로부터 유래되었다. (b) 메티오닌이 결핍되고 폴린산이 지시된 농도로 보충된 배지 내 phMTHFR 로 형질전환된 fol3Δ::KanMX met13Δ::KanMX 반수체 효모의 성장. 3 개의 독립적인 형질전환체를 각각의 폴린산 농도에서 시험 재현성에 대해 시험하였다. 곡선 표지 met13Δ 은 50 ㎍/㎖ 폴린산에서 성장된, 빈 벡터로 형질전환된 세포의 단일 단리물을 나타냈다.
도 2. 비-동의적 MTHFR 집단 변이체의 기능적 영향 및 엽산-치유가능성. (a) 6 개의 MTHFR 변이체를 3 가지 상이한 폴린산 농도에서 메티오닌이 결핍된 배지 내 fol3Δ::KanMX met13Δ::KanMX 세포를 구제하는 능력에 대해 시험하였다. M110I 대립유전자 및 M110I A222V 이중-치환 대립유전자를 오직 50 및 25 ㎍/㎖ 폴린산에서만 시험하였다. 곡선 표지 주요 (Major) 는 집단 내에서 가장 흔한 MTHFR 대립유전자에 상응한다. 각각의 곡선은 3 ~ 6 개의 독립적 형질전환체의 풀 (pool) 로부터 유래한다. (b) MTHFR 단백질 (656 개의 아미노산) 의 도식은 거의 동일한 크기의 N-말단 촉매성 도메인 및 C-말단 조절 도메인으로 나뉜다 (35). 모든 비-동의적 변화의 위치가 표시된다. 양성 변화는 녹색이다. 1 에서 4 의 숫자 변화는 경중도의 순서가 증가하는 것을 나타내는 엽산-치유적 대립유전자를 나타낸다. 변화 #5 (R134C) 는 거의 기능-상실이고 엽산-치유적 (결과 참조) 으로서 지정되지 않으나, 다소 엽산-증강성이었다.
도 3. MTHFR 변이체의 효소 활성. 표시된 MTHFR 구축물로 형질전환된 세포로부터의 미정제 효모 추출물을 제조하고 본원에 기재된 바와 같이 MTHFR 활성에 대해 어세이하였다. 지시된 시간 동안의 열 처리는 방사능표지된 기질의 첨가 전 반응에 대해 수행되었다. 측정은 3 배수 어세이의 2 개의 독립적인 세트의 평균이었다; 오차 막대는 6 개 데이터 지점에 대한 표준 편차이다.
도 4. 효모에서 되풀이되는 바와 같은 MTHFR 변이체에 대한 이형접합체 표현형. MTHFR 대립유전자의 동형접합성 또는 이형접합성은 본원에 기재된 바와 같이 주요, R134C 및 A222V 대립유전자에 대해 2배체 효모에서 재현되었다. 2배체는, 각각 게놈 내에 통합된 MTHFR 의 단일 대립유전자를 발현하는 반수체 균주의 교배로부터 수득되었다. 폴린산 보충의 기능으로서의 성장은 반수체에 대한 것으로서 정확하게 어세이하였다.
도 5. 효모에서 발현된 인간 MTHFR 변이체의 면역블롯. (a) 상이한 MTHFR 대립유전자를 갖고 있는 효모 세포로부터 추출물을 제조하고 본원에 기재된 바와 같이 항-HA 항체로 검출하였다. A222V M110I 는 이중 치환 대립유전자였다; 주요는 집단 내 가장 공통적인 MTHFR 대립유전자를 나타낸다. 2 개의 최-우측 라인은 나란히, 주요 대립유전자 및 비-인산화가능 T34A 대립유전자였다 (37). (b) 본 연구에서 확인된 MTHFR 의 모든 변이체에 대한, 비인산화된 하부 밴드 대 인산화된 상부 밴드의 신호 강도 비는 기능적 강도의 증가하는 경중도의 함수로서 그래프로 작성되었다. x-축 상의 대립유전자는 활성에 대해 양성 또는 등급순으로 분류되었다. 모든 양성 대립유전자 (주요 대립유전자 및 모든 조절 도메인 변화 포함) 가 그래프로 작성되었고, 2 가지 MTHFR 종의 거의 동일한 비를 보여주므로, 기호가 중첩되었다.
도 6. 2 가지 인간 B6 효소: CBS 및 CTH 에서의 B6 (파이독신)-반응성에 대한 어세이.
발명의 상세한 설명
상기 표시된 바와 같이, 본 발명은 대사 경로 내 효소-인코딩 유전자의 손상된 대립유전자를 확인하고, 보조인자 치유에 대한 이들의 민감성을 측정하기 위한 신규한 생체 내 어세이를 제공한다. 관심의 기능적 상동 효소에 의한 상보성을 가능하게 하는 1 차 돌연변이, 및 보조인자의 보충에 의존하는 균주가 되게 하는 2 차 돌연변이 (또는 돌연변이 그룹) 를 포함하는 복합 효모 돌연변이체는 보조인자 가용성의 기능으로서 효소 상보성 연구를 제공한다. 구체적으로는, 본 발명은 또한 효소-인코딩 유전자 내 저-빈도 손상된 대립유전자의 보조인자 치유가 놀랍게도 공통적이고, 상기 대립유전자가 대사 경로에 대해 집합적으로 유의한 영향을 줄 수 있다는 것을 증명한다. 따라서, 본 발명은 효소-인코딩 유전자 내의 이러한 저-빈도 손상된 대립유전자의 검출 및 특징화, 및 효과적인 치유의 결정에 특히 초점을 둔 진단 및 예후 방법을 고려한다.
MTHFR 의 "N-말단 촉매성 도메인" 은 인간 MTHFR 내 아미노산 1-359 를 말한다. 참조 인간 MTHFR mRNA 서열은 Genbank 접근 번호 NM_005957 에서 찾은 반면, 인코딩된 656 아미노산 서열은 Genbank 접근 번호 NP_005958 에서 찾았다.
MTHFR 기능장애는 야생형 MTHFR 활성으로부터의 편차를 의미한다. 효소 기능장애 및 관련 상태 및 질환은 예를 들어, 효소의 특이적 활성의 변화, 효소의 잘못된 위치화, 효소 수준의 변화, 및 기타 변화를 통해 일어날 수 있다.
보조인자에 대한 이의 효소 활성 및 민감성을 측정하기 위한 생체 내 어세이
본원에 제공된 어세이는 기능적으로 상동인 효모 유전자 내 상보적 돌연변이에 대한 효소 인코딩 유전자의 대립유전자의 능력을 시험하기 위한 것 뿐 아니라, 상기 효소의 보조인자에 대한 반응성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 어세이는 효모 유전자의 정상 기능과 관련되고, 그의 기능장애에 의해 변형되는 산출물, 또는 표현형을 측정하는 것을 포함한다.
어세이는 관심의 기능적 상동 효소에 의한 상보성을 가능하게 하는 1 차 돌연변이, 및 첫번째 유전자의 기능과 관련된 검정가능한 표현형에 대해 보조인자의 보충에 의존하는 균주가 되게 하는 2 차 돌연변이를 포함하는 효모 균주의 사용을 포함한다.
본 방법은 (i) 효모 세포 내에 효소-인코딩 유전자의 시험 대립유전자를 도입하는 단계, 상기 효모 세포는 효소-인코딩 유전자에 대해 기능적으로 상동인 첫번째 유전자 중에 1 차 돌연변이, 및 효소 기능에 필요한 보조인자의 보충에 의존하는 효모 세포가 되게 하는 두번째 유전자 (또는 유전자 그룹) 중에 2 차 돌연변이를 포함하고, 상기 1 차 돌연변이는 첫번째 유전자의 기능과 관련된 효모의 측정가능한 특성을 변경함; (ii) 성장 배지에 보조인자를 보충하는 단계; 및 (iii) 야생형 효소의 존재보다는 시험 대립유전자의 존재하에서 측정가능한 특성의 복원이 덜 검출되므로, 시험 대립유전자에 의해 첫번째 유전자 돌연변이의 불완전 상보성을 검출하고 시험 대립유전자를 손상된 대립유전자로서 확인하는 단계를 포함한다. 보충된 보조인자의 양을 변화시킴으로써, 보조인자 가용성에 대한 손상된 대립유전자의 민감성을 측정한다.
바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자의 시험 대립유전자는 자연 발생적 대립유전자, 또는 개별적 자연 발생적 다형성의 복합체에 서열이 상응한다. 바람직한 구현예에서, 시험 대립유전자는 인간 유전자의 대립유전자, 또는 다수의 인간 대립유전자 내 개별적 다형성의 복합체에 서열이 상응한다.
바람직한 구현예에서, 효모는 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae ("S. 세레비지아에") 이지만, 다른 효모 종이 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 2배체 효모가 사용된다. 2배체 효모는 시험 대립유전자에 대해 동형접합 또는 이종접합일 수 있다. 2배체 효모는 야생형 유전자 및 시험 대립유전자를 포함할 수 있다. 2배체 효모는 시험 대립유전자의 조합을 포함할 수 있다. 본원에서 증명되는 바와 같이, 기능적으로 손상된 대립유전자에는 이종접합 표현형을 갖는 대립유전자가 포함될 수 있다. 하나의 구현예에서, 2배체 효모는 상보성에 대해 시험되는 대립유전자에 대하여 이종접합이다. 하나의 구현예에서, 2배체 효모는 효소-인코딩 유전자의 야생형 대립유전자 및 손상된 대립유전자를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 어세이의 측정된 산출량은 성장이다.
바람직한 구현예에서, 어세이 방법은 상응하는 야생형 대립유전자의 활성과 관심의 시험 대립유전자의 활성을 비교하는 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 시험 대립유전자, 예를 들어, 효소-인코딩 유전자의 대립유전자의 활성을 측정하기 위한 생체 내 어세이를 제공한다. 하나의 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 엽산/호모시스테인 대사작용에 관련되거나 이와 관계가 있다. 또다른 구현예에서, 시험 대립유전자는 MTHFR 대립유전자, ATIC 대립유전자, GART 대립유전자, MAT1A 대립유전자, MAT2A 대립유전자, 및 MTHFS 대립유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 어세이는 엽산 상태의 기능으로서 활성을 추가로 측정할 수 있다. 또다른 구현예에서, 효소-인코딩 대립유전자는 CTH 대립유전자 및 CBS 대립유전자로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 시험 대립유전자는 MTHFR 대립유전자이고, N-말단 촉매성 도메인 내 하나 이상의 치환 및 C-말단 조절 영역 내 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. C-말단 영역 내 치환 단독은 전형적으로 기능을 손상시키지 않지만, 대립유전자를 기능적으로 손상시키는 다른 치환과 조합될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 1 차 돌연변이는 효모 유전자 met13 에 있고, 이것은 야생형 인간 MTHFR 에 의해 기능적으로 상호보완될 수 있다. 또다른 구현예에서, 첫번째 효모 유전자는 ade16 또는 ade17 이고, 이것은 야생형 인간 ATIC 에 의해 기능적으로 보완될 수 있다. 하나의 구현예에서, 첫번째 효모 유전자는 ade7 이고, 이것은 야생형 인간 GART 에 의해 기능적으로 보완될 수 있다. 하나의 구현예에서, 첫번째 효모 유전자는 sam1 또는 sam2 이고, 이것은 야생형 인간 MAT1A 또는 야생형 인간 MAT2A 에 의해 기능적으로 보완될 수 있다. 하나의 구현예에서, 첫번째 효모 유전자는 fau1 이고, 이것은 야생형 인간 MTHFS 에 의해 기능적으로 보완될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 2 차 돌연변이는 효모 유전자 fol3 이고, 이것은 보충된 배지 내 엽산에 의존하는 효모가 되게 한다. 이러한 효모 균주는 시험 대립유전자의 활성, 1 차 돌연변이에 의존하는 시험 대립유전자, 및 엽산 상태에 대한 이의 반응을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 효모 유전자 met1 내 1 차 돌연변이, 및 효모 유전자 fol3 내 2 차 돌연변이를 갖는 복합 효모가, MTHFR 대립유전자의 활성 및 엽산 상태에 대한 이의 반응을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 어세이 방법은 시험 대립유전자에 의해 인코딩되는 효소가 엽산 가용성에 민감한지의 여부를 측정하기 위해 엽산의 양을 변화시키는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 어세이 방법에는 50 ㎍/㎖ 미만의 엽산의 존재하에서 산출량을 측정하는 것이 포함된다. 바람직한 구현예에서, 어세이 방법에는 약 50 ㎍/㎖ 엽산의 존재하에서 산출량을 측정하는 것이 포함된다. 바람직한 구현예에서, 어세이 방법에는 50 ㎍/㎖ 초과의 엽산의 존재하에서 산출량을 측정하는 것이 포함된다.
하나의 구현예에서, 엽산은 효소-인코딩 유전자의 손상된 대립유전자가 엽산에 의해 치유가능한 지의 여부를 측정하기 위해 변화된다.
또다른 구현예에서, 첫번째 효모 유전자는 cys3 이고, 두번째 효모 유전자는 6 자리-결실 sno1Δ sno2Δ sno3Δ snz1Δ snz2Δ snz3Δ 이다. 이러한 효모 균주는 CTH 대립유전자의 활성, 및 비타민 B6 상태에 대한 이의 반응을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 비타민 B6 상태의 기능으로서 활성을 추가로 측정할 수 있는, CTH 대립유전자의 활성을 측정하기 위한 생체 내 어세이를 제공한다. 바람직한 구현예에서, CTH 대립유전자는 자연 발생적 인간 대립유전자를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, CTH 대립유전자는 개별적 인간 CTH 대립유전자의 복합체를 포함한다.
또다른 구현예에서, 첫번째 효모 유전자는 cys4 이고, 두번째 효모 유전자는 6 자리-결실 sno1Δ sno2Δ sno3Δ snz1Δ snz2Δ snz3Δ 이다. 이러한 효모 균주는 CBS 대립유전자의 활성, 및 비타민 B6 상태에 대한 이의 반응을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 비타민 B6 상태의 기능으로서 활성을 추가로 측정할 수 있는, CBS 대립유전자의 활성을 측정하기 위한 생체 내 어세이를 제공한다. 바람직한 구현예에서, CBS 대립유전자는 자연 발생적 인간 대립유전자를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, CBS 대립유전자는 개별적 인간 CBS 대립유전자의 복합체를 포함한다.
하기 표 1 에는 효소-인코딩 유전자가 열거되어 있고, 효소-인코딩 유전자의 대립유전자의 활성을 측정하기 위해 사용될 수 있는 예시적 복합 효모 돌연변이가 제시되어 있다.
Figure pct00001
효모 균주는 당업계에 잘 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, [Shan et al., JBC, 274:32613-32618, 1999] 를 참조한다.
효모 균주 내 핵산의 도입은 당업계에 잘 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, [Shan et al., JBC, 274:32613-32618, 1999] 를 참조한다.
효소-인코딩 유전자의 신규 대립유전자
실시예 영역에서 기재되는 바와 같이, 효소에 미묘하게 영향을 주는, 예를 들어, 효소-인코딩 유전자의 손상된 대립유전자를 산출하는 단일 뉴클레오티드 다형성은 대립유전자의 빈도와 관련 없이 본원에 기재된 생체 내 어세이를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법은 대립유전자가 손상된 대립유전자인지, 그렇다면 손상된 대립유전자가 보조인자-치유가능한지의 여부를 측정하기 위해 사용되었다. 표 3 및 표 A-F 에서 제시된 것은 본원에 기재된 어세이에 의해 특징화된 (표 3) 또는 특징화될 수 있는 (표 A-F) 효소-인코딩 유전자 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A 및 GART 에 대한 단일 뉴클레오티드 다형성이다. 상기 표에는 또한 미리 확인되지 않은 상기 유전자에 대한 SNP 가 제시되어 있다. 따라서, 본원에 기재된 것은 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A, 및 GART 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소-인코딩 유전자에 대한 신규 대립유전자이다. 상기 대립유전자는 본원에 기재된 어세이를 사용하여 특징화될 수 있고, 본원에 기재되는 바와 같은 스크리닝, 예방 및 치료 방법에서 유리하게 검출될 수 있다. 당업자는 보조인자 치유가능한 것으로서 손상된 대립유전자의 특징화가 본원에 기재되는 바와 같은 스크리닝, 예방 및 치료 방법을 알려준다는 것을 인지 및 인식할 것이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "대립유전자" 는 뉴클레오티드 서열, 예컨대, 게놈 내 하나 초과의 형태로 존재하는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 이다. 본원에 기재된 바와 같은 "대립유전자" 는 게놈 유전자좌의 자연 발생적 서열에 제한되지 않는다. "대립유전자" 에는 전사체 및 이로부터 유도되는 스플라이싱된 서열 (예를 들어, mRNA 서열, cDNA 서열) 이 포함된다. "대립유전자" 는 자연 발생적 대립유전자 또는 합성 대립유전자일 수 있다. 여기에는 N-말단 촉매성 도메인 내 돌연변이 뿐 아니라, C-말단 조절 영역 내 돌연변이가 포함될 수 있다.
본 발명에 따르면 "동형접합" 은 2 개 카피의 유전자 또는 SNP 가 다른 대립유전자와 서열이 일치하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 효소-인코딩 유전자의 야생형 대립유전자에 대한 대상 동형접합은 서열의 2 개 이상의 일치하는 카피를 함유한다. 이러한 대상은 대사 경로 내 보조인자-의존성 효소 결핍증에 취약하지 않을 것이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "이종접합" 은 2 개의 상이한 카피의 대립유전자, 예를 들어, 1 개 카피의 야생형 대립유전자 및 손상된 대립유전자일 수 있는 1 개 카피의 변이체 대립유전자가 게놈에 존재하는 것을 나타낸다. 이러한 게놈을 갖는 대상은 이종접합이고, 대사 질환 내 보조인자-의존성 효소 결핍증에 취약할 수 있다. "이종접합" 은 또한 그 대립유전자 내에 2 개의 상이한 돌연변이를 갖는 대상을 포함한다.
"손상된 대립유전자" 는 기능적으로 손상된 대사 효소를 인코딩하는 유전자의 대립유전자를 의미하고, 이의 기능 장애는 보조인자-치유가능할 수 있거나 할 수 없다.
"손상된 대립유전자 돌연변이" 는 손상된 대립유전자의 기능 장애의 근원이 되고, 돌연변이 지점에서 손상된 대립유전자와 야생형 서열을 구별하는 특정 핵산 돌연변이를 말한다. 전형적으로는, 손상된 대립유전자 돌연변이는 단일 코돈 내 비-동의적 지점 돌연변이이다.
"보조인자-치유가능한" 은 손상된 대사 효소의 기능 장애를 보상하기 위한 변형된 보조인자 수준의 능력을 말한다.
보조인자로의 보충에는 보조인자로 전환될 수 있는 보조인자의 전구체로의 보충이 포함된다.
"보조인자" 는 관심의 효소의 직접적인 보조인자인 인자 (예를 들어, MTHFR, ATIC, GART, MAT1A, MAT2A, 및 MTHFS 의 경우 엽산) 뿐 아니라 관심의 효소에 대한 간접적인 보조인자인 인자를 말한다. 그러므로, 보조인자는 효소 기능에 직접적으로 또는 간접적으로 영향을 줄 수 있다.
당업계에 공지된 빈도의 측정치에는 "대립유전자 빈도", 즉 특이적 SNP 를 갖는 집단 내 유전자의 분획이 포함된다. 임의의 유전자에 대한 대립유전자 빈도는 합계가 1 이어야만 한다. 당업계에 공지된 빈도의 또다른 측정치는 "이형접합체 빈도", 즉 하나는 각 부모로부터 유전되는 유전자의 SNP 의 2 개의 형태 또는 2 개의 대립유전자를 갖고 있는 집단 내 개인의 분획이다. 대안적으로는, 유전자의 특정 대립유전자에 대해 동형접합인 개인의 수는 유용한 측정치일 수 있다. 대립유전자 빈도, 이형접합체 빈도, 및 동형접합체 빈도 사이의 관계는 자유롭게 번식된 집단 내 대립유전자 빈도, 이형접합체 빈도 및 동형접합체 빈도 사이의 관계를 평형에서 제시하는 하디-와인버그 (Hardy-Weinberg) 방정식에 의해 많은 유전자에 대해 기술된다. 대부분의 인간 변이는 하디-와인버그 평형으로 있다. 본원에 사용되는 바와 같은, "저-빈도 대립유전자" 는 4% 미만의 대립유전자 빈도를 갖는다.
본원에 기재되는 것은 엽산/호모시스테인 대사작용에 관여하는 또는 이와 관련이 있는 인간 효소-인코딩 유전자에 대한 신규 대립유전자이다. "엽산/호모시스테인 대사작용" 은 엽산 및/또는 호모시스테인 대사작용을 의미한다. 이러한 효소-인코딩 유전자에는 MTHFR, ATIC, GART, MAT1A , MAT2A 및 MTHFS 가 포함된다. 휴고 유전자 명명 위원회 (Hugo Gene Nomenclature Committee: HGNC) 기호, 유전자ID (GeneID), NCBI 뉴클레오티드 접근 번호 (NC_), NCBI 폴리펩티드 접근 번호 (NB_) 및 엽산/호모시스테인 대사작용에 관여하는 또는 이와 관련된 효소-인코딩 유전자의 명칭이 표 2 에 제시된다.
Figure pct00002
하나의 양상에서, 본 발명은 엽산/호모시스테인 대사작용에 관여하는 신규 인간 효소-인코딩 대립유전자에 서열이 상응하는 단리된 핵산을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 MTHFR 대립유전자, ATIC 대립유전자, GART 대립유전자, MAT1A 대립유전자, MAT2A 대립유전자, 및 MTHFS 대립유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소-인코딩 대립유전자에 서열이 상응하는 단리된 핵산을 제공하며, 이것은 보조인자-치유가능할 수 있거나 할 수 없다. 상기 신규 대립유전자에는 저-빈도 대립유전자가 포함된다. 상기 신규 대립유전자에는 손상된 대립유전자가 포함된다.
따라서, 본원에서는 핵산이 MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 4078; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 4234; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 5733; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 5872; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 6642; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 6657; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 6681; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 6774; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 10906; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 11656; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 11668; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 11902; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 12232; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 2622; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 12759; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 13040; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 14593; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 14612; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 14705; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 13170; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 116401; 및 MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 116451 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드에서 발견된 SNP 를 포함하는, MTHFR 유전자의 대립유전자에 대한 서열에 상응하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 위치에서의 SNP 의 서열은 표 A 에 제시되어 있다.
또한, 본원에서는 핵산이 ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1100; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1114; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1179; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1244; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1270; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1288; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1301; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1380; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1396; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1453; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1506; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1689; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 7227; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 7232; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 7388; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 8756; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 8808; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14099; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14140; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14144; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14183; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14229; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14238; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14245; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14260; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14489; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14970; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 15003; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 15040; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 15043; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 15149; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 15240; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 15844; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 16063; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 21363; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 21372; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 21400; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 21521; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 21611; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22187; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22273; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22282; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22291; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22342; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22512; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22519; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22538; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22564; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22589; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22737; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 24992; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 25009; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 27757; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 27855; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 27985; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 28015; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 33901; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 33919; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 33920; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 33933; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35723; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35737; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35742; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35840; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35917; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35968; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35973; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38338; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38342; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38437; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38342; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38582; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38627; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38667; 및 ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38725 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드에서 발견된 SNP 를 포함하는, ATIC 유전자의 대립유전자에 대한 서열에 상응하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 위치에서의 SNP 의 서열은 표 B 에 제시되어 있다.
또한, 본원에서는 핵산이 MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 8808; MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 8912; MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 8957; MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 8998; MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 52560; MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 52878; 및 MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 52902 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드에서 발견된 SNP 를 포함하는, MTHFS 유전자의 대립유전자에 대한 서열에 상응하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 위치에서의 SNP 의 서열은 표 C 에 제시되어 있다.
또한, 본원에서는 핵산이 MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 5045; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 5181; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 5233; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 6739; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 6795; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 9833; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 10006; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 10312; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 10339; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 10374; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 10484; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 10555; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 14038; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 14114; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 14177; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15424; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15500; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15646; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15706; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15715; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15730; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15758; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 16133; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 16174; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15706; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15715; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15730; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15758; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 16133; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 16174; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 16218; 및 MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 16971 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드에서 발견된 SNP 를 포함하는, MAT1A 유전자의 대립유전자에 대한 서열에 상응하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 위치에서의 SNP 의 서열은 표 D 에 제시되어 있다.
또한, 본원에서는 핵산이 MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 2871; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 2873; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 2939; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 3287; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 3394; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 3466; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 3498; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 3650; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 3704; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4174; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4449; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4476; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4608; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4660; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4692; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4931; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 5313; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 5460; 및 MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 5480 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드에서 발견된 SNP 를 포함하는, MAT2A 유전자의 대립유전자에 대한 서열에 상응하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 위치에서의 SNP 의 서열은 표 E 에 제시되어 있다.
또한, 본원에서는 핵산이 GART 유전자의 뉴클레오티드 3782; GART 유전자의 뉴클레오티드 3842; GART 유전자의 뉴클레오티드 7745; GART 유전자의 뉴클레오티드 7984; GART 유전자의 뉴클레오티드 10775; GART 유전자의 뉴클레오티드 11521; GART 유전자의 뉴클레오티드 11522; GART 유전자의 뉴클레오티드 11541; GART 유전자의 뉴클레오티드 12356; GART 유전자의 뉴클레오티드 14200; GART 유전자의 뉴클레오티드 14273; GART 유전자의 뉴클레오티드 14282; GART 유전자의 뉴클레오티드 14739; GART 유전자의 뉴클레오티드 14781; GART 유전자의 뉴클레오티드 18055; GART 유전자의 뉴클레오티드 18064; GART 유전자의 뉴클레오티드 18130; GART 유전자의 뉴클레오티드 18142; GART 유전자의 뉴클레오티드 18197; GART 유전자의 뉴클레오티드 18232; GART 유전자의 뉴클레오티드 18401; GART 유전자의 뉴클레오티드 20812; GART 유전자의 뉴클레오티드 20825; GART 유전자의 뉴클레오티드 16174; GART 유전자의 뉴클레오티드 15706; GART 유전자의 뉴클레오티드 20862; GART 유전자의 뉴클레오티드 22481; GART 유전자의 뉴클레오티드 22521; GART 유전자의 뉴클레오티드 25425; GART 유전자의 뉴클레오티드 25433; GART 유전자의 뉴클레오티드 25601; GART 유전자의 뉴클레오티드 25867; GART 유전자의 뉴클레오티드 25912; GART 유전자의 뉴클레오티드 25951; GART 유전자의 뉴클레오티드 25956; GART 유전자의 뉴클레오티드 26127; GART 유전자의 뉴클레오티드 26195; GART 유전자의 뉴클레오티드 31627; GART 유전자의 뉴클레오티드 31641; GART 유전자의 뉴클레오티드 31887; GART 유전자의 뉴클레오티드 31902; GART 유전자의 뉴클레오티드 31933; GART 유전자의 뉴클레오티드 33173; GART 유전자의 뉴클레오티드 33264; GART 유전자의 뉴클레오티드 31933; GART 유전자의 뉴클레오티드 33173; GART 유전자의 뉴클레오티드 33264; GART 유전자의 뉴클레오티드 33286; GART 유전자의 뉴클레오티드 36963; GART 유전자의 뉴클레오티드 36964; GART 유전자의 뉴클레오티드 37428; GART 유전자의 뉴클레오티드 37433; GART 유전자의 뉴클레오티드 38762; GART 유전자의 뉴클레오티드 38914; 및 GART 유전자의 뉴클레오티드 38989 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 GART 유전자 내 뉴클레오티드에서 발견된 하나의 SNP 를 포함하는, GART 유전자의 대립유전자에 대한 서열에 상응하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 위치에서의 SNP 의 서열은 표 F 에 제시되어 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 M110I, H213R, D223N, D291N, R519C, R519L, 및 Q648P 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 MTHFR 단백질 내 비-동의적 돌연변이를 인코딩하는 서열을 포함하는 인간 MTHFR 대립유전자와 서열에 상응하는 단리된 핵산을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 M110I, H213R, D223N, D291N, R519C, R519L, 및 Q648P 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 MTHFR 단백질 내 비-동의적 돌연변이를 인코딩하는 서열을 포함하는 2 개 이상의 인간 MTHFR 대립유전자와 서열에 상응하는 핵산을 제공한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "단리된" 이라는 용어에는 자연적으로 연관되어 있는 다른 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물 또는 기타 물질이 실질적으로 없는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열에는 DNA 및 RNA 서열이 포함된다.
본원에 제공되는 핵산은 본원에 기재된 검출 방법에서 탐침 (예를 들어, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 탐침) 또는 프라이머로서 유용할 수 있다. 본 목적에 적합한 탐침 또는 프라이머의 디자인은 다수의 인자를 고려하는 것을 필요로 한다. 예를 들어, 10, 15, 또는 18 개의 뉴클레오티드 내지 약 20, 또는 내지 약 30 개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 분절은 특정 용도가 발견될 것이다. 더 긴 서열, 예를 들어, 40, 50, 80, 90, 100 개, 심지어 전장의 서열은 특정 구현예에 심지어 더욱 바람직하다. 적어도 약 18 내지 20 개의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 길이는, 충분히 특이적인 혼성화를 허용하기에 충분하여 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 탐침으로서 유용하도록 당업자에 의해 잘 용인된다. 게다가, 계획하는 적용에 따라, 표적 서열에 대한 탐침의 선별성 정도를 다양하게 하기 위해 혼성화 조건을 다양하게 사용하는 것이 바람직할 것이다. 고 선별성이 필요한 적용을 위해서는, 전형적으로는 혼성체를 형성하기 위해 비교적 엄격한 조건을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 비교적 저염 및/또는 고온 조건은, 예컨대 약 50℃ 내지 약 70℃ 의 온도에서 0.02 M ~ 0.15 M NaCl 에 의해 제공된다. 이러한 선택 조건은 탐침과 주형 또는 표적 폴리뉴클레오티드 분절 사이에 미스매치가 있는 경우 약간은 용인할 수 있다.
또한 제공되는 것은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터이다. 이러한 벡터에는 적합한 숙주 세포 내 본 발명의 핵산의 발현을 제공하는 발현 벡터가 포함된다.
부가적으로 제공되는 것은 본 발명의 핵산을 포함하는 숙주 세포이다. 또한 제공되는 것은 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포이다. 본 발명은 또한 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 본 발명의 핵산에 의해 인코딩되는 효소를 제조하는 방법을 제공한다.
또한 제공되는 것은 본 발명의 핵산에 의해 인코딩되는 단리된 효소이다.
손상된 대립유전자의 검출
본원에 기재된 방법 (예를 들어, 대사 경로에 관련된 유전자의 손상된 대립유전자와 연관된 상태 또는 질환의 스크리닝, 예방 및/또는 치료 방법) 은 일반적으로는 손상된 대립유전자; 바람직하게는 시험 유전자 내 다수의 공지된 SNP 를 산출할 수 있는 대사 경로 내 하나 이상의 효소-인코딩 유전자 중의 다수의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 필요로 한다. 대립유전자 및/또는 미리 결정된 서열 SNP 는 정상과 손상된 대립유전자 사이의 구별을 가능하게 하는 대립유전자 특이적 혼성화, 서열-의존적-기반 기술에 의해 검출될 수 있다. 대립유전자 특이적 어세이는 매칭된 (예를 들어, 정상:정상 또는 손상된:손상된) 서열과 비교하여, 서로 혼성화되는 미스매치된 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 정상:손상된) 의 차별되는 능력에 따라 다르다.
개인 중에서 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성의 존재를 검출하기 위해 다양한 방법이 이용가능하다. 이 분야에서의 진보로 정확하고, 용이하고, 적은 비용의 대규모 SNP 유전형 검사가 제공되었다. 가장 최근에는 예를 들어, 동적 대립유전자-특이적 혼성화 (DASH), 마이크로플레이트 어레이 진단 젤 전기영동 (MADGE), 파이로서열분석, 올리고뉴클레오티드-특이적 라이게이션, TaqMan 시스템 뿐 아니라 다양한 DNA "칩" 기술, 예컨대 Affymetrix SNP 칩을 포함하여 여러 신규한 기술이 기술되고 있다. 이러한 방법은 전형적으로 PCR 에 의한 시험 유전자의 증폭을 필요로 할 수 있다. 공격적인 절단 후 질량 분석 또는 고정된 자물쇠 탐침 및 롤링-사이클 증폭에 의한 작은 신호 분자의 발생에 근거한 또 다른 새롭게 개발된 방법은, 결국 PCR 을 필요로 하지 않을 것이다. 특이적인 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하기 위한 당업계에 공지된 여러 방법은 하기에 요약되어 있다. 본 발명의 방법은 모든 이용가능한 방법을 포함하는 것으로 이해된다.
단일 뉴클레오티드 다형성의 분석을 용이하게 하기 위해 여러 방법이 개발되었다. 하나의 구현예에서, 단일 염기 다형성은 예를 들어, Mundy, C. R. (U.S. Pat. No. 4,656,127) 에 기재된 바와 같이 특이화된 엑소뉴클레아제-내성 뉴클레오티드를 사용하여 검출될 수 있다. 본 방법에 따르면, 대립유전자에 대해 바로 3' 대립유전자 서열에 상보적인 프라이머는 특정 동물 또는 인간으로부터 수득되는 표적 분자에 혼성화되게 한다. 표적 분자 상의 대립유전자가 존재하는 특정 엑소뉴클레아제-내성 뉴클레오티드 유도체에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 경우, 유도체는 혼성화된 프라이머의 말단 상에 혼입될 것이다. 이러한 혼입은 프라이머를 엑소뉴클레아제에 대해 내성이 되게 하여, 검출을 가능하게 한다. 샘플의 엑소뉴클레아제-내성 유도체의 정체는 알려져 있으므로, 프라이머가 엑소뉴클레아제에 대해 내성이 되었다는 발견은 표적 분자의 대립유전자에 존재하는 뉴클레오티드가 반응에 사용되는 뉴클레오티드 유도체의 것에 상보적이라는 것을 밝힌다. 본 방법은 다량의 관련 없는 서열 데이터의 측정을 필요로 하지 않는 장점을 갖는다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 용액-기반 방법은 대립유전자의 뉴클레오티드의 정체를 확인하기 위해 사용된다 [Cohen, D. et al. (French Patent 2,650,840; PCT Appln. No. WO91/02087)]. U.S. Pat. No. 4,656,127 의 Mundy 방법에서, 프라이머는 다형성 부위에 대해 바로 3' 대립유전자 서열에 상보적인 것이 사용된다. 본 방법은 대립유전자의 뉴클레오티드에 상보성인 경우 표지된 디데옥시뉴클레오티드 유도체를 사용하는 부위가 프라이머의 말단 상에 혼입되게 될 것인 뉴클레오티드의 정체를 확인한다.
Genetic Bit Analysis 또는 GBA™ 으로 알려져 있는 대안적인 방법이 [Goelet, P. et al. (PCT Appln. No. 92/15712)] 에 기재되어 있다. [Goelet, P. et al.] 의 방법은 대립유전자에 대해 3' 서열에 상보적인 프라이머 및 표지된 터미네이터의 혼합물을 사용한다. 그러므로 혼입되는 표지된 터미네이터는 시험 유전자의 대립유전자에 존재하는 뉴클레오티드에 의해 측정되고, 이에 상보적이다. [Cohen et al. (French Patent 2,650,840; PCT Appln. No. WO91/02087)] 의 방법과는 반대로 [Goelet, P. et al.] 의 방법은 바람직하게는 프라이머 또는 표적 분자가 고체 상에 고정되는 비균질 상 어세이이다.
최근, DNA 내 대립유전자를 어세이하기 위한 여러 프라이머-지침 뉴클레오티드 혼입 절차가 기재되어 있다 (Komher, J. S. et al., Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989); Sokolov, B. P., Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990); Syvanen, A. -C, et al., Genomics 8:684-692 (1990); Kuppuswamy, M. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143-1147 (1991); Prezant, T. R. et al., Hum. Mutat. 1:159-164 (1992); Ugozzoli, L. et al., GATA 9:107-112 (1992); Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208:171-175 (1993)). 상기 방법들은, 이들이 모두 대립유전자에서의 염기 사이를 구별하기 위해 표지된 데옥시뉴클레오티드의 혼입에 의존한다는 것이 GBA™ 와는 다르다. 이러한 포멧에서, 신호는 혼입된 데옥시뉴클레오티드의 수에 비례하므로, 동일한 뉴클레오티드의 이동 (run) 에서 발생하는 단일 뉴클레오티드 다형성이 이동 길이에 비례하는 신호를 야기할 수 있다 (Syvanen, A. -C. et al., Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993)).
임의의 세포 유형 또는 조직은 본원에 기재된 진단에서 사용하기 위한 핵산 샘플을 수득하는데 이용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, DNA 샘플은 체액, 예를 들어 공지된 기술 (예를 들어, 정맥천자) 에 의해 수득된 혈액 또는 타액으로부터 수득된다. 대안적으로는, 핵산 시험은 건조 샘플 (예를 들어, 모발 또는 피부) 상에서 수행될 수 있다. RNA 또는 단백질을 사용하는 경우, 이용될 수 있는 세포 또는 조직은 효소-인코딩 유전자를 발현해야만 한다.
또한 검출 방법은 생검 또는 절제로부터 수득되는 환자 조직의 조직 섹션 (고정된 및/또는 동결된) 상에서 직접적으로 제자리에서 수행될 수 있고, 이 때 핵산 정제는 필요없다. 핵산 시약은 이러한 제자리 절차를 위해 탐침 및/또는 프라이머로서 사용될 수 있다 (예를 들어, Nuovo, G. J., 1992, PCR in situ hybridization: protocols and applications, Raven Press, NY 참조).
주로 하나의 핵산 서열 검출에 초점을 두고 있는 방법 외에, 이러한 검출 계획에서 프로파일을 또한 평가할 수 있다. 핑거프린트 프로파일은 예를 들어, 차이 디스플레이 절차, 노던 분석 및/또는 RT-PCR 을 사용하여 생성될 수 있다.
바람직한 검출 방법은 효소 인코딩 유전자의 하나 이상의 대립유전자의 영역과 중복되는 탐침을 사용하는 대립유전자 특이적 혼성화이다.
대립유전자 특이적 혼성화를 사용하는 손상된 대립유전자의 검출
대립유전자 특이적 혼성화에 의한 손상된 대립유전자의 검출을 위해 당업계에 잘 알려진 다양한 방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 시험 대립유전자는 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO) 로 탐침되고; 각각의 ASO 는 공지된 대립유전자의 서열을 포함한다. ASO 분석은 표적 폴리뉴클레오티드 분절에 혼성화하는 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드에 대한 탐침의 능력을 시험함으로써 표적 폴리뉴클레오티드 분절에서의 특이적 서열 치환을 검출한다. 바람직하게는, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 탐침은 손상된 대립유전자의 서열 (또는 그의 상보체) 를 함유한다. 표적 폴리뉴클레오티드 분절 내 손상된 대립유전자의 존재는 야생형 대립유전자의 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드 탐침이 표적 폴리뉴클레오티드 분절에 혼성화하지 않는 조건 하에서 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 탐침과 표적 폴리뉴클레오티드 분절 사이의 혼성화에 의해 표시된다. 손상된 대립유전자의 서열을 갖는 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 탐침과 표적 폴리뉴클레오티드 분절 사이의 혼성화의 결핍은 표적 분절 내 손상된 대립유전자의 부재를 나타낸다.
하나의 구현예에서, 표적 유전자(들) 은 표준 도트 블롯 포맷에서 탐침될 수 있다. ASO 에 상응하는 서열을 함유하는 시험 유전자 내 각각의 영역은 예를 들어, 막 상의 개별적인 도트로서 개별적으로 고체 표면에 적용된다. 각각의 개별적인 영역은 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 방법 (예를 들어, Mullis, K. B., 1987, U.S. Pat. No. 4,683,202 에 언급된 실시 구현예 참조) 을 사용하여 별도의 PCR 증폭 생성물로서 제조될 수 있다.
ASO 분석 수행을 위해 도트 블롯 포맷에 대한 대안으로서 사용될 수 있는 막-기반 포맷에는 역 도트 블롯, (복합 증폭 어세이), 및 복합 대립유전자-특이적 진단 어세이 (MASDA) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
역 도트 블롯 포맷에서, 예를 들어, 공지된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 탐침은 고체 표면 상에 고정되고, 그 후 표지된 시험 폴리뉴클레오티드 분절을 포함하는 샘플로 혼성화된다. 본 상황에서, 프라이머는 표지될 수 있고, 또는 NTP 는 표지된 시험 폴리뉴클레오티드 분절을 포함하는 샘플을 제조하기 위해 증폭 전에 표지될 수 있다. 대안적으로는, 시험 폴리뉴클레오티드 분절은 단리 및/또는 합성 후에 표지될 수 있다. 복합 포맷에서, 개별 샘플은 단지 단일 표적 서열 대신에 표적 유전자 내에 다중 표적 서열을 함유한다. 예를 들어, ASO 표적 서열 중 하나 이상을 함유하는 다중 PCR 생성물 각각은 동일한 샘플 도트 내 적용된다. 다중 PCR 생성물은 [Caskey et al., U.S. Pat. No. 5,582,989] 의 방법을 사용하는 단일 증폭 방법에서 동시에 생성될 수 있다. 그러므로 동일한 도트는 상응하는 서열이 샘플 도트에서 제시되는 각각의 ASO 에 의해 탐침될 수 있다.
MASDA 포맷은 (다중 표적 서열을 갖는 도트를 함유하는) 각각의 블롯을 탐침하기 위해 다중 ASO 를 사용하여 복합 포맷의 복합성 수준을 확장한다. 본 절차는 본원에 전체가 참조로서 인용되어 있는 U.S. Pat. No. 5,589,330 [A. P. Shuber] 및 [Michalowsky et al., American Journal of Human Genetics, 59(4): A272, poster 1573 (October 1996)] 에 상세히 기재되어 있다. 첫째로, 다중 ASO 탐침과 고정화 샘플 사이의 혼성화가 검출된다. 본 방법은 제시된 도트 내 다중 표적 서열 중 돌연변이의 존재가, 상응하는 손상된 대립유전자로 혼성화되는 탐침 혼합물 내 단일 ASO 로부터의 임의의 양성 혼성화 신호 결과보다 충분히 드물다는 예측에 의존한다. 그 다음 혼성화 ASO 는, 이것을 혼성화 부위로부터 단리하고 뉴클레오티드 서열을 측정하여 확인된다.
도트 블롯, 역 도트 블롯, 복합, 및 MASDA 포맷에서 사용될 수 있는 적합한 물질은 당업계에 잘 알려져 있고, 나일론 및 니트로셀룰로오스 막이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
표적 서열이 PCR 증폭에 의해 생성되는 경우, 출발 물질은 DNA 가 직접 증폭되는 경우 염색체 DNA 일 수 있다. 대안적으로는, 출발 물질은 mRNA 일 수 있고, 이 경우 mRNA 는 먼저 cDNA 로 역전사된 후, 잘 알려진 RT-PCR 기술에 따라 증폭된다 (예를 들어, U.S. Pat. No. 5,561,058, Gelfand et al. 참조).
상기 기재된 방법은 제한된 수의 서열 변이 (예를 들어, 손상된 대립유전자) 의 적정한 스크리닝에 적합하다. 그러나, 빠르고, 비용면에서 효율적인 대규모 스크리닝을 위한 분자 진단이 필요하여, ASO 의 기본 개념을 통합하나, 돌연변이 검출 및 샘플 수에 대한 역량을 크게 초과하는 기술이 개발되고 있다. 상기 기재된 것에 대한 이러한 대안적인 방법에는 대규모 칩 어레이 서열-기반 기술이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 대규모 어레이를 사용하면 많은 서열 변이체에 대한 빠른 분석이 가능하다. 칩 어레이의 적용 및 개발에서의 차이에 대한 리뷰는 [Southern, E. M., Trends In Genetics, 12: 110-115 (March 1996)] 및 [Cheng et al., Molecular Diagnosis, 1:183-200 (September 1996)] 에 제시되어 있다. 칩 어레이의 제조를 포함하여 여러 접근법이 존재한다. 차이에는 고정된 올리고뉴클레오티드를 부착시키기 위한 고체 지지체의 유형, 변이체 확인을 위한 표지화 기술 및 탐침에 대한 표적 폴리뉴클레오티드의 서열-기반 기술에서의 변화가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
'DNA 칩' 상에서의 대규모 분석을 위한 유망한 방법론은 본원에 전체가 참조로서 인용되어 있는 [Hacia et al., Nature Genetics, 14:441-447 (1996)] 에 상세히 기재되어 있다. [Hacia et al.] 에 기술된 바와 같이, 96,000 개가 넘는 올리고뉴클레오티드 (길이는 각각 20 개 뉴클레오티드) 의 고밀도 어레이가 광유도 화학 합성을 사용하여 단일 유리 또는 규소 칩 상에 고정화된다. 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 탐침의 수 및 디자인에 따라, 잠재적으로 서열 내 모든 염기가 변형을 위해 검사될 수 있다. 그러므로 칩에 적용된 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 탐침은 서열 변이, 예를 들어, 집단 내에서 발생하는 것으로 아직 알려지지 않은 SNP 를 함유할 수 있거나, 이들은 집단 내에서 발생하는 것으로 알려진 SNP 에 제한될 수 있다.
칩 상에 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 탐침으로의 혼성화 전, 당업자에게 잘 알려진 수단에 의해 시험 샘플을 단리하고, 증폭시키고 표지한다 (예를 들어, 형광 마커). 그 다음 시험 폴리뉴클레오티드 샘플을 고정된 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 탐침에 혼성화시킨다. 고정된 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 탐침에 대한 표적 폴리뉴클레오티드 분절의 서열-기반 기술의 강도를 정량하고, 참조 서열과 비교한다. 수득된 유전적 정보는 분자적 진단에 사용될 수 있다. 분자적 진단에서의 'DNA 칩' 의 통상적인, 그러나 제한되지 않는 유용성은 공지된 SNP 에 대한 스크리닝이다. 그러나, 이것은 본 분야에서 기재되는 돌연변이 만을 살핌으로써 기술에 제한을 줄 수 있다. 본 발명은 대립유전자 특이적 혼성화 분석을 이전에 이용되었던 것보다 더 많은 수의 돌연변이로 수행할 수 있게 한다. 그러므로, 대규모 ASO 분석의 효율 및 포괄성이 확장되어, 공지된 돌연변이 뿐 아니라 허용되는 원리에 의해 예상되는 바와 같이 일어날 것인 포괄적인 방식으로 모든 돌연변이로도 번거로운 종단간 (end-to-end) 서열 분석의 필요성을 감소시키고, 상기 번거로운 시험과 관련된 비용 및 시간이 감소할 것이다.
따라서, 하나의 양상에서, 본 발명은 효소-인코딩 유전자 또는 효소-인코딩 핵산의 손상된 대립유전자를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 본원에 제공되는 것은 MTHFR, ATIC, CBS, CTH, GART, MAT1A, MAT2A, 및 MTHFS 의 대립유전자를 검출하는 방법이다.
하나의 구현예에서, 효소-인코딩 핵산 내에서 SNP 를 검출하는 것은 핵산 서열분석을 포함한다. 하나의 구현예에서, 효소-인코딩 핵산 내에서 돌연변이를 검출하는 것은 PCR 을 포함한다. 하나의 구현예에서, 효소-인코딩 핵산 내에서 돌연변이를 검출하는 것은 RFLP 분석을 포함한다. 하나의 구현예에서, 효소-인코딩 핵산 내에서 돌연변이를 검출하는 것은 핵산 혼성화를 포함한다. 혼성화를 통한 돌연변이 SNP 의 검출은 예를 들어, 효소-인코딩 핵산, 또는 이러한 SNP 를 포함하는 이의 분절에 대해 엄격한 조건 하에서 혼성화될 핵산을 포함하는 핵산 어레이를 사용하여 수행될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재되는 바와 같은 효소-인코딩 유전자의 대립유전자의 활성을 측정하기 위한 생체 내 어세이의 용도를 포함한다.
방법의 조합은 또한 효소-인코딩 유전자의 손상된 대립유전자를 검출하고 특징화하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재되는 바와 같은 효소-인코딩 유전자의 활성을 측정하고, 효소-인코딩 핵산 내 SNP 를 검출하는 것을 위한 생체 내 어세이의 용도를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재되는 바와 같은 효소 활성을 측정하기 위한 생체 내 어세이, 및 승온에서 효소 안정성을 측정하기 위한 온도 민감성 어세이의 용도를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재되는 바와 같은 효소 활성을 측정하기 위한 생체 내 어세이, 및 효소의 특이적 활성을 측정하기 위한 시험관 내 어세이의 용도를 포함한다.
바람직한 구현예에서, MTHFR 의 손상된 대립유전자는 M110I, H213R, D223N, D291N, R519C, R519L, 및 Q648P 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 MTHFR 단백질 내 돌연변이를 인코딩하는 비-동의적 치환을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 손상된 대립유전자는 M110I, H213R, D223N, 및 D291N 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 MTHFR 단백질 내 돌연변이를 인코딩하는 비-동의적 치환을 포함한다.
효모 균주
하나의 양상에서, 본 발명은 엽산/호모시스테인 대사작용에 관여하는 효소의 손상된 대립유전자를 검출할 수 있는 효모 균주를 제공한다. 이러한 효모 균주는 본원에 기재된 방법에 유용하다. 효모 균주는 관심의 기능적 상동 효소에 의한 상보성을 가능하게 하는 1 차 돌연변이, 및 첫번째 유전자의 기능과 관련된 검정가능한 표현형에 대한 보조인자의 보충에 의존하는 균주가 되게 하는 2 차 돌연변이 (또는 돌연변이 그룹) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 CTH 의 손상된 대립유전자를 검출할 수 있고, 비타민 B6 에 대한 이의 반응성을 측정할 수 있는 효모 균주를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 효모 균주는 cys3 및 6 자리-결실 sno1Δ sno2Δ sno3Δ snz1Δ snz2Δ snz3Δ 내 돌연변이를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 CBS 의 손상된 대립유전자를 검출할 수 있고, 비타민 B6 에 대한 이의 반응성을 측정할 수 있는 효모 균주를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 효모 균주는 cys4 및 6 자리-결실 sno1Δ sno2Δ sno3Δ snz1Δ snz2Δ snz3Δ 내 돌연변이를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 MTHFR 의 손상된 대립유전자를 검출할 수 있고, 엽산에 대한 이의 반응성을 측정할 수 있는 효모 균주를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 효모 균주는 met13 및 fol3 내 돌연변이를 포함한다.
질환 위험의 스크리닝
하나의 양상에서, 본 발명은 일탈 엽산/호모시스테인 대사작용과 연관된 상태 또는 질환의 위험을 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은 엽산/호모시스테인 대사작용에 포함되는 유전자의 손상된 대립유전자에 대한 스크리닝을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 효소가 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A, 및 GART 로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 효소 기능장애와 연관된 질환 또는 상태의 위험을 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 질환 또는 상태는 심혈관 질환, 관상동맥병, 허혈성 뇌졸중, 죽상동맥경화증, 신경관 결손, 구안지 구열, 전-자간증, 조산/저체중 출생, 재발성 초기 자발적 유산, 혈전증, 망막동맥폐색, 다운 신드롬, 결장직장암, 유방암, 폐암, 전립선암, 우울증, 정신분열병, 알쯔하이머 질환/치매, 노인성 황반 변성, 및 녹내장으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 본 방법은 본원에 기재되는 바와 같은 MTHFR 의 손상된 대립유전자, ATIC 의 손상된 대립유전자, MTHFS 의 손상된 대립유전자, MAT1A 의 손상된 대립유전자, MAT2A 의 손상된 대립유전자, 및 GART 의 손상된 대립유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 손상된 대립유전자를 검출하기 위한 방법의 용도를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 CBS 기능장애와 연관된 질환 또는 상태의 위험을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 질환 또는 상태는 심혈관 질환, 관상동맥병, 허혈성 뇌졸중, 죽상동맥경화증, 신경관 결손, 구안지 구열, 전-자간증, 조산/저체중 출생, 재발성 초기 자발적 유산, 혈전증, 망막동맥폐색, 다운 신드롬, 결장직장암, 유방암, 폐암, 전립선암, 우울증, 정신분열병, 알쯔하이머 질환/치매, 노인성 황반 변성, 및 녹내장으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 본 방법은 본원에 기재되는 바와 같은 손상된 CBS 대립유전자를 검출하기 위한 방법의 용도를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 CTH 기능장애와 연관된 질환 또는 상태의 위험을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 질환 또는 상태는 심혈관 질환, 관상동맥병, 허혈성 뇌졸중, 죽상동맥경화증, 신경관 결손, 구안지 구열, 전-자간증, 조산/저체중 출생, 재발성 초기 자발적 유산, 혈전증, 망막동맥폐색, 다운 신드롬, 결장직장암, 유방암, 폐암, 전립선암, 우울증, 정신분열병, 알쯔하이머 질환/치매, 노인성 황반 변성, 및 녹내장으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 본 방법은 본원에 기재되는 바와 같은 손상된 CTH 대립유전자를 검출하기 위한 방법의 용도를 포함한다.
화학요법 반응 잠재성의 스크리닝
하나의 양상에서, 본 발명은 개인의 화학요법 반응 잠재성을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 본원에 기재되는 바와 같은 엽산/호모시스테인 대사작용에 관여하는 유전자의 손상된 대립유전자를 검출하기 위한 방법의 용도를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 유전자는 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A, 및 GART 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 개인 내 손상된 대립유전자의 검출은 감소된 반응 잠재성을 나타낸다.
바람직한 구현예에서, 화학요법은 메토트렉세이트 또는 5-플루오로우라실이다.
화학요법 독성의 스크리닝
하나의 양상에서, 본 발명은 개인에 대한 화학요법 독성을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은 엽산/호모시스테인 대사작용에 관련된 유전자의 손상된 대립유전자를 검출하기 위한 방법의 용도를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 유전자는 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A, 및 GART 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 개인 내 손상된 대립유전자의 검출은 증가된 독소 잠재성을 나타낸다.
바람직한 구현예에서, 화학요법은 메토트렉세이트 또는 5-플루오로우라실이다.
예방 및 치료
하나의 양상에서, 본 발명은 대사 효소 결핍증과 연관된 상태 또는 질환을 예방하는 방법을 제공한다. 본 방법은 보조인자-민감성 손상된 대립유전자의 존재에 대한 정보를 주는 하기 어세이 및 방법으로부터 수득되는 정보에 근거한, 개인의 보조인자의 섭취를 증가시키는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은 대사 유전자의 보조인자-치유가능한 손상된 대립유전자를 검출하는 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 일탈 엽산/호모시스테인 대사작용과 연관된 상태 또는 질환을 예방하는 방법을 제공한다. 본 방법은 개인의 엽산 및/또는 비타민 B6 의 섭취를 증가시키는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은 엽산/호모시스테인 대사작용에 관련된 유전자의 손상된 대립유전자를 검출하는 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 효소-인코딩 유전자가 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A, 및 GART 로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 보조인자 치유가능한 효소-인코딩 유전자의 손상된 대립유전자를 갖는 개인에서의 효소 기능장애와 연관된 상태 또는 질환을 예방하는 방법을 제공한다. 본 방법은 개인의 엽산의 섭취를 증가시키는 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 손상된 CBS 대립유전자를 갖는 개인에서의 CBS 기능장애와 연관된 상태 또는 질환을 예방하는 방법을 제공한다. 본 방법은 개인의 비타민 B6 의 섭취를 증가시키는 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 손상된 CTH 대립유전자를 갖는 개인에서의 CTH 기능장애와 연관된 상태 또는 질환을 예방하는 방법을 제공한다. 본 방법은 개인의 비타민 B6 의 섭취를 증가시키는 것을 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 일탈 엽산/호모시스테인 대사작용과 연관된 상태 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 개인의 엽산 및/또는 비타민 B6 의 섭취를 증가시키는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은 엽산/호모시스테인 대사작용에 관련된 유전자의 손상된 대립유전자를 검출하는 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 효소-인코딩 유전자가 보조인자에 의해 치유가능한 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A, 및 GART 로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 보조인자 치유가능한 효소-인코딩 유전자의 손상된 대립유전자를 갖는 개인에서의 효소 기능장애와 연관된 상태 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 개인의 엽산의 섭취를 증가시키는 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 손상된 CBS 대립유전자를 갖는 개인에서의 CBS 기능장애와 연관된 상태 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 개인의 비타민 B6 의 섭취를 증가시키는 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 손상된 CTH 대립유전자를 갖는 개인에서의 CTH 기능장애와 연관된 상태 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 개인의 비타민 B6 의 섭취를 증가시키는 것을 포함한다.
실시예
실시예 1: 인간 내 엽산-치유 MTHFR 효소 변이체의 유병률
저-빈도 변이의 발생률 및 영향을 측정하고, 비타민 치유 현상을 연구하기 위해 큰 집단으로부터 엽산-치유가능한 MTHFR 효소 변이체의 유병률을 측정하였다. 500 명을 넘는 개인으로부터, 14 개의 상이한 비-동의적 치환을 확인하였고, 이 중 5 명은 효소 기능이 손상되었다. 모든 유해한 대립유전자가 적어도 다소 엽산 반응성이었으며, 5 개 돌연변이체 단백질 중 4 개는 세포내 엽산 수준을 상승시켜 정상 수준으로 완전히 복귀시킬 수 있을 것이다.
실시예 1.1: 방법
DNA 샘플 집단. DNA 샘플은 [Coriell Institute Cell Repository (Camden, New Jersey, USA)] 로부터 입수하였다.
MTHFR 엑손 서열분석. 변이체 SeqR 생산 라인 (Applied Biosystems, Foster City, CA) 으로부터 시판되는 프라이머 쌍을 사용하고 제공된 프로토콜에 따라 PCR 서열분석에 의해 상기 샘플 내에서 11 개의 MTHFR 코딩 엑손을 서열분석하였다. 서열분석된 엑손 영역은 mRNA 에 대한 NCBI MTHFR 참조 서열 (NM_005957) 및, 656 개의 아미노산의 상응하는 단백질 (NP_ 005958) 에 상응하였다. 서열분석 엠플리콘 및 탐침 정보는 하기 표적 엠플리콘에 대해, "http://www.ncbi.nlm.nih.qov/qenome/probe" 에서 이용가능하다:
Exon 1 (RSA000045684); Exon 2 (RSA000045680); Exon 3 (RSA000577249); Exon 4 (RSA000045678); Exon 5 (RSA000045676); Exon 6 (RSA001308795); Exon 7 (RSA001253193); Exon 8 (RSA000045669); Exon 9 (RSA000580767); Exon 10 (RSA 000580766); Exon 11 (RSA000580765, RSA000027240). 코딩 영역에 걸쳐 있는 오직 엑손 11 의 일부만이 서열분석되었다. 염기-결정 (base-calling) 의 고 신뢰성 확보를 위해, 분석에 고품질 판독 만을 사용하였다 (표적 엑손에 걸쳐 있는 영역의 경우 평균 QV 점수 >40; 모든 엑손은 이중 가닥 판독에 의해 포함되었다). 상기 여과 기준에 근거하여, 성공률은 각 엑손에 대해 89.9% 내지 95% 범위였다 (표 I 참조). 모든 서열 정보를 SeqScape 소프트웨어 스위트 (Applied Biosystems).3 을 사용하여 분석하였다. 품질 관리 측정치로서, TaqMan (Applied Biosystems) 대립유전자-변별 어세이에 의해 염기-결정의 서브세트를 직접적으로 확인하고, 하기 기재된 바와 같은 공개 이용가능한 유전자형 데이터와 비교하였다.
플라스미드. 유도성 효모 GAL1 프로모터의 통제 하에 5'-말단 HA (헤마글루티닌 A) 에피토프-태그 인간 MTHFR 오픈 리딩 프레임 (참조 단백질 서열 NP_005948) 및 URA3 선별 마커를 갖고 있는 플라스미드 phMTHFR 은 [Warren Kruger (Shan et al., 1999, supra)] 로부터 기증받았다. 본 플라스미드는 QuikChange 키트 (Stratagene) 를 사용하는 부위-지정 돌연변이화에 의한 모든 MTHFR 변이체를 재건하기 위한 백본으로서 담당하였다. 갈락토오스-유도성 MTHFR 변이체를 함유하는 통합 플라스미드를, HO 유전자좌에서 상기 카세트의 표적 통합을 가능하게 하는 phMTHFR-기반 플라스미드로부터의 URA3, GAL1 프로모터 및 MTHFR 코딩 영역을 함유하는 분절을 pHO-폴리-HO (Voth et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29:e59) 내로 PCR 클로닝함으로써 제작하였다.
균주. 모든 반수체 효모 균주는 S288c 배경 내 MATa his3 leu2 ura3 lys2 였다 (Brachman et al., 1998, Yest 14:115-32). 동질 유전자형 MATa 와 MATα 균주를 교배시켜 MATa/MATα 2배체 균주를 제작하였다. fol3Δ::KanMX 및 fol3Δ::KanMX met13Δ::KanMX 균주는 S. 세레비지아에 유전자-녹아웃 콜렉션 (Invitrogen) 으로부터의 균주를 사용하는 표준 교배/포자형성 기술에 의해 수득되었다. 각각 GAL1:MTHFR 변이체 카세트의 통합 버전을 함유하는 fol3Δ::KanMX met13Δ::KanMX 반수체를 교배시킴으로써 2배체 (MTHFR 변이체의 경우 동형접합 또는 이종접합) 를 제작하였다.
성장 조건. 엽산이 결핍된 합성 성장 배지가, 비타민 제외 효모 질소 베이스 (Yeast Nitrogen Base without Vitamins) (Qbiogene), 및 개별적으로 후에 첨가되는 엽산을 제외한 모든 비타민을 함유하는 최소 배지 (Sherman, 2002, Genetics & Molecular Biol., eds. Guthrie and Fink (Academic, New York), pp.3-41) 였다. 모든 fol3Δ::KanMX 세포에 50 ㎍/㎖ 폴린산 (Sigma) 을 보충하였다. 동적 성장 측정을 위해, fol3Δ::KanMX met13Δ::KanMX 세포를 GAL1 프로모터-유래 MTHFR 변이체로 형질전환시키고, 폴린산 (50 ㎍/㎖) 및 메티오닌 (20 ㎍/㎖) 이 보충된 합성 갈락토오스 배지 (2% 갈락토오스, 0.1% 글루코오스) 내에서 로그상까지 성장시켰다. 세포를 3 회 세정하고, 다양한 양의 폴린산을 함유하나, 메티오닌이 결핍된 신선한 갈락토오스 배지를 함유하는 96 웰 플레이트 내로 분취하였다. 웰 당 부피는 200 ㎕ 로, 출발 세포 밀도 OD595 = 0.01 였다. 30℃ 에서 교반 없이, Tecan GENios 플레이트 판독기로 60 시간 이상 매 15 ~ 30 분 동안 흡광도를 추적하였다. 도 1a 에서 사용된 MET13 세포를, 메티오닌의 부재하에서 모두 성장하는 것을 제외하고는 동일한 방식으로 처리하였다.
MTHFR 효소 활성 어세이. 생리학적 조건 하에서 MTHFR 에 의해 촉매화되는 역 반응을 측정하는 어세이는 기재된 바와 같았으나 (Shan et al., 1999, supra) 다음과 같은 변형을 하였다: 효모 추출물을 350 ㎕ 의 용해 완충액 (100 mM 수크로오스, 50 mM KHPO4 (pH 6.3), 프로테아제 억제제 칵테일) 내 40 OD595 세포 등가물 (상기와 같이 폴린산 및 메티오닌이 보충된 fol3Δ met13Δ 세포) 의 비이드 용해에 의해 제작하였다. 추출물을 간략한 원심분리에 의해 정화하고, 선형 범위의 활성을 측정하기 위해 10 ~ 200 ㎍ 의 추출물을 사용하였다. 방사선 표지된 기질 (5-[14C]MeTHF) 은 [GE Healthcare Life Sciences] 의 것이었다. 열 처리를 위해, 5-[14C]MeTHF 가 없는 반응 혼합물을 표시된 시간 동안 55℃ 로 가열하였고, 그 지점에 5-[14C]MeTHF 를 다시 첨가하고, 반응을 진행시켰다.
MTHFR 면역블롯 분석. 10 개의 OD595 세포 등가물 (상기와 같이 폴린산 및 메티오닌이 보충된 fol3Δ met13Δ 세포) 을 15 분 동안 200 ㎕ 0.1 M NaOH 에 추출하였다. 50 ㎕ SDS 샘플 완충액 (0.5M Tris 6.8, 0.4% SDS) 을 상청액에 첨가한 다음, 이것을 끓이고, 정화하여 SDS-PAGE 에 적용하였다. LI-COR Infrared Imager 상에서 HA-태그 MTHFR 변이체를 검출하였다. 마우스 모노클론 항-HA 항체는 Sigma 의 것이었다. 적재 대조군인 효모 3-포스포글리세라이트 키나아제 (Pgkip) 가, Jeremy Thorner (University of California, Berkeley, CA) 에 의해 기증된 마우스 항체에 의해 검출되었다.
실시예 1.2: 결과
인간 내 MTHFR 변이체. 다양한 인종의 564 명의 개인으로부터 각각의 11 개의 엑손 내의 코딩 부분을 증폭시킴으로서 인간 MTHFR 의 전체 코딩 영역을 서열분석하였다. 코딩 영역의 길이, 검사된 대립유전자의 수 및 모든 비-동의적 치환은 표 3 에 열거되어 있다. 모두에서, 2,081,106 bp 의 코딩 DNA, 및 1,000 개 초과의 대립유전자 깊이까지 샘플링된 각각의 엑손을 분석하였다. 상기 데이터는 14 개의 비-동의적 변화를 밝혀냈고, 이 중 11 개는 부수적 대립유전자 빈도 (MAF) <1% 를 보이며, 7 개의 대립유전자는 오직 1 회만 보였다. 일부 저-빈도 대립유전자가 미리 보였다 (표 3 참조). 저-빈도 비-동의적 치환의 수는 랜덤 집단 내로 깊게 샘플링된 다른 연구와 양호하게 일치하였다 (Martin et al., 2006, Pharmacogenet Genomics 16:265-77; Livingston, 2004, Genome Res 14:1821-31; Glatt et al., 2001, Nat. Genet. 27:435-38). 또한, 3 웰에서 연구된 공통의 치환은 예상된 전반적인 집단 빈도를 나타내는 것으로 관찰되었다 (A222V - 29.3%, E429A - 23.6%, R594Q - 4.4%).
염기-결정의 정확성에 대한 품질-관리 체크로서, 8 개의 변이체 (4 개의 싱글톤 포함) 를 독립적으로 PCR 로 증폭되었고, 데이터의 100% 일치를 보였던 100 개 샘플에서 TaqMan 대립유전자-변별 어세이에 의해 재분석하였다. 또한, 모두, 본 연구에서 일부 중복되는 Coriell 샘플 (dbSNP build 127) 을 사용하는 Environmental Genome Project (http://www.niehs.nih.gov/envqenom/) 및 Perlegen (Mountain View, CA) 로부터의 집단 유전자형 데이터는 817 개 중 814 개 (99.6%) 유전자형 결정과 일치하였다. 3 개의 불협 유전자좌 중 2 개에 대해, 본 서열 데이터는 모호하지 않았으며, 옳은 것으로 나타났다.
완전한 코딩 영역 서열을 480 명의 개인에 대해 수득하였다. 18 명 (4%) 이 저-빈도 비-동의적 변이체의 보유자였다. 유의하게는, 저-빈도 변화 범위를 가진 3 개의 공통의 다형성 (A222V, E429A 및 R594Q) 의 조합은 상당한 개개인의 이질성을 유도하였다. 1배체가 대부분의 경우, 데이터로부터 추측될 수 없었던 본 그룹에서 28 개의 상이한 비-동의적 유전자형이 관찰되었다.
생체 내 MTHFR -엽산 상호작용. 유전적 변이체의 임상적 의미가 이들의 기능적 결과에 놓여있기 때문에, 모든 비-동의적 변화를 MTHFR 기능에 대한 이의 영향에 대해, 및 중요하게는, 손상된 대립유전자가 엽산-반응성을 보이는지 아닌 지를 시험하였다. 엽산 영양요구성 (fol3) 을 met13 균주 내로 도입하고, 성장 배지 내 폴린산을 다양하게 함으로써 세포내 엽산 농도의 적정을 가능하게 하였다. 폴린산 (5-포르밀-테트라히드로엽산) 은 효모에서, 다른 엽산 조효소로 전환될 수 있는 메테닐-테트라히드로엽산으로 대사될 수 있다 (Cherest et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:14056-63). 이러한 방식으로, 인간 MTHFR 기능성 (메티오닌의 부재하에서의 성장) 을 세포 엽산 상태를 점점 더 제한하는 기능으로서 측정하였다.
상기 조건하에서, 50 ㎍/㎖ 초과의 폴린산 보충은 임의의 유의한 성장 이점을 부여하지 않았다 (도 1a). 그러나, 50 ㎍/㎖ 미만의 농도에서, 성장은 배지 내 이용가능한 폴린산과 명확한 연관성이 있었다. 그러므로 세포내 엽산 수준은 본 범위에서 속도-제한성이었다. FOL3 세포의 성장과 비교하면, 폴린산 보충은 내인성 엽산 생합성의 결핍을 완전히 보상하지 않았다. 그러나, 이 차이는 세포가 성장 속도보다는 정지 상에 들어가는 농도를 주로 반영하는 것이었고, 아마도 폴린산 섭취, 또는 단독 엽산 공급원으로서 폴린산의 이용의 제한을 반영하는 것일 것이다.
fol3 met13 세포를 보상하는 인간 MTHFR 의 능력은 배지 내 폴린산 보충의 기능이었다 (도 1b). 엽산 보충의 경우와 같이, GAL1 프로모터로부터의 인간 MTHFR 의 발현은 Met13p 의 상실을 완전히 보상하지 못했다 (도 1a 에서 동등한 엽산 투여량에서의 fol3 MET13 세포로의 도 1b 와 비교). 그러므로, 50 ㎍/㎖ 미만의 폴린산, 엽산 및 MTHFR 모두는 성장에 대해 속도-제한성이었고, 심지어 MTHFR 활성의 미묘한 변화도 성장 판독에 반영되게 하였다. 50 ㎍/㎖ 초과의 폴린산 보충은 내인성 효모 MTHFR (MET13; 도 1a) 또는 주요 인간 대립유전자 (도 1b) 를 발현하는 세포에 대해 유의한 성장 이점을 부여하지 않았으나, MTHFR 의 손상된 대립유전자에 대해서는 유익하였다 (하기 참조) 는 것을 유념한다.
MTHFR 변이체의 기능적 영향. 엽산 농도의 범위에 대해 시험된 5 개의 비-동의적 대립유전자는 관찰된 기능적 영향의 범위를 보여주었다 (도 2a). 100 ㎍/㎖ 폴린산에서 A222V 변이체 기능이 거의 완전히 복원되었고, 4 배 낮은 수준의 보충에서 (25 ㎍/㎖) 활성이 (주요 대립유전자에 대해) 유의하게 적었다. 그러므로, 상기 조건하에서 A222V 결함의 공지된 엽산 치유가능성이 요약되었다. 상기 조건하에서 효모 내 감소된 엽산의 정확한 세포내 농도는 알려지지 않았다. 그럼에도 불구하고, A222V 대립유전자의 거동은 효모 및 인간 세포에서 세포내 농도를 효과적으로 적정하였다. A222V 효소는 공통의 대립유전자의 고유 활성의 대략 50% (Martin, 2006, Pharmacogenet. Genomics 16:265-77; Rozen, 1997, Thromb. Haemost. 78:523- 26) 를 가지고, 50 ㎍/㎖ 엽산 보충시 성장 속도의 50% 감소가 관찰되었다. 또한, 50 ㎍/㎖ 폴린산에서 성장하는 세포로부터 무-세포 어세이에서의 A222V 효소 활성에 있어 동일한 50% 감소가 관찰되었다 (하기 표 3). 그러므로, 효모 내 A222V 의 거동은 인간 세포 내 이의 거동을 요약하였다.
4 개의 저-빈도 대립유전자를 동일한 방식으로 시험하였다 (도 2a). R519C 는 성장이 모든 엽산 농도에서 영향을 받으므로 양성인 것으로 나타났다. R134C 는 모든 엽산 농도에서 심각하게 손상되었고, 활성은 다소 엽산-반응성이었다. 성장이 50 ㎍/㎖ 의, 폴린산 또는 그 초과에서 주요 대립유전자와 유사하였으나, 50 ㎍/㎖ 미만의 폴린산에서는 기능적으로 열악하였다는 점에서, D223N 및 M110I 대립유전자는 A222V (덜 심각하게 손상되었지만) 와 유사한 엽산-치유 활성을 나타냈다.
MTHFR 효소는 알로스테릭 저해제 S-아데노실메티오닌과 결합하는 N-말단 촉매성 도메인 및 C-말단 조절 도메인을 갖는다 (AdoMet; Sumner et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:7697-7700). 촉매성 도메인 내에 있는 6 개의 대립유전자 (M110I, R134C, H213R, A222V, D223N 및 D291N) 중, 오직 H213R 만이 양성이었다 (도 2b). M110I, A222V, D223N 및 D291N 은, 상기 효소 변이체가 더 높은 농도의 엽산 보충시 (50-200 ㎍/㎖ 폴린산) 주요 대립유전자와 유사했지만, 엽산이 더욱 속도-제한적이 되므로 상당히 약화되었던 엽산-치유 거동을 나타냈다. R134C 변이체는 임의의 수준의 엽산 보충 시 성장을 지지하는 주요 대립유전자의 역량에 전혀 접근하지 못하므로, 반응성이지만, 치유 대립유전자는 아닌 것으로 분류되었다. 조절 도메인 내 모든 치환 (G422R ~ T653M) 은 주요 대립유전자와 유사하게 거동하였다 (도 2b).
아미노산 치환 간의 상승적 상호작용. 변이체의 분포는 2 개 (또는 그 이상) 의 치환을 함유하는 복합 대립유전자의 존재를 나타냈다. 그러므로 여러 복합 대립유전자 (개인 샘플 내 이들의 생성에 근거함) 를 대립유전자 조합이 상승 또는 억제 효과를 갖는지의 여부를 시험하기 위해 제작하였다. 공통의 변이체 (A222V E429A 및 A222V R594Q) 를 갖는 A222V 조합의 경우, 부수적 대립유전자 동형접합체가 대립유전자 중 하나 이상에 대해 관찰되므로, 이러한 변이체가 존재한다는 것이 확실하다. 그러나, 저-빈도 변이체의 경우, A222V 변이체 및 신규 변이체 모두는 항상 이형접합체로서 생성된다. 1배체가 알려지지 않았으므로, 이들 개체는 2 개의 단독 치환 대립유전자 또는 복합 대립유전자를 가질 수 있을 것이다. 그러므로 모든 가능한 이중-치환 대립유전자가 제작되고 그 기능이 시험되었다 (예를 들어, M110I A222V, 도 2a). 시험된 2 가지 폴린산 농도에서, M110I A222V 변이체는 개별 대립유전자의 합보다 더욱 열악한 기능을 보였고, 이것은 복합 대립유전자에서 상승 결함을 나타내는 것이다. At 50 □g/㎖ 폴린산에서, M110I 변이체는 주요 대립유전자와 거의 구별할 수 없었으나, 이것은 A222V 결함을 유의하게 향상시켰다. 시험된 모든 조합의 경우, 개별적으로 기능 영향을 받은 대립유전자 (M110I 및 D291N) 는 A222V 와 조합되는 경우 상승되었으나, 양성 변화는 A222V 결함에 영향을 주지 않았다.
생체 내 기능을 요약하는 생화학 어세이. 성장 어세이의 신뢰성을 평가하기 위해, 미정제 효모 용해물에서 모든 변이체에 대해 무-세포 MTHFR 효소 어세이를 수행하였다 (재료 및 방법 참조). 특이적 활성 측정 외에, 변이체를 55℃ 에서 다양한 시간 동안 열 처리에 의해 열불안정성 (효소 안정성의 측정) 에 대해 시험하였다. 고유 활성과 성장 속도 사이에는 양호한 상관관계가 있었다 (도 3; 도 2 에서의 성장 곡선으로, 주요 MTHFR 대립유전자, A222V 및 R134C 에 대해 비-열처리된 샘플의 활성 비교). 또한, A222V 변이체는 이전에 보고된 바와 같이 (20,25,34), 주요 대립유전자의 효소 활성의 대략 50% 를 나타내었다. 성장 어세이에서와 같이, R519C 변이체는 주요 대립유전자에 대해 유사한 활성을 나타내었고, 공통의 E429A 변이체를 포함하는 조절 도메인에서의 모든 변화의 대표였다 (데이터는 제시되지 않음). E429A 가 효소 기능에 영향을 준다는 보고가 있었지만 (27), 본 데이터는 상기 변화가 양성이었다는 다른 보고들 (10,20,25) 과 일치하였다.
A222V 돌연변이체 효소는 주요 형태보다 덜 안정하고, 더욱 열불안정하고 (Guenther et al., 1999, Nat. Struct. Biol. 6:359-65; Yamada et al., 2001 , Proc. Natl. Acad. Sci. 98:14853-58), 상기 변이체의 엽산 치유는 단백질의 안정화를 촉진함으로써 일어나는 것으로 생각된다. 본원에서 사용되는 조건 하에서 (55℃, 20 m), A222V 는 거의 모든 활성을 잃는 반면, 주요 대립유전자는 그의 본래 활성의 약 30% 를 보유하며, 이전 연구와 일치한다 (20). 신규 D223N 대립유전자는 또한 효소 결함이 그렇게 크지 않지만, 이 경우 엽산-치유가능성을 유사하게 설명할 수 있는 증가된 열불안정성을 나타내었다.
이형접합체 표현형. 저-빈도 대립유전자가 이형접합체로서 통상 생성되므로, 이들 중요성이 소실되는 경향이 있다. MTHFR 대립유전자의 이형접합성의 기능적 중요성을 더 잘 이해하기 위해, 통합 발현 카세트로부터 발현되는 동일한 대립유전자 (동형접합체) 또는 이형접합체를 제작하기 위한 상이한 대립유전자 (방법 참조) 를 갖는 반수체 균주를 교배시킴으로써 인간 MTHFR 의 2 개 카피를 갖는 2배체 효모를 제작하였다. 상기에서와 같이, 상기 균주를 엽산 보충의 기능으로서 성장에 대해 시험하였다 (도 4). 본 어세이에서의 성장 표현형을 나타낸 이형접합체는 엽산을 제한하는 조건하에서 악화되었고, 이는 감소된-기능 대립유전자는 야생형과 공우성이었다는 것을 나타낸다.
성장 어세이에서 측정된 바와 같은 세포 MTHFR 활성은 대립유전자의 부가적인 효과를 반영하는 것으로 나타났다. 게다가, 반접합체로의 부가적인 실험에서 (단일 통합 발현 대립유전자를 갖는 2배체; 데이터는 제시되지 않음) 돌연변이체 대립유전자의 구제가 거의 또는 전혀 제공되지 않은 이형접합체에서의 주요 및 부수적 대립유전자 사이의 이종이량체의 형성이 증명되었다. 예를 들어, 2배체 MTHFR 주요 대립유전자/널 세포 (반접합체) 는 모든 조건 하에서 주요 대립유전자/R134C 이형접합체와 유사하게 거동하였고, 저 엽산 배지 (A222V 가 비활성화된) 에서는 주요 대립유전자/A222V 이형접합체와 유사하였다. 그러므로, 이형접합체 세포 내 유해한 대립유전자의 표현형 기여는 쉽게 관찰되었고, 인간 게놈에서 이형접합성으로부터의 보다 널리퍼진 표현형 결과 가능성을 높였다.
인산화에 의한 효모 내 MTHFR 변이체의 변형. MTHFR 변이체 단백질의 풍부함은 N-말단 헤마글루티닌 A (HA) 에피토프 태그에 대한 항체를 사용하는 면역블롯팅에 의해 측정되었다 (도 5a). 모든 샘플에서, 단백질은 대략 72kD 및 78kD 의 두 줄로 이동해 내려갔다. 상기 패턴은 곤충 세포에서 발현된 인간 MTHFR 에 대해 관찰된 것과 매우 닮았고 (37), 상부 밴드는 N-말단 근처에서 복합적으로 인산화된 MTHFR 을 나타낸다. 곤충 세포에서의 MTHFR 의 인산화는 위치 34 에서의 트레오닌 잔기에 의존하고, 상기 트레오닌의 알라닌으로의 치환 (T34A) 은 인산화될 수 없는 효소를 야기한다 (37). 상기 돌연변이는 S. 세레비지아에에서 발현되는 인간 MTHFR 에 대해 동일한 효과를 가지며, 곤충 세포에서와 같이, 상부 밴드가 인산화 MTHFR 였다는 것을 나타냈다 (도 5a).
MTHFR 의 인산화의 역할은 음성 조절에 관여하는 것으로 제안된다 (37). 이 가설을 지지하는 것으로, 관찰된 인산화 패턴이 직접적으로 세포 MTHFR 활성과 관련이 되는 것이다. 구체적으로는, 비인산화:인산화 형태의 풍부함의 비는, 활성이 감소하면서 증가하였다 (도 5b). 흥미롭게도, 모든 변이체 (인산화 및 비인산화 형태) 의 전반적인 풍부함이 두드러지게 상이한 것으로 나타나지는 않았다. 이것은, 다른 인자가 단백질 수준 측정에 관여하지 않는다면 고유의 효소 안정성에 영향을 주었던 경우 예상되지 못할 수 있다.
모든 기능적으로 손상된 대립유전자는 엽산 및 FAD 결합 부위를 함유하는 MTHFR 의 촉매적 반쪽인 N-말단 (36) 에 무리를 이루었다. 반면, MTHFR 의 C-말단 조절 도메인 내 8 개의 비-동의적 치환을 확인하였고, 모든 8 개는 상보성 및 무-세포 효소 어세이 모두에서 양성으론 나타났다. 게다가, 복합 대립유전자 내 조절 도메인 치환과 A222V 사이에서는 아무런 상승도 관찰되지 않았다 (도 2). E429A 에 대해 보고된 바와 같이 상기 변형이 중성이었거나 (10,20,25), 상기 어세이는 결함에 민감하지 않았다. 그러나 이 발견은 MTHFR 내 대부분의 돌연변이가 촉매성 도메인에서 심각한 임상적 표현형 생성을 야기한다는 관찰과 일치하였다 (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php). 조절 도메인은 촉매성 도메인의 안정화에 역할을 하는 것으로 제안되었다 (20). 그렇다면, 이 역할은 아미노산 치환에 대해 다소 내성이 있을 수 있고, 아라비돕시스 (Arabidopsis) C-말단 도메인에 융합된 S. 세레비지아에 N-말단 도메인으로 구성된 키메라 MTHFR 이 (조절 도메인 내 효모 효소의 대략 50 개의 비-동의적 치환과 동등함) 어떻게 유해한 효소 활성을 나타내지 않는지를 설명할 수 있다 (38). Martin et al (25) 은 C-말단 도메인 내 공통의 R594Q 변이체가 COS-1 세포 내에서 발현되는 경우 효소 활성에 영향을 준다는 것을 보고하였다는 것을 유념해야만 한다. 그러나 상기 변화는 효모에서 발현되는 효소의 세포-기반 및 무-세포 어세이에서 양성으로 나타났다. 이러한 불일치에 대한 원인은 명백하지는 않지만, 본 출원인이 면역블롯 분석에서 MTHFR (미공지 인산화 상태) 의 오직 단일 종류만을 관찰하였기 때문에 숙주 발현 시스템을 반영하는 것일 수 있다.
이형접합체의 표현형. 기능적으로 손상된 MTHFR 대립유전자에 대한 2배체 효모 이종접합의 거동은 이형접합체 표현형이, 특히 엽산 제한 조건 하에서 명백하게 관찰될 수 있다는 것을 증명하였다 (도 4). 대부분의 유전 변이가 이형접합성으로서 발생하고 저-빈도 대립유전자가 집단 내 이형접합체로서 주로 존재하므로 이형접합체 내 표현형의 출현은 상당하였다. 이 결과는 림프구 추출물 내 세포 MTHFR 활성이 유전자형과 직접적으로 관련되어 있다는 관찰과 일치한다: A222V 에 대한 개별적인 이종접합 (A/V) 는 주요 대립유전자 동형접합체 (A/A) 에 대해 관찰된 총 활성의 대략 65% 를 갖고, A222V 동형접합체 (V/V) 가 A/A 동형접합체의 활성의 30% 를 보유한다 (7). 혈청 트리글리세라이드 수준에 영향을 주는 아디포킨 ANGPTL4 내 대립유전자의 전체 스펙트럼을 시험하는 최근 연구에서, 비-동의적 E40K 대립유전자에 대한 이종접합성은 낮은 혈장 트리글리세라이드 수준과 유의하게 연관되어 있었다 (18). 그러므로, 이종접합성이 표현형으로 검출가능한 경우는, 동형접합체보다 많은 보유자가 있을 수 있기 때문에 저-빈도 변이체의 기여의 유의성을 증가시킨다. MTHFR 활성이 세포 성장에 대해 속도-제한적이었다는 조건 하에서 이형접합체 표현형이 관찰되었다는 것을 유념한다. 효소 단계가 인간 내 특정 경로에서 속도 제한적인지의 여부는 유전적 및 환경적 인자 모두에 달려있다.
돌연변이 및 MTHFR 인산화 및 풍부함. 촉매성 도메인 내 비-동의적 변화의 엽산 치유는 단백질 안정화에 의해 (A222V 의 경우와 같이; 9,10) 또는 보조인자 Km 과 같은 분자 기능의 다른 양상을 극복함에 의해 발생할 수 있다 (2,5). 하나 이상의 유해한 대립유전자, D223N 은 A222V 와 유사한 증가된 열불안정성 (도 3) 을 보였고, 이것은 안정성 결함에 대한 논쟁이 있다. MTHFR 의 엽산-치유 대립유전자는, 엽산 종류가 효소의 불안정한 형태를 안정화시키는 것이라는 가설은 MTHFR 단백질의 수준이 제시된 바와 같이 변이체의 고유 활성에 비례할 것이라고 제안될 것이다 (25). 그러나, 인산화 상태는 효소 활성과 연관성이 있는 반면 (도 5), 전반적인 풍부함 (인산화 및 비인산화 형태) 이 명백하게 변하는 것으로 나타나지 않았던 (2 배 범위 내) 것을 관찰하였다. [Yamada et al] (37) 에서 고유 활성에 대한 인산화의 억제 효과가 증명되었으므로, 인산화 MTHFR 은 효소의 활성 형태인 것 같지 않다. 이와 일치하게, 성장 및 효소 어세이 모두에서의 비-인산화가능 T34A 변이체의 거동은 주요 대립유전자의 거동과 유사하였다 (데이터는 제시되지 않음). 게다가, 낮은 세포내 엽산 수준은 MTHFR 안정성을 감소시키는 반면 (풍부함에 의해 측정되는 바와 같이), 상기 효과는 기능을 손상시키는 변이체에서 향상되지 않는다. 이들 결과가 유해한 변화의 예상된 단백질 불안정성과 상충하기 때문에, 현재 연구 중인 상보적 조절 반응이어야만 한다는 것으로 추론되었다. 이러한 방식으로 변이체의 활성은 명백하게 상이할 수 있는 반면 (도 2) 전체 단백질 풍부함은 그렇지 않을 수 있다 (도 5). 본 결과가 인산화에 의한 피드백 조절과 일치하지만 (37), 변동 내 인산화의 역할은 알려지지 않았다. 이 맥락에서, 다른 손상된 대립유전자와 조합으로 T34A 변화의 영향을 측정하는 것이 흥미로울 것이다.
엽산/호모시스테인 대사 경로
[Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)] 참조 경로 (www.genome.jp/kegg) 에는 엽산 및 호모시스테인 대사작용 단계가 묘사되어 있다. 경로는 메티오닌 신타아제 반응을 통해 연결되고, 세포 배양물, 동물 모델 시스템 및 인간에서의 변연 엽산 결핍은 호모시스테인 재-매틸화를 손상시킨다 (예를 들어, Stover PJ. 2004. Physiology of folate and vitamin B12 in health and disease. Nutr Rev 62:S3-12 참조).
호모시스테인은 NTD 에 대한 가설 위험 인자이다 (예를 들어, Mills et al., 1995. Homocysteine metabolism in pregnancies complicated by neural tube defects. Lancet 345 149-1151 참조) 엽산 결핍증은 또한 엽산 부족은 또한 MTHFR 및 CBS 모두의 알로스테릭 저해제인 S-아데노실-메티오닌 (SAM, 예를 들어, Stover, supra 참조) 에 의해 매개된 메틸화를 손상시킨다 (예를 들어, Kraus et al., 1999. Cystathionine β-synthase mutations in homocystinuria. Hum Mut 13:362-375; Daubner et al., 1982. In Flavins and Flavoproteins, eds. Massey, V. & Williams, C. H, (Elsevier, New York), pp. 165-172 참조). 또한, S-아데노실-호모시스테인:S-아데노실-메티오닌 (SAH/SAM) 비의 증가는 NTD 발달 메카니즘에서 제안되어 왔다 (예를 들어, Stover, supra, Scott, 2001. Evidence of folic acid and folate in the prevention of neural tube defects. Bibl Nutr Dieta 55:192-195. van der Put et al., 2001. Folate, Homocysteine and Neural Tube Defects: An Overview. Exptl Biol Med 226 243-270. 1,5,6 참조)
호모시스테인 대사작용에 관여하는 비-엽산 이용 효소
시스타티오닌-β-신타아제 (CBS) 결함은 상승된 호모시스테인 수준을 야기하고, 시스타티오닌-β-리아제 (CTH) SNP 는 상승된 호모시스테인과 유사하게 연관되어 있다 (예를 들어, Kraus et al., supra, Wang et al., 2004. Single nucleotide polymorphism in CTH associated with variation in plasma homocysteins concentration. Clin Genet 65483-486 참조). 엽산-이용 효소가 아니더라도, CBS 및 CTH 모두는 비타민 B6-보조인자에 의존하고, 손상된 대립유전자는 기능장애적 엽산/호모시스테인 대사작용의 위험을 제기한다. CBS 및 CTH 의 손상된 대립유전자는 본원에 기재된 바와 같은 MTHFR 손상된 대립유전자에 대한 엽산 요법과 유사한 B8 요법에 대한 표적이다. CBS 및 CTH 의 기능 및 비타민-반응성은 효모 상보성 어세이에서 요약된다 (도 6).
CBS 돌연변이 효소의 비타민 B6-치유법은 S. 세레비지아에에서 요약된다.
세포내 비타민 B6 (피리독신) 농도 (도 6) 의 함수로서 CTH 및 CBS 를 어세이하기 위해 효모 균주를 조작하였다. CTH 및 CBS 에 대한 S. 세레비지아에 오르소로그는 각각 cys3 및 cys4 이고, 이의 결함은 시스테인 영양요구성을 야기한다. 효소를, 균주 배경이 피리독신 생합성 (6 자리-결실 sno1Δ sno2Δ sno3Δ snz1Δ snz2Δ snz3Δ; Stolz et al, 2003. Tpn1p, the plasma membrane vitamin B6 transporter of Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 278:18990-18996) 뿐 아니라 cys3 또는 cys4 결손에 대해 결실인 것을 제외하고는 MTHFR 에 대해 본원에서 기재된 바와 유사한 방식으로 피리독신 농도의 함수로서 시험하였다.
도 6 은 고체 배지 상의 정량적 효모 성장 어세이를 보여주고, 모든 효소가 피리독신 보충의 기능으로서 동종 효모 결함을 구제하고 CBS 의 2 개의 호모시스틴뇨증성 대립유전자 (I278T, R266K) 의 비타민-반응성은 본 상보성 어세이에서 요약됨을 증명하였다: 상기 대립유전자는 제한 B6 수준에 대해 야생형 효소보다 더욱 민감해지고, 상응하게 더욱 커진 성장 결함을 보인다. 인간 CBS 에 의한 cys4 돌연변이체에서의 시스테인 영양요구성의 구제는 이전에 증명되었다 (Kruger et al., 1995. A yeast assay for functional detection of mutations in the human cystathionine-β-synthase gene. Hum Mol Genet 4:1155-1161; Kruger et al., 1994. A yeast system for expression of human cystathionine beta-synthase structural and functional conservation of the human and yeast genes. Proc Natl Acad Sci 91:6614-6618)
실시예 2: 부가적인 MTHFR 변이체 DNA 샘플의 확인
집단. 신경관 결손의 영향을 받은 각각의 250 명의 신생아 또는 신경관 결손의 영향을 받지 않은 각각의 250 명의 신생아의 건조 혈반 (bloodspot) 으로부터 (Guthrie Cards) 게놈 DNA 를 단리하였다. 단리된 게놈 DNA 샘플 중의 MTHFR 엑손을 실시예 1 에 표시된 바와 같이 서열분석하였다. 일치 인간 게놈 서열 (NM_005957) 에 대항하는 미스매치로서 서열 데이터로부터 효소 구조에 영향을 주는 돌연변이를 확인하였다. 모든 치환을 표 A 에 열거한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
실시예 1 에 기재된 바와 같은 기능적 영향을 관찰하기 위해 엽산 농도 범위에 따라 본원에 기재된 생체 내 효모 어세이를 사용하여 MTHFR 변이체의 기능적 영향을 시험하였다.
실시예 3: ATIC , MTHFS , MAT1A , MAT2A 및 GART 변이체의 확인
DNA 샘플 집단. 신경관 결손의 영향을 받은 각각의 250 명의 신생아 또는 신경관 결손의 영향을 받지 않은 각각의 250 명의 신생아의 건조 혈반으로부터 (Guthrie Cards) 게놈 DNA 를 단리하였다. 엽산/호모시스테인 대사 경로로부터 18 명의 지원자 유전자 내의 총 234 개의 엑손을 서열분석하였다. 효소 구조에 영향을 주는 서열분석 및 엠플리콘 돌연변이를 ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A, 및 GART 에 대해 표 2 에 열거된 일치 인간 게놈 서열에 대항하는 미스매치로서 서열 데이터로부터 확인하였다. ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A, 및 GART 에 대한 모든 치환을 표 B, C, D, E, 및 F 에 각각 열거한다.
Figure pct00005
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ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A, 및 GART 변이체의 기능적 영향을 실시예 1 에 기재된 바와 같은 기능적 영향을 관찰하기 위해 기술된 생체 내 효모 어세이를 사용하고 표 1 에 기재된 바와 같은 적합한 효모 균주 배경을 사용하여 엽산 농도 범위에 대해 시험한다.
모든 인용물은 그 전체가 참조로서 본원에 표현적으로 인용된다.
표 3. 다양한 인종의 500 명의 비선별된 개인에서의 샘플링으로부터 관찰된 비- 동의적 MTHFR 대립유전자의 스펙트럼
Figure pct00015

Claims (31)

  1. 하기 단계를 포함하는, 보조인자 투여에 의해 치유가능한 효소-인코딩 유전자의 손상된 대립유전자의 생체 내 스크리닝 방법:
    i) 효모 세포 내에 효소-인코딩 유전자의 시험 대립유전자를 도입하는 단계, 상기 효모 세포는 효소-인코딩 유전자에 대해 기능적으로 상동인 첫번째 유전자 중에 1 차 돌연변이, 및 효소 기능에 필요한 보조인자의 보충에 의존하는 효모 세포가 되게 하는 두번째 유전자 또는 유전자 그룹 중에 2 차 돌연변이를 포함하고, 상기 1 차 돌연변이는 첫번째 유전자의 기능과 관련된 효모의 측정가능한 특성을 변경함;
    ii) 성장 배지에 보조인자를 보충하는 단계; 및
    iii) 야생형 효소의 존재보다는 시험 대립유전자의 존재하에서 측정가능한 특성의 복원이 덜 검출되므로, 시험 대립유전자에 의해 첫번째 유전자 돌연변이의 불완전 상보성을 검출하고 시험 대립유전자를 손상된 대립유전자로서 확인하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 시험 대립유전자가 보조인자 민감성인지의 여부를 측정하기 위해 보충된 보조인자의 양을 적정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 효모가 2배체인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 2배체 효모가 효소-인코딩 유전자의 시험 대립유전자에 대해 이종접합인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 첫번째 유전자가 met13 이고, 두번째 유전자가 fol3 이고, 보조인자가 엽산이고, 측정가능한 특성이 성장이고, 효소-인코딩 유전자가 MTHFR, MAT1A, MAT2A, GART, MTHFS 및 ATIC 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 첫번째 유전자가 cys3 이고, 두번째 유전자 그룹이 6 자리 (sextuple)-결실 sno1Δ sno2Δ sno3Δ snz1Δ snz2Δ snz3Δ 이고, 효소 인코딩 유전자가 CTH 이고, 보조인자가 비타민 B6 이고, 측정가능한 특성이 성장인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 첫번째 유전자가 cys4 이고, 두번째 유전자 그룹이 6 자리-결실 sno1Δ sno2Δ sno3Δ snz1Δ snz2Δ snz3Δ 이고, 효소 인코딩 유전자가 CBS 이고, 보조인자가 비타민 B6 이고, 측정가능한 특성이 성장인 방법.
  8. 하기 단계를 포함하는, 보조인자-의존성 효소 결핍증에 대한 소인의 검출 방법:
    i) 대상으로부터 샘플을 수득하는 단계;
    ii) 하나 이상의 효소-인코딩 유전자의, 보조인자 치유가능한 다수의 손상된 대립유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 단계;
    하나 이상의 손상된 대립유전자의 존재는 대상에게 보조인자-의존성 효소 결핍증의 위험이 있다는 것을 나타냄.
  9. 하기 단계를 포함하는, 대상의 대사 경로 내 효소 결핍증의 확인 및/또는 특징화 방법:
    i) 대상으로부터 샘플을 수득하는 단계;
    ii) 상기 경로 내에서 하나 이상의 효소-인코딩 유전자의 다수의 손상된 대립유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 단계;
    손상된 대립유전자의 존재는 대상에게 치유가능한 효소 결핍증이 있다는 것을 나타냄.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 손상된 대립유전자가 저-빈도 대립유전자인 방법.
  11. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 손상된 대립유전자가 상기 경로 내의 다중 효소-인코딩 유전자로부터 유래하는 방법.
  12. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 다수의 손상된 대립유전자가 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 확인되는 방법.
  13. 하기 단계를 포함하는, 대상에서의 대사 효소 결핍증의 치료 방법:
    i) 대상으로부터 샘플을 수득하는 단계;
    ii) 하나 이상의 효소-인코딩 유전자의, 다수의 손상된 대립유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 및
    iii) 하나 이상의 손상된 대립유전자의 존재에 기반하여 상기 대상에게 보조인자 보충제를 투여하는 단계.
  14. 제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 대사 경로가 호모시스테인이고, 비타민이 엽산이고, 손상된 대립유전자가 인간 MTHFR 중의 M110I, H213R, D223N, D291N, R519C, R519L, 및 Q648P 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  15. 제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 대사 경로가 호모시스테인이고, 비타민이 엽산이고, 손상된 대립유전자가 인간 MTHFS 중의 R84Q, V119L 및 T202A 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  16. 제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 대사 경로가 호모시스테인이고, 비타민이 엽산이고, 손상된 대립유전자가 인간 MAT1A 중의 I90V, L176R 및 R312Q 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  17. 제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 대사 경로가 호모시스테인이고, 비타민이 엽산이고, 손상된 대립유전자가 인간 GART 중의 T16M, A161G, L363I, V367M, R385K, I397V, V421I, A445T, D510G, H601R, A632V, P641A, D752G, L797M, E804A, 및 N870S 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  18. 대사 경로에서 효소-인코딩 유전자 중 저-빈도 치유가능한 손상된 대립유전자를 검출하기 위한 다수의 핵산 탐침을 포함하는, 대사 경로 내의 치유가능한 효소 결핍증을 평가하기 위한 키트.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 손상된 대립유전자가 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 확인되는 키트.
  20. 손상된 대립유전자 돌연변이가 MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 4078; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 4234; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 5733; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 5872; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 6642; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 6657; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 6681; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 6774; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 10906; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 11656; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 11668; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 11902; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 12232; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 2622; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 12759; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 13040; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 14593; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 14612; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 14705; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 13170; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 116401 로 이루어지는 군으로부터 선택되고; SNP 의 서열은 표 A 에 제시되어 있는, 손상된 대립유전자 돌연변이 또는 이의 상보체를 포함하는 단리된 핵산.
  21. 손상된 대립유전자 돌연변이가 ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1100; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1114; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1179; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1244; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1270; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1288; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1301; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1380; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1396; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1453; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1506; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1689; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 7227; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 7232; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 7388; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 8756; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 8808; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14099; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14140; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14144; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14183; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14229; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14238; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14245; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14260; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14489; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14970; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 15003; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 15040; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 15043; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 15149; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 15240; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 15844; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 16063; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 21363; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 21372; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 21400; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 21521; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 21611; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22187; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22273; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22282; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22291; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22342; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22512; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22519; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22538; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22564; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22589; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22737; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 24992; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 25009; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 27757; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 27855; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 27985; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 28015; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 33901; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 33919; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 33920; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 33933; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35723; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35737; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35742; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35840; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35917; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35968; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35973; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38338; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38342; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38437; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38342; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38582; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38627; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38667; 및 ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38725 로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 뉴클레오티드의 서열은 표 B 에 제시되어 있는, 손상된 대립유전자 돌연변이 또는 이의 상보체를 포함하는 단리된 핵산.
  22. 손상된 대립유전자 돌연변이가 MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 8808; MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 8912; MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 8957; MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 8998; MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 52560; MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 52878; 및 MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 52902 로 이루어지는 군으로부터 선택되고; SNP 의 서열은 표 C 에 제시되어 있는, 손상된 대립유전자 돌연변이 또는 이의 상보체를 포함하는 단리된 핵산.
  23. 손상된 대립유전자 돌연변이가 MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 5045; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 5181; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 5233; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 6739; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 6795; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 9833; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 10006; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 10312; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 10339; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 10374; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 10484; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 10555; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 14038; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 14114; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 14177; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15424; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15500; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15646; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15706; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15715; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15730; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15758; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 16133; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 16174; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15706; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15715; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15730; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15758; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 16133; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 16174; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 16218 로 이루어지는 군으로부터 선택되고; SNP 의 서열은 표 D 에 제시되어 있는, 손상된 대립유전자 돌연변이 또는 이의 상보체를 포함하는 단리된 핵산.
  24. 손상된 대립유전자 돌연변이가 MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 2871; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 2873; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 2939; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 3287; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 3394; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 3466; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 3498; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 3650; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 3704; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4174; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4449; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4476; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4608; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4660; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4692; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4931; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 5313; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 5460; 및 MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 5480 으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; SNP 의 서열은 표 E 에 제시되어 있는, 손상된 대립유전자 돌연변이 또는 이의 상보체를 포함하는 단리된 핵산.
  25. 손상된 대립유전자 돌연변이가 GART 유전자의 뉴클레오티드 3782; GART 유전자의 뉴클레오티드 3842; GART 유전자의 뉴클레오티드 7745; GART 유전자의 뉴클레오티드 7984; GART 유전자의 뉴클레오티드 10775; GART 유전자의 뉴클레오티드 11521; GART 유전자의 뉴클레오티드 11522; GART 유전자의 뉴클레오티드 11541; GART 유전자의 뉴클레오티드 12356; GART 유전자의 뉴클레오티드 14200; GART 유전자의 뉴클레오티드 14273; GART 유전자의 뉴클레오티드 14282; GART 유전자의 뉴클레오티드 14739; GART 유전자의 뉴클레오티드 14781; GART 유전자의 뉴클레오티드 18055; GART 유전자의 뉴클레오티드 18064; GART 유전자의 뉴클레오티드 18130; GART 유전자의 뉴클레오티드 18142; GART 유전자의 뉴클레오티드 18197; GART 유전자의 뉴클레오티드 18232; GART 유전자의 뉴클레오티드 18401; GART 유전자의 뉴클레오티드 20812; GART 유전자의 뉴클레오티드 20825; GART 유전자의 뉴클레오티드 16174; GART 유전자의 뉴클레오티드 15706; GART 유전자의 뉴클레오티드 20862; GART 유전자의 뉴클레오티드 22481; GART 유전자의 뉴클레오티드 22521; GART 유전자의 뉴클레오티드 25425; GART 유전자의 뉴클레오티드 25433; GART 유전자의 뉴클레오티드 25601; GART 유전자의 뉴클레오티드 25867; GART 유전자의 뉴클레오티드 25912; GART 유전자의 뉴클레오티드 25951; GART 유전자의 뉴클레오티드 25956; GART 유전자의 뉴클레오티드 26127; GART 유전자의 뉴클레오티드 26195; GART 유전자의 뉴클레오티드 31627; GART 유전자의 뉴클레오티드 31641; GART 유전자의 뉴클레오티드 31887; GART 유전자의 뉴클레오티드 31902; GART 유전자의 뉴클레오티드 31933; GART 유전자의 뉴클레오티드 33173; GART 유전자의 뉴클레오티드 33264; GART 유전자의 뉴클레오티드 31933; GART 유전자의 뉴클레오티드 33173; GART 유전자의 뉴클레오티드 33264; GART 유전자의 뉴클레오티드 33286; GART 유전자의 뉴클레오티드 36963; GART 유전자의 뉴클레오티드 36964; GART 유전자의 뉴클레오티드 37428; GART 유전자의 뉴클레오티드 37433; GART 유전자의 뉴클레오티드 38762; GART 유전자의 뉴클레오티드 38914; 및 GART 유전자의 뉴클레오티드 38989 로 이루어지는 군으로부터 선택되고; SNP 의 서열은 표 F 에 제시되어 있는, 손상된 대립유전자 돌연변이 또는 이의 상보체를 포함하는 단리된 핵산.
  26. 손상된 대립유전자 돌연변이가 M110I, H213R, D223N, D291N, R519C, R519L, 및 Q648P 로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 손상된 대립유전자 돌연변이 또는 이의 상보체를 포함하는 단리된 핵산.
  27. 제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 손상된 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는, 일탈 엽산/호모시스테인 대사작용과 관련이 있는 상태 또는 질환의 위험의 스크리닝 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 질환 또는 상태가 심혈관 질환, 관상동맥병, 허혈성 뇌졸중, 죽상동맥경화증, 신경관 결손, 구안지 구열 (orofacial clefts), 전-자간증, 조산/저체중 출생, 재발성 초기 자발적 유산, 혈전증, 망막동맥폐색, 다운 신드롬, 결장직장암, 유방암, 폐암, 전립선암, 우울증, 정신분열병, 알쯔하이머 질환/치매, 노인성 황반 변성, 및 녹내장으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  29. MTHFR 및 GART 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자의 손상된 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는, 화학요법 반응 잠재성에 대한 스크리닝 방법.
  30. MTHFR 및 GART 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자의 손상된 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는, 화학요법 독성에 대한 스크리닝 방법.
  31. 제 20 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산을 포함하는, 엽산/호모시스테인 대사 경로 내의 유전자의 손상된 대립유전자를 검출하기 위한 어레이.
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