MX2009000393A - Uso de la tilvalosina como agente antiviral. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona al uso de un antibiótico macrólido, tilvalosina, como un agente anti-viral. La tilvalosina es particularmente útil para el tratamiento del PRRSV.

Description

USO DE LA TILVALOSINA COMO AGENTE ANTIVIRAL CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención está relacionada con el uso de un antibiótico en la preparación de un medicamento antiviral. La invención también se relaciona con un método de tratamiento una infección viral que comprende la administración de un antibiótico a un sujeto que tiene una infección viral.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La tilvalosina es el nombre INN provisional para el acetilisovaleriltilosina y es un antibiótico macrólido. El producto que contiene tilvalosina es conocido como Aivlosin®. Este es utilizado en una variedad de tratamientos, particularmente para el tratamiento de varias infecciones bacterianas en animales de granja. La tilvalosina es un derivado de la tilosina y tiene la siguiente formula estructural: en la cual R es isovaleril. Cuando el ganado es criado en explotaciones a gran escala, especialmente en explotaciones intensivas, estos animales presentan tendencia a sufrir de ciertas enfermedades. Tales enfermedades también tienden a propagarse rápidamente a través del ganado. Una de tales enfermedades es el síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS por sus siglas en inglés) . El PRRS es ocasionado por un virus, PRRSV, y afecta a los cerdos de todas las edades. Tiene ambos signos respiratorio y reproductivo y se cree le cuesta cientos de millones de libras esterlinas por año a la industria porcina mundial. PRRS se complica frecuentemente por una infección bacteriana, particularmente una infección con Mycoplasma hyopneumoniae . (M-hyo) . Esta infección se extiende en la población porcina y ocasiona neumonía. Cuando un cerdo es infectado con ambos M-hyo y PRRSV, la neumonía puede volverse muy severa. En la actualidad, Aivlosin® es utilizado para tratar M-hyo, en cerdos con y sin PRRS . Sorprendentemente los inventores han encontrado que el Aivlosin® ( tilvalosina) puede ser utilizado para tratar el PRRSV en si mismo. Los inventores han encontrado que el Aivlosin® (tilvalosina) tiene un efecto directo sobre el virus . Hasta ahora, el Aivlosin® solamente ha sido utilizado para tratar infecciones bacterianas tales como M-hyo. El Aivlosin® no ha sido utilizado para tratar infecciones virales. Aunque Aivlosin® (tilvalosina) ha sido utilizado para tratar M-hyo en cerdos con PRRS, no se conocía que podría tener un efecto sobre el virus así como sobre la infección bacteriana. No es usual para los antibióticos tener un efecto sobre infecciones virales. La Tilvalosina es un antibiótico macrólido. Otros macrólidos tienen muy variados efectos sobre los virus. La Tilmicosina ha mostrado ser efectiva contra algunos virus, incluyendo PRRSV. Sin embargo, la Tilmicosina es mucho mas toxica que la tilvalosina en los ensayos de cultivo celular de potencia antiviral. Además, la tilosina, el antibiótico al cual la tilvalosina esta relacionada mucho mas estrechamente no tiene efecto sobre el PRRSV y no se le conoce por tener efecto alguno sobre otros virus . SUMARIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la invención, esta provisto el uso de la tilvalosina, o un derivado funcional, metabolito, éster o sal de la misma, en la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de una infección con un virus . Como se indico arriba, la tilvalosina es un antibiótico macrólido llamado 3-0 acetil-4"-0-isovaleriltilosina . La tilvalosina es conocida en el arte previo. Los derivados y metabolitos de la tilvalosina incluidos cualquier compuesto estrechamente relacionados a la tilvalosina o a los cuales se convierte la tilvalosina cuando esta en solución o cuando se administro a un sujeto. Los derivados y metabolitos de la tilvalosina incluyen un número de compuestos encontrados como sustancias relacionadas en tilvalosina, especialmente en solución, tal como 3-0-acetiltilosina; 3, 4"-di-0-acetiltilosina; a-0-acetil-4"-0-propioniltilosina; 3-0-acetil, -4"-isovalerilmacrocina; 3-0-acetil-4"-0-butiltilosina; 3-0-acetil-4"-O-isovalerilrelomicina; 4"-0-isovaleriltilosina; 3, 20-di-O-acetil-4"-isovalerilrelomicina y 3, 4"' -0-acetil-4"-0-isovaleriltilosina . La tilvalosina puede estar en la forma de Aivlosin®.

Cuando la tilvalosina esta presente en la forma de un éster farmacéuticamente aceptable, se prefiere un alquil éster de la misma. Cuando la tilvalosina esta presente en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable, cualquier sal apropiada puede ser utilizada. Son preferidas las sales formadas con ácidos orgánicos, especialmente formadas con ácidos tales como el ácido ascórbico, glicólico, láctico, málico, tartárico o cítrico. Los derivados funcionales, metabolitos, esteres y sales funcionan de la misma forma que la tilvalosina, es decir, tienen un efectos similar sobre una infección viral en particular. Particularmente se prefiere que la invención se relacione al uso de la tilvalosina, o un éster o sal de la misma, en la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de una infección con un virus.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Ahora la invención será descrita a detalle, a modo de ejemplo solamente, con referencia a las figuras, en las cuales , Figura 1 muestra los resultados de un ensayo ara el numero de células que están infectadas después de la exposición a PRRSV, en la presencia de Aivlosin® (tilvalosina) ; Figura 2 muestra los resultados de un ensayo para el numero de células MDCK que son infectadas después de la exposición a la influenza, en la presencia de Aivlosin® (tilvalosina) ; Figura 3 los resultados de un ensayo para el numero de células Caco-2 que son infectadas seguidas a la exposición a la influenza, en la presencia de Aivlosin® (tilvalosina) ; Figura 4 muestra los resultados de un ensayo para el numero de células HeLa que son infectadas después de la exposición a influenza, en la presencia de Aivlosin® (tilvalosina) ; Figura 5 muestra el efecto del tiempo y la concentración sobre la acumulación intracelular de tilvalosina en las células HRT-18. a) las células HRT-18 fueron incubadas con 0.5, 5 ó 50 µg/mL de tilvalosina por 4 o por 24 h. Las de medio (barras blancas y gris claro) y células (barras negras y gris obscuro) fueron cosechadas por duplicados . Las concentraciones en el medio se muestran como µg de tilvalosina/mL de medio mientras que aquellas de las células son µg de tilvalosina/mg de células, b) La proporción de las concentraciones intracelular : extracelular de tilvalosina se calcularon para cada muestra (muestra 1 en las barras negras y la muestra 2 en las barras blancas) y fueron graficadas; Figura 6 muestra la acumulación intracelular de tilvalosina, tilosina y tilmicosina en las celular HRT-18, a) las células HRT-18 fueron incubadas con 10 µg/mL de cada antibiótico por 4 o 24 h. Las muestras duplicadas de las células fueron cosechadas a cada punto en el tiempo (barras blancas y negras) y se cosecho una muestra de medio (barras grises). Las concentraciones en el medio se muestran como µg de macrólido/mL de medio mientras que aquellas de las células son µg de macrólido/mg de células, b) las proporciones de concentración intracelular : extracelular de cada macrólido se calcularon y graficaron (muestra 1 en las barras negras y la muestra 2 en las barras blancas) ; Figura 7 muestra la acumulación intracelular y el transporte transepitelial de la tilvalosina en células Caco-2 polarizadas. Las células Caco-2 fueron incubadas con 100 mg/mL de tilvalosina en las cámaras apical (a) o basolateral (b) por 30 (barras gris claro) , 60 (barras negras), 120 (barras blancas) y 240 (barras gris obscuro) minutos. Las muestras duplicadas de las células y medio de ambas cámaras fueron cosechadas a cada punto en el tiempo. Las concentraciones en el medio se muestran como µg de tilvalosina/mL de medio mientras que aquellas de las células son µg de tilvalosina/mg de células. Se calcularon y graficaron las proporciones de concentración intracelular : extracelular de muestras donde la tilvalosina fue adicionada en las cámaras apical (c) y basolateral (d) (muestra 1 en las barras negras y muestra 2 en las barras blancas) . El medio de la cámara basolateral después de la administración apical (e) y la cámara apical después de la administración basolateral (f) fue muestreada y la concentración de la tilvalosina fue graficada como un porcentaje en la entrada; Figura 8 muestra la acumulación intracelular y transporte transepitelial de la tilvalosina, tilosina y tilmicosina en células Caco-2 polarizadas, a) las células Caco-2 fueron incubadas con 10 µg/mL de tilvalosina, tilosina y tilmicosina en la apical por 30 (barras gris claro) , 60 (barras negras) , 120 (barras blancas) y 240 (barras gris obscuro) minutos. Las muestras duplicadas de las células y medio de ambas cámaras fueron cosechadas a cada punto en el tiempo. Las concentraciones en el medio se muestran como µ? de macrólido/mL de medio mientras que aquellas de las células son µg de macrólido/mg de células, b) las proporciones de la concentración intracelular : extracelular de las muestras fueron calculadas y graficadas (muestra 1 en las barras negras y la muestra 2 en las barras blancas), c) el medio de la cámara basolateral después de la administración apical fue muestreado y la concentración de antibiótico se gráfico como un porcentaje de la entrada; Figura 9 muestra la acumulación intracelular de tilvalosina, tilosina y tilmicosina en la células epiteliales de riñon de cerdo, a) las células LLC-PKI fueron incubadas con 10 µg/mL de cada antibiótico durante los tiempos mostrados en la llave. Las muestras duplicadas de las células y el medio fueron cosechadas a cada punto en el tiempo (barras grises para muestras a 32 min., barras blancas para muestras a 75 min., y barras negras para muestras a 120 min.) . Las concentraciones en el medio se muestran como µg de macrólido/mL de medio mientras que aquellas de las células son µg de macrólido/mg de células, b) las proporciones de la concentración intracelular : extracelular de cada macrólido fueron calculadas y graficadas (barras grises para muestras a 32 minutos, barras blancas para muestras a 75 minutos y barras negras para muestras a 120 minutos); y Figura 10 muestra la acumulación intracelular de antibióticos macrólidos en las glóbulos blancos de cerdo y pollo, a) las glóbulos blancos de cerdo fueron incubadas con 10 µg/mL de tilvalosina o tilosina por 10 o 20 min. Las células cargadas con macrólido después de 20 min., de incubación fueron transferidas al medio e incubadas por un periodo adicional de 30 min. Las muestras duplicadas de las células y el medio fueron cosechadas a cada punto en el tiempo (barras grises para 10 min., barras blancas para 20 min., y barras negras para 30 min de enjuague) las concentraciones en el medio se muestran como µg de macrólido/mL de medio mientras que aquellas de las células son µg de macrólido/mg de células, b) las proporciones de concentración intracelular : extracelular de cada macrólido fueron calculadas y graficadas (barras grises para 10 min y barras blancas para 20 min) , c) la cantidad de macrólido que permanece en a célula después de enjuagar se evaluó y el % de retención en las células fue calculado y graficado (barras negras para 30 min., de muestras de enjuague), d) las glóbulos blancos de pollo fueron incubadas con 10 µg/mL de tilvalosina, tilosina o tilmicosina por 15, 30 o 60 min. Las muestras duplicadas de las células y el medio fueron cosechadas a cada punto en el tiempo (barras grises para 15 min., barras blancas para 30 min., y barras negras para 60 min.). Las concentraciones en el medio se muestran como µg de macrólido/mL de de medio mientras que aquellas de las células son µg de macrólido/mg de células, e) las proporciones de concentración intracelular : extracelular de cada macrólido fueron calculadas y graficadas (barras grises para 15 min., barras blancas para 30 min., y barras negras para 60 min.) . Figura 11 muestra el efecto de Aivlosin® (tilvalosina) , tilmicosina y tilosina en la infección con el virus de influenza de las células MDCK. Figura 12 muestra los efectos Aivlosin® (tilvalosina, sobre el PRRSV propagado después de la infección. Figura 13 muestra el efecto de varias sustancias ( clorpromazina, cloroquina, citocalasina D, nocodazole) y Aivlosin® (tilvalosina) sobre el PRRSV. Figura 14 muestra el efecto de varias dosis de cloroquina sobre la replicación del PRRSV, EAV (virus de artritis equina) y FCV (calicivirus felino) . Figura 15 muestra los efectos de Aivlosin® (tilvalosina) sobre el virus de la influenza (cepa Udorn) : a) Porcentaje de células infectadas por el virus en monocapa celular b) Ensayo en placa utilizado para cuantificar el titulo viral en la células pre-tratadas con Aivlosin® (tilvalosina) o no tratadas. La replicación del virus PRRSV es inhibida en las monocapas de células tratadas, siendo solamente detectado inoculum viral residual .

Figura 16 muestra el efecto de varios macrólidos sobre la replicación de VR2332 (una cepa Americana tipo 1 de PRRSV) Figura 17 muestra los resultados de un ensayo para la entrada de VR2332. Figura 18 muestra el efecto de la tilvalosina sobre la infección viral de células HeLa y HT29. Figura 19 muestra los resultados de ensayo con anaranjado de acridina para probar el efecto de la tilvalosina sobre el pH endosomal.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El termino infección con un virus se refiere a la presencia de partículas virales en un huésped. En particular, se refiere a la presencia de partículas virales en un sujeto que no son encontradas normalmente en tal huésped o de partículas virales que son patógenas o causan enfermedad en el huésped. La prevención de una infección con un virus significa que existe una reducción del numero de partículas virales en un huésped; o reducción o prevención del efecto citopático de la reproducción del virus; 'o reducción o prevención de la entrada del virus al citoplasma celular; o la reducción o prevención de los efectos patológicos o signos/síntomas de la infección viral, cuando se comparo al estatus esperado de un huésped no tratado seguido a la exposición al virus. Un huésped no tratado es un huésped que no ha recibido el medicamento preparado de acuerdo con la invención. El estatus esperado es el número probable de partículas virales o el nivel de efectos citopático o efectos patológicos o signos/síntomas en un huésped no tratado después de la exposición al virus. Un experto en el arte previo seria capaz de predecir esto . El tratamiento de una infección con un virus significa que existe una reducción del numero de partículas virales en un huésped; o reducción o prevención de la replicación de las partículas virales en un huésped; o reducción o prevención del efecto citopático de la reproducción del virus; o reducción o prevención de la entrada del virus al citoplasma celular; o la reducción o prevención de los efectos patológicos, signos clínicos o síntomas de la infección viral, cuando se comparo al estatus previo al tratamiento . Donde hay una reducción del numero de partículas virales en un huésped, o reducción de la replicación de las partículas virales en un huésped, o reducción del efecto citopático de la reproducción del virus, o reducción de la entrada del virus en el citoplasma celular, o reducción de los efectos patológicos, signos clínicos o síntomas de la infección viral, la reducción es estadísticamente significativa de preferencia. Por ejemplo, hay preferentemente una reducción de al menos 25%, mayormente preferible al menos 30%, aun más preferible al menos 35%, mucho más preferible al menos 40%. Un huésped es un organismo superior, las células de los cuales son utilizadas por el virus para su replicación. El huésped puede ser un humano o un animal. Se prefiere que el huésped sea un animal, especialmente un animal de la ganadería como una vaca, caballo, ave o cerdo. Se prefiere particularmente que el huésped sea un cerdo. Alternativamente se prefiere que el huésped sea un humano. El virus es preferentemente un virus que utiliza la ruta endosomal o lisosomal para infectar a las células del huésped . Los términos ruta endosomal y ruta lisosomal son conocidos en el arte previo. Se refieren a los mecanismos utilizados por algunos virus para entrar a las células. Todos los virus deben tener rutas de entrada a las células blanco para iniciar la replicación. Los virus generalmente hacen esto en dos formas, bien por un mecanismo directo en la membrana plasmática de la célula o bien siguiendo la introducción dentro de un compartimento celular tal como un endosomal o un lisosoma. Los virus que usan endosomas y lisosomas para entrar a la célula deben también fusionarse con o penetrar la membrana endosomal o lisosomal para ser liberados dentro del citoplasma celular. Un endosoma es un organelo que acarrea materiales recientemente ingeridos por endocitosis. El término es conocido en el arte previo. Un lisosoma es un organelo que contiene enzimas degradantes. El término es conocido en el arte. Muchos virus que utilizan la ruta endosomal o lisosomal requieres un pH especifico para sufrir un cambio conformacional que provoca la fusión con la membrana endosomal y la entrada a la célula. Sin ser ligado a una teoría particular, esta la opinión del inventor que la tilvalosina penetra a las células y se concentra en los endosomas y lisosomas y afecta el pH en aquellos endosomas y lisosomas. Los inventores opinan que este cambio en el pH de los endosomas y lisosomas previene la fusión de partículas virales dentro del endosoma y lisosoma con la membrana endosomal y lisosomal y por lo tanto previene que el virus penetre el citoplasma celular y se replique. Preferentemente el virus es un virus que utiliza la ruta endosomal o la ruta lisosomal tardía. Un endosoma tardío es un organelo pre-lisosomal . El término tardío se refiere a la cantidad de tiempo que le toma a las moléculas ingeridas por endocitosis ser transportadas al endosoma tardío. Los endosomas tardíos son más esféricos que los endosomas tempranos y están posicionados cerca del núcleo. Los endosomas tardíos tienen un pH más ácido que los endosomas tempranos. El término endosoma tardío es conocido en el arte previo. El virus es preferentemente un virus que utiliza una ruta endosomal o lisosomal controlada por Rab 7. Las proteínas Rab 7 son pequeñas GTPasas encontradas en la cara citoplasmática de ciertos compartimientos celulares. Estas tienen un papel en la regulación de la circulación a través de la membrana de aquellos compartimientos . La Rab 7 tiene un papel en la regulación de la circulación en los endosomas y lisosomas tardíos. Preferentemente el virus es un virus que requiere un pH dentro del endosoma o lisosoma por debajo de 6.5, mayormente preferible por debajo de 5.5, aun mas preferentemente por debajo de 5, con mucha mayor preferencia por debajo de 4.5. El pH del endosoma o lisosoma puede ser medido utilizando un colorante sensible al pH, por ejemplo uno de los cuales fluórese azul a pH neutro y amarillo/verde a pH bajo. La proporción de azul : amarillo proporciona una medida del pH del endosoma/lisosoma (Diwu, Chen, Zhang, Klaubert y Haughland (1999) Chemistry and Biology Vol 6 Issue 7 411- Generalmente es conocido si un virus utiliza las rutas endosomal o lisosomal para lograr penetrar la célula. En el caso poco probable que no sea conocido, un experto en el arte puede confirmar si un virus utiliza la ruta endosomal o lisosomal, verificar que parte de la ruta es utilizada o confirmar el pH o la dependencia de la proteina Rab que prueba la entrada viral dentro de las células en la presencia de compuestos que son conocidos por alterar el pH endosomal o lisosomal; o que utiliza mutantes que son negativos para una proteina Rab particular. Por ejemplo, se pueden utilizar los siguientes inhibidores químicos: • Cloroquina y cloruro de amonio, los cuales elevan el pH endosomal actuando como secuestradores de protones; y • Nocodazol, el cual de-polimeriza los microtúbulos y bloquea la transición de endosomas tempranos a endosomas tardíos . Si un virus no logra penetrar la célula en la presencia de cloroquina o cloruro de amonio, este puede ser considerado como dependiente del pH, requiriendo un pH ácido para infectar a las células. Si un virus esta impedido por el nocodazol para infectar las células, este se puede considerar para utilizar la ruta de endosoma tardío o la ruta lisosomal para penetrar las células, su entrada a estas rutas esta siendo bloqueada por el nocodazol . De manera alternativa, los siguientes mutantes dominantes negativos se pueden utilizar: • Mutante rab5 S34N, la cual bloquea la transición de vesículas recubiertas de clatrina en la membrana plasmática a endosomas tempranos y • Mutante rab7 T22N, la cual bloquea la transición de endosomas tempranos a endosomas tardíos. Los virus inhibidos por la rab5 S34N mutante requieren parar a través de un endosoma temprano, a pH aproximadamente de 6.5. Los virus inhibidos por la rab7 T22N mutante requieren pasar a través de un endosoma tardío a pH aproximadamente de 5. El virus puede ser, por ejemplo, un virus de cualquiera de las siguientes familias: Adenoviridae, Arteriviridae, Asfarviridae, Buyaviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Filoviridae, Flaviviridae, Orthomyxoviridae , Parvoviridae, Picornaviridae, Reoviridae y Togaviridae. Además, el virus puede ser, por ejemplo, un virus de cualquiera de los siguientes géneros: Mastadenovirus, Arterivirus, Asfarvirus, Hantavirus, Circovirus, Coronavirus, Flavivirus, Pestivirus, Hepacivirus, Influenza virus A, Isavirus, Parvovirus, Enterovirus, Rhinovirus, Orthoreovirus , Rotavirus y Alphavirus. En particular, el termino virus puede significar cualquier de uno o mas de, o cualquier combinación de adenovirus 7; PRRSV; influenza, incluyendo humana, aviar, porcina, equina, bovina e influenza canina; virus de la anemia de salmón; fiebre clásica porcina; virus de la Hepatitis C; virus de la Hepatitis E; virus de la fiebre porcina africana; virus Puumala; virus de la bronquitis infecciosa; gastroenteritis transmisible; SARS CoV; virus raburg; virus Ebola; virus del Oeste del Nilo; virus de la fiebre amarilla; virus de la encefalitis transmitido por garrapatas; virus de la diarrea bovina; parvovirus canino; Coxsackie B3; Coxsackie B5, reovirus aviar, rotavirus, virus del bosque de Semliki y circo tipo 2 porcino. El virus es preferentemente PRRSV. Alternativamente el virus preferentemente no es PRRSV.

En otra alternativa, el virus es preferiblemente influenza, especialmente, influenza humana, particularmente influenza humana de la cepa A o B, especialmente cepa A. Los detalles de los virus preferidos son dados en la Tabla 6. Además, la invención proporciona el uso de tilvalosina o un derivado funcional, metabolito, éster o sal de la misma en la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento v de una infección con un virus como se definió aquí y la prevención o tratamiento de una infección bacteriana. La prevención o tratamiento de una infección con un virus puede ser simultanea con o subsecuente o previa a la prevención o tratamiento de una infección bacteriana. El término infección bacteriana significa la presencia de bacterias en un huésped. En particular, significa la presencia en un sujeto de bacterias que normalmente no se encuentran en tal huésped o de bacterias que son patógenas o causan enfermedad en el huésped o la presencia de tales bacterias en una ubicación dentro del huésped en el cual las bacterias no son encontradas normalmente. La prevención de una infección bacteriana significa que hay una reducción del número de bacterias en un huésped; o reducción o prevención de la replicación de las bacterias en un huésped; o la reducción o prevención de los efectos patológicos o signos clínicos o síntomas de la infección bacteriana, cuando se comparo al estatus esperado de un huésped no tratado a continuación de la exposición a las bacterias. Un huésped no tratado es un huésped que no ha recibido el medicamento preparado de acuerdo con la invención. El estatus esperado es el número probable de bacterias o efectos patológicos o signos clínicos o síntomas en un huésped no tratado después de la exposición a las bacterias. Un experto en el arte previo seria capaz de predecir esto. El tratamiento de una infección bacteriana significa que hay una reducción del número de bacterias en un huésped; o reducción o prevención de la replicación de las bacterias en un huésped; o la reducción o prevención de los efectos patológicos o signos o síntomas de la infección bacteriana, cuando se comparo al estatus previo al tratamiento . La infección bacteriana puede ser cualquier infección que es susceptible al tratamiento con tilvalosina o un metabolito funciona, derivado, éster o sal de la misma. En particular la infección bacteriana puede ser una infección con cualquiera de una o más de las siguientes bacterias: Especies de Mycoplasma ( . hyopneumoniae , M. hyosynoviae, M. hyorhinis, M. gallisepticum, M. synoviae, M. meleagridis, M. bovis, M. bovirhinis) Orninthobacterium rhinotracheale Bordetella bronchiseptica Actinobaccilus pleuropneumoniae Pasteurella multocida Mannheimia (Pasteurella) haemolytica Rhodococcus (Corynebacterium) equi Streptococci (Strep.suis, Strep. pyogenes,) Staphylococci {Staph. aureus, Staph. epidermidis, ) Brachyspira hyodysenteria Brachyspira pilosicoli Lawsonia intracellularis Clostridium perfringens (Clostridium species) Corynebacterium diptheriae Aerococcus catalasicus Alcaligenes viscolactis Micrococcus luteus Microbacterium flavum Bacillus subtilis Bacillus circulans Bacillus lichenifor is Rickettsia spp Chlamydia spp Listeria spp Erysipelothrix rhusiopathiae Bartonella henselae Helicobacter pylori Streptococcus agalactiae, Strep. uberis Fusobacterium necrophorum Leptospira spp La infección bacteriana es preferentemente una infección con una especie de mycoplasma, especialmente Mycoplasma hyopneumoniae. Un numero de infecciones virales son frecuentemente vistas en conjunción con otras infecciones virales y/o infecciones bacterianas y es particularmente útil para ser capar de usar un medicamento para tratar mas de una de las infecciones. Por ejemplo, una de las enfermedades mas importantes económicamente de la producción comercial de cerdos es un enfermedad que ha sido llamada Enfermedad Respiratoria Porcina Compleja (PRDC) . Es multifactorial y un numero de virus y bacterias están involucrados, incluyendo PRRSV, circovirus porcino tipo 2, influenza porcina, coronavirus porcino y virus pseudorabies (Aujeszky's) y las bacterias patógenas Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus suis y Bordetella brochiseptica . Por consiguiente, cuando la infección viral es una infección con PRRSV y/o influenza porcina, la infección bacteriana es preferentemente una infección con una o mas de Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida , Streptococcus suis o Bordetella brochiseptica. En ,las reses existe una enfermedad respiratoria compleja similar asociada con el virus de la diarrea bovina viral (BVD por sus siglas en inglés) , parainfluenza (PIV) , virus sincital respiratorio bovino (BRSV) , rinotraqueitis infecciosa bovina (IBR) y Pasteurella. La Mycoplasma bovis también puede agravar esta enfermedad. Por consiguiente cuando la infección viral es una infección con el virus de la diarrea bovina viral, la infección bacteriana es preferentemente una infección con Mannheimia (Pasteurella) haemolytica o Mycoplasma bovís. Existe un numero de virus de la influenza aviar de baja patogenicidad en aves y estos han sido asociados con un mayor incremento de la enfermedad cuando también esta presente Mycoplasma gallisepticum. Alta mortalidad y morbilidad se observa en los rebaños doblemente infectados.

Por consiguiente, cuando la infección viral es una infección con influenza aviar, la infección bacteriana es preferentemente una infección con Mycoplasma gallisepticum.

La infección por virus de la influenza en el hombre puede predisponer al individuo a infecciones bacterianas secundarias tales como Staphylococcus aureus, Streptococci haemolyticus, Pneumococci , Pseudomanoas aeruginosa , Haemophilus influenzae . Como consecuencia, cuando la infección viral es una infección con influenza humana, la infección bacterial es preferentemente una infección con una o mas de Staphylococcus aureus, Streptococci haemolyticus , Pneumococci , Pseudomanoas aeruginosa , y Haemophilus influenzae . La Mycoplasma pneumoniae es una causa común de enfermedad respiratoria y han sido reportadas coinfecciones con virus de la influenza y el virus sincitial respiratorio, como tiene el hecho de que M.pneumoniae puede superinfectar durante un brote de influenza. Por lo tanto, alternativamente, cuando la infección viral es una infección con influenza, la infección bacteriana es preferiblemente una infección con Mycoplasma pneumoniae . También es proporcionado un método de prevención o tratamiento de una infección viral que comprende la administración de tilvalosina o un derivado funcional, metabolito, éster o sal de la misma, o una composición farmacéutica que comprende tilvalosina o un derivado funcional, metabolito, éster o sal de la misma, a un sujeto que tiene una infección viral. El método también puede ser utilizado para el tratamiento simultáneo o prevención de una infección bacteriana . • Una composición farmacéutica para ser administrada en el método de la invención comprende la tilvalosina o un derivado funcional, metabolito, éster o sal de la misma con cualquier acarreador, adyuvante o vehículo aceptable farmacéuticamente. Los acarreadores, adyuvantes o vehículos aceptables farmacéuticamente que pueden ser utilizados en la composición farmacéutica incluye, pero no están limitados a, intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana, sustancias buffer tales como fosfatos, glicerina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos saturados vegetales, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, fosfato ácido de sodio, fosfato ácido de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, silica coloidal, trisilicato de magnesio, polivinil pirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos , ceras, polímeros de bloque de polietilen- polioxipropilen, polietilenglicol y grasa de lana . La composición farmacéutica puede ser administrada oralmente, parenteralmente, por inhalación en spray, rectalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente, tópicamente, transdérmicamente o vía un reservorio implantado. Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden contener cualquier acarreador, adyuvante o vehículo convencional no toxico aceptable farmacéuticamente. El término parenteral como se uso aquí incluye, las técnicas de inyección o infusión subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrasinovial, intrasternal, intratecal, intralesional e intracraneal . La composición farmacéutica puede estar en la forma de una preparación inyectable estéril, por ejemplo, como una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión puede ser formulada de acuerdo a las técnicas conocidas en el estado de la técnica utilizando agentes de dispersión o humectantes adecuados (tales como, por ejemplo, Tween 80) y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril puede ser también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no toxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1 , 3-butanediol . Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden ser empleados están el manitol, agua, solución de Ringer y una solución de cloruro de sodio isotónica. Además, aceites no volátiles estériles son convencionalmente empleados como un medio disolvente o de suspensión. Para este propósito, cualquier aceite no volátil suave puede ser empleado incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como el ácido oleico y sus derivados glicéridos son útiles en la preparación de inyectables, como son aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como el aceite de oliva o aceite de castor, especialmente en sus versiones polioxietiladas . Estas soluciones o suspensiones de aceites también pueden contener un alcohol diluyente o dispersante de cadena larga tal como Ph.Helv o un alcohol similar. La composición farmacéutica puede ser administrada oralmente en cualquier forma de administración oralmente aceptable incluyendo, pero no limitado a, capsulas, tabletas y suspensiones y soluciones acuosas. En el caso de las tabletas para uso oral, los acarreadores que son utilizados comúnmente incluyen lactosa y almidón de maíz. Los agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, también son adicionados típicamente. Para la administración oral en una forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando las suspensiones acuosas son administradas oralmente, el ingrediente activo es combinado con los agentes emulsificantes y de suspensión. Si se desea, ciertos agentes endulzantes y/o saborizantes y/o colorantes se pueden adicionar. La composición farmacéutica puede también ser administrada en la forma de supositorios para administración rectal. Estas composiciones pueden ser preparadas mezclando un compuesto de esta invención con un excipiente adecuado no irritante, el cual es sólido a temperatura ambiente pero liquido a la temperatura recta y por lo tanto se fundirá en el recto para liberar los componentes activos. Tales materiales incluyen, pero no están limitados a, manteca de cacao, cera de abeja y polietilenglicoles . La composición farmacéutica puede ser administrada por vía nasal en aerosol o inhalación. Tales composiciones están preparadas de acuerdo a las técnicas conocidas en el arte de formulación farmacéutica y puede ser preparada como soluciones salinas, empleando alcohol bencílico u otros conservadores adecuados, promotores de absorción para mejorar la biodisponibilidad, fluorocarburos · y/u otros agentes para solubilizar o dispersar conocidos en el arte previo . El sujeto puede ser cualquier sujeto que tenga una infección viral. En particular, el sujeto puede ser un humano o un animal. Se prefiere que el huésped sea un animal, especialmente un animal de cría (ganado) como una vaca, caballo, ave o cerdo. Particularmente se prefiere que el huésped sea un cerdo. Alternativamente, el huésped preferiblemente es un humano.

EJEMPLOS EJEMPLO 1. Ensayo para PRRSV Las células A 104 fueron pre-tratadas con Aivlosin® ( tilvalosina) o tilmicosina por cuatro horas. Las células fueron entonces expuestas al PRRSV en la presencia de la tilvalosina o tilmicosina. Las células fueron después enjuagadas tres veces con PBS para remover virus no enlazados y se añadió medio fresco que contenía tilvalosina o tilmicosina. Las células fueron incubadas por un periodo adicional de 24 horas antes de ser fijadas con formaldehído al 4%. La infección viral fue detectada por inmunofluorescencia indirecta utilizando anticuerpos primarios policlonales anti-PRRSV porcinos y anticuerpos secundarios FITC-marcados anti-porcinos . La inmunofluorescencia fue detectada utilizando un microscopio confocal Leica. Las células que mostraron fluorescencia verde (a partir de la tinción con FITC) fueron marcadas como positivas por núcleo teñido con DAPI.

EJEMPLO 2. Ensayos para Influenza . La tilvalosina se adiciono a las células MDC , HeLa o CaCo-2 por 2 ó 4 horas a diferentes concentraciones. Las células fueron luego expuestas a la cepa PR8 del virus de la influenza A (multiplicidad de infección de 10) . Las células se fijaron después con formaldehido al 4% después de 4 horas y teñidos para la nucleoproteina de influenza (NP) utilizando anticuerpos primarios anti-NP de conejo y anticuerpos secundarios Alexa Fluor 488 anti-conejo. La inmunofluorescencia se detecto utilizando un microscopio confocal Leica. Las células que mostraron fluorescencia verde (a partir de la tinción con Alexa Fluor 488) fueron marcadas como positivas por núcleo teñido con DAPI.

EJEMPLO 3. Comparación de la acumulación intracelular y del transporte trans-epitelial de Aiylosin, Tilosina y Tilmicosina. Se probó la capacidad de los antibióticos macrólidos tilvalosina, tilmicosina y tilosina para penetrar y acumularse dentro de los tres tipos de células, epitelio (intestino, riñon) y formula blanca. La tilvalosina (3-acetil-4-isovaleril-tilosina ) penetro rápidamente los tres tipos de células y la mayor concentración se obtuvo en el citoplasma de los glóbulos blancos. También penetro las células epiteliales CaCo-2 polarizadas tanto por la superficie apical como basolateral, para ser concentrada en el interior de las células y ser transportada a la superficie opuesta. La penetración de la tilosina a los tipos de células fue relativamente pobre, mientras que la tilmicosina fue intermedia en su capacidad para penetrar y acumularse en las células. La absorción más grande de tilvalosina puede estar relacionada con la presencia de un grupo isovalerilo. Aunque los tres antibióticos son macrólidos, mostraron diferencias en al menos un aspecto de distribución, relevante para su eficacia en el tratamiento de la enfermedad clínica. Los antibióticos macrólidos son conocidos por penetrar las células y concentrarse en ellas. El antibiótico básico débil se queda atrapado en el ambiente ácido de las células, especialmente en los lisosomas (Tulkens, 1991) y también puede concentrarse en otros organelos intracelulares . Sin embargo, la extensión de la penetración intracelular y concentración varia entre los macrólidos y entre los tipos de células (Bosnar y cois., 2005, Labro, 1993) . La tilmicosina previamente ha sido reportada por concentrarse en las células (Scorneaux y Shrycock, 1988a, b) . Los tres antibióticos macrólidos con reivindicaciones de eficacia similar son la acetilisovaleriltilosina (tilvalosina, Salud Animal ECO) , tilosina (tilan, Salud Animal Elanco) y tilmicosina (pulmotil, Salud Animal Elanco) . Recientemente la tilvalosina ha sido aprobada en toda la Unión Europea (EU por sus siglas en inglés) , vía el procedimiento centralizado, para el tratamiento y prevención de neumonía enzoótica (Mycoplasma hyopneumoniae) en cerdos, para el tratamiento de ileítis {Lawsonia intracellularis) y para el tratamiento y prevención de disentería porcina (Brachyspira hyodysenteriae) . Es utilizada en ciertos países que no pertenecen a la EU para el tratamiento y prevención de micoplasmosis {Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synovae) en pollos. La tilmicosina es utilizada en cerdos para el tratamiento de neumonía ocasionada por Mycoplasma hyopneumoniae y para el tratamiento de infecciones respiratorias en bandadas de pollos asociadas con Mycoplasma gallisepticum. La tilosina es utilizada para la prevención y control de neumonía enzoótica, para la prevención y control o el tratamiento de disentería porcina y para el tratamiento y control de Lawsonia intracellularis . También es utilizada para el control de la Mycoplasma gallisepticum cepa S6 en pollos. Por lo tanto, las células enterocitas y epiteliales respiratorias parecen ser los blancos para estos patógenos . Existen varios reportes del efecto de los macrólidos sobre el sistema inmune innato o no específico (Lanaro y cois., 2000, Labro, 1993; Labro, 2000; Sunazuka y cois., (2003)) . Los dos mayores tipos de células fagocíticas en el cuerpo involucradas en el combate de enfermedades microbianas son los macrófagos y los neutrófilos (heterófilos en pollos) . Mientras que los macrófagos, derivados de los monocitos sanguíneos, son células relativamente longevas, los neutrófilos son células de corta vida. Es conocido que ambos tipos de células son importantes en el sistema inmune innato . Se investigo la absorción y concentración de los tres antibióticos en varios tipos de células, que representan enterocitos, células epiteliales y glóbulos blancos (WBCs) . La investigación utilizada estableció a las líneas celulares epiteliales de intestino humanas (HRT-18 y Caco-2) como ambos tipos de células retienen algunas de las propiedades de los enterocitos in-????. Las células Caco-2 pueden formar monocapas polarizadas (en esto tienen una superficie apical y una superficie basolateral) cuando desarrollan una membrana semi-permeable . El medio puede ser ubicado tanto arriba como debajo de la membrana semipermeable y el transporte trans-epitelial de las moléculas puede ser estudiado utilizando estas células. Los enterocitos están involucrados en la absorción de antibióticos a partir del intestino (lumen intestinal) . Las células renales de cerdo fueron utilizadas como un ejemplo de un tipo de célula epitelial y también se utilizaron tanto WBCs de pollo como de cerdo.

MATERIALES Y MÉTODOS Soluciones de antibiótico almacenadas La tilvalosina se obtuvo en la forma de tartrato como el producto soluble en agua (Salud Animal ECO) . El principio activo tilvalosina (3-acetil-4-isovaleriltilosina) comprende el 70.71% de gránulos de tilvalosina para solución oral, de acuerdo al certificado de análisis. A lo largo de este reporte, tilvalosina se refiere al principio activo, acetilisovaleriltiloxina . La tilosina, en la forma de Tilan soluble, (Salud Animal ELANCO), se utilizo como la sal tartrato. La tilmicosina, se uso en la forma de Pulmotil AC (Salud Animal ELANCO) . La tilmicosina se deriva de un producto de fermentación de la fracción B de la tilosina. Líneas Celulares Las células HRT-18, Caco-2 y LLC-PKI se obtuvieron a partir de ECACC. Las células HRT-18 se mantuvieron en el medio RMI 1640 que contiene 10% de suero fetal de ternera, 100 U/mL de penicilina y 100 µ?/p? de estreptomicina. Las células Caco-2 se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de suero fetal de ternera, 2 mM de L-glutamina y 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina. Las células LLC-KI se mantuvieron en medio 199 que contiene 10% de suero fetal de ternera, 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina. Preparación De Los Glóbulos Blancos De Cerdo Y Pollo La sangre de cerdo se recolectó en vacutainers BD con Heparina (6) . 20 mL de sangre y 30 mL de buffer salino de fosfato (PBS) se mezclaron en un tubo cónico de centrifuga de 50 mL. Esto se repitió para obtener 3 de estos tubos. Las mezclas se centrifugaron por 10 min a 2050x g. Los glóbulos blancos, junto con algunos eritrocitos abajo, fueron cosechados en un tubo cónico de centrifuga de 50 mL. Se adiciono el PBS a aproximadamente 50 mL. Una solución al 63% de Percol se preparo como sigue: 6.3 mL de Percol (Sigma), 1.0 mL de NaCl 1.5 M, 2.7 mL de H20. A cada uno de los dos tubos cónicos de centrifuga de 50 mL se adiciono 10 mL de Percol al 63%. 25 mL de los glóbulos blancos resuspendidos fueron puestos en capas en la parte superior de ' cada una de las soluciones de Percol. Se produjo una interfase definida. El material se centrifugó a 3000x g por 10 min. Una banda clara de glóbulos blancos se observo en la interfase PBS/Percol. Los glóbulos blancos fueron cosechados en PBS (50 mL) y centrifugados a 500x g por 10 min. La bolita de células fue resuspendida en medio (medio mínimo esencial Glasgow que contiene penicilina y estreptomicina) . Se hizo un conteo celular viable utilizando azul de tripan. El mismo método utilizado para el aislamiento de WBCs de cerdo se uso para los WBCs de pollo, con la excepción de que la heparina (100 I.U/mL) se preparó y mezcló con un volumen igual de sangre completa de pollo. Efectos Del Tiempo Y Concentración Para La Acumulación Intracelular De Tilvalosina En Las Células HRT-18. Las células HRT-18, en platos de cultivo tisular de 6 cm, fueron incubadas en la presencia de 0.5, 5 o 50 µg/mL de tilvalosina. Después de 4 h, dos platos por cada concentración de tilvalosina y dos platos sin antibiótico fueron extraídos de la incubadora. Una muestra de medio (aproximadamente 1 mL) se extrajo, colocada en un tubo Eppendorf marcado y almacenado a -20°C. El resto del medio fue eliminado después. Cada una de las monocapas de células se lavo dos veces en PBS, utilizando aproximadamente 5 mL para cada lavado. El embolo de un jeringa de plástico de 2 mL se utilizo para raspar gentilmente las células. Se adiciono el PBS (50 µ?,) al plato y las células removidas con delicadeza en este medio, utilizando una micropipeta. La muestra fue entonces colocada en un tubo Eppendorf y centrifugada a 8000x g en una centrifuga de banco (Biofuge pico, Heraeus Instruments) por 13 segundos. Se formo una evidente pelotita de células. El sobrenadante se extrajo utilizando una micropipeta y el material celular se almaceno a -20 °C en un tubo Eppendorf etiquetado. Después de aproximadamente 24 h los platos de cultivo tisular restantes se extrajeron de la incubadora y se trataron como se describió arriba para las muestras de 4 h. todas las muestras, incluyendo las muestras de 4 h. Se almacenaron después a -70°C. Acumulación Intracelular De Tilvalosina, Tilosina Y Tilmicosina En Células HRT-18. Las células HRT-18 fueron preparadas como se describió arriba y se usaron en el paso 42. Las soluciones almacenadas de antibióticos (tanto tilvalosina, tilosina como tilmicosina) se diluyeron en medios de cultivo y 10 mg/mL de cada antibiótico se adiciono a las monocapas celulares concluyentes . Las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera al 5% de CO2 por 4 h o 24 h. Los medios y las células se cosecharon y evaluaron por antibiótico, como se describe arriba. Acumulación Intracelular Y Transporte Trans-Epitelial En Células Caco-2 Las células Caco-2 fueron sembradas a una densidad de 0.8 x 106 células por pozo de una placa con pozos Transwell Clear de filtro 6, tamaño de poro 0.4 µp?. Las células fueron incubadas con 2 mL de medio en las cámaras apical y basolateral. Este medio se reemplazo cada 2 días durante 10-14 días. La resistencia trans-epitelial se midió utilizando el aparato Millicell ERS (Millipore) al día 7, 10 y/o 14 para identificar cuando las células han sido polarizadas. Lecturas > 1000 O fueron indicativas de células polarizadas. Los diferentes fármacos (a 100 µq/tc?L) se colocaron en las cámaras apical o basolateral y a diferentes puntos en el tiempo, hasta los 240 min, el medio en ambos compartimientos tanto en el apical como en el basolateral y las células se cosecharon y analizaron para determinar su contenido de macrólido. Acumulación Intracelular De Tilvalosina, Tilosina Y Tilmicosina En Células De Riñon De Cerdo. Las células -LLC-PKI fueron incubadas en platos de cultivo tisular de plástico de 6 cm2 con 10 µg/mL de los diferentes macrólidos . Las células y el medio fueron cosechados como se describe arriba a 30, 75 y 120 min. Acumulación Intracelular De Tilvalosina, Tilosina Y Tilmicosina En Glóbulos Blancos De Cerdo Y Glóbulos Blancos De Pollo. Las células se incubaron con 10 mg/mL de cada antibiótico. Todos los tubos se colocaron sobre una maquina mezcladora rotatoria a 37 °C. El sobrenadante y las muestras de las celular se cosecharon a los tiempos descritos en las leyendas de las figuras. Las muestras duplicadas se utilizaron para cada antibiótico en cada punto en el tiempo . Análisis De Las Muestras Que Contienen Tilvalosina, Tilosina Y Tilmicosina. Todos los sobrenadantes y las muestras celulares se transportaron congeladas (a aproximadamente -20°C) a York Bioanalytical Solutions (York, Inglaterra) para el análisis. Brevemente, se pesaron 0.25 g de buffer (medio RP I que contiene 10% de FCS) en un tubo de polipropileno. Se adiciono un volumen de 50 µ?, de la solución de trabajo apropiada, a las muestras de control de calidad (QC) . Se añadió metanol (50 µ?) a cada muestra de blanco utilizada para la preparación de los estándares de calibración, las muestras recuperadas y los blancos de reactivo. Se adiciono a cada muestra un volumen de 2.5 mL de buffer fosfato 0.1 , mezclada en el vortex por aproximadamente 1 min y después centrifugada a 3220x g por 10 min a 4°C. Para la fase de limpieza liquido-líquido, se transfirió una alícuota de sobrenadante (100 µ!_) a un tubo de polipropileno. El pH se ajusto a pH 8-8.5 por la adición de NaOH 0.1 M y se mezclo en el vortex. Se adiciono acetato de etilo (5 mL) y después se cubrió, la mezcla completa se agito por 10 min y después se centrifugo a 3220x g por 10 min a 4°C. Se adicionó 100 µ??. de acetato de amonio (20 mM; pH nativo) -ácido fórmico (v/v) , 1000:3, a cada pozo en una placa de recolección de 2 mL de polipropileno. Se transfirió una alícuota de la mezcla de acetato de etilo (100 µ??) a la placa de recolección de polipropileno y evaporada bajo atmósfera de nitrógeno (40°C) hasta que el acetato de etilo se evaporo totalmente mientras que el acetato de etilo permaneció. Se añadió metanol (100 µL) a cada pozo, excluyendo' los estándares de calibración. A cada pozo que contenía un estándar de calibración se añadieron 100 µ?. de la solución de trabajo de calibración apropiada. Las muestras se mezclaron en el vortex por al menos 10 minutos y sometidas al análisis por cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas tándem. El método establecido fue aplicable a las muestras de medio (y los estándares de calibración y las muestras de control de calidad) . Para las células, los tubos de muestra se pesaron y se añadieron 100 µ!_ de acetonitrilo . Las muestras fueron mezcladas en el vortex por 10 segundos, después se centrifugaron a 10285x g a 4°C por 5 min. La muestra se transfirió a un tubo de polipropileno. El tubo de muestra original se lavo con buffer fosfato 0.1 M (1 mL) . Esta fue transferida al tubo de polipropileno. Se hizo un segundo lavado de 1 mL, posteriormente un lavado final de 0.5 mL. El tubo de polipropileno estaba ahora en la misma etapa como al final de la extracción liquida, pero con las células presentes más que el medio. Esto fue hecho a través de la preparación de la muestra como se describe arriba. Los tubos de muestra original se dejaron secar (por ejemplo, cualquier remanente de disolvente se evaporo) y fueron nuevamente pesados para determinar el peso de las células en la muestra, para permitir la determinación de la concentración por gramo de células.

Resultados Efectos Del Tiempo Y Concentración Para La Acumulación Intracelular De Tilvalosina En Células HRT-18. Se realizaron experimentos iniciales para examinar el efecto del incremento de la concentración a través del tiempo sobre la acumulación intracelular de tilvalosina en la linea celular epitelial de intestino HRT-18. Como se vio en la Figura 5a hubo una absorción rápida (en 4 h) de tilvalosina en las células HRT-18 directamente proporcional a la concentración en el medio. Las células acumularon altas concentraciones de tilvalosina - al menos 585 µg/g de células. La proporción de la concentración célula :medio (mostrada en la Figura 5b) fue aproximadamente 1:12 para las tres concentraciones iniciales de tilvalosina en el medio. Se obtuvieron resultados similares después de 24 de incubación, sin embargo las proporciones fueron mas bajas. Acumulación Intracelular De Tilvalosina, Tilosina Y Tilmicosina En Células HRT-18. Además comparamos la acumulación intracelular de tilvalosina en células HRT-18 con la acumulación relacionada con los macrólidos tilosina y tilmicosina. Como se muestra en la Figura 6a la tilvalosina penetro las células epiteliales de intestino HRT-18 con mayor rapidez.

Se detecto un valor promedio de 61.8 µ? de tilvalosina/mg de células a las 4 horas mientras que solamente se detecto un promedio de 7.24 µg de tilmicosina/mg de células al mismo punto en el tiempo. Se encontró un promedio de 57.6 µg de tilvalosina/mg de células a las 24 h y de 32.45 µg de tilmicosina/mg de células. A ambos puntos en el tiempo la tilosina no penetro fácilmente las células HRT-18. Las proporciones intracelular : extracelular se muestran en la Figura 6b. Después de 4 h, la acumulación de tilvalosina resulto en un valor promedio para la concentración dentro de las células de 5.13 veces. Solamente una muestra de tilmicosina fue concentrada y esta fue 1.32 veces. Después de 24 h las proporciones medias de las concentraciones fueron similares para la tilvalosina (5.34 veces) y la tilmicosina (4.64 veces). La incapacidad de la tilosina para penetrar las células epiteliales HRT-18 significa que las proporciones de las concentraciones fueron menores a 1. Acumulación Intracelular Y Transporte Trans-Epitelial De Tilvalosina En Células Caco-2 Polarizadas. Después examinamos la acumulación intracelular de tilvalosina en otra linea celular epitelial de intestino, Caco-2. Estas células, cuando se desarrollan en soportes permeabilizados , pueden diferenciarse y volverse polarizadas; asi forman una bifurcaciones ajustadas entre las células y esto resulta en la formación de una membrana apical (superior) y basolateral (lateral e inferior) . La Figura 7a muestra la concentración de tilvalosina en las células y el medio de las cámaras apical y basolateral cuando la tilvalosina fue adicionada al medio de la cámara apical. La Figura 7b muestra resultados similares cuando la tilvalosina fue adicionada a la cámara basolateral. La tilvalosina demuestra una penetración rápida a las células Caco-2 polarizadas. Se detecto una concentración intracelular promedio de 428 µ? de tilvalosina/mg de células 30 min después de la administración apical (barras gris claro en la Figura 7a) y de 493 µg de tilvalosina/mg de células después de la administración basolateral (barras gris claro en la Figura 7b) . Después de la administración apical de las concentraciones de tilvalosina en las células alcanzaron un máximo (559.5 - 620 µg de tilvalosina/mg de células) entre los 60 min y 120 min y después disminuyo a 375 µg de tilvalosina/mg de células a los 240 min. Las células que habían recibido tilvalosina administrada en la cámara basolateral no alcanzo los mismos niveles de concentración intracelular como aquellos donde fue administrada en la cámara apical. La concentración máxima promedio alcanzada fue después de 30 min de incubación y después de este tiempo las concentraciones intracelulares disminuyeron a 155.5 µg de tilvalosina/mg de células a los 240 min. Las proporciones intracelular : extracelular se muestran en la Figura 7c y 7d. Después de la administración apical (Figura 7c) la tilvalosina rápidamente se concentro dentro de las células Caco-2 en una proporción de 4.64 después de 30 min. Esta proporción alcanza el punto mas alto entre 60 min y 120 min (valor promedio de 10.23 - 15.58) y después disminuyo a un valor promedio de 5.85 a los 240 min. La tilvalosina también demostró una rápida concentración después de la administración basolateral - una proporción intracelular : extracelular promedio de 7 se observo después de solo 30 min. Después de este tiempo aunque la proporción decreció a 3.57 después de 240 min. También examinamos el medio en la cámara opuesta al sitio de administración (por ejem., la cámara basolateral cuando la tilvalosina se adiciono a la cámara apical) para investigar si la tilvalosina podría ser transportada a través de las células epiteliales polarizadas. Como se muestra en las figuras 7e (administración apical) y 7f (administración basolateral) se detectaron niveles similares de tilvalosina en la cámara opuesta alcanzando niveles de 19% (Figura 7e) o 22.05% (Figura 7f) de tilvalosina comparados con la cámara de administración después de 240 min. La concentración incrementada de tilvalosina en el medio de la cámara opuesta coincide con los niveles disminuidos de tilvalosina detectados dentro de las células sugiriendo que las concentraciones intracelulares disminuidas pueden deberse a la salida se reparte dentro del medio en el lado opuesto de las células .

La Acumulación Intracelular Y Transporte Trans-Epitelial De Tilvalosina, Tilosina Y Tilmicosina En Células Caco-2. Se llevaron a cabo experimentos similares para comparar la acumulación intracelular y transporte trans-epitelial de la tilvalosina con tilosina y tilmicosina, aunque solamente examinamos el efecto después de la administración apical. Como se mostró en la Figura 8a la tilvalosina otra vez mostró una rápida penetración y acumulación alcanzando una concentración promedio máxima de 42.2 µ? de tilvalosina/mg de células después de 120 min. Como antes la concentración intracelular de tilvalosina disminuyo al punto en el tiempo 240 min (a un valor promedio de 34.3 de tilosina/mg de células). La tilosina no penetro fácilmente a las células Caco-2 polarizadas -después de 240 min se detectaron solamente 1.86 µg de tilosina/mg de células. La tilmicosina demostró más baja penetración y acumulación que la tilvalosina. La concentración intracelular promedio a 120 min fue 8.6 µg de tilmicosina/mg de células (comparado con 42.2 µg de tilvalosina/mg de células al mismo punto en el tiempo) . A los 240 min la tilmicosina alcanzo una concentración promedio de 16.05 µg de tilmicosina/mg. Las proporciones intracelular : extracelular mostradas en la Figura 8b muestra que la tilvalosina rápidamente se concentro en las células Caco-2 polarizadas. La tilosina no se concentro en estas células y la tilmicosina demostró un efecto intermedio con cinéticas de concentración más baja, pero se alcanzaron concentraciones al doble similares después de 240 min (3.49 veces la concentración para tilvalosina y 2.5 veces la concentración para tilmicosina).

Los datos mostrados en la Figura 8c indican un transporte mas eficiente de la tilvalosina al fluido basolateral que de la tilosina o tilmicosina. Después de 240 min de incubación con tilvalosina, la cámara basolateral contenia un promedio de 10.47% del valor de la cámara apical. Esto se compara con un promedio de 0.52% del valor para la tilosina y 1.08% de la tilmicosina. Acumulación Intracelular De Tilvalosina, Tilosina Y Tilmicosina En Células Renales De Cerdo. Los animales huésped típicamente tratados con tilvalosina, tilosina y tilmicosina son cerdos y aves. Examinamos la acumulación intracelular de estos macrólidos en la línea celular porcina epitelial de riñon LLC-PKI. Como se muestra en la Figura 9a la tilvalosina penetro y acumulo rápidamente en las células LLC-PKI, después de 75 min se detecto una concentración promedio de 53.95 µg de tilvalosina/mg de células comparada con 2.41 µg de tilosina/mg de células y 4.98 µg de tilmicosina/mg de células. Como se muestra en la Figura 9b la tilvalosina alcanzo una proporción intracelular : extracelular máxima de 8.9 a los 120 min. Acumulación Intracelular De Tilvalosina Y Tilmicosina En Glóbulos Blancos De Cerdo Y Pollo. También examinamos la acumulación intracelular de los macrólidos en glóbulos blancos aislados de pollo y cerdo. La tilvalosina penetro rápidamente los glóbulos blancos de cerdo (Figura 10a) . Después de 10 min se detecto una concentración promedio de 57.4 µg de tilvalosina/mg de células comparada con 31.21 µg de tilmicosina/mg de células . El pequeño incremento en esto valores se detecto a los 20 min - donde se detectaron 61.45 µg de tilvalosina/mg de células y 36 g de tilmicosina/mg de células. Como se muestra en la Figura 10b la proporción intracelular : extracelular promedio fue 8.68 para la tilvalosina, comparada con 4.33 para la tilmicosina. Se encontraron proporciones similares para ambos antibióticos después de 20 min. Cuando la células repletas de antibiótico se dejaron en el medio sin antibiótico, hubo un transporte fuera de la célula. La cantidad retenida dentro de la célula fue similar para ambos antibióticos aproximadamente del 14 a 15% (Figura 10c) . Por lo tanto, la mayor parte de antibiótico en las células se perdió bajo estas condiciones.

El tipo de célula equivalente al neutrófilo de mamíferos en pollos es el heterófilo. Los glóbulos blancos fueron aislados de la sangre de pollo y probados para la acumulación de antibiótico. Los resultados, como se muestra en la Figura 10D, demuestran que la tilvalosina se acumula rápidamente dentro de las células. A los 15 min la concentración de tilvalosina en las células tenia un valor promedio de 89.8 de tilvalosina/mg de células, esta alcanzó un valor máximo para este ensayo de 122.9 µg de tilvalosina/mg de células después de 60 min. La tilosina fue capaz de penetrar estas células y mostró concentraciones intracelulares de tilosina que incrementan de 10.1 µg de tilosina/mg de células a los 15 min a 32.1 µg de tilosina/mg de células a los 60 min. La tilmicosina otra vez mostró un efecto intermedio e incremento de 37.1 µg de tilmicosina/mg de células a los 15 min a 71.3 µg de tilmicosina/mg de células a los 60 min. Las proporciones intracelular : extracelular (Figura lOe) mostró que a los 15 min la concentración intracelular de tilvalosina fue aproximadamente 18 veces la concentración en el medio. Se detecto una concentración de 19 veces después de 60 min. Ambas tilmicosina y tilosina se concentraron en las células, aunque esto vario durante el periodo de tiempo experimental desde aproximadamente 4.2 a 8 veces para tilmicosina y a partir de 2.65 a aproximadamente4.7 para tilosina .

Discusión La absorción y acumulación de antibiótico en las células podría ser un factor importante que podría afectar la replicación del virus. La replicación del virus tiene lugar exclusivamente dentro de las células, conforme el virus requiere la maquinaria de las células para la replicación. Normalmente, no se esperaría que los antibióticos afectaran la replicación de los virus. Sin embargo, en este caso se ha encontrado inesperadamente que el Aivlosin ® ( tilvalosina) afecta la replicación de PRRSV e influenza A. Los datos comparativos, para la penetración de la célula, entre los macrólidos pueden ayudar a explicar las posibles diferencias sobre los efectos de la replicación viral. En estos estudios los inventores han investigado la absorción y acumulación intracelular de los tres macrólidos tilvalosina, tilosina y tilmicosina- en células epiteliales de humano y cerdo y glóbulos blancos de pollo y cerdo (WBC) . Los inventores demostraron que la tilvalosina fue capaz de penetrar y concentrarse en un grado mayor que la tilosina o tilmicosina en todos los tipos de células. Sin embargo los datos claramente desestiman el grado de concentración intracelular debido a la presencia del medio entre las células (fluido intercelular) (Scorneaux y Shryock, 1999) . Además ha sido demostrado que los macrólidos se localizan dentro de los compartimientos celulares ácidos, particularmente lisosomas (Tulkens, 1991, Carbón, 1995) . Estos compartimientos constituyen una proporción relativamente pequeña del volumen citosólico en las lineas celulares epiteliales y asi las concentraciones localizadas de antibiótico serán altas. Los experimentos iniciales para estudiar la acumulación de tilvalosina en células epiteliales de intestino (HRT-18) demostraron que el antibiótico se concentró eficientemente a niveles que dependieron directamente de aquellos en el medio. Experimentos adicionales que comparan la absorción y concentración de tilvalosina, tilosina y tilmicosina en células HRT-18 y LLC-PK1 demostraron diferencias marcadas en el comportamiento entre ellos. La diferencia más sorprendente fue que la tilosina penetró ambas lineas celulares con ineficiencia y no se concentró en ellas. A partir de los datos de HRT-18 se puede por lo tanto esperar que la absorción dentro del huésped a través de las células epiteliales de intestino sea más baja para la tilosina que para la tilvalosina. Los datos in vivo (Okamoto y cois; 1981) han demostrado que la tilvalosina administrada oralmente produce niveles sanguíneos más altos que la tilosina. Existe claramente una diferencia marcada en el comportamiento entre tilvalosina y tilosina, a pesar de sus estructuras moleculares estrechamente relacionadas. La observación que 3-acetiltilosina (datos no publicados) y la tilosina se comportan de la misma manera soporta el punto de vista de que el grupo hidrofóbico isovalerilo presente en la tilvalosina ( 3-acetil- ' ' -isovaleril tilosina) es importante para su absorción eficiente y acumulación subsecuente en los compartimentos ácidos. La tilmicosina es intermedia en términos de la relación de penetración de la célula/acumulación, pero los niveles finales logrados son muy similares a aquéllos logrados con tilvalosina. Esto puede reflejar la hidrofobicidad intermedia de la tilmicosina. Los valores de pKa reportados de los fármacos son todos consistentes con la protonación y acumulación en los compartimentos ácidos tales como los lisosomas. La falla de la acumulación de tilosina aun por 24 horas probablemente refleja su capacidad limitada para atravesar la membrana plasmática y las membranas intracelulares de los organelos . La investigación de la absorción y excreción de los antibióticos macrólidos utilizando células Caco-2 se extendió al trabajo de la célula HRT-18. Las células Caco-2 son células humanas de adenocarcinoma de colon. Estas son células epiteliales que exhiben las características de enterocitos maduros incluyendo las microvellosidades (microvilli) , bifurcaciones ajustadas, enzimas tales como las hidrolasas del intestino delgado, transportadores de nutrientes y proteínas de membrana, CTFR, ICA -1, receptor de interleucina-1 , receptor de interleucina-6 y receptor anti-tripsina alfa 1 (Varilek y cois., 1994, Kaiserlian y cois., 1991, Zweibaum y cois., 1983, Sood y cois., 1992, Molmenti y cois, 1993). Estas características las hacen muy adecuadas para evaluar la capacidad de los fármacos para pasar a través del epitelio de manera direccional. Las células polarizadas han sido utilizadas en numerosos estudios para examinar las .rutas de penetración y transporte de varios de los diferentes tipos de moléculas, incluyendo inmunoglobulinas y albúminas. (Ellinger y cois, 2001, Maples y cois, I 1997, Antohe y cois, 1997). Estas células también han sido utilizadas para estudiar la penetración polarizada y liberación de los virus (Cordo y cois, 2005, y Chu y Ng 2002, Rossen y cois. 2001, Jarvis y cois, 1999) . Los resultados a partir de las células en la presente investigación demostraron una rápida concentración de tilvalosina a los 30 min (el primer punto en el tiempo) para la administración apical y basolateral. Los valores similares se obtuvieron utilizando una u otra ruta de administración, que sugieren mecanismos similares de administración en ambas superficies. La tilvalosina se movió a través de la célula a la superficie opuesta y fue liberada dentro del medio. De este modo el antibiótico administrado en la superficie apical podría ser detectado en el medio basal. Este efecto incremento a través del tiempo, para que después de 4 h aproximadamente el 20% de la cantidad total de la tilvalosina haya sido transportada. Esto parece ser un proceso eficiente, tomando en cuenta el pequeño numero de células involucradas en el transporte. El movimiento de la tilvalosina se disminuye en un gradiente de concentración. El mecanismo por el cual esto ocurre es desconocido. La tilosina no se concentro intracelularmente en las células Caco-2, la tilmicosina mostró un comportamiento intermedio - la penetración rápida no se lleva a cabo pero durante el tiempo el antibiótico se concentro intracelularmente y una cantidad modesta fue transportada a través del epitelio. Este trabajo in vivo utilizando células epiteliales de intestino sugiere que el antibiótico in vivo podría ser transportado desde el lumen del intestino dentro del cuerpo y también desde el cuerpo dentro del. lumen del intestino. Esto ha sido demostrado para los macrólidos claritromicina y azitromicina . Nightingale (1997) reporto que la azitromicina es eliminada por la ruta hepática con alguna secreción biliar y también es eliminada directamente por secreción dentro del Blumen del intestino. Se cree que esta ruta tras-intestinal explica la eliminación del 30 al 35% del total de la dosis administrada. El mismo autor estableció que la claritromicina, sufre tanto eliminación renal, como hepática y además eliminación trans-intestinal, las cuales explica la excreción de aproximadamente el 10% de la dosis total de este macrólido. Los estudios previos han destacado la absorción incrementada y la gran acumulación de los macrólidos por los neutrófilos y las células de la linea monocito/macrófago . Nuestros datos demostraron que la tilvalosina penetro rápidamente y se acumulo tanto en los glóbulos blancos de pollo y cerdo después de solo 10 min de incubación. La absorción fue mayor que aquella observada para la tilosina o la tilmicosina. Una función mayor de los neutrófilos es la fagocitosis de organismos patógenos. Las células cargadas con el antibiótico pueden ser mejores para que el huésped se deshaga de los organismos susceptibles por incremento de la capacidad asesina dentro de la célula. También por liberación del antibiótico dentro del medio que lo rodea en proximidad, las células permiten concentraciones altas del antibiótico para ser producidos localmente, lo cual permite que la muerte extracelular se lleve a cabo.

En el presente estudio nuestra técnica permitió la comparación de la absorción de la tilvalosina y tilmicosina en WBCs de cerdo. La tilvalosina fue rápidamente captada por los glóbulos blancos de cerdo (la mayoría de los cuales son neutrófilos) y después de solo 10 in de incubación se obtuvo una proporción IC:EC de 9. La tilmicosina también penetro rápidamente los WBCs porcinos, aunque la concentración alcanzada fue menor (x 4) . Cuando se utilizaron los WBCs aviares, la tilvalosina alcanzo proporciones de IC:EC altas, aproximadamente x 18, en 15 min, las cuales fueron mantenidas. Tanto la tilosina como la tilmicosina también se concentraron, pero a una extensión menor. Los macrólidos has demostrado tener efectos sobre el sistema inmune nato, lo cual incluye la reducción de la inflamación que ocasiona la apoptosis incrementada de los neutrófilos (Chin y cois, 1998) y reduce el reclutamiento de neutrófilos en el sitio de infección (Lanaro y cois., 2000) . Estos efectos también podrían asistir al huésped en la prevención de la patología que puede estar asociada con la inflamación. Existen varios mecanismos diferentes por los cuales una molécula puede penetras las células. Estos incluyen la difusión pasiva (para moléculas liposolubles ) disminuyendo en un gradiente de concentración, el transporte activo y la endocitosis en sus varias formas (clatrina- mediada, caceolae- mediada, pinocitosis, macropinocitosis y fagocitosis como describió Pelkmans y Helenius 2003, Stuart y Ezelowitz 2005) . El movimiento de los antibióticos macrólidos dentro de las células ha sido estudiado pero la información es bastante escasa. Muchos de los estudios fallan al distinguir entre los procesos de cruce de la membrana plasmática dentro del citosol y el proceso de acumulación en las vesículas acidas. Es probable que la entrada al citosol sea un proceso pasivo, dependiente del gradiente de concentración. La absorción de los macrólidos ha demostrado ser mayor a pH alcalino. Esto confirma el punto de vista que la. difusión pasiva de las moléculas no cargadas se favoreció. La acumulación de los macrólidos no toma lugar a 4°C; esto es posiblemente porque las bombas de protones que acidulan los endosomas y lisosomas no están activas a esta temperatura mas que este proceso activo en la membrana plasmática sea inhibido, pero la observación que la azitromicina esta aun concentrada en las células pretratadas con los inhibidores metabólicos (Glaude y Snider, 1990) sugiere que un gradiente de pH pre-existente debería ser suficiente para permitir la acumulación de macrólido en los endosomas y lisosomas. El efecto de la temperatura baja puede ser debido a una disipación del pH bajo en estos organelos o, mas probablemente, a una reorganización de la estructura de la membrana plasmática que hace lenta la difusión mas dramáticamente que seria predicha por el efecto normal de la temperatura sobre las velocidades de difusión. La capacidad de las moléculas para atravesar las membranas en la ausencia de los canales específicos o transportadores es fuertemente dependiente de su capacidad para "disolverse" en la fase lipídica de la membrana. La hidrofobicidad esta entonces probablemente para ser el paso determinante de la. eficacia del acrólido de penetrar y acumularse, con los valores de pKa también jugando un papel en algunos casos. Las propiedades de la tilvalosina reportadas en esta publicación son consistentes con su posesión de un grupo isovalerilo y un pKa de 7.6. Los temas alrededor de la relación entre la actividad antibacteriana y la eficiente acumulación celular son complejos. Carbón (1995) estableció que es muy difícil predecir, para un tipo dado de célula y un tipo dado de infección intracelular , las concentraciones intracelulares reales las cuales son necesarias para un fármaco antimicrobiano para ser efectivo in vivo. Una consideración clave es, sin embargo, la relación espacial entre la bacteria y la célula que acumula el antibiótico. Los tres tipos de interacción son de particular interés en el contexto de los macrólidos tales como la tilvalosina, tilosina y tilmicosina. La primera involucra aquellas bacterias intracelulares , las cuales son capaces de sobrevivir en el ambiente de pH bajo de los endosomas/fagolisosomas . En este caso la acumulación del fármaco en el compartimiento ácido debe hacerlos altamente efectivos. El segundo tipo de interacción involucra la liberación desde una vesícula dentro del citosol. En este caso la acumulación de antibiótico en la vesícula solamente será de relevancia previa a la liberación de la bacteria, pero el material acumulado en la vesícula puede proporcionar un reservorio de antibiótico para liberar dentro del citosol. La tercera forma de interacción involucra la interacción extracelular estrecha en la cual la bacteria típicamente une a la membrana plasmática de la célula "huésped". En este caso también la acumulación será de relevancia solamente si la célula actúa como un reservorio del fármaco que es liberado lentamente dentro del entorno que rodea. Las propiedades de la tilvalosina descritas en esta publicación son consistentes con la eficacia contra las bacterias que penetran cualquiera de estos tipos de las relaciones con las células. La dificultad en la extrapolación desde las propiedades in vitro se ilustró por experiencias con otros macrólidos relativamente hidrofóbicos acumulados eficientemente. Entonces la absorción celular de la azitromicina es relativamente alta, con la absorción más lenta que aquella de otros macrólidos, pero esto no es paralelo al incremento en la eficacia (Labro, 1996) . Similarmente, las proporciones intracelular a extracelular altas han sido reportadas para la tilmicosina (Scorneaux and Shryock, 1998a, b, 1999) pero la eficacia no es excepcional, especialmente a las dosis comerciales utilizadas, como demostró Reeve-Johnson y cois. (1997a, b) para la micoplasmosis en pollos. Este antibiótico, que se encontró en concentraciones intracelulares altas y que se mueve a través de la membrana celular relativamente fácil, se puede haber esperado que sea altamente efectivo contra, por ejemplo, micoplasma. Permanece para ser determinado que las características de la molécula de 3 ' -acetil-4 ' -isovaleriltilosina cuenta para su eficacia particular contra un intervalo de importantes patógenos asociados a la célula . Nuestros resultados utilizando las células epiteliales de cerdo (PK) aportan resultados similares a aquellos utilizando células humanas (HRT-18, Caco-2). De hecho los resultados fueron muy claros y una vez mas la tilvalosina se concentro rápidamente en las células, mientras que la tilosina no se concentro y la tilmicosina tiene propiedades intermedias . Por consiguiente, los datos presentados en este estudio indican las marcadas diferencias en la absorción celular de las moléculas de macrólido, aunque la tilmicosina sea derivada de la fracción B de la tilosina y la tilvalosina sea derivada de la fracción A. la 3'-acetil-4 ' -isovaleriltilosina difiere de la 3 ' -acetiltilosina (3AT) debido a que tiene el grupo isovalerilo. La capacidad de la tilvalosina para penetrar rápidamente las células parece ser debido al grupo isovalerilo, la cual se muestra en los datos de este estudio y también de un estudio previo (Tsuchiya y cois., 1981) que sugirieron que la tilvalosina es más lipofilica que la tilosina o la 3AT . La 3AT es un metabolito mayor a la tilvalosina y es generado dentro de la célula. Presuntamente, el metabolito ha reducido la capacidad para salir de la célula, comparado con la tilvalosina. El hecho de que la 3AT es aun metabolitamente activa y es probablemente retenido en la célula mas tiempo que la molécula original lo cual puede ser ventajoso clínicamente .

EJEMPLO 4. Con relación al ejemplo 1, se llevaron a cabo experimentos para examinar el efecto de la tilvalosina sobre la infección de las células MDCK por la cepa de influenza equina Miami (comparados con las cepas humana PR8 y Udorn) . Las células MDCK fueron pretratadas con 1 µg/mL de tilvalosina, tilosina o tilmicosina por 4 horas. Las células fueron después infectadas con PR8, Udorn o Miami (a una multiplicidad de infección de 10) en la presencia de los fármacos. Las células se fijaron 4 horas la postinfección e infección fueron evaluadas por inmunofluorescencia indirecta para la nucleoproteina de la influenza. Los resultados se muestran en la figura 11. La tilvalosina (a 1 µg/mL) inhibió la infección de las células MDCK por la cepa de influenza equina Miami en un 92%, por Udorn en un 76% y por infección con PR8 la inhibición fue completa.

EJEMPLO 5. Los experimentos se llevaron a cabo para examinar el efecto de la tilvalosina, tilosina y tilmicosina sobre la infección con PRRSV y la propagación después de la infección a multiplicidad baja y también el efecto de adición de los fármacos después de la infección. Las células MA104 fueron infectadas con PRRSV a una multiplicidad de infección {moi por sus siglas en inglés) de 0.01 (debe infectar aproximadamente al 10% de las células en la primera vuelta) , a las 8 horas post-infección la tilvalosina, tilosina y tilmicosina se adicionaron a 1 µg/mL. Las células fueron cosechadas a las 28 horas post infección y la infección se evaluó por inmunofluorescencia indirecta. Los resultados que muestran el número de células virus-positivas para cada tratamiento se muestran en la figura 12. Como se estableció arriba a un moi de 0.01 debe infectar aproximadamente al 10% de las células. Sin embargo, después de 28 horas el virus habrá completado una vuelta de infección y habrá infectado a las células vecinas. Hemos encontrado que los antigenos virales pueden ser detectados a las 10 horas post infección a niveles bajos. Esta detección incremente a las 16-20 horas post infección y por 24 horas pueden ser detectados niveles bajos de expresión en las células vecinas. La adición de los fármacos a las 8 horas post infección no debe tener efecto sobre la infección primaria (por ejem., sin efecto sobre la entrada del virus entrante) . Podría, sin embargo, efectuar la replicación viral directa o indirectamente a través de otros mecanismos y también podría efectuar la penetración del virus durante la segunda vuelta de infección donde el virus es producido por la infección de las células vecinas por las células infectadas iniciales . La adición de Aivlosin® ( tilvalosina) a las 8 horas post infección inhibió la infección por PRRSV reduciendo la infección al 1% de células virus-positivas. El Aivlosin® (tilvalosina) pareció inhibir la replicación viral (fueron detectadas algunas células infectadas), previno la propagación del virus a las células vecinas y también redujo el efecto abscopal (bystander effect- efecto que ejerce la irradiación de tejidos sobre tejidos no irradiados) observado en las células no-tratadas/infectadas, donde las células vecinas no muestran expresión de antigenos virales. EJEMPLO 6. Los experimentos se llevaron a cabo para determinar si la tilvalosina tiene un efecto sobre el virus de la artritis equina (EAV) . Los inventores encontraron que la infección por EAV no se bloqueo con tilvalosina o con nocodazole, sugiriendo que EAV no circula hacia los endosomas tardíos. EJEMPLO 7. Estudios Para Examinar El Efecto De Inhibidores Conocidos De La Infección Por PRRSV Cuando Se Adicionaron A Varios Momentos Pre Y Post Infección. Cuando se adiciono, 4 horas antes de la infección, clorpromazina, cloroquina, nocodazole, citocalasina D y Aivlosin® (tilvalosina) se inhibió la infección inicial por PRRSV y por consiguiente no se observo la propagación. Cuando se adiciono, al momento de la infección, clorpromazina, cloroquina, citocalasina D y tilvalosina se inhibió la infección inicial por PRRSV y por no tanto no se observo la propagación. El nocodazole no inhibió la infección inicial. Las células tratadas con nocodazole aun permiten el largo proceso indicando que su generación no es dependiente de los microtúbulos aunque las células los contengan . Cuando se adicionó, 2 ó 4 horas después de la infección, solamente Aivlosin® ( tilvalosina ) se inhibió la infección del sitio inicial de infección y la propagación. Las células tratadas con clorpromazina mostraron el sitio inicial de infección pero el fármaco pareció prevenir la propagación. El nocodazole no tuvo efecto sobre la infección (debido a la toxicidad su efecto sobre la propagación otra vez no clara) y nuevamente se observo el largo proceso que contiene virus. La citocalasina D no tuvo efecto sobre la infección inicial asi se detectaron células infectadas, sin embargo los largos procesos estuvieron ausentes y no se pudo detectar la propagación. Esto sugiere que los procesos son dirigidos por la polimerización de la actina y que estos son requeridos para propagar los virus desde el sitio inicial de infección. La cloroquina no tiene efecto sobre la infección inicial o la propagación viral cuando se adiciona post infección. Los resultados se muestran en la figura 13. EJEMPLO 8. Comparación De La Sensibilidad De PRRSV, EAV Y FCV A La Cloroquina. El calcivirus felino, el virus de la artritis equina y el PRRSV, todos requieren la acidulación endosomal para infectar exitosamente a sus células huésped. Esto se ha demostrado elevando el pH endosomal con fármacos tales como la cloroquina. La cloroquina es una base débil y eleva el pH endosomal secuestrando protones (por ejem., concentraciones mayores de CQ secuestraran mas protones y elevaran el pH aun más) . El efecto del incremento de las concentraciones de CQ se muestra en la figura 14. Los datos muestran que concentraciones relativamente bajas de CQ (menores a 5 µ?) se requirieron para inhibir la infección por PRRSV sugiriendo que aun una elevación modesta en el pH endosomal es suficiente para inhibir la penetración del virus. La inhibición de FCV requiere concentraciones altas de CQ (200 µ? y mayores) y EAV es inhibido a 50 µ y superiores. Las concentraciones más altas de CQ sugieren que se requiere la elevación del pH para inhibir FCV y EAV. Todos estos datos indican que PRRSV requiere pasar a través de los endosomas con pH mucho mas bajo (por ejem., en los endosomas tardíos) que el EAV o FCV (por ejem., en los endosomas tempranos) . EJEMPLO 9. Cepa US de PRRSV. Los inventores también infectaron células A104 con VR2332 (una cepa US de PRRSV) para examinar el efecto de la tilvalosina sobre la infección. Los resultados se muestran en la figura 16.

Las células MA104 fueron pre-incubadas con Aivlosin®, tilvalosina, tilosina o tilmicosina a las concentraciones mostradas por 4 horas. Las células fueron después infectadas con VR2332 a un jnoi de 10 en la presencia de los fármacos. Las células fueron entonces incubadas por 20 horas. La infección se evaluó por inmunofluorescencia indirecta. Los resultados son comparables con los observados para la cepa Europea examinada previamente. EJEMPLO 10. Ensayo de penetración de VR2332 (cepa US de PRRSV) . Las células MA104 se trataron con clorpromazina, cloroquina, nocodazol o citocalasina D por 30 minutos; o tilvalosina, tilosina o tilmicosina por 4 horas. Las células fueron después infectadas con VR2332 a un moi de 10 e incubadas toda la noche. Los resultados presentados en la figura 17 muestran que la cepa US de PRRSV también es sensible a la tilvalosina pero no a la tilosina. La tilmicosina mostró inhibición parcial a la concentración utilizada. EJEMPLO 11. Efecto De La Tilvalosina Sobre La Infección Viral De Células Hela o HT29: Virus A Multiplicidad Alta Y Baja . El trabajo ha demostrado que las células HeLa tratadas con tilvalosina son altamente resistentes a la infección viral. Los inventores han repetido este ensayo con un número de virus y comparado con la infección viral de las células HT29 (una linea celular utilizada rutinariamente para la infección por enterovirus) . El virus se añadió a multiplicidad alta (para observar la propagación del virus en la monocapa celular) . Las células fueron tratadas con tilvalosina, tilosina, tilmicosina y cloroquina por 4 horas. Las células fueron después infectadas con el virus a un moi de 10 por 4 horas o moi de 0.1 por 16 horas. La tilvalosina inhibió la entrada del virus de la influenza y la entrada del virus coxsackie B5. La cloroquina también inhibió la entrada de los tres tipos de virus. La tilosina y tilmicosina no tuvieron efecto. El EV11 no fue afectado por ninguno de los tratamientos. La tilvalosina y la cloroquina inhibieron la infección por el virus de la influenza y por el virus coxsackie B5 a baja multiplicidad. La tilosina y tilmicosina no tuvieron efecto. Sorprendentemente EV11 fue inhibido por la tilvalosina en el ensayo de baja multiplicidad. La tilvalosina pareció inhibir la propagación del virus asi como los sitios iniciales de infección pudieron ser vistos por inmunofluorescencia, pero no se pudieron observar sitios secundarios. Los resultados se muestran en la figura 18.

EJEMPLO 12. Curso Temporal del Virus de la Influenza Las células MDCK fueron cultivadas en 24 placas con o sin cubreobjetos (las células que crecieron sobre los cubreobjetos son utilizadas para los ensayos de inmunofluorescencia) . Las células fueron tratadas con 1 µg/mL de tilvalosina por 4 horas. Las células fueron infectadas después con Udorn {moi de 0.1). Las muestras fueron cosechadas a las 4, 8, 16 y 24 horas . La figura 15a muestra los resultados del ensayo de inmunofluorescencia y la 15b el ensayo de placa. En ambos ensayos, el Aivlosin® (tilvalosina) inhibió la infección por la cepa de influenza Udorn durante el periodo de 24 horas del ensayo.

EJEMPLO 13. Ensayos De Anaranjado De Acridina El anaranjado de acridina es un colorante que provoca una fluorescencia verde en las células con la excepción de los compartimentos ácidos (como los endosomas) que aparecen rojos debido a la protonación del colorante y de la inhibición de la fluorescencia verde. Una substancia que aumenta el pH endosomal prevendrá la aparición de la fluorescencia roja. Se determinó el efecto de Aivlosin ® y otros antibióticos macrólidos en un número de lineas celulares, con una tinción de endosomas con anaranjado de acridina (ver Figura 19) . Se selecciona primero un área de células cultivadas en un cubreobjetos de vidrio utilizando una tinción DAPI . Esta tinción muestra los núcleos de las células como azul. Este procedimiento seleccionado ayuda a reducir cualquier parcialidad en los resultados. Se usaron luego los filtros verde y rojo en el microscopio de epifluorescencia para examinar aproximadamente 20 células. Se determinó el número de manchas rojas (vesículas del endosoma) . Se contabilizó el número promedio de endosomas teñidos con anaranjado de acridina.

La tilosina no tuvo mucho efecto en el aumento del pH en los endosomas de cualquier línea celular. El Aivlosin ® ( tilvalosina) y tilmicosina tuvieron efectos similares en células RA . Sin embargo, Aivlosin ® (tilvalosina) tuvo efectos mayores que el tilmicosina en células epiteliales. Estos resultados muestran que el Aivlosin ® (tilvalosina) aumenta el pH en endosomas. PRRSV requiere condiciones ácidas para la fusión y entrada al citoplasma de la célula. Un aumento en el pH podría prevenir este proceso de fusión y subsecuente entrada del virus y propagación en la célula.

EJEMPLO 14. Determinación De La Eficacia De Tilvalosina Para El Control De PRRSV Materiales y Métodos Diseño Experimental Todos los procedimientos de estudio y cuidado de animales fueron aprobados por y de conformidad con las guias del Comité Institucional en Cuidado Animal y Uso de la Universidad del Estado de Iowa. Sesenta y ocho cerdos machos híbridos de 10 a 12 días de edad fueron conseguidos de una manada seronegativa y no vacunada para PRRSV o Mycoplasma hyopneumoniae, como fue designado por el investigador principal. Todos los cerdos fueron etiquetados y pesados a su llegada. Los cerdos fueron asignados a 4 grupos de 16 cerdos cada uno (Tabla 1) . La asignación de cerdos en los grupos la llevó a cabo un experto en estadística. Los cerdos fueron asignados al grupo utilizando aleatorización en bloques (por peso) de tal modo que los grupos estuvieran balanceados de acuerdo al peso del cerdo. Se alojó por separado a cada grupo, pero en idénticos cuartos en las instalaciones de aislamiento. Se colocaron .comederos y bebederos en cada cabina de modo que los cerdos pudieran comer y beber a voluntad (ad limitum) a lo largo del ensayo. Se sacrificó a los 4 cerdos extras previo al día 0 del ensayo y no fueron incluidos en el ensayo.

Cada grupo de tratamiento consiste de 2 corrales con 8 cerdos cada uno. A su llegada, los cerdos recibieron una dieta medicada concentrada y comercial, libre de cualquier contaminante o pesticida y contiene 50 gramos por tonelada de ecadox (Philbro Animal Health) . Todos los cerdos fueron tratados con clorhidrato de ceftiofur (Excenel ®, Pfizer Inc.) de acuerdo a direcciones indicadas para 3 días después de la llegada. Parámetros De Producción Los cerdos fueron pesados individualmente hasta su llegada y en los días de experimentación 0, 7, 14, 17 y 28 para evaluar la ganancia de peso (ganancia diaria promedio) . Evaluación Clínica Los cerdos fueron evaluados diariamente durante 10 días en sus signos clínicos respiratorios incluyendo tos y frecuencia de respiración incrementada como se describió previamente1. La puntuación fue: 0 = normal; 1 = disnea y/o taquipnea media cuando están estresados; 2 = disnea y/o taquipnea media cuando se encuentran en descanso; 3 = disnea y/o taquipnea moderada en situación de estrés; 4 = disnea y/o taquipnea moderada en situación de descanso; 5 = disnea y/o taquipnea grave en situación de estrés; 6 = disnea y/o taquipnea grave en situación de descanso. Además, cualquier absceso de tos observado se registro como O = sin tos y 1 = tosiendo. Un veterinario o un individuo calificado hacen las observaciones. Tratamiento Tres grupos de cerdos recibieron alimentos con medicamento que contenían tilvalosina a 3 diferentes concentraciones proporcionadas por Salud Animal ECO. Los cerdos en los tres grupo recibieron la dieta medicada durante el estudio completo desde el Día de prueba 0 hasta el Día de prueba 28. El cuarto grupo fue alimentado de manera idéntica, con alimentos no medicados. Ensayos de Alimentación Muestras representativas de una libra de la alimentación se recolectaron en los Días de Prueba 17 y 28. Las muestras de alimentación no se recolectaron al inicio del estudio. Todas las muestras se marcaron con el número de código, lugar de muestreo, numero de protocolo, fecha de muestreo y firma, se colocaron en una bolsa de plástico para congelar. El tamaño fue aproximadamente 0.5 kg del alimento. Se recolectaron las muestras duplicadas. Un conjunto de muestras se envío sobre hielo seco a Salud Animal ECO para ser probadas por el laboratorio de analítica y el duplicado de la muestra se quedó en el lugar . Procedimiento De Prueba/Reto Una dosis de 1 x 105 de dosis infecciosa de cultivo tisular (TCID)50 en 2 mL de medio de una cepa de PRRSV altamente virulenta, VR2385, se inoculo por administración intranasal a todos los cerdos. Necropsia A · seis cerdos de cada grupo de tratamiento se les realizo la necropsia en el Día de Prueba 17 (10 días de post infección) y al resto de los cerdos se les realizo la necropsia el Día de Prueba 28 (21 días de post infección) . En el Día de Prueba 17, a dos cerdos seleccionados aleatoriamente de cada corral se les realizo la necropsia y el resto de los cerdos (n = 10) se sometieron a la necropsia el Dia de Prueba 28. A los cerdos se les administro un solución aprobada para la eutanasia de AVMA (Fatal-Plus, Vortech Pharmaceuticals , Dearborn, MI) seguido de exsanguinación . La traquea y los pulmones se cerraron con un fórceps y se removieron del cerdo. Los pulmones fueron evaluados por lesiones macroscópicas consistentes con PRRSV como se describió previamente. Se recolectaron muestras traqueales asépticamente para aislamiento bacteriano utilizando métodos microbiologicos estándar. Los pulmones se lavaron con 50 mL de buffer de fosfato salino (PBS) que contenia los antibióticos (9 µg de gentamicina/mL, 100 U de penicilina/mL y 100 µg de estreptomicina/mL) . Una porción de cada lóbulo pulmonar se recolecto y proceso para el examen histopatológico . Las lesiones histopatológicas fueron marcados como se describió previamente. Brevemente, 0 = sin lesiones microscópicas; 2 = neumonía intersticial multifocal moderada; 3 = neumonía intersticial difusa y 4 = neumonía intersticial grave. La inmunohistoquímica fue marcada como se describió previamente. De manera breve, 0 = sin células antígeno-positivas para PRRSV; 1 = 1-10 células positivas/campo; 2 = 11-30 células positivas/campo; 3 = 31-100 células positivas/campo y 4 = > 100 células positivas/campo. PCR De Tiempo-Real La sangre para el PCR se recolectó en los Días de Prueba 0, 10, 17, 21 y 28. El ARN total fue extraído utilizando el Mini kit QIAamp Viral RNA (QUIAGEN) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y se solubilizó en 60 µL de solución de elución. Los extractos de ARN se almacenaron a -80 °C hasta que se llevo a cabo la amplificación del RT-PCR a tiempo real. El cebador directo ("forward primer") y la sonda ("probé") utilizados en la cuantificación de PRRSV es la región ORF . La sonda ("probé") se etiquetó con un colorante fluorescente reportero, 6-carboxifluoresceina (FAM) en 5'-end (cinco prima) y un colorante inhibidor, Black Hole Quencher 1 (BHQ-1) en 3'-end (tres prima). La cuantificación de PRRSV se realizo utilizando RT-PCR a tiempo real en un Rotor-Gene RG-300 (Corbett Research, Sydney, AU) . Los 20 µL de la mezcla de reacción consistieron de 10 µ1_ de la mezcla maestra de buffer 2x Taq an Universal PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) ; 0.1 µ?. de transcriptasa reversa Superscript III (200 U/mL) (Invitrogen, Carlsbad, CA) ; 0.2 de RNAaseOUT (40 U/ L ) (Invitrogen, Carlsbad, CA) ; 2 L de cebador ("forward primer") y cebador reverso ("reverse primer") con la concentración óptima; 0.8 de la sonda ("probé") TaqMan con la concentración óptima; 2.9 µ]_ de agua libre de ADNasa/ARNasa y 2 µL de estándar de ARN diluida 10 veces o 2 µ]1. de ARN total extraído de cada muestra. La amplificación se realizo a 55°C por 45 min, 95°C porlO min; después por 45 ciclos a 95°C por 15 segundos y 60°C por 60 segundos cada uno. La fluorescencia se leyó al final de cada serie de amplificación. Todas las diluciones estándar y las muestras desconocidas se corrieron por duplicado. Las curvas estándar fueron aceptadas cuando los coeficientes de correlación (r2) fueron > 0.99. La cuantificación de PRRSV se logro comparando el valor del umbral de ciclos (Cr) de la salida de la muestra de ARN con el valor CT de diferentes diluciones del estándar de ARN. Serología La sangre se recolecto hasta la llegada y en los Días de Prueba O, 17 y 28. Los niveles de anticuerpos PRRSV se determinaron utilizando un ensayo comercial ELISA (HerdChek: PRRS; IDEXX Laboratories, Westbrook, ME) . Análisis Estadístico Primero los datos fueron resumidos (utilizando medias, desviaciones estándar e histogramas) para evaluar la calidad de los datos y las suposiciones distribucionales . Los datos fueron tratados como continuos (incluyendo los promedios de las puntuaciones) o como discretos (ejem., las puntuaciones) . Algunos de los datos fueron repetidos, medidos para cada día (puntaje de temperatura y respiración) y analizados al resumir primero los valores individuales de cada cerdo con el puntaje máximo o promedio y después analizados como datos univariados . Todas las otras mediciones repetidas se analizaron transversalmente . Los datos se analizaron utilizando ANOVA, Kruskal- allace ANOVA no parametrito o la prueba de ?-cuadrada dependiendo del tipo y distribución de datos. Las pruebas ómnibus significativas estadísticamente fueron seguidas por pruebas post-hoc de comparación de pares utilizando el ajuste Tukey HSD (datos continuos) o el ajuste de Bonferroni (datos discretos) . Una excepción fue las variables ADG el día 17, por lo cual la prueba ómnibus fue estadísticamente significativa pero las pruebas de comparación de pares, pruebas ajustadas, no mostraron significancia entre los grupos. Para este caso, se reportaron las pruebas de comparación de pares sin ajuste. Se promediaron los datos del lóbulo de pulmón. Resultados Parámetros De Producción El crecimiento global de los cerdos se evaluó pesando y promediando la ganancia diaria (ADG) (Tabla 2). No se observaron diferencias estadísticos en los pesos promedio de ninguno de los cerdos en ninguno de los grupos. En el día 17. La ganancia diaria promedio de los cerdos en el grupo 4 comparado con los cerdos del grupo 1. No se observo ninguna otra diferencia a ningún punto en el tiempo del estudio . Enfermedad Clínica Las puntuaciones para la enfermedad clínica se resumen en la Tabla 4. Las puntuaciones de la respiración clínica y las temperaturas rectales fueron registradas como el valor máximo durante el tiempo para cada cerdo y después se analizaron los promedios de las puntuaciones máximas. Además, se analizo la media de la temperatura rectal promedio. Para las puntuaciones respiratorias, los cerdos de los grupos 1 y 2 tuvieron puntuaciones significativamente mas bajas que las observadas para los grupos 3 y 4. Para las temperaturas rectales máximas, los cerdos del grupo 3 tuvieron la media de las temperaturas rectales promedio más altas que todos los otros grupos. Sin embargo, no se observaron diferencias en la temperatura rectal promedio observada en cada grupo. Puntuaciones Macroscópicas , Microscópicas E Inmunohistoquímica (IHC) . Las puntuaciones de las lesiones microscópicas de pulmón se resumen en la Tabla 5. No se observaron diferencias en la media de las puntuaciones de las lesiones macroscópicas de pulmón en ninguno de los grupos. La neumonía es consistente con la infección bacteriana observada en 40 de los cerdos en el estudio. Esto también puede haber impactado la gravedad de la neumonía por PRRSV en este estudio. Microscópicamente, los cerdos en el grupo 1 tuvieron significativamente puntuación mas baja de lesión en la primera necropsia comparado con todos los otros grupos. No se observaron diferencias en las puntuaciones de las lesiones microscópicas en la segunda necropsia. Las puntuaciones de inmunohistoquímica para nodos linfáticas traqueobronquiales , amígdalas o pulmones (un promedio de 2 secciones) , no se mostraron diferencias estadísticos entre los grupos. Bacteriología La Bordetella bronchiseptica se aisló del tracto respiratorio de la mayoría de los cerdos. Además, un número de animales se cultivaron para evaluar si estaban presentes micoplasmas porcinos. De estas, se aisló Mycoplasma hyorhinis en 7 de 23 cerdos. Ensayos De PCR (RT-PCR) De Tiempo-Real Los resultados de RT-PCR se resumen en la Tabla 5. Se observaron diferencias el Día de Prueba 10, con los niveles en el numero de copias de PRRSV ARN fue significativamente mas alto en los grupos 3 y 4 que los niveles en el grupo 2. Además, el nivel de PRRSV ARN en el grupo 4 fue significativamente mayor al mismo tiempo comparado con el grupo 1. No se observo ninguna otra diferencia en los niveles de PRRSV ARN sérico a ningún momento en el estudio. No se detecto PRRSV ARN en el día de prueba 0 previo al estudio .

Serología Todos los cerdos fueron negativos para anticuerpos en suero. En el día de prueba 17, 2 cerdos en los grupos 1 y 2y un cerdo en cada uno de los grupos 3 y 4 permanecieron seronegativo para anticuerpos PRRSV. Todos los otros cerdos fueron seropositivo. Todos los cerdos restantes fueron seropositivo hasta el final del estudio. Discusión El PRRSV continúa como un problema significativo para la industria porcina. Salud Animal ECO estuvo interesado en evaluar la capacidad de Aivlosin® (tilvalosina) para reducir la enfermedad clínica y la viremia asociada con la infección por PRRSV. Se observaron diferencias en la ganancia diaria promedio en el día de prueba 17 y en la gravedad de la enfermedad clínica medida por la puntuación respiratoria y la temperatura rectal máxima. Además, el nivel de PRRSV ARN fue diferente entre los grupos en el día de prueba 10 el cual fue 3 días siguientes de inoculación de PRRSV. Ninguna otra diferencia en los niveles fue observada, sin embargo existió una amplia variación en los niveles medidos de RNA en cada uno de los grupos haciendo difícil la interpretación de los datos. De manera interesante, las dosis mas bajas de Aivlosin® (tilvalosina) actuaron de manera mas efectiva incrementando la ganancia diaria promedio y reduciendo la enfermedad clínica y el nivel de viremia PRRSV. Se observaron menos efectos de tilvalosina con la neumonía inducida con PRRSV. No se observo ninguna diferencia en la severidad de la neumonía macroscópica de los cerdos, aunque la neumonía PRRSV fue bastante grave en este modelo de prueba. Nuevamente, como con la viremia, la enfermedad clínica y la ganancia diaria promedio, la administración de dosis más bajas de tilvalosina fueron más efectivas en el control de la enfermedad como se observo al reducir las lesiones microscópicas en la primera necropsia.

Este estudio mostró que la tilvalosina en dosis mas bajas parece reducir la enfermedad clínica y la viremia asociada con la infección por PRRSV.

Tabla 1.- Diseño Experimental de cerdos infectados con PRRSV y administrándoles Aivlosin® (tilvalosina ) y controles no tratados.

Numero de Numero de cerdos cerdos que que Numero Grupo Medicación/prueba sufrieron sufrieron total de la la cerdos necropsia necropsia al día 10 el día 21 1 100 ppm/PRRSV 8 8. 16 2 200 ppm/PRRSV 8 8 16 3 600 ppm/PRRSV 8 8 16 4 0 ppm/PRRSV 8 8 16 Total 32 32 64 Tabla 2.- Ganancia diaria promedio en kg (lbs) (± error estándar) de cerdos infectados con PRRSV y administrándoles Aivlosin® (tilvalosina) y controles no tratados.

A, B = medias con letras diferentes dentro de una columna son estadísticamente diferentes. • Valor-p indica la diferencia estadística entre los grupos de tratamiento dentro de una columna.

Tabla 3.- Suma de la enfermedad clínica de cerdos infectados con PRRSV y administrándoles Aivlosin® (tilvalosina) y controles no tratados.

A, B = medias con letras diferentes dentro de una columna son estadísticamente diferentes. • Valor-p indica la diferencia estadística entre los grupos de tratamiento dentro de una columna.

Tabla 4.- Media microscópica de las puntuaciones de lesión pulmonar por PRRSV (± error estándar) de cerdos infectado con PRRSV y administrándoles Aivlosin® .( tilvalosina) y controles no tratados.

A, B = medias con letras diferentes dentro de una columna son estadísticamente diferentes. • Valor-p indica la diferencia estadística entre los grupos de tratamiento dentro de una columna.

Tabla 5.- Media del ensayo de la reacción en cadena de polimerasa transcriptasa reversa (RT-PCR) a tiempo-real error estándar en Q) de los cerdos infectados con PRRSV administrándoles tilvalosina y controles no tratados.

*ND = no detectable A, B = medias con letras diferentes dentro de una columna son estadísticamente diferentes. • Valor-p indica la diferencia estadística entre los grupos de tratamiento dentro de una columna.

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Familia Genero Virus Ejemplo de huésped Adenoviridae Mastadenovirus adenovirus 7 Hombre Arteri iridae Arter ivirus Syndrome respiratorio Cerdo y reproductivo porcino 5 Asfarviridae Asfarvir us Virus de la fiebre Cerdo Africana porcina Bunyaviridae Hantavirus Virus Puumala Hombre Circoviridae Circovirus Circovirus porcine 2 cerdo Coronaviridae Coronavi rus Virus de bronquitis infecciosa A e Virus de la gastroenteritis Cerdo contagiosa (TGEV) SARS CoV Hombre Filoviridae Marburavirus Marburg del lago Victoria Hombre Filoviridae Ebolavirus Reston, Sudan, de la costa Ivory, Hombre Ebolavirus de Zaire tlaviviridae Flavivirus Virus del oeste del Nilo Hombre , caballo, pájaros Virus de la fiebre amarilla Hombre Virus de encefalitis transmitida Hombre por garrapatas Flaviviridae Pestivirus Virus de la diarrea viral bovina Ganado vacuno Fiebre clasica porcina Cerdo Flaviviridae Hepacivirus hepatitis C Hombre Influenzavirus Hombre , erdo, caballo Orthomyxoviridae A Virus de influenza A, Perro virus de influenza B Orthomyxo iridae Isavirus Virus de la anemia infecciosa Salmón de salmón Parvovir idae Parvovirus Parvovirus canino Perro Picornaviridae Entero Coxsackie B3, B5 Hombre Picomaviridae Rhino Subgrupo mayor Hom re Picomaviridae Rhino Subgrupo menor Hombre Reoviridae Orthoreov Reovirus aviar Ave Reoviridae Rota irus rotavirus Hombre , ovejas , cerdo, ganado vacuno Togaviridae Alfavirus Virus del bosque de Semliki Hombre Virus de hepatitis E Cerdo Tabla 6

Claims (27)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN
2. Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad y, por lo tanto se reconoce como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
3. REIVINDICACIONES 1. El uso de tilvalosina, o un derivado funcional, metabolito, éster o sal de la misma, en la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de una infección con un virus. 2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el virus es un virus que utiliza la ruta endosomal o lisosomal para infectar células huésped. 3. El uso de conformidad con la reivindicación 2, en donde el virus es un virus que utiliza la ruta endosomal o lisosomal tardía para infectar células huésped.
4. 4. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde el virus es un virus que utiliza la ruta lisosomal para infectar células huésped.
5. 5. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde el virus es un virus que utiliza la ruta endosomal tardía para infectar células huésped.
6. 6. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde el virus requiere un pH dentro del endosoma o lisosoma por debajo de 6.5.
7. 7. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el virus es un Mastadenovirus, un Arterivirus, un Asfarvirus, un Hantavirus, un Circovirus, un Coronavirus, un Filiovirus, un Flavivirus, un Pestivirus, un Hepacivirus, un Influenza virus A, un Isavirus, un Parvovirus, un Enterovirus, un Rhinovirus, un Orthoreovirus , un Rotavirus, o un Alphavirus .
8. 8. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el virus se selecciona de adenovirus 7, PRRSV, influenza, virus de la anemia de salmón, fiebre clásica porcina, virus de la Hepatitis C, virus de la Hepatitis E, virus de la fiebre porcina Africana, virus Sin Nombre (Nameless virus), virus Cuatro Esquinas (Four Corners virus), virus Puumala, virus de la bronquitis infecciosa, gastroenteritis transmisible, SARS CoV, virus del Oeste del Nilo, Marburgvirus, virus del Ebola, virus de la fiebre amarilla, virus de encefalitis transmitido por garrapatas, virus de la diarrea bovina, parvovirus canino, Coxsackie B3, Coxsackie B5, reovirus aviar, rotavirus, virus del bosque de Semliki y circo tipo 2 porcino.
9. 9. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el virus es PRRSV.
10. 10. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el virus es influenza.
11. 11. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el medicamento es también para prevenir o tratar una infección bacteriana.
12. 12. El uso de conformidad con la reivindicación 9 ó 10, en donde el medicamento es también para prevenir o tratar una infección bacteriana.
13. 13. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde cuando la infección viral es una infección con cualquiera de PRRSV o influenza porcina, la infección bacteriana es una infección con uno o más de Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus suis y Bordetella brochiseptica.
14. 14. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde cuando la infección viral es una infección con virus de diarrea bovina, la infección bacteriana es una infección con Mannheimia (Pasteurella) haemolytica o Mycoplasma bovis .
15. 15. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde cuando la infección viral es una infección con influenza humana, la infección bacteriana es una infección con uno o más de Staphylococcus aureus, Streptococci haemolytícus, Pneumococci, Pseudomanoas aeroginosa , y Haemophilus influenzae .
16. 16. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde cuando la infección viral es una infección con influenza aviar, la infección bacteriana es una infección con Mycoplasma gallisepticum.
17. 17. Un método para tratar una infección con un virus caracterizado porque comprende administrar tilvalosina o un derivado funcional, metabolito, éster o sal de la misma, o una composición farmacéutica que comprende tilvalosina o un derivado funcional, metabolito, éster o sal de la misma, a un sujeto que tiene 'una infección viral.
18. 18. Un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el virus es un virus que utiliza la ruta endosomal o lisosomal para infectar células huésped.
19. 19. Un método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el virus es un virus que utiliza la ruta endosomal o lisosomal tardía para infectar células huésped .
20. 20. Un método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el virus es un virus que utiliza la ruta lisosomal para infectar células huésped.
21. 21. Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el virus es un virus que utiliza la ruta endosomal tardía para infectar células huésped.
22. 22. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, caracterizado porque el virus requiere de un pH dentro del endosoma o lisosoma por debajo de 6.5.
23. 23. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, caracterizado porque el virus es un Mastadenovirus , un Arterivirus, un Asfarvirus, un Hantavirus, un Circovirus, un Coronavirus, un Flavivirus, un Pestivirus, un Hepacivirus, un Influenza virus A, un Isavirus, un Parvovirus, un Enterovirus, un Rhinovirus, un Orthoreovirus , un Rotavirus, o un Alphavirus.
24. 24. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, caracterizado porque el virus se selecciona de adenovirus 7, PRRSV, influenza, virus de la anemia de salmón, fiebre clásica porcina, virus de la Hepatitis C, virus de la Hepatitis E, virus de la fiebre porcina Africana, virus Sin Nombre (Nameless virus) , virus Cuatro Esquinas (Four Corners virus) , virus Puumala, virus de la bronquitis infecciosa, gastroenteritis transmisible, SARS CoV, virus del Oeste del Nilo, arburgvirus, virus del Ebola, virus de la fiebre amarilla, virus de encefalitis transmitido por garrapatas, virus de la diarrea bovina, parvovirus canino, Coxsackie B3, Coxsackie B5, reovirus aviar, rotavirus, virus del bosque de Semliki y circo tipo 2 porcino.
25. 25. Un método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el virus es PRRSV.
26. 26. Un método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el virus es influenza.
27. 27. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 26, caracterizado porque el método es también para tratar o prevenir una infección bacteriana.