ASOCIACIÓN ENTRE UN ANTIATEROTROMBÓTICO Y UN INHIBIDOR DE LA ENZIMA DE CONVERSIÓN DE LA ANGIOTENSINA La invención se refiere a la asociación de un antiaterotrombótico y un inhibidor de la enzima de conversión de la angiotensina (IECA), así como a las composiciones farmacéuticas que la contienen. Más específicamente, la presente invención tiene como objeto la asociación de un antagonista específico de los receptores TP y de un IECA. De manera sorprendente, los presentes inventores han demostrado que esta asociación permite inhibir la expresión del gen de la E-selectina, molécula de adhesión de 115 kDa que interviene en el mecanismo de la inflamación. De hecho, la E-selectina se sobreexpresa en los tejidos inflamatorios característicos de diversas patologías tales como la diabetes, las enfermedades aterotrombóticas, la hipertensión, la obesidad, la enfermedad de Alzheimer De manera más precisa, la E-selectina favorece la adhesión entre leucocitos y las células endoteliales, que constituye una condición previa indispensable en todo proceso inflamatorio (Frenette P.S and wagner DD., Insigths into selectin function from knockoutmice, 1997, Thromb. And Haem., 78, 60-64). Esta etapa, llamada «rolling», requiere la inducción en la superficie de las células endoteliales de moléculas de la familia de las selectinas (P-selectina (o CD62P) y E- selectina (o CD62E o ELAM por «endotelial leukocyte adhesión molecule»)) que van a interactuar con su ligando leucocitario («ligando carbohidratado sialilado», «ligando 1 de la glicoproteína P-selectina» o PSGL1). De esta forma, la progresión de los leucocitos que se desplazan sobre la pared endotelial de los vasos está ralentizada. Le sigue una etapa de adhesión cerrada, denominada «sticking», en el transcurso de la cual los leucocitos se
fijan a la superficie del vaso. Por último, los leucocitos migran a través de la pared vascular hacia los tejidos inflamatorios (diapédesis) a través de un gradiente de factores quimiotácticos (TNF-a, IL-1, IL-8). Es importante destacar que la expresión de la E-selectina está limitada al endotelio y reponde a los estímulos inflamatorios tales como IL-1 , TNF-a o el lipopolisacárido bacteriano (LPS). El nivel de E-selectina presente en la superficie de las células es máximo entre 4 y 6 horas después de la estimulación. Este retraso es prolongado porque es sintetizada de novo después de la estimulación de las células. El nivel de E-selectina recupera su nivel basal 24 horas después de la activación, pero in vivo, y en determinadas situaciones, la E-selectina durante un período más largo de tiempo en la superficie celular. Existen formas circulantes de diferentes moléculas de adhesión, entre ellas de la E-selectina. Estas formas solubles son generadas probablemente por escisión enzimática en un sitio próximo al punto de inserción en la membrana. La cuantificación de estas moléculas solubles está en correlación con la concentración de moléculas de adhesión presente en la superficie de las células endoteliales (Leeuwenberg JFM, Smeets EF, Neefjes JJ et al, E-selectin and intercellular adhesión molecule-1 are released by human endotelial cells in vitro, 1992, Immulogy, 77, 543-549). De este modo, el incremento de los niveles circulantes de moléculas de adhesión solubles, y más particularmente de la E-selectina, indica una activación de las células endoteliales (Smith CW, Potential signifícance of circulating E-selectin, 1997, Circulation, 95, 1986-1988). Se ha puesto de manifiesto un aumento del nivel de E-selectina plasmática en la obesidad y se ha demostrado una correlación positiva con el
índice de masa corporal (Ferri C, Desideri G, Valenti, et al, Early upregulation of endotelial adhesión molecules in obese hypertensive men, 1999, Hypertension, 34, 568-573). Un incremento de la tensión oxidativa en el sistema cardiovascular de estos pacientes y/o los estímulos metabólicos tales como por ejemplo la insulina en contacto con el endotelio podrían explicar estas observaciones. De hecho, en los pacientes diabéticos que padecen diabetes de tipo I o II existe una correlación entre el nivel de E-selectina y el riesgo vascular (Bannan S, Mansfield MW, Grant PJ, Soluble vascular cell adhesión molecule-1 and E-selectin levéis in relation to vascular risk factor and to E-selctin genotype in the first degree relatives of NIDDM patients, 1998, Dabetologia, 41 , 460-466). Por consiguiente se considera que el nivel de E-selectina es un marcador de las complicaciones vasculares asociadas a la diabetes. La resistencia a la insulina, la hiperglucemia y la hiperinsulinemia aumentan la expresión de la E-selectina explicando entonces la predisposición a la aterosclerosis observada en estos pacientes. Se ha demostrado ampliamente un aumento de los niveles de E-selectina circulante en pacientes hiperlipidémicos con un descenso de dicho nivel después del tratamiento hipolipemiante (Hackman A, Abe, Insull W et al, Levéis of soluble cell adhesión molecules in patients with dyslipemia, 1996, Circulation, 93, 1334-1338). Esto sugiere que los niveles de colesterol influyen sobre el nivel de E- selectina soluble. De hecho, una dislipidemia grave implica una disfunción endotelial con aumento de la expresión de E-selectina en las células endoteliales. Numerosos estudios han demostrado las correlaciones existentes entre el nivel y la expresión de E-selectina y la hipercolesterolemia y la aterosclerosis. Al estar inducida la síntesis de E-selectina por las citoquinas, un aumento del nivel de E-selectina podría ser un marcador de la inflamación
vascular. Numerosos estudios han puesto de manifiesto igualmente en pacientes que padecen enfermedades venosas crónicas una activación de las células endoteliales debida a la hipertensión venosa y por lo tanto una elevación de los niveles circulantes de moléculas de adhesión (Saharay M, Shields DA, Georgianos SN et al, Endotelial activation in patients with chronic venous disuade, 1998, Eur J Vasc Surg, 15, 342-349: Verbeuren TJ, Bouskela E, Cohén RA et al, Regulation of adhesión molecules: a new target for the tratment of chronic venous insufficiency, 2000, Microcirculation, 7, S41-S48). Por otra parte, también se ha descrito un incremento del nivel de E-selectina en pacientes hipertensos (Ferri C, Bellini C, Desideri G et al, Clustering of endotelial markers of vascular damage in human SALT-sensitive hypertension. Influence of dietary sodium load and depletion, 1998, Hypertension, 32, 862-868). De la misma forma, se han hecho numerosas referencias en la bibliografía al papel de la E-selectina en las complicaciones del sistema renal (SingbartI K, Ley K, Preotection from ischemia-reperfusion induced severe acute renal failure by blocking E-selctina, 2000, Crit. Care. Med., 28(8), 2507-2514, Nakatani K, Fujii H, et al, Endotelial adhesión molecules un glomerular lesions: association with their severity and diversity in lupus models, 2004, Kindney Int., 65(4), 1290-1300). También se ha demostrado la implicación de la E-selctina en pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer; en efecto, se han observado niveles elevados de E- selectina en estos pacientes (Borrón B, Volpi R, Martín G, Del Bono R, Archetti S, Colciaghi F, Akkawi NM, Di Luca M, Romanelli G, Caimi L, and Padovina A, Peripheral blood abnormalities in Alzheimer Disease:
Evidence for early endotelial dysfunction, 2002, Alzheimer's disuades and Assiciated disorders, 16(3), 150-155). Por último, numeroso estudios establecen la implicación del nivel de E-selctina en los procesos metastáticos y por lo tanto en el cáncer (Kobayashi H, Boelte KC, Lin PC, Endotelial Cell Adhesión Molecules and Cáncer Progression, 2007, Current Medical Chemistry, 14, 377-386; Kneuer C, Ehrhardt C, Radomski MW, Bakowsly U, Selctins potential pharmacological targets?, 2006, Drug Discovery Today, Vol. 11 , N° 21/22, 1034-1040). La presente invención se refiere a la asociación de un antiaterotrombótico y un inhibidor de la enzima de conversión de la angiotensina (IECA) en la que: - el compuesto antiaterotrombótico es un compuesto (A) de la fórmula (I):
en su forma racémica o de isómero óptimamente puro así como sus sales de adición farmacéuticamente aceptables. Descrito en la patente EP 64871 , este compuesto es un potente antagonista de los receptores TP, más particularmente un antagonista específico del tromboxano A2 y de los receptores de las prostaglandinas-endoperóxidos (PGG2-PGH2). Por otra parte, se ha demostrado que este compuesto disminuye de manera significativa la expresión endotelial de la molécula de adhesión VCAM-1
en el ratón ateromatoso Apo -I- diabético (Zuccollo A, Shi C, Mastroianni R et al, The thomboxane A2 receptor antagonist S 18886 prevents enhaced atherogenesis caused by diabetes mellitas, 2005, Circulaction, 112, 3001 -3008). - el inhibidor de la enzima de conversión de la angiotensina (IECA) se selecciona de forma no limitativa entre los siguientes compuestos: el inhibidor de la enzima de conversión de la angiotensina (IECA) se selecciona de forma no limitativa entre los siguientes compuestos: perindopril opcionalmente bajo la forma de su metabolito activo perindoprilato, ramipril opcionalmente bajo la forma de su metabolito activo ramiprilato, enalapril opcionalmente bajo la forma de su metabolito activo enalaprilato, captopril, lisinopril, delapril, fosinopril, quinapril, espirapril, imidapril, trandolapril opcionalmente bajo la forma de su metabolito activo trandolaprilato, benazepril, cilazapril, temocapril, alaceprilceronapril, moveltipril o moexipril, así como sus sales de adición de ácido o de base farmacéuticamente aceptable. Cabe señalar que ciertos IECA inhiben la inducción de la expresión de las moléculas de adhesión en las células endoteliales del ratón Apo E-/- en el que se ha infundido angiotensina II (da Cunha V, Tham DM, Martin-McNulty B et al, Enalapril attenuates angiotensin ll-induced atherosclerosis and vascular inflammation, 2005, Atherosclerosis, 178, 9-17). Al estudiar la interacción entre los sistemas tromboxano A2-receptor TP y renina-angiotensina, los presentes inventores han demostrado un sinergismo importante de estas vías sobre la expresión de las moléculas de adhesión. Con este fin, se ha utilizado un antagonista de los receptores Tp a una concentración que carece de efecto sobre la expresión de la E-selectina
inducida por el TNF-a en las células endoteliales humanas. A continuación se ha ensayado esta misma concentración en presencia de diferentes concentraciones igualmente inactivas de múltiples IECA. Con la asociación de los dos compuestos se ha observado un descenso significativo de la expresión de la E-selectina inducida por el TNF-a en las células endoteliales humanas, que demuestra un sinergismo inesperado entre los dos compuestos. Este efecto sinérgico se ha puesto también de manifiesto en un ensayo de trombosis y de tensión arterial en la rata. En este ensayo, se ha demostrado que la actividad antitrombótica del compuesto (A) de la fórmula (I) se refuerza en presencia del compuesto (B) y aumenta de forma muy importante y totalmente inesperada. Este ensayo demuestra igualmente que la presencia del compuesto (A) de la fórmula (I) refuerza de modo importante e inesperado el efecto antihipertensivo del compuesto (B). La asociación del compuesto (A) de la fórmula (I) y del compuesto (B) ha permitido igualmente disminuir de forma neta y significativa la expresión de la molécula de adhesión a las células vasculares I (VCAM-I) en la aorta y de la fibronectina en el riñon en un modelo de ratón ateromatoso diabético. Estos resultados permiten prever el uso de una asociación [antagonista de los receptores TP/IECA] para la fabricación de un medicamento útil en el tratamiento de complicaciones vasculares, y más particularmente cardiovasculares y cerebrovasculares, asociadas a la diabetes, a las enfermedades aterotrombóticas, a la hiperlipidemia, a la hipertensión, a las enfermedades venosas crónicas, a la inflamación, al síndrome metabólico asociado a la obesidad, o al cáncer. Entre las enfermedades aterotrombóticas, las composiciones según la invención son particularmente útiles para el
tratamiento del infarto miocardio, la angina de pecho, los accidentes vasculares cerebrales, los aneurismas aórticos o de la arteritis de los miembros inferiores. Por otro lado, la neftropatía asociada a la diabetes, a la hipertensión o a las enfermedades inflamatorias es igualmente una indicación en la que la asociación [antagonista de los receptores TP/IECA] resulta particularmente útil. Por último, la retinopatía diabética forma parte también de las indicaciones terapéuticas preferidas de la invención. Los factores de riesgo vasculares y las enfermedades vasculares, tales como la hipertensión, la obesidad, la diabetes, las enfermedades cardiacas, las enfermedades cerebrovasculares y la hiperlipidemia y por lo tanto la aterosclerosis intervienen en la génesis de demencias tales como al enfermedad de Alzheimer y la demencia vascular (Qiu C, Ronchi D. y Fratiglioni L., The epidemiology of the dementias: an update, 2007, Current Opinión in Psychiarty, 20, 380-385). Adicionalmente, en las enfermedades neurogenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, se ha observado un aumento del nivel de isoprostanos. Estos isoprostanos son marcados, pero también mediadores de la tensión oxidativa que seria el origen de la enfermedad (Monttuschi P., Barnes PJ, y Kackson Roberts II L., Isoprostanes: markers and mediators of oxidative stress, 2004, The FASEB journal, 18, 1791-1800). Los isoprostanos ejercen al menos una parte de su actividad estimulando los receptores TP (Montuschi P., Barnes PJ. Y Jackson Roberts II L., Isoprostanes: markers and mediators of oxidative stress, 2004, The FASEB Journal, 18, 1791-1800) y su actividad resultaría por lo tanto bloqueada por la presente asociación. La asociación de los presentes inventores actúa, tal como han demostrado los estudios descritos en la presente solicitud de patente, sobre las
enfermedades vasculares que representan factores de riesgo para las demencias. Los IECA preferidos son perindopril de la fórmula (B) y ramipril de la fórmula (C) así como sus sales y, más particularmente el perindopril de la fórmula (B) y sus sales:
(B) (C) Entre las sales de adición de perindopril, se pueden citar a título no limitativo las sales de adición de una base farmacéuticamente aceptable tales como las sales de terc-butilamina, de arginina, de sodio, de potasio, etc.... El perindopril estará presente preferentemente bajo la forma de una sal de terc-butilamina o de una sal de arginina. En las asociaciones según la invención, el compuesto (A) es preferentemente el ácido 3-[(6R)-6-[[(4-clorofenil)sulfonil]amino]-2-metil-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-1-il]-propanoico, llamado también terutroban. También son concebibles asociaciones análogas que implican otros antagonistas de los receptores TP tales como ifetroban o ramatroban. Entre las sales de adición del compuesto (A), se pueden citar a título no limitativo las sales de adición de una base farmacéuticamente aceptable
tales como las sales de sodio, de potasio, de terc-butilamina, de dietilamina, etc.. Se prefiere más particularmente la sal sódica de terutroban. En las composiciones farmacéuticas según la invención, las cantidades de IECA y de antagonista de los receptores TP están adaptadas a la naturaleza de los principios activos y por lo tanto sus proporciones relativas son variables en función de los principios activos. Cuando el compuesto (A) es terutroban en forma de su sal sódica y el IECA es perindopril en forma de sal de terc-butilamina o de arginina, estas proporciones están comprendidas entre 10% y 40% del peso total de los principios activos para perindopril y entre 60 y 90% del peso total de los principios activos para terutroban. Los porcentajes preferidos para esta asociación están comprendidos entre 15 y 25% de perindopril en forma de sal de terc-butilamina frente a 75 a 85% de terutroban en forma de su sal sódica, y comprendidos entre 20 y 30% de perindopril en forma de sal de arginina frente a 70 a 80% de terutroban en forma de sal sódica. La presente invención se refiere igualmente a las composiciones farmacéuticas que comprenden una asociación del compuesto (A) y de un IECA, opcionalmente bajo la forma de sales farmacéuticamente aceptables, con uno o múltiples vehículos o excipientes inertes, atóxicos y apropiados. En las composiciones farmacéuticas según la invención, la fracción en peso de principios activos (peso de los principios activos con respecto al peso total de la composición) está comprendida entre 5 y 50%. En lo que se refiere a excipientes farmacéuticamente aceptables, se pueden citar a título no limitativo los aglutinantes, diluyentes, disgregantes,
estabilizadores, conservadores, lubricantes, odorantes, aromatizantes o edulcorantes. Entre las composiciones farmacéuticas según la invención, se prestará especial atención a aquéllas que son adecuadas para la administración por vía oral, parenteral y en especial intravenosa, transcútaneas, nasal, rectal, perlingual, ocular, respiratoria y más específicamente a los comprimidos simples o grageas, a los comprimidos sublinguales, cápsulas duras, comprimidos perlinguales, cápsulas, pastillas, preparaciones inyectables, aerosoles, gotas oftálmicas o nasales, supositorios, cremas, pomadas, geles dérmicos, etc.. La vía de administración preferida es la vía oral y las composiciones farmacéuticas correspondientes pueden permitir la liberación instantánea o diferida de los principios activos. Las composiciones farmacéuticas preferidas son los comprimidos. La posología es adaptable a la naturaleza y gravedad de la afección, a la vía de administración así como a la edad y peso del paciente. En las composiciones según la invención, la posología se encuentra dentro del intervalo de 1 hasta 100 mg para el compuesto (A) y de 0.5 hasta 100 mg según la naturaleza del IECA en una o múltiples tomas durante 24 horas. Cuando el IECA es perindopril, la dosis de administración diaria está comprendida entre 0.5 y 20 mg en una o múltiples tomas. Los ejemplos de composición que aparecen a continuación se ofrecen sin carácter limitativo. Comprimidos de terutroban/perindopril: EJEMPLO 1 :
Componentes Cantidad (mg) Terutroban, sal sódica 30 Perindopril, sal de terc-butilamina 8 Sílice coloidal hidrófoba 0.4 Almidón 6 Estearato de magnesio 2 Celulosa microcristalina 50 Lactosa 103.6 Para un comprimido terminado hasta 200 EJEMPLO 2:
Componentes Cantidad (mg) Terutroban, sal sódica 30 Perindopril, sal de arginina 10 Sílice coloidal hidrófoba 0.4 Almidón 6 Estearato de magnesio 2 Celulosa microcristalina 50 Lactosa 101.6 Para un comprimido terminado hasta 200 RESULTADOS FARMACOLÓGICOS Inhibición in vitro de la expresión de E-selectina 1 ) Cultivo celular El estudio se llevo a cabo sobre células endoteliales humanas HUVEC (Células Endoteliales de la Vena Umbilical Humana, Clonetics Co). Las células se cultivan en un medio EBM2 (Medio Endotelial, Clonetics Co)
suplementado con SFB (Suero Fetal Bovino) al 2% y EGM2 (Medio de
Crecimiento Endotelial, Clonetics Co). 2) Clonación del promotor de E-selectina} a) amplificación del promotor por PCR Se amplificó por PCR y sub-clonó un fragmento de 850 pb, correspondiente al promotor humano de E- selectina, que se extiende desde los nucleótidos en posición -800 hasta +50 (n° de acceso M64485; Tamaru et al., E-selectina gene expresión is induced synergistically with the coexistence of activated classic protein kinase C and signáis elicited by interleukin-?ß but not tumor necrosis factor-a, 1999, J. Biol.Chem, 274-3753-3763). En un volumen de reacción final de 100 pl, se depositaron 5 unidades de ADN-polimerasa de Pyrococcus furiosus (Pfu) nativo (Stratagene) en presencia de 1 pg de ADN genómico humano (Clontech), dNTP (desoxi-nucleótidos trifosfato) 200 µ? (Clontech), 200 ng de cebadores en un medio que contiene el tampón específico de la enzima. El juego de cebadores utilizados fue el siguiente: 5'GGATCCGGTACCGAGATGGCGTTTCTCCATGT (SEQ ID N°1) y 5' GAGCTTAAGCTTCTGTCTCAGGTCAGTATAGG (SEQ ID N°2) El programa de PCR, sobre el aparato Gene Amp PCR system 9700, presentó un inicio a 94°C durante 1 min seguido de una amplificación sobre 35 ciclo (94°C durante 1 min, 55°C durante 1 min, 72°C durante 3 min). El producto de PCR se precipitó seguidamente durante toda la noche a -20°C en presencia de acetato sódico 0.3 M a pH 5.2 y etanol. Después de centrifugar a 14000 rpm a 4°C, el residuo se resuspendió en etanol al 70% y se centrifugó nuevamente a 14000 rpm a 4°C. El residuo obtenido se secó y a continuación se recogió en agua.
b) digestión de la secuencia promotora A continuación la secuencia amplificada se dirigió en dos etapas por medio de las enzimas de restricción Kpn I e Hind III. La secuencia amplificada se dirigió durante 1 h 30 min a 37°C en presencia de 30 unidades de enzima y 100 pg/ml de BSA (Albúmina de Suero Bovino). Después de cada digestión, el producto obtenido se purificó sistemáticamente sobre columnas Micro Bio-Spin® Chromatography (Bio-Rad) con el fin de eliminar las sales de tampón. c) construcción del plásmido PGL3/E-selectina El plásmido pGL3 Basic (Promega), que contiene el gen luciferasa de la luciérnaga Firefly, se dirigió con las enzimas de restricción Kpn I e Hind III de acuerdo con el mismo protocolo que se ha usado para el inserto y seguidamente se purificó sobre gel de agarosa Low Meeting al 1%. La ligación del vector plamídico pGL3-Basic y del inserto correspondiente al promotor de la E- selectina se llevó a cabo por medio de DNA Ligasa T4 (LigaFast® Rapad DNA Ligation System de Promega). Por convención, en la ligación, se utiliza un excedente del inserto equivalente al triple del vector. Adicionalmente, al ser este inserto seis veces más corto que el vector (0.85 kb), la conservación del equilibrio estequiométrico requiere un peso seis veces mayor de vector. Por lo tanto, se hicieron reaccionar 10.6 ng de inserto y 25 ng de vector pGL3 Basic en presencia de 3 unidades de ligasa T4, a temperatura ambiente. 3) Transfección de células HUVEC El plásmido PGL3/E-selectina se transfectó en la células HUVEC antes del cuarto pasaje. La transfección tuvo lugar en placas que presentan las células con una confluencia de 50%, depositando en cada uno de los pocilios Lipofectin® (Invitrogen) y 3 pg del plásmido PGL3/E-selectina. La Lipofectin® (6
pg/ml) se activó previamente durante 30 min en un medio OPTI-MEM (GIBCO®) y seguidamente se puso en contacto durante 15 min con los plásmidos previamente diluidos en el medio. Las células se incubaron durante 4 horas a 37°C en una atmósfera con CO2 al 5% y O2 al 95%. Se retiró el medio de transfección y se sustituyó durante la noche por un medio de cultivo enriquecido para estabilizar las células. La inducción de la expresión de los genes informadores se efectuó durante 4 h en un medio exento de suero M199 (GIBCO®). Las células se sometieron a raspado y lisis en un tampón de lisis (kit Dual-Luciferase®, Promega) y seguidamente se mantuvieron a -20°C. La fase de inducción fue de 4 h para las células HUVEC, en presencia de 100 Ul/ml de Factor de Necrosis Tumoral-a (TNF-a). Durante esta fase inductiva, se agregaron concentraciones diferentes por una parte: - de perindoprilato (0 a 100 µ?), sal sódica de terutroban (0 a 100 µ?) o sal sódica de terutroban (30 µ?) + concentraciones diferentes de perindoprilato (10, 30 y 100 µ?) (tabla 1) y por otra parte: - de ramipnlato (0 a 100 µ?), sal sódica de terutroban (0 a 100 µ?) o sal sódica de terutroban (10 µ?) + concentraciones diferentes de ramiprilato (30 y 100 µ?) (tabla 2). 4) Determinación de la actividad del promotor La actividad del promotor de E-selectina se determinó por cuantificación de la actividad de luciferasa producida (kit Dual-Luciferasa®, Promega). En cada pocilio se agregó una solución de luciferina, el sustrato de la
luciferasa Firefly. Se obtiene de esta forma una emisión luz. La placa se incubó durante 10 min en la oscuridad puesto que la actividad de luciferasa es sensible a la luz y seguidamente se inició una lectura en el luminómetro para cuantificar los fotones emitidos (Wallac, Perkin Elmer), en donde el resultado obtenido es la media de cpm (cuentas por minuto) durante en período de 5 s. 5) Resultados terutroban-perindopril El terutroban (compuesto A) bajo su forma de sal sódica y el perindopril (compuesto B) bajo la forma de su metabolito activo perindoprilato, se analizaron por separado a concentraciones diferentes (0, 10, 30, 100 µ?) sobre las células HUVEC después de la inducción con TNF-a. De manera análoga, se estudiaron el compuesto A bajo su forma de sal sódica (30µ?)+ diferentes concentraciones del compuesto B bajo la forma de su metabolito activo (0, 10, 30, 100 µ?). La actividad del promotor de E-selectina se midió bajo las condiciones controladas y en presencia de productos en estado inducido. Las actividades, expresadas en cpm y porcentaje de observaciones controladas, se ilustran en la tabla 1.
Tablal : Medición de la actividad del promotor de E- selectina en presencia de la sal sódica del compuesto A, del metabolito activo del compuesto b o de la sal sódica del compuesto A (30 µ?) + metabolito activo del compuesto B en estado inducido por TNF-a (100 Ul/ml). *p<0.05; **p<0.01 con respecto al control ANOVA de un factor, ensayo de seguimiento de Dunnett (n= 4-5). La sal sódica de terutroban y perindopril bajo la forma de su metabolito activo el perindoprilato carece de cualquier efecto sobre la expresión
del gen de E-select¡na a las concentraciones analizadas. Cuando se incuba el perindoprilato simultáneamente con la sal sódica de terutroban (30 µ?), se observa una inhibición de la expresión del gen de E-selectina a partir de perindoprilato 10 µ? (60.8 % de actividad de expresión del gen de E-selectina frente a 100% sin producto; p<0.01 , ANOVA de un factor, ensayo de seguimiento de Dunnett). Los resultados demuestran muy claramente que la administración de estos dos compuestos asociados permite obtener un efecto sinérgico importante completamente inesperado. 6) Resultados terutroban-ramipril El terutroban (compuesto A) bajo su forma de sal sódica y el ramipril (compuesto C) bajo la forma de su metabolito activo ramiprilato, se analizaron por separado a concentraciones diferentes (0, 30, 100 µ?) sobre las células HUVEC después de la inducción con TNF-a. De manera análoga, se estudiaron el compuesto A bajo su forma de sal sódica (10 µ?) + diferentes concentraciones del compuesto C bajo la forma de su metabolito activo (0, 30, 100 µ?). La actividad del promotor de E-selectina se midió bajo condiciones controladas y en presencia de productos en estado inducido. Las actividades expresadas en cpm y porcentaje de observaciones controladas se ilustran en la tabla 2. Actividad en cpm %/ % de inhibición/ Control Media ± ESM control Compuesto A, sal Control 100 % Sódica 30 µ? 99.5 ± 9.1 100 µ? 88.8 ± 8.9 Compuesto C, Control 100 %
Metabolito activo 30 µ? 1 11.1 ± 17.2 100 µ? 114.6 ± 38.9 Compuesto A, sal Control 100 % Sódica (10 µ?) + 30 µ? 55.2 ± 4.8 (**) 44.7 ± 4.8 Compuesto C, 100 µ? 44.2 ± 9.1 (**) 55.8 ± 9.1 metabolito activo Tabla 2: Medición de la actividad del promotor de E-selectina en presencia de la sal sódica del compuesto A, del metabolito activo del compuesto C o de la sal sódica del compuesto C o de la sal sódica del compuesto A (10 µ?) + metabolito activo del compuesto C en estado inducido por TNF-a (100 Ul/ml).**p<0.01 con respecto al control. ANOVA de un factor, ensayo de seguimiento de Dunnet (n=3). El terutroban bajo la forma de su sal sódica y el ramipril bajo la forma de su metabolito activo el ramiprilato carecen de cualquier efecto sobre la expresión del gen de E-selectina a las concentraciones analizadas. Cuando se incuba el ramiprilato simultáneamente con la sal sódica de terutroban (10 µ?), se observa una inhibición de la expresión del gen de E-selectina a partir de ramiprilato 30 µ? (55.2 % de expresión del gen de E-selectina frente a 100 % sin producto; p<0.01 , ANOVA de un factor, ensayo de seguimiento de Dunnett). Los resultados demuestran muy claramente que la administración de estos compuestos asociados permite obtener un efecto sinérgico importante completamente inesperado. Los resultados de la asociación por una de terutroban (compuesto A) en forma de su sal sódica y perindopril (compuesto B) en forma de su metabolito activo y por otra parte de terutroban (compuesto A) en forma de su sal
sódica y ramipril (compuesto C) en forma de su metabolito activo demuestran que la asociación entre el compuesto (A) de la fórmula (I) y de un inhibidor de la enzima de conversión de la angiotensina presenta un efecto sinérgico importante y completamente inesperado. Inhibición de la trombosis y de la tensión arterial en la rata 1 ) Material y métodos La técnica de trombosis utilizada es la de Tanaka y colaboradores (Eur. J.Pharmacol., 2008; 401 ,413-18). a) Trombosis arterial Las ratas CD (350-375 g) fueron anestesiadas con pentobarbital 50 mg/kg i.p. y se dispusieron sobre una manta provista de termorregulación y termostato. Después de efectuar una laparotomía se liberó la orta. La trombosis se indujo depositando una pastilla de papel filtro (8 mm) saturada con FeCb al 50% durante 10 min. 20 min después de retirar la pastilla se ligó la arteria y se practicó una incisión y se pesó el coágulo existente. Determinados animales se trataron con terutroban (compuesto A) en su forma de sal sódica a la dosis de 0.1 mg/kg, otros con perindopril (compuesto B) en forma de su sal de terc-butilamina a la dosis de 1 mg/kg y otros se trataron con terutroban en forma de su sal sódica (compuesto A) a 0.1 mg/kg y perindopril (compuesto B) en forma de sal de terc-butilamina a 1 mg/kg. b) Tensión arterial Después de la anestesia con pentobarbital (50 mg/kg, i.p.), el animal se depositó sobre una mana equipada con termorregulación y termostato. Se liberó la carótida y se introdujo un catéter para monitorizar la tensión arterial con ayuda de un captador Gould conectado a un programa informático
Acqknowledge. La tensión arterial se registró 1 hora después del tratamiento y durante 30 min. Determinados animales se trataron con terutroban (compuesto A) en su forma de sal sódica de 0.1 mg/kg, otros con perindopril (compuesto B) en forma de su sal de terc-butilamina a la dosis de 0.3 mg/kg, y otros se trataron con terutroban en forma de su sal sódica (compuesto A) a 0.1 mg/kg y perindopril (compuesto B) en forma de su sal de terc-butilamina a 0.3 mg/kg. 2) Resultados a) Trombosis arterial El peso de los coágulos en las ratas controladas fue de 17.1 ± 1.3 mg; el tratamiento con terutroban (compuesto A), sal sódica a 0.1 mg/kg no modificó el peso: 16.8 ± 1.3 mg. El peso de los coágulos en las ratas controladas fue de 15.6 ± 0.7 mg; el tratamiento con perindopril (compuesto B), sal de terc-butilamida a 1 mg/kg no modificó este proceso: 15.2 ± 1.1 mg. El peso de los coágulos en las ratas controladas fue de 16.3 ± 0.8 mg; el tratamiento con la asociación de terutroban (compuesto A), sal sódica a 0.1 mg/kg con perindopril (compuesto B), sal de terc-butilamina a 1 mg/kg disminuyó de forma significativa el peso del coágulo hasta 10.1 ± 0.6 mg. Estos resultados ponen de manifiesto el sinergismo de acción inesperado de las dos sustancias en la trombosis arterial. b) Tensiones arteriales La tensión arterial de las ratas controladas fue de 131 ± 7 mmHg. Ni el terutroban (compuesto A), sal sódica a 0.1 mg/kg, ni el perindopril (compuesto B), sal de terc-butilamina a 0.3 mg/kg (que es una dosis inactiva en la rata) modificaron esta tensión: 126± 7 mmHg y 120 ± mmHg respectivamente. La asociación de terutroban (compuesto A), sal sódica y de perindopril (compuesto
B), sal de terc-butilamina , redujo fuerte y significativamente la tensión arterial hasta 95 ± 7 mmHg. Estos resultados demuestran e sinergismo de acción inesperado de las dos sustancias sobre la regulación de la tensión arterial. Este ensayo demuestra las acciones inhibitorias sobre la trombosis y la tensión arterial de la asociación de terutroban (compuesto A) y perindopril (compuesto B) e ilustra por lo tanto el potencial para el tratamiento, con esta asociación, de las patologías arteriales tales como enfermedades trombóticas (infarto de miocardio, angina de pecho, accidentes vasculares cerebrales, arteritis de los miembros inferiores,...) y la hipertensión. Inhibición de la expresión de la Molécula de Adhesión endotelial 1 (VCAM-1) aórtica y de la fibronectina renal in vivo En este estudio se utilizaron cuatro grupos de 9 ratones deficitarios en apolipoproteína E (ApoE-/-, que desarrollan espontáneamente placas de ateroma en la orta). A la edad de 8 semanas, los ratones se convirtieron en diabéticos por medio de 5 inyecciones intraperitoneales de 70 mg/kg de estreptozotocina durante 5 días. A la novena semana, los animales fueron distribuidos en cuatro grupo: un grupo de control no tratado, un grupo tratado con terutroban (compuesto A), sal sódica (1 mg/kg/día con la alimentación), un grupo tratado con perindopril (compuesto B), sal de terc-butilamina (0.1 mg/kg/día con el agua de bebida), un grupo tratado con la asociación de terutroban (compuesto A), sal sódica (1 mg/kg/día con la alimentación) y perindopril (compuesto B), sal de terc-butilamina (0.1 mg/kg/día con el agua de bebida). Para la expresión de la fibronectina renal, los ratones fueron tratados durante 6 semanas y seguidamente sacrificados tras anestesia con
isoflurano. Para la expresión de las VCAM-1 aórticas, los ratones fueron tratados durante 13 semanas y a continuación se les sacrificó. Se extrajeron las aortas y los ríñones derechos que se disecaron y congelaron en nitrógeno líquido. Los tejidos se sometieron a un estallido en frío y se extrajeron los
ARN totales con ayuda del kit RNeas® micro (Qiagen). A continuación, se llevó a cabo la trascripción inversa a partir de 1 pg del ARN total con ayuda del kit Superscript® III first strand cDNA synthesis (Invitrogen). Las expresiones de VCAM-1 aórtica y de la fíbronectina renal se cuantificaron por PCR en tiempo real y se homologaron con relación a 3 genes de referencia: ß-actina, hípoxantina-guanina fosforribosil transferasa (HPRT) y glíceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Se utilizó el kit IQ® SYBR® Green supermix (Biorad), con 2µ? de ADNc y 150 nM de cada cebador. Las muestras se desnaturalizaron durante 5 min a 95'C y se amplificaron durante 40 ciclos de acuerdo con el protocolo siguiente: desnaturalización durante 20 segundos a 95°C e hibridación y elongación durante 1 minuto a 52°C para la fíbronectina, 54°C para VCAM-1 , ß-actina y HPRT, 56°C para GAPDH. El umbral del ciclo (definido como el punto para el que la fluorescencia se considera significativamente más elevada que el ruido de fondo) para la VCAM-1 aórtica y la fíbronectina renal de los animales no tratados se homologó con relación a los genes de referencia (y considerados como 100 %) y a continuación se compararon con los de los animales tratados. Los cebadores específicos usados fueron los siguientes: VCAM-1 : 5'-AGA GCA GAC TTT CTA TTT CAC-3' (sentido) (SEQ ID N°3) y 5'-CCA TCT TCA CAG GCA TTT C-3' (antisentido) (SEQ ID N°4);
Fibronectina: 5'-TGA CAA ATA CAC TGG GAA C-3' (sentido) (SEQ ID N°5) y 5'-GCC AAT GTA GGA CTG-3' (antisentido) (SEQ ID N°6); ß-actina: 5'-AAG ACC TCT ATG CCA ACA CAG-3' (sentido) (SEQ ID N°7) y 5'-AGC CAC CGA TCC ACA CAG-3' (antisentido) (SEQ ID N°8); HPRT: 5'-AGC TAC TGT AAT GAT CAG TCA ACG-3' (sentido) (SEQ ID N°9) y 5 -AGA GGT CCT TTT CAC CAG CA-3' (antisentido) (SEQ ID N°10)¡ GAPDH: 5'-GCC TTC CGT GTT CCT ACC C-3' (sentido) (SEQ ID N°11) y 5'-TGC CTG CTT CAC CAC CTT-3' (antisentido) (SQ ID N°12). La actividad de los componentes terutroban (compuesto A), sal sódica, perindoprii (compuesto B), sal de terc-butilamina y de su asociación se evalúa comparando los niveles de expresión de VCAM-1 aórtica y fibronectina renal con los de los animales no tratados (considerados como 100%). Fibronectina renal: El tratamiento de ratones con terutroban (compuesto A), sal sódica o perindoprii (compuesto B), sal de terc-butilamina por separado no tuvo un efecto significativo sobre la expresión del gen de la fibronectina renal (69 ± 16% para terutroban (compuesto A), sal sódica y 86 ± 9.9 %, para perindoprii (compuesto B), sal de terc-butilamina frente a 100 % sin tratamientos, NS, ANOVA de un factor, ensayo de seguimiento de Dunnett). Cuando los ratones fueron tratados con la asociación de terutroban (compuesto A), sal sódica y perinfropril (compuesto B), sal de terc-butilamina, se observó una inhibición de la
expresión del gen de la fibronectina renal (43 ± 9.1 % frente a 100 % sin tratamiento, P<0.01 , ANOVA de un factor, ensayo de seguimiento de Dunnett). VCAM-1 -aórtica: Los ratones tratados con terutroban (compuesto A), sal sódica o perindopril (compuesto B), sal de terc-butilamina por separado no exhibieron efectos significativos sobre la expresión del gen de VCAM-1 aórtica (la expresión residual es de 88 ± 22% para terutroban (compuesto A), sal sódica y 76 ± 21% para perindopril (compuesto B), sal de terc-butilamina frente a 100% sin tratamiento, NS, ANOVA de un factor, ensayo de seguimiento de Dunnett). Cuando los ratones se trataron con la asociación de terutroban (compuesto A), sal sódica y perindopril (compuesto B), sal de terc-butilamina, se observó una inhibición del gen de VCAM-1 (la expresión residual es de 27 ± 6.2 % frente a 100 % sin tratamiento, P<0.01 , ANOVA de un factor, ensayo de seguimiento de Dunnett). El tratamiento de animales ateromatosos y diabéticos con la asociación de terutroban (compuesto A), sal sódica/perindopril (compuesto B), sal de terc-butilamina permite por tanto reducir clara y significativamente la expresión de VCAM-1 en la orta y de fibronectina en el riñon en comparación con los animales no tratados o tratados con terutroban (compuesto A), sal sódica, o perindopril (compuesto B), sal de terc-butilamina por separado. Los resultados demuestran de manera muy clara que la administración de estos dos compuestos asociados permite obtener un efecto sinérgico importante y completamente inesperado. Este ensayo demuestra las actividades inhibitorias sobre la expresión de las moléculas de adhesión y sobre la fibronectina renal de la
asociación de terutroban (compuesto A)/perindopril (compuesto B) y por lo tanto el potencial para el tratamiento de patologías arteriales tales como las complicaciones vasculares asociadas a la diabetes, la hipertensión, la aterosclerosis, la inflamación, el síndrome metabólico asociado a la obesidad, las complicaciones vasculares asociadas con la obesidad, la angina de pecho, arteritis de los miembros inferiores, accidentes vasculares cerebrales. A la vista del papel que se desempeñan las moléculas de adhesión en la enfermedad venosa, la asociación puede tratar también esta enfermedad.