MX2007015602A - Tratamiento de trastornos del sistema nervioso central asociados con mutaciones en genes que codifican las enzimas lisosomicas. - Google Patents

Tratamiento de trastornos del sistema nervioso central asociados con mutaciones en genes que codifican las enzimas lisosomicas.

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Abstract

Se describe un metodo para tratar un individuo que tiene un trastorno neurologico con una mutacion o mutaciones asociadas en un gen que codifica una enzima lisosomica. Especificamente, se administra al individuo una chaperona farmacologica especifica para la enzima lisosomica que incrementa el trafico de la proteina desde el ER al lisosoma en las celulas neurales, con o sin concomitantemente incrementar la actividad enzimatica en las celulas neurales. La restauracion del trafico mitiga la tension celular y otras toxicidades asociadas con acumulacion de proteinas mutantes. La restauracion de la actividad enzimatica mitiga la acumulacion de sustrato y patologias asociadas con acumulacion de lipido. En una modalidad especifica, el trastorno neurologico es la enfermedad de Parkinson o parkinsonismo que esta asociado con mutaciones en la glucocerebrosidasa.

Description

TRATAMIENTO D? TRASTORNOS DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL ASOCIADOS CON MUTACIONES EN GENES QUE CODIFICAN LAS ENZIMAS LISOSOMICAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para tratar a un individuo que tiene un factor, condición o trastorno de riesgo neurológico asociado con una mutación o mutaciones en una enzima lisosómica tal como ácido ß-glucosidasa. Específicamente, se administra al individuo una chaperona farmacológica específica para la enzima lisosómica que incrementa el tráfico de la proteína del ER a la lisosoma en las células neurales, y/o concomitante incrementa la actividad de la enzima en células neurales. ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN Los trastornos del almacenamiento lisosómico son un grupo de enfermedades recesivas autonómicas causadas por la acumulación de glicoesfingolípidos, glicógeno, o mucopolisacáridos celulares, debido a las enzimas hidrolíticas defectuosas. Los ejemplos de LSD incluyen pero no se limitan a la enfermedad de Gaucher (Beutler y otros, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 8a. ed. 2001 Scriver y otros, ed. pp . 3635-3668, McGraw-Hill, New York) , GMi-gangliosidosis, (id. en pp 3775-3810) , fucosidosis (The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease 1995. Scriver, C. R. , Beaudet, A. L., Sly, . S. and Valle, D. , ed Ref. 188511 pp. 2529-2561, McGraw-Hill, New York) , mucopolisacaridosis, (id. en pp 3421-3452) , enfermedad de Pompe (id. en pp. 3389-3420) , enfermedad de Hurler-Scheie ( eismann y otros, Science. 1970; 169, 72-74), enfermedades A y B de Nieman?-Pick, (The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease 8a. ed. 2001. Scriver y otros ed. , pp 3589-3610, McGraw-Hill, New York) , enfermedad de Fabry (id. en pp. 3733-3774) . Otras incluyen la Leucodistrofia metacromática, la enfermedad de Kuf, (Lipofucsinosis de Lipoide neuronal en adulto) y Adrenoleucodistrofia. Cada LSD está asociado con una enzima hidrolítica defectuosa específica causada por unas o más mutaciones que causan que la enzima se haga conformacionalmente inestable en el ER después de la síntesis, y de esta forma, se activan para la degradación en lugar del tráfico a través de Golgi a la ubicación nativa en el lisosoma. Varios LSD tienen una implicación neurológica significativa. Por ejemplo, la enfermedad de Gaucher es el LSD más común que está asociado con la acumulación de glicoesfingolípidos (GSL, por sus siglas en inglés) en las células, particularmente monocitos y macrófagos, dé individuos afligidos. Esta configuración aberrante de GSL da como resultado una deficiencia genética (mutación) en él ácido ß-glucosidasa de la enzima lisosómica (Gba; glucocerebrosidasa) , la hidrolasa lisosómica que desglosa la glucosilceramida GSL (GluCer) . La enfermedad ha sido clasificada en tres tipos clínicos, dependiendo de su implicación neurológica y de la actividad de la enfermedad (Cox y otros, Q J Med. 2001; 94: 399-402). La enfermedad de Gaucher de tipo 2 es la forma más severa, más rara, y está asociada con el inicio temprano de la enfermedad neurológica aguda. La característica específica de la enfermedad de Gaucher neuropática es una anormalidad de la mirada horizontal. Los pacientes afligidos desarrollan una encefalopatía progresiva, y síntomas extrapiramidales tales como rigidez y movimiento de tipo Parkinson (parkinsonismo) . La mayor parte de los pacientes con Gaucher de tipo 2 mueren en la infancia temprana de apnea o aspiración debido ai deterioro neurológico. La enfermedad de Gaucher de tipo 3 también tiene una implicación neurológica, aunque a un grado menor que la de tipo 2. Los pacientes con el tipo 3 tienen síntomas en el sistema nervioso central que incluyen una pobre coordinación de los movimientos (ataxia), convulsiones, la parálisis de los músculos del ojo, epilepsia, y demencia. Una subclasificación de tipo 3, el tipo 3c, está asociado con hepatosplenomegalia, opacidades córneas, ataxia progresiva y demencia, y la calcificación de la válvula cardiaca y la raíz aórtica. Otros LSD con una implicación neurológica gangliosidosis GMI, que está asociada con la ß-galactosidasa mutante y resulta en lipidosis neuronal; Gangliosidosis GM2 (enfermedad de Tay-Sachs) , que está asociada con la hexosaminidasa A mutante y da como resultado la lipidosis neuronal; la enfermedad de Niemann-Pick, que está asociada con la esfingomielinasa mutante y también da como resultado la lipidosis neuronal; (enfermedad de Krabbe) leucodistrofia de la galactocerebrosidasa; y lipofuscinosis ceroide neuronal, que está asociada con proteasas lisosómicas mutantes y da como resultado la lipidosis neuronal. La leucodistrofia metacromática es una deficiencia de la enzima de arilsulfatasa A y los síntomas de los pacientes incluyen trastornos de movimientos progresivos, convulsiones, trastornos cognitivos y también esquizofrenia y problemas psiquiátricos además de alteraciones gastrointestinales. La - úr. enfermedad de Kuf (Lipofucsinosis Lipoide Neuronal en adultos) puede manifestarse como síntomas psiquiátricos y convulsiones. La leucodistrofia adrenal es un trastorno que es caracterizado por la desmielinación de la materia blanca progresiva del sistema nervioso central y la insuficiencia adrenocortical . Chaperonas Farmacológicas Especificas Recientemente, se ha desarrollado una estrategia de chaperona farmacológica específica para rescatar las proteínas mutadas, inestables, de una degradación presumiblemente en el retículo endoplásmico (ER, por sus siglas en inglés) o en otra degradación de proteína celular/sistemas de deposición. En las modalidades particulares, esta estrategia de intercambio de paradigma utiliza inhibidores reversibles de molécula pequeña que específicamente se unen a una enzima lisosómica defectuosa asociada con un trastorno lisosómico particular, estabilizan la enzima mutante en el ER, y "acompañan" a la enzima mutante para que así salga del ER. Se ha encontrado inesperadamente que los inhibidores podrían unirse con especificidad a la enzima durante la síntesis y el pliegue del ER, pero podrían disociarse de la enzima en su ubicación nativa, por lo tanto restaurando su actividad. En la ausencia de la chaperona, la proteína de la enzima mutada se pliega inapropiadamente en el ER (Ishii y otros, Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996; 220: 812-815) , y se retarda en su mutación hacia el producto final, y subsecuentemente se degrada en el ER. Estas chaperonas específicas son chaperonas farmacológicas específicas designadas (o chaperonas específicas del sitio activo en donde la chaperona es un inhibidor competitivo de una enzima) . El término "chaperona específica del sitio activo" evolucionó de los estudios iniciales utilizando enzimas lisosómica de tipo silvestre y mutante. La porción catalítica de las enzimas, es decir, la parte en donde la enzima se une e interactúa con su sustrato, es generalmente conocida como el "sitio activo de entrada" . La estrategia nada lógica de utilizar un inhibidor competitivo reversible de una enzima (es decir, un inhibidor de enzima que compite con el sustrato para la unión al centro catalítico) para incluir enzimas lisosómicas mal plegadas para asumir una conformación molecular estable, primero se hipotetizó en virtud de la habilidad de algunos inhibidores competitivos de unir los centros catalíticos durante la biosíntesis y estabilizar las enzimas. De esta forma, cualquier estabilización que podría lograrse in vivo en el ER durante el pliegue de una enzima naciente, especialmente una enzima mutante que tiene un defecto de pliegue, podría ser benéfico ya que podría evitar la unión de las "chaperonas" ER endógenas que unen polipéptidos mal plegados y los activan para la degradación. Además, el inhibidor competitivo fue "reversible" según se desasoció de la enzima una vez que la enzima alcanzó el lisosoma, en donde el inhibidor quedó fuera de competencia a través del sustrato natural. La estrategia de chaperona específica ha sido descrita y ejemplificada para aproximadamente 15 enzimas "t., involucradas en los LSD, en las Patente de E. U. A. No.. ¡1, 6,274,597, 6,583,158, 6,589,964, y 6,599,919, de Fan y otros, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Por ejemplo, un derivado de molécula pequeña de galactosa, 1- desoxigalactonojirimicina (DGJ) , un inhibidor competitivo potente de la enzima de a-galactosidasa A de Fabry (a-Gal A) , efectivamente incrementó la estabilidad in vitro del mutante a-Gal A humano (R301Q) a un pH neutral y mejoró la actividad de la enzima mutante en los linfoblastos establecidos de pacientes con Fabry con las mutaciones R301Q o Q279E. Además, la administración oral de DGJ a ratones transgénicos sobre-expresó una a-Gal A mutante (R301Q) que substancialmente elevó la actividad enzimática en los órganos principales (Fan y otros., Natures Med. 1999; 5: 112-115). Se ha descrito un rescate similar de Gba de células de paciente con Gaucher utilizando otro iminoazúcar, isofagomina (IFG) , y sus derivados, descrito en U.S. 6,916,829 de Fan y otros, y utilizando otros compuestos específicos para Gba (descrito en la solicitud de Patente de E. U. A. Pendiente No. Serie 10/988,428, y 10/988,427, ambas presentadas el 12 de noviembre del 2004) . Mutaciones de la Enzima LSD y T stor os Neurológicos Gb& y Parklxxson . Se ha descubierto recientemente que existe un enlace entre las mutaciones en enzimas lisosómicas y trastornos neurológicos diferentes de LSD. Como ejemplo, existe un enlace bien establecido entre las mutaciones en el gene Gba y la enfermedad de Parkinson. En un estudio, se encontró que un grupo de 17 pacientes con un inicio temprano, raro, con parkinsonismo resistente a tratamiento, tienen por lo menos un alelo con una mutación sin sentido Gba, incluyendo individuos homocigotos y heterocigotos para N370S, una mutación típicamente asociada con la enfermedad no neuropática, de tipo 1, (Tayebi y otros, Mol. Genet. Metab. 2003; 79; 104-109) . En otro estudio, se evaluó una población de 99 judíos Ashkenazi con enfermedad de Parkinson idiopática para seis mutaciones Gba (N370S, L444P, 84GG, V394L, y R496H) . Treinta y un pacientes con Parkinson tuvieron uno o dos alelos Gba mutantes: 23 fueron heterocigotos para N370S; 3 fueron homocigotos para N370S; 4 fueron heterocigotos para 84GG; y 1 fue heterocigoto para R496H (Aharon-Peretz y otros, New Eng. J. Med. 2004; 351: 1972-77) . La frecuencia de un alelo N370S mutante fue 5 veces de aquellos entre 1573 sujetos normales, y aquellos de 84GG fueron 21 veces de los sujetos normales. Entre pacientes con enfermedad del Parkinson, los pacientes que llevaban una mutación Gba también fueron más jóvenes que aquellos que no llevaban. Este estudio sugiere que la heterocigosidad para una mutación Gba puede predisponer a los judíos Ashkenazi a la enfermedad de Parkinson. Las enfermedades de Parkinson y de Gaucher también > :~. comparten algunas características patológicas, incluyendo la pérdida neuronal, astrogliosis, y la presencia de inclusiones de a-sinucleina de tipo cuerpo Lewy en las neuronas del hipocampo (región CA2-4) . Una publicación reciente describió el grado de patología neurológica en las tres formas de la enfermedad de Gaucher (Wong y otros, Mol Genet. Metabol . 2004; 38: 192-207). Las anormalidades en las capas corticales cerebrales 3 y 5, el hipocampo CA2-4, y la capa 4b se encontraron en pacientes con Gaucher teniendo los tres tipos . La pérdida neuronal fue evidente solamente en pacientes con los tipos 2 y 3, mientras los pacientes de tipo 1 presentaron astrogliosis (Wong y otros., supra). Dos pacientes con Gaucher de tipo 1 y parkinsonismo/demencia exhibieron inclusiones positivas a a-sinucleina en las neuronas CA2-4 del hipocampo, un paciente tuvo cuerpo Lewy de tipo troncocerebral y de tipo cortical, y uno tuvo una pérdida neuronal marcada de neuronas de la sustancia negra (Wong y otros, supra) . En resumen, los 4 pacientes con parkinsonismo y demencia tuvieron gliosis CA2-4 del hipocampo, y depleción neural, gliosis, y cuerpos Lewy de tipo troncocerebral en la sustancia negra. Varios modelos de ratón también demostraron este enlace entre Gba y Parkinson. La actividad de hidrolasa in vitro óptima de Gba requiere saposina C, una proteína activadora que se deriva de un precursor, prosaposina. Los ratones de transgénicos expresaron bajos niveles (4-45% de tipo silvestre) de prosaposina y saposinas (PS-NA) , cruzadas inversamente en los ratones con mutaciones de punto "i":» específicas (V394L/V394L o D409H/D409H) de Gba, tuvieron varios fenotipos del SNC similar a fenotipos PD incluyendo: ataxia del paso, temblores, estremecimiento al punto de caerse, y de una vejiga neurogénica (Sun y otros, J Lipid Res. 2005. 46(10): 2102-13). El trabajo de la chaperona farmacológica específica descrito anteriormente estableció la habilidad de restaurar una función suficiente para una enzima mutante (mutación conformacional) para reducir o aún eliminar la configuración de las cantidades tóxicas del sustrato lípido en los LSD. Sin embargo, no fue claro que este método pudiera afectar a los individuos heterocigotos, o individuos con mutaciones homocigotas que no fueron diagnosticados con un LSD de x '* acuerdo con un criterio actual, pero que están en riesgo de desarrollar una condición neurológica o trastorno debido a los efectos de la mutación, o individuos que fueron diagnosticados como teniendo trastornos de almacenamiento lisosómico pero que tienen mutaciones además de otras mutaciones conformacionales que convierten a la proteína en no funcional. Todas estas poblaciones están en riesgo de desarrollar un trastorno neurológico debido ya sea a su ganancia de función tóxica, pérdida de función patológica, o una combinación. De esta forma, aún permanece una necesidad en la técnica de ser capaz de identificar los factores causantes y conducir las consecuencias de dichas mutaciones en estas poblaciones de pacientes. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para el tratamiento de un trastorno neurológico en un individuo, en i donde el trastorno neurológico está asociado con una mutación en el gen que codifica una enzima lisosómica, a través de la administración de una cantidad efectiva de una chaperona farmacológica específica para tratar el trastorno neurológico. En una modalidad, el individuo es homocigoto para la mutación. En otra modalidad, el individuo es hemicigoto, heterocigoto, o un compuesto heterocigoto para la mutación. En una modalidad, la mutación da como resultado que la enzima sea un mutante conformacional. En una modalidad específica, en donde la chaperona incrementa el tráfico de la enzima mutante desde el retículo endoplásmico y puede o no puede concomitante restablecer la actividad enzimática. En otra modalidad, la mutación da como resultado ,** cantidades incrementadas o la agregación, de otra sustancia celular, tal como un lípido u otra proteína o un fragmento de proteína, tal como a-sinucleina. En una modalidad específica de la presente invención, la enzima lisosómica es glucocerebrosidasa y el trastorno neurológico es la enfermedad de Parkinson o parkinsonismo . En otra modalidad específica, la enfermedad ,dé Parkinson es una enfermedad de Parkinson con un inicio temprano. En algunas modalidades de la invención, la chaperona farmacológica específica es un inhibidor de la enzima lisosómica, y el inhibidor es un inhibidor reversible o competitivo o ambos. En una modalidad específica, la chaperona farmacológica para la glucocerebrosidasa es isofagomina o (5R, 6R, 7S3 8S) -5-hidroximetil-2-octil-5, 6, 7, 8-tetrahidroimidazo [1, 2-a] pirimidin-6, 7, 8-triol. La presente invención también proporciona un método para diagnosticar un trastorno neurológico asociado con uria enzima lisosómica mutante, a través de la clasificación de un individuo que exhibe síntomas neurológicos para una mutación en una o más enzimas lisosómica. En una modalidad, la mutación da como resultado una enzima que es un mutante conformacional. En otra modalidad, la clasificación se hace a través de la determinación de la actividad enzimática disminuida de una rauestra biológica del individuo comparada con una muestra biológica de un individuo sano. En una modalidad específica, el trastorno neurológico diagnosticado es parkinsonismo o enfermedad de Parkinson. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1A-1B. demuestran los niveles de la actividad de Gba en el cerebro de ratones transgénicos L444P tratados con la chaperona farmacológica específica de isofagomina (ÍA) . También se describe el nivel de actividad Gba en el cerebro después de un deslave y periodo de retratamiento (IB) . Figuras 2A-2N. describen la tinción fluorescente de lisosomas utilizando rojo LysoTracker® en células de fibroblastos Gaucher (2A) y fibroblastos normales (2B) . La tinción para la proteína LAMP-1 lisosómica también se llevó a cabo sobre fibroblastos normales (2C) y fibroblastos Gaucher (2D) . Las Figura 2E-2F muestran una superposición de la tinción Gba y LAMP-1 doble en fibroblastos Gaucher. También se describe una superposición doble (LAMP-1 y Gba) de células Gaucher tratadas con chaperona farmacológica específica de isofagomina (2G-2H) y la chaperona farmacológica específica de C-bencil-isofagomina (2I-2J) . Finalmente, las Figuras 2K-2N muestran la tinción de las células Gaucher de Gba solamente. Las células Gaucher de control fueron teñidas cori un anticuerpo secundario solamente (2K) , o no fueron tratadas (2L) , o se trataron con isofagomina (2M) o C-bencil-isofagomina (2N) .
Figuras 3A-3I . describen la tinción fluorescente de células Gaucher (3D-3I) y fibroblastos normales (3A-3C) para la presencia de proteínas poliubiquitinadas (PUP, por sus siglas en inglés) (3A, 3D, 3G) y Gba (3B, 3E, 3H) , y una superposición para ambas (3C, 3F, 31) . Figura 4. La Figura 4 describe el gen que codifica el ácido ß-glucosidasa, también referido como glucocerebrosidasa o Gba (número del acceso de GenBank J03059; SEC ID NO: 1) . Figura 5. La Figura 5 describe la proteína Gba humana de tipo silvestre. La proteína Gba consiste de 536 aminoácidos y tiene el número del acceso de GenBank. J03059 (SEC ID NO: 2) . Figura 6. La Figura 6 describe el seudogen homólogo para Gba localizado aproximadamente a 16 kb en corriente descendente del gen Gba (número del acceso de GenBank M16328,-SEC ID NO: 3) . Figura 7. La Figura 7 describe el polipéptido codificado por el seudogen homólogo para Gba (SEC ID NO: 4) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el descubrimiento de que los trastornos neurológicos que se presentan en individuos no diagnosticados con trastornos de almacenamiento lisosómico pueden estar enlazados a mutaciones en enzimas lisosómicas. Por consiguiente, la presente invención, una chaperona farmacológica específica, tal como un ASSC, puede mitigar ambas patología de ganancia de función o pérdida de función asociadas con mutaciones de enzimas lisosómicas que están asociadas con factores de riesgo, condiciones, o trastornos neurológicos . Las chaperonas pueden inducir eí tráfico apropiado de las proteínas mutantes a un nive.l suficiente para inhibir, aún en el punto de prevención, la acumulación tóxica asociada con la construcción de proteínas mutante, mal plegadas (es decir, ganancia de función) , lo cual a su vez puede efectuar la función neurológica. En algunos casos en donde la mutación solamente afecta el pliegue del tráfico de la proteína a su ubicación celular nativa y no es, por ejemplo, una mutante que afecta la actividad catalítica u otra de la proteína, o es una mutante no de sentido, las chaperonas pueden restaurar la actividad i- i de la proteína mutante, por lo tanto conduciendo las patologías asociadas con la pérdida de función de la proteína, tal como la acumulación de sustrato o aún la agregación de otras proteínas tóxicas o fragmentos que resultan de la acumulación del sustrato. Definiciones Los términos utilizados en esta especificación generalmente tienen los significados ordinarios en la técnica, dentro del contexto de esta invención y en el contexto específico en donde cada término se utiliza. Ciertos términos se describen a continuación, o en cualquier otro lugar en la especificación para proporcionar una guía adicional al practicante en la descripción de las composiciones y métodos de la invención y como hacerlos *y utilizarlos , El término "Enfermedad de Gaucher" incluye el tipo 1, tipo 2 y tipo 3, y los intermedios y subgrupos de los mismos con base en manifestaciones fenotípicas. Un "trastorno neurológico" se refiere a cualquier enfermedad del sistema nervioso central (SNC) o sistema nervioso periférico (SNP) que está asociado con defectos celulares neuronales o gliales incluyendo pero no limitándose a pérdida neuronal, degeneración neuronal, desmielinización neuronal, gliosis (es decir, astrogliosis) , o acumulación neuronal o extraneuronal de proteínas o toxinas aberrantes (por ejemplo, ß-amiloide, o a-sinucleina) . El trastorno neurológico puede ser crónico o agudo. Los trastornos neurológicos ilustrativos incluyen pero no se limitan a enfermedad de Gaucher y otros LSD incluyendo la enfermedad de Fabry, enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Pompe, y la mucopolisacaridosis; enfermedad de Parkinson; enfermedad de Alzheimer; esclerosis lateral amiotrófica (ALS, por sus siglas en inglés) ; Esclerosis Múltiple (MS, por sus siglas en inglés) ; Enfermedad de Huntington; Ataxia de Fredrich; daño cognitivo medio; y trastornos del movimiento (incluyendo < ataxia, parálisis cerebral, coreoatetosis, distonia, síndrome de Tourette, el kernicterus) ; trastornos de temblores, leucodistrofias (incluyendo adreleucodistrofia, leucodistrofia metacromática, enfermedad de Canavan, enfermedad de Alexander, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher) ; lipofucsinosis ceroide neuronal; telangectasia ataxia; y síndrome Rett. Este término también incluye eventos cerebrovasculares tales como choques y ataques isquémicos. Como se utiliza aquí, el término "trastorno neurológico" también incluye personas en riesgo de desarrollar trastorno, enfermedad o condición neurológica así r*. como personas ya diagnosticadas con un trastorno, enfermedad o una condición neurológica. Un "trastorno neurológico asociado con una mutación en enzima lisosómica" se refiere a cualquier trastorno neurológico en donde la mutación o mutaciones en el gen que codifica la enzima también están presente cuando se evaluó en individuos que tiene el trastorno neurológico, comparado con individuos que no tienen o no están en riesgo de desarrollar el trastorno neurológico (es decir, individuo sano) . En modalidades específicas, el trastorno neurológico asociado con las mutaciones Gba (Gaucher) es la enfermedad de Parkinson o parkinsonismo. El término "gen Gba humano" se refiere al gen que codifica ácido ß-glucosidasa, también referido como glucocerebrosidasa o Gba. El gen Gba está en el cromosoma Iq21 e involucra 11 exones (número del acceso de GenBank J03059; SEC ID NO: 1) . También existe un seudogen homólogo para Gba localizado en aproximadamente 16 kb en corriente descendentes del gen Gba (número del acceso de GenBank M16328; SEC ID NO: 3) . La proteína de "Gba humana" se refiere a la proteína Gba humana de tipo silvestre. La proteína Gba consiste de 536 aminoácidos y está con el número del acceso de GenBank J03059 (SEC ID NO: 2) . El polipéptido codificado por el seudogen antes mencionado se describe en SEC ID NO: 4. Como se utiliza aquí, el término "chaperona farmacológica," o algunas veces "chaperona farmacológica específica" ("SPC", por sus siglas en inglés), se refiere a una molécula que específicamente se une a una proteína tal como una enzima lisosómica (por ejemplo, Gba) y tiene uno o más de los siguientes efectos: (i) mejorar la formación de una conformación molecular estable de la proteína; (ii) incluye el tráfico de la proteína desde el ER a otra ubicación celular, preferiblemente una ubicación celular nativa, es decir, previene la degradación asociada con ER de la proteína; (iii) previene la agregación de proteínas mal plegadas; (iv) restauración y mejoramiento de por lo menos la función de tipo silvestre, estabilidad, y/o actividad de la proteína; y/o mejora el fenotipo o función de la célula que cosecha la proteína. De esta, una chaperona farmacológica para una proteína es una molécula que se une a la proteína dando por resultado el pliegue apropiado, el tráfico, la no-agregación, y la actividad de la proteína. Como se utiliza aquí, este término no se refiere a chaperonas endógenas, tales como BiP, o agentes no específicos que han demostrado una actividad chaperona no específica contra varias proteínas, tal como glicerol, DMSO o agua deuterada, algunas veces denominadas "chaperonas químicas" (ver Sato y otros, Biochem Biophys Acta. 1988; 126(2): 756-62; Welch y otros, Cell Stress and Chaperones 1996; 1 (2) : 109-115; Welch y otros, Journal of Bioenergetics and Biomembranes 1997; 29(5) :491-502; Patente de E.U.A. No. 5,900,360; Patente de E.U.A. No'. 6,270,954; and Patente de E.U.A. No. 6,541,195). Como se utiliza aquí, el término "específicamente une" se refiere a la interacción de una chaperona farmacológica con una proteína específica, específicamente, una interacción con residuos de aminoácidos de una proteína que participan directamente en el contacto de la chaperona farmacológica. Un compuesto que específicamente se une a una proteína objetivo, por ejemplo, Gba, significa que se une y ejerce un efecto la chaperona farmacológica sobre Gba y no un grupo genérico de proteínas relacionadas o no relacionadas. Los residuos de aminoácido de la proteína que interaccionan con una chaperona farmacológica dada pueden o no pueden estar dentro del "sitio activo" de la proteína. Unión específica puede evaluarse a través de los ensayos de unión de rutina o través estudios estructurales, por ejemplo, co-cristalización, RMN., y similares. El término "proteína del tipo silvestre" se refiere a las secuencias de nucleótido que codifican proteínas funcionales, y secuencias de polipéptido que se codifican a través de las secuencias de nucleótidos antes mencionadas, y cualquier otra secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido funcional (teniendo las mismas propiedades funcionales y afinidades de unión, que las secuencias polipéptido antes mencionadas) , así como variantes alélicas en individuo normales, que tiene la habilidad de lograr una conformación funcional en el ER, logrando una ubicación apropiada dentro de la célula, y que exhiben actividad de tipo silvestre (por ejemplo, hidrólisis GluCer) . Como se utiliza aquí el término "proteína mutante"' se refiere a un polipéptido traducido de un gen contiene una mutación genética que da como resultado una secuencia de aminoácidos alterada. En una modalidad, la mutación resulta en una proteína que no logra una conformación nativa bajo las condiciones normalmente presentes en el ER, cuando se compara con la proteína del tipo silvestre, o exhibe una estabilidad o actividad disminuida según comparado con la proteína de tipo silvestre. Este tipo de mutación es referida en la presente como una ""mutación conformacional," y la proteína que lleva dicha mutación es referida como una "mutante conformacional" . La falla al lograr esta conformación da como resultado que la proteína se degrade o agregue, en lugar de ser transportada a través de una trayectoria normal en el sistema de transporte de proteína a su ubicación nativa en la célula o dentro del entorno extracelular. En otra modalidad, la proteína tiene otra mutación además de otra diferente de la mutante conformacional, que permite la traducción, y por lo tanto la acumulación de ER de toda o la porción de proteína (cuya proteína puede o no puede retener la actividad de tipo silvestre) . En algunas modalidades, puede ocurrir una mutación en una parte no de codificación del gen que codifica la proteína que da como resultado una expresión menos eficiente de la proteína, por ejemplo, una mutación que afecta la eficacia de la transcripción, la eficiencia de la división, o la estabilidad del ARNm, y similar. Al mejorar el nivel de expresión del tipo silvestre así como variantes mutantes conformacionales de la proteína, la administración de una chaperona farmacológica puede mitigar un déficit que resulta de la ineficiente expresión de la proteína. Otras mutaciones pueden resultar como actividad enzimática disminuida a una renovación más rápida.
Las modalidades específicas de los mutantes Gba asociadas con enfermedades neuronopáticas incluyen pero no,,se limitan a: N370S, L444P, K198T, D409H, R496H, V394L, 84GG, 'y R329C. Una mutación heterocigota de Gba se refiere a un genotipo en donde existe un alelo de tipo silvestre y -u?. alelo mutante, por ejemplo, N370S/wt. Una mutación Gba heterocigota también se refiere a un genotipo en donde existen dos alelos mutados cada uno con una mutación diferente, por ejemplo, N370S/L444P. Este término también incluye el genotipo mutante/nulo, es decir, N370S/nulo. Esta definición también se aplica cuando se hace referencia a mutaciones heterocigotas en otras enzimas lisosómicas. Una mutación Gba homocigota se refiere a un genotipo en donde existen dos alelos Gba mutantes en donde las mutaciones son iguales, por ejemplo, N370S/N370S. Esta definición también se aplica cuando se hace referencia a mutaciones homocigotas en otras enzimas lisosómicas. El término "estabiliza una conformación apropiada" se refiere a la habilidad de una chaperona farmacológica para inducir o estabilizar una conformación de una proteína mutada que es funcionalmente idéntica a la conformación de la contraparte de tipo silvestre. El término "funcionalmente idéntica" significa que puede haber variaciones menores en la conformación (casi todas las proteínas exhiben alguna flexibilidad conformacional en sus estado fisiológico)'-, flexibilidad conformacional que no da como resultado (1) agregación de proteína, (2) eliminación a través de la trayectoria de degradación asociada con el retículo endoplásmico, (3) deterioro de la función de la proteína, por ejemplo la actividad Gba, y/o (4) transporte inapropiado dentro de la célula, por ejemplo, la localización de la lisosoma, a un grado mayor o menor que la de la proteína de tipo silvestre. El término "conformación molecular estable" se refiere a una conformación de una proteína, es decir, Gba, inducido por una chaperona farmacológica específica, que proporciona al menos la función de tipo silvestre parcial en la célula. Por ejemplo, una conformación molecular estable de una proteína mutante sería una en donde la proteína se escapa del ER y trafica a la ubicación celular nativa como lo hace un Gba de tipo silvestre (por ejemplo, la lisosoma) , en lugar de un mal plegado y ser degradada. Además, una conformación molecular estable de una proteína mutada también puede poseer actividad completa o parcial, por ejemplo, hidrólisis GluCer. Sin embargo, no es necesario que la conformación molecular estable tenga todos los atributos funcionales de la proteína de tipo silvestre. El término "actividad de tipo silvestre" se refiere a la función fisiológica normal de una proteína, por ejemplo, Gba, en una célula. Por ejemplo, la actividad Gba incluye el pliegue y tráfico del ER al lisosoma, con o sin la habilidad concomitante para hidrolizar un sustrato tal como GluCer o 4-metillumbeliferil (4-MU) . Dicha funcionalidad puede probarse por medios conocidos para establecer la funcionalidad de dicha proteína. Ciertas pruebas pueden evaluar los atributos de una proteína que pueden o no pueden corresponder a su función in vivo actual, pero sin embargo son sustitutos agregados de la funcionalidad de la proteína, y el comportamiento de tipo silvestre en dichas pruebas es una consecuencia de las técnicas de rescate o mejoramiento del pliegue de la invención. Una de dichas actividades de acuerdo con la invención es el transporte apropiado de la proteína mutante, por ejemplo Gba del retículo endoplásmico hacia la ubicación celular nativa, por ejemplo lisosoma, o dentro del entorno extracelular. El término "expresión endógena" refiere a la expresión fisiológica normal de una proteína en las células en un individuo que no tiene o se sospecha de tener una enfermedad del SNC o trastorno asociado con una deficiencia, sobre-exprésion, u otro defecto, de una proteína tal como en la secuencia de ácido nucleico o polipéptido que inhiben su expresión, actividad, o estabilidad. Este término también se refiere a la expresión de la proteína en tipos de células én donde es normal para la proteína ser expresada y no incluye la expresión en células o tipos de célula, por ejemplo, tumores, en donde la proteína no se expresa en individuos sanos . Como se utiliza aquí, los términos "mejora de la expresión" o "incremento de la expresión" se refiere al incremento de la cantidad de un polipéptido que adopta una conformación funcional en la célula contactada con la chaperona farmacológica específica para esa proteína, con relación a su expresión en una célula (preferiblemente del mismo tipo de célula o la misma célula, por ejemplo, en un momento anterior) no contactada con la chaperoña farmacológica específica para esa proteína. Los términos antes mencionados alternativamente significan el incremento de la eficiencia del transporte de un polipéptido desde el ER en una célula puesta en contacto con una chaperona farmacológica específica para esa proteína, con relación a la eficacia del transporte de una contraparte de tipo silvestre en una célula (preferiblemente de la misma célula, por ejemplo, en un tiempo anterior, o el mismo tipo célula) no puesto en contacto con la chaperona farmacológica específica para esa proteína. Como se utiliza aq í, el término "eficiencia del transporte" se refiere a la habilidad de una proteína mutante a ser transportada fuera del retículo endoplásmico a su ubicación nativa dentro de la célula, a otra ubicación dentro de la célula, a la membrana celular, o dentro del entorno extracelular. Un "inhibidor competitivo" de una enzima puede referirse a un compuesto que estructuralmente se asemeja a-la estructura química y la geometría molecular del sustrato de la enzima para unir la enzima en aproximadamente el mismo lugar que el sustrato. De esta forma, el inhibidor compite por el mismo sitio activo que la molécula de sustrato, de esta forma incrementando el Km. La inhibición competitiva usualmente es reversible si están disponibles suficientes moléculas del sustrato para el inhibidor, es decir, los inhibidores competitivos pueden unirse reversiblemente. Por consiguiente, la cantidad de inhibición de la enzima depende de la concentración del inhibidor, la concentración del sustrato, y las afinidades relativas del inhibidor y el sustrato para el sitio activo. La inhibición competitiva no clásica ocurre cuando el inhibidor se une remotamente al sitio activo, creando un cambio conformacional en la enzima de tal forma que el sustrato ya no se puede unir a éste. En una inhibición competitiva no clásica, la unión del sustrato al sitio activo evita la unión del inhibidor en un sitio separado y viceversa. Esto incluye la inhibición alostérica. Un "inhibidor de tipo mixto lineal" de una enzima es un tipo de inhibidor competitivo que permite que el sustrato se una, pero reduzca su afinidad, de tal forma que -a el Km se incrementa y el Vmax se disminuye. 1 Un "inhibidor no competitivo" se refiere a un compuesto que forma fuertes enlaces con una enzima y no puede ser desplazado por la adición de sustrato en exceso, es decir, los inhibidores no competitivos pueden ser irreversibles. Un inhibidor no competitivo puede unirse en, cerca, o remotamente del sitio activo de una enzima o proteína, y en conexión con las enzimas, no tiene efecto sobre el Km pero disminuye el Vmax. La inhibición no competitiva se refiere a una situación en donde el inhibidor se une solamente al complejo de enzima-sustrato (ES) . Ija enzima se convierte en inactiva cuando el inhibidor se une. Esto difiere de los inhibidores competitivos no clásicos que pueden unirse a la enzima en ausencia de sustrato. El término "Vmax" se refiere a la velocidad inicial máxima de una reacción catalizada por enzima, es decir, los niveles de sustrato de saturación. El término "Km" es la concentración de sustrato requerida para lograr , Vmax. Un "paciente que responde" es un individuo diagnosticado con un trastorno neurológico asociado con una mutación de enzima lisosómica y tratado de acuerdo con el método actualmente reivindicado que exhibe una mejora, mitigación o prevención de unos o más síntomas clínicos, o mejora o reversión de uno o más marcadores clínicos sustitutos. Como ejemplo, un "paciente que responde" para individuos con la enfermedad de Parkinson (que tienen mutaciones Gba concomitantes) es uno que exhibe una mejora," mitigación o prevención de uno o más síntomas clínicos, ó mejora o revierte uno o más marcadores clínicos sustitutos que incluyen pero no se limitan a: pérdida neuronal, astrogliosis, y la presencia de inclusiones de a-sinucleina de tipo cuerpo Lewy en neuronas CA2-3. Los términos "dosis terapéuticamente efectiva" y "cantidad efectiva" se refieren a la cantidad de la chaperoná farmacológica específica que es suficiente para dar como resultado una respuesta terapéutica. Una respuesta terapéutica puede ser cualquier respuesta que un usuario (por ejemplo, un médico) reconocerá como una respuesta efectiva a la terapia, tal como a través de la evaluación de los síntomas y marcadores clínicos sustitutos. De esta forma, una respuesta terapéutica generalmente será una mitigación de uno o más de los síntomas de la enfermedad o trastorno, por ejemplo, un trastorno neurológico. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que son fisiológicamente tolerables y típicamente no producen reacciones indóciles cuando se administra a un ser humano. Preferiblemente, como se utiliza aquí, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por la agencia reguladora del estado del gobierno federal o listado en la Farmacopea de E.U.A. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente eri seres humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, coadyuvante, excipiente, o vehículo con el cual el compuesto se administra. Dichos portadores farmacéuticos pueden líquidos, tales como agua y aceites. El agua y soluciones salinas de solución acuosa y dextrosa acuosa y soluciones de glicerol son preferiblemente utilizadas como portadores, particularmente para soluciones inyectables. Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin, 18o. Edición, u otras ediciones. Los términos "alrededor de" y "aproximadamente" generalmente significan un grado de error aceptable para la cantidad medida dada la naturaleza o precisión de las mediciones. Típicamente, los grados ilustrativos de error están dentro del 20 por ciento (%) , preferiblemente dentro del 10%, y más preferiblemente dentro del 5% de un valor dado o rango de valores. Alternativa, y particularmente en los sistemas biológicos, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" pueden significar valores que están dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro de cinco veces y más preferiblemente dentro de 2 veces un valor dado.
Las cantidades numéricas dadas en la presente son aproximadas a menos que se manifieste lo contrario, significando que el término "alrededor de" o "aproximadamente" puede ser inferido pero no expresamente declarado. Definiciones de Biologia Molecular De acuerdo con la presente invención se puede utilizar la biología molecular convencional, microbiología, y técnicas de ADN recombinante dentro de la experiencia en la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (aquí "Sambrook y otros, 1989"); DNÁ Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985) ; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed. 1984) ; Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & SJ. Higgins eds, (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & SJ. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)],- Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel y otros (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994) . Como se utiliza aquí, el término "aislado" significa que el material referido se remueve del entorno en el cual se encuentra normalmente. De esta forma, un material biológico aislado puede estar libre de componentes celulares, es decir, componentes de las células en donde el material sé encuentra o se produce. En el caso de moléculas de ácido nucleico, un ácido nucleico aislado incluye un producto PCR,' un ARNm aislado, un ADNc, o un fragmento de restricción. -En otra modalidad, un ácido nucleico aislado es preferiblemente extirpado del cromosoma en donde se encuentra, y más preferiblemente ya no está unido a regiones no de codificación, no reguladoras u otros genes, localizados en corriente ascendente o corriente descendente del gen contenido por la molécula del ácido nucleico aislada cuando es encontrado en el cromosoma. En aún otra modalidad, el ácido nucleico aislado carece de uno o más intrones. Las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen secuencias insertadas en plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales, y similares. De esta forma, en una modalidad específica, un ácido nucleico recombinante es un ácido nucleico aislado. Una proteína aislada puede estar asociada con otras proteínas o ácidos nucleicos, o ambos, con los cuales se asocia en la célula, o con membranas celulares si la proteína está asociada con la membrana. Un orgánulo, célula o tejido aislado se remueve al sitio anatómico el cual se encuentra en un organismo. Un material aislado puede ser, pero no necesita ser, purificado. El término "purificado" como se utiliza aquí se refiere al material, tal como un ácido nucleico o polipéptido GBA, que ha sido aislado bajo condiciones que reducen^' ó eliminan los materiales no relacionados, es decir',1 contaminantes. Por ejemplo, una proteína purificada está preferiblemente de manera substancial libre de otras proteínas o de ácidos nucleicos con los cuales se asociada en una célula. Como se utiliza aquí, el término "substancialmente libre" se utiliza operacionalmente, en el contexto de las pruebas analíticas del material. Preferiblemente, el material purificado substancialmente libre de contaminantes es al menos 50% puro; más preferiblemente, al menos 90% puro, y más preferiblemente aún al menos 99% puro. La pureza se puede evaluar a través de cromatografía, electroforesis de gel, inmunoensayo, análisis de la composición, ensayo biológico, y otros métodos conocidos en la técnica. El término "célula hospedera" significa cualquier célula de cualquier organismo que se selecciona, modifica, transforma, cultiva o utiliza o manipula en cualquier forma, para la producción de una sustancia a través de la célula, por ejemplo la expresión a través de la célula de un gen, una secuencia de ADN o ARN, o proteína o una enzima. De acuerdo con la presente invención, la célula hospedera se modifica para expresar un ácido nucleico y polipéptido de enzima lisosómica de tipo mutante o silvestre. Las células hospedera además se pueden utilizar para clasificación u otros ensayos. Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que ha experimentado una manipulación biológica molecular. Las células hospederas ilustrativas para uso en la presente invención son las células HEK293, células COS, y células CHO,: Los polinucleótidos en la presente pueden flanquearse a través de secuencias reguladoras naturales (control de expresión) , o pueden asociarse con secuencias heterólogas, incluyendo promotores, sitios de entrada de ribosoma interna (IRES, por sus siglas en inglés) y otras secuencias de sitio de unión de ribosoma, potenciadore.s, elementos de respuesta, supresores, secuencias de señal, secuencias del poliadenilación, intrones, regiones no de codificación 5' y 3' y similares. Los ácidos nucleicos también se pueden modificar a través de muchos medios conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones incluyen metilación, "caps" (protección) , sustitución de uno o más de los nucleótidos de existencia natural con un análogo, y modificaciones de internucleótido, tales como, por ejemplo, aquellos con enlaces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforoamiditas, carbamatos, etc.), y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioato, etc.). Los polinucleótidos pueden contener una o más porciones covalentemente enlazadas adicionales, tales como, por ejemplo proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.), intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), quelatadores (ppr ejemplo, metales, metales radiactivos, hierro, metales oxidables, etc.), y alquiladores. Los polinucleótidos se pueden derivar a través de la formación de un fosfotriéster de metilo o de etilo, o un enlace de fosforoamidato de alquilo. Además, los polinucleótidos en la presente también se pueden modificar con una etiqueta capaz de proporcionar una señal detectable, ya sea directa o indirectamente. Las etiquetas ilustrativas incluyen radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina, y similares. Una "secuencia de codificación" o una secuencia "que codifica" un producto de expresión, tal como un ARN o un polipéptido, es una secuencia de nucleótidos que, cuando se expresa, da como resultado la producción de ese ARN o polipéptido, por ejemplo, la secuencia de nucleótido Gba codifica una secuencia de aminoácidos para un polipéptido Gba (proteína) . Una secuencia de codificación para la proteína puede incluir un codón de inicio (usualmente ATG) y un codón de detención. El término "gen" , también denominado un "gen estructural" significa una secuencia de ADN que codifica o corresponda a una secuencia particular de aminoácidos que comprende todas o parte de una o más proteínas lisosómica, y puede o no puede incluir secuencias de ADN reguladoras, tales como secuencias promotoras, que determinan por ejemplo las condiciones bajo las cuales el gene se expresa. Los términos "expresa" y "expresión" , cuando son utilizados en el contexto de la producción de una secuencia de aminoácido a partir de una secuencia de ácido nucleico -, significa permitir o causar que la información en un gen o secuencia de ADN se manifieste, por ejemplo produciendo una proteína Gba a través de la activación de las funciones celulares involucradas en la transcripción y traducción del gen Gba o secuencia ADN correspondiente. Una secuencia de ADN se expresa en o a través de una célula para formar un "producto de expresión" tal una proteína Gba. El producto de expresión mismo, por ejemplo, la proteína resultante, también se puede decir que se "expresa" a través de la célula. Un producto de expresión se puede caracterizar como intracelular, extracelular o secretado. De acuerdo con lá presente invención, la proteína se expresa intracelularmente en neuronas . El término "intracelular" significa algo que está dentro de una célula. El término "extracelular" significa algo que está fuera de una célula. Una sustancia se "secreta" a través de una célula si aparece fuera de una medida significativa de la célula, de cualquier lugar o dentro de la célula.
El término "heterólogo" se refiere a una combinación de elementos no de existencia natural en combinación. Por ejemplo, el ADN heterólogo se refiere a ADN no localizado naturalmente en la célula, o en un sitio cromosómico de la célula. Preferiblemente, el ADN heterólogo incluye un gen foráneo a la célula. Un elemento regulador de expresión heterólogo es un elemento operativamente asociado con un gen diferente que es uno que está operativamente asociado en naturaleza. En el contexto de la presente invención, un gen que codifica una proteína de interés es heterólogo al ADN de vector en donde se inserta para la clonación o expresión, y es heterólogo a la célula hospedera que contiene un vector, en donde se expresa, por ejemplo una célula E. coli . El término "transformación" se refiere al procedimiento a través del cual el ADN, es decir, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de enzima lisosómica, se introduce desde el medio circundante dentro de una célula hospedera . El término "transducción" se refiere a la introducción de ADN, es decir, un ácido nucleico que codifica un polipéptido Gba, dentro de una célula hospedera procariótica, por ejemplo, en la célula hospedera procariótica a través de un virus bacteriano, o bacteriófago. Una célula hospedera procariótica o eucariótica que recibe y expresa el ADN o ARN introducido ha sido "transformada" o "traducida" y es un "transformante" o un "clon." El ADN o ARN introducido en una célula hospedera puede venir de cualquier fuente, incluyendo células del mismo género o especie como la célula hospedera, o células de un género o especies diferentes, o secuencias sintéticas. El término "célula recombinantemente creada" se refiere a cualquier célula procariótica o eucariótica que ha sido manipulada para expresar o sobreexpresar el ácido nucleico de interés, es decir, un ácido nucleico que codifica un polipéptido Gba, a través de cualquier método apropiado, incluyendo transfección, transformación o transducción. Este :\': .j.;. término también incluye la activación endógena de un ácido nucleico en una célula que normalmente no expresa ese producto de gen o que expresa el producto de gen en un nivel sub-óptimo. El término "transfección" significa la introducción de un ácido nucleico foráneo (es decir, extrínseco ó extracelularmente) dentro de una célula. El ácido nucleico "foráneo" incluye un gen, secuencia de ADN o ARN para una célula hospedera, de tal forraa que la célula hospedera replicará el ADN y expresará el gen introducido o secuencia para producir una sustancia deseada, típicamente una proteína o enzima codificada por el gen o secuencia introducida. EÍ gen introducido, es decir, un ácido nucleico que codifica un polipéptido Gba, o secuencia puede también ser denominado un gen o secuencia "clonada" , puede incluir secuencias reguladoras o de control, tales como secuencia de inicio, detención, promotora, de señal, de secreción, u otras secuencias utilizadas por la maquinaria genética de la célula. El gen o secuencia puede incluir secuencias no funcionales o secuencias sin ninguna función. El ADN puede introducirse ya sea como un elemento extracromosómico o través de integración cromosómica o una célula hospedera que recibe y expresa el ADN o ARN introducido. Dependiendo de la célula hospedera utilizada, la transformación/transfección se hace utilizando técnicas estándares apropiadas para dichas células. El tratamiento de calcio utilizando cloruro de calcico, como se describe en la sección 1.82 de Sambrook y otros, 1989 supra , generalmente se utiliza para células bacterianas que contienen barreras de pared celular sustanciales. Otro método para la transformación emplea polietilenglicol/DMSO, como se describe en Cheng y Miller (Nucleic Acids Res. 1988, 16:3580). Aún otro método es el uso de la técnica denominada electroporación. Alternativamente, cuando se utiliza un vector viral, las células hospedera se pueden infectar a través del virus que contiene el gen de interés. El término "vector" , "vector de clonación" , "vector de expresión" significa el vehículo a través del cual la secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gene Gba) se introduce en una célula hospedera, para así transformar el hospedero y promover la expresión (por ejemplo, transcripción y traducción) de la secuencia introducida. Los vectores incluyen plásmidos, fagos, virus, etc.; estos se explican con mayor detalle más adelante. Los vectores típicamente comprenden el ADN del agente transmisible, dentro del cual se inserta el ADN foráneo. Una forma común de insertar un segmento de ADN dentro de otro segmento de ADN involucra el uso de enzimas denominadas enzimas de restricción que dividen el ADN en sitios específicos (grupos específicos de nucleótido) denominados sitios de restricción. Un "cásete" se refiere a una secuencia codificadora de ADN o segmento de ADN que codifica el producto de expresión que se puede insertar en un vector en sitios de restricción definidos. Los sitios de restricción de cásete se designan para asegurar de inserción del cásete en un marco de lectura apropiado. Generalmente, el ADN foráneo se inserta en uno o más sitios de restricción del ADN de vector, y después se lleva a través del vector en una célula hospedera junto con el vector de ADN transmisible. Un segmento o secuencia de ADN que tiene un ADN insertado o adicionado, tal como un vector de expresión, también puede ser denominado una "construcción de ADN" . Un tipo de vector común es un "plásmido" , que generalmente es una molécula independiente de ADN de estructura de cadena doblé}' usualmente de origen bacteriano, que puede fácilmente aceptar el ADN adicional (foráneo) y que puede fácilmente introducirse en una célula hospedera adecuada. Un vector plasmídico por lo general contiene ADN de codificación y ADN promotor y tiene uno o más sitios de restricción adecuados para la inserción del ADN foráneo. El ADN de codificación es una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácido particular para una proteína o una enzima particular. El ADN promotor es una secuencia de ADN que inicia, regula, o por el contrario media o controla la expresión del ADN dé codificación. El ADN promotor y el ADN de codificación pueden ser del mismo gen o de diferentes genes, y pueden ser dei mismo o diferentes organismos . Un gran número de vectores, incluyendo vectores de plásmido y fúngicos, han sido descritos para la replicacióri .... '1 y/o expresión en una variedad de hospederos eucarióticos y procarióticos. Los ejemplos no limitantes incluyen pKK (Clonetech) , plásmidos pUC, plásmidos pET (Novagen, Inc., Madison, Wl) , plásmidos pRSET o pREP (Invitrogen, San Diego, CA) , o plásmidos (New England Biolabs, Beverly, MA) , pCXN y muchas células hospederas apropiadas, utilizando los métodos descritos o citados en la presente o por el contrario conocidos por los expertos en la técnica relevante. Los vectores de clonación recombinantes por lo general incluyen uno o más sistemas de replicación para la clonación o expresión, uno o más marcadores para la selección en el hospedero, por ejemplo, resistencia a antibióticos, y unos ? más casetes de expresión. Se puede utilizar una amplia variedad dé combinaciones de hospedero/vector de expresión (es decir, sistemas de expresión) en la expresión de las proteínas de interés. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir de segmentos de secuencia de ADN cromosómicas, no cromosómicas, y sintéticas. Los vectores adecuados incluyen los plásmidos bacterianos conocidos, por ejemplo, los plásmidos de E . coli col El, pCRl, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX (Smith y otros, Gene 67:31-40, 1988), pMB9 y sus derivados, plásmidos tales como RP4 ; ADN de fago, por ejemplo, numerosos derivados del fago 1, por ejemplo, NM989, y otro ADN de fago, por ejemplo, M13 y ADN de fago de estructura de cadena individual filamentosa; plásmidos de levadura tales como el plásmido 2m o derivados del mismo; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, tales como plásmidos que han sido modificados para utilizar el ADN de fago u otras secuencias de control de expresión; y similares. Otros sistemas de expresión común utilizan células hospederas de insecto y vectores de baculovirus . Los vectores de expresión ilustrativos comercialmente disponibles para uso en las células de mamíferos incluyen pMEP4 , pCEP4, el pLXSN, PXT1, las series pcDNA3 , las series pcDNA4 , pCMV-Script, pCMV-Tag y otros vectores basados en CMV, pVP22, pVAXl, pUB6. Para la transfección de células de mamífero, los vectores virales incluyen vectores virales asociados con adeno, virus de viruela, y retrovirus. Los vectores de expresión de mamíferos son rutinarios y bien conocidos en la técnica. Las células hospederas pueden inherentemente también cosechar el polipéptido de interés, por ejemplo, Gba. Los polipéptidos heterólogos tales como Gba, el ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, ADNc) se insertan adecuadamente en un vector replicable para la expresión en el medio de cultivo bajo el control de un promotor adecuado. Como se observó anteriormente, muchos vectores están disponibles para este propósito, y la selección del vector apropiado dependerá principalmente del tamaño del ácido nucleico ha ser insertado en el vector y la célula hospedera particular a ser transformada con el vector. Cada vector contiene varios componentes dependiendo de su función (amplificación de ADN o expresión de ADN) y la célula hospedera particular con la cual es compatible. Los componentes del vector para la transformación bacteriana generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, y un promotor. El ADN que codifica el polipéptido Gba puede expresarse no solamente de forma directamente, sino también como una fusión con otro polipéptido, preferiblemente una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de división específico en el término N del polipéptido maduro. En general la secuencia de señal puede ser un componente de vector, o puede ser parte de un ADN de polipéptido que se inserta en el vector. La secuencia de señal heteróloga seleccionada deberá ser una que sea reconocida y procesada (es decir, dividida por una peptidasa de señal) a través de la célula hospedera. Para las células hospederas bacterianas que no reconocen y procesan la secuencia de señal de polipéptido nativa, la secuencia de señal se substituye por una secuencia de señal bacteriana seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste de fosfatasa alcalina, penicilinasa, al lpp, o líderes de enterotoxina II estables al calor. Ambos vectores de expresión y de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que habilita que el vector replique en una o más células hospederas seleccionadas. Generalmente, en los vectores de expresión esta secuencia es una que permite que el vector replique independientemente del ADN cromosómico del hospedero, e incluye orígenes de replicación o secuencias autónomas de replicación. Dichas secuencias son bien conocidas por una variedad de bacterias . El origen de replicación del plásmidó pBR322 es adecuado para la mayor parte de las bacterias Gram-negativo. Los vectores de expresión y de clonación también generalmente contienen un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de ias células hospederas transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células hospederas no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típica codifican proteínas que (a) confiere resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampiciliná; neomicina, metotrexato, o tetraciclina; (b) complementa las deficiencias autotróficas; o (c) suministra nutrientes críticos no disponibles del medio de complejo. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco que detiene el crecimiento de una célula hospedera. Estas células que son exitosamente transformadas con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a fármacos y de esta forma sobrevive el régimen de selección. El vector de expresión para la producción de un ? polipéptido heterólogo también contiene un promotor inducible que se reconoce a través de un organismo hospedero y está operablemente enlazado al ácido nucleico que codifica el polipéptido del interés. Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unir la polimerasa de ARN en la célula e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación en corriente descendente (dirección 3'). Para los propósitos dé definir la presente invención, la secuencia promotora está unida a su término 3' a través del sitio de iniciación de transcripción y se extiende en corriente ascendente (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por arriba del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de iniciación de transcripción, así como los dominios de unión de proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión de la polimerasa de ARN. Una secuencia de codificación está "bajo el control de" o "operativamente asociada con" las secuencias de control de transcripción y de traducción en una célula en donde la polimerasa de ARN que describe la secuencia de codificación en ARNm, la cual después se trans-ARN y divide (si contiene intrones) y se traduce en la proteína codificada por la secuencia de codificación. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes anteriormente listados utilizan técnicas de ligación estándar. Los plásmidos aislados o fragmentos de ADN se dividen, personalizan y vuelven a ligar en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos . Para el análisis para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligación se utilizan para transformar las cepas bacterianas, y los transformantes exitosos se seleccionan a través de la resistencia a ampicilina o tetraciclina cuando es apropiado. Los plásmidos de los transformantes se preparan, se analizan a través de la digestión de endonucleasa de restricción, y/o se secuencian a través del método de Sanger y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1977, 74:5463-5467 o Messing y otros, Nucleic Acids Res. 1981, 9:309), o a través del método de Maxam y otros {Methods in Enzymology 1980, 65:499). Las células hospederas se transforman con los vectores de expresión antes mencionados y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados cuando es apropiado para el promotor utilizado. Definiciones Quimicas El término "alquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo de C?-C20 recto o ramificado que consiste solamente de átomos de carbono y de hidrógeno, que no contiene insaturación, y que está unido al resto de la molécula a través de un enlace individual, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, 1-metiletilo (isopropilo) , n-butilo, n-pentilo, 1, 1-dimetiletilo (t-butilo). Los alquilos utilizados en la presente son preferiblemente alquilos de C?- C8- El término "alquenilo" refiere al un grupo hidrocarburo alifático de C2-C20 que contiene por lo menos un enlace doble de carbono-carbono y que puede ser una cadena recta o ramificada, por ejemplo, etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo (alilo) , iso-propenilo, 2-metilo-l-propenilo, 1-butenilo, 2-butenilo. El término "cicloalquilo" denota un sistema anular de hidrocarburo mono- o multicíclico no aromático, insaturado tal como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciciohexilo. Los ejemplos de grupos cicloalquilo multicíclicos incluyen un grupo cíclico puenteado de grupos perhidronaftilo, adamantilo y norbonilo o grupos espirobicíclicos, por ejemplo espiro (4 , 4) non-2-ilo. El término "cicloalquilo" se refiere a un cicloalquilo como se definió anteriormente directamente unido a un grupo alquilo como se definió anteriormente, que da como resultado la creación de una estructura estable tal como ciclopropilmetilo, ciclobutiletilo, ciclopentiletilo. El término "éter de alquilo" se refiere a un grupo alquilo o grupo cicloalquilo como se definió anteriormente que tiene por lo menos un oxígeno incorporado en la cadena alquilo, por ejemplo, metil etil éter, éter dietílico, tetrahidrofurano.
El término "alquilamina" se refiere a un grupo alquilo o a un grupo cicloalquilo como se definió anteriormente que tiene por lo menos un átomo de nitrógeno., por ejemplo, n-butilamina y tetrahidrooxazina. . ,'. El término "arilo" se refiere a radicales aromáticos que están en el rango de aproximadamente 6 ,a aproximadamente 14 átomos de carbono tales como fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, bifenilo. El término "arilalquilo" se refiere a un grupo arilo como se definió anteriormente directamente enlazado a un grupo alquilo como se definió anteriormente, por ejemplo, -CH2C6H5, y -C2H4C6H5. El término "heterocíclico" se refiere a un radical anular de 3 a 15 miembros estable que consiste de átomos dé carbono y que forma de 1 a 5 heteroátomos de carbono y qué forma de 1 a 5 heteroátomos seleccionados de grupo que consiste de nitrógeno, fósforo, oxígeno y azufre. Para los propósitos de esta invención, el radical anular heterocíclico puede ser un sistema anular monocíclico, bicíclico o tricíclico, que puede incluir sistemas anulares fusionados, puenteados, o espiro, y los átomos de nitrógeno, fósforo, carbono, oxígeno o azufre en el radical anular heterocíclico pueden estar opcionalmente oxidados en varios estados de oxidación. Además, el átomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado; y el radical anular puede estar parcial o completamente saturado (es decir, heteroaromático, o heteroarilo aromático) . Los ejemplos de radicales anulares heterocíclicos incluyen, pero no se limitan a, azetidinilo, acridinilo, benzodioxolilo, benzodioxanilo, benzofuranilo, carbazolilo, cinolinilo, dioxolanilo, indolizinilo, naftiridinilo, perhidroazepinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, piridilo, pteridinilo, purinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, tetrazolilo, imidazolilo, tetrahidroisoquinolilo, piperidinilo, piperazinilo, 2-oxopiperazinilo, 2-oxopiperidinilo, 2-oxopirrolidinilo, 2-oxoazepinilo, azepinilo, pirrolilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, oxazolilo, oxazolinilo, oxasolidinilo, triazolilo, indanilo, isoxazolilo, isoxasolidinilo, morfolinilo, tiazolilo, tiazolinilo, tiazolidinilo, isotiazolilo, quinuclidinilo, isotiazolidinilo, indolilo, isoindolilo, indonilo, isoindonilo, octahidroindolilo, octahidroisoindolilo quinolilo, isoquinolilo, decahidroisoquinolilo, bencimidazolilo, tiadiazolilo, benzopiranilo, benzotiazolilo, benzooxazolilo, furilo, tetrahidrofurtilo, tetrahidropiranilo, tienilo, benzotienilo, tiamorfolinilo, sulfóxido de tiamorfolinilo, sulfona de tiamorfolinilo, dioxafosfolanilo, oxadiazolilo, cromanilo, isocromanilo. El radical anular heterocíclico puede estar unido a la estructura principal en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que da como resultado la creación de una estructura estable. El término "heteroarilo" se refiere a un anillo heterocíclico en donde el anillo es aromático. El término "heteroarilalquilo" se refiere al radical anular heteroarilo como se definió anteriormente directamente enlazado a un grupo alquilo. El radical heteroarilaquilo puede estar unido a la estructura principal de cualquier átomo de carbono del grupo alquilo que da como resultado la creación de una estructura estable. El término "heterociclilo" se refiere a un radical anular heterocíclico como se definió anteriormente. El radical anular de heterociclilo se puede estar unido a la estructura principal en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que da como resultado la creación de una estructura estable . El término "heterociclilalquilo" se refiere a un radical anular heterocíclico como se definió anteriormente directamente enlazado a un grupo alquilo. El radical heterociclilalquilo puede estar unido a la estructura principal en el átomo de carbono en el grupo alquilo que da como resultado la creación de una estructura estable. Los sustituyentes en el "alquilo sustituido" , "alquenilo substituido", "alquinilo substituido", "cicloalquilo sustituido", "cicloalquilalquilo sustituido", "cicloalquenilo sustituido" , "arilalquilo sustituido" , "arilo sustituido" , "anillo heterocíclico sustituido" , "anillo heteroarilo sustituido", "heteroarilalquilo sustituido", o "anillo heterociclilalquilo sustituido" puede ser igual o diferente con uno o más grupos seleccionados de hidrógeno, hidroxi, halógeno, carboxilo, ciano, amino, nitro, (=0) , tio (=S) , o grupos opcionalmente sustituidos seleccionados de alquilo, alcoxi, alquenilo, alquinilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, anillo heterocíclico, C00Rx, -C(0)Rx, -C(S)RX, -C(0)NRxRy, C(0)0NRxRy, -NRxC0NRyRz, -N(Rx)S0Ry, -N(Rx)S02Ry, - (=N-N (Rx) Ry) ,' -NRxC(0)0Ry, -NRxRy, -NRxC(0)Ry-, -NRxC(S)Ry -NRxC (S) NRyRz , -S0NRxRy-, -S02NRxRy-, -0RX, -0RxC (O) NRyRz, -0RxC (0) 0Ry- , -0C(0)Rx, -0C(0)NRxRy, -RxNRyRz, -RxRyRz, -RXCF3, -RxNRyC (O) Rz, -Rx0Ry, -RxC(0)0Ry, -RxC(0)NRyRz, -RxC(0)Rx, -Rx0C(0)Ry, -SRX, -S0Rx, -S02RX, -0N02, en donde Rx, Ry y Rz en cada uno de los grupos anteriores puede ser un átomo de hidrógeno, alquiló sustituido o sin sustituir, haloalquilo, arilalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, anillo heterocíclico sustituido o sin sustituir, heterociclilalquilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir, o heteroarilalquilo sustituido o sin sustituir.
El término "halógeno" se refiere a radicales de flúor, cloro, bromo y yodo. Ganancia Tóxica de Función En una modalidad particular, la invención se refiere al uso de chaperonas farmacológicas específicas para una enzima lisosómica para incrementar el nivel de tráfico de proteína apropiada y la disminución del nivel de la acumulación de enzima mutante. Esto a su vez, se puede utilizar para tratar condiciones neurológicas asociadas con una mutación o a mutaciones en la enzima, incluyendo formas de enfermedades de almacenamiento lisosómico en donde la mutación en uno o ambos alelos produce enzimas que son mutaciones conformacionales a través de las cuales también tienen mutaciones en dominios funcionales, aboliendo la actividad enzimática. Esta modalidad se ejemplificada en la presente a través del efecto de una chaperona farmacológica específica sobre un mutante Gba encontrado en una forma neurológica de la enfermedad de Gaucher en donde no estuvo presente un Gba funcional . La chaperona incrementó el nivel de la proteína Gba a partir de ER, y restauró la ubiquitinación apropiada de la proteína mutante. Este efecto no fue previsto a partir del trabajo anterior sobre el rescate de ASSC de la función de la proteína. La agregación de proteína, tal como la acumulación de Gba, en el SNC es particularmente extremo ya que las neuronas son incapaces de regenerarse después de la neurodegeneración o apoptosis que surge de la tensión neuronal asociada con la acumulación tóxica. De esta forma, la presencia de mutaciones homocigotas o heterocigotos es suficiente para causar la agregación o acumulación de proteína mutante en neuronas y la tensión celular, finalmente conduciendo a la muerte celular. Se han publicado numerosos reportes enlazando la agregación de proteína en el SNC a patología. Por consiguiente, en una modalidad, la presente invención se basa, en el concepto de que la patología del SNC en enfermedades de almacenamiento lisosómico, y otros trastornos neurológicos asociados con mutaciones en las enzimas lisosómicas se pueden explicar, en parte, a través de la acumulación tóxica del mutante, enzimas mal plegadas en neuronas, y un método de chaperona farmacológica específica puede invertir este efecto. El efecto tóxico también depende de la función de la proteína, los efectos de la mutación de la función y la estabilidad de la proteína, y si la pérdida o reducción de la función de la proteína es más o menos dañina que los efectos tóxicos de la acumulación y/o agregación de proteína. Por consiguiente, el incremento del tráfico de la proteína desde ER utilizando una chaperona farmacológica específica puede aliviar la patología de la enfermedad a través de la reducción de los efectos tóxicos de la acumulación/agregación de la proteína, aún sin necesariamente restaurar la función de la proteína. En consecuencia las chaperonas farmacológicas específicas podrían potencialmente utilizarse para tratar cualquier enfermedad en donde un contribuyente significativo para la patología de la enfermedad es acumulación tóxica de proteína y/o agregación de proteína, incluyendo las asociadas con las enfermedades neurodegenerativas, especialmente enfermedades de almacenamiento lisosómico con la implicación neurológica tal como la enfermedad de Gaucher, y otros factores de riesgo neurológicos, trastornos, o condiciones asociados con mutaciones en las enzimas lisosómicas, tal como la enfermedad de Parkinson. Como se indicó anteriormente, se pueden asociar otros tipos de enfermedades neurológicas con una enzima lisosómica disfuncional y de esta forma se pueden tratar a través de chaperonas farmacológicas como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica, Canavan, Creutzfeldt-Jakob, Huntington, esclerosis múltiple, enfermedad de Pick y atrofia espinocerebelar . Por consiguiente, un método de tratamiento que incrementa el transporte de la enzima mutante desde el ER, y/o incrementa la actividad la enzima, es benéfico en la mitigación los efectos neuronopáticos asociados con lá enfermedad de almacenamiento lisosómico u otras enfermedades neurológicas asociadas que están enlazadas con mutaciones en enzimas lisosómicas. Aún en la ausencia de una actividad enzimática incrementada (es decir, restauración de la pérdida de la función) , y la reducción de la acumulación de sustrato, el tráfico apropiado de la enzima mutante tiene efectos benéficos sobre la neurona tales como (i) aliviar la tencióri celular en la trayectoria de degradación de ubiquitina/proteasoma para las proteínas normales; o (ii) reducir la respuesta de la proteína no plegada causada por la tensión ER, de esta forma mejorando las patologías tales como, por ejemplo, agregación de a-sinucleina en pacientes con Parkinson que tienen mutaciones en Gba. El soporte para estos efectos es provisto directamente a continuación. Tensión Celular. Está bien establecido que la acumulación o agregación de numerosas proteínas mal plegadas en la célula conduce a la tensión celular. Esta tensión algunas veces está correlacionada con cantidades de poliubiquitina incrementada, una proteína "tensa" celular. Los conjugados de ubiquitina-proteína han revelado que la ubiquitina es un componente de muchos de los cuerpos de inclusión filamentosos característicos de las enfermedades neurodegenerativas, sugiriendo la activación de una respuesta neuronal común en este tipo de proceso de enfermedad (Lowe y otros, Neutopathol Appl Neurobiol. 1990; 16: 281-91). Por ejemplo, los estudios genéticos, incluyendo la identificación de mutaciones en genes asociados con el Parkinson familiar (incluyendo a-sinucleina) , y la presencia de inclusiones citoplásmicas proteínicas en las neuronas negras dopaminérgicas adicionales en casos esporádicos de Parkinson han sugerido un papel importante para el sistema de ubiquitina-proteasoma y la degradación de proteína aberrante (Betarbet y otros, Exp Neurol. 2005; 191 Suppl l:S17-27) . Además, los estudios in vivo e in vi tro han enlazado la a-sinucleina agregada y la tensión oxidativa a un sistema de ubiquitina-proteasoma comprometida y la patogénesis de la enfermedad de Parkinson. Además, los defectos estructurales y funcionales en las proteasomas 26/20S con la acumulación y agregación de proteínas anormales potencialmente citotóxicas han sido identificados en los pares compactos de pacientes con sustancia negra con enfermedad de Parkinson esporádica (McKnaught y otros, Ann Neurol. 2003; 53 Suppl 3:S73-84). Específicamente, las mutaciones en a-sinucleina que causan que la proteína se pliegue mal y que sea resistente a la degradación proteosómica causa el Parkinson familiar. De esta forma, un defecto en el manejo de la proteína parece ser un factor común en las formas esporádicas y las varias formas familiares de PD . Se llegó a la misma conclusión a partir de los experimentos en donde la combinación de un inhibidor de proteasoma con agentes que inducen el mal pliegue de la proteína se adicionaron a un cultivo de neuronas dopaminérgicas (Mytilineou y otros, J. Neural Transm. 2004; 111 (10-11) : 1237-51) . La pérdida preferencial de neuronas de dopamina y muerte celular está marcadamente incrementada cuando se combinan las dos . Además, se ha reportado que la proteína ubiquitinada se agrega cuando se encuentra en células de pacientes para algunas enfermedades de almacenamiento lisosómico incluyendo la enfermedad de Gaucher (Asmarina y otros, Eur. J. Biochem. 2003; Suplemento 1; resumen no. P3.7-08) . Estas células también despliegan patrones de expresión de gen alterados para genes relacionados con la trayectoria de ubiquitina/proteasoma. Una teoría alternativa para las interrupciones en la homeostasis neuronal en LSD con la implicación del SNC es debido a la supresión de la trayectoria de ubiquitina/proteasoma a través de enzimas acumuladas (Rocca y otros, Molecular Biology of the Cell. 2001; 12: 1293-1301). Por ejemplo, se ha encontrado que uno de los mecanismos de toxicidad asociados con la agregación de a-sinucleina es la inhibición proteasómica, que ocurre en muchos procedimientos neurodegenerativos. Específicamente, se ha demostrado que la a-sinucleina agregada inhibe la función proteasómica a través de la interacción con S6' , una subunidad de proteasoma (Snyder y otros, J Mol Neurosci. 2004; 24(3): 425-42). La función de la proteasoma se disminuye en el cerebro de sujetos con enfermedad de Parkinson así como cerebros de individuos animales que carecen de Parkinson, el cual es una ligasa de ubiquitina E3 y parte del sistema proteosómico del ubiquitina. La agregación de proteína y la inhibición proteasómica asociada también ha estado enlazada con inflamación (Li y otros, Int. J. Biochem. Cell Biol. 2003; 35: 547-552) . Se ha propuesto que una falta de balance entre las chaperonas moleculares y las proteínas dañadas/desnaturalizadas/mal plegadas, conduce a la acumulación de lo anterior, lo que puede dar como resultado en el envejecimiento orgánico, inhibición de la proteasoma (conduciendo a la apoptosis) , o necrosis, dependiendo de la severidad de la falta de balance (Soti y otros, Aging Cell. 2003; 2:39-45). Esta hipótesis es referida como la "hipótesis de acumulación de proteína tóxica" . Ya que los monómeros de a-sinucleina se cree que se degradan a través de las proteasomas y formación de oligómero es dependiente de la concentración, esto podría conducir a una acumulación y oligomerización de a-sinucleina. La acumulación tanto del mutante Gba como la a-sinucleina (lo anterior debido a la pérdida de actividad Gba) podría exacerbar este efecto en las proteasomas, y un Gba deficiente también puede dañar cualquier incremento en la respuesta autofágica a través de lisosomas que ocurren para compensar la deficiencia de la trayectoria de la degradación de la proteasoma.
Tensión ?R. Además de la explicación anteriormente referenciada, la acumulación continua de proteínas mal plegadas en el lumen del ER crea una respuesta de tensión ER, la cual a su vez, obtiene la "respuesta de proteína mal plegada" (UPR) . El UPR es una respuesta de tensión celular de control de calidad que da como resultado la inhibición de la síntesis de proteína, tal como a través de la tensión oxidativa, o retención de las proteínas mutantes en el ER que son incapaces de plegarse. Sin esta respuesta, el ER se engulle con proteínas inestables, mal plegadas, lo cual da como resultado la muerte celular a través de la apoptosis (Gow y otros, NeuroMolecular Med. 2003; 4: 73-94). También se ha demostrado que Gba interactúa con el receptor de Rianodina en el ER para perturbar la homeostasis Ca2+, conduciendo a un plegado de proteína dañado y un UPR, una apoptosis inducida por la tensión ER y una muerte celular dirigida a la mitocondria debido a un incremento en el Ca2+ citosólico (Korkotian y otros, J Biol Chem. 1999. 274(31): 21673-8; Lloyd-Evans y otros, J Biol Chem. 2003. 278(26): 23594-9; Pelled y otros, Neurobiol Dis. 2005. 18(1): 83-8). Auto agia. Además de los lípidos de degradación, los lisosomas son responsables de la degradación de las proteínas agregadas (discutido más adelante) . Este procedimiento, denominado autofagia, es un procedimiento de degradación en volumen intracelular a través del cual una porción del citoplasma se distribuye a los lisosomas a ser degradados a través de las enzimas lisosómicas . Dichas enzimas incluyen proteasas (catepsina) que divide los enlaces peptídicos, fosfatasas, que remueven los fosfatos covalentemente unidos, nucleasas, que dividen ADN/ARN, lipasas, que dividen las moléculas de lípido, y enzimas que dividen carbohidratos. Las proteínas agregadas, incluyendo las enzimas lisosómicas mutadas, pueden causar la activación de una respuesta autofágica conspicua que conduce a los cambios degenerativos de larga duración en neuronas. Muchas neuronas en los trastornos del SNC, incluyendo esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , exhiben el tráfico vesicular irregular y respuestas autofágicas. Es posible que la creación de vacío autofágico-lisosómico excesivo pueda causar la muerte neuronal. La sobre-activación de la respuesta autofágica, especialmente en combinación con la inhibición de la trayectoria de proteasoma como un mecanismo compensador, a través de proteínas mutantes acumuladas es una hipótesis para un enlace entre las enzimas lisosómicas mutantes acumuladas y la neurodegeneración, especialmente en la enfermedad de Alzheimer. Pérdida Patológica de Función Además de la restauración apropiada del tráfico de enzimas lisosómicas, la restauración de la chaperona farmacológica específica de la actividad de la enzima mutante será benéfico en pacientes que cosechan una(s) mutación (es) de desestabilización en uno o ambos alelos que reduce la cantidad de enzima funcional (por ejemplo, Gba) en su ubicación nativa (por ejemplo, la lisosoma) debido al ineficiente plegado y al tráfico. Aún una pequeña pérdida de la función puede conducir a patologías tales como acumulación o agregación de sustrato, que puede dar como resultado el sembrado de otros agregados patológicos . Por consiguiente, en una modalidad, la presente invención proporciona métodos para mejorar los trastornos neurológicos asociados con la proteínas de enzima lisosómicas mutantes a través del incremento de la actividad reducida de las enzimas lo cual, a su vez, (i) incrementa la degradación lisosómica de los sustratos, las proteínas agregadas o fragmentos; (ii) disminuye la apoptosis o necrosis neuronal; y (iii) previene la alteración del "balance" de fosfolípidos en membranas celulares (discutidas directamente más adelante) . Las explicaciones posibles postuladas para explicar la pérdida neuronal o neuropatía en la enfermedad de Gaucher se puede explicar a través de la pérdida de la actividad Gba asociada a las mutaciones. La pérdida de actividad causa la acumulación de ceramida, tal como la GluCer, en células con Gba deficiente. Esto ha sido demostrado que causa la apoptosis en las células de neurona CA2-4 de hipocampo cultivadas, debido a un incremento en el calcio intracelular y un incremento en la sensibilidad a la muerte celular mediada por calcio. Las neuronas dopaminérgicas también han demostrado que experimentan apoptosis después del daño inducido por ceramida. En segundo lugar, los altos niveles de glucosilesfingosina del compuesto tóxico, también un sustrato de Gba, ha sido observado en órganos de ratones Gaucher de alelos nulos letales. La glucosilesfingosina también está elevada en los tejidos de pacientes que tienen los tres tipos de enfermedad de Gaucher. Aunque los niveles cerebrales se elevan solamente en esos pacientes con participación neuronal utilizando los métodos actuales de detección (Sidransky, Mol. Gen. Metanol. 2004; 83:6-15), las pequeñas cantidades de acumulación no detectables utilizando los métodos actuales podrían aún afectar el pliegue de la proteína y también dañar el tráfico de la proteína a través de la afección de la composición de transporte de lípido (discutido infra) . En tercer lugar, el contenido del fosfolípido de membrana afecta la actividad de Gba en las células. Principalmente, los fosfolípidos negativamente cargados mejoran la actividad de Gba, y los fosfolípidos positivamente cargados tales como fosfatidilcolina (PC) no lo hacen. Por consiguiente, un mecanismo en donde el Gba disminuido en la enfermedad de Gaucher activa una enzima involucrada en la síntesis de PC, por lo tanto incrementando PC, puede causar una reducción adicional en Gba (Wong y otros, supra ) . Además, la ceramida elevada puede inhibir el transporte axonal de a-sinucleina, favoreciendo la agregación y la formación del cuerpo Lewy. Las neuronas presumiblemente requieren a-sinucleina para la funcionar. Ya que la a-sinucleina enlaza el PC pobremente, la vesículas de transporte axonal que están comprometidas principalmente de PC no pueden ser tan eficientes como las vesículas comprendidas de fosfolípidos ácidos (Wong y otros, supra) . Además, como se discutió anteriormente, los lisosomas están involucrados en la compensación de agregados involucrados en numerosos trastornos del SNC a través de autofagia. La autofagia es particularmente relevante en neuronas, ya que la pérdida de la autofagia causa la neurodegeneración en la ausencia de proteínas mutantes asociadas con la enfermedad (Hará y otros, Nature, publicación en línea abril 19 del 2006) . La inducción del sistema autofágico lisosómico, en un esfuerzo protector para eliminar los componentes intracelulares alterados ocurre durante la tensión oxidativa (Kiffm y otros, Antioxid Redox Signal. 2006; 8(1-2): 152-62). Como un ejemplo, los oligómeros de a-sinucleina. Un grupo reportó una interacción entre la glucosilceramida conteniendo gangliosidas y a-sinucleina en lisosomas en homogenatos de cerebro humano (Schlossmacher y otros, New Eng J Med. 2005; 352: 730). En los pacientes Gaucher con Parkinson, el GA localizado con a-sinucleina en cuerpos Lewy (Wong y otros, Mol. Genet. Metabol . 2004; 38: 192-207). Estos resultados soportan que el procesamiento de a-sinucleina ocurre dentro de las lisosomas, y proporciona un enlace bioquímico entre la actividad de Gba disminuida y la sinucleinopatía en la enfermedad Parkinson. Además, la autofagia es esencial para la eliminación de las formas agregadas de huntingtina mutante y ataxina-1, del compartimiento citoplásmico (Iwata y otros, Proc Acad Nati Acad Sci U. S. A. 2005; 102(37): 13135-40). Lá autofagia también juega el papel principal en la compensación de células de agregados de proteína en la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y otros trastornos de expansión del poliglutamina (Meriin y otros de, Int J Hyperthermia. 2005; 21(5): 403-19). De esta forma, las deficiencias en las hidrolasas lisosómicas podrían afectar adversamente la respuesta autofágica a la acumulación tóxica de proteínas (incluyendo las proteínas lisosómicas acumuladas mismas) . Acumulación de sustrato y defectos de tráfico endocíticos. La acumulación de sustratos celulares, tales como esfingolípidos y colesterol en enfermedades lisosómicas, especialmente aquellas que involucran el SNC, han estado - , asociadas con interrupciones en el tráfico endocítico de proteínas y lípidos. Esto puede ocurrir debido a la interrupción de las proteínas rab (ras en el cerebro) , que 5 son proteínas asociadas con membranas que localizan los compartimiento subcelulares discretos y están asociadas con el tráfico de proteína. La interrupción rab causa el secuestro a través de las proteínas asociadas con membranas en "gran cantidad de lípido" . Las grandes cantidades de 0 lípidos son microdominios de membrana enriquecidos en esfingolípidos (esfigomielina y fosfotidilcolina) y colesterol. Estos han sido sugeridos como que sirven como plataformas para varios eventos celulares, incluyendo la señalización y el tráfico de membrana. En particular, las 5 grandes cantidades de lípidos estabilizan la asociación de proteínas ancladas con GPl dentro de la membrana ER y están directamente involucradas en la conformación de la proteína y también dirigen los lípidos o proteínas asociadas con lípidos a entrar en la célula al compartimiento apropiado a través de 0 los endosomas. Por consiguiente, la acumulación de grandes cantidades de lípidos en membranas de endosomas y lisosomas en, por ejemplo, enfermedades de almacenamiento lieosómico, debido a la actividad de la hidrolasa de lípido disminuida, podría alterar la clasificación intracelular de 5 glicoesfingolípidos (que ya están acumulados) , y proteínas asociadas con lípidos cuando entran en la célula (Pagano y otros, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2003; 358: 885-91) . La hipótesis de falta de clasificación está soportada por recientes hallazgos en mucopolisacaridosis (MPS) , en donde se demostró que los diferentes sustratos acumulados, gangliosidas GM2 y GM3, acumulados en las mismas neuronas, pero fueron constantemente localizados en poblaciones separadas de vesículas citoplásmicas (McGlynn y otros, Comp Neurol. 2004; 480:415-26). Estos autores hipotetizan que el co-secuestro en neuronas individuales sugieren la presencia de defectos en la composición, tráfico y/o reciclación de componentes de grandes cantidades de lípidos, conduciendo a nuevos mecanismos para explicar la disfunción neuronal en trastornos MPS. Los estudios de modelos de ratón para la enfermedad Gaucher también sugieren que la actividad Gba reducida más generalmente interrumpe el catabolismo de glicoesfingolípidos que conducen a la acumulación de especies más complejas (gangliosidas) . La acumulación de gangliosidas puede dar como resultado la distonia y parkinsonismo en seres humanos (Roze y otros, Movement Disorders. 2005; 20(10): 1366-1369). Un modelo de ratón que acumula la galgliosida GM2 también acumula a-sinucleina (Suzuki y otros, Neuroreport. 2003; 14(4): 551-4. Dicha acumulación de gangliosidas también puede conducir a la acumulación de a-sinucleina, así como la muerte neuronal a través de las trayectorias UPR (Lee y otros, J Biol Chem. 2002. 277(1): 671-8). Además, como se recitó anteriormente, se ha demostrado que los esfingolípidos pueden funcionar como una semilla para la formación de agregados de a-sinucleina. Estos mecanismos de neurotoxicidad como un resultado de la acumulación de lípidos parcialmente puede explicar la neuropatología de la enfermedad Gaucher, ya que existe a una pérdida de correlación entre la actividad Gba y la severidad de la enfermedad Gaucher. Esta correlación trabaja para diferenciar estos tres tipos de enfermedades principales (I-III) , aunque existe un empalme y la correlación es débil dentro de los tipos individuales. Los pacientes que son heterocigotos normales para Gba no experimentan una acumulación de lípidos significativa, porque existe alguna cantidad de Gba producido por medio del alelo normal. Sin embargo, aún en la acumulación de pequeñas cantidades de GluCer puede interrumpir la homeostasis calcica ER y dañar el pliegue de la proteína (descrito anteriormente) o posiblemente aún sembrar una agregación de a-sinucleina a través de algún mecanismo. En vista de lo anterior, el uso de chaperonas farmacológicas específicas de acuerdo con la presente invención es ventajoso sobre la terapia de reemplazo de enzima (ERT, por sus siglas en inglés) y la terapia de reducción del sustrato (SRT, por sus siglas en inglés), ya que el principal debe ser administrado directamente en el cerebro a través de un catéter, y ya que ninguno conduce los problemas de acumulación tóxica de enzimas lisosómicas mutantes mismas, es decir, el mutante Gba. Por consiguiente, estos tratamientos son menos efectivos que un tratamiento que pueda reducir la acumulación de proteina mutante, o mejorar y/o restaurar la función de la proteína (por lo tanto reduciendo la acumulación de sustratos) o ambos. Enzimas Lisosómicas Mutante y Chaperonas Farmacológicas Especificas A continuación está una tabla que enumera las enzimas lisosómicas y chaperonas farmacológicas específicas para aquellas enzimas lisosómicas que se pueden utilizar para tratar individuos que tienen mutaciones en las enzimas y que tienen una condición o trastorno neurólogo resultante, o están en riesgo de desarrollar una condición o trastorno neurológico.
En una modalidad no específica, a continuación existen algunas chaperonas farmacológicas específicas contempladas para esta invención que se pueden utilizar para tratar factores de riesgo neurológicos, condiciones o trastornos en donde se muta el Gba. También se ejemplifican mutaciones Gba contempladas a ser "rescatadas" por las chaperonas. Mutaciones Gba . La presencia de la mutación N370S de punto Gba y por lo menos un alelo (heterocigoto) está casi universalmente asociada con la enfermedad Gaucher de tipo 1 (Cox, supra) . La homocigocidad N370S está asociada con un fenotipo menos severo que la heterocigocidad nulo/N370S Gba (N370S/nulo) , probablemente debido a la actividad Gba residual de los homocigotos. De hecho, algunos pacientes N370S/N370S son asintomáticos a lo largo de la mayor parte de su vida pero están en riesgo de desarrollar trastornos neurológicos tales como Parkinson. En este caso, la mutación Gba podría un factor de riesgo para Parkinson. Las mutaciones de punto adicionales asociadas con Gaucher de tipo 1 incluyen 84GG, R496H, Q350X, y H162P (Orvisky y otros, Human Mutation. 2002; 495, 19 (4 ) : 458- 9) . Además, la mutación IVS10+2T-3>G y IVS10+2T-^> de sitio dividida también estuvo asociada con la enfermedad Gaucher de tipo 1 (Orvisky, supra) . La enfermedad Gaucher de tipo 2 neuropática está asociada con mutaciones que resultan principalmente de dos sustituciones de aminoácidos, L444P y A456P. La homocigocidad L444P también está comúnmente asociada con la enfermedad Gaucher de tipo 3, aunque esta mutación ha sido identificada en pacientes con los tres tipos de enfermedades . Otras mutaciones de punto asociadas con la enfermedad de Gaucher neuropática de tipo 2 y 3 incluyen D409H (homocigoto) y V349L y D409V (heterocigoto) . Los pacientes homocigotos para D409H exhiben un fenotipo único que incluye hidrocefalia y calcificación de la válvula cardiaca y aórtica además de la participación neurológica. Los dos últimos puntos de mutación, V349L y D409V, dan como resultado que Gba sea catalíticamente defectuoso. Otras mutaciones identificadas en la enfermedad de tipo 2 o 3, son K198E, K198T, Y205C, F251L," 1402F, y la mutación IVS10+2T-> A de sitio de división (Orvisky y otros, supra; y Lewin y otros, Mol Genet Metab. 2004; 81(l):70-3). Los pacientes y ratones angélicos que carecen de actividad Gba mueren brevemente después de nacer debido a la deshidratación, ya que la ceramida es esencial para la integridad cutánea de la piel (Liu y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1998; 95:2503-08). Chaperonas para Gba. La isofagomina (IFG; (3R, 4R, 5R) -5- (hidroximetil) -3 , 4-piperidindiol) se refiere a un compuesto que tiene la siguiente estructura: IFG tiene una fórmula molecular de CSH13N03 y un peso molecular de 147.17. Este compuesto además se describe en las patentes de E. U. A. 5,844,102 de Sierks y otros, y 5,863,903, de Lundgren y otros. C-bencil-IFG, se refiere a un compuesto que tiene la siguiente estructura: Otras chaperonas para Gba incluyen glucoimidazol, policiclohexanilo, y derivados de hidroxil piperidina, que se describen en las solicitudes publicadas de E. U. A. Pendientes 2005/0130972 y 2005/0137223, y publicaciones PCT correspondientes WO 2005/046611 y WO 2005/046612, todas presentadas el 12 de noviembre de 2004 e incorporadas aquí por referencia. El glucoimidazol y sus derivados están representados por la siguiente estructura química: en donde B se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, hidroxi, acetamino, y halógeno; R1 y R2 opcionalmente presentes son enlazadores lineales flexibles, cortos de una longitud de aproximadamente 6Á a 12Á, preferiblemente de 9Á. R1 y R2 también pueden estar independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo sustituido o sin sustituir de C2-C6 opcionalmente interrumpido por una o más porciones seleccionadas del grupo que consiste de NH, NHCOO, NHCONH, NHCSO, NHCSNH, CONH, NHCO, NR3, O, S, S(o)m y -S(0)mNR3; alquenilo sustituido o sin sustituir de C2-C6 opcionalmente interrumpido por una o más porciones seleccionadas del grupo que consiste de NH, NHCOO, NHCONH, NHCSO, NHCSNH, CONH, NHCO, NR3 , 0, S, S(?)m y -S(0)mNR3; alquinilo sustituido o sin sustituir de C2-C6 opcionalmente interrumpido por una o más porciones selecciona del grupo que consiste de NH, NHCOO, NHCONH, NHCSO, NHCSNH, CONH, NHCO, NR3, O, S, S(o)ra y -S(0)mNR3, en donde m es 1 o 2 ', y R3 es independienteraente seleccionado en cada ocurrencia de los grupos que consiste de alquilo sustituido o no sustituido con hidrógeno, alquenilo sustituido o no sustituido; alquinilo sustituido o sin sustituir; cicloalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquenilo sustituido o sin sustituir; arilo sustituido o sin sustituir; arilalquilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir; heterocíclico sustituido o sin sustituir; heterocicloalquilalquilo sustituido o sin sustituir; heteroarilaquilo sustituido o sin sustituir; y sales y profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos. Además, R1-L1 o R2-L2 puede ser un hidrógeno, si cualquiera de R2-L2 o R1-L1 es diferente de hidrógeno, respectivamente . R5 representa un hidrógeno, hidroxi, o hidroximetilo; L1 y L2 son grupos lipofílicos seleccionados del grupo que consiste de alquilo sustituido o sin sustituir de C3-C?2, alquenilo sustituido o no sustituido; alquinilo sustituido o sin sustituir; cicloalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquenilo sustituido o sin sustituir; arilo sustituido o sin sustituir; arilalquilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir; heterocíclico sustituido o sin sustituir; heterocicloalquilalquilo sustituido o sin sustituir; heteroarilaquilo sustituido o sin sustituir. En modalidades específicas, los compuestos GIZ incluyen (5R, 6R, 7S, 8S) -5-hidroximetil-2-octil-5, 6, 7, 8-tetrahidroimidazo [1, 2-a] piridin-6, 7, 8-triol y (5R, 6R, 7S, 8S) - 5-Hidroximetil-2- (3, 3-dimetilbutil) -5,6,7, 8-tetrahidroimidazo [1, 2-a] piridin-6, 7, 8-triol . Los derivados de polihidroxilcicloalquilo (PHCA) contemplados para uso en la presente invención incluyen compuestos representados por la siguiente estructura química: en donde B se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, hidroxi, N-acetamino, y halógeno. R1 se selecciona independientemente en cada ocurrencia del grupo que consiste de hidrógeno; alquilo sustituido o sin sustituir; alquenilo sustituido o no sustituido; alquinilo sustituido o sin sustituir; cicloalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquenilo sustituido o sin sustituir; arilo sustituido o sin sustituir; arilalquilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir; heterocíclico sustituido o sin sustituir; heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir; heteroarilaquilo sustituido o sin sustituir. -C(0)R3 y -S(0)mR3, en donde m es 1 o 2 y R3 se selecciona independientemente de cada ocurrencia del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, alquenilo sustituido o no sustituido; alquinilo sustituido o sin sustituir; cicloalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquenilo sustituido o sin sustituir; arilo sustituido o sin sustituir; arilalquilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir; heterocíclico sustituido o sin sustituir; heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir; heteroarilaquilo sustituido o sin sustituir, y -C(O) junto con alquilo de C!-C6 sustituido o sin sustituir. R2 opcionalmente presente es un enlazador flexible, corto de longitud lineal de aproximadamente 6Á a aproximadamente 12A, preferiblemente de aproximadamente 9A. R2 se puede seleccionados del grupo que consiste de alquilo sustituido o sin sustituir de C2-C6 opcionalmente interrumpido por una o más porciones seleccionadas del grupo que consiste de NH, NHCOO, NHCONH, NHCSO, NHCSNH, CONH, NHCO, NR3 , 0, S, S(o)m y -S(0)mNR3,- alquenilo sustituido o sin sustituir de C2-C6 opcionalmente interrumpido por una o más porciones seleccionadas del grupo que consiste de NH, NHCOO, NHCONH, NHCSO, NHCSNH, CONH, NHCO, NR3 , O, S, S(?)m y -S(0)mNR3; alquinilo sustituido o sin sustituir de C2-C6 opcionalmente interrumpido por una o más porciones selecciona del grupo que consiste de NH, NHCOO, NHCONH, NHCSO, NHCSNH, CONH, NHCO, NR3, O, S, S(o)m y -S(0)mNR3, en donde m es 1 o 2, y R3 es independientemente seleccionado en cada ocurrencia del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido con hidrógeno, alquenilo sustituido o no sustituido; alquinilo sustituido o sin sustituir; cicloalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquenilo sustituido o sin sustituir; arilo sustituido o sin sustituir; arilalquilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir; heterocíclico sustituido o sin sustituir; heterocicloalquilalquilo sustituido o sin sustituir; heteroarilaquilo sustituido o sin sustituir; y -C(O) junto con alquilo de C?-C6 sustituido o sin sustituir; y sales y profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos.
L es un grupo lipofílico seleccionado del grupo que consiste de alquilo de C3-C12 sustituido o sin sustituir, alquenilo sustituido o no eustituido; alquinilo sustituido o sin sustituir; cicloalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquenilo sustituido o sin sustituir; arilo sustituido o sin sustituir; arilalquilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir; heterocíclico sustituido o sin sustituir; heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir; heteroarilaquilo sustituido o sin sustituir. Los derivados de hidroxilpiperidina contemplados para uso en la presente invención en donde Gba está mutado se representan por la siguiente estructura química. en donde A representa un carbono o un nitrógeno; B es un hidrógeno, hidroxilo, N-acetamida o un halógeno; R1 es un hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo, arilalquilo, heteroarilo, heterocíclico, heterocicloalquilalquilo o heteroarilalquilo sustituidos o sin sustituir; -C(0)R3 o -S(0)mR3. Preferiblemente, R1 comprende H o una porción orgánica que tiene de 1 a 12 átomos de carbono.
R2 es un enlazador flexible, corto opcional, con una longitud lineal de aproximadamente 6Á a aproximadamente 12a. Alternativamente, R2 es un alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o sin sustituir de C?-C6, opcionalmente interrumpido por una o más porciones seleccionadas del grupo que consiste de NH, NHCOO, NHCONH, NHCSO, NHCSNH, CONH, NHCO, NR3, 0, S, S(?)m y -S(0)mNR3. R3 es un hidrógeno, o alquilo, alquenilo; alquinilo; cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo; arilalquilo; heteroarilo; heterocíclico; heterocicloalquilo, o heteroarilalquilo, sustituido o sin sustituir. Preferiblemente, R3 comprende H o una porción orgánica que tiene de 1 a 12 átomos de carbono o más preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono. m es 1 o 2, y R5 es hidrógeno, hidroxilo o hidroximetilo. L es un grupo lipofílico que tiene de 1 a 12 átomos de carbono que comprende un alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo; arilo; arilalquilo; heteroarilo; heterocíclico; heterocicloalquilo; o heteroarilalquilo sustituido o sin sustituir. En modalidades específicas, los compuestos de hidroxilpiperidina contemplados para uso en la presente invención incluyen pero no se limitan a los siguientes: (3R, 4R, 5R, 6S/6R) -5- (hidroximetil) -6-n-butil-3 , 4-dihidroxipiperidina; (3R, 4R, 5R, 6S/6R) -5- (hidroximetil) -6-n- hexil-3 , 4-dihidroxipiperidina; (3R, 4R, 5R, 6S/6R) -5 (hidroximetil) -piperidin-6-n-heptil-3, 4-dihidroxipiperidina; (3R,4R,5R,6S/6R) -5- (hidroximetil) -6-n-octil-3 , 4-dihidroxipiperidina; (3R, 4R, 5R, 6S/6R) -5- (hidroximetil) -6-n-nonil-3, 4-dihidroxipiperidina; (3R, 4R, 5R, 6S/6R) -5- (hidroximetil) -6-bencil-3 , 4-dihidroxipiperidina. Aún otras chaperonas para Gba se describen en la patente de E. U. A. 6,599,919 de Fan y otros, e incluyen calistegina A3, calistegina A5, calistegina Bi, calistegina B2, calistegina B3, calistegina B4, calistegina Ci, N-metil-calistegina B2, DMDP, DAB, castanoespermina, 1-deoxinoj irimicina, N-butil-dexodinoj irimicina, 1-desoxinoj irimicina bisulfito, N-butil-isofagomina, N- (3-ciclohexilpropil) -isofagomina, N- (3-fenilpropil) -isofagomina, y N-[(2E,6Z,10Z)-3,7, 11-trimetildodecatrienil] -isofagomina-K. En otra modalidad específica a continuación las chaperonas farmacológicas específicas incluyendo 1-desoxinoj irimicina (DNJ; 1, 5-imino-l, 5-didesoxi-D-glucitol- CAS No. 19130-96-2) y derivados que se pueden utilizar para tratar factores de riesgo, condiciones o trastornos neurológicos en donde la enzima a-glucosidasa lisosómica (Gaa) se muta. Las mutaciones ilustrativas de Gaa incluyen las siguientes: D645E (Lin y otros., Zhonghua Min Guo Xiao Er Ke YiXue HUÍ Za ZM. 1996 ; 37 (2) : 115-21) ; D645H (Lin y otros., Biochem Biophys Res Commun. 1995 17 ;208 (2) : 886-93) ; R224W, S619R, y R660H (New y otros. Pediatr Neurol. 2003 ;29 (4) : 284-7); T1064C y C2104T (Montalvo y otros., Mol Genet Metab. 2004;81(3) :203-8) ; D645N y L901Q (Kroos y otros., Neuromuscul Disord. 2004;14 (6) :371-4) ; G219R, E262K, M408V (Fernandez-Hojas y otros., Neuromuscul Disord. 2002; 12(2): 159-66)'; G309R (Kroos y otros., Clin Genet. 1998 ; 53 (5) : 379-82) ; D645N, G448S, R672W, y R672Q (Huie y otros., Biochem Biophys Res Commun. 1998; 27 ; 244 (3) : 921-7) ; P545L (Hermans y otros., Hum Mol Genet. 1994 ;3 (12) : 2213-8) ; C647W (Huie y otros., Huie y otros., Hum Mol Genet. 1994 ; 3 (7) : 1081-7) ; G643R (Hermans y otros., Hum Mutat . 1993 ,-2 (4) : 268-73) ; M318T (Zhong y otros., Am J Hum Genet. 1991;49 (3) : 635-45) ; E521K (Hermans y otros., Biochem Biophys Res Commun. 1991 ; 179 (2) : 919-26) ; W481R (Raben y otros., Hum Mutat. 1999 ; 13 (1) : 83-4) ; y L552P y G549R (datos no publicados) . Los mutantes de división incluyen IVS1AS, T>G, -13 y IVS8+1G>A) . Las chaperonas de a-glucosidasa ilustrativas están representados por la siguiente estructura química: en donde : Ri es H o un alquilo, cicloalquilo, alquenilo,. alquiléter, o alquilamina recto o ramificado, que contiene de 1 a 12 átomos de carbono, un arilo, alquilarilo, heteroarilo, o heteroarilalquilo que contiene de 5 a 12 átomos anulares, en donde R1 está opcionalmente sustituido con uno o más de -ON, -COOH, -Cl, -F, -CF3, -CF3, -OCF3, -0-C (=0) N- (alquilo) 2 ; y R2 es H; un alquilo, cicloalquilo, alquenilo o alquiléter recto o ramificado, que contiene de 1 a 9 átomos de carbono o arilo que contiene de 5 a 12 átomos de carbono, en donde R2 está opcionalmente sustituido con-OH, -COOH, -CF3, -0CF3 o un anillo heterocíclico; en donde por lo menos uno de Ri y R2 no es H, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En particular, las chaperonas para el ácido a-glucosidasa incluyen pero no se limitan a N-metil-DNJ, N-etil-DNJ, N-propil-DNJ, N-butil-DNJ, N-pentil-DNJ, N-hexil-DNJ, N-heptil-DNJ, N-octil-DNJ, N-nonil-DNJ, N-metilciclopropil-DNJ, y metilciclopentil-DNJ. Además de los derivados DNJ sustituidos con nitrógeno, otros derivados útiles DNJ como chaperonas para Gaa incluyen derivados de DNJ sustituidos con N-bencilo y derivados que tienen un sustituyente anexo al carbono adyacente al nitrógeno de anillo también son compuestos preferidos de la presente invención. Dichos compuestos se describen en la solicitud copendiente comúnmente propietaria, con el número de serie 11/ , , presentada el 17 de mayo del 2006. En aún otra modalidad, las chaperonas preferidas para el tratamiento de trastornos neurológicos asociados con mutaciones heterocigotos en a-galactosidasa (a-Gal A) , otras enzimas lisosómicas, se representan por las siguientes estructuras químicas: En donde Rx y R2 representan H, OH, o un grupo alquilo, hidroxialquilo o alcoxilo de 1-12 carbonos. R2 y R2< independientemente representan un grupo H, LH, o N-acetamido, o un grupo alquilo de 1-12 carbonos. R4 y R4< independientemente representan H, CH20H, CH3, O COOH; Re y Re- independientemente representan H, CH20H, CH3, o COOH; R7 representa H u OH; R0 representa H, metilo, o una cadena de carbono saturada o insaturada de cadena recta o ramificada que contiene 9-12 átomos de carbono, generalmente sustituido con un grupo fenilo, hidroxilo o ciciohexilo. En una modalidad específica, la chaperona es 1-dexosinorj irimicina . Las mutaciones a-Cal A ilustrativas asociadas con la enfermedad de Fabry incluyen R301Q, L166V, A156V, G272S, y M296I.
Detección y tráfico de proteinas acumuladas . La acumulación de proteínas en el ER se puede detectar y/o visualizar y manifestar como la ubicación perinuclear en los perfiles túbulo vesiculares que se co-localizan con las proteínas residentes ER tales como BiP. Estas proteínas también se reducen o están ausentes en su ubicación nativa dentro de la célula tal como en la superficie celular o en otro compartimiento celular tal como el lisosoma. La acumulación de proteínas en el citoplasma se puede detectar utilizando métodos de co-localización similares con proteínas citosólicas . Los métodos para detectar el tráfico dañado de enzimas lisosómicas son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, para las proteínas que son N- y O-glicosiladas en el aparato Golgi, la marcación metabólica de seguimiento de pulso utilizando proteínas radioactivamente marcadas, combinadas con el tratamiento de glicosidasa y la inmunoprecipitación, se pueden utilizar para detectar si las proteínas están experimentando la glicosilación completa en el Golgi, o si están siendo retenidas en el ER en lugar del tráfico hacia el Golgi para una glicosilación adicional. Los métodos sensibles para visualmente detectar la localización celular de las proteínas también incluye la microscopía fluorescente utilizando proteínas fluorescentes o anticuerpos fluorescentes. Para la evaluación de las muestras celulares, los anticuerpos fluorescentes se pueden utilizar para detectar proteínas . Para la detección en células manipuladas o creadas, las proteínas de interés se pueden etiquetar con por ejemplo, la proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés) , proteína fluorescente azui verdosa, la proteína fluorescente amarilla (YFP, por sus siglas en inglés) , y la proteína fluorescente roja, antes de la transfección, seguido por microscopía multicolor y de lapso de tiempo y microscopía de electrón para estudiar el destino de las proteínas en células fijas y en células vivientes . Para una revisión del uso de la fotorecepción fluorescente en el tráfico de proteínas, ver Watson y otros, Adv Drug Deliv Rev. 2005; 57 (1) : 43-61) . Para una descripción del uso de microscopía confocal para la co-localización intracelular de proteínas, ver Miyashita y otros, Methods Mol Biol. 2004; 261:399-410. Además, los experimentos de marcación doble con anticuerpos para, por ejemplo, LAMP-1 o LysoTracker® para la lisosoma (roja) (u otra cepa o marcador específico para la lisosoma tal como los puntos quantum fluorescentes, dextrina azul de cascada) y la enzima lisosómica (verde) , relaciones de traslape verde/rojo (co-localización) se pueden utilizar para medir los cambios en la enzima lisosómica, por ejemplo, el tráfico de la enzima a las lisosomas (el incremento de la relación de verde/rojo significa más enzimas que trafican para la lisosoma) . Las células sanas normales con trayectorias endocíclicas normales podrían producir más fluorescencia. Ver también el Ejemplo 2, infra. La espectroscopia de correlación de correlación de fluorescencia (FCS, por sus siglas en inglés) es un método de detección ultrasensible y no invasivo, capaz de la resolución de molécula individual y en tiempo real (Vukojevic y otros, Cell Mol Life Sci. 2005; 62(5): 535-50). SPFI (fotorecepción de fluorescencia de partícula individual) utiliza la alta sensibilidad de la fluorescencia para visualizar moléculas individuales que han sido selectivamente marcadas con partículas fluorescentes pequeñas (Cherry y otros, Biochem Soc Trans. 2003; 31(Pt 5): 1828-31). Para la localización de proteínas dentro de grandes cantidades de lípidos, ver Latif y otros, Endocrinology, 2003; 144(11): 4725-8). Para una revisión de la fotorecepción de células vivas, ver Hariguchi, Cell Struct Funct . 2002; 27 (4) : 333-4) . Microscopía de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET, por sus siglas en inglés) también se utilizó para estudiar la estructura y la localización de las proteínas bajo condiciones fisiológicas (Periasamy, J Biomed Opt. 2001; 6(3): 287-91). En modalidades particulares, la detección de a-sinucleina en individuos que cosechan mutaciones Gba se puede hacer utilizando el método ELISA o el análisis western-blot . Los métodos LCMS/MS y/o TCL se pueden utilizar para monitorear los niveles GluCer (acumulación de sustrato) El monitoreo ex vivo de los niveles de a-sinucleina y las relaciones de oligómero/monómero, en respuesta al tratamiento de animales con inhibidores y/o chaperonas, se puede evaluar utilizando los ensayos de división de cerebro. Ensayos de Ubiquitinación. Además, los ensayos para determinar la presencia y localización de conjugados de ubiquitina/enzima lisosómica se pueden utilizar para evaluar la ganancia tóxica de los efectos de la función de las mutaciones y en respuesta al tratamiento de la chaperona. Los estudios morfológicos utilizando inmunohistoquímica o inmunofluorescencia para localizar estos conjugados es un método de detección sensible. Ver, Ejemplo 3, infra. Como se indicó anteriormente, la presencia de niveles bajos de proteínas ubiquitinadas comparado con células no tensas, puede ser indicativo de la inhibición de la función de proteasoma.
Como otro ejemplo, un proceso denominado AlphaScreen™ (Perkin-Elmer) se puede utilizar para detectar las proteínas ubiquitinadas. En este modelo, la porción GST de una proteína de fusión GST-UbcH5a se ubiquitinó utilizando biotina-ubiquitina (bio-Ub) . Después de la activación de la ubiquitina a través de El, en la presencia de ATP, el bio-Ub se transfirió a UbcH5a. En esta reacción, UbcH5a actúa como el portador para transportar el bio-Ub a su porción GST marcada. La proteína que se convierte en bioteñida y ubiquitinada después se captura a través del aceptor anti-GST y estreptavidina. Las perlas donadora resultan de la generación de señal. No se generó ninguna señal en la ausencia de ubiquitinación. Además, los ensayos de alto rendimiento para medir las actividades de las varias ligasas de ubiquitina E3 y las enzimas de conjugación E2 se pueden utilizar para determinar el incremento o disminución en la ubiquitinación de la proteína (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) . Respuesta UPR. La tensión ER se puede evaluar determinado los niveles de expresión de los genes y las proteínas codificadas por los genes involucrados en UPR. Dichos genes y proteínas incluyen aquellos mencionados anteriormente Grp78/BiP, Grp94, y orpl50, que se sobre regulan en estados tempranos del UPR. Otras proteínas involucradas en la respuesta de tensión ER incluyen IRE1, PERK, ATF6, y XBP1, que se regulan de manera ascendente en células sometidas a tensión ER continua. Además, la tensión celular prolongada conduce a la apoptosis, y de esta forma, la regulación ascendente de la cinasa jun (JNK) y caspasas 3, 9 y 12. La presente invención contempla una comparación de los niveles de expresión de los genes indicadores antes mencionados y/o proteínas entre los pacientes con acumulación de proteína tóxica o sustrato o agregación e individuos sanos. En otra modalidad, la presente invención también contempla la evaluación del efecto de las chaperonas farmacológicas específicas sobre células tensionadas para identificar los compuestos para lidiar la tensión celular causada por la ganancia tóxica de agregados de función. Como controles positivos, los inductores de tensión ER tales como tunicamicina, ditiotreitol (DTT) , lacatcistina, y el peróxido se pueden utilizar para causar la acumulación de proteínas sin plegar en el ER. La tunicamicina inhibe la glicosilación enlazada ? y DTT previene la formación del enlace de disulfuro. La lacatcictina es un inhibidor de proteasoma. Los liberadores de tensión tales como ciclohexamida, un inhibidor de síntesis de proteína, se pueden utilizar como controles positivos cuando se evalúan los compuestos de chaperonas sobre células estresadas .
Los ensayos para los niveles de expresión incluyen la expresión del gen a través del análisis de microensayo. Esto se puede lograr utilizando el equipo del chip del gen U133 Affymetrix (genoma humano) que contiene dichos genes (Affymetrix, Santa Clara, CA) . Además, esta técnica ha sido utilizada por otros. Por ejemplo, el análisis de microensayo de ARN recolectado de múltiples puntos en el tiempo después del tratamiento con 6-hidroxidopamina se combinó con la obtención de datos y técnicas de agrupamiento para identificar los diferentes subgrupos funcionales de genes de tensión celular (Holtz y otros, Antioxidants & Redox Signaling. 2005; 7: 639-648). 6-OHDA es un mimético parkinsoniano que ha demostrado que causa cambios transcripcionales asociados con la tensión celular y el UPR. Apoptosis. Además, corao se manifestó anteriormente, la tensión ER persistente, prolongada que no elimina mediante el UPR puede también conducir a la muerte celular programada en células neuronales, por ejemplo, apoptosis. Para la evaluación in vivo , las líneas celulares neuronales tales como h?T2 (?o. de acceso ATCC CRL-10742) , Hs68 (# CRL-1636) , HC?-IA (# CRL-10442), SK-?-FI (# CRL-2142), SK-?-DZ (# CRL-2149), SK-?-SH (# HTB-Il) , o ?T2/D1 (# CRL- 1973), o células germinales embriónicas o células germinales neurales que ha sido diferenciadas in vi tro a neuronas (ver, por ejemplo, US 2003/0013192 de Laeng y otros; y Yan y otros, Stem Cells. 2005; 23:781-90), se pueden transfectar con Gba mutante y evaluarse para apoptosis. De esta forma, el número de células apoptóticas puede medirse utilizando análogos de sustrato fluorescentes, por ejemplo, caspasa 3, un indicador anterior de apoptosis. La apoptosis se puede detectar utilizando métodos en la técnica, incluyendo clasificación celular activada fluorescente (FACS) , y/o utilizando un lector de placas (por ejemplo, 96 cavidades para alto rendimiento) . Para lo anterior, el porcentaje de células positivas para apoptosis o muerte celular puede determinarse, o la intensidad fluorescente puede medirse con relación a la concentración de la proteína. Morfologia de la célula/organelo . Las anormalidades morfológicas en neuronas puede resultar de la acumulación de proteína mutante y puede evaluarse utilizando análisis morfométrico. Por ejemplo, los cambios en la morfología neuronal en neuronas transfectadas con tau-GFP incluyeron asimetría, una reducción en el número de axones en la proyección anterior y posterior, agrupamiento de axón anormal, formación de burbujas de axón anormal, formación de burbujas de axón y ramificación terminal reducida. Otras alteraciones en la morfología celular incluyendo agregación, tamaño de célula (área celular o densidad celular) , polimegatismo (variación del tamaño de la célula tal como coeficiente de variación del área celular media) ; pleomorfismo (variaciones de la forma de la célula como porcentaje de las células hexagonales o coeficiente de la variación de la forma de la célula) , perímetro celular, longitud lateral de célula promedio, forma de la célula, etc. La morfología se puede evaluar utilizando el análisis morfométrico cuantitativo de acuerdo con los métodos descritos en, Ventimiglia y otros, J Neurosci Methods. 1995; 57:63-6; y Wu y otros, Cerebral Cortex. 2004; 14: 543-54 (análisis de alto rendimiento) ; y utilizando el software de análisis de imagen tal como el software Image Pro-Plus. La tensión celular/ER también se puede detectar mediante la evaluación de la morfología del organelo. Por ejemplo, el UPT en células S . cerevisiae que expresan CY028 se manifestó como una morfología aberrante del retículo endoplásmico (ER) y como una proliferación de membrana extensiva para la morfología ER y la proliferación de membrana de células S . cerevisiae que producen CY000 de tipo silvestre (Sagt y otros, Applied y Environmental Microbiology. 2002; 68: 2155-2160). Además, los indicadores morfológicos específicos se pueden asociar con enfermedades de agregación individual. Por ejemplo, en la enfermedad de Gaucher, los lípidos se acumulan en lisosomas de macrófagos dando como resultado una morfología diferente indicativa de un macrófago activado.
Almacenes de calcio ER. La tensión ER también se puede detectar midiendo los niveles de calcio en el lumen y citosol ER, y también mediante la determinación del nivel de proteínas reguladoras de calcio tal como SERCA2b, una ATPase de calcio ubicua que regula los almacenes de calcio intracelulares. Como control, la tensión ER puede inducirse a través de la depleción de calcio, utilizando, tapsigargina. Función de la proteasoma. La función de proteasoma, una respuesta de tensión celular a la acumulación de proteínas o sustratos, puede medirse de acuerdo con el método de Glas y otros (Nature. 1998; 392: 618-622). La evaluación de la función de la proteasoma 26S en animales vivos mediante la fotorecepción ha sido lograda por el reportero de ubiquitina-luciferasa para la fotorecepción de bioluminiscencia (Luker y otros, Nature Medicine. 2003. 9, 969 - 973) . El aislamiento de proteasoma y los ensayos se describen en Craiu y otros, JBC. Los equipos para el aislamiento de proteasoma están comercialmente disponibles de, por ejemplo, Calbiochem (Cat. No. 539176). Este equipo se puede utilizar para aislar las subunidades de proteasoma de extractos celulares para estudiar su función e interacciones con otras proteínas . Las subunidades de proteasoma puede identificarse cargando perlas directamente sobre el gel de SDS-PAGE gel y la inmunotinción con anticuerpos específicos de subunidad. Alternativamente, la proteasoma unida a las perlas se puede utilizar en los ensayos proteolíticos utilizando sustratos de proteasoma. Ensayos de crecimiento y tráfico celular de pH. EÍ tráfico de proteínas en las células ocurre a lo largo de los gradientes de pH (es decir, pH de ER de aproximadamente 7.0, pH de Golgi de aproximadamente 6.2-7.0, pH de red trans-Golgi de aproximadamente 6.0, pH de endosomas anterior y posterior de aproximadamente6.5 , pH de lisosomas aproximadamente 4.5). El tráfico, las morfologías de lisosoma/endosoma y los pH luminales también se interrumpen en algunas enfermedades de almacenamiento lisosómico (Ivleva y otros, Biomed Sci 1991; 2: 398-402; Futerman y van Meer, Nat Rev Mol Cell Biol. 2004; 5: 554-65), y pH elevado en el endosoraa ha sido demostrado para promover una inversión del tráfico vesicular de endosomas para Golgi (van Wert y otros, 1995, supra) . La tasa de crecimiento de las células (por ejemplo células de pacientes no tratados, de tipo silvestre, y células de pacientes tratados con chaperona) expuestas a un rango de pH que puede medirse y compararse utilizando un lector de placas fluorescente. Los ensayos de apoptosis y muerte celular (descritos anteriormente) también se pueden utilizar para determinar la sensibilidad del pH sobre la viabilidad celular. Alternativamente, el pH lisosómico y los efectos del pH sobre el tráfico se pueden evaluar utilizando un microscopio confocal. Las sondas fluorescentes sensibles al pH que están endocitosadas por las células se pueden utilizar para medir los rangos de pH en los lisosomas y endosomas (es decir, la fluoresceína es roja a un pH de 5.0 y de azul a verde a un pH de 5.5 a 6.5) . La morfología lisosómica y el pH se pueden comparar en células de pacientes tratados y no tratados con chaperona de tipo silvestre. Este ensayo se puede correr en paralelo con el ensayo del lector de placas para determinar la sensibilidad al pH. Además, el tráfico de las enzimas para la lisosoma se puede evaluar en células a diferentes pH utilizando los experimentos de marcación doble descritos anteriormente. Los grados de endocitosis de las células (células de pacientes tratados y no tratados con chaperona, de tipo silvestre) expuestas a varios pH se pueden medir utilizando puntos Quantum y Azul de Dextrina. Además, los ensayos que describen el uso de análogos de lípido fluorescente (BODIP Y-LacCer, - gangliosidas GMl etc.) se describen en Pagano, Phil Trans R Soc Lond B . 2003; 358-885-91. Actividad de la enzima. Además de evaluar el efecto de las chaperonas sobre la agregación/tráfico, utilizando eí ensayo de localización de enzima descrito anteriormente, también se pueden utilizar los ensayos bioquímicos para determinar si las proteínas son funcionales, y para evaluar los efectos de la función de restauración, una vez que han sido chaperoneadas fuera del ER, por ejemplo, para la lisosoma. Los ensayos de actividad generalmente se diseñan para medir la actividad de una proteína objetivo en la presencia o ausencia de un agente de prueba. Dichos ensayos dependerán de la proteína específica. Por ejemplo, cuando la proteína es una enzima, los ensayos de actividad enzimática intracelular utilizando sustratos que son rutinarios en la técnica se pueden utilizar para evaluar la actividad enzimática. La evaluación ex vivo e in vivo de la actividad enzimática puede realizarse utilizando animales normales o modelos de animales de estados de enfermedad tales como los descritos infra . Métodos de Diagnóstico La presente invención proporciona un método para el diagnóstico de un factor de riesgo, condición o trastorno neurológico asociado con una mutación en una enzima lisosómica. Ya que los efectos neurológicos que ocurren en pacientes con LSD pueden estar presentes en otros trastornos neurológicos, las personas con mutaciones en las enzimas lisosómicas, pero que no han sido diagnosticadas con un LSD no pueden ser efectivamente tratadas. Un ejemplo son individuos con mutaciones heterocigotas en el gen Gba, que están en riesgo de desarrollar, o han desarrollado parkinsonismo, o la enfermedad de Parkinson. Otros síntomas neurológicos ilustrativos que pueden estar asociados con uria enzima lisosómica mutante incluyen la neurodegeneración, regresión neurológica, convulsiones, ceguera, trastornos del movimiento ocular, espasticidad, demencia; retrasos dei desarrollo; síntomas neuromusculares, neuropatía periférica (dolor neuropático) , acroparestesia, deterioros en ?? memoria a largo plazo, eventos cerebrovasculares tales como eventos cerebrovasculares (choque, ataque isquémico temporal) y deglución deteriorada. Los métodos para identificar una mutación o mutaciones en enzimas lisosómicas con bien conocidos en la técnica e incluyen la comparación de la actividad de la enzima de una enzima lisosómica de una muestra biológica de un individuo que exhibe síntomas neurológicos, o un individuo que está en riesgo de desarrollar síntomas neurológicos (tal como un portador para un LSD o uno relacionado con un individuo que tiene un LSD. Los métodos para identificar mutaciones en el nivel molecular, es decir, alteraciones de nucleótido o aminoácido, también son conocidos por los expertos en la técnica, tales como amplificación PCR seguida por secuenciación, polimorfismo de conformación de estructura de cadena individual (SSCP) o utilizando micro arreglos de ADN para muestras grandes (Tennis y otros, Cáncer Epidemiology Biomarkers & Preventio . 2006 ;15: 80-85) Formulación, Dosificación y Administración ds Chaperonas Farmacológicas Especificas La presente invención proporciona que la chaperona farmacológica específica sea administrado en una forma que dosis que permita la administración sistémica, ya que los compuestos necesitan cruzar la barrera cerebral sanguínea para ejercer los efectos sobre las células neuronales. En una modalidad, la chaperona farmacológica específica se administra como monoterapia, preferiblemente en una forma de dosis oral (descrita más adelante) , aunque se contemplan otras formas de dosis. En una modalidad, se contempla que el régimen de dosis deba ser uno que proporcione un nivel pico periódico del compuesto en el plasma del individuo que se está tratando. Otra modalidad puede requerir de niveles de estado estable, constantes del compuesto en el plasma. Esto se puede obtener ya sea mediante administración diaria en dosis divididas, o formulaciones de liberación controlada, o mediante administración menos frecuente de formas de dosis de liberación sostenida. Las formulaciones, dosis y rutas de administración para la chaperona farmacológica específica se detallan a continuación. Formulaciones La chaperona farmacológica específica se puede administrar en una forma adecuada para cualquier ruta de administración, incluyendo por ejemplo, oralmente en la forma de tabletas o cápsulas o líquido, o en la forma de solución acuosa estéril para inyección. Cuando la chaperona farmacológica específica se formula para administración oral, las tabletas o cápsulas se pueden preparar por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales corao agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa) ; llenadores (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato ácido de calcio; lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice) ; disgregantes (por ejemplo, almidón de papa o glicolato de almidón de sodio) ; o agentes de humectación (por ejemplo, lauril sulfato de sodio) . Las tabletas se pueden cubrir por medio de métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentase como un producto seco para constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de uso. Dichas preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbito, derivados de celulosa o ácidos comestibles hidrogenados) ; agentes de emulsificación (por ejemplo, lecitina o acacia) ; vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, esteres oleosos, alcohol etílico, o aceites vegetales fraccionados) ; y conservadores (por ejemplo, hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico) . Las preparaciones también pueden contener sales reguladoras de pH, agentes saborizantes, de coloración o edulcorantes según sea apropiado. Las preparaciones para administración oral pueden ser adecuadamente formuladas para dar liberación controlada o sostenida de la chaperona farmacológica específica. Las formulaciones farmacéuticas de la chaperona farmacológica específica adecuadas para uso parenteral/inyectable en general incluyen soluciones acuosas estériles (en donde son solubles al agua) , o dispersiones o polvos estériles para la preparación extemporánea de las soluciones o dispersiones inyectables. En todos los casos, la forma deber ser estéril y debe ser fluida al grado que exista como inyectable. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos . El portador puede ser un solvente o medio de dispersión conteniendo, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol, y similares) , mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de una capa tal como lecitina, por medio del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de agentes tensioactivos . La prevención de la acción de los microorganismos puede darse mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenes, clorobutanol, fenol, alcohol bencílico, ácido sórbico y similares. En muchos casos, será razonable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr mediante el uso en las composiciones de agentes de retraso de absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando la chaperona farmacológica específica en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los otros ingredientes antes enumerados, según se requiera, seguido por filtración o esterilización terminal. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los varios ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos para la preparación son las técnicas de secado por vacío y liofilización que producen un polvo de ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de la solución previamente filtrada estéril del mismo.
La formulación puede contener una incipiente. Los expedientes farmacéuticamente aceptables que pueden incluirse en la formulación son reguladores de pH tales como regulador de pH de citrato, regulador de pH de fosfato, regulador de pH de acetato, y regulador de pH y bicarbonato, aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos; proteínas, tales como albúmina de suero, colágeno, y gelatina; sales tales como EDTA o EGTA, y cloruro de sodio; liposomas; polivinilpirrolidona; azúcares, tales como dextrina, manitol, sorbitol y glicerol; propilenglicol y polietilenglicol (por ejemplo, PEG-4000, PEG-6000) ; glicerol; glicina u otros aminoácidos; y lípidos. Los sistemas reguladores de pH para uso con la formulación incluyen reguladores de citrato; acetato; bicarbonato; y de fosfato. El regulador de pH de fosfato es una modalidad preferida. Las formulaciones también pueden contener detergente no iónico. Los detergentes no iónicos preferidos incluyen Polisorbato 20, Polisorbato 80, Tritón X-100, Tritón X-114, Nonidet P-40, Octil -glucosida, Octil ß-glucosida, Brij 35, Plurónico, y Tween 20. Administración La ruta de administración de la chaperona farmacológica específica puede ser oral (preferiblemente) o parenteral, incluyendo intravenosa, subcutánea, intrarterial, intraperitoneal, oftálmica, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intradérmica, intracraneana, intraespinal, intraventricular, intrahecal, intracisternal, intracapsular, intrapulmonar, intranasal, transmucosa, transdérmica, o a través de inhalación. La administración de las formulaciones parenteral es antes descritas de la chaperona farmacológica específica puede ser a través de inyecciones periódicas de un bolo de la preparación, o se pueden administrar a través de administración intravenosa o intraperitoneal a partir un depósito que es externo (por ejemplo, una bolsa i.v.) o interno (por ejemplo un implante) . Ver, por ejemplo, patentes de EUA Nos. 4,407,957 y 5,798,113, cada una incorporada equipo referencia. Los métodos y aparatos para la distribución intrapulmonar se describen por ejemplo, en las patentes de EUA Nos. 5,654,007, 5,780,014, y 5,814,607, cada una de las cuales incorpora equipo referencia. Otros sistemas de distribución parenteral útiles incluyen partículas del copolímero de acetato de etilen-vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables, distribución de bombas, distribución celular encapsulado, distribución liposómica, inyección distribuida con aguja, inyección sin aguja, memorizaron, aerosol, electroporación y parche transdérmico. Los dispositivos de inyección sin aguja se describen en las patentes de EUA Nos. 5,879,327; 5,520,639; 5,846,233 y 5,704,911, las especificaciones de las cuales se incorporaran aquí por referencia. Cualquiera de las formulaciones descritas anteriormente se puede administrar utilizando estos métodos. Las inyecciones subcutáneas tienen la ventaja de permitir la autor-administración, lo cual da como resultado una vida media de plasma prolongada comparado con la administración intravenosa. Además, se puede utilizar una variedad de dispositivos diseñados para la conveniencia del paciente, tales como plumas de inyección reclinables y dispositivos de inyección sin aguja, con las formulaciones de la presente mención como se explica aquí. Dosificación La cantidad de chaperona farmacológica específica efectiva para rescatar el mutante endógeno Gba se puede determinar sobres de caso por caso por los expertos en la técnica. Los farmacocinéticos y farmacodinámicos tales como vida media (t /2) , concentración de plasma pico (Cmax) , tiempo para la concentración de plasma pico (tmax) , exposición según medida por el área por debajo de la curva (AUC) , y distribución del tejido para ambos, proteína de reemplazo y chaperona farmacológica específica, así como los datos para la unión de chaperona/Gba farmacológico específico (constantes de afinidad, constantes de asociación y disociación, y valencia) , se pueden obtener utilizando métodos ordinarios conocidos en la técnica para determinar las cantidades compatibles requeridas para estabilizar la proteína de reemplazo, sin inhibir su actividad, y de esta forma conferir un efecto terapéutico. Los datos obtenidos del ensayo de cultivo celular o estudios de animales se pueden utilizar para formular un rango de dosis terapéutica para uso en seres humanos y animales no humanos. La dosis de los compuestos utilizados en los métodos terapéuticos de la presente invención preferiblemente caen dentro de un rango de concentraciones en circulación que incluye la concentración ED50 (efectiva para el 50% de la población probada) pero con poca o nada de toxicidad. La dosis particular utilizar en cualquier tratamiento puede variar dentro de este rango, dependiendo de factores tales como la forma de dosis particular utilizada, la ruta de administración utilizada, las condiciones del individuo (por ejemplo, paciente) , etcétera. Una dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de los ensayos de cultivo celular y formularse en modelos de animal para lograr el rango de concentración en circulación que incluye el IC50. La concentración IC50 de un compuesto es la concentración que logra una inhibición medio- máxima de los síntomas (por ejemplo, como se determina partir de los ensayos de cultivo celular) . Las dosis apropiadas para uso en el individuo particular, por ejemplo en pacientes seres humanos, después puede determinarse más exactamente utilizando dicha información.
Las mediciones de los compuestos en plasma pueden rutinariamente medirse en un individuo tal como un paciente a través de técnicas tales como cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o cromatografía de gas . La toxicidad y la eficacia terapéutica de la composición se puede determinar a través de procedimientos farmacéuticos estándares, por ejemplo en ensayos de cultivo celular o utilizando animales para determinar el LD50 y ED50. Los parámetros LD50 y ED50 son bien conocidos en la técnica, y se refieren a las dosis de un compuesto que es letal para el 50% de una población y terapéuticamente efectiva en el 50% de una población, respectivamente. La relación de dosis entre los efectos tóxico y terapéutico es referida como el índice terapéutico y puede expresarse como la relación: LD5o/ED50. Noche pero les farmacológicos específicos que exhiben grandes índices terapéuticos son preferidos. Las concentraciones óptimas de la chaperona farmacológica específica se determinan de acuerdo con la cantidad requerida para estabilizar e inducir una conformación apropiada de la proteína recombinante, por ejemplo, Gba, in vivo, en tejidos o circulación, sin persistentemente evitar su actividad, biodisponibilidad de la chaperona farmacológica específica en tejido o en circulación, y el metabolismo de la chaperona farmacológica específica en tejido o en circulación. Por ejemplo, cuando la chaperona farmacológica específica es un inhibidor de enzima, la concentración del inhibidor se puede determinar calculando el valor IC50 de la chaperona específica para la enzima. Tomando en consideración la biodisponibilidad y metabolismo del compuesto, las concentraciones alrededor del valor IC50 del compuesto isofagomina para la enzima Gba son de 0.04 µM, indicando que es un inhibidor potente . Terapia de fármaco de combinación La chaperona farmacológica específica se puede utilizar para tratar pacientes con trastornos en el SNC están asociados con mutaciones en las enzimas lisosómicas en combinación con otros fármacos que también se utilizan para tratar los trastornos SNC. Por ejemplo, para pacientes que tienen enfermedad de Parkinson, tales como agonistas del receptor de dopamina, anticolinérgicos, inhibidores COMT, inhibidores de oxidasa B de monoamina. Los agentes ilustrativos incluyen pero no se limitan a levodopa (Sinemetµ; Merck) , Parlodel® (mesilato de bromocriptina; Novartis) ; Permax® (mesilato de pergolida; Eli Lilly) ; Requip® (HCl de ropinirole) , Mirapex® (Diclorhidrato de pramipexol) ; Cogetin® (mesilato de benzotropina) ; Artane® (HCl de trihexifenidil; American Cyanamid) ; Symmetrel® (clorhidrato de amantadina; Du Pont Merck) ; y Eldepryl® (Somerset Pharmaceuticals) .
Terapia de Combinación con Terapia de Gea Aunque aún no han sido aprobadas para tratamiento terapéutico en los Estados Unidos, las terapias de gen (tanto ex vivo como transferencia directa ( para numerosos trastornos genéticos, están bajo investigación. La presente invención también contempla el uso de la chaperona farmacológica específica en combinación con la terapia de gen para reemplazar el gen Gba defectuoso en la enfermedad neurológica. Dicha combinación mejorará la eficacia de la terapia de gen incrementando nivel de expresión del Gba terapéutico in vivo - ya que, además de mejorar el pliegue y el procesamiento de las enzimas mutadas, los chaparrones farmacológicos específicos han demostrado que mejoran el pliegue y el procesamiento de las contrapartes conformacionalmente estables o de tipo silvestre (ver, por ejemplo, U.S. 6,274,597 de Fan y otros, ejemplo 3). La patente de EUA No. 6,309,634 de Bankiewicz describes una terapia de gen para tratar la enfermedad de Parkinson. De acuerdo con el método, los viriones del virus asociado con adeno recombinante (rAAV) se producen in vi tro y comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica descarboxilasa de aminoácido aromático (AADC) . Otro grupo que recientemente inserto el gen para el factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) , también a través de los vectores virales asociados con adeno recombinantes en un modelo de mono de la enfermedad de Parkinson (Eslamboli y Otros, J Neurosci. 2005; 25 (4) : 769-77) . Cualquiera de los métodos para terapia de gen que están o estarán disponibles en la técnica se pueden utilizar para distribución de genes terapéuticos . los métodos ilustrativos se describen a continuación. Para revisiones generales de los métodos de terapia de gen, ver Goldspiel y otros, Clinical Pharmacy 1993, 12:488-505; Wu y Wu, Biotherapy 1991, 3:87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1993, 32:573-596; Mulligan, Science. 1993, 260:926-932; y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 1993, 62:191-217; May, TIBTECH 1993, 11:155-215. Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología AND recombinante que se pueden utilizar se describen en Ausubel y otros, (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer y Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli y otros, (eds.), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY; y Colosimo y otros, Biotechniques 2000; 29 (2) : 314-8, 320-2, 324. El gen que se va administrar para los métodos de la presente invención se puede aislar y purificar utilizando biología molecular ordinaria, microbiología, y técnicas de ADN recombinante dentro de la experiencia la técnica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican la proteína objetivo se pueden aislar utilizando la expresión de ADN recombinante como se describe la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harb r Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I y II (D.N. Glover ed. 1985) ; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed. 1984) ; Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J.E Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & SJ. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B.E Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984) . El ácido nucleico que codifica la proteína puede ser de longitud completo o truncado, mientras el gen codifique una proteína biológicamente activa. El gen Gba identificado y aislado después se puede insertar en un vector de clonación apropiado. Los vectores adecuados para la terapia de gen incluyen virus, bacteriófagos, cósmidos, plásmidos, vectores fúngicos, y otros vehículos recombinantes típicamente utilizados en la técnica que han sido descritos para la expresión en una variedad hospederos eucarióticos y procarióticos, y se pueden utilizar para la terapia de gen así corao para la expresión de proteína simple. En una modalidad específica, el vector es un vector viral. Los vectores virales, especialmente vectores adenovirales se pueden informar en complejos con un anfífilo at iónico, tal corao un líquido catiónico, poliL-lisina (PLL) , y dietilaminoetidextrina (DELAE-dextrina) , que proporcionan una eficiencia incrementada del infección viral de células objetivo (Ver, por ejemplo, PCT/US97/21496 presentada en Nov. 20, 1997, incorporada aquí por referencia. Los vectores virales para uso en la presente invención incluyen vectores derivados de vacuna, virus de herpes, AAV y retrovirus. En particular, los virus de herpes, especialmente virus simple de herpes (HSV, por sus siglas en inglés) , tales como aquellos descritos en la patente de EUA No. 5,672,344, la descripción de la cual se incorpora aquí por referencia, son particularmente útiles para la distribución de un transgen a una célula neuronal. Los vectores AAV, tales como aquellos descritos en las patentes de EUA Nos. 5,139,941, 5,252,479 y 5,753,500 y Publicación PCT WO 97/09441, la descripción de las cuales incorpora aquí, también son útiles ya que estos vectores se integran en el cromosoma hospedero, con un animal en la necesidad de repetir la administración del vector. Para una revisión de los vectores virales en terapia de gen, ver McConnell y otros, Hum Gene Ther. 2004; 15(11): 1022-33; Mccarty y otros, Annu Rev Genet. 2004; 38:819-45; Mali y otros, Clin. Pharmacokinet . 2002; 41(12) :901-1 1; Scott y otros, Neuromuscul Disord. 2002; 12 Suppl l:S23-9. Además, de la patente de EUA No. 5,670,488.
Las secuencias de codificación del gen a Ser distribuido están operablemente enlazadas a las secuencias de control de expresión, por ejemplo, un promotor que dirige la expresión del gen. Como sutiliza aquí, la frase "operativamente enlazado" se refiere a la relación funcional de un polinucleótido/gen con las secuencias reguladora y efectora de los nucleótidos, tales corao promotores, mejoradores, sitios de detención de transcripción y traducción, y otras secuencias de señal. Por ejemplo, el enlace operativo de un ácido nucleico a un promotor se refiere a la relación física y funcional entre el polinucleótido y el promotor de tal forma que la transcripción de ADN se inicia partir del promotor por medio una polimerasa de ARN específicamente reconoce y se une al promotor, y en donde el promotor dirige la transcripción de ARN a partir del polinucleótido. En una modalidad específica, se utiliza un vector en el cual las secuencias de codificación y cualquier otra secuencia deseada se flanquean mediante regiones que promueven la recombinación homologa en un sitio deseado en el genoma, de esta forma proveyendo la expresión de la construcción a partir una molécula de ácido nucleico que le ha sido integrada en el genoma (Koller y Smithies, Proc. Nati. Acad. Sd. USA. 1989, 86:8932-8935; Zijlstra y otros, Nature. 1989, 342:435-438; U.S. Patente de EUA No. 6,244,113 de Zarling y otros; y U.S. Patente de EUA No. 6,200,812 de Pati y otros). Distribución de gen La distribución del vector en un paciente puede ser ya sea directa, en cuyo caso el paciente es directamente expuesto al vector o un complejo de distribución, o indirecta, en cuyo caso, las células primero se transforman con él vector in vi tro, después se trasplantan al paciente. Estos dos métodos son conocidos, respectivamente, como terapia de gen in vivo y ex vivo . Transferencia directa. En una modalidad específica, el vector se administra directamente in vivo, en donde entra en las células del organismo y media la expresión del gen. Esto se puede lograr a través de cualquiera de numerosos métodos conocidos y discutidos anteriormente, por ejemplo, a través de la construcción como parte de un vector de expresión apropiado y su administración por lo que se hace intracelular, por ejemplo, a través de infección utilizando un vector retroviral u otro vector viral defectuoso o atenuado (ver, Patente de EUA No. 4,980,286), o a través de inyección directa de ADN desnudo, o a través del uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de gen; Biolistic, Dupont) ; o recubriendo con lípidos receptores de superficie celular o agentes de transfección, en capitulación en biopolímeros (por ejemplo, polisacárido de poli-ß-l-64-N-acetilglucosamina; ver Patente de EUA No. ,635,493), encarcelación en liposomas, micropartículas o microcápsulas; mediante la administración en el enlace a un péptido u otro ligando conocido para entrar en el núcleo; o a través de la administración en el enlace ligando sujeto a la endocitosis mediada por el receptor (ver, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem. 1987, 62:4429-4432), etc. en otra modalidad, un complejo de ácido nucleico-ligando se puede formar en donde ligando comprende un péptido viral fusogénico para interrumpir los endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosómica, o péptidos 12-mer catiónicos, por ejemplo, derivados de antenapedia, que se puede utilizar para transferir el ADN terapéutico en las células (Mi y otros, Mol. Therapy. 2000, 2:339-47). En aún otra modalidad, el ácido nucleico se puede activar in vivo para la absorción y la expresión específica celular, mediante la activación de un receptor específico (ver, por ejemplo, Publicaciones PCT Nos. WO 92/06180, WO 92/22635, WO 92/20316 y WO 93/14188) . Recientemente se ha utilizado una técnica referida como magnetofección para distribuir vectores a mamíferos. Esta técnica asocia los vectores con las nanopartículas superparamagnéticas para la distribución bajo la influencia de campos magnéticos. Esta aplicación reduce el tiempo de distribución y mejorar la eficacia del vector (Scherer y otros, Gene Therapy. 2002; 9:102-9). Las metodologías de activación y distribución adicionales se contemplan en la distribución de los vectores, a continuación. En una modalidad específica, el ácido nucleico se puede administrar utilizando un portador líquido. Los portadores lípidos pueden asociarse con ácidos nucleicos desnudos (por ejemplo, AND de plásmido) para facilitar el paso a través de las membranas celulares. Los lípidos catiónico, aniónico o neutral se pueden utilizar para este propósito. Sin embargo, los lípidos catiónicos son preferidos porque han demostrado que se asocian mejor con el ADN el cual, generalmente, tiene una carga negativa. Los lípidos Kathy catiónicos también han demostrado que median la distribución intracelular del ADN de plásmido (Feigner y Ringold, Nature. 1989; 337:387). La inyección intravenosa de los complejos del lípido-plásmido catiónicos en ratones ha demostrado que da como resultado la expresión del ADN en el pulmón (Brigham y otros, Am. J. Med. Sci. 1989; 298:278). Ver también, Osaka y otros, J. Pharm. Sci. 1996; 85 (6) : 612-618 ; San y otros, Human Gene Therapy. 1993; 4:781-788; Sénior y otros, Biochemica et Biophysica Acta. 1991; 1070:173-179); Kabanov y Kabanov, Bioconjugate Chem. 1995; 6:7-20; Liu y otros, Pharmaceut . Res. 1996; 13; Remy y otros, Bioconjugate Chem. 1994; 5:647-654; Behr, J-P., Bioconjugate Chem. 1994; 5:382-389; Wyman y otros, Biochem. 1997; 36:3008-3017; Patente de EUA No. 5,939,401 to Marshall y otros; y Patente de EUA No. 6,331,524 de Scheule y otros Los lípidos catiónicos representativos incluyen aquellos descritos, por ejemplo, la patente de EUA No. 5,283,185; y por ejemplo, la patente de EUA No. 5,767,099, las descripciones de las cuales incorporan aquí por referencia. En una modalidad preferida, el líquido catiónico es carbamato de N4 -espermina de colesterilo (GL-67) descrito en la patente de EUA No. 5,767,099. Los lípidos preferidos adicionales incluyen carbamato de N4-esperimidina de colesterilo (GL-53) y carbamato de 1- (N4 -espermina) -2 , 3-dilaurilglicerol (GL-89) . Preferiblemente, para la administración in vivo de vectores virales, se utiliza un tratamiento inmunosupresor apropiado, por ejemplo, vector de adenovirus, para evitar la inmuno-desactivación del vector viral y las células transfectadas. Por ejemplo, las citocinas es inmunosupresoras, tales como interleucina-12 (IL-12) , interferón-? (IFN-?), o el anticuerpo anti-CD4, se puede administrar para bloquear las respuestas inmunes humorales o celulares para los vectores virales. A este respecto, es ventajoso utilizar un vector viral que se crea para expresar un número mínimo de antígenos. Transferencia indirecta. Las células somáticas pueden crearse ex vivo con una construcción que codifica una proteína de tipo silvestre utilizando cualquiera de los métodos descritos anteriormente, y re-implantados en un individuo. Este método se describe en general en WO 93/09222 de Selden y otros. Además, esta tecnología se utiliza en la tecnología ImPACT Propietaria de la Distribución Basada en la Célula, descrita en Payumo y otros, Clin . Orthopaed. y Rela ted Res . 2002; 403 S: S228-S242. En dicha terapia de gen, las células somáticas (por ejemplo, fibroblastos, hepatocitos, o células endoteliales) se remueven del paciente, se cultivan in vi tro, se transfectan con el (los) gen (es) de interés terapéutico, caracterizadas y reintroducidas en el paciente. Ambas células primarias (derivadas de un individuo o tejido y creadas antes del pasaje) , y células secundarias (pasadas in vi tro antes de la introducción in vivo) pueden utilizarse, así como sus líneas celulares inmortalizadas conocidas en la técnica. Las células somáticas útiles para los métodos de la presente invención incluyen pero no se limitan a células somáticas, tales como fibroblastos, queratinocitos, células epiteliales, células endoteliales, células gliales, células neurales, elementos formados de la sangre, células musculares, otras células somáticas que pueden cultivarse, y precursores de célula somática. En una modalidad preferida, las células son fibroblastos o células germinales mesenquiraatosas . Las construcciones de ácido nucleico, que incluyen el gen exógeno y, opcionalmente, ácidos nucleicos que codifican un marcador seleccionable, junto con secuencias adicionales necesarias para la expresión del gen exógeno en células primarias o secundarias receptoras, se utilizan para transferir las células primarias o secundarias en donde el producto codificado se va a producir. Dichas construcciones incluyen pero no se limitan a vectores infecciosos, tales como retroviral, herpes, adenovirus, virus de paperas y polio virus asociados con adenovirus, se pueden utilizar para este propósito. Las células germinales mesenquimatosas (MSC) son células germinales que no producen sangre producidas en la médula ósea. Las MSC se pueden hacer para diferenciar y proliferar dentro de tejidos no sanguíneos especializados. Las células germinales para transfectadas con retrovirus son buenos candidatos para la terapia debido a su capacidad para auto-renovación. Esta habilidad prohibe la administración repetitiva de la terapia de gen. Otra ventaja es que si las células germinales inyectadas llegan al órgano objetivo y después se diferencian, pueden reemplazar las células dañadas o mal formadas en el órgano. Como un ejemplo, la enfermedad de Gaucher, ensayos en la realización de la traducción de células germinales somáticas de un individuo con un retrovirus que codifica el gen Gba, seguido por la devolución de las células germinales corregidas al paciente, en donde forman residencia en la médula ósea y producen células que expresan Gba tales como macrófagos.
Distribución de la chaperona . Cuando se administra en combinación con terapia de gen que codifica un gen terapéutico, la chaperona farmacológica específica se puede administrar de acuerdo con los métodos y formas de dosificación descritas anteriormente. Combinación con inhibidores de sustrato Además, la combinación de chaperonas de molécula pequeña de esta invención con otros inhibidores de sustrato de molécula pequeña, como se describe en los antecedentes, también se contempla. Ya que aún una pequeña reducción en la actividad enzimática lisosómica puede conducir a una elevada acumulación de lípidos, lo cual a su vez, altera el balance de fosfolípidos de la célula e inicia los eventos de señalización que dan como resultado la apoptosis. Los inhibidores de sustrato ilustrativos incluyen NB-DNJ (Miglustat) para la inhibición de glucosiltransferasas específicas de ceramida (reducción de los sustratos glicolípidos) (Kasperzyk y otros, Journal of Neurochemistry 2004. 89: 645-653) . EJEMPLOS La presente invención además se describe por medio de los ejemplos, presentados a continuación. El uso de dichos ejemplos ilustrativos solamente y en ninguna forma limita el alcance y significado de la invención o de cualquier otro término ejemplificado. Igualmente, la invención no está limitada a ninguna modalidad preferida particular descrita aquí. Ciertamente, muchas modificaciones y variaciones de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica después de la lectura de esta especificación. La invención por consiguiente se limitará solamente por los términos de las reivindicaciones anexas tomadas juntas con el completo alcance de los equivalentes a los cuales las reivindicaciones se intitulan. EJEMPLO 1 : Determinación de la actividad Gba incrementada en cerebros de ratones transgénicos L444P tratados con chaparrones farmacológicos especificos L444P es una mutación asociada con enfermedad Gaucher de tipo 2 y 3. Los ratones transgénicos L444P ( homocigotos para el Gba mutado L444P humano en un antecedente nulo de sintasa de glusilceramida) exhiben una deficiencia en la actividad Gba en el cerebro. Sin embargo, debido a la interrupción en el gen de sintasa de glucosilceramida, estos ratones no exhibieron acumulación de GluCer en por ejemplo, raacrófagos. La interrupción de la sintasa de glucosilceramida concomitante es necesaria, ya que los ratones transgénicos L444P hechos previamente murieron dentro de los 3 días de nacimiento debido a daño en la función de la barrera de impermeabilidad en la epidermis. En este experimento, los ratones transgénicos L444P se trataron con isofagomina o C-bencil-isofagomina y los marcadores sustitutos se midieron a los 1, 3, 6 y 12 meses para determinar la eficacia de las chaperonas. Además, los ratones en un período de ineficacia de 2 semanas sin tratamiento con chaperona después de 4 semanas de tratamiento también se evaluaron para la reversión de los marcadores sustitutos de regreso a los niveles vistos en controles no tratados . Tratamiento con chaperona farmacológica específica . Se administró a los ratones isofagomina o C-Bencil-isofagomidna en su agua para beber, ad libi tum . La dosis diaria estimada se basó en el volumen de agua consumida que es de aproximadamente 10 mg/kg/día. Ensayos de actividad Gba en el cerebro . Al final de los meses 1, 3, 6 y 12, los ratones se sacrificaron y se evaluaron para la mejora de la actividad de la enzima Gba en el cerebro. El tejido cerebral se cosecho frescamente (sangre lavada con PBS) , o se descongeló de existencia congelada. El tejido es tejido desmenuzado y homogenizados sobre hielo en 200-500 µl regulador de pH Mcllvaine (MI) (0.25% de taurocolato de sodio, 0.1% de Tritón x-100 en 0. ÍM de regulador de pH de citrato y 0.2M de regulador de pH de fosfato, pH 5.2), y se centrifugó a 10,000 x g. El sobrenadante se recolectó y se puede congelar en este paso. Se agregó aproximadamente 1-10 µl de sobrenadante de los homogenatos de tejido cerebral a una placa de 96 cavidades transparente para el Ensayo de Proteína Micro BCA (Pierce, cat# 23235) para cuantificar la cantidad de proteína total de acuerdo con el protocolo del fabricante. Como un control negativo, se agregaron otros 10 µl en una placa negra, mezclada con 10 µl de 2.5 mM de CBE (2.7 mg Epóxido de Conduritol B en 6.7 ml de regulador de pH) , un inhibidor de la actividad de Gba, y se dejó a temperatura ambiente (TA) por 30 minutos. 50 µl de 3 mM de 4-metal Umbelliferal beta-D-glucosida (4-MU-beta-D-glucosida; hecha fresca, el polvo se disolvió en 0.2 ml de DMSO, después q.s. al volumen apropiado con regulador de pH de MI) , un sustrato Gba, y después se agregó, y la placa negra además se incubó a 37°C durante 1 hora. Después de la incubación, se agregaron 10 µl de sobrenadante a una segunda placa negra, se mezcló con 10 µl de regulador de pH de MI y 50 µl 6 mM de sustrato Gba de 4-MU-beta-D-glucosida, y se incubó a 37°C durante 1 hora. La reacción después se detuvo mediante la adición de 70 µl de 0.2 M d glicina, pH 10.8. La placa se leyó en un lector de placas (contador multinivel Victor2 1420; Wallac) a F60. La actividad beta-glucosa relativa se determine a través de la siguiente ecuación: F6o sin CBE - F46o con CBE) / (muestra A550 - regulador de pH A550) La lectura de F46o se convirtió en 4 -MU nmoles basado en la curva estándar MU y A550 se convirtió en el mg de la proteína con base en la curva estándar de la proteína. Se definió una unidad de la actividad de Gba como nmoles de 4 -MU liberada en una hora. Estudio de Deslave . Para determinar si y en que marco de tiempo los efectos de agua para beber dosificados AT2101 en ratones L444P retrocedieron después del cese del tratamiento, se realizó un estudio de deslave. Nueve ratones L444P de 3 meses de edad se dosificaron a aproximadaraente 10 mg/kg/día durante 4 semanas con un número igual de ratones no tratados como un control. Cuatro ratones tratados y cuatro ratones no tratados se sacrificaron al final de las 4 semanas, y los animales restantes no se trataron adicionalmente con isofagomina, es decir, se les dio agua para beber normal, durante otras dos semanas antes de sacrificarlos y la evaluación de la actividad de Gba en el cerebro. Resultados Actividad Gba en el cerebro . Se observó un aumento significativo en la actividad Gba después de tan solo dos semanas de tratamiento con isofagomina en el cerebro (Figura ÍA) , que persistió durante 4-12 semanas. Notablemente, en el cerebro, el tratamiento con isofagomina dio como resultado un incremento de aproximadamente 1 U/mg en ratones no tratados, a aproximadamente 4.5 U/mg después de 2 y 4 semanas de tratamiento, y además se incrementó aproximadamente 6 U/mg después de 12 semanas (p<0.001). Se espera que la actividad de Gba incrementada persista a 3, 6, y 12 meses y mientras la chaperona se administre. Similarmente, después de dos semanas, los ratones tratados con C-bencil- isofagomina también exhibieron una actividad Gba incrementada en los órganos tales como el bazo, y una tendencia hacia una actividad incrementada en el pulmón y cerebro (datos no mostrados) . Se espera que los incrementos en la actividad de Gba se observen en otros órganos, incluyendo el cerebro, después de un tratamiento adicional, ya que después de dos semanas de tratamiento con AT2206, hubo una tendencia hacia un incremento en el cerebro (datos no mostrados) . Deslave . Similar a lo anterior, después de 4 semanas de tratamiento a 10 mg/kg/día, la actividad de Gba se elevó significativamente en el cerebro de los ratones transgénicos L444P. (Figura IB) . Discusión Los resultados proveyeron la primera indicación de que los niveles fisiológicos de la chaperona son suficientes para cruzar la actividad mejoradas de la barrera del cerebro sanguínea de Gba en el cerebro y en los órganos periféricos (por ejemplo, bazo e hígado) . Esto es sorprendente ya que los agentes periféricamente administrados por lo general tienen que ser administrados en dosis más altas para ser efectivos en el cerebro. En el caso en donde los inhibidores de Gba por debajo del la inhibición se utilizaron como chaperonas, las altas dosis del inhibidor en la periferia serían inhibidoras del Gba mutante, por lo tanto derrotando el propósito de la mejora en la actividad enzimática como se demostró previamente. Se obtuvieron resultados similares en monos tratados con IFG, en donde el IFG se detectó en el siguiente tratamiento IFG. EJEMPLO 2: Restauración del Tráfico Lisosómico Interrumpido en Fibroblastos Gaucher Aunque los fibroblastos Gaucher N370S (de un paciente ser humano) no demostraron acumulación de sustrato (es decir, GluCer) en el citoplasma, estos fibroblastos exhiben una proteína lisosómica anormal y la tinción Gba comparado con fibroblastos de tipo silvestre. El tratamiento de fibroblastos N370S con isofagomina de chaperona farmacológica incrementó la cantidad de Gba visto en el lisosoma y se restauró a un patrón de tinción lisosómica normal para las células. Métodos Cultivo celular. Se cultivaron los fibroblastos N370S (DMN89.15) en DMEM con 10% de FBS y 1% de penn/strep a 37°C con 5% de C02. La línea celular de fibroblasto de tipo silvestre CRL- 2097 de un individuo saludable se utilizó corao un control. Las células se sub-cultivaron de placas de 10 cm en placas de 12 cavidades con cubiertas deslizables. Las células de una placa de 10 cm confluente se diluyeron en 30 ml de medio de cultivo. Se agregó isofagomina o c-bencil-isofagomina de una solución concentrada de 10 mM (5% de DMSO) a cada cavidad de una placa de 12 cavidades en las siguientes concentraciones : C-bencil-isofagomina-control (anticuerpo secundario solamente); no tratado; 0.03 µM; 0.1 µM; 0.3 µM; 1.0 µM; 3.0 µM; y 10.0 µM. Isofagomina-control (anticuerpo secundario solamente) ; no tratado; 10 µM; 30 µM; 100 µM; 1 nM; 3 nM; y 10 nM. Las células se cultivaron durante un total de aproximadamente 6 días. Fijación y Tinción. Las células se lavaron durante 5 minutos en PBS, se fijaron por 15 minutos en 3.7% de paraformaldehído (en PBS) , se volvieron a lavar durante 5 minutos en PBS, y se permeabilizaron con 0.5% de saponina por 5 minutos. Las células después se lavaron con PBS conteniendo 0.1% de saponina, se trataron durante 5 minutos con borohidruro de sodio al 0.1% fresco/0.01% de saponina, y se lavaron 3 veces con PBS con 0.1% de saponina/ 1% BSA por 5 minutos cada vez . Las células se incubaron durante 1 hora con 500 µl de anti-Gba primario (1:200) o solución de anticuerpo de anti-LAMP-1 (1:200; BD Pharmingen, Cat. No. 555798) en PBS con 1% de BSA. La tinción lisosómica utilizando LysoTracker® Red (Cambrex, East Rutherford, NJ) se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la incubación, las células se lavaron 3 veces en 1% de BSA conteniendo 0.1% de saponina en PBS, seguido por incubación con la solución del anticuerpo secundario (1:500; anti-conejo AlexaFluor588 para anti-Gba y anti-ratón IgG AlexaFluor594 para anti- LAMP-I) . Las células se montaron en cubiertas deslizables, se sellaron y se visualizaron inmediatamente. Microscopia Confocal. Las células se visualizaron utilizando un microscopio confocal. La ganancia del canal rojo y verde se estableció en 6 y la energía láser se optimizó utilizando la ventana de intensidad, y no se ajustó para el resto del experimento. Todas las transparencias se analizaron en la misma sesión y todas las imágenes se obtuvieron sin ningún acercamiento utilizando los lentes de 20x y 60x, el agujero pequeño, tamaño de píxel óptimo, un promedio de dos exploraciones, y los canales rojo y verde se adquirieron simultáneamente como en los experimentos previos. Todas las imágenes se desplegaron a la misma intensidad y las gráficas de la intensidad de canal rojo + verde se generaron para cada imagen por medio de la colocación del cursor sobre el número máximo de células.
Las mediciones futuras se pueden hacer calculando una relación de empalme de los píxeles rojo red (LAMP-I) y verde (GBA) . Resultados Los fibroblastos Gaucher N370S que habían sido confluentes durante más de 5 días exhibieron un patrón de tinción lisosómica granular utilizando LysoTrac er® Red (Fig. 2A) comparado con un fibroblasto normal, que tiene un patrón de tinción acentuado (Fig. 2B) . Se mostraron resultados similares para los fibroblastos L444P (datos no mostrados) . La tinción para LAMP-1 lisosómica se muestra tanto en fibroblastos N370S como normales (Figs. 2C-D, respectivamente) . Más LAMP- I se muestra en los fibroblastos Gaucher. El tratamiento con 30.0 µM de isofagomina (AT2201) (Fig. 2G-H) y 3.0 µl de C-bencil-isofagomina (AT2206) (Fig. 2I-J) incrementó la cantidad de Gba en los lisosomas y restableció un patrón de tinción acentuado de lisosoma para Gba y LAMP-1 comparado con un control no tratado (Fig. 2E-F) , como se indica por la tinción doble. Las Figuras 2K-2N muestran los cambios en la tinción lisosómica Gba en fibroblastos Gaucher N370S como sigue: (K) -control (anticuerpo secundario solamente); (L) fibroblastos N370S no tratados; (M) -30 µM de isofagomina; y (N) 3 µM de C-bencil-isofagomina. La tinción de Gba se muestra que localiza las lisosomas en controles tratados con chaperona contra no tratados. Se obtuvieron similares resultados para fibroblastos Gaucher L444P (datos no mostrados) . Esta mejora en la morfología de célula normal con tratamiento con chaperona es debido a una disminución en la cantidad o acumulación de Gba mutante, posiblemente en la forma de agregados, en el ER y/o citosol. Por consiguiente, esta estrategia podría aliviar los síntomas del SNC en pacientes con Parkinson con mutaciones N370S heterocigotas, o pacientes Gaucher heterocigotos con mutaciones N370S homocigotas y parkinsonismo/demencia. EJEMPLO 3 : Incremento de Proteinas Poliubiquitinadas con Tratamiento con Chaperona en Fibroblastos de Gaucher; Restauración de la Trayectoria de Degradación de Proteasoma La proteína anti-poliubiquitinada (PUP) y la marcación anti-Gba de fibroblastos humanos saludables se comparó con aquellas en los fibroblastos de un paciente Gaucher que tiene la mutación Gba L444P, y fibroblastos de paciente Gaucher que tiene mutación Gba N370S. Métodos Cultivo de células. Se cultivaron fibroblastos L444P Gaucher (línea celular GM10915) ; fibroblastos N370S Gaucher (línea celular DMN89.15); y fibroblastos de un individuo saludable (CRL-2097) en DMEM con 10% de FBS y 1% de PS a 37C con 5% de C02. Las células se sub-cultivaron de placas de 10 cm en placas de 12 cavidades con cubiertas deslizables estériles. Las células N370S de un matraz T-75 confluente se diluyeron 1:6 y se cultivaron durante otros 4 días . Se agregaron chaperonas de isofagomina o C-bencil-isofagomina de una solución concentrada de 10 mM (5% de DMSO) a cada fila de una placa de 12 cavidades a las siguientes concentraciones . C-bencil-isofagomina-no tratada; control (anticuerpo secundario solamente); 0.03 µM; 0.1 µM; 0.3 µM; 1.0 µM; 3.0 µM; y 10.0 µM . Isofagomina-no tratado; control (anticuerpo secundario solamente) ; 10 µM; 30 µM; 100 µM; 1 nM; 3 nM; y 10 nM. Fijación y tinción. Las células se lavaron una vez en PBS por 5 minutos, seguido por fijación durante 15 minutos en 3.7% de paraformaldehído fresco. Las células después se lavaron otra vez en PBS por 5 minutos y se trataron durante 5-10 minutos con 0.1% de borohidruro de sodio fresco. Las células se lavaron tres veces en PBS con 1% de BSA (5 min cada vez) antes de la tinción. Las células se incubaron durante 1 hora con 500 µl de los siguientes anticuerpos primarios (diluidos 1:200 en PBS con 1% de BSA) : 1. Anticuerpo monoclonal de ratón para el clon FK1 de proteínas ubiquitinadas (AFFINITI Research Products No. Cat. PW 8805) 2. Anticuerpos anti-Gba de conejo comercialmente disponibles, por ejemplo 8E4. Las células después se lavaron tres veces con PBS con 1% de BSA, seguido por incubación durante 2 hora con una dilución de 1:500 de los siguientes anticuerpos secundarios: 1. IgG anti-ratón de cabra (cadena µ) AlexaFluor568 (Molecular Probes Cat. No. A21043); 2. IgG anti-conejo de cabra (H+L) AlexaFluor488 altamente absorbida en forma cruzada (Molecular Probes Cat . No. Al 1034) Las células se lavaron tres veces en PBS con BSA, montado y almacenado a 4°C antes de la visualización. Resultados Los experimentos iniciales indicaron que la concentración de proteínas poliubiquitinadas (PUP) en células es mayor (muy intensa) en células sanas (Figs. 3A y 3C) que en N370S Gaucher (Figs. 3D y 3F) y fibroblastos L444P (Figs. 3G y 31) en donde la tinción es mucho menos intensa) . La agregación de proteína se sabe que inhibe la trayectoria de ubiquitina/proteasoma. Por consiguiente, la disminución de la agregación utilizando chaperonas tiene un efecto positivo en la trayectoria de degradación mediada por proteasoma.
Discusión Los pacientes Gaucher con la mutación L444P tienen una participación del SNC extensiva. Esto puede deberse al hecho de que la enzima mutante L444P se sabe que es mucho más inestable que, por ejemplo, el mutante N370S, haciendo esto aún más probable que los agregados se formarán, y por lo tanto inhibiendo la trayectoria de ubiquitina/proteasoma (Tsuji y otros, N. Eng. J. Med. 1987; 315: 570). Muchas otras enfermedades neurodegenerativas son causadas por mutaciones que resultan en la acumulación de proteínas ubiquitinadas, y además se ha reportado que los agregados de proteína pueden directamente afectar la trayectoria de ubiquitina/proteasoma e inducir la expresión de mediadores inflamatorios (Li y otros, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2003; 35: 547-552). Si se estabiliza el L444P de ratón utilizando una chaperona farmacológica específica, la tensión sobre la trayectoria de ubiquitina/proteasoma se alivia a través del tráfico de Gba incrementado para la lisosoma, por lo tanto alargando la vida media del mutante Gba, en lugar de ser degradado en el ER transitaría hacia la lisosoma. Esto explica la tinción PUP incrementada en fibroblastos normales comparado con los fibroblastos Gaucher. Otras mutaciones Gba que clínicamente no resultan en síntomas del SNC abiertos (es decir, N370S) aún pueden resultar en la acumulación de la proteína mutante en el ER y citosol, causando tensión adicional en la trayectoria de ubiquitina/proteasoma o la interrupción en las neuronas por la disminución de la habilidad de las células para monoubiquitinar proteínas. La presente invención no está limitada en alcance por las modalidades específicas descritas en la presente. De hecho, varias modificaciones de la invención además de las descritas aquí serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y las figuras anexas. Dichas modificaciones pretenden caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Además se entiende que todos los valores son aproximados, y se proveen para la descripción. Las patentes, solicitudes de patente, publicaciones, descripciones de productos, y protocolos se citan a lo largo de esta solicitud, las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad para todos los propósitos. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (20)

  1. REIVINDICACIONES
  2. Habiéndose descriuo la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para el tratamiento de un trastorno neurológico en un individuo, caracterizado porque el trastorno neurológico está asociado con una mutación en el gen que codifica una enzima lisosómica, el método comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de una chaperona farmacológica específica que se une a la enzima lisosómica. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el individuo es homocigoto para la mutación.
  3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 15 caracterizado porque el individuo es hemicigoto, heterocigoto o un compuesto heterocigoto para la mutación.
  4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la mutación es un mutante conformacional.
  5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la chaperona incrementa el tráfico de la enzima mutante a partir del retículo endoplásmico y/o restaura la actividad de la enzima.
  6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la mutación da como resultado cantidades en incremento de, o agregación, de otra sustancia celular.
  7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6 caracterizado porque la sustancia celular es un lípido u otra proteína.
  8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima lisosómica es glucocerebrosidasa y el trastorno neurológico es enfermedad de Parkinson o parkinsonismo.
  9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la enfermedad de Parkinson es la enfermedad de Parkinson de inicio temprano.
  10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 15 caracterizado porque la chaperona farmacológica específica es un inhibidor de la enzima lisosómica.
  11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el inhibidor es un inhibidor reversible .
  12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el inhibidor es un inhibidor competitivo.
  13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la chaperona farmacológica específica es isofagomina o (5R, 6R, 7S, 8S) -5-hidroximetil-2-octil-5,6,7, 8-tetrahidroimidazo [1,2-a] piridin-6 , 7, 8-triol .
  14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13 caracterizado porque el individuo es heterocigoto u homocigoto para una mutación N370S.
  15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el individuo es heterocigoto para una mutación 84GG.
  16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el individuo es heterocigoto para una mutación R496H.
  17. 17. Un método para diagnosticar un trastorno neurológico asociado con una enzima lisosómica mutante, caracterizado porque comprende clasificar un individuo que exhibe síntomas neurológicos para una mutación en una o más enzimas lisosómicas.
  18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la mutación es una mutación conformacional .
  19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la clasificación es la determinación de la actividad enzimática incrementada a partir de una muestra biológica del individuo comparada con una muestra biológica de un individuo sano.
  20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el trastorno neurológico es parkinsonismo o enfermedad de Parkinson.
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