MX2007015416A - Metodos para la identificacion, evaluacion y tratamiento de pacientes con terapia contra cancer. - Google Patents

Metodos para la identificacion, evaluacion y tratamiento de pacientes con terapia contra cancer.

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Abstract

La presente invencion se dirige a la identificacion de marcadores predicativos que pueden utilizarse para determinar si los pacientes con cancer presentan o no respuesta clinica a un esquema terapeutico antes de tratamiento. En particular, la presente invencion se dirige al uso de ciertos marcadores individuales y/o combinaciones de marcadores predictivos, en donde la expresion de los marcadores predictivos se correlaciona con la respuesta o no respuesta a un esquema terapeutico. Asi pues, mediante el examen de los niveles de expresion de los marcadores predictivos individuales y/o marcadores predictivos que consiste en una serie de marcadores, es posible determinar, en un entorno clinico, si un agente terapeutico, o una combinacion de agentes, tiene la posibilidad de reducir la velocidad de crecimiento de tumores.

Description

MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN, EVALUACIÓN Y TRATAMIENTO DE PACIENTES CON TERAPIA CONTRA CÁNCER REFERENCIA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio ante la Solicitud Provisional US No. 60/688,634 presentada el 8 de junio dé 2005, el contenido de la cual se incorpora en la presente para esta referencia en su totalidad.
ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN Uno de los problemas continuos con el tratamiento en pacientes con cáncer es las diferencias individuales en las respuestas a los tratamientos. Con un índice terapéutico estrecho y el potencial tóxico de muchos tratamientos anticáncer disponibles, estas respuestas diferenciales contribuyen potencialmente a los pacientes que sufren esquemas de tratamiento innecesarios, ineficaces e incluso potencialmente peligrosos. Si un tratamiento diseñado podría ser optimizado para tratar pacientes individuales, estas situaciones podrían ser reducidas o incluso eliminadas. Además, el tratamiento diseñado, elegido puede proporcionar un tratamiento general más enfocado, exitoso para el paciente. Por consiguiente, existe la necesidad de identificar pacientes de cáncer particulares que respondan particularmente a tratamientos contra cáncer particulares, solos o en combinación con otras quimioterapias. Por tanto, seria benéfico proporcionar el diagnóstico, etapificación, pronóstico y monitorización de pacientes con cáncer, que incluye, por ejemplo pacientes de cáncer hematológico (por ejemplo mieloma múltiple, leucemias, linfoma, etcétera) así como pacientes de cáncer de tumor solido (por ejemplo pulmón, mama, próstata, ovario, colon, riñon, hígado) que se beneficien de tratamientos de inhibición de cáncer particulares; o para indicar una predisposición de tales pacientes a la no respuesta a tratamientos, dando como resultado así medidas preventivas apropiadas.
La inhibición del proteasoma representa una estrategia importante en tratamiento contra cáncer. El proteasoma es un complejo multienzimatico presente en todas las células que desempeña una función en la degradación de proteínas involucradas en la regulación del ciclo celular. Por ejemplo, King y col., demostraron que la vía de la ubiquitma-proteasoma desempeña una función primordial en la regulación del ciclo celular, el crecimiento neoplásico y metástasis. Diversas proteínas reguladoras clave, incluidas p53, ciclinas y las cmasas p21 y p27KIP1, dependientes de ciclina, se degradan temporalmente durante el ciclo celular mediante la vía de la ubiquitina-proteasoma . La degradación ordenada de estas proteínas es necesaria que la célula progrese a través del ciclo celular y sufra mitosis. Ver, por ejemplo, Science 274: 1652-1659 (1996). Más aún, la vía de la ubiquitina-proteasoma es necesaria para la regulación transcripcional. Palombella y col., enseñan que la activación del factor de transcripción NF-kB es regulada por la degradación mediada por proteasoma de la proteína inhibidora IkB. Ver la Solicitud de Patente Internacional Publicación No. WO 95/25533. A su vez, NFkB desempeña una función importante en la regulación de los genes involucrados en las respuestas inmune e inflamatoria. Por ejemplo, Read y col., demostraron que la vía de la ubiquitina-proteasoma es necesaria para la expresión de las moléculas de adhesión celular, como puede ser E-selectina, ICAM-1 y VCAM-1. Ver Immuní ty 2 : 493-506 (1995). Otros hallazgos adicionales soportan la función de la inhibición de proteasoma en tratamientos contra cáncer, como Zetter encontró que las moléculas de adhesión celular están involucradas en la metástasis de tumor y angiogénesis in vivo, dirigiendo la adhesión y extravasación de las células tumorales y desde la vasculatura a sitios de tejido distante dentro del cuerpo. Ver, por ejemplo Semmars m Cáncer Biology 4: 219-229 (1993) . Ademas Beg y Baltimore, encontraron que NF-kB es un factor antiapoptosico, y la inhibición de la activación de NF-kB hace a las células mas sensibles al estrés ambiental y a los agentes citotoxicos. Ver Science 274: 782 (1996) .
El primer inhibidor de proteasoma descrito con actividad antitumor, bortezomib (acido N-pirazincarbonil-L-fenilalamn-L-leucinboromco, PS-341) (VELCADE® para inyección, Millenium Pharmaceuticals, Inc., Cambridge, MA; Johnson & Johnson Pharmaceutical Research and Development L.L.C.) ha sido aprobado para el tratamiento de mieloma múltiple reincidente. Actualmente estudios clínicos están en curso en indicaciones adicionales que incluye canceres hematologicos adicionales asi como tumores solidos. Estos y otros inhibidores de proteasoma éster y acido borónico peptido han sido descritos por Adams y col., ver, por ejemplo, la Patente US No. 5,780,454 (1998), la Patente US No. 6,066,730 (2000), la Patente US No. 6,083,903 (2000). Estas describen el uso de los compuestos ester boronico acido boronico descritos para reducir la tasa de degradación de la proteína del músculo, para reducir la actividad de NF-kB en una célula, para reducir la tasa de degradación de la proteína p53 en una célula, para inhibir la degradación de ciclina en una célula, para inhibir el crecimiento de una célula de cáncer y para inhibir la adhesión de las células dependientes de NF-kB.
Bortezomib especifica y selectivamente inhibe el proteasoma mediante la unión estrecha (Ki = 0.6 nM) a uno de los sitios activos de la enzima. Bortezomib es selectivamente citotóxico y tiene un patrón novedoso de citotoxicidad en ensayos m vi tro e m vi vo del Instituto Nacional de Cáncer (NCI) . Adams J. y col., Cáncer Res 59: 2615-22. (1999). Además, Bortezomib tiene actividad citotóxica en una variedad de modelos de tumor de xenoinjerto. Teicher BA, y col., Clin Cáncer Res . 5: 2638-45 (1999) . Bortezomib inhibe la activación del factor nuclear -KB (NF-KB) , atenúa el crecimiento celular mediado por ?nterleuc?na-6 (IL-6) y tiene un efecto apoptósico directo, y posiblemente un efecto antiangiogénico . Además, Bortemozíb es directamente citotóxico para células de mielo en cultivo, independiente de su estado p53. Ver, por ejemplo, Hideshi a T, y col., Cáncer Res . 61: 3071-6 (2001). Además de un efecto citotoxico directo de Bortezomib sobre las células de mieloma, Bortezomib inhibe la expresión del factor de necrosis tumoral alfa (molécula de adhesión intercelular estimulada por TNF-a-1 (ICAM-1) por células de mieloma y la expresión de ICAM-1 y la molécula de adhesión de células vasculares-1 (VCAM-1) en células estromales de médula ósea (las BMSC) dando como resultado adherencia disminuida de las células de mieloma y, en consecuencia, secreción de citocinas disminuida. T, , y*» col., Oncogene-..X .20:.,. 4519-27 (2001). Mediante la inhibición de las interacciones de las células de mieloma, con la médula ósea circundante, Bortezomib puede inhibir el crecimiento y supervivencia del tumor, así como la angiogénesis y la migración de las células tumorales. El efecto antineoplásico de Bortezomib puede involucrar diversos mecanismos distintos que incluye la inhibición de las vías de señalización del crecimiento celular, la desregulación del ciclo celular, la inducción de apoptósis y la inhibición de la expresión de las moléculas ' de adhesión" 'celular. Notablemente, Bortezomib induce apoptósis en células que sobre expresan linfoma de células B 2 (Bcl-2), un rasgo genético que confiere crecimiento no regulado y resistencia a la quimioterapéutica tradicional. McConkey DJ, y col., The Proteasome as a new drug target in metasta tic prosta te cáncer. la Annual Genitourinary Oncology Conference, Houston, TX. Resumen (1999) .
Los esteroides glucocorticoides tienen la capacidad de ocasionar muerte apoptósica de muchas variedades de células, y una selección de esteroides glucocorticoides consecuentemente ha sido utilizado en el tratamiento de diversas malignidades, que incluye malignidades linfoides, y tratamientos combinados en tumores sólidos. Por ejemplo, el tratamiento óptimo para mieloma reincidente no está establecido, pero comúnmente se utiliza una dosis alta de dexametazona . Ver, por ejemplo, Kumar A, y col, Lancet Oncol ; 4: 293-304 (2003); Alexaninan R, y col., Ann Intern Med. 105: 8-11 (1986); Friedenberg WR, y col., Am J. Hema tol . 36: 171-75. (1991). Las tasas de repuestas con este tratamiento son semejantes a las de vincristina, doxorubicina y dexametasona (VAD) , y se estima que el componente dexametasona representa el 85% del efecto VAD. Ver, por ejemplo, Alexanian R, y col., Blood. 80: 887-90 (1992); Sonneverld P, y col., Br. J. Haema tol . 115: 895-902. (2001). La quimioterapia en dosis altas seguida por trasplante de células primordiales autólogas mejora la supervivencia del paciente, pero en la mayoría de los casos la enfermedad reincide. Attal M y col., N Engl . J Med. 335: 91-97 (1996), Child JA, y col., N. Engl . J Med. 348: 1875-83 (2003) .
Además del uso de dexametasona, corticosteroides adicionales han demostrado uso en tratamientos de cáncer, incluida la hidrocortisona en tratamientos combinados para cáncer de próstata, predisolona [sic] en leucemia, prednisolona en tratamiento de linfoma y triamcinolona ha demostrado recientemente alguna actividad anticáncer. Ver, por ejemplo, Scholz M. y col., J. Urol . 173: 1947-52. (2005); Sano J. , y col., Res Vet Sci . (Mayo 10, 005); Zinzani PL. y col., Semin Oncol . 32 (1 supl. 1): S4-10. (2005); y Abrams, MT y col., J. Cáncer Res Clin Oncol . 131: 347-54 (2005). Se piensa que la transcripción génica resultante del tratamiento con glucocorticoides da como resultado la muerte apoptósica y efecto terapéutico. El análisis de las líneas de células sensibles y resistentes ha demostrado patrones de expresión génica diferenciales, sugiriendo diferencias de expresión para tasas de respuestas variadas al tratamiento de glucocorticoides. Ver, por ejemplo, Thompson E. B., y col., Lipids . 39, 821-5 (2004), y las referencias citadas en ésta.
Aunque se observan avances en el desarrollo de los tratamientos contra cáncer exitosos, respuestas de pacientes individuales siguen demostrando subseries de repuestas de pacientes a algún tratamiento particular. Hemos hecho estudios de análisis de la expresión génica para evaluar poblaciones de pacientes que sufren tratamiento de glucocorticoides y terapia de inhibición de proteasoma. Los análisis fueron realizados para identificar marcadores predictivos asociados con pacientes particulares que responden bien al tratamiento (respondedores) con glucocorticoides y/o inhibidor de proteasoma contra aquellos pacientes que no responden al tratamiento (no respondedores) con un glucocorticoide y/o inhibidor de proteasoma.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa, en parte, en la identificación de marcadores individuales y series de marcadores que pueden utilizarse para determinar si un tumor puede ser tratado eficazmente por tratamiento con un tratamiento para la inhibición de proteasoma y/o tratamiento de glucocorticoide. Por ejemplo, las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente pueden utilizarse para determinar si un paciente responderá o no responderá a un agente terapéutico para la inhibición de proteasoma. Además, las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente pueden utilizarse para determinar si un paciente responderá o no responderá a un agente terapéutico glucocorticoide. Con base en estas identificaciones, la presente invención proporciona, sin limitación: 1) los métodos y composiciones para determinar si un tratamiento de inhibición de proteasoma y/o un tratamiento con glucocorticoide será o no eficaz para detener o hacer más lento el crecimiento de tumor y el tratamiento del paciente; 2) los métodos y composiciones para monitorizar la eficacia de un tratamiento de inhibición de proteasoma (un agente inhibidor de proteasoma o una combinación de agentes) y/o un tratamiento con glucocorticoide utilizado para el tratamiento de tumores; 3) los métodos y composiciones para tratamientos de tumores que comprendan el tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide; y 4) los métodos y composiciones para identificar agentes terapéuticos específicos y combinaciones de agentes terapéuticos que sean eficaces para el tratamiento de tumores en pacientes específicos .
Los marcadores de la presente invención, cuya expresión se correlaciona con la respuesta a un agente, se identifican en la Tabla ÍA, la Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3. Mediante el examen de la expresión de uno o más de los marcadores o series marcadores identificados en un tumor, es posible determinar el agente terapéutico o combinación de agentes terapéuticos que con mayor probabilidad reducirá la tasa de crecimiento de las células cancerosas. Mediante el examen de la expresión de uno o más de los marcadores identificados o series de marcadores en un cáncer, también es posible determinar el agente terapéutico o combinación de agentes que será menos probable para reducir la tasa de crecimiento de las células cancerosas. Por el examen de la expresión de uno o más de los marcadores o series de marcadores identificados, por tanto, es posible eliminar agentes terapéuticos ineficaces o inapropiados. Lo que es importante señalar es que estas determinaciones pueden hacerse en cada paciente y cada agente. Así pues, es posible determinar si un esquema terapéutico específico es probable que beneficie a un paciente particular o tipo de paciente y/o si un esquema específico debe continuarse.
La presente invención se dirige a los métodos para identificar y/o seleccionar un paciente de cáncer que responda a un esquema terapéutico. En particular, los métodos se dirigen a identificar o seleccionar a un paciente de cáncer que responda a un esquema terapéutico que comprenda tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide. Además se proporcionan los métodos para identificar a un paciente que no sea sensible a tal esquema de tratamiento. Estos métodos por lo regular incluyen la determinación del nivel de expresión de uno o más marcadores predictivos en el tumor de un paciente (por ejemplo, las células cancerosas del paciente) , la comparación del nivel de expresión con un nivel de expresión de referencia y la identificación si la expresión en la muestra incluye un patrón o perfil de expresión de un marcador o serie de marcadores predictivos, seleccionados que correspondan a la respuesta o no respuesta al tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide.
Además, los métodos que se proporcionan incluyen los métodos terapéuticos que además incluyen el paso de iniciar, continuar o comenzar, o detener, descontinuar o interrumpir un tratamiento en consecuencia donde un perfil de marcadores predictivo del paciente indica que el paciente responderá o no responderá al esquema terapéutico de inhibición de proteasoma y/o glucocorticoide. En otro aspecto, se proporcionan los métodos para el análisis de un paciente que todavía no está en tratamiento con inhibición de proteasoma o glucocorticoide y la identificación y predicción que el paciente no responderá al agente terapéutico y tal paciente no debe ser tratado con el tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide cuando el perfil de marcadores del paciente indique que el paciente no responderá. Así pues, los métodos proporcionados de la invención pueden eliminar el uso ineficaz o inapropiado de esquemas de tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento de glucocorticoide.
Además se proporcionan los clasificadores que pueden utilizarse para desarrollar una prueba diagnostica o un arreglo legible útil para identificar a los pacientes que responderán o no responderán al tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide. Las sondas o péptidos identificados en un clasificador de la invención pueden estar incluidos en una prueba diagnostica o pronostica para seleccionar un tratamiento, por ejemplo, el tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide o una prueba que se utilice para determinar la continuación del tratamiento, por ejemplo, tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide.
Los métodos adicionales incluyen métodos para determinar la actividad de un agente, la eficacia de un agente o identificar nuevos agentes terapéuticos o combinaciones. Estos métodos incluyen los métodos para identificar un agente útil como un inhibidor de proteasoma y/o un inhibidor de glucocorticoide [sic], para tratar un cáncer, por ejemplo un cáncer hematológico (por ejemplo mieloma múltiple, leucemias, linfoma, etcétera) o cáncer a partir de un tumor sólido (por ejemplo en pulmón, mama, próstata, ovario, colon, riñon o hígado) , con base en su capacidad para afectar la expresión de los marcadores en una serie de marcadores de la invención, por ejemplo, un inhibidor que disminuye o aumenta el nivel de expresión de un marcador o marcadores proporcionado como regulado hacia arriba o regulado hacia abajo, respectivamente, en una serie predictiva para respuesta a la inhibición de proteasoma del cáncer sería un inhibidor candidato para el cáncer. En otro ejemplo, un inhibidor que disminuya o aumente el nivel de expresión de un marcador o marcadores proporcionado como regulado hacia arriba o regulado hacia abajo, respectivamente, en una serie predictiva para respuesta a inhibición de glucocorticoide del cáncer sería un candidato inhibidor para el cáncer.
La presente invención también se dirige a los métodos de tratamiento de un paciente con cáncer, con un esquema terapéutico, en particular un tratamiento inhibidor de proteasoma (por ejemplo un agente inhibidor de proteasoma solo o en combinación con un agente adicional como un agente quimioterapéutico) y/o un esquema terapéutico con glucocorticoide (un agente glucocorticoide, solo o en combinación con un agente adicional), que incluye el paso de seleccionar a un paciente cuyo perfil de marcadores predictivo indique que el paciente responderá al esquema terapéutico y el tratamiento del paciente con glucocorticoide.
Métodos adicionales incluyen la selección de pacientes que sean probables de experimentar respuesta o tiempo aumentado para la progresión en tratamiento con un tratamiento de cáncer (por ejemplo tratamiento de inhibición de proteasoma, tratamiento con glucocorticoide) . Además se proporciona los métodos para la selección de un paciente que tenga enfermedad agresiva y tiempo más rápido para la progresión.
Métodos adicionales incluyen un método para evaluar si tratar o pagar por el tratamiento de cáncer, por ejemplo, cáncer hematológico (por ejemplo mieloma múltiple, leucemia, linfoma, etcétera) o cáncer de un tumor sólido (por ejemplo en pulmón, mama, próstata, ovario, colon, riñon o hígado) , mediante la revisión del perfil de marcadores predictivo de un paciente para respuesta o no respuesta al tratamiento de inhibición de proteasoma y/o glucocorticoide.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en la presente tienen el mismo significado que los comúnmente entendidos por un experto en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque los métodos y materiales semejantes equivalentes a los descritos en la presente pueden utilizarse en la práctica o la prueba de la presente invención, métodos y materiales preferidos están descritos en la presente. El contenido de todos los registros de acceso a la base de datos (por ejemplo, el identificador publico representativo ID de los archivos de anotaciones Affymetrix HG-133A Entrez, GenBank, RefSeq) mencionados a lo largo de esta solicitud (incluidas las tablas) también se incorporan por este medio para referencia. El contenido de los archivos que describen las secuencias de sondas Affymetrix HG-133A y las secuencias de sondas HG-133B, ambos archivos FASTA, con fecha 9 de junio de 2003 (Affymetrix, Inc., Santa Clara CA) , también por este medio se incorporan para referencia. En el caso de conflicto, regirá la presente especificación, incluidas las definiciones.
Los artículos "un" y "uno" se utilizan en la presente para referirse a uno o a más de uno (es decir, por lo menos) del objeto gramatical del artículo. Como un ejemplo, "un elemento" significa por lo menos un elemento y puede incluir más de un elemento.
Un "marcador" es un polímero que se encuentra en estado natural correspondiente a por lo menos uno de los ácidos nucleicos o proteínas asociados con los identificadores de la serie de sondas Affymetrix listados en cualquiera de las Tablas ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3. Por ejemplo, marcadores incluye, sin limitación, secuencias reconocidas por los identificadores de las sondas y series de sondas Affymetrix, hebras sentido y antisentido de DNA genómico (es decir, incluidos cualquiera de los intrones que ocurren en estos), RNA generado por transcripción de DNA genómico (es decir, antes de empalme), RNA generado por empalme de RNA transcrito del DNA genomico, y proteínas generadas por la traducción del RNA empalmado (es decir, incluidas las proteínas antes y después de clivaje de regiones normalmente clivadas como secuencias de señales de transmembrana) . Cuando se utiliza en la presente, un "marcador" también puede incluir un cDNA preparado por transcripción inversa de un RNA generado por transcripción de DNA genomico (incluido el RNA empalmado) . Una "serie de marcadores" es un grupo de marcadores, que contiene dos o mas marcadores predictivos de la invención. Los marcadores de la presente invención incluyen marcadores predictivos identificados en la Tabla ÍA, IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3; como identificados por el identificador de la serie de sondas particular, identificador público representativo, titulo, símbolo génico, y/o identificador del gen Entrez, incluye el nucleótido representativo y/o la secuencia de protema o fragmento de ésta que corresponde al identificador .
Un "marcador predictivo" cuando se utiliza en la presente incluye un marcador que ha sido identificado por tener expresión diferencial en células de tumor de un paciente y además que la expresión es característica de un paciente que responde en forma positiva o negativa al tratamiento con un esquema de inhibidor de proteasoma y/o esquema de glucocorticoide . Por ejemplo, un marcador predictivo incluye un marcador que demuestra mayor expresión en un paciente que no responde; alternativamente un marcador predictivo incluye un marcador que demuestra mayor expresión en un paciente que responde. Del mismo modo, un marcador predictivo está destinado para incluir aquellos marcadores que demuestran menor expresión en un paciente que no responde asi como aquellos marcadores que demuestran menor expresión en un paciente que responde. Así pues, cuando se utiliza en la presente, marcador predictivo está destinado para incluir todas y cada una de estas posibilidades, y además puede incluir cada marcador único individualmente como un marcador predictivo; o de otro modo puede incluir una o más o todas las características colectivamente cuando re hace referencia a "marcadores predictivos" o "series de marcadores predictivos" . Una serie de marcadores predictivos también puede ser conocida como un "clasificador" .
Cuando se utiliza en la presente, "que se encuentra en estado natural" se refiere a una molécula (por ejemplo RNA, DNA, proteína, etcétera) que se encuentra en la naturaleza (por ejemplo codifica una proteína natural, una proteína naturalmente producida, etcétera) .
El término "sonda" se refiere a cualquier molécula que sea capaz de unirse selectivamente a una molécula diana específicamente propuesta, por ejemplo un marcador de la invención. Las sondas pueden ser sintetizadas por un experto en la técnica o derivadas de preparaciones biológicas apropiadas. Para propósitos de detección de moléculas diana, las sondas pueden ser específicamente diseñadas para que sean etiquetadas, como se describe en la presente. Los ejemplos de moléculas que pueden utilizarse como sondas incluye, mas no se limita a, RNA, DNA, proteínas, anticuerpos y monomeros orgánicos.
El nivel de expresión "normal" de un marcador es el nivel de expresión del marcador en las células en un entorno semejante o situación de respuesta, en un paciente no afligido con cáncer. Un nivel de expresión normal de un marcador también puede referirse al nivel de expresión de una "muestra de referencia", (por ejemplo muestra de individuos sanos que no tengan la enfermedad asociada con el marcador) . Una expresión de una muestra de referencia puede estar compuesta de un nivel de expresión de uno o más marcadores de una base de datos de referencia. De otro modo, un nivel de expresión "normal" de un marcador es el nivel de expresión del marcador en células no tumor en un ambiente semejante o situación de respuesta del mismo paciente del cual se obtiene el tumor .
"Expresión diferencial" de un marcador se refiere a la expresión de un marcador que varia en nivel entre pacientes. Además, en esta invención nos referimos a un marcador como "diferencialmente expresado" cuando su nivel de expresión se correlaciona con, o de otro modo es indicativo de, respuesta o no respuesta al tratamiento. "complementario" se refiere al concepto amplio de la complementariedad de las secuencias entre regiones de dos hebras de ácido nucleico o entre dos regiones de la misma hebra de ácido nucleico. Se sabe que un residuo de adenina de una primera región de ácido nucleico es capaz de formar enlaces de hidrógeno específicos ("apareamiento de bases") con un residuo de una segunda región de ácido nucleico que sea antiparalela a la primera región si el residuo es tinina o uracilo. Del mismo modo, se sabe que un residuo de citocina de una primera hebra de ácido nucleico tiene la capacidad de aparear las bases con un residuo de una segunda hebra de ácido nucleico que sea antiparal?la a la primera hebra si el residuo es guanina. Una primera región de un ácido nucleico es complementaria a una segunda región del mismo o un ácido nucleico diferente si, cuando las dos regiones se arreglan en un modo antiparalelo, por lo menos un residuo de nucleótido de la primera región es capaz de aparear las bases con un residuo de la segunda región. Preferentemente, la primera región consiste en una primera porción y la segunda región consiste en una segunda porción, con lo cual, cuando la primera y segunda porciones se arreglan en un modo antiparalelo, por lo menos alrededor de 50% y preferentemente al menos alrededor de 75%, al menos aproximadamente 90% o al menos aproximadamente 95% de los residuos de nucleótidos de la primera porción son capaces del apareamiento de bases con residuos de nucleótidos de la segunda porción. Más preferentemente, todos los residuos de nucleótidos de la primera porción son capaces del apareamiento de bases con los residuos de nucleótidos de la segunda porción.
Cuando se utiliza en la presente, expresión "informativa" se propone para referirse al nivel de expresión de un marcador predictivo diferencialmente expresado que corresponda a la respuesta o no respuesta. El nivel de expresión de un marcador en un paciente es "informativo" si es mayor que un nivel de referencia por una cantidad mayor que el error estándar del ensayo que se emplee para evaluar la expresión. De otro modo, un marcador que sea diferencialmente expresado tendrá intervalos comunes de nivel de expresión que sean predictivos de respuesta o no respuesta. Un nivel de expresión informativo es un nivel que entra dentro del intervalo de expresiones de respuesta o no respuesta. Todavía más, una serie de marcadores pueden junto ser "informativos" si la combinación de sus niveles de expresión cumple o está por encima o por debajo de un registro predeterminado para una serie de marcadores predictivos según se determina por los métodos que se proporcionan en la presente.
Un marcador determinado puede ser indicativo de pacientes que responden y no responden; por ejemplo, la expresión de un marcador predictivo proporcionado en la presente por encima de un umbral determinado (por ejemplo un nivel de expresión informativo) puede ser indicativo de un paciente que responde, como se describe en la presente. La expresión de ese marcador por debajo de un umbral determinado (por ejemplo por debajo de un nivel informativo) puede ser indicativo de un paciente que no responde.
Un cáncer o tumor es tratado o diagnosticado de acuerdo con los métodos presentes. "Cáncer" o "tumor" está destinado para incluir cualquier crecimiento neoplásico en un paciente, incluido un tumor inicial y cualquier metástasis. El cáncer puede ser de tipo tumor líquido o sólido. Los tumores líquidos incluyen tumores de origen hematológico que incluye, por ejemplo, mielomas (por ejemplo mieloma múltiple) , leucemias (por ejemplo síndrome de Waldenstrom, leucemia linfocítica crónica, otras leucemias) , y linfomas (por ejemplo linfomas de células B, linfoma de no Hodgkín) . Los tumores sólidos pueden originarse en órganos, e incluye canceres como puede ser pulmón, mama, próstata, ovario, colon, riñon e hígado. Cuando se utiliza en la presente, células cancerosas, incluidas células de tumor, se refiere a las células que se dividen a una velocidad anormal (aumentada) . Las células cancerosas incluyen, mas no se limitan a, carcinomas, como carcinoma de células escamosas, carcinoma de células básales, carcinoma de glándula sudorípara, carcinoma de glándula sebácea, adenocarcinoma, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma no diferenciado, carcinoma broncogenico, carcinoma de células renales, melanoma, hepatoma-carcinoma de células hepáticas, carcinomas de las vías biliares, colangiocarcmoma, carcinoma papilar, carcinoma de células transicionales, coriocarcinoma, semonoma, carcinoma embrional, carcinomas mamarios, carcinoma gastrointestinal, carcinomas colonicos, carcinoma de vejiga, carcinoma prostatico y carcinoma de células escamosas de la región del cuello y cabeza; sarcomas como fíbrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordosarcoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, sinoviosarcoma y mesioteliosarcoma; canceres hematológicos como mielomas, leucemias (por ejemplo leucemia mielogena aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia granulocitica, leucemia monocítica, leucemia monolítica, leucemia linfocítica) , y lmfomas (por ejemplo lmfoma folicular, linfoma de células manto, linfoma de células B grandes, difusas, linfoma maligno, plasmocitoma, sarcoma de células de retículo o enfermedad de Hodgkín) ; y tumores del sistema nervioso que incluye glioma, mermgoma, meduloblastoma, shwanoma o epidimoma .
Un cáncer es "responsivo" o responde a un agente terapéutico si su tasa de crecimiento se inhibe como resultado del contacto con el agente terapéutico, en comparación con su crecimiento en ausencia del contacto con el agente terapéutico. El crecimiento de un cáncer puede medirse en diferentes formas, por ejemplo, el tamaño de un tumor o la expresión de los marcadores del tumor apropiados para ese tipo de tumor pueden ser medidos. Por ejemplo, las definiciones de respuesta que se utilizan para identificar los marcadores asociados con mieloma y su respuesta al tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide, se utilizaron los criterios del Southwestern Oncology Group (SWOG, Grupo de Oncología del Sudoeste) como está descrito en Blade y col., Br . J. Haema tol . 1998, Sep; 102 (5) : 1115-23 (también ver la Tabla C) . Estos criterios definen el tipo de respuesta mediada en mieloma y también la caracterización del tiempo para progresión de la enfermedad que es otra medida importante de una sensibilidad de tumor a un agente terapéutico. La cualidad de ser sensible o responder a un tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide es una variable uno, con diferentes canceres presentando diferentes niveles de "respuesta" a un agente terapéutico determinado, en diferentes combinaciones. Todavía más, las medidas de respuesta pueden ser evaluadas utilizando criterios adicionales más allá del tamaño del crecimiento del tumor, incluida la calidad de vida del paciente, el grado de metástasis, etcétera. Además, los marcadores de pronósticos clínico y las variables pueden ser evaluadas (por ejemplo la proteína M en mieloma, niveles de PSA en cáncer de próstata) en situaciones pertinentes.
Un cáncer es "no responsivo" o no responde a un agente terapéutico si su tasa de crecimiento no es inhibida, o es inhibida en un grado muy bajo, como resultado del contacto con el agente terapéutico si se compara con su crecimiento en ausencia del contacto con el agente terapéutico. Como se ya se mencionó, el crecimiento de un cáncer puede medirse en diversas formas, por ejemplo, el tamaño de un tumor o la expresión de los marcadores de tumor apropiados para ese tumor de tumor puede medirse. Por ejemplo, las definiciones de respuesta que se utilizan para identificar los marcadores asociados con no respuesta de mieloma múltiple a los agentes terapéuticos, los criterios del Southwestern Oncology Group (SWOG) como se describe en Blade y col., fueron utilizados en los experimentos que se describe en la presente. La cualidad de ser no responsivo a un agente terapéutico es altamente variable, con diferentes canceres presentado diferentes niveles de "no respuesta" a un agente terapéutico determinado, en diferentes condiciones. Todavía más, las medidas de no respuesta pueden ser evaluadas utilizando criterios adicionales más allá del tamaño del crecimiento de un tumor, incluida la calidad de vida del paciente, el grado de metástasis, etcétera. Además, los marcadores pronósticos clínicos y variables pueden ser evaluados (por ejemplo la proteína M en mieloma, los niveles de PSA en cáncer de próstata) en situaciones pertinentes.
"Tratamiento" debe significar la prevención o inhibición del crecimiento de tumor, así como la causa de encogimiento de un tumor. El tratamiento también está destinado a incluir la prevención de metástasis de tumor. Un tumor es "inhibido" o "tratado" si por lo menos un síntoma (según se determina por la respuesta/no respuesta, el tiempo de progresión o indicadores conocidos en la técnica y descritos en la presente) del cáncer o tumor se alivia, termina, hace más lento, se lleva al mínimo o impide. Cualquier mejoría de algún síntoma físico o de otro, de un tumor de acuerdo con un tratamiento que utilice un esquema terapéutico (por ejemplo esquema de inhibición de proteasoma, esquema de glucocorticoides) como se describe en la presente, está dentro del alcance de la invención.
Cuando se utiliza en la presente, el término "agente" se define ampliamente como cualquier cosa a las que las células cancerosas, incluidas las células tumorales, puedan exponerse en un protocolo terapéutico. En el contexto de la presente invención, agentes como estos incluyen, más no se limitan a, agentes para la inhibición de proteasoma, agentes esteroides glucocorticoides así como agentes quimioterapéuticos como los conocidos en la técnica y descritos con mayor detalle en la presente.
Un "equipo" o kit es cualquier objeto de fabricación (por ejemplo un paquete o envase) que contenga por lo menos un reactivo, por ejemplo, una sonda, para detectar específicamente un marcador o serie de marcadores de la invención. El artículo de fabricación puede ser promovido, distribuido o comercializado como una unidad para realizar los métodos de la presente invención. Los reactivos incluidos en tal equipo contienen sondas/cebadores y/o anticuerpos para uso en la detección de la expresión de marcadores responsivos y no predictivos. Ademas, los equipos de la presente invención preferentemente pueden contener instrucciones que describen un ensayo de detección apropiado. Estos equipos pueden utilizarse convenientemente, por ejemplo, en el entorno clínico, para diagnosticar y evaluar pacientes que presentan síntomas de cáncer, en particular pacientes que exhiban la presencia posible de un cáncer con capacidad de tratamiento con inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide, que incluye, por ejemplo, canceres hematologicos, por ejemplo, mielomas (por ejemplo mieloma múltiple), linfomas (por ejemplo linfoma de no Hodgkín) , leucemias y tumores solidos (por ejemplo de pulmón, mama, ovario, etcétera) .
Los métodos y composiciones presentes están diseñados para utilizarlos en el diagnostico y terapéutica para un paciente que sufra de cáncer. El cáncer puede ser de tipo tumor líquido o sólido. Los tumores líquidos incluyen tumores de origen hematológico como puede ser, por ejemplo, mielomas, por ejemplo mieloma múltiple) , leucemias (síndrome de Waldenstrom, leucemia linfocítica crónica, otras leucemias) , y linfomas (por ejemplo linfomas de células B, lmfoma de no Hodgkín) . Los tumores solidos pueden originarse en órganos, e incluye canceres como pulmón, mama, próstata, ovario, colon, riñon e hígado.
La invención proporciona los métodos para determinar o evaluar un esquema de tratamiento de cáncer apropiado para tratar un tumor en un paciente. Los esquemas de tratamiento de cáncer apropiado para uso en o junto con los métodos proporcionados consisten en el tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide. Por ejemplo, el tratamiento de inhibidor de proteasoma consiste en el tratamiento de un paciente con un inhibidor de proteasoma (por ejemplo Bortezomib, o cualquier otro inhibidor de proteasoma descrito con mayor detalle en la presente) , solo o en combinación con uno o más agentes adicionales. En otro ejemplo, el tratamiento con glucocorticoide consiste en el tratamiento de un paciente con un glucocorticoide (por ejemplo dexametasona o cualquier otro glucocorticoide descrito con mayor detalle en la presente) , solo o en combinación con uno o más agentes adicionales.
Los métodos que se proporcionan comprenden la medición del nivel de expresión de por lo menos un marcador predictivo en el tumor del paciente y determinar un esquema de tratamiento de cáncer para tratar el tumor con base en el nivel de expresión del marcador o los marcadores predictivos, según sea pertinente. Un nivel de expresión informativo de un marcador o marcadores predictivos en la muestra del paciente es una indicación que el paciente es un paciente sensible o que responde y se beneficiaría del tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide cuando el marcador o la serie de marcadores predictivos proporcionados en la presente indiquen tal respuesta. Además, un nivel de expresión informativo de un marcador o marcadores predictivos en un paciente es una indicación que el paciente es un paciente que no responde y no se beneficiaría del tratamiento de inhibición de proteasoma y/o el tratamiento con glucocorticoide cuando el marcador o marcadores proporcionados en la presente indiquen tal no respuesta.
La invención ademas propone los métodos para determinar si un paciente sera sensible o responderá a un esquema de tratamiento de cáncer para tratar un tumor. Tale métodos consisten en medir el nivel de expresión por lo menos un marcador predictivo en el tumor del paciente y determinar un esquema basado en inhibición de proteasoma y/o un esquema basado en glucocorticoide para tratar el tumor con base en el nivel de expresión del marcador o la serie de marcadores predictivos. Un nivel de expresión informativo de un marcador predictivo en la muestra del paciente es una indicación que el paciente es un paciente que responde y se beneficiaría del tratamiento de inhibición de proteasoma y/o glucocorticoide . Un nivel de expresión informativo de una serie de marcadores predictivos en el paciente es una indicación que el paciente es un paciente que responde y se beneficiaría del tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide cuando el marcador o los marcadores proporcionados en la presente indican tal respuesta. Los marcadores predictivos seleccionados para uso en los métodos comprenden marcadores predictivos que demuestran expresión aumentada en pacientes que responden y/o tiempo mas prolongado para la progresión de la enfermedad.
La invención propone los métodos para determinar si un paciente tiene enfermedad agresiva y progresará en la enfermedad más rápido que un paciente que no demuestre enfermedad agresiva. Un paciente indicativo de enfermedad agresiva también puede no responder a un esquema de tratamiento contra cáncer para tratar un tumor. Estos métodos comprenden medir el nivel de expresión de por lo menos un marcador predictivo en el tumor del paciente e identificar al paciente que tiene enfermedad agresiva con base en el nivel de expresión del marcador o serie de marcadores predictivos. Un nivel de expresión informativo de un marcador predictivo en la muestra del paciente es una indicación que el paciente tiene enfermedad agresiva y es probable que progrese y pueda no beneficiarse del esquema basado en la inhibición del proteasoma y/o tratamiento del esquema basado en glucocorticoide. Un nivel de expresión informativo de una serie de marcadores predictivos en el paciente es una indicación que el paciente es un paciente que tiene enfermedad agresiva y no se beneficiaría del esquema basado en la inhibición del proteasoma y/o el esquema basado en glucocorticoides cuando el marcador o serie de marcadores seleccionado proporcionado en la presente indica tal agresividad de la enfermedad. Los marcadores predictivos seleccionados para uso en los métodos consisten en los marcadores predictivos que demuestran aumentada expresión en pacientes que no responden y/o tiempo más corto para la progresión de la enfermedad en pacientes y no son específicos para el tratamiento en inhibición de proteasa o tratamiento con glucocorticoides.
Todavía más, la invención proporciona los métodos para determinar si un paciente responderá a un esquema de tratamiento de cáncer para tratar un tumor. Estos métodos consisten en medir el nivel de expresión de por lo menos un marcador predictivo en el tumor del paciente y determinar un esquema basado en inhibición de proteasoma y/o el esquema basado en glucocorticoide para tratar el tumor con base en el nivel de expresión del marcador o la serie de marcadores predictivos. Un nivel de expresión informativo de un marcador predictivo en la muestra del paciente es una indicación que el paciente es un paciente que no responde y no se beneficiará del esquema basado en inhibición de proteasoma y/o tratamiento de esquema basado en glucocorticoides. Un nivel de expresión informativo de una serie de marcadores predictivos en el paciente es una indicación que el paciente es un paciente que no responde y no se beneficiará del esquema basado en inhibición de proteasoma y/o esquema basado en glucocorticoides cuando el marcador o serie de marcadores seleccionado proporcionado en la presente indica que no habrá respuesta. Los marcadores predictivos seleccionados para uso en los métodos comprenden los marcadores predictivos que demuestran expresión aumentada en pacientes que no responden y/o tiempo más corto para la progresión de la enfermedad.
La invención además propone los métodos para tratar un tumor en un paciente con un esquema basado en inhibición de proteasoma y/o tratamiento de un esquema basado en glucocorticoides. Tales métodos de tratamiento consisten en medir el nivel de expresión de por lo menos un marcador predictivo en el tumor de un paciente; determinar si un esquema basado en inhibición de proteasoma y/o esquema basado en glucocorticoides para tratar el tumor es apropiado con base en el nivel de expresión del marcador o los marcadores predictivos, y tratar a un paciente con un tratamiento basado en inhibición de proteasoma y/o tratamiento basado en glucocorticoides cuando el nivel de expresión del paciente indica que es un paciente que responde. Un nivel de expresión informativo del marcador predictivo en la muestra del paciente es una indicación que el paciente es un paciente que responde y se beneficiará del tratamiento de un esquema basado en inhibición de proteasoma y/o esquema basado en glucocorticoides cuando el marcador o la serie de marcadores predictivos proporcionados en la presente indican que el paciente es un paciente que responde.
Los métodos de la invención utilizan por lo menos uno de los marcadores predictivos establecidos en algunas de las Tablas ÍA, IB, Tabla 2A, TABLA 2B y Tabla 3. Además, los métodos que se proporcionan pueden utilizar 2, 3, 4, 5, 6 o más marcadores para formar una serie de marcadores predictivos. Por ejemplo, las series de marcadores seleccionadas a partir de los marcadores de la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y/o Tabla 3 pueden ser generados utilizando los métodos que se proporcionan en la presente y pueden comprender entre dos, y todos los marcadores que se establecen en la Tabla 1A, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B o Tabla 3 y todos y cada combinación entre estos (por ejemplo, cuatro marcadores seleccionados, 16 marcadores seleccionados, 74 marcadores seleccionados, etcétera) . En algunas modalidades, la serie de marcadores predictivos comprende por lo menos 5, 10, 20, 40, 60, 100, 150, 200 o 300 o más marcadores. En otras modalidades, la serie de marcadores predictivos comprenden no más de 5, 10, 20, 40, 60, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600 ó 700 marcadores. En algunas modalidades, la serie de marcadores predictivos incluye una pluralidad de genes asociados con cáncer, por ejemplo, cáncer hematológico (por ejemplo mieloma múltiple, leucemias, linfoma, etcétera) o cáncer de un tumor sólido (por ejemplo en pulmón, mama, próstata, ovario, colon, riñon o hígado) . En algunas modalidades, la serie de marcadores predictivos incluye una pluralidad de marcadores enlistados en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B, o Tabla 3. En algunas modalidades la serie de marcadores predictivos incluye por lo menos alrededor de 1%, aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% de los marcadores que se enlistan en la Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B o Tabla 3. Las series de marcadores predictivos seleccionados pueden ser ensamblados a partir de los marcadores predictivos que se proporcionan utilizando los métodos que se proporcionan en presente y los métodos análogos conocidos en la técnica. Una serie de marcadores predictivos ejemplar se proporciona en la Tabla 4. En algunos aspectos, los marcadores comprenden aquellos establecidos en la Tabla .
Los métodos de la invención además proporcionan la capacidad para construir series de marcadores a partir de marcadores predictivos individuales establecidos en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 utilizando los métodos que se describen con mayor detalle en la presente. En otro aspecto, más de una serie de marcadores puede utilizarse en combinación con los métodos de diagnóstico, pronóstico y tratamiento que se proporcionan.
Los métodos de la invención pueden realizarse de modo que la determinación del nivel de expresión de un marcador predictivo se mide antes del tratamiento de tumor para identificar si el paciente responderá a un tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide.
Además, los métodos de la invención pueden realizarse al mismo tiempo con el tratamiento antitumor en curso para determinar si el pacientes esta respondiendo al tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide presente o responderá a un tratamiento adicional que consista en el tratamiento de la inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide.
Todavía más, los métodos de la invención pueden realizarse de que el tratamiento de tumor se haya llevado a cabo para evaluar si el paciente responderá al curso futuro de tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide.
Si los métodos se hacen durante el tratamiento continuo del tumor o después de un curso de tratamiento del tumor, el tratamiento del tumor puede consistir en el tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide, solo o las formas alternativas de tratamiento contra cáncer. Los métodos que se proporcionan están diseñados para determinar si el paciente se beneficiará del tratamiento por inhibición del proteasoma y/o con glucocorticoide adicional o futuro, y puede incluir algún tratamiento de inhibición de proteasoma y/o con glucocorticoide solo o en combinación con otros agentes terapéuticos.
En algunos aspectos, el nivel de expresión del marcador predictivo en el tumor del paciente se mide aislando una muestra del tumor y haciendo el análisis de la muestra aislada, o una parte de esta. En otro aspecto, el nivel de expresión del marcador predictivo en el tumor del paciente se mide utilizando técnicas de imagenología in vivo.
En algunos aspectos, la determinación del nivel de expresión de un marcador predictivo consiste en la detección de mRNA. Tal detección puede llevarse a cabo por cualquier método pertinente, que incluye por ejemplo PCR, northern, detección de arreglo de nucleótidos, imagenología in vivo utilizando sondas que puedan detectar el ácido nucleico apropiado. En otos aspectos, la determinación del nivel de expresión del nivel predictivo consiste en la detección de proteína. Tal detección puede llevarse a cabo utilizando cualquier método pertinente para la determinación de proteínas, que incluye, por ejemplo, ELISA, western blot, imunoensayo, detección de arreglo de proteínas, imagenología in vivo, utilizando sondas que puedan detectar el péptido apropiado.
La determinación del nivel de expresión de un marcador predictivo se compara con un nivel de expresión de referencia. Por ejemplo, un nivel de expresión de referencia puede ser un nivel de expresión de referencia patrón, predeterminado para evaluar si la expresión marcador o serie de marcadores es informativa y hacer una evaluación para determinar si el paciente responde o no responde. Además, la determinación del nivel de expresión de un marcador predictivo se puede comparar con un nivel de expresión de marcador de referencia interno que se mide al mismo tiempo que el marcador predictivo para hacer una evaluación para determinar si el paciente responde o no responde. Por ejemplo, la expresión de un marcador o marcadores distintos que sean marcadores no predictivos de la invención, pero que se sepa que demuestran un nivel de expresión constante puede evaluarse como un nivel de marcador de referencia interno, y el nivel de la expresión del marcador predictivo se determina en comparación con la referencia. En un ejemplo alternativo, la expresión del marcador o marcadores predictivos seleccionados en una muestra de tejido que es una muestra no tumor puede evaluarse como un nivel de marcador de referencia interno. El nivel de expresión de un marcador o marcadores puede determinarse teniendo expresión aumentada en ciertos aspectos. El nivel de expresión de un marcador o marcadores se puede determinar teniendo expresión disminuida en otros aspectos. El nivel de expresión puede determinarse como cambio no informativo en la expresión en comparación con un nivel de referencia. En todavía otros aspectos, el nivel de expresión se determina contra un nivel de expresión patrón predeterminado como se determina por los métodos que se proporcionan en la presente.
La invención también se refiere a los diferentes reactivos y equipos para diagnosticar, etapificar, pronosticar, monitorizar y tratar a un paciente con cáncer (por ejemplo un paciente con un tumor líquido o un tumor sólido) , con tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide. Se proporcionan los reactivos para la detección de los marcadores y series de marcadores y para uso en los métodos de la invención que comprenden por lo menos dos marcadores predictivos aislados establecidos en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3. Estos reactivos incluyen sondas de ácido nucleico, cebadores, anticuerpos, derivados de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y sondas peptídicas para la detección de los marcadores predictivos pertinentes establecidos en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3.
Además se proporcionan los equipos para uso en los métodos proporcionados. Los equipos de la invención incluyen reactivos para evaluar los marcadores predictivos (por ejemplo por lo menos un marcador predictivo) y las series de marcadores predictivos (por ejemplo, por lo menos, dos tres, cuatro o más marcadores seleccionados de la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3) , así como las instrucciones para uso de acuerdo con los métodos que se proporcionan en la presente. En algunos aspectos, los equipos proporcionados contienen sondas de ácido nucleico para la evaluación de los marcadores predictivos. En todavía otros aspectos, los equipos proporcionados contienen anticuerpo, derivado de anticuerpo, fragmento de anticuerpo o reactivos peptídicos para la evaluación de los marcadores predictivos .
Identificación de marcadores que responden y no responden La presente invención proporcionan los marcadores que se expresan en un tumor que es responsivo al tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoides y cuya expresión se correlaciona con la respuesta a ese agente terapéutico. La presente invención también proporciona los marcadores que se expresan en un tumor que es no responsivo al tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide y cuya expresión se correlaciona con la no respuesta a tal tratamiento. Por consiguiente, uno o más de los marcadores puede utilizarse para identificar canceres que puedan ser tratados exitosamente por tratamiento con inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide. Uno o más de los marcadores de la presente invención puede utilizarse para identificar a los pacientes que puedan ser tratados exitosamente utilizando tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide. Además, los marcadores de la presente invención pueden utilizarse para identificar a un paciente que se haya vuelto o este en riesgo de volverse resistente al tratamiento con inhibición de proteasoma y/o con glucocorticoide. La invención también presenta combinaciones de marcadores, a los que se hace referencia en la presente como "series de marcadores" que pueden predecir si un paciente es probable que responda o no responda a un tratamiento de inhibición de proteasoma y/o esquema de tratamiento con glucocorticoide .
La Tabla 1 establece los marcadores predictivos identificados utilizando el análisis estadístico aplicado a las muestras de 224 pacientes, los cuales son identificadores específicos de respuesta o no respuesta al tratamiento de inhibición de proteasoma (por ejemplo Bortezomib) . Los marcadores de la Tabla 1 están diferencialmente expresados en muestras de pacientes que son sensibles o no sensibles al tratamiento con Bortezomib inhibidor de proteasoma. Así pues, uno apreciaría que los marcadores identificados pueden funcionar en un modelo predictivo para identificar prospectivamente la repuesta de los pacientes al tratamiento de inhibición de proteasoma, incluida la respuesta a Bortezomib u otros tratamientos de inhibición de proteasoma conocidos en la técnica así como aquellos descritos con mayor detalle en la presente. En particular, los marcadores de la Tabla 1 están correlacionados con una respuesta positiva al tratamiento (al que se hace referencia en la presente como "que responde, (R") ; o un tiempo prolongado hasta progresión de la enfermedad (TTP) . Según se determina por un análisis de riesgo proporcional cox, como se describe con mayor detalle en la presente. Un paciente con una respuesta positiva (completa, parcial o mínima; ver la Tabla C) al tratamiento en adelante será mencionado como un "respondedor". Los predoctores de tiempo prolongado para progresión son útiles como indicadores adicionales de pacientes que son probables de progresar en enfermedad a una velocidad más lenta y pueden ser más probables para ser sensibles al tratamiento comparado con otros pacientes. Además, los marcadores predictivos en la Tabla 1 están correlacionados con una respuesta negativa o deficiente a un agente (al que se refiere en la presente como "que no responde, (NR"), o un tiempo corto para progresión de la enfermedad (TTP) . Un paciente con una respuesta deficiente (denominada una enfermedad progresiva o refractaria; ver la Tabla C) al tratamiento se menciona en adelante como un "no respondedor". Estos marcadores predictivos identificados son útiles como indicadores adicionales de pacientes que son probables a progresar a la enfermedad a una velocidad más rápida, y menos probables para ser sensibles al tratamiento en comparación con otros pacientes. Un paciente con no respuesta al tratamiento en adelante será mencionado como "estable".
La Tabla ÍA proporciona marcadores predictivos que son indicadores regulados hacia arriba de no respuesta y/o se correlacionan con tiempo más corto para la progresión. Los marcadores Nos 1-547 de la Tabla ÍA son marcadores predictivos recién identificados, y los marcadores predictivos No. 548-657 han sido previamente identificados como marcadores asociados predictivos de no respuesta y/o correlación con tiempo más corto para la progresión. Ver, la publicación de la patente internacional No. WO 04053066, publicada el 24 de junio de 2004. La Tabla IB proporciona marcadores predictivos que son indicadores regulados hacia arriba de respuesta y/o se correlacionan con tiempo más prolongado la progresión. Los marcadores números 658-876 de la Tabla IB son marcadores predictivos recién asociados, y los marcadores predictivos Nos. 877-911 han sido identificados previamente como marcadores asociados predictivos de respuesta y/o correlación con tiempo mas prolongado para la progresión. Ver la publicación de la Patente Internacional NO. WO 0453066 publicada el 24 de junio de 2004.
La Tabla 2 establece marcadores predictivos identificados utilizando el análisis estadístico aplicado a las muestras de 224 pacientes, los cuales son identificadores específicos de respuesta o no respuesta al tratamiento con glucocorticoide (por ejemplo dexametasona) . Los marcadores de la Tabla 2 están diferencialmente expresados en muestras de pacientes que son sensibles o no sensibles al tratamiento con el agente esteroide glucocorticoide dexametasona. Asi pues, uno apreciara que los marcadores identificados pueden funcionar en un modelo predictivo para identificar prospectivamente la respuesta del paciente al tratamiento con glucocorticoide, incluida la respuesta dexametosa u otros tratamientos con glucocorticoide conocidos en la técnica asi como aquellos descritos con mayor detalle en la presente. Como en la Tabla 1, la Tabla 2 establece marcadores predictivos identificados los cuales son identificadores específicos de respuesta o tiempo prolongado para la progresión; o no respuesta o tiempo corto para la progresión tras tratamiento con glucocorticoide (por ejemplo dexametasona) .
La Tabla 2A proporciona marcadores predictivos que son indicadores regulados hacia arriba de no respuesta y/o se correlacionan con tiempo más corto para la progresión. La Tabla 2B proporciona marcadores predictivos que son indicadores regulados hacia arriba de respuesta y/o se correlacionan con tiempo más prolongado la progresión.
La Tabla 3 establece marcadores predictivos identificados los cuales no distinguen entre respuesta al tratamiento de inhibición de proteasoma y respuesta al tratamiento de glucocorticoide, más bien son marcadores predictivos indicadores de respuesta/tiempo más prolongado para la progresión o no respuesta/tiempo más corto para la progresión con respecto al tratamiento, y son indicadores de agresividad de la enfermedad general. Los marcadores Nos. 1203-1423 de la Tabla 3 son marcadores predictivos recién asociados, y los marcadores predictivos No. 1424-1474 han sido previamente identificados como marcadores asociados predictivos de no respuesta/correlación con tiempo más corto para la progresión y/o respuesta/correlación con tiempo más prolongado para la progresión en relación con la respuesta de pacientes en etapa avanzada al tratamiento con Bortezomib. Ver, la Publicación de Patente Internacional No. WO 04053066, publicada el 24 de junio de 2004.
En los métodos de la presente invención se determina el nivel de expresión de uno o más marcadores predictivos seleccionados del grupo que consiste en los marcadores identificados en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3. Cuando se utiliza en la presente, el nivel o cantidad de expresión se refiere al nivel de expresión absoluto de un mRNA codificado por el marcador o el nivel de expresión absoluto de la proteína codificada por el marcador (es decir, si alguna o ninguna expresión esta o no ocurriendo en las células cancerosas) .
En general, es preferible determinar la expresión de dos o más de los marcadores sensibles o no predictivos identificados, o tres o más de los marcadores sensibles o no predictivos identificados, o todavía más grande una serie de marcadores sensibles y/o no predictivos identificados, seleccionados de los marcadores predictivos que se identifican en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3. Por ejemplo, la Tabla 4 establece series de marcadores identificadas utilizando los métodos que se describen en la presente y pueden utilizarse en los métodos de la presente invención. Todavía más, series de marcadores adicionales y/o alternativas que contienen los marcadores predictivos identificados en la presente se pueden generar utilizando los métodos y marcadores predictivos proporcionados. Así pues, es posible evaluar la expresión de un panel de marcadores sensibles y no predictivos utilizando los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente .
Como una alternativa para hacer determinaciones basadas en el nivel de expresión absoluta de los marcadores seleccionados, las determinaciones pueden basarse en niveles de expresión normalizados. Los niveles de expresión son normalizados corrigiendo el nivel de expresión absoluto de un marcador predictivo haciendo la comparación de su expresión con la expresión de un marcador de referencia que no sea un marcador predictivo, por ejemplo un gen de mantenimiento que se exprese constitutivamente. Los marcadores apropiados para la normalización incluyen genes de mantenimiento, como puede ser el gen de actina. Los genes constitutivamente expresados son conocidos en la técnica y pueden identificarse y seleccionarse de acuerdo con el tejido y/o la situación pertinente del paciente y los métodos de análisis. Tal normalización permite comparar el nivel de expresión en una muestra, por ejemplo, una muestra de tumor, con otra muestra, por ejemplo una muestra no tumor, o entre muestras de diferentes fuentes.
Más aún, el nivel de expresión puede ser proporcionado como un nivel de expresión relativo. Para determinar un nivel de expresión relativo de un marcador o serie de marcadores, el nivel de expresión del marcador o serie de marcadores predictivos ser determina para 10, o más muestras individuales, preferentemente 50 o más muestras individuales para establecer una línea base, antes de la determinación del nivel de expresión para la muestra en cuestión. Para establecer un medición de la línea base, se determina la media del nivel de expresión inyectada a uno de los marcadores o series de marcadores predictivos ensayados en el número más grande de muestras y esto se utiliza como un nivel de expresión línea base para los marcadores o serie de marcadores predictivos en cuestión. El nivel de expresión del marcador o la serie de marcadores determinados para la muestra de prueba (nivel de expresión absoluta) entonces se divide entre la media del valor de expresión obtenida para este marcador o serie de marcadores. Esto proporciona un nivel de expresión relativo y ayuda a identificar casos extremos de respuesta o no respuesta.
Determinación de la respuesta o no respuesta a un agente El nivel de expresión (incluido el nivel de la proteasoma) de los marcadores predictivos identificados de pacientes sensibles/no sensibles y puede utilizarse preferentemente: 1) determinar si un paciente puede ser tratado por un agente o combinación de agentes; 2) determinar si un paciente esta respondiendo al tratamiento con un agente o combinación de agentes; 3) seleccionar un agente apropiado o combinación de agentes para tratar a un paciente; 4) monitopzar la eficacia de un tratamiento en curso; 5) identificar nuevos tratamiento contra cáncer (agentes individuales inhibidor de proteasoma y/o agentes glucocorticoides o agentes complementarios que puedan utilizarse alternativamente o en combinación con agentes para inhibición de proteasoma y/o glucocorticoides) ; 6) identifica la agresividad de un cáncer; y 7) seleccionar un agente apropiado o combinación de agentes en el tratamiento de la recurrencia temprana y tardía de un cáncer. En particular, los marcadores predictivos identificados pueden utilizarse para determinar el tratamiento apropiado, para monitorizar el tratamiento clínico y los estudios en humanos de un fármaco que se este analizando para la eficacia, y desarrollar nuevos agentes y combinaciones terapéuticas.
Un cáncer puede ser predispuesto para responder a un agente si uno o más de los marcadores predictivos correspondiente identificados en la Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 (como se indica por (+) en la Tabla 3) demuestra expresión aumentada. En algunos aspectos de la invención, la predisposición de un cáncer a ser sensible a un agente se determina por los métodos de la presente invención, en donde se evalúa la expresión informativa de los marcadores predictivos individuales de las series de marcadores identificados en la Tabla 4. Del mismo modo, la predisposición de un paciente para que sea sensible a un agente se determina por los métodos de la presente invención, en donde una serie de marcadores generada utilizando los métodos descritos en la presente en donde los marcadores que comprende la serie de marcadores incluye marcadores predictivos establecidos en la Tabla Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3, y se evalúa la expresión de la serie de marcadores.
Un cáncer puede estar predispuesto a no respuesta a un agente si uno o más de los marcadores no predictivos correspondiente demuestra niveles de expresión informativos. Un cáncer puede estar predispuesto a no respuesta a un agente si uno o más de los marcadores predictivos correspondiente identificados en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, y Tabla 3 (como se indica por (-) en la Tabla 3 demuestra expresión informativa aumentada. En algunos aspectos de la invención, la predisposición de un cáncer para que sea no sensible a un agente se determina por los métodos de la presente invención, en donde se evalúa la expresión informativa de los marcadores predictivos individuales de las series de marcadores identificados en la Tabla 4. Del mismo modo, la predisposición de un paciente para que sea no sensible a un agente se determina por los métodos de la presente invención, en donde se genera una serie de marcadores utilizando los métodos que se describen en la presente en donde los marcadores que comprenden la serie de marcadores incluye los marcadores predictivos establecidos en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, y/o Tabla 3 y se evalúa la expresión de la serie de marcadores.
En un aspecto, la serie de marcadores predictivos para la evaluación de un cáncer predispuesto para responder o predispuesto para no responder a un tratamiento comprende marcadores seleccionados a partir de aquellos establecidos en cualquiera de las tablas ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3. Todavía otro aspecto considera marcadores establecidos en la Tabla ÍA y Tabla IB solos o en combinación con serie de marcadores establecidos en la Tabla 2A y Tabla 2B y/o Tabla 3, o de otro modo, aquellos marcadores establecidos en la Tabla 2A y Tabla 2B solos o en combinación con Tabla ÍA y Tabla IB y/o Tabla 3. En todavía otro aspecto, el marcador o los marcadores predictivos evaluados se seleccionan de aquellos establecidos en la Tabla 3. En algunos aspectos, la serie de marcadores se selecciona de los establecidos en la Tabla 4. De acuerdo con los métodos, el tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide se continuaría donde el perfil de expresión indica respuesta continua, o no respuesta disminuida utilizando los métodos de evaluación que se describen en la presente.
La presente invención proporciona los métodos para determinar si un tratamiento contra cáncer, por ejemplo, inhibidor de proteasoma y/o agente glucocorticoide, puede utilizarse para reducir la tasa de crecimiento de un tumor, que consiste en evaluar la expresión de por lo menos un marcador predictivo o una serie de marcadores predictivos en una muestra de tumor; e identificar que el tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide es o no es apropiado para reducir la tasa de crecimiento del tumor, con base en la evaluación.
La invención proporciona un método para determinar si un esquema terapéutico de inhibición de proteasoma (por ejemplo un agente inhibidor de proteasoma (por ejemplo Bortezomib) solo o en combinación con otro agente quimioterapéutico) puede utilizarse para reducir la tasa de crecimiento de un tumor que consiste en determinar el perfil de expresión de un marcador predictivo o serie de marcadores predictiva; e identificar que un agente terapéutico para la inhibición de proteasoma es o no es apropiado para reducir la tasa de crecimiento de las células de mieloma con base en el perfil de expresión.
Además se proporciona los métodos para determinar si un tratamiento inhibidor de proteasoma puede utilizarse para reducir el crecimiento de un tumor, que consiste en obtener una muestra de células de tumor, evaluar la expresión de uno o más marcadores individuales o una serie de marcadores, en las células de tumor expuestas a un agente y en las células de tumor que no hayan sido expuestas al tratamiento de inhibición de proteasoma; e identificar que un agente es o no es apropiado para tratar el tumor con base en la evaluación.
La invención proporciona un método para determinar si un esquema de glucocorticoide (por ejemplo el agente esteroide glucocorticoide (por ejemplo dexametosana) solo o en combinación con otro agente quimioterapéutico) puede utilizarse para reducir la tasa de crecimiento de un tumor, que consiste en determinar el perfil de expresión de un marcador predictivo o una serie de marcadores predictivos; e identificar que un agente terapéutico glucocorticoide es o no es apropiado para reducir la tasa de crecimiento del tumor con base en el perfil de expresión.
Además se proporcionan los métodos para determinar si un tratamiento con glucocorticoide puede utilizarse para reducir el crecimiento de un tumor, que consiste en obtener una muestra de células de tumor, evaluar la expresión de uno o más marcadores individuales o una serie de marcadores, en las células de tumor expuestas al agente y en células de tumor que no hayan sido expuestas al tratamiento con glucocorticoide; e identificar que un agente es o no es apropiado para tratar el tumor, con base en la evaluación.
En tales métodos, se determina que un tratamiento de inhibición de proteasoma y/o esquema de tratamiento con glucocorticoide es apropiado para tratar el tumor cuando el perfil de expresión del marcador predictivo o la serie de marcadores predictivos demuestra respuesta aumentada o no respuesta disminuida de acuerdo con el perfil de expresión de los marcadores predictivos en presencia del agente .
La invención también proporciona un método para determinar si el tratamiento con un inhibidor de proteasoma debe iniciarse en un paciente seleccionado a partir de un paciente con mieloma múltiple, un paciente con linfoma, un paciente de leucemia, un paciente de cáncer de pulmón, un paciente de cáncer de mama, y una paciente con cáncer de ovario, un paciente con cáncer de próstata, un paciente de cáncer de colon, un paciente de cáncer de riñon y un paciente de cáncer de hígado; que consiste en obtener una o más muestras, seguido por la determinación del nivel de expresión de uno o más marcadores que corresponde a los marcadores identificados en alguna de las Tablas ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 de la muestra; e iniciar el tratamiento inhibidor de proteasoma cuando el perfil de expresión de los marcadores predictivos identificados en cualquiera de las tablas ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 es indicativo de un paciente sensible a tal tratamiento. En otra versión, el tratamiento no se inicia cuando el perfil de expresión de los marcadores predictivos identificados en alguna de la Tabla 1A, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 es indicativo de un paciente no sensible al tratamiento.
La invención también proporciona un método para determinar si el tratamiento con tratamiento de inhibición de proteasoma debe iniciarse en un paciente seleccionado de un paciente con mieloma múltiple, un paciente de linfoma, un paciente de leucemia, un paciente de cáncer de pulmón, un paciente de cáncer de mama y un paciente de cáncer de ovario, un paciente de cáncer de próstata, un paciente de cáncer de colon, un paciente de cáncer de riñon y un paciente de cáncer de hígado; que consiste en obtener una o mas muestras de células de tumor de un paciente, seguido por la determinación del perfil de expresión de la muestra de una serie de marcadores predictivos que comprende los marcadores identificados en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3; e hincar el tratamiento inhibidor de proteasoma cuando el perfil de expresión de los marcadores predictivos identificados en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 es indicativo del paciente sensible. De otro modo, el tratamiento no se inicia cuando el perfil de expresión de los marcadores predictivos identificados en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y/o Tabla 3 es indicativo de un paciente no sensible.
La invención también proporciona un método para determinar si el tratamiento con un tratamiento glucocorticoide debe iniciarse en un paciente seleccionado de un paciente con mieloma múltiple, un paciente de linfoma, un paciente de leucemia, un paciente de cáncer de pulmón, un paciente de cáncer de mama, y una paciente de cáncer de ovario, un paciente de cáncer de próstata, un paciente de cáncer de colon, un paciente de cáncer de riñon y un paciente de cáncer de hígado; seguido por la determinación del nivel de expresión de uno o más marcadores que corresponden a los marcadores identificados en alguna de las tablas ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 en la muestra; e iniciar el tratamiento con glucocorticoide cuando el perfil de expresión de los marcadores predictivos identificados en algunas de las tablas ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 es indicativo de un paciente sensible a tal tratamiento. De otro modo, el tratamiento no se inicia cuando el perfil de expresión de los marcadores predictivos identificados en alguna Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 es indicativo de un paciente no sensible al tratamiento.
La invención también proporciona un método para determinar si el tratamiento con terapia glucocorticoide debe iniciarse en un paciente seleccionado de un paciente de mieloma múltiple, un paciente de linfoma, un paciente de leucemia, un paciente de cáncer de pulmón, un paciente de cáncer de mama, y una paciente de cáncer de ovario, un paciente de cáncer de próstata, un paciente de cáncer de colon, un paciente de cáncer de riñon y un paciente de cáncer de hígado; que consiste en obtener una o más muestras de células de tumor de un paciente, seguido por la determinación de perfil de la expresión en la muestra de una serie de marcadores predictivos que comprende los marcadores identificados en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3; e iniciar el tratamiento glucocorticoide cuando el perfil de expresión de los marcadores predictivos identificados en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 es indicativo de un paciente sensible. De otro modo, el tratamiento no se inicia cuando el perfil de expresión de los marcadores predictivos identificados en la Tabla 1A, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y/o Tabla 3 es indicativo de un paciente no sensible.
Monitorización de la eficacia de un agente anticáncer Como se analiza anteriormente, los marcadores sensibles y no predictivos identificados pueden ser utilizados como marcadores farmacodinámicos para evaluar si el tumor se ha vuelto resistente a un tratamiento en curso (por ejemplo tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide) . Cuando el cáncer no esta respondiendo a un tratamiento, el perfil de expresión de las células de tumor cambiará: el nivel o expresión relativa de uno o más de los marcadores predictivos (por ejemplo aquellos marcadores predictivos que se identifican en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3) tales que el perfil de expresión representa un paciente no sensible.
En un uso como éste, la invención propone los métodos para determinar si un tratamiento contra cáncer que comprende tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide debe continuarse en un paciente de cáncer, que consiste en determinar la expresión de por lo menos un marcador predictivo o una serie de marcadores, en donde los marcadores se seleccionan de aquellos establecidos en alguna de la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 en una muestra de tumor de un paciente expuesta a un tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide; y continuar el tratamiento cuando el perfil de expresión del marcador o la serie de marcadores demuestra respuesta al agente que se está utilizando.
En otro uso como estos, la invención proporciona los métodos para determinar si un tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide debe interrumpirse en un agente de cáncer, que consiste en determinar la expresión de por lo menor un marcador predictivo o una serie de marcadores predictivos, en donde los marcadores se seleccionan de aquellos establecidos en alguna de la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 en una muestra de tumor de un paciente expuesta a un tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide; e interrumpir o alterar el tratamiento cuando el perfil de expresión de los marcadores identificados en alguna de las tablas, Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 demuestra no sensibilidad al agente que se esta utilizando .
Cuando se utiliza en la presente, un paciente se refiere a cualquier individuo que sufra tratamiento de inhibidor de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide para el tratamiento contra cáncer. El individuo puede ser un paciente humano que se someta a inhibición de proteasoma (por ejemplo Bortezomib u otro agente relacionado) y/o tratamiento con glucocorticoide (por ejemplo dexametasona, utilizando un solo agente terapéutico. El individuo puede ser un paciente humano que sufra tratamiento de inhibición de proteasoma (por ejemplo Bortezomib u otro agente relacionado) y/o con glucocorticoide (por ejemplo dexametasona) utilizando un agente terapéutico junto con otro agente (por ejemplo un tratamiento quimioterapeutico) . La presente invención también incluye la comparación de dos o mas muestras obtenidas de un paciente que sea sometido a un tratamiento anticancer que incluye el tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide . En general, es posible obtener una primera muestra del paciente antes de comenzar el tratamiento y una o mas muestras durante el tratamiento. En un uso como este, se determina una linea base de la expresión antes del tratamiento, luego se monitorizan los cambios en el estado de expresión de la línea base durante el curso del tratamiento. De otro modo, dos o más muestras sucesivas obtenidas durante el tratamiento pueden utilizarse sin la necesidad de una muestra línea base previa al tratamiento. En un uso como este, la primera muestra obtenida del individuo se utiliza como una línea base para determinar si la expresión de un marcador particular o serie de marcadores esta aumentando o disminuyendo.
En general, durante la monitorización de la eficacia de un tratamiento terapéutico, se examinan dos o más muestras de un paciente. En otro aspecto, se utilizan tres o más muestras obtenidas en sucesión, incluido por lo menos una muestra previa al tratamiento.
La invención proporciona los métodos para determinar si el tratamiento con un esquema de tratamiento de inhibidor de proteasoma debe continuarse en un paciente seleccionado de un paciente de mieloma múltiple, un paciente de linfoma, un paciente de leucemia, un paciente de cáncer de pulmón, un paciente de cáncer de mama, y una paciente de cáncer de ovario, un paciente de cáncer de próstata, un paciente de cáncer de colon, un paciente de cáncer de riñon y un paciente de cáncer de hígado; que consiste en obtener dos o mas muestras de células de tumor de un paciente en diferentes momentos durante el transcurso de un esquema de tratamiento de inhibición de proteasoma, seguido por la evaluación de la expresión de uno o más marcadores que corresponden a los marcadores identificados en alguna de la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 en las dos más muestras; y continuar el tratamiento cuando el perfil de expresión de los marcadores predictivos identificados en alguna de las tablas ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 es indicativo de un paciente sensible durante el transcurso del tratamiento. En métodos como estos, un tratamiento de inhibición de proteasomas y esquema se determina apropiado para tratar al paciente cuando el perfil de expresión del marcador predictivo o la serie de marcadores predictivos demuestra aumentada o no respuesta disminuida de acuerdo con el perfil de expresión de los marcadores predictivos en presencia del agente.
Además se proporcionan los métodos para determinar si el tratamiento con un esquema de tratamiento de inhibidor de proteasoma debe continuarse en un paciente seleccionado de un paciente de mieloma múltiple, un paciente de linfoma, un paciente de leucemia, un paciente de cáncer de pulmón, un paciente de cáncer de mama, y una paciente de cáncer de ovario, un paciente de cáncer de próstata, un paciente de cáncer de colon, un paciente de cáncer de riñon y un paciente de cáncer hepático; que consiste en obtener dos o mas muestras de células de tumor de un paciente en diferentes momentos durante el transcurso de un tratamiento contra cáncer, seguido por la evaluación de la expresión de una serie de marcadores predictivos que comprende los marcadores que se identifica en alguna de las tablas ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 en las dos o mas muestras; y continuar el tratamiento cuando el perfil de expresión de la serie de marcadores predictivos indica respuesta aumentada o no respuesta disminuida de acuerdo con la expresión durante el transcurso del tratamiento. De otro modo, el tratamiento se interrumpe cuando el perfil de expresión de la serie de marcadores demuestra respuesta disminuida y/o no respuesta aumentada durante el transcurso del tratamiento.
La invención proporciona los métodos para determinar si el tratamiento con un esquema de tratamiento con glucocorticoide debe continuarse en un paciente seleccionado de un paciente de m eloma múltiple, paciente de linfoma, un paciente de leucemia, un paciente de cáncer de pulmón, un paciente de cáncer de mama, y una paciente de cáncer de ovario, un paciente de cáncer de próstata, un paciente de cáncer de colon, un paciente de cáncer de riñon y un paciente de cáncer de hígado; que consiste en obtener dos o más muestras de células de tumor de un paciente en diferentes tiempos durante el transcurso del esquema de tratamiento con glucocorticoide, seguido por la evaluación de la expresión de uno o más marcadores que corresponda a los marcadores identificados en alguna de las tablas ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 en dos o más muestras; y continuar el tratamiento cuando el perfil de expresión de los marcadores predictivos identificados en alguna de las tablas ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 sea indicativo de un paciente sensible durante el transcurso del tratamiento. En estos métodos, el esquema de tratamiento con glucocorticoide se determina apropiado para tratar al paciente cuando el perfil de expresión del marcador predictivo o la serie de marcadores predictivos demuestra respuesta aumentada o no respuesta disminuida de acuerdo con el perfil de expresión de los marcadores predictivos en presencia del agente.
Adicionalmente se proporcionan los métodos para determinar si el tratamiento con un esquema de tratamiento con glucocorticoide debe continuarse en un paciente seleccionado de un paciente de mieloma múltiple, paciente de linfoma, un paciente de leucemia, un paciente de cáncer de pulmón, un paciente de cáncer de mama, y una paciente de cáncer de ovario, un paciente de cáncer de próstata, un paciente de cáncer de colon, un paciente de cáncer de riñon y un paciente de cáncer de hígado; que consiste en obtener dos o mas muestras de células de tumor o un paciente en diferentes tiempos durante el transcurso de un esquema de tratamiento con glucocorticoide, seguido por la evaluación de la expresión de una serie de marcadores predictivos que consiste en los marcadores identif3 cados en alguna de las tablas ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 en las dos o más muestras; y continuar el tratamiento cuando el perfil de expresión de la serie de marcadores predictivos indica respuesta aumentada o no respuesta disminuida de acuerdo con la expresión durante el transcurso del tratamiento. De otro modo, el tratamiento se interrumpe cuando el perfil de expresión de la serie de marcadores demuestra respuesta disminuida y/o no respuesta aumentada durante el transcurso de tratamiento.
Algunos aspectos de la invención se refieren a los métodos de tratamiento y/o diagnostico de un paciente con cáncer utilizando las muestras. La fuente de las células cancerosas que se utilizan en los métodos presentes se basará en la forma en la que se esté utilizando el método de la presente invención. Por ejemplo, si el método se está utilizando para determinar si el cáncer de un paciente puede ser tratado con un agente o una combinación de agentes, entonces la fuente preferida de la muestra será células cancerosas obtenidas de un tumor del paciente, por ejemplo, una biopsia de tumor (incluido un tumor sólido o uno líquido) , una muestra de sangre, una muestra de plasma, una muestra de orina, una muestra de saliva, una muestra de linfa u otra muestra puede utilizarse. Una muestra obtenida de un tumor puede estar enriquecida para células de tumor para aumentar la especificidad del análisis. Una variedad de métodos conocidos en la técnica puede utilizarse para enriquecer las células de tumor, que incluye la centrifugación diferencial, análisis de clasificación de células por fluorescencia (FACS), aislamiento de células con base en el crecimiento independiente de la unión al sustrato, unión a un agente de selección, por ejemplo, a un anticuerpo a un marcador de tumor y además unir el anticuerpo y de ese modo la célula de tumor unida al soporte sólido, etcétera. De otro modo, es posible ensayar una línea de células de cáncer semejante al tipo de cáncer que se esta tratando. Por ejemplo, si se esta tratando mieloma múltiple, entonces puede utilizarse una línea de células de mieloma, si se está utilizando el método para predecir o monitopzar la eficacia de un protocolo terapéutico, entonces una muestra de tejido o sangre de un paciente que se este tratando es una fuente preferida. Si el método se esta utilizando para determinar la actividad de un agente, la eficacia de un agente o para identificar nuevos agentes terapéuticos o combinaciones, es posible utilizar cualquier célula de cáncer, por ejemplo, células de una linea de células de cáncer, células aisladas de un tumor de un modelo animal.
Un experto puede fácilmente seleccionar y obtener las células de cáncer apropiadas que se utilicen en el método presente. Para las lineas de células de cáncer, se prefieren las fuentes como el The National Cáncer Institute (Instituto Nacional de Cáncer) para las células NCI-60. Para las células de cáncer obtenidas de un paciente, es posible emplear métodos de biopsia normales, como puede ser biopsia de aguja.
Las muestras de mieloma fueron utilizadas para identificar los marcadores de la presente invención, además, el nivel de expresión de los marcadores puede evaluarse en otros tipos de tejido incluidos los trastornos de los tipos de células hematológicas relacionadas que incluye, por ejemplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, el síndrome mielodisplásico y otros canceres hematológicos que incluye linfomas, leucemias, así como tumores de varios tejidos sólidos. De este modo se apreciará que la células de otras malignidades hematológicas que incluye, por ejemplo, linfomas de células B, linfoma de no Hodgkin, síndrome de Waldenstrom u otras leucemias serán útiles en los métodos de la presente invención. Todavía más, los marcadores predictivos que predicen agresividad de la enfermedad así como respuesta y no respuesta a los agentes terapéuticos para la inhibición de proteasoma en tumores sólidos (por ejemplo pulmón, mama, próstata, ovario, colon, riñon e hígado) también pueden ser útiles en los métodos de la presente invención.
Preferentemente, las muestras que se utilicen serán de tumores semejantes o de células no cancerosas del mismo origen de tejido como el tumor en cuestión. La elección de la fuente de células dependerá del uso de los datos del nivel de expresión relativo. Por ejemplo, el uso de tumores de tipos semejantes para obtener una media de la puntuación de expresión permite la identificación de los casos extremos de respuesta o no respuesta. El uso de la expresión encontrada en tejidos normales como una media del registro de expresión ayuda a validar si el marcador o serie de marcadores sensible/no predictivo ensayados es especifico del tumor (contra las células normales). Un uso posterior como este es particularmente importante para identificar si un marcador o serie de marcadores sensible o no predictivo puede servir como un marcador o serie de marcadores diana. Además, a medida que se acumulan más datos, se puede revisar la media del valor de expresión, proporcionando valores de expresión relativos, mejorados con base en los datos acumulados.
Ensayos de detección Diversos métodos están disponibles para examinar la expresión de los marcadores, que incluye la tecnología del arreglo/chip de genes, RT-PCR, hibridación ín situ, mmunohistoquímica, inmunoabsorción, FISH (hibridación ín situ de fluorescencia), análisis FACS, Northern blot, Southern blot o análisis citogenéticas . Un experto puede seleccionar de estos u otros métodos apropiados y disponibles con base en el tipo de marcador o marcadores, la muestra de tejido y la enfermedad pertinente. Diferentes métodos o combinaciones de métodos podrían ser apropiados en diferentes pasos o, por ejemplo, en diferentes tipos de tumor sólido o hematológico .
En algunos aspectos de la invención, la expresión del marcador o los marcadores preaictivos identificados en la Tabla 1A, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 se detecta midiendo el mRNA que corresponda al marcador o la serie de marcadores predictivos. En todavía otros aspectos de la invención, la expresión de los marcadores que corresponden a los marcadores o serie de marcadores identificados en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 se detecta midiendo la proteina que corresponde al marcador o la serie de marcadores.
Un método ejemplar para detectar la presencia o ausencia de un acido nucleico o polipeptido que corresponda a un marcador de la invención en una muestra biológica implica obtener una muestra biológica (por ejemplo una muestra de tumor) de un individuo a prueba y poner en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente con capacidad para detectar el polipéptido o ácido nucleico (por ejemplo mRNA, DNA genomico o cDNA) . Los métodos de detección de la invención de este modo pueden utilizarse para detectar mRNA, proteina, cDNA o DNA genomico, por ejemplo, en una muestra biológica m vi tro así como m vivo . Por ejemplo, las técnicas m vi tro para la detección de mRNA incluyen hibridaciones northern, hibridaciones m situ y ensayos Taiman (Applied Biosystems) de acuerdo con las condiciones de laboratorio GLP aprobadas. Las técnicas m vi tro para la detección de un polipeptido correspondiente a un marcador de la invención incluye los ensayos mmunosorbentes de enzimas ligadas (ELISA) , western blots, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicas m vi tro para la detección de DNA genómico incluye hibridaciones southern. Además, las técnicas ín vivo para la detección de un polipeptido correspondiente a un marcador de la invención incluye la introducción en un individuo de un anticuerpo etiquetado dirigido contra el polipéptido. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser etiquetado con un marcador radiactivo cuya presencia y localizacion en un individuo puede detectarse por las técnicas de imagenología normales.
Un principio general, de tales ensayos diagnósticos y pronósticos incluye la preparación de una muestra o mezcla de reacción que puede contener un marcador, una sonda, bajo condiciones apropiadas y durante un tiempo suficiente para permitir que el marcador y la sonda interactúen y se unan, formando así un complejo que puede ser separado y/o detectado en la mezcla de reacción. Estos ensayos pueden ser realizados en diferentes formas.
Por ejemplo, un método para realizar un ensayo como este incluiría anclar el marcador o sonda sobre un soporte en fase sólida, también mencionado como sustrato y detectar los complejos marcador/sonda diana anclados sobre la fase sólida al final de la reacción. Un ejemplo de un método como este, una muestra de un individuo, la cual se va a ensayar para la presencia y/o concentración del marcador, puede anclarse sobre un portador o soporte en fase sólida. En otro ejemplo, es posible la situación contraria, en la que la sonda puede ser anclada a una fase sólida y una muestra de un individuo puede dejarse reaccionar como un componente no anclado del ensayo. Un ejemplo consiste en el uso de un arreglo o chip que contiene un marcador serie de marcadores predictivos anclados para el análisis de la expresión de la muestra.
Existen múltiples métodos establecidos para el anclaje de los componentes del ensayo a una fase sólida. Estos incluyen, sin limitación, moléculas marcadoras o sondas que se inmovilizan por conjugación de biotina y estreptavidina. Estos componentes del ensayo biotmilados pueden prepararse a partir de biotina-NHS (N-hiroxi-succinimida) utilizando las técnicas conocidas en la materia (por ejemplo el kit de biotmilización, Pierce Chemical, Rockford, IL) , e inmovilizados en los pozos de placas de 96 pozos recubiertos con estreptavidina (Pierce Chemical). En algunos aspectos, las superficies con componentes del ensayo inmovilizados pueden prepararse por anticipado y almacenarse. Otros portadores o soportes en fase sólida apropiados para estos ensayos incluyen cualquier material que pueda unir la clase de molécula a la que pertenece el marcador o sonda. Los soportes o portadores bien conocidos pueden ser, más no se limitan a, vidrio, poliestireno, nailon, polipropileno, nailon, polietileno, dextrano, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnenita.
Para hacer los ensayos con los enfoques antes mencionados, el componente no inmovilizado se adiciona a la fase sólida en la cual se ancla el segundo componente. Después de que la reacción está completa, los componentes no acomplejados pueden ser separados (por ejemplo por lavado) en condiciones tales que cualquiera de los complejos formados permanecerá inmovilizado en la fase sólida. La detección de los complejos marcador/sonda anclados a la fase sólida puede lograrse en diversos métodos delineados en la presente. En un ejemplo, cuando la sonda es el componente del ensayo no anclado, puede ser etiquetada con el propósito de detección y lectura del ensayo, directa o indirectamente, con etiquetadas detectables que se describen en la presente y que son bien conocidos para un experto en la técnica.
También es posible detectar directamente la formación del complejo marcador/sonda sin mayor manipulación o etiquetado del componente (marcador o sonda, por ejemplo utilizando la técnica de transferencia de energía de fluorescencia (ver, por ejemplo, Lakowicz y col., Patente US No. 5,631,169; Stavrianopoulos y col., patente US No. 4,868,103). Una etiqueta fluoróforo sobre la primera molécula "donadora" se selecciona de modo que, tras la excitación con luz incidente de longitud de onda apropiada, su energía fluorescente emitida será absorbida por una etiqueta fluorescente en una segunda molécula "aceptora", que a su vez pueda fluorescer debido a la energía absorbida. De otro modo, la molécula de proteína "donadora" puede simplemente utilizar la energía fluorescente natural de residuos de triptofano. Se eligen etiquetas que emitan diferentes longitudes de onda de luz, de modo que la etiqueta de la molécula "aceptora" pueda ser diferenciada de la "donadora". Puesto que la eficiencia de la transferencia de energía entre la etiqueta se relacionada con la distancia que separa las moléculas, las relaciones espaciales entre las moléculas se puede evaluar. En una situación en la que ocurre unión entre las moléculas, la emisión fluorescente de la etiqueta de la molécula "aceptora" en el ensayo debe ser máxima. Un evento de unión FET puede ser convenientemente medido a través de medios de detección fluorométrica normales bien conocidos en la técnica (por ejemplo utilizando un fluorímetro) .
En otro ejemplo, la determinación de la capacidad de una sonda para reconocer un marcador puede lograrse sin etiquetar algún componente del ensayo (sonda o marcador) utilizando una tecnología como puede ser el análisis de interacción molecular de tiempo real (BIA) (ver, por ejemplo, Sjolander, S. y Urbanickzy, C, 1991, Anal . Chem . 63: 2338-2345 y Szabo y col., Curr. Opm . Struct . Biol . 5: 699-705). Cuando se utiliza en la presente, "BIA" o "resonancia de plasmón superficial" es una técnica para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real sin etiquetar alguno de los interactuantes (por ejemplo BIAcore) . Los cambios en la masa en la superficie de unión (indicativa de un episodio de unión) da como resultado alteraciones del índice de refracción de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de resonancia de plasmón superficial (SPR) ) , dando como resultado una señal de detectable que puede utilizarse como indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.
De otro modo, en otro ejemplo, ensayos diagnósticos y pronósticos análogos pueden hacerse con el marcador y sondas como solutos en fase líquida. En un ensayo como este, el marcador y sonda acomplejados se separan de los componentes no acomplejado por cualquiera de las técnicas normalizadas, que incluye más no se limita a: centrifugación diferencial, cromatografía, electroforesis e inmunoprecipitación. En la centrifugación diferencial, los complejos marcador/sonda pueden separarse de los componentes del ensayo no acomplejados mediante una serie de pasos de centrifuga, debido a los diferentes equilibrios de sedimentación de los complejos con base en sus diferentes tamaños y densidades (ver, por ejemplo, Rivas, G., y Minton, A. P., 1993, Trends Biochem Sci . 18 (8): 284-7). También es posible utilizar las técnicas cromatográficas normalizadas para separar las moléculas acomplejadas de las no acomplejadas. Por ejemplo, la cromatografía de filtración en gel separa moléculas con base en el tamaño, y a través de la utilización de una resina de filtración gel apropiada en un formato de columna, por ejemplo, el complejo relativamente más grande puede ser separado de los componentes no acomplejados relativamente más pequeños. Del mismo modo, las propiedades de carga relativamente diferentes del complejo marcador/sonda en comparación con los componentes no acomplejado se puede aprovechar para diferenciar el complejo de los componentes no acomplejados, por ejemplo, mediante la utilización de resinas cromatográficas de intercambio iónico. Estas resinas y las técnicas cromatográficas son bien conocidas para un experto en la técnica (ver, por ejemplo, Heegaard, N. H. 1998, J. Mol . Recogni t . Winter 11 (1-6): 141-8; Hage, D. S. y Tweed, S. A. J. Chroma togr B Biomed Sci . Appl . 1997 Octubre 10; 699-(l-2): 499-525). La electroforesis en gel también puede emplearse para separar componentes del ensayo acomplejados de componentes no unidos (ver, por ejemplo, Ausubel, y col., ed., Curren t Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987-1999) . En esta técnica, los complejos proteína o ácido nucleico se separan con base en el tamaño o carga, por ejemplo. Para mantener la interacción de unión durante el proceso electroforético, normalmente se prefieren materiales matriz de gel no desnaturalizante y las condiciones en ausencia de agente reductor. Las condiciones apropiadas para el ensayo particular y los componentes de este serán bien conocidos para un experto en la materia.
El nivel de mRNA que corresponde el marcador puede determinarse mediante formatos in si tu e in vi tro en muestras biológicas utilizando los métodos conocidos en la materia. El término "muestra biológica" esta destinado a incluir tejidos, células, fluidos biológicos y aislados de estos, aislados de un individuo, así como tejidos, células y fluidos presentes en un individuo. Múltiples métodos de detección de la expresión utilizan RNA aislado. Para los métodos in vi tro, cualquier técnica de separación de RNA que no seleccione contra el aislamiento de mRNA puede utilizarse para la purificación del RNA a partir de células de tumor (ver, por ejemplo, Ausubel y col., ed., Current. Protocols. In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999) . Además, grandes números de muestras de tejido pueden ser fácilmente procesadas utilizando las técnicas bien conocidas para el experto en la materia, como puede ser, por ejemplo, el proceso de aislamiento de RNA de un solo paso de Chomczynski (1989, Patente US No. 4,843,155).
Un método diagnóstico para la detección de niveles de mRNA consiste en poner en contacto el mRNA aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que pueda hibridar al mRNA codificado por el gen que se esté detectando. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un cDNA de longitud completa, o una porción de éste, como puede ser un oligonucleótido de por lo menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridar específicamente en condiciones restrictivas a mRNA o DNA genómico que codifica un marcador de la presente invención. Otras sondas apropiadas para uso en los ensayos diagnósticos de la invención están descritas en la presente. La hibridación de un mRNA con la sonda indica que el marcador en cuestión se esta expresando.
En un formato, el mRNA se inmoviliza sobre una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo corriendo el mRNA aislado sobre un gel de agaroza y transfiriendo el mRNA del gel a una membrana, como puede ser nitrocelulosa. En otro formato, la sonda o sondas se inmovilizan sobre una superficie sólida y el mRNA se pone en contacto con la sonda o sondas, por ejemplo, en un arreglo de chip de gen affimetrix. Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente los métodos de detección de mRNA conocidos para uso en la detección del nivel de mRNA codificado por los marcadores de la presente invención.
Un método alternativo para determinar el nivel de mRNA que corresponde al marcador de la presente invención en una muestra consiste en el proceso de amplificación del ácido nucleico, por ejemplo, por rtPCR (la descripción experimental establecida en Mullís, 1987, Patente US No. 4,683,202), la reacción en cadena de la ligasa (Barany, 1991, Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 88: 189-193) , la replicación de la secuencia autosostenida (Guatelli y col., 1990, Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 86: 1874-1878), el sistema de amplificación transcripcional (Kwoh y col., 1989, Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 86: 1173-1177), la Q-beta replicacisa (Lizardi y col., 1988, Bio/Technology 6: 1197), la replicación del circulo rodante (Lizardi y col., Patente US No. 5,854,033) o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido por la detección de las moléculas amplificadas utilizando las técnicas bien conocidas para los expertos en la materia. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la determinación de moléculas de ácido nucleico si tales moléculas están presentes en cantidades muy bajas. Cuando se utiliza en la presente, los cebadores de la amplificación se definen como un par de moléculas de ácido nucleico que puede hibridar a regiones 5' ó 3' de un gen (hebras más y menos, respectivamente, o viceversa) y contienen una región corta entre estas. En general, los cebadores de amplificación son de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos de longitud y flanquean una región de aproximadamente 50 a 200 nucleótidos de longitud. En condiciones apropiadas y con reactivos apropiados, tales cebadores permiten la amplificación de una molécula de ácido nucleico que contenga la secuencia de nucleótidos flanqueada por los cebadores .
Para los métodos in situ, el mRNA no necesita ser aislado de las células de cáncer antes de la detección. En métodos como estos, una muestra de célula o tejido se prepara/procesa utilizando los métodos histológicos conocidos. Luego la muestra se inmoviliza en un soporte, por lo regular, un porta objetos de vidrio, y luego se pone en contacto con una sonda que puede hibridar a mRNA que codifica el marcador.
Como una alternativa para hacer determinaciones basadas en el nivel de expresión absoluto del marcador, las determinaciones pueden basarse en el nivel de expresión normalizado del marcador. Los niveles de expresión se formalizan corrigiendo el nivel de expresión absoluto de un marcador comparando su expresión con la expresión de un gen de referencia que no es un marcador, por ejemplo, un gen de mantenimiento que se exprese constitutivamente. Los genes apropiados para la normalización incluyen genes de mantenimiento como el gen de actina o los genes específicos de células epiteliales.
Esta normalización permite la comparación del nivel de expresión en una muestra, por ejemplo, una muestra de un paciente, con otra muestra, por ejemplo una muestra no de cáncer, o entre muestras de diferentes orígenes.
De otro modo, el nivel de expresión puede ser proporcionado como nivel de expresión relativo. Para determinar un nivel de expresión relativo de un marcador, se determina el nivel de expresión del marcador para 10 o más muestras de aislados de células normales contra cancerosas, preferentemente 50 o más muestras, antes de la determinación el nivel de expresión para la muestra en cuestión. El nivel de expresión medio de cada uno de los marcadores y series de marcadores ensayados en el número más grande de muestras se determina y este se utiliza como un nivel de expresión linea base para el marcador. El nivel de expresión del marcador determinado para la muestra experimental (nivel de expresión absoluto) entonces se divide entre el valor de expresión medio obtenido para este marcador. Esto proporciona un nivel de expresión relativo.
En otro aspecto de la presente invención, se detecta un polipéptido que corresponde a un marcador. Un agente preferido para detectar un polipéptido de la invención es un anticuerpo con capacidad para unirse a un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención, preferentemente un anticuerpo con un nivel detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más preferentemente, monoclonales. Es posible utilizar un anticuerpo intacto, o un fragmento de este (por ejemplo Fab ó F(ab')2). El término "etiquetado" con respecto a la sonda o anticuerpo, esta destinado a comprender el etiquetado directo de la sonda o anticuerpo por acoplamiento (es decir, enlace físico) de una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como etiquetado indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que esté directamente etiquetado. Los ejemplos del etiquetado indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario etiquetado con florescencia y el etiquetado final de una sonda de DNA con biotina de modo que ésta pueda ser detectada con estreptavidina etiquetada con esencia.
Es posible emplear diversos formatos para determinar si una muestra contiene una proteína que se une a un anticuerpo determinado. Los ejemplos de estos formatos pueden ser, más no se limitan a, inmunoensayo de enzimas (EIA) , radioinmunoensayo (RÍA) , análisis western blot y el ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligadas (ELISA) . Un experto puede apartar fácilmente los métodos de detección de proteínas/anticuerpos, conocidos, para utilizarlos en la determinación si una muestra que contiene células cancerosas expresa un marcador de la presente invención.
En un formato, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden utilizarse en los métodos como puede ser las técnicas western blot o de inmunofluorescencia para detectar las proteínas expresadas. En tales usos, generalmente es preferible inmovilizar el anticuerpo o las proteínas sobre un soporte sólido. Los soportes o portadores en fase sólida apropiados incluyen cualquier soporte con capacidad de unión de un antígeno o u anticuerpo. Los soportes o portadores bien conocidos incluyen, vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextran, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita .
Un experto en la técnica conocerá muchos otros portadores apropiados para unión del anticuerpo o antígeno, y podrá adaptar tal soporte para uso con la presente invención. Por ejemplo, la proteína aislada de células de tumor puede ser corrida sobre una electroforesis en gel de poliacrilamida e inmovilizada sobre un soporte en fase sólida como nitrocelulosa. El soporte entonces puede ser lavado con soluciones amortiguadoras apropiadas seguido por el tratamiento con el anticuerpo etiquetado de manera que se pueda detectar. El soporte en fase sólida puede entonces ser lavado con la solución amortiguadora una segunda vez para separar el anticuerpo no unido. La cantidad de etiquetada unida sobre el soporte sólido entonces se puede detectar por medios tradicionales.
Otro método para determinar el nivel de un polipéptido que corresponde a un marcador es la espectrometría de masa. Por ejemplo, las proteínas intactas o péptidos, por ejemplo péptidos trípticos, pueden ser analizados a partir de una muestra, por ejemplo, una muestra de tumor, sangre, plasma, orina, etcétera que contenga uno o más marcadores polipéptidos. El método además puede incluir el tratamiento de la muestra para reducir las cantidades de proteínas abundantes, por ejemplo, albúmina sérica, para aumentar la sensibilidad del método. Por ejemplo, es posible utilizar cromatografía líquida para fraccionar la muestra de modo que las porciones de la muestra puedan ser analizadas por separado por espectrometría de masa. Los pasos pueden realizarse en sistemas separados o en un sistema combinando cromatografía líquida/espectrometría de masa (LC/MS, ver por ejemplo Liao, y col., Arthri tis Rheum, 50. 3792-3803 (2004)). El sistema de espectrometría de masa también puede estar en modo en tándem o cascada (MS/MS) . La distribución del estado de la carga de la mezcla de proteínas o péptidos se puede adquirir sobre uno o múltiples barridos y analizarse por métodos estadísticos, por ejemplo, utilizando el tiempo de retención y la relación de la masa a la carga (m/z) en el sistema LC/MS, para identificar las proteínas que se expresan en niveles estadísticamente significativos diferencialmente en muestras de pacientes sensibles o no sensibles a la inhibición del proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoides. Los ejemplos de los espectrómetros de masa que pueden utilizarse son un sistema de trampa de iones (ThermoFinningan, San José, CA) o un espectrómetro de masa cuadruplo de tiempo de vuelo (Applied Biosystems, Foster City, CA) . El método además puede incluir el paso de la huella dactilar de la masa del péptido, por ejemplo, en un método de espectrometría de masa de ionización de deserción de láser asistido por matriz con tiempo de vuelo (MALDI-TOF) . El método además puede incluir el paso de secuenciar uno o más de los péptidos trípticos. Los resultados de este método pueden utilizarse para identificar las proteínas a partir de bases de datos de secuencias primarias, por ejemplo, los mantenidos por el Centro Nacional de Información Biotecnológica, Bethesda, MD, o el Instituto Suizo de Bioinformática, Genova, Suiza, y basado en los picos de la base m/z del péptido tríptico de espectrometría de masa.
Arreglos legibles en apara to electrónico El aparato electrónico, que incluye los arreglos legibles que contienen por lo menos un marcador predictivo de la presente invención también está contemplado para uso en conjunto con los métodos de la invención. Cuando se utiliza en la presente, "medios legibles en aparato electrónico" se refiere a cualquier medio apropiado para almacenar, mantener o contener datos o información que puedan ser leídos y accedidos directamente por un aparato electrónico. Cuando se utiliza en la presente, el término "aparato electrónico" está destinado para incluir cualquier aparato de cómputo o procesamiento apropiado u otro dispositivo configurado o adaptado para almacenar datos o información. Los ejemplos del aparato electrónico apropiado para uso con la presente invención y monitorizar la información registrada incluyen el aparato de computo independiente; redes, incluidas una red de área local (LAN) , una red de área amplia (WAN), Internet, intranet y extranet; aparatos electrónicos como asistentes digitales personales (los PDA), teléfono celular, localizador y similares; y sistemas de procesamiento locales y distribuidos. Cuando se utiliza en la presente, "registrado" se refiere a un proceso para almacenar o codificar información en un medio legible por un aparato electrónico. Los expertos en la técnica pueden adoptar fácilmente cualquiera de los métodos actualmente conocidos para registrar información sobre medios conocidos para generar manufacturas que contengan los marcadores de la presente invención.
Por ejemplo, los sistemas de microarreglos son bien conocidos y se utilizan en la técnica para evaluar las muestras, sea por evaluación de la expresión génica (por ejemplo detección de RNA, detección de proteínas) o producción de metabolitos, por ejemplo. Los microarreglos para uso de acuerdo con la invención incluyen una o más sondas de marcador o marcadores predictivos de la invención característicos de respuesta y/o no respuesta a un esquema terapéutico como se describe en la presente. En una modalidad, el microarreglo comprende una o más sondas correspondientes a uno o más de los marcadores seleccionados del grupo que consiste en los marcadores que demuestran expresión aumentada en pacientes sensibles, y genes que demuestran no respuesta en pacientes. Diversas configuraciones diferentes de microarreglos y métodos para su producción son conocidos para los expertos en la técnica y están descritos, por ejemplo, en las Patentes U. S. Nos: 5,242,974; 5,384,261 5,405,783 5,412,087 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327 5,445,934 5,556,752 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186 5,429,807 5,436,327 5,472,672; 5,527,681; 5,529,756 5,545,531 5,554,501 5,561,071; 5,571,639; 5,593,839 5, 624,711 5,700,637 5,744,305; 5,770,456; 5,770,722 5,837,832 5,856,101 5,874,219; 5,885,837; 5,919,523 5981185; 6,022,963; 6,077,674; 6,156,501; 6261776 6346413; 6440677; 6451536; 6576424; 6610482; 5,143,854 5,288,644; 5,324,633; 5,432,049; 5,470,710; 5,492,806 5,503,980; 5,510,270; 5,525,464; 5,547,839; 5,580,732 5,661,028; 5,848,659; y 5,874,219;; Shena, et al.
Tibtech 16:301, 1998; Duggan, et al., Nat. Genet. 21:10 1999; Bowtell, et al., Nat. Genet. 21:25, 1999; Lipshutz et al., 21 Nature Genet. 20-24, 1999; Blanchard, et al. 11 Biosensors and Bioelectronics, 687-90, 1996; Maskos et al., 21 Nucleic Acids Res. 4663-69, 1993; Hughes, et al., Nat. Biotechol. 19:342, 2001; cada uno de los cuales se incorpora en la presente para referencia. Un microarreglo de tejido puede utilizarse para la identificación de proteína. (Ver Hans y col., Blood, 103: 275-282 (2004)). Un microarreglo de fago-epítope puede utilizarse para identificar una o más proteínas en una muestra con base en si la proteína o las proteínas inducen auto-anticuerpos en el paciente (Bradford y col., Urol . Oncol . 24: 237-242 (2006)).
De este modo, un microarreglo comprende una o más sondas que corresponden a uno o más marcadores predictivos identificados en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3. El microarreglo puede comprender sondas correspondientes a, por ejemplo, por lo menos 10, por lo menos 20, por lo menos 50, por lo menos 100 o por lo menos 1000 marcadores predictivos de la invención característicos de la respuesta del paciente al tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoides. El microarreglo puede comprender sondas correspondientes a uno o más marcadores predictivos como se establece en la presente. Todavía más, el microarreglo puede comprender series de marcadores completas como se establece en la presente y las cuales pueden ser seleccionadas y compiladas de acuerdo con los métodos que se establecen en la presente. El microarreglo puede ser utilizado para ensayar la expresión de uno o más marcadores predictivos o series de marcadores predictivos en el arreglo. En un ejemplo, el arreglo puede ser utilizado para ensayar la expresión de más de un marcador predictivo o serie de marcadores en una muestra para averiguar un perfil de expresión de los marcadores en el arreglo. De este modo, es posible ensayar simultáneamente la expresión de hasta aproximadamente 44,000 marcadores. Esto permite elaborar un perfil que muestre una batería de marcadores específicamente expresados en una o más muestras. Todavía más, esto permite preparar un perfil para evaluar la sensibilidad a uno o más tratamientos (por ejemplo tratamiento con glucocorticoides o tratamiento de inhibición de proteasoma) .
El arreglo también es útil para averiguar patrones de expresión diferenciales de uno o más marcadores en células normales y anormales (por ejemplo la muestra, por ejemplo, de tumor) . Esto proporciona una batería de marcadores predictivos que podrían servir como una herramienta para facilitar la identificación de pacientes sensibles y no sensibles. Además, el arreglo es útil para averiguar la expresión de los marcadores de referencia para niveles de expresión de referencia. En otro ejemplo, el arreglo puede ser utilizado para monitorizar el transcurso del tiempo de la expresión de uno o más marcadores predictivos en el arreglo.
Además de una determinación cualitativa como ésta, la invención permite la cuantificación de la expresión de los marcadores. Así pues, los marcadores predictivos pueden ser agrupados con base en la serie de marcadores o indicaciones de sensible o no sensible por el nivel de expresión de la muestra. Esto es útil, por ejemplo, para averiguar la indicación de sensible o no sensible de la muestra en virtud del puntaje de los niveles de expresión de acuerdo con los métodos que se proporcionan en la presente.
El arreglo también es útil para averiguar el efecto de la expresión de un marcador sobre la expresión de otros marcadores predictivos en la misma célula o en células diferentes. Esto proporciona, por ejemplo, una selección de dianas moleculares alternativas para intervención terapéutica sin el esquema de inhibición de proteasoma y/o el esquema del tratamiento con glucocorticoides es no sensible.
Reactivos y equipos La invención también comprende los equipos para detectar la presencia de un polipéptido o ácido nucleico correspondiente a un marcador de la invención en una muestra (por ejemplo una muestra de tumor) . Estos equipos pueden utilizarse para determinar si un individuo esta predispuesto a responder o no responder a un esquema de tratamiento contra cáncer. En otro aspecto, la invención proporciona un kit de prueba para monitorizar la eficacia de un compuesto terapéutico en una muestra. Por ejemplo, el equipo puede contener una sonda etiquetada capaz de detectar un polipéptido o un mRNA que codifique un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención en una muestra biológica y medios para determinar la cantidad del polipéptido o mRNA de la muestra (por ejemplo un anticuerpo que se une al polipéptido o una sonda oligonucleótida que se una a DNA o mRNA que codifique el polipéptido) . Los equipos además pueden contener instrucciones para uso de los equipos proporcionados y la interpretación de los resultados obtenidos utilizando el equipo; reactivos adicionales para la preparación de las sondas para uso en los métodos proporcionados; y la etiqueta detectable, sola o conjugada a la sonda o sondas proporcionadas.
Para los equipos basados en anticuerpo, el equipo puede contener, por ejemplo: (1) un primer anticuerpo (por ejemplo unido a un soporte sólido) que sea un polipéptido que corresponda a un marcador de la invención; y como una opción, (2) un segundo anticuerpo diferente que se une al polipéptido o al primer anticuerpo y se conjugue a una etiqueta detectable.
Para equipos basados en oligonucleótido, el equipo puede contener, por ejemplo: (1) un oligonucleótido, por ejemplo, un oligonucleótido etiquetado de manera que se pueda detectar, el cual hibrida a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención; (2) un par de cebadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico que corresponda a un marcador de la invención; o (3) una serie de marcadores que contenga los oligonucleótidos que hibridan a por lo menos dos secuencias de ácido nucleico que codifiquen los marcadores predictivos polipeptídicos de la invención. El equipo también puede contener, por ejemplo, un agente amortiguador, un preservador o un agente estabilizador de proteínas. El equipo además puede contener componentes necesarios para detectar la etiqueta detectable (por ejemplo una enzima o un sustrato) . Para series de marcadores, el equipo puede contener un arreglo o chip de la serie de marcadores para uso en la detección de los marcadores predictivos. El equipo también puede contener una , muestra de referencia o una serie de muestras de referencia que pueden ser ensayadas y comparadas con la muestra experimental. Cada componente del equipo puede estar contenido dentro de un envase individual y todos los diferentes envases pueden estar dentro de un solo paquete, junto con las instrucciones para interpretar los resultados de los ensayos que se hagan utilizando el equipo.
Agentes terapéuticos Los marcadores y series de marcadores de la presente invención son predictivos de los pacientes que son sensibles o no sensibles (sensibles o resistentes) a los esquemas de tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoides, en general.
Los agentes terapéuticos para uso en los métodos de la invención incluyen una clase de agentes terapéuticos conocidos como inhibidores de proteasoma. Por "inhibidor de proteasoma" debe entenderse cualquier sustancia que inhiba directa o indirectamente el proteasoma 20S o 26S o la actividad de éste. Preferentemente, tal inhibición es específica, es decir, el inhibidor de proteasoma inhibe la actividad del proteasoma en una concentración que es menor que la concentración de la concentración del inhibidor necesario para producir otro efecto biológico no relacionado. Preferentemente, la concentración del inhibidor de proteasoma necesario para la inhibición del proteasoma es por lo menos dos veces menor, más preferentemente al menos 5 veces menor, incluso más preferentemente al menos 10 veces menor, y más preferentemente al menos 20 veces menor que la concentración necesaria para producir un efecto biológico no relacionado. Los compuestos inhibidores de proteasoma de esta invención son aquellos compuestos que son útiles para inhibir el crecimiento del tumor, (por ejemplo crecimiento de tumor de mieloma múltiple, otros tumores hematológicos o sólidos como se describe con mayor detalle en la presente) en los pacientes. El inhibidor de proteasoma también está destinado para incluir las sales aceptadas para uso farmacéutico de los compuestos.
El tratamiento de inhibición de proteasoma, generalmente comprende por lo menos un agente que inhibe la actividad del proteasoma en una célula, y puede comprender agentes terapéuticos adicionales. En algunas aplicaciones de la invención, el agente que se utiliza en los métodos de la invención es un inhibidor de proteasoma. Un ejemplo de un inhibidor de proteasoma ha sido apropiado para tratamiento de pacientes de mieloma múltiple quienes han recibido por lo menos dos tratamientos previos y han demostrado progresión de la enfermedad en el ultimo tratamiento y están siendo actualmente probado en estudios clínicos para indicaciones adicionales es bortezomib. Los esquemas de tratamiento de inhibición de proteasoma también pueden incluir agentes terapéuticos adicionales como agentes quimioterapéuticos. Algunos ejemplos de los agentes quimioterapéuticos tradicionales se establecen en la Tabla A. De otro modo o en combinación con estos agentes quimioterapéuticos, clases más novedosas de agentes terapéuticos también pueden utilizarse en el tratamiento de inhibición de proteasoma.
Los ejemplos que se describen en la presente conllevan el uso del inhibidor de proteasoma ácido N-pirazincarbonil- L-fenilalanina-L-leucinborónico, bortezomib ( (VELCADE™) ; anteriormente conocido como MLN341 o PS-341) . El término "inhibidor de proteasoma" está destinado a incluir Bortezomib, los compuestos que sean estructuralmente similares a Bortezomib y/o análogos de Bortezomib.
"Inhibidor de proteasoma" también puede incluir "miméticos". Los "miméticos" están destinados a incluir los compuestos que no son estructuralmente similares a Bortezomib pero imitan la actividad terapéutica de Bortezomib o compuestos estructuralmente similares in vivo.
Los inhibidores de proteasoma para uso en la práctica de la invención incluyen ácidos borónicos peptídicos adicionales como los descritos en Adams et al., Patente U.S. No. 5,780,454 (1998), Patente U.S. No. 6,066,730 (2000), Patente U.S. No. 6,083,903 (2000), Patente U.S. No. 6,548,668 (2003), y Siman et al. WO 91/13904, cada una de las cuales se incorpora por este medio para referencia en su totalidad, incluidos todos los componentes y formulas descritas en éstas. De preferencia, un compuesto de ácido borónico para uso en la presente invención se selecciona del grupo que consiste en: N- (4-morfolin) carbonil- . beta .-( 1-naftil) -L-alanina-L-leucina ácido borónico; N- (8-quinolin) sulfonil-. eta. - (1-naftil) -L-alanina-L-alanina-L-leucina ácido borónico; N- (2-pirazin) carbonil-L-fenilalanina-L-leucina ácido borónico y N- (4-morfolin) carbonil- [O- (2-piridilmetil) ] -L-tirosina-L-leucina ácido borónico.
Además, los inhibidores de proteasoma incluyen inhibidores de proteasoma aldehido peptídico como aquellos descritos en Stein y col., Patente US No. 5,693,617 (1997), y las Publicaciones de la Patente Internacional WO 95/24914 publicada el 21 de septiembre de 1995 y Siman y col., WO 91/13904 publicada el 19 de septiembre de 1991; Iqbal y col. J. Med. Chem. 38: 2276-2277 (1995), así como Bouget y col., Bioorg Med. 19, 1991; 17: 4881-4889 (2003) cada una de las cuales se incorpora por este medio para referencia en su totalidad, incluidos todos los componentes y formulas descritas en éstas.
Además, los inhibidores de proteasoma incluyen lactacistina, y análogos de lacticistina que han sido descritos en Fentany y col., Patente US No. 5,756,764 (1998), y la Patente US No. 6,147,223 (2000), Schreiber y col., Patente US No. 6,645,999 (2003), y Fanteany y col., Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 81994) 91: 3358, cada una de las cuales se incorpora por este medio para referencia en su totalidad, incluidos todos los componentes y fórmulas descritos en éstas.
Además, los inhibidores de proteasoma péptido vinilsulfona sintético y los inhibidores de proteasoma epoxicetona han sido descritos y son útiles en los métodos de la invención, ver, por ejemplo Bogyo y col., Proc . Na ti . Acad. Sci . 94: 6629 (1997); Spaltensteinet y col., Tetrahedron Lett. 37: 1343 (1996); Meng L, Proc . Na ti . Acad. Sci . 96: 10403 (1999); y Meng LH, Cáncer Res 59: 2798 (1999), cada una de las cuales es incorpora por este medio para referencia en su totalidad.
Todavía más, recientemente se ha demostrado que los compuestos que se encuentran en estado natural tienen actividad de inhibición de proteasoma pueden utilizarse en los métodos presentes. Por ejemplo, TMC-95A, un péptido cíclico, o Gliotoxina, ambos metabolitos micóticos o compuestos polifenoles encontrados en el té verde han sido identificados como inhibidores de proteasoma. Ver, por ejemplo, Koguchi, Y, Antibiot (Tokio) 53: 105. (2000); Kroll M, Chem Biol 6: 689 (1999); y Nam S, J. Biol. Chem 276: 13322 (2001), cada una de las cuales se incorpora por este medio para referencia en su totalidad.
Agentes terapéuticos adicionales para uso en los métodos de la invención comprenden una clase conocida de agentes terapéuticos que comprenden esteroides glucocorticoides. El tratamiento con glucocorticoides, generalmente comprende por lo menos un agente glucocorticoide (por ejemplo dexametasona) . En algunas aplicaciones de la invención, el agente que sé utiliza en los métodos de la invención es un agente glucocorticoide. Un ejemplo de un glucocorticoide que se utiliza en el tratamiento de pacientes de mieloma múltiple así como otros tratamientos contra cáncer es dexametasona. Los glucocorticoides adicionales que se utilizan en el tratamiento de terapia hematológica y combinada en tumores sólidos incluyen hidrocortisona, prednisolona, prednisona y triamsinolona . Los esquemas de tratamiento con glucocorticoides pueden utilizarse solos, o pueden utilizarse junto con otros agentes quimioterapéuticos. Los agentes quimioterapéuticos son conocidos en la técnica y están descritos con mayor detalle en la presente. Los ejemplos de los agentes quimioterapéuticos se establecen en la Tabla A. Al igual que con el tratamiento de inhibición de proteasoma, las clases novedosas de tratamientos contra cáncer pueden ser combinadas con esquemas de tratamiento con glucocorticoides cuando estas sean desarrolladas. Los métodos de la invención incluyen la combinación de tratamiento de inhibición de proteasoma con tratamiento con glucocorticoides, solos o junto con otros agentes.
En un aspecto, uno o más de los marcadores que se enlistan en cualquiera de la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3, pueden utilizarse para identificar agentes candidatos para uso en un esquema de tratamiento que producirá una respuesta en un paciente. Por ejemplo, el método puede identificar un agente o una combinación de agentes útiles como un inhibidor de proteasoma. En otro ejemplo, el método puede identificar un agente o combinación de glucocorticoides. En otro ejemplo, el método puede identificar una serie de pacientes que probablemente no sean sensibles a los tratamientos actuales, y por tanto buenos candidatos para inclusión en un estudio clínico de un fármaco dirigido a satisfacer una necesidad no cumplida de pacientes no sensibles. Por ejemplo, un marcador o serie de marcadores asociados con no respuesta a Bortezomib puede identificar a un paciente o un sistema experimental que contenga la capacidad para expresar el marcador o serie de marcadores. El método puede identificar un agente candidato que logre una respuesta en tal paciente o sistema experimental. En el método, una composición de ensayo que contenga una célula, por ejemplo una célula de tumor, capaz de expresar un marcador o una pluralidad de marcadores enlistados en cualquiera de las Tablas ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y/o Tabla 3 se pone en contacto con el agente experimental, por ejemplo, durante una cantidad de tiempo para que el agente experimental afecte el nivel del marcador, detecte el nivel del marcador y compare el nivel con el nivel de una célula de referencia, por ejemplo, una célula que se puso en contacto con un inhibidor de proteasoma conocido (por ejemplo Bortezomib) o glucocorticoide (por ejemplo dexametasona) o una célula normal, e identifique el agente como un inhibidor de proteasoma candidato o glucocorticoide si el agente experimental produce un nivel de expresión informativo del marcador o marcadores comunes de un paciente sensible. Por el contrario, el agente experimental puede no ser identificado como un agente candidato si este se utiliza en el método y produce un nivel de expresión informativo común de un paciente no sensible. La composición de ensayo puede contener un aislado de células de tumor de un paciente con cáncer, por ejemplo un cáncer hematológico (por ejemplo mieloma múltiple, leucemias, linfomas, etcétera) o cáncer de un tumor sólido (por ejemplo en pulmón, mama, próstata, ovario, colon, riñon o hígado) . En otra versión, la composición de ensayo puede tener una línea de células de tumor. La composición que contiene las células puede ser un modelo de tumor in vivo, por ejemplo, un ratón inmunocomprometido o una rata con un tumor ectópico, por ejemplo subcutáneo o ascites, por ejemplo un tumor humano. La composición de ensayo puede ser un individuo humano.
Además de lo anterior, el término esquema de tratamiento de inhibición de proteasoma y/o esquema de tratamiento con glucocorticoide puede incluir otros agentes además de los agentes para la inhibición del proteasoma, incluidos los agentes quimioterapéuticos. Un "agente quimioterapéutico" está destinado a incluir reactivos químicos que inhiben el crecimiento de células o tejidos proliferativos en donde el crecimiento de estas células o tejidos es no deseado. Los agentes quimioterapéuticos como pueden ser los agentes antimetabólicos, por ejemplo, Ara AC, 5-FU y metotrexato, agentes antimitóticos, por ejemplo taxane, vinblastina y vincristina, agentes alquilantes, por ejemplo melfalano, BCNU y mostaza nitrogenada, inhibidores de topoisomerasa II, por ejemplo VW-26, topotecan y bleomicina, agentes rompedores de la hebra, por ejemplo doxorubicina y DHAD, agentes reticuladores, por ejemplo cisplatino y CBDCA, radiación y luz ultravioleta. En una modalidad preferida, el agente es un inhibidor de proteasoma (por ejemplo Bortezomib u otros compuestos relacionados) son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo Gilman A.G., y col., The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8a Ed., sec 12: 1202-1263 (1990)), y normalmente se utilizan para tratar enfermedades neoplásicas. Los agentes terapéuticos que se emplean generalmente en tratamientos de quimioterapia se enlistan más adelante en la Tabla A.
Los agentes probados en los métodos presentes pueden ser un solo agente o una combinación de agentes. Por ejemplo, los métodos presentes pueden utilizarse para determinar si un solo agente quimioterapéutico, como metotrexato, puede utilizarse para tratar un cáncer o si una combinación de dos o mas agentes puede utilizarse en combinación con un inhibidor de proteasoma (por ejemplo Bortezomib) y/o un agente glucocorticoide (por ejemplo dexametasona) . Las combinaciones preferidas incluirán agentes que tengan mecanismos de acción diferentes, por ejemplo, el uso de un agente antimitotico en combinación con un agente alquilante y un inhibidor de proteasoma.
Los agentes que se describen en la presente pueden ser administrados por cualquier vía mtradermica, subcutánea, oral, intraarterial o intravenosa. Preferentemente, la administración sera por vía intravenosa. Preferentemente la administración parenteral puede ser proporcionada en un bolo o por infusión.
La concentración del compuesto descrito en una mezcla aceptada para uso farmacéutico variara dependiendo de diversos factores, que incluye la dosificación del compuesto que va a ser administrada, las características farmacocinéticas del compuesto o los compuestos que se empleen y la vía de administración. El agente puede ser administrado en una sola dosis o en dosis repetidas. Los tratamientos pueden ser administrados diario o con mayor frecuencia dependiendo de diversos factores, que incluyen la salud general del paciente, y la formulación o vía de administración del compuesto o los compuestos seleccionados.
TABLA A: Agentes quimioterapéuticos TABLA A: (continuación) Moléculas aisladas de ácido nucleico, vectores y células hospederas Un aspecto de la invención pertenece a las moléculas de ácido nucleico aisladas que corresponden a un marcador predictivo de la invención, incluidos los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido correspondiente a un marcador predictivo de la invención o una porción de un polipéptido como éste. Los ácidos nucleicos aislados de la invención también incluyen moléculas de ácido nucleico suficientes para uso como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico que correspondan a un marcador predictivo de la invención, incluidos los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido correspondiente a un marcador predictivo de la invención, y fragmentos de estas moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, aquellas apropiadas para uso como cebadores de PCR para la amplificación o mutación de las moléculas de ácido nucleico. Cuando se utiliza en la presente, el término "molécula de ácido nucleico" está destinado para incluir moléculas de DNA (por ejemplo cDNA o DNA genómico) y moléculas de RNA (por ejemplo mRNA) y análogos del DNA o RNA generado utilizando los análogos nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es DNA bicatenario.
Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, un ácido nucleico que codifique una proteína correspondiente a un marcador listado en cualquiera de las Tablas ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y/o Tabla 3, puede ser aislado y manipulado (por ejemplo, amplificado, clonado, sintetizado, etcétera) utilizando las técnicas normales de la biología molecular y la información de la secuencia en los registros de las bases de datos descritos en la presente. (Por ejemplo descritas en Sambrook y col., ed., Molecular Cloning: A Labora tory Manual , 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) .
Más aún, una molécula de ácido nucleico de la invención puede contener solo una porción de una secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de ácido nucleico de longitud completa comprende un marcador predictivo de la invención o la cual codifica un polinucleótido correspondiente a un marcador de la invención. Ácidos nucleicos como éstos pueden utilizarse, por ejemplo, como una sonda o cebador. La sonda/cebador normalmente se utiliza como uno o más oligonucleótidos considerablemente purificados. El oligonucleótido normalmente comprende una región de la secuencia del nucleótido que hibrida en condiciones restrictivas a por lo menos aproximadamente 7, preferentemente alrededor de 15, más preferentemente alrededor de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 ó 400 o más nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico de la invención.
Las sondas basadas en la secuencia de una molécula de ácido nucleico de la invención pueden utilizarse para detectar transcritos o secuencias genómicas correspondientes a uno o más marcadores predictivos de la invención. La sonda comprende un grupo etiqueta unido a ésta, por ejemplo, un radio isótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Estas sondas pueden utilizarse como parte de un equipo de prueba diagnóstica para identificar células o tejidos que expresen la proteína, como puede ser mediante la medición de los niveles de una molécula de ácido nucleico que codifique la proteína en una muestra de células de un individuo, por ejemplo, detectando niveles de mRNA o determinando si un gen que codifica la proteína ha sido mutado de delecionado.
Además de las secuencias de nucleótidos descritos en los registros de las bases de datos descritos en la presente, los expertos en la técnica se darán cuenta que los polimorfismos de las secuencias de DNA que dan origen a cambios en la secuencia de los aminoácidos pueden existir dentro de una población (por ejemplo la población humana) . Estos polimorfismos genéticos pueden existir entre individuos dentro de una población debido a variación alélica en estado natural. Un alelo es uno de un grupo de genes que se encuentra alternativamente en un locus genético determinado. Además, se apreciará que los polimorfismos de DNA que afectan los niveles de expresión de RNA también pueden existir que pueden afectar el nivel de expresión total de ese gen (por ejemplo afectando la regulación o degradación) .
Cuando se utiliza en la presente, los términos "gen" y "gen recombinante" se refiere a las moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención, que incluye, por ejemplo, secuencias que difieren, debido a la degeneración del código genético, de la secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos que codifican una proteína a la cual corresponde un marcador de la invención, y de este modo codifican la misma proteína.
Cuando se utiliza en la presente, la frase "variante alélica" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se encuentra en un locus determinado o a un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos. Variaciones alélicas que se encuentran en estado natural como éstas normalmente pueden dar como resultado 1-5% de varianza en la secuencia de nucleótidos de un gen determinado. Alelos alternativos pueden ser identificados secuenciando el gen que interesa en una cantidad de individuos diferentes. Esto se puede llevar a cabo fácilmente utilizando sondas de hibridación para identificar el mismo locus génico en diversos individuos. Cualquiera y todas estas variaciones de nucleótidos y los polimorfismos de aminoácidos resultantes o variaciones que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional están destinados para entrar dentro del alcance de la invención.
La presente invención comprende las moléculas de ácido nucleico antisentido, es decir, moléculas que son complementarias a un ácido nucleico sentido de la invención, por ejemplo, complementarias a la hebra codificante de una molécula de cDNA bicatenaria correspondiente a un marcador de la invención o complementaria a una secuencia de mRNA correspondiente a un marcador de la invención. Por consiguiente, un ácido nucleico antisentido de la invención puede unir con hidrógeno (es decir, hibridar con) a un ácido nucleico sentido de la invención. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una hebra codificante entera, o solo una porción de esta, por ejemplo, todo o una parte de la región que codifica la proteína (o el marco de lectura abierto) . Una molécula de ácido nucleico antisentido también puede ser antisentido a toda o parte de una región no codificante de la hebra codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención. Las regiones no codificantes ("regiones 5' y 3' no traducidas") son las secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificante y no se traducen en aminoácidos .
Un oligonucleótido antisentido puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 45 ó 50 o más nucleótidos de longitud. Un ácido nucleico antisentido de la invención puede ser construido utilizando síntesis química y reacciones de ligación enzimática utilizando los procedimientos que se conocen en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo un oligonucleótido antisentido) puede ser sintetizado químicamente utilizando nucleótidos que ocurren en la naturaleza o nucleótidos diversamente modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex que se forma entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ejemplo, es posible utilizar derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Los ejemplos de los nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar ácidos nucleicos antisentido incluyen: 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, * hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2 , 2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-mannosilqueosina, 5 ' -metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v) , wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, ácido uracil-5-oxiacético metiléster, ácido uracil-5-oxiacético (v) , 5-metil-2-tiouracilo, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, y 2, 6-diaminopurina. De otro modo, el ácido nucleico antisentido puede ser producido biológicamente utilizando un vector de expresión en el cual un ácido nucleico haya sido subclonado en una orientación antisentido (es decir, RNA transcrito desde el ácido nucleico insertado será de una orientación antisentido para un ácido nucleico diana que interese, descrito con mayor detalle en la subsección siguiente) .
Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser modificadas en la porción base, la porción azúcar o el esqueleto fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, el esqueleto desoxirribosa fosfato de los ácidos nucleicos puede ser modificado para generar ácidos nucleicos peptídicos (ver Hyrup y col., 1996, Bioorganic & Medi cinal Chemistry 4 (1) : 5-23) . Cuando se utiliza en la presente, los términos "ácidos nucleicos peptídicos" o "los PNA" ser refiere a miméticos de ácido nucleico, por ejemplo, miméticos de DNA, en los cuales el esqueleto desoxirribosa fosfato está sustituido por un esqueleto pseudopeptídico y solo se retienen las cuatro nucleobases naturales. El esqueleto neutro de los PNA ha demostrado permitir la hibridación específica a DNA y RNA en condiciones de baja fuerza iónica. La síntesis de los oligómeros PNA puede hacerse utilizando protocolos de síntesis p.eptídica en fase sólida normales como se describe en Hyrup y col., (1996), Supra; Perry-O' Keefe y col., (1996) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 93: 14670-675.
Los PNA pueden utilizarse en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas. Por ejemplo, los PNA pueden utilizarse, por ejemplo, en el análisis de mutaciones de pares de bases únicas en un gen mediante, por ejemplo, pinzado de PCR dirigido a PNA; como enzimas de restricción artificiales cuando se utilizan en combinación con otras enzimas, por ejemplo, Sl nucleasas (Hyrup, (1996), supra; o como sondas o cebadores para la secuencia del DNA e hibridación (Hyrup, 1996, supra; Perry-O' -Keefe y col., 1996, Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 93: 14670-675) .
En otro aspecto, los PNA pueden ser modificados, por ejemplo, para mejorar su estabilidad o captación celular, uniendo grupos lipófilos u otros grupos cooperadores al PNA, mediante la formación de quimeras PNA-DNA o mediante el uso de liposomas u otras técnicas de suministro de fármacos conocidas en la materia. Por ejemplo, las quimeras PNA-DNA pueden ser generadas las cuales pueden combinar las propiedades ventajosas del PNA y el DNA. Estas quimeras permiten a las enzimas de reconocimiento de DNA, por ejemplo, RNASE H y DNA polimerasas, interactuar con la porción del DNA mientras que la porción del PNA proporcionaría elevada afinidad de unión y especificidad. Las quimeras PNA-DNA pueden ser ligadas utilizando ligadores de longitudes apropiadas seleccionados en términos de apilamiento de bases, números de enlaces entre las nucleobases y orientación (Hyrup, 1996, Supra) , la síntesis de las quimeras PNA-DNA pueden hacerse como se describe en (Hyrup, 1996, Supra) , y Finn y col., (1996), Nucleic Acids Res. 24 (17): 3357-63. Por ejemplo, una cadena de DNA puede ser sintetizada sobre un soporte sólido utilizando la química normal del acoplamiento de fosfaramidita y análogos de nucleósidos modificados. Los compuestos como 5'-(4-metoxitritil) amino-5' -desoxi-timidina fosforamidita pueden utilizarse como un enlace entre el PNA y el extremo 5' del DNA (Mag y col., 1989, Nucleic Acids Res. 17: 5973-88). Los monómeros de PNA entonces se acoplan en una forma de un paso para producir una molécula quimérica con un segmento de PNA 5' y un segmento de DNA 3' (Finn y col., 1996, Nucleic Acids Res. 24 (17): 3357-63). De otro modo, las moléculas quiméricas pueden ser sintetizadas con un segmento de DNA 5' y un segmento de PNA 3' (Peterser y col., 1975, Bioorganic Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124) .
El oligonucleótido puede incluir otros grupos anexados como péptido (por ejemplo para elegir receptores de células hospederas in vivo) o agentes que faciliten el transporte a través de la membrana celular (ver, por ejemplo, (ver, por ejemplo, Letsinger et al, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al, 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:648-652; Publicación PCT No. WO 88/09810) o la barrera hematoencefálica (ver, p. ej . , Publicación PCT No. WO 89/10134). Además, los oligonucleótidos pueden ser modificados con agentes de clivaje activados por la hibridación (ver, por ejemplo, Krol y col., 1988, Bio/Techniques 6: 958-976) para este fin, el oligonucleótido puede ser conjugado a otra molécula, por ejemplo, un péptido, agente reticulador accionado por hibridación, agente de transporte, agente de clivaje accionado por hibridación, etcétera.
La invención también incluye ácidos nucleicos faros moleculares que tengan por lo menos una región que sea complementaria a un marcador de la invención, de modo que el faro molecular sea útil para cuantificar la presencia del marcador predictivo de la invención en una muestra. Un ácido nucleico "faro molecular" es un ácido nucleico que contiene un par de regiones complementarias y que tiene un fluoróforo o un extinguidor fluorescente asociado con éste. El fluoróforo y el extinguidor se asocian con diferentes porciones del ácido nucleico en tal orientación que cuando se hibridan entre sí regiones complementarias, la fluorescencia del fluoróforo se extingue por el extinguidor. Cuando las regiones complementarias del ácido nucleico no se hibridan entre sí, la fluorescencia del fluoróforo es extinguida en menor grado. Los ácidos nucleicos faros moleculares están descritos, por ejemplo, en la Patente US 5,876,930.
Los vectores, incluidos los vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica un polipéptido correspondiente a un marcador predictivo de la invención pueden utilizarse para la producción de ácidos nucleicos y proteínas correspondientes a los marcadores predictivos de la invención; así como para la producción de compuestos relacionados con los marcadores predictivos. Los vectores útiles además contienen secuencias promotoras y/o reguladoras para la expresión eficaz del ácido nucleico y/o proteína correspondiente al marcador predictivo que interesa. En algunos casos, los promotores pueden incluir secuencias promotoras/reguladoras constitutivas, secuencias promotoras/reguladoras inducibles, secuencias promotoras/reguladoras específicas de tejido o secuencias promotoras/reguladoras endógenas que se encuentran en estado natural correspondientes al marcador predictivo que interesa, según sea necesario. Diferentes vectores de expresión son bien conocidos en la técnica y pueden ser adaptados para adecuarlos al sistema particular para expresión. Por ejemplo, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden ser diseñados para la expresión de un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención en células procarióticas (por ejemplo E. coli) o eucariotas (por ejemplo células de insecto {utilizando vectores de expresión baculovirus}, células de levadura o células de mamífero) . Las células hospederas adecuadas son conocidas en la técnica e incluyen las descritas en Goeddel, supra. De otro modo, el vector de expresión recombinante puede ser transcrito y traducido in vi tro, por ejemplo utilizando las secuencias reguladoras del promotor P7 y T7 polimerasa. Los vectores y las células hospederas pueden ser producidos utilizando la metodología de rutina conocida en la técnica. Además, los vectores de células hospederas pueden utilizarse para la producción de ácidos nucleicos, polipéptidos y fragmentos de estos correspondientes a los marcadores de la invención.
Proteínas aisladas y anticuerpos Un aspecto de la invención pertenece a las proteínas aisladas que corresponden a los marcadores predictivos de la invención, y porciones con actividad biológica de éstos, asi como a los fragmentos polipeptídicos apropiados para uso como in unogenos para aumentar los anticuerpos dirigidos contra un polipéptido correspondiente a un marcador predictivo de la invención. Los polipeptidos para uso en la invención pueden ser aislados, purificados o producidos utilizando información de identificación génica proporcionada en la presente en combinación con la biología molecular de rutina, técnicas de purificación de proteínas y del DNA recombinante bien conocidas en la materia.
Los polipeptidos preferidos tienen la secuencia de aminoácidos enlistada en uno de los registros de las bases de datos GenBank y Entrez descritos en la presente. Otras proteínas útiles son considerablemente idénticas (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 70%, preferentemente 80%, 90%, 95% o 99%) a una de estas secuencias y retienen la actividad funcional de la proteina de la proteina que ocurre en la naturaleza, correspondiente, pero difiere en la secuencia de aminoácidos debido a la variación alélica natural o mutagenesis.
La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático que determine el número de posiciones idénticas compartidas entre dos secuencias. La determinación se puede llevar a cabo utilizando cualquier método conocido en la materia para comparación de la identidad y similitud. Los ejemplos de los métodos que se utilizan pueden incluir, por ejemplo, un algoritmo matemático que se utiliza para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc . Na ti . Acad. Scí . USA 87: 2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90: 5873-5877. Un algoritmo como éste está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, y col., (1990) J. Mol . Biol . 215: 403-410. Los buscadores de nucleótidos BLAST pueden ser realizados con el programa NBLAST, puntuación igual 100, longitud de palabra = 12 para obtener las secuencias de nucleótidos homologas aún a las moléculas de un ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de la proteína BLAST pueden hacerse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra =3 para obtener las secuencias de aminoácidos homologas a una molécula de proteína de la invención. Para obtener alineaciones con espacios para propósitos de comparación, es posible utilizar Gapped BLAST como está descrito en Altschul y col., (1997) Nucleic Acids Res . 25: 3389-3402. De otro modo, es posible utilizar PSI-BLAST para hacer una búsqueda iterada que detecte relaciones distintas ente moléculas. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, es posible utilizar los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo XBLAST y NBLAST) . Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo de un algoritmo matemático que se utiliza para la comparación de las secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, (1988) CABIOS 4: 11-17. Un algoritmo como este esta incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) el cual es parte del paquete de software de alineamiento de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, es posible utilizar una tabla de residuos de peso PAM120, sanción de la longitud de espacios de 12 y una sanción del espacio de 4. Todavía otro algoritmo útil para identificar regiones de similitud de secuencia local y alineación es el algoritmo FASTA como está descrito en Pearson y Lipman (1988) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 85: 2444-2448. Cuando se utiliza el algoritmo FASTA para comparar secuencias de nucleótidos o aminoácidos, puede utilizarse una tabla de residuos de peso PAM120, por ejemplo, con un valor k-tuplo de 2. El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse utilizando las técnicas semejantes a las antes descritas, con o sin permitir espacios. Durante el cálculo del porcentaje de identidad solo se cuentan coincidencias exactas.
La invención también proporciona proteína quiméricas o de fusión correspondientes a un marcador de la invención. Cuando se utiliza en la presente, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" comprende todo o parte (preferentemente una parte con actividad biológica) de un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención ligado de manera operante a un polipéptido heterólogo (es decir, un polipéptido diferente del polipéptido que corresponde al marcador) . Dentro de la proteína de fusión, el término "ligado de manera operante" está destinado para indicar que el polipéptido de la invención y el polipéptido heterólogo se fusionan en marco entre sí. El polipéptido heterólogo puede ser fusionado al amino terminal o carboxilo terminal del polipéptido de la invención. Las proteínas de fusión útiles pueden incluir GST, c-myc, FLAG, HA y cualquier otro rótulo heterólogo conocido para uso en la producción de las proteínas de fusión. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de un polipéptido recombinante de la invención.
Además, las proteínas de fusión pueden incluir una secuencia señal de otra proteína como gp67, melitina, fosfatasa alcalina placentaria humana y phoA. En todavía otro aspecto, la proteína de fusión es una proteína de fusión inmunoglobulina en la cual todo o parte del polipéptido que corresponde a un marcador predictivo de la invención se fusiona a secuencias derivadas de un miembro de la familia de proteínas de inmunoglobulina. Las proteínas de fusión inmunoglobulinas de la invención pueden utilizarse como inmunogénos para producir anticuerpos dirigidos contra un polipéptido de la invención a un individuo, para purificar ligandos y en ensayos de tamizaje para identificar moléculas que inhiban la interacción de los receptores con los ligandos.
Un polipéptido aislado que corresponda a un marcador predictivo de la invención, o un fragmento de este, puede utilizarse como un inmunógeno para generar anticuerpos utilizando las técnicas normalizadas para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Por ejemplo, un inmunógeno normalmente se utiliza para preparar anticuerpos mediante la inmunización de un individuo apropiado (es decir, inmunocompetente) como puede ser un conejo, cabra, ratón u otro mamífero o vertebrado. Un preparado inmunogénico apropiado puede contener, por ejemplo, polipéptido expresado de manera recombinante o sintetizado químicamente. La preparación puede además incluir un adyuvante, como el adyuvante completo o incompleto de Freund o agente inmunoestimulador similar.
Por consiguiente, otro aspecto de la invención pertenece a los anticuerpos dirigidos contra un polipéptido de la invención. Los términos "anticuerpo" y "sustancia anticuerpo" como se utiliza de manera indistinta en la presente se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de las moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de' unión al antígeno las cuales se unen específicamente a un antígeno, como puede ser un polipéptido de la invención, por ejemplo un epítope de un polipéptido de la invención. Una molécula que se une específicamente a un polipéptido determinado de la invención es una molécula que se une al polipéptido, pero no se une considerablemente a otras moléculas en una muestra, por ejemplo una muestra biológica, la cual contiene naturalmente el polipéptido. Los ejemplos de las porciones con actividad inmunológica de las moléculas de inmunoglobulina incluyen los fragmentos F(ab)y F(ab')2 que pueden ser generados tratando el anticuerpo con una enzima como puede ser una pepsina. La invención proporciona los anticuerpos policlonales y monoclonales. Las variantes sintéticas y genéticamente manipuladas (ver la Patente US No. 6,331,415) de cualquiera de las anteriores también están consideradas por la presente invención. Los anticuerpos policlonales y monoclonales pueden producirse mediante una variedad de técnicas que incluye la metodología tradicional del anticuerpo monoclonal murino, por ejemplo, la técnica de hibridación de células somáticas normalizada de Kohier y Milstein, Na ture 256: 495 (1975), la técnica del hibridoma de células B humanas (ver Kozbor y col., 1983, Immunol . Today 4: 72) la técnica del EBV-hibridoma (ver Colé y col., pp. 77-96 In Monoclonal An tibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985) o las técnicas del trioma. Ver en general Harlow, E. y Lañe, D. (1988) An tibodies : A Labora tory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; y Current Protocols Immunology, Coligan y col., John Wiley % Sons, New York, 1994. Preferentemente, para aplicaciones diagnosticas, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Además, para uso en aplicaciones in vivo, los anticuerpos de la presente invención preferentemente son anticuerpos humanos o humanizados. Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se detectan tamizando los sobrenadantes de cultivo de hibridoma para anticuerpos que se unan al polipéptido que interesa, por ejemplo, utilizando un ensayo ELISA normal.
Si se desea, las moléculas anticuerpos pueden ser cosechadas o aisladas del individuo (por ejemplo de la sangre o suero del individuo) y además purificadas por las técnicas bien conocidas, como puede ser la cromatografía de la proteína A para obtener la fracción de IgG. En otra versión, los anticuerpos específicos para una proteína o polipéptido de la invención pueden seleccionarse o (por ejemplo parcialmente purificados) o purificarse mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad para obtener el anticuerpo considerablemente purificado y purificado. Mediante una composición de anticuerpo considerablemente purificado se entiende, en este sentido, que el anticuerpo contiene no más dé solo 30% (en peso seco) de anticuerpos contaminantes dirigidos contra epítopes que no sean aquellos de la proteína o polipéptido deseados de la invención, preferentemente no más de 20%, pero más preferentemente no más de 10%, y más preferentemente no más de 5% (por peso seco) de la muestra es anticuerpo contaminantes. Una composición de anticuerpos purificados significa que por lo menos 99% de los anticuerpos de la composición están dirigidos contra la proteína o polipéptido deseado de la invención.
Además, los anticuerpos recombinantes, como pueden ser los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden porciones humanas y no humanas, los cuales pueden prepararse utilizando técnicas de DNA recombinante normalizadas, están dentro del alcance de la invención. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones son derivadas de especies animales diferentes, como aquellas que tienen una región variable derivadas de un mAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Ver, por ejemplo, Cabilly y col., Patente US No. 4,816,567; y Boss y col., Patente US No. 4,816,397, las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad.) Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especies no humanas que tienen una o más regiones complementariamente determinantes (las CDR) de la especie no humana y una región de entramado de una molécula de inmunoglobulina humana. (Ver, por ejemplo, Queen, Patente US No. 5,585,089, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. ) Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden ser producidos por las técnicas del DNA recombinante conocidos en la materia, por ejemplo utilizando los métodos que se describen en la Publicación PCT No. WO 87/02671; Solicitud de Patente Europea 184,187; Solicitud de Patente Europea 171,496; Solicitud de Patente Europea 173,494; Publicación PCT No. WO 86/01533; Patente U. S. No. 4,816,567; Solicitud de Patente Europea 125,023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc . Na ti Acad. Sci . USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol . 139:3521- 3526; Sun et al. (1987) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cáncer Res . 47:999-1005; Wood et al (1985) Na ture 314:446-449; y Shaw et al (1988) J. Na ti . Cáncer Ins t . 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al (1986) Bio/Techniques 4:214; Patente U. S. 5,225,539; Jones et al. (1986) Na ture 321:552-525; Verhoeyan et al (1988) Science 239:1534; and Beidler et al (1988) J. Immunol . 141:4053-4060.
Los métodos para preparar anticuerpos humanos son conocidos en la técnica. Un método para preparar anticuerpos humanos emplea animales transgénicos, como puede ser un ratón transgénico. Estos animales transgénicos contienen una porción considerable de genoma productor de anticuerpos humanos insertado en su propio genoma, la producción de los propios anticuerpos endógenos del animal se vuelve deficiente en la producción de anticuerpos. Los métodos para preparar estos animales transgénicos son conocidos en la materia. Animales transgénicos como éstos pueden prepararse utilizando la tecnología XENOMICE™ o utilizando un enfoque "minilocus". Los métodos para preparar XENOMICE™ están descritos en las Patentes US Nos. 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598 y 6,075,181, las cuales se incorporan en la presente para referencia. Los métodos preparar animales transgénicos utilizando el enfoque "minilocus" están descritos en las Patentes US Nos. 5,545,807, 5,545,807, 5,545,806, y 5,625,825; también ver la Publicación Internacional No. WO 93/12227, las cuales se incorporan cada uno en la presente para referencia.
Los fragmentos de anticuerpos pueden ser derivados de cualquiera de los anticuerpos antes descritos. Por ejemplo, los fragmentos que se unen al antígeno, así como los polipéptidos monoméricos, diméricos o triméricos de longitud completa derivados de los anticuerpos antes descritos son útiles. Los homólogos de anticuerpo útiles de este tipo incluyen: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente consistente en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento divalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región bisagra; y (iii) un fragmento Fd consistente en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv consistente en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y col., Na ture 341: 544-546 (1989)), el cual consiste en dominio VH; (vii) un anticuerpo cadena pesada funcional de un solo dominio, el cual consiste en un dominio VHH (conocido como un nanocuerpo) ver, por ejemplo, Cortez-Retamozo y col., Cáncer Res . 64: 2853-2857 (2004), y las referencias que se mencionan en ésta; y (viii) una región determinante de la complementariedad aislada (CDR) , por ejemplo, una o más CDR aisladas junto con suficiente entramado para proporcionar un fragmento de unión al antígeno. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, estos pueden ser unidos utilizando métodos recombinantes, mediante un ligador sintético que les permita convertirse en una sola cadena proteínica en la cual los pares de regiones VL y VH forman moléculas monovalentes (conocidas como Fv, onocatenarias (scFv) ; ver, por ejemplo, Bird y col., Science 242: 423-426 (1988); y Huston y col., Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 85: 5879-5883 (1988). Anticuerpos monocatenarios como estos también están destinados para estar comprendidos dentro del termino "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando las técnicas tradicionales conocidas para los expertos en la materia, y los fragmentos son tamizados para la utilidad en la misma forma que los anticuerpos intactos. Los fragmentos de anticuerpos, como Fv, F(ab')2 y Fab pueden prepararse por clivaje de la proteína intacta, por ejemplo por clivaje de proteasa o química.
Un anticuerpo dirigido contra un polipéptido correspondiente a un marcador predictivo de la invención (por ejemplo un anticuerpo monoclonal) puede utilizarse para detectar el marcador predictivo (por ejemplo en una muestra celular) para evaluar el nivel y patrón de expresión del marcador predictivo. Los anticuerpos también pueden ser utilizados diagnósticamente para monitorizar los niveles de proteína en tejidos o fluidos corporales (por ejemplo en una muestra de tumor) como parte de un procedimiento de análisis clínico, por ejemplo para determinar la eficacia de un esquema de tratamiento determinado. La detección puede ser facilitada acoplando el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de las sustancias detectables pueden ser las diferentes enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos.
Los ejemplos de las enzimas apropiadas pueden ser peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de los complejos del grupo protético incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de los materiales fluorescentes apropiados pueden ser umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o picoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes pueden ser luciferasa, luciferina y aequorina, y los ejemplos de material radioactivo apropiado incluyen 125I, 125I, 35S ó 3H .
Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona los anticuerpos considerablemente purificados o fragmentos de éstos, y anticuerpos no humanos o fragmentos de estos, cuyos anticuerpos o fragmentos se unen especialmente a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un marcador predictivo identificado en la presente. Los anticuerpos considerablemente purificados de la invención, o los fragmentos de estos, pueden ser anticuerpos humanos, no humanos, quiméricos y/o humanizados.
En otro aspecto, la invención proporciona los anticuerpos no humanos o fragmentos de éstos, cuyos anticuerpos o fragmentos se unen especialmente a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se codifica por una molécula de ácido nucleico de un marcador predictivo de la invención. Anticuerpos no humanos como estos pueden ser anticuerpos de cabra, ratón, oveja, caballo, pollo, conejo o rata. De otro modo, los anticuerpos no humanos de la invención pueden ser anticuerpos quiméricos y/o humanizados. Además, los anticuerpos no humanos de la invención pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales.
En todavía otro aspecto, la invención proporciona los anticuerpos monoclonales o fragmentos de estos, cuyos anticuerpos o fragmentos se unen específicamente a un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de la presente invención, una secuencia de aminoácidos codificada por el cDNA de la presente invención, un fragmento de por lo menos 15 residuos de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de la presente invención, una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la presente invención (en donde el porcentaje de identidad se determina utilizando el programa ALIGN del paquete de software GCG con una tabla de residuos de peso PAM120, una sanción de longitud de espacio de 12 y una sanción de espacio de 4 ) y una secuencia de aminoácidos que es codificada por una molécula de ácido nucleico que hibrida a una molécula de ácido nucleico consistente en las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, o un complemento de éste, en condiciones de hibridación de 6X SSC a 45°C y lavando en 0.2X SSC, 0.1% SDS a 65°C. Los anticuerpos monoclonales pueden ser anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos y/o no humanos.
Los anticuerpos considerablemente purificados o fragmentos de estos pueden unirse específicamente a un péptido señal, una secuencia secretada, un dominio extracelular, un dominio de transmembrana o uno citoplásmico o membrana citoplásmica de un polipéptido de la invención [sic] . Los anticuerpos considerablemente purificados o fragmentos de éstos, los anticuerpos no humanos o fragmentos de éstos y/o los anticuerpos monoclonales o fragmentos de éstos de la invención se unen específicamente a una secuencia secretada o un dominio extracelular de las secuencias de aminoácidos de la presente invención.
La invención también proporciona un equipo que contiene un anticuerpo de la invención conjugado a una sustancia detectable, e instrucciones para su uso. Todavía otro aspecto de la invención es una composición diagnóstica que contiene un anticuerpo de la invención y un portador aceptado para uso farmacéutico. En algunos aspectos, la composición diagnóstica contiene un anticuerpo de la invención, una porción detectable y un portador aceptado para uso farmacéutico.
Ensayos de sensibilidad Una muestra de células cancerosas se obtiene de un paciente. Un nivel de expresión se mide en la muestra para un marcador que corresponde a por lo menos uno de los marcadores predictivos que se establece en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y/o Tabla 3. Se utiliza preferentemente una serie de marcadores que contienen los marcadores identificados en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y/o Tabla 3, y se ponen juntos en una serie de marcadores utilizando los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, las series de marcadores pueden contener las series de marcadores identificados en la Tabla 4, o cualquier serie de marcadores preparados por los métodos semejantes. Análisis como este se utilizan para obtener un perfil de expresión del tumor del paciente. La evaluación del perfil de expresión entonces se utiliza para determinar si el paciente es un paciente sensible y se beneficiará del tratamiento de inhibición de proteasoma (por ejemplo tratamiento con un inhibidor de proteasoma (por ejemplo Bortezomib) solo o en combinación con otros agentes) y/o del tratamiento con glucocorticoides (por ejemplo tratamiento con un glucocorticoide (por ejemplo dexametasona) solo o en combinación con otros agentes) . La evaluación puede incluir el uso de una serie de marcadores preparada utilizando cualquiera de los métodos que se proporcionan u otros métodos de puntaje similares conocidos en la técnica (por ejemplo votación ponderada, CTF) . Todavía más, la evaluación puede comprender el uso de más de una serie de marcadores preparada. Un tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide será identificado como apropiado para tratar el cáncer cuando el resultado de la evaluación demuestre no respuesta disminuida o respuesta aumentada en presencia del agente.
En un aspecto, la invención presenta un método para evaluar a un paciente, por ejemplo, un paciente con cáncer, por ejemplo, un cáncer hematológico (por ejemplo mieloma múltiple, leucemias, linfoma, etcétera) o cáncer de un tumor sólido (por ejemplo en pulmón, mama, próstata, ovario, colon, riñon o hígado) para respuesta o no respuesta al tratamiento con un esquema de tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide. El método incluye proporcionar una evaluación de la expresión de los marcadores en una serie de marcadores predictiva de marcadores en el paciente, en donde la serie de marcadores predictivos tiene las siguientes propiedades: incluye una pluralidad de genes, cada uno de los cuales se expresa diferencialmente como entre pacientes sensibles o no sensibles al tratamiento con un esquema de tratamiento de inhibición de proteasoma y/o un tratamiento con glucocorticoide e individuos no afligidos y contiene un número suficiente de marcadores expresados diferencialmente de raodo que la expresión diferencial (por ejemplo comparada con un nivel en una muestra de referencia no afectada) de cada uno de los marcadores en la serie de marcadores predictivos en un individuo es predictiva de la respuesta o no respuesta con no más de aproximadamente 15%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5%, aproximadamente 2.5% o aproximadamente 1% positivos falsos (en donde positivo falso significa la predicción que un paciente es sensible o no sensible cuando el individuo no lo es) ; y proporcionar una comparación de la expresión de cada uno de los marcadores en la serie del paciente con un valor de referencia, evaluando con ello al paciente.
El examen de la expresión de uno o más de los marcadores o series de marcadores identificados en una muestra de tumor tomada de un paciente durante el transcurso del tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide, también es posible para determinar si el agente terapéutico sigue funcionando o si el cáncer se ha vuelto no sensible (refractario) al protocolo de tratamiento. Por ejemplo, un paciente que reciba un tratamiento de Bortezomib eliminaría células tumorales y sería monitorizado para la expresión de un marcador o serie de marcadores. Si el perfil de expresión de una o más serie de marcadores identificados en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y/o Tabla 3 demuestra respuesta aumentada en presencia del agente, se continuaría el tratamiento con el inhibidor de proteasoma. Sin embargo, si el perfil de expresión de una o más series de marcadores identificadas en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y/o Tabla 3 demuestra no respuesta aumentada en presencia del agente, entonces tal vez el cáncer se haya vuelto resistente al tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide, y debe iniciarse otro protocolo de tratamiento para tratar al paciente .
Es importante señalar que estas determinaciones pueden hacerse paciente por paciente o agente por agente (o combinaciones de agentes) . Así pues, es posible determinar si un tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide particular es probable o no que beneficie a un paciente específico o grupo/clase de pacientes, y si se debe continuar un tratamiento específico.
Uso de la información En un método, se proporciona información, por ejemplo, a cerca de los niveles de expresión de los marcadores del paciente (por ejemplo, el resultado de la evaluación de un marcador predictivo o serie de marcadores predictivos descritos en la presente) , o a cerca si un paciente será sensible o no sensible a un tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoides, (por ejemplo se comunica, por ejemplo se comunica electrónicamente) a una tercera parte, por ejemplo un hospital, clínica, entidad gubernamental, parte reembolsadora o compañía de seguros (por ejemplo una compañía de seguros de vida) . Por ejemplo, la elección del procedimiento medico, el pago para un procedimiento médico, el pago por una parte reembolsadora, o el costo para un servicio o seguro puede estar en función de la información. Por ejemplo, la tercera parte recibe la información, hace una determinación basada por lo menos en parte en la información, y opcionalmente comunica la información o hace una elección del procedimiento, pago, nivel de pago, cobertura, etcétera, basado en la información. En el método se determina el nivel de expresión informativo de un marcador predictivo o una serie de marcadores predictivos seleccionados de, o derivados de la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y/o Tabla 3.
En una modalidad se evalúa una prima para un seguro (por ejemplo de vida o medico) como función de la información a cerca de uno o mas niveles de expresión de marcador, por ejemplo un marcador predictivo o una serie de marcadores predictivos, por ejemplo, un nivel de expresión asociado con la respuesta o no respuesta a un tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoides (por ejemplo el nivel de expresión informativo) . Por ejemplo, las primas pueden ser aumentadas (por ejemplo en un cierto porcentaje) si los marcadores de un paciente o la serie de marcadores predictivos del paciente descritos en la presente se expresan diferencialmente entre un candidato asegurado (o un candidato que busca la cobertura del seguro) y un valor de referencia (por ejemplo una persona no afectada) . Como otro ejemplo, las primas pueden ser disminuidas si los niveles de un marcador predictivo o serie de marcadores predictivos son sostenidos (como se describe en la presente) después del tratamiento con un inhibidor de proteasoma o un glucocorticoide . Las primas también pueden ser escaladas dependiendo de los niveles de expresión del marcador, por ejemplo del resultado de evaluar un marcador predictivo o serie de marcadores predictivos descritos en la presente. Por ejemplo, las primas pueden estar evaluadas para distribuir riesgos, por ejemplo, como función de los niveles de expresión del marcador, por ejemplo, el resultado de la evaluación de un marcador predictivo o serie de marcadores predictivos descritos en la presente. En otro ejemplo, las primas se evalúan como función de los datos actuariales que se obtienen que se obtienen de pacientes que sean respondedores mejorados o no mejorados.
La información a cerca de los niveles de expresión del marcador, por ejemplo, el resultado de evaluar un marcador predictivo o una serie de marcadores predictivos descritos en la presente (por ejemplo, el nivel de expresión informativo) puede utilizarse, por ejemplo, en un proceso de aseguramiento para el seguro de vida. La información puede ser incorporada en un perfil a cerca de un individuo. Otra información en el perfil puede incluir, por ejemplo, la fecha de nacimiento, sexo, estado civil, información financiera, información crediticia, niños y otros. Una política de seguros puede ser recomendada como función de la información sobre los niveles de expresión del marcador, por ejemplo, el resultado de evaluar un marcador predictivo o serie de marcadores predictivos descritos en la presente, junto con uno o más de otros elementos de información del perfil. Una prima de seguro o evaluación de riesgo también se puede evaluar como función de la información del marcador predictivo o serie de marcadores predictivos. En una implementación, se asignan puntos con base en ser sensible o no sensible a un tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoides.
En una modalidad, la información sobre los niveles de expresión del marcador, por ejemplo, el resultado de la evaluación de un marcador predictivo o serie de marcadores predictivos descritos en la presente, se analiza por una función que determina si autorizar la transferencia de fondos para pagar por un servicio o tratamiento proporcionado a un individuo (o tomar otra decisión referida en la presente) . Por ejemplo, los resultados de analizar una expresión de un marcador predictivo o serie de marcadores predictivos descritos en la presente puede indicar que un individuo es sensible o no sensible a un tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide, sugiriendo que un curso de tratamiento es necesario, activando con ello un resultado que indica o causa la autorización para pagar por un servicio o tratamiento proporcionado a un individuo. En un ejemplo, el nivel de expresión informativo de un marcador predictivo o serie de marcadores predictivos seleccionado de o derivado de la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y/o Tabla 3 se determina y se autoriza el pago si el nivel de expresión informativo identifica un paciente sensible. Por ejemplo, una entidad, por ejemplo, un hospital, un proveedor de cuidados, entidad gubernamental o una compañía de seguros u otra entidad que pague para, o reembolse gastos médicos, puede utilizar el resultado de un método descrito en la presente para determinar si una parte, por ejemplo, una parte diferente del paciente, pagará por el servicio (por ejemplo un tratamiento particular) o el tratamiento proporcionado al paciente. Por ejemplo, una primera entidad, por ejemplo, una compañía de seguros, puede utilizar el resultado de un método descrito en la presente para determinar si proporcionar el pago financiero a, o a nombre de un paciente, por ejemplo, si rembolsar o reintegrar a una tercera parte, por ejemplo, un vendedor de productos o servicios, un hospital, medico u otro prestador de servicios, por un servicio o tratamiento proporcionado a un paciente. Por ejemplo, una primera entidad, por ejemplo, una compañía de seguros, puede utilizar el resultado de un método descrito en la presente para determinar si continuar, interrumpir, enlistar a un individuo en un plan de seguros o programa, por ejemplo, seguros de salud o plan o programa de seguro de vida.
En un aspecto, la descripción pone en relieve un método para proporcionar datos . El método incluye proporcionar datos descritos en la presente, por ejemplo, generados por un método descrito en la presente, proporcionar un registro, por ejemplo, un registro descrito en la presente, para determinar si se proporcionará un pago. En algunas modalidades, se proporcionan los datos por cómputo, disco compacto, teléfono, facsímile, correo electrónico o carta. En algunas modalidades, se proporcionan los datos por una primera parte a una segunda parte. En algunas modalidades, la primera parte se selecciona del individuo, el proveedor de cuidados para la salud, un medio tratante, una organización de mantenimiento de la salud (OMS) , un hospital, una entidad gubernamental o una entidad que vende o proporciona el fármaco. En algunas modalidades, la segunda parte es un tercero pagador, una compañía de seguros, empleador, plan de salud patrocinado por el empleador, OMS o entidad gubernamental. En algunas modalidades, la primera parte se selecciona del individuo, un proveedor de cuidados para la salud, un medico tratante, una OMS, un hospital, una compañía de seguros o una entidad que vende o suministra el fármaco y la segunda parte es una entidad gubernamental. En algunas modalidades, la primera parte se selecciona del individuo, un proveedor de cuidados para la salud, un medico tratante, una OMS, un hospital, una compañía de seguros o una entidad que vende o suministra el fármaco y la segunda parte es una compañía de seguros.
En otro aspecto, la descripción pone en relieve un registro (por ejemplo un registro legible por computadora) que incluye una lista y el valor de expresión para el marcador predictivo o la serie de marcadores predictivos para un paciente. En algunas modalidades, el registro incluye más de un valor para cada marcador.
EJEMPLIFICACIÓN Con base en los hallazgos positivos en mieloma múltiple en estudios clínicos fase 1 (Orlowski, J Clin Oncol. 2002 noviembre 15; 20 (22) : 4420-7. , Aghajanian, Clin Cáncer Res. 2002 agosto 8 (8): 2505-11), estudios de mieloma fase 2 fueron realizados para permitir un estimado más preciso de la actividad antitumoral de Bortezomib en una población de pacientes más homogénea. La seguridad y eficacia de Bortezomib en individuos con mieloma múltiple fue investigada en dos estudios clínicos fase 2, M34100-024 (individuos con la primera recaída) y M34100-025 (individuos con segunda o mayor recaída y refractarios a su última terapia anterior) . En el Estudio M34100-025, la tasa CR+PR o Bortezomib solo fue 27% (53 de 193 pacientes), y la tasa de respuesta total (CR+PR+MR) para Bortezomib solo fue de 35% (67 de 193 pacientes). Véase Richardson PG, y col., N Engl . J Med. , 348: 2609-17 (2003). En el estudio M34100-024 las tasas CR+PR fueron 30% y 38% fueron vistas entre pacientes con mieloma múltiple recidivante tratado con Bortezomib 1.0 mg/m2 y 1.3 mg/m2, respectivamente. Ver Jagannath, Br J Haema tol . 127: 165-72 (2004). Las muestras de los pacientes y los criterios de respuesta de pacientes que participaban en estos estudios, así como los siguientes estudios adicionales descritos más adelante fueron buscados para uso en análisis farmacogenómico para identificar los marcadores asociados con la respuesta del paciente a los tratamientos.
Comparación de estudio de etiqueta abierta de Bortezomib contra dexametasona en dosis alta en pacientes con mieloma recurrente y resistente Se hizo un estudio aleatorizado, de etiqueta abierta, multicéntrico que comprendía 627 pacientes enlistados con mieloma múltiple recurrente o resistente (protocolo M34101-039) . Ver Richardson y col., N. Engl .
J. Med. 352: 2487-2498 (2005). Los pacientes fueron tratados con Bortezomib (315 pacientes) o dexametasona en dosis alta (312 pacientes).
Dosis de tra tamien to y administra ción Suministro del medi camen to y alma cenami en to Bortezomib para inyección (VELCADE™ Millenium Pharmaceuticals, Inc., Cambridge, MA) , un polvo liofilizado, estéril para reconstitución, fue suministrado en viales que contenían 2.5 mg de Bortezomib y 25 mg de manitol USP. Cada vial fue reconstituido con 2.5 mL de salina normal (0.9%), inyección de cloruro de sodio USP, de modo que la solución reconstituida contenía Bortezomib en una concentración de 1 mg/mL. La solución reconstituida era transparente e incolora con un pH final entre 5 y 6.
Tabletas de dexametasona (DECADRON® Merck & Co.
Inc.
TABLA B Información del medicamento Los pacientes fueron asignados para recibir Bortezomib o dexametasona en dosis alta por asignación aleatoria en una proporción 1:1. La aleatorización fue para que sea estratificada, con base en el número de líneas de terapia anterior (una línea anterior contra más de una línea anterior de terapia) , el tiempo de progresión en relación con el tratamiento (progresión durante su tratamiento más reciente o dentro de 6 meses de haber interrumpido su tratamiento más reciente, o recaída >6 meses después de recibir su tratamiento más reciente) , y tamizaje de los niveles de ß2-microglobulina (>2.5 mg/L contra < 2.5 mg/L).
Los pacientes asignados al grupo Bortezomib recibieron tratamiento durante un máximo de 273 días. Los pacientes en este grupo de tratamiento recibieron hasta 8 ciclos de tratamiento de 3 semanas seguido por hasta 3 ciclos de tratamiento de 5 semanas de Bortezomib. Dentro de cada ciclo de tratamiento de 3 semanas, el paciente recibió Bortezomib 1.3 mg/m2/dosis solo como una inyección intravenosa en bolo (IV) dos veces por semana durante 2 semanas (en los días 1, 4, 8 y 11) de un ciclo de 21 días. Dentro de cada ciclo de tratamiento, de 5 semanas, el paciente recibía Bortezomib 1.3 mg/m2/dosis solo como inyección IV en bolo una vez por semana (en los días 1, 8, 15 y 22) de un ciclo de 35 días.
Los pacientes asignados al grupo de dexametasona en dosis alta recibieron tratamiento durante un máximo de 280 días. Los pacientes en este grupo de tratamiento recibieron hasta 4 ciclos de tratamiento de cinco semanas, seguido por hasta 5 ciclos de tratamiento de 4 semanas. Dentro de cada ciclo de tratamiento de 5 semanas, el paciente recibía dexametasona 40 mg/día PO, una vez al día en los días 1 a 4, 9 a 12 y 17 a 20 de un ciclo de 35 días. Dentro de cada ciclo de tratamiento de 4 semanas, el paciente recibía dexametasona 40 mg/día PO una vez diario en los días 1 a 4 de un ciclo de 28 días. El protocolo proporcionado para pacientes en el grupo de dexametasona que experimentaron enfermedad progresiva confirmada (PD) para recibir Bortezomib en un estudio compañero (un estudio de etiqueta abierta, no comparativo, internacional de PS-341 administrado a pacientes con mieloma múltiple quienes recibieron dexametasona en dosis alta o experimentaron enfermedad progresiva después de recibir por lo menos 4 tratamientos previos, (protocolo M34101-040). 240 pacientes adicionales que no participaron en este estudio, enlistados en el estudio compañero y de acuerdo con el protocolo habrían recibido por lo menos 4 tratamientos anteriores. Las muestras farmacogenómicas fueron también buscadas para estos 240 pacientes.
Durante el estudio, se evalúo la respuesta de la enfermedad de acuerdo con los criterios del Grupo Europeo para Transplante de Sangre y Médula (EBMT) como se presenta en la Tabla C.
Tabla C. Criterios de respuesta de la enfermedad Tabla C Criterios de respuesta de la enfermedad 1 Tabla C Criterios de respuesta de la enfermedad Tabla C Criterios de respuesta de la enfermedad 1 1. Con base en los criterios EBMT. Ver, Blade J. et al., _Br J Haematol; 102(5) : 1115-23 (1998) . 2. Para la evaluación apropiada de CR, la médula ósea debe ser >20% celular y el calcio sérico debe estar dentro de los límites normales. 3. Se requiere una recolección y evaluación de la médula ósea para documentar CR. La repetición de la recolección y evaluación de la médula ósea no se necesita para confirmar CR en pacientes con mieloma secretor quienes tengan una ausencia sostenida de proteína monoclonal por inmunofijación durante un mínimo de 6 semanas; sin embargo, se necesita repetir la recolección y evaluación de la médula ósea en la visita de Confirmación de la Respuesta para pacientes con mieloma no secretor. 4. La necesidad de tratamiento urgente puede requerir repetir estas pruebas más pronto o eliminar un examen repetido. 5. Para la determinación de PD, el aumento en la paraproteína es en relación con el nadir.
Los pacientes eran evaluables para respuesta si ellos habían recibido por lo menos una dosis del medicamento en estudio y tenían enfermedad medible en la línea base (627 pacientes totales: 315 en el grupo Bortezomib y 312 en el grupo dexametasona) . La evaluación de la respuesta confirmada al tratamiento con Bortezomib o dexametasona de acuerdo con los criterios del Grupo Europeo para Transplante de Sangre y Médula (EBMT) se proporcionan en la Tabla D. La respuesta y datos del progreso de la enfermedad fueron determinados por un algoritmo de computadora que integro los datos de un laboratorio central y las formas de reporte de caso para cada sitio clínico, de acuerdo con los criterios BLADE (Tabla C) . La tasa de respuesta (respuesta completa más parcial (CR+PR)) en el grupo de Bortezomib fue 38%; y en el grupo de dexametasona fue 18% (P<0.0001). La respuesta completa se obtuvo en 20 pacientes (6%) que recibieron Bortezomib, y en dos pacientes (<1%) que recibieron dexametasona (P<0.0001), con respuesta completa más respuesta casi completa en 13 y 2% (P<0.0001) en pacientes que recibían Bortezomib y dexametasona, respectivamente. Estos datos han sido sometidos para publicación. Véase Richardson PG, y col., [Sometido NEJM] .
Tabla D: Resumen de la mejor respuesta confirmada al tratamiento1,2 (Población, N = 627) Mejor respuesta Bortezcmib Dexametasona Diferencia Valor confirmada nn ((%%)) nn ((%%)) (IC 95%) a pb (n = 315) (n = 312) Tasa de respuesta 121 (38) 56 (18) 0.20 (0.14, 0.27) <0.0001 total (CR+PR) Respuesta completa 20 (6) 2 (<1) 0.06 (0.03, 0.09) 0.0001 Respuesta parcial 101 (32) 54 (17) 0.15 (0.08, 0.21) <0.0001 Casi CR: IF+ 21 (7) 3 (<1) 0.06 (0.03, 0.09) Remisión SWOG 46 (15) 17 (5) 0.09 (0.05, 0.14) Respuesta menor 25 (8)) 52 (17) -0.09 (-0.14, -0.04) CR+RP+MR .. .... 146 (46). . 08 (35) 0.12 (0.04, 0..19) Sin cambio 137 (43) 149 (48) -0.04 (-0.12, 0.04) Enfermedad 22 (7) 41 (13) -0.06 (-0.11, -0.01) progresiva No evaluable 10 (3) 14 (4) -0.01 (-0.04, 0.02) 1: respuesta basada en el algoritmo de cómputo utilizando los criterios EBMT especificados en el protocolo 2: porcentajes calculados para el resultado estadístico en la sección 14 se ?redondean' al entero más cercano, incluidos los porcentajes >0.5% pero <1% redondeando a 1%; estos están reportados en las Tablas dentro del texto como <1% a) intervalo de confianza asintótico para la diferencia en las tasas dé respuesta b) valor P de la prueba chi cuadrada de Cochran-Mantel-Haenzel ajustada para los. factores de estratificación de la aleatorización real.
El progreso de la enfermedad fue determinado por los criterios Bladé como está descrito en la Tabla C y antes. El tiempo medio para el progreso de la enfermedad en el grupo de Bortezomib fue 6.2 meses (189 días); y en el grupo dexametasona fue 3.5 meses (106 días) (proporción de riesgo 0.55, P<0.0001). La fecha de progresión fue determinada por algoritmo de computadora el valor P de la prueba log-rango ajustada por factores de aleatorización reales. Ver, Richardson y col., New Engl J. Med.
La mediana del tiempo para respuesta fue de 43 días para pacientes en ambos grupos. La mediana de la duración de la respuesta fue 8 meses en el grupo de Bortezomib y 5.6 meses en el grupo de dexametasona.
Los pacientes que recibieron Bortezomib tuvieron una supervivencia general superior. Supervivencia de un año fue 80% en Bortezomib y 66% en dexametasona '(P<0.0030). Esto representa un 41% disminución en el riesgo de muerte en el grupo Bortezomib durante el primer año después de enlistarse. La proporción de riesgo para la supervivencia total fue 0.57 (P<0.0013) favoreciendo a Bortezomib. El análisis de la supervivencia total incluye datos de 147 pacientes (44%) en el grupo dexametasona quienes tuvieron progreso de la enfermedad y posteriormente fueron cruzados para recibir Bortezomib en un estudio compañero.
La evaluación de la calidad de vida puede ser analizada para determinar si la respuesta al tratamiento fue acompañado por mejoramiento medible en la calidad de vida. El análisis se hace en puntuaciones resumen así como en aspectos individuales, con métodos analíticos específicos delineados en un plan de análisis estadístico formal desarrollado antes de cerrar la base de datos.
Muestras farmacogenómicas recolectadas Las muestras farmacogenómicas de tumor (aspirado de médula ósea) fueron recolectadas de los pacientes para evaluación de la expresión de los niveles globales de mRNA .
Procedimientos estadísticos Se presentaron tabulaciones en resumen que presentaron el número de observaciones, la media, desviación estándar, mediana, mínimo y máximo para variables continuas y el número y porcentaje por categoría de datos categóricos. Las categorías para el resumen fueron los dos grupos de tratamiento asignados.
Un plan de análisis estadístico formal fue desarrollado y finalizado antes de cerrar la base de datos. Los análisis de eficacia primaria fueron hechos en la población intento para tratar (ITT) . El análisis de la eficacia primaria se hizo en las tasas de respondedores, donde un respondedor fue definido como una CR, PR o MR utilizando los criterios establecidos respectivamente en la Tabla C. Se establecieron los límites de confianza de 90% de dos lados en las proporciones de respondedores de cada grupo de dosis, correspondiente a un límite menor de un lado, de 95%.
Para aquellos pacientes que participaron en la porción farmacogenómica del estudio, la correlación entre los niveles de expresión del RNA y la respuesta al tratamiento fueron evaluados descriptivamente. Además, la duración de la respuesta, el tiempo para la progresión de la enfermedad, la calidad de vida y supervivencia total del paciente puede ser analizada utilizando la expresión del 'RNA como un factor.
Tabla E Resumen de la respuesta farmacogenómica del paciente Se evaluó un total de 224 muestras de pacientes para análisis farmacogénomico . Estas muestras de pacientes fueron recolectadas de las pruebas clínicas de Bortezomib para el tratamiento de mieloma múltiple. Ver la Tabla E. La tasa de repuesta total a Bortezomib en esta serie de pacientes fue de 46.4% (tasa CR+PR de 35%). La tasa de respuesta total a dexametasona fue 39.7% (tasa CR+PR de 22.2%). Todos los análisis farmacogenómicos dependieron de los criterios del Grupo Europeo para Transplante de Sangre y Médula (EBMT) de categoría de respuesta.
Identificación de los marcadores sensibles y no predictivos Biopsias de 224 pacientes de mieloma múltiple dieron como resultado la generación de los datos de expresión génica de alta calidad que se utilizaron para identificar los marcadores predictivos. Los marcadores candidatos que se correlacionaron con el resultado de los pacientes en mieloma múltiple para tratamiento de inhibición de proteasoma (p. ej . Bortezomib) o tratamiento de glucocorticoide (p. ej . dexametasona) fueron seleccionados utilizando una combinación de algoritmos de rango de marcador. El aprendizaje supervisado y los algoritmos de selección de la característica fueron luego utilizados para identificar los marcadores de la presente invención.
Una serie de datos que comprendían 224 muestras de descubrimiento, datos del tiempo para progresión y categorización de la respuesta a corto plazo fueron utilizados para identificar los genes asociados con el resultado del paciente a uno de los dos tratamientos (Bortezomib o dexametasona) . La serie de datos consistió en muestras de descubrimiento acopladas con el resultado del paciente medidas por la mejor respuesta y el tiempo para la progresión de la enfermedad. Para la mejor respuesta, cada paciente fue clasificado como respondedor (NR) , enfermedad estable -(Ns) o progresión (NP) . Para la identificación de los marcadores, las tres clases de respuesta fueron además agrupadas en respondedores contra no respondedores (estable y progresión) (NP+S) , respondedores contra progresión o progresión contra otros (estable y respondedores (NR+S) . Los análisis además separaron los pacientes con base en el tratamiento que recibieron. Para análisis de Bortezomib NR= 79, Ns= 43 y NP= 41. Así pues, el análisis de respondedor contra no respondedor utiliza 79 contra 84 muestras. El análisis respondedor contra progresión utiliza 79 contra 41 y el análisis progresión contra otros utiliza 41 contra 122 muestras. Para el análisis de dexametasona NR= 25, Ns= 16 y NP= 21. Por consiguiente, el análisis de respondedor contra no respondedor utiliza 25 contra 37 muestras. El análisis respondedor contra progresión utiliza 25 contra 21 y el análisis progresión contra otros utiliza 21 contra 41 muestras. 44,928 transcritos génicos (series de sondas de Affymetrix) fueron perfilados para cada muestra en los dos microarreglos Affymetrix U133 (A y B) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El RNA total fue aislado de tejido de tumor homogeneizado mediante TriazolTM (Life Technologies, Inc.) y almacenado a 80°C, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los métodos detallados para el etiquetado de las muestras y la ulterior hibridación a los arreglos están disponibles de Affymetrix (Santa Clara, CA) . En resumen, 1.5 µg del RNA total fue convertido al cDNA bicatenario (Superscript; Life Technologies, Inc.) cebando la síntesis de la primera hebra con un cebador T7-(dT)24 que contenía un promotor T7 polimerasa (Affymetrix, Ine) . Todo del cDNA bicatenario fue posteriormente utilizado como modelo para generar cRNA biotinilado utilizando la secuencia promotora T7 incorporada en un sistema de transcripción in vi tro (kit megascript; Ambion y Bio-11-CTP y Bio-16-UTP; Enzo) . Los oligonucleótídos de referencia y adiciones fueron adicionados a 6-10 µg de cRNA, el cual fue luego hibridazo a los arreglos de oligonucleótidos U133A y B durante 16 h a 45°C con rotación constante. Los arreglos fueron luego lavados y teñidos en una estación fluídica Affymetrix utilizando el protocolo EUKGE-WS1 y fueron barridos en un digitalizador Gene Array de Affymetrix.
Normali zación y transformación logarí tmi ca Los valores de expresión para todos los marcadores en cada microarreglo fueron normalizados para una media recortada de 150. Los valores de expresión fueron determinados utilizando el software de procesamiento de datos de análisis de expresión génica MAS5 (Affymetrix, Santa Clara, CA) . Estos valores serán referidos como la "expresión normalizada" en el resto de esta sección. En otro paso de procesamiento, el numero 1 fue adicionado a cada valor de expresión normalizado. El logaritmo base 2 fue tomado del número resultante, y este valor será mencionado como la "expresión log" en el resto de esta sección.
Análisis de los componen tes de la varianza Hubo hasta 6 hibridaciones repetidas para cada paciente: 3 hibridaciones repetidas para cada uno de dos etiquetados T7 RNA. Para resumir los replicados en un solo estimado de intensidad para cada paciente, se utilizó un modelo lineal de efectos mixtos. Para cada serie de sondas, se ajusto un modelo que incluía términos el efecto aleatorio específico de la muestra del paciente representado la desviación de la intensidad media total, y el efecto aleatorio de la hibridación del replicado. Estos efectos aleatorios se mencionan como los componentes de varianza del modelo. El ajuste del modelo incluye la evaluación de la varianza debido a estos dos efectos aleatorios, dando como resultado estimados de la varianza de la muestra del paciente y la varianza de la repetición.
Resumen de la expresión a través de repeticiones El valor de la expresión del resumen final, para cada muestra en cada serie de sondas, fue obtenido estimando el mejor predictor no sesgado lineal (BLUP) . El BLUP puede ser visto como un promedio ponderado de las repeticiones de cada individuo con ponderaciones inversamente proporcionales a la combinación lineal de los componentes de la varianza. Las ponderaciones influyen en la cantidad de que cada estimado de intensidad de cada individuo se desvía de la media total. Los detalles sobre los modelos de efectos mixtos y el cálculo de los estimados BLUP pueden encontrarse en la mayoría de los textos que analizan los modelos de efectos mixtos lineales y componentes de vapanza. Ver, por ejemplo, "Variance Components" de Searle, Casella, y McCulloch, Wiley Series ín Probability and Mathematical Statistics, 1992 John Wiley & Sons.
Separación de genes con baja vapanza mterpaciente Las series de sondas fueron reducidas en número para incluir solo aquellas que tenían más de 75% de su vapanza debido a la vapanza de la muestra de pacientes. De 44928 series de sondas, 7.017 pasaron este filtro y fueron llevadas a otro análisis.
Transformación log inversa opciona l El valor de la expresión de BLUP fue utilizado para el análisis de la expresión diferencial con la prueba t. para calcular los puntajes de la expresión diferencial digital, el valor del resumen final, x, fue transformado otra vez a la escala original por exponenciación, invirtiendo así la transformación logarítmica: y= 2X-1 Selección del marcador úni co Los transcritos génicos únicos que aparecen asociados con las categorías de respuesta del paciente o con tiempo para progresión del paciente pueden ser identificados utilizando la metodología de clasificación y filtraje de la característica que se describe más adelante. La identificación del marcador único de los marcadores predictivos utilizando la metodología que se describe en la presente se establecen en la Tabla 1 (Tabla ÍA y Tabla IB) , Tabla (Tabla 2A y Tabla 2B) y Tabla 3.
Selección del modelo Una serie de uno o más transcritos génicos que juntos clasifican las muestras en grupos sensible y resistente (o sensible y no sensible) o predecir TTP, en el contexto si un algoritmo clasificador particular, se refiere a este como un "modelo". Los transcritos génicos son referidos como "características". La determinación de cual combinación de transcrito o transcritos génicos clasifica mejor las muestras en grupos sensible y resistente se refiere "selección del modelo". La siguiente sección describe el proceso de cómo los modelos de la presente invención fueron identificados. Un modelo ejemplar se establece en la tabla 4. Los métodos que se proporcionan en la presente junto con la identificación del marcador único o los marcadores predictivos pueden utilizarse para identificar modelos adicionales que comprenden los marcadores de la invención.
Clasificación y fil traj e de la característica El primer paso en la selección del modelo predictivo es filtrar las 7.017 características a un número más pequeño que muestre una correspondencia con las clasificaciones de las muestras. El filtra e implica primero clasificar las características por un método de puntaje, y luego tomar solo las características de clasificación más alta para otro análisis. Los algoritmos de filtraje que se utilizan en la presente invención fueron: (1) la prueba t, y (2) Pooled Fold Change ("PFC") . En algunos aspectos, se utilizó la prueba t para identificar los genes que muestran un cambio pequeño pero consistente en los niveles, y PFC fue utilizado para identificar los genes que estuvieron "off" en una clase, pero "on" en una fracción de la otra clase. Para datos del tiempo para progresión, el modelado de riesgos proporcionales Cox fue utilizado para determinar un valor p para la asociación de una característica con tiempo para progresión.
La prueba t es un método estadístico normal para probar la diferencia significativa de las medias entre dos series de puntos que se suponen tienen distribución normal. Ésta está estrechamente relacionada a la medida más ad hoc de la expresión diferencial SNR (relación señal a ruido) , que es la diferencia de la media de la clase dividida entre la suma de las desviaciones estándar de la clase, y se ha utilizado para analizar datos de expresión antes; por ejemplo, ver la definición de P(g,c), una medida de la correlación entre la expresión del gen g y el vector de clase c, en Golub y col., "Molecular Clasification of Cáncer: Class Discovery and class prediction by marcker expression monitoring", Science, 286: 531-537 (1999), el contenido de la cual se incorpora en la presente para referencia.
El método Pooled Fold Change ("PFC") es una medida de la expresión diferencial entre dos grupos de muestras, arbitrariamente denominada "control" y "probador". PFC encuentra los genes con mayor expresión en el probador que en las muestras control. Para las comparaciones de dos clases descritas en esta invención, cada clase fue utilizada a su vez como el probador. Para calificar como teniendo mayor expresión, las muestras del probador deben estar por encima del ?es?mo percentil de la muestra control. Los valores fold-change de las muestras del probador se someten a una transformación no lineal que da origen a una asíntota especificada por el usuario, para distinguir niveles moderados de fold-change, pero no hace distinciones entre fold-change, muy grandes. Los valores fold-change comprimidos de las muestras del probador sobre expresadas se promedian para obtener el puntaje POOF. En particular, PFC para una muestra de probador determinada, s, y gen, g, se calcula como el promedio a través de las muestras del probador de la relación probador: control comprimida (Rs,g)= C (xgs/ ( k+xgQ) ) , donde C (x) es la función de compresión C(z)= A(l-3~z/A) para z > T, y C(z)= 0 para z<T, donde T es un valor umbral no menor que 1.0. A es una asíntota superior en el valor fold-change, k es una constante que refleja el ruido aditivo de los datos, es decir, el componente fijo de la varianza en adiciones repetidas. Xgs es el valor de expresión del gen g en la muestra s, xgQ es el Qés?mo percentil del valor de expresión de las muestras control.
Una fracción mínima f de las muestras del probador deben tener R(s,g) mayor que 0; si este no se mantiene cierto, entonces el valor de R(s,g) se establece en 0.
Utilizamos los siguientes parámetros en nuestra aplicación de este algoritmo: Parámetro Q f T A k Valor en la corrida 1 0.9 0.3 1.2 5 0.25 Los marcadores que utilizan las 7,017 series de sondas fueron analizados para la expresión diferencial a través de las 224 muestras de los pacientes utilizando la prueba t y los métodos PFC antes descritos. Las series de sondas encontradas significativas por la prueba t con un valor para menor que 0.01, o teniendo un puntaje PFC diferente de 0, se reportan en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3. Estas series de sondas pueden utilizarse para construir series de marcadores como se ejemplifica más adelante.
Se hizo un análisis de riesgo proporcional Cox para determinar los predoctores de tiempo hasta progresión de la enfermedad (TTP) en pacientes con mieloma múltiple recurrente y resistente después de tratamiento. Esta metodología esta diseñada para analizar datos del tiempo para el evento donde algunos de los datos pueden ser censurados (ver E. T. Lee, Statistical Methods for Survival Data Analysis, 2a ed. 1992, John Wiley % Sons, Ine) . La mediana del tiempo para progresión de la enfermedad en el grupo Bortezomib fue 6.2 meses (189 días); y en el grupo de dexametasona fue de 3.5 meses (106 días) (relación de riesgo 0.55, p<0.0001). La fecha de progresión fue determinada por algoritmo de cómputo. Se utilizó el paquete estadístico SAS para hacer el análisis; que parámetros utilizar para evaluar, etcétera .
Estimamos los modelos de riesgo proporcional Cox para cada uno de los 7,017 transcritos pasando el filtro de varianza. Es decir, 7,017 modelos fueron estimados donde cada modelo contenía un transcrito. Para cada modelo obtuvimos estimados del riesgo relativo, intervalos de confianza de 95% y valores p para la asociación de cada transcrito a TTP. De los 7,017 modelos, encontramos 294 transcritos que tenían valores p de menos de 0.01 en el análisis de los 162 pacientes tratados con Bortezomib. Encontramos 187 transcritos que tenían valores p de menos que 0.01 analizando los 63 pacientes tratados con dexametasona. Es decir, estos transcritos fueron significativamente asociados con TTP. Estas series de sondas están enlistadas en la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3.
El rango o clasificación reportada en las Tablas ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3 se determina clasificando independientemente los diferentes puntajes de los marcadores. Los rangos o clasificaciones se generan para TTP, para PD contra R, para PD contra NC+R, para NR contra R. Para las comparaciones de las respuestas, se clasificaron la prueba T y los puntajes digitales. Así pues, puede haber hasta 7 diferentes rangos #1 para marcadores predictivos específicos del inhibidor de proteasoma del resultado del tratamiento.
Resumen de los da tos proporcionados en las tablas Los siguientes términos se utilizan a lo largo de las tablas: "No" o "número" corresponden a un número de identificación para los marcadores predictivos.
"ID Probeset" corresponde al identificador Affymetrix (Santa Clara, CA) del Human Genome U133A, arreglos de oligonucleótidos serie B que se utilizaron; "ID Public Rep" se refiere a un identificador público representativo para el gen correspondiente a la serie de sondas, y se tomó de los archivos de anotación HG-U133A y HG-U133B, con fecha 12 de abril de 2005 los cuales estuvieron disponibles y se bajaron del área de soporte Gene Chip del sitio Web Affymetrix (www. Affymetrix. com/support/technical/byproduct . affx?prod uct=hgul33) ; "Título" corresponde a una descripción, donde está disponible, y también se tomó de los archivos de anotaciones de Affymetrix; "Símbolo del gen" • corresponde a un símbolo con el que el gen es comúnmente conocido y se tomó de los archivos de anotaciones de Affymetrix; "ID Entrez Gene" corresponde al identificador del gen único NCBI Unigene; "Marcador TTP" representa la indicación del marcador predictivo que se regula hacia arriba significativamente en las muestras con una correlación de tiempo más largo para la progresión (+ ) , o se regula hacia arriba significativamente en las muestras con una correlación para tiempo más corto para la progresión (-) ; "Marcador de respuesta" representa la indicación del marcador predictivo que se regula hacia arriba significativamente en las muestras que son sensibles al tratamiento (+ ) , o se regula hacia arriba significativamente en las muestras que son no sensibles al tratamiento (-) ; "Tipo de especificidad" indica la significancia de TTP y/o el indicador de la respuesta como indicador significativo del marcador predictivo; "Rango" corresponde al proceso de determinar cual de los marcadores individuales puede utilizarse en combinación para agrupar o clasificar una muestra, por ejemplo, como sensible o no sensible. El rango esta indicado como el puntaje de rango más bajo identificado entre todos los métodos para cada uno de los marcadores predictivos. En la Tabla 3 donde los marcadores predictivos son indicativos de respuesta o no respuesta para el tratamiento de inhibición de proteasoma o tratamiento con glucocorticoide, el rango indica el rango más bajo a través de diversos métodos para las muestras tratadas con Bortezomib o dexametasona. Para determinar el mejor clasificador se utilizaron los tres métodos de selección de característica diferentes, y la determinación del rango: (1) prueba t, (2) Pooled fold-change ("PFC") y (3) la prueba de la suma de rangos de Wilcoxon .
Los marcadores predictivos de la invención se proporcionan en las Tablas ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3. La Tabla 1 establece los marcadores predictivos que se identifican los cuales son identificadores específicos de respuesta o no respuesta al tratamiento de inhibición de proteasoma (por ejemplo Bortezomib) . La Tabla 1A proporciona los marcadores predictivos los cuales son indicadores regulados hacia arriba de no respuesta y/o se correlacionan con tiempo más corto para la progresión. Los marcadores números 1-547 de la Tabla ÍA son marcadores predictivos recién asociados, y los marcadores predictivos números 548-657 han sido previamente identificados como marcadores asociados predictivos de no respuesta y/o correlación con tiempo más corto para la progresión. Ver, la publicación de Patente Internacional No. WO 04053066, publicada el 24 de junio de 2004. La Tabla IB proporciona los marcadores predictivos que son indicadores regulados hacia arriba de respuesta y/o se correlacionan con tiempo más prolongado para la progresión. Los marcadores números 658-876 de la tabla IB son marcadores predictivos recién asociados, y los marcadores predictivos número 877-911 han sido previamente identificados como marcadores asociados predictivos de respuesta y/o correlación con tiempo más prolongado para la progresión. Ver, la publicación de Patente Internacional NO. WO 04053066 publicada el 24 de junio de 2004. La Tabla 2 establece marcadores predictivos identificados los cuales son identificadores específicos de respuesta o no respuesta al tratamiento con glucocorticoides (por ejemplo dexametasona) . La tabla 2A proporciona los marcadores predictivos que son indicadores regulados hacia arriba de no respuesta y/o se correlacionan con tiempo más corto para la progresión. Los marcadores números Nos. 912-1062 de la Tabla 2A son marcadores predictivos recién asociados, y los marcadores predictivos No. 1063-1070 han sido previamente identificados como marcadores asociados predictivos de no respuesta y/o correlación con tiempo más corto para la progresión relacionado con no respuesta del paciente en etapa avanzada al tratamiento de Bortezomib. Ver, la publicación de la Patente Internacional No. WO 04053066, publicada el 24 de umo de 2004. La tabla 2B proporciona los marcadores predictivos que son indicadores regulados hacia arriba de respuesta y/o se correlacionan con tiempo más prolongado para la progresión. Los marcadores números 1071-1185 de la Tabla 2B son marcadores predictivos recién asociados, y los marcadores predictivos número 1186-1202 han sido previamente identificados como marcadores asociados predictivos de respuesta y/o correlación con tiempo más prolongado para la progresión relacionado con la respuesta del paciente en etapa avanzada para el tratamiento con Bortezomib. Ver, la Publicación de la Patente Internacional No. WO 05053066, publicada el 24 de junio de 2004. La Tabla 3 establece marcadores predictivos identificados los cuales son no específicos para el tratamiento de inhibición de proteasoma o tratamiento con glucocorticoide, más bien son marcadores predictivos indicadores de respuesta/tiempo más prolongado para la progresión (+) o no respuesta/tiempo más corto para la progresión (-) con respecto a cualquier tratamiento, y son indicadores de agresividad general de la enfermedad. Los marcadores números 1203-1423 de la Tabla 3 son marcadores predictivos recién asociados, y los marcadores predictivos número 1424-1474 han sido previamente identificados como marcadores asociados predictivos de no respuesta/correlación con tiempo más corto para la progresión y/o respuesta/correlación con tiempo más prolongado para la progresión en relación con la respuesta del paciente en etapa avanzada para el tratamiento con Bortezomib. Ver, la publicación de la Patente Internacional No. WO 04053066 publicada el 24 de junio de 2004.
TABLA 1. IDENTIFICACIÓN DEL MARCADOR PREDICTIVO DEL INHIBIDOR DE PROTEASOMA ÍA Indicadores de regulación ascendente marcadores predictivos de no 15* g<lS 4<í x -jt_ li- U?M -* S?x&ss transportador H+, subunidadg '.». t ! 225373. _& . m-?? i Bí?arpéF? Proteína PP2135 PÍ1YÍ5 i4 rr j i &? • TABLA 2: IDENTIFICACIÓN DE LOS MARCADORES PREDICTIVOS DE GLUCOCORTICOIDES Indicadores regulados hacia arriba de los marcadores predictivos 2a de no respuesta y/o tiempo corto para la progresión ??? -i- Métodos de clasificación Diversos algoritmos actualmente están disponibles que pueden utilizarse para clasificar las muestras de los pacientes utilizando una serie determinada de características. Por tanto, la combinación de los marcadores seleccionada a través del proceso de selección de la característica puede utilizarse en cualquiera de los algoritmos disponibles para derivar una ecuación de predicción en cuanto a si la muestra del paciente es sensible o resistente. Los métodos de clasificación utilizados para ilustrar el uso de múltiples marcadores para la clasificación de las muestras de los pacientes en la presente invención fueron: 1) clasificación lineal predictiva ("LPS", de linear Predictive Score) ; y 2) k-vecinos más cercanos (k-nearest neighbors) .
La clasificación lineal predictiva fue implementada como se describe por Wright y col., "A gene-expression based method to diagnose clinically distinct groups of diffuse large B cell lymphoma" • PNAS 100 (17): 9991-9996 (2003) , el contenido de la cual se incorpora en la presente para referencia. Como se describe por Wright y col., la clasificación LPS para un vector X se calcula como: LPS(X) = y_jajXj donde Xj representa de expresión log para la característica jes?mo en *j_a serie, y a-, es un factor de escalamiento que representa el grado al cual la característica jes?mo Se asocia con el resultado que ha de ser pronosticado. Como en Wright y col., nosotros utilizamos el estadístico t de las características para los factores de escalamiento. Dada la clasificación LPS, la probabilidad que una muestra este en la primera de las dos clases se determina utilizando esta fórmula: PCX (= "s ". = - f{LPS(X);ßl ,<7l ) {LPS{Xy u s -C 2) yf( PS(Xy,µt,s¿) donde f(x;µ,s2) representa la función de densidad normal con media µ y varianza s , y *7. > y s2 • son medias observadas y varianzas de las clasificaciones LPS para la categoría 1 y categoría 2. En este caso, por ejemplo, la categoría 1 serian los respondedores, y la categoría 2 serian no respondedores. Entonces la predicción para una nueva muestra seria que esta estarla en la primera clase con probabilidad P(XeS?) y .en la segunda clase con probabilidad P(XeS2)=l-P (X€Si) .
El método de clasificación k vecinos más cercanos calcula la similitud entre un perfil de consulta y cada uno de los perfiles en la serie traming [ Introduction to Machine Learmng by Ethem ALPAYDIN, The MIT Press, octubre 2004, ISBN 0-262-01211-1]. Se seleccionan los k perfiles más similares, y un voto se toma entre sus etiquetas de clase para determinar la predicción para el perfil de consulta. En este caso, utilizamos k=l.
Selección de la característica La selección de la característica es el proceso de determinar una subserie de los miles de características disponibles en la serie de datos, resultando en una combinación de características que forman una serie de marcadores o modelo, para clasificar a los pacientes por resultado de tratamiento. Existen múltiples enfoques para seleccionar las características. En este caso, reportamos dos enfoques para generar series de marcadores ejemplares: (1) las principales N características más significativas, y (2) un método de selección de características estándar, selección de características de avance secuencial (ver, Dash and Liu, "Feature selection for Classification" , Inteligent Data Analysis 1: 131-156, 1997). Ahora nosotros describimos como la selección de las características se aplica a nuestra s-epe de datos.
Como un primer paso, solo las características asociadas con la variable resultado se consideran como candidatas para una serie de características. Para los modelos de los modelos LPS [sic] , fueron determinadas todas las características con valores p ajustadas a la prueba múltiple menores que 0.05. Para los modelos k vecinos más cercanos, los principales cien marcadores PFC fueron determinados. En cualquier caso, la selección de avance secuencial comienza sin marcadores en la serie. En cada iteración se forma una serie de nuevas características adicionando una característica seleccionada por una función de evaluación. La iteración termina cuando no se adiciona característica que mejore la función de evaluación. La función de evaluación es el número de muestras correctamente pronosticada: (1) por el modelo construido en todas las muestras, o (2) en la validación cruzada dejando un dato fuera (leave-one-cross-validation (Dash and Liu, 1997). Los amarres se rompen utilizando la característica que tiene una asociación univariada mayor con la variable del resultado. Las series de marcadores múltiples pueden ser generadas por rondas repetidas de selección de características, cada vez removiendo las características ya seleccionadas.
Aplicación específica de la predicción de clase Clasificación lineal del predictor (LPS) Utilizando los 162 pacientes tratados con Bortezomib clasificados en los grupos de respuesta o no respuesta, la tabla siguiente muestra los marcadores en la primera serie predictiva LPS que construimos a partir de nuestra serie de datos. También se indica si el marcador es más altamente expresable en los pacientes sensibles (R) o en los no sensibles (N) . Las anotaciones de la serie de sondas aquellas proporcionadas por Affymetrix.
Se apreciará que series de marcadores adicionales pueden obtenerse empleando los métodos descritos en la presente, y los métodos normalizados en el campo, para identificar modelos. Existen múltiples características altamente correlacionadas que podrían ser sustituidas entre si en los modelos; no todas estas están en enlistadas. Los métodos similares pueden emplearse utilizando uno o más marcadores a partir de las series de marcadores identificadas de la presente invención para generar Predictive Markes Sets (series de marcadores predictivos) .
La presente invención no se limita en su alcance por las modalidades especificas descrias que se destinan como ilustraciones de los aspectos de la invención. Los métodos y componentes funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención, además de los mostrados y descritos en la presente y serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción antes mencionada, utilizando no más que experimentación de rutina. Estos equivalentes están destinados para estar comprendidos por las siguientes cláusulas .
Todas las referencias mencionadas en la presente, incluidos los articulos de revistas patentes y bases de datos se incorporan expresamente para referencia.

Claims (27)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar un esquema de tratamiento contra cáncer para tratar un tumor en un paciente, que consiste en: a) determinar el nivel de expresión de por lo menos un marcador predictivo en una muestra de un paciente; b) comparar el nivel de expresión del marcador o los marcadores predictivos con un nivel de expresión control para determinar si el nivel de expresión del marcador predictivo es un nivel de expresión informativo; y c) determinar un esquema de tratamiento contra cáncer para tratar el tumor con base en la expresión del marcador o los marcadores predictivos en donde el marcador o los marcadores predictivos se seleccionan de los marcadores predictivos que se identifican en algunas de las Tablas 1A, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3; y en donde un nivel de expresión informativo es indicativo que el paciente es un paciente sensible o un paciente no sensible.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el nivel de expresión del marcador predictivo se determina por detección del mRNA.
3. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el nivel de expresión del marcador predictivo se determina por detección de proteina.
4. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el esquema de tratamiento contra cáncer consiste en un tratamiento de un esquema basado en inhibición de proteasoma .
5. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el tratamiento contra cáncer consiste en un esquema de tratamiento con glucocorticoide.
6. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la determinación del nivel de expresión informativo se determina por comparación con un marcador control o por comparación con un patrón predeterminado.
7. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor se selecciona de tumores líquidos o sólidos .
8. El método de la reivindicación 7, caracterizado porque el tumor liquido se selecciona del grupo que consiste en mielomas, mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, linfomas de células B, síndrome de Waldenstrom, leucemia linfocitica crónica y otras leucemias.
9. El método de la reivindicación 7, caracterizado porque el tumor sólido se selecciona del grupo seleccionado de tumores de pulmón, mama, próstata, ovario, colon, riñon e hígado.
10. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el nivel de expresión informativo se determina por una serie de marcadores predictivos que comprende dos o más marcadores predictivos.
11. El método de la reivindicación 4, caracterizado porque el esquema basado en inhibición de proteasoma para tratar el tumor consiste en el tratamiento con un inhibidor de proteasoma se selecciona del grupo que consiste en un peptidilaldehído, un ácido peptidilborónico, un éster peptidilborónico, una vinilsulfona, una epoxicetona y un análogo de lactacistina .
12. El método de la reivindicación 5, caracterizado porque el tratamiento con glucocorticoide para tratar el tumor comprende tratamiento con un glucocorticoide seleccionado del grupo que consiste en dexametasona, hidroximetasona, hidrocortisona, prednisolona, prednisona y tpamcmolona .
13. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra del paciente que consiste en células tumorales se obtiene de un individuo en cualquier momento seleccionado de antes del tratamiento del tumor, al mismo tiempo con el tratamiento del tumor o después del tratamiento del tumor.
14. Una serie de marcadores para uso en el método de la reivindicación que consiste en por lo menos Probesets seleccionados de la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3.
15. Un método para identificar un marcador predictivo o una serie de marcadores predictivos que consiste en: a) determinar en una muestra el nivel de expresión de uno o más marcadores predictivos identificados en cualquiera de las Tablas ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3; b) aplicar un método de análisis estadístico al nivel de expresión de cada marcador para seleccionar las características asociadas con respuesta o no respuesta; y c) identificar un marcador o sene de marcadores que comprenda las características seleccionadas.
16. El método de la reivindicación 15 caracterizado porque el nivel de expresión del marcador predictivo se determina por detección de mRNA.
17. El método de la reivindicación 15, caracterizado porque el nivel de expresión del marcador predictivo se determina por detección de proteina.
18. El método de la reivindicación 15, caracterizado porque la muestra es una muestra de tumor.
19. El método de la reivindicación 18, caracterizado porque el tumor se selecciona de tumores líquidos o sólidos.
20. Una serie de marcadores identificada por el método de la reivindicación 15, que consiste en por lo menos dos marcadores seleccionados de la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3.
21. El método de la reivindicación 15, caracterizado porque el método de análisis estadístico es el método de clasificación lineal predictiva.
22. El método de la reivindicación 15, caracterizado porque el método del análisis estadístico es el modelo del k-vecino más cercano.
23. Un kit o equipo para determinar un tratamiento de inhibición de proteasoma y/o tratamiento con glucocorticoide para tratar un tumor en un paciente, que contiene reactivos para evaluar la expresión de por lo menos un marcador predictivo, e instrucciones para su uso.
24. El equipo de la reivindicación 23, caracterizado porque los reactivos comprenden uno o una pluralidad de sondas de ácido nucleico, en donde la sonda se une específicamente a por lo menos un marcador predictivo.
25. El equipo de la reivindicación 23, caracterizado porque los reactivos contienen por lo menos un reactivo detector seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y una sonda peptídica, en donde el anticuerpo, derivado de anticuerpo, fragmento de anticuerpo o sonda peptídica se une específicamente a una proteína correspondiente a por lo menos un marcador predictivo.
26. Un método para identificar un agente candidato útil para tratar cáncer, que consiste en: a) poner en contacto una composición de ensayo que contiene una célula tumoral con un agente experimental; b) determinar el nivel de expresión informativo de por lo menos un marcador seleccionado de la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3; c) identificar el agente experimental como un agente candidato si este induce un nivel de expresión informativo común de un paciente sensible.
27. Un método para decidir si pagar por el tratamiento de cáncer, que consiste en: a) obtener el nivel de expresión informativo de un marcador predictivo o una serie de marcadores predictivos seleccionados de o derivados de la Tabla ÍA, Tabla IB, Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 3; b) autorizar el pago si el nivel de expresión informativo identifica a un paciente sensible.
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