MX2007013171A

MX2007013171A - Metodo para alterar la especificidad de union de las proteinas mediante reacciones de oxido-reduccion.

Info

Publication number: MX2007013171A
Application number: MX2007013171A
Authority: MX
Inventors: John A Mcintyre
Original assignee: Redox Reactive Reagents L L C
Priority date: 2005-04-19
Filing date: 2006-04-06
Publication date: 2008-01-18
Also published as: CA2602635C; CN101262774A; US9557325B2; CA2602635A1; EP1871171A4; JP2008536920A; WO2006113139A3; AU2006236928B2; AU2006236928A1; EP1871171A2; US20050260681A1; WO2006113139A2; BRPI0608373A2

Abstract

La especificidad de union del menos una proteina suspendida o disuelta en un medio liquido se altera de manera reversible al exponer la proteina a un agente oxidante o a una corriente electrica; una proteina enmascarada tal como un autoanticuerpo se puede detectar, aislar y recuperar a partir de una muestra biologica al someter el fluido biologico a un agente oxidante o a una corriente electrica para cambiar la especificidad de union de las proteinas enmascaradas contenidas en esta.

Description

MÉTODO PARA ALTERAR LA ESPECIFICIDAD DE UNION DE LAS PROTEÍNAS MEDIANTE REACCIONES DE OXBDO-REDUCCIOM CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para alterar una especificidad de unión de una proteína que tiene una especificidad de unión que se puede alterar mediante reacciones de óxido-reducción. La presente invención ' se refiere adicionalmente a un método para alterar de manera reversible le especificidad de unión de los anticuerpos, particularmente autoanticüerpos enmascarados que están naturalmente presentes en la sangre, plasma, suero u otros fluidos corporales de sujetos normales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El término "enfermedad autoinmune" se refiere a un grupo de enfermedades en donde el sistema inmune de manera errónea ataca a las células, tejidos y órganos del cuerpo de la propia persona. Típicamente, las enfermedades autoinmunes incluyen la unión del anticuerpo a los componentes del propio cuerpo, tales como proteínas y lípidos comunes. Los anticuerpos que se unen a los componentes propios (o, más típicamente, a los compuestos a los que son tan comunes que se encuentran en cada organismq) se refieren como autoanticuerpos. Como un ejemplo, la unión del autoanticuerpo de los fosfolípidos y/o de las proteínas plasmáticas que se unen al fqsfolípido se asocian con enfermedades tales como lupus sistémico eritematosO (SLE - por sus siglas en inglés), trombosis de vena profunda y trombosis arterial recurrente, embolismos pulmonares, aborto espontáneo recurrente, trombocitopenia, corea, epilepsia, livedo, hipertensión pulmonar idiopática,1 condiciones reumatológicas y un hospedero de enfermedades de la colágena. Otras enfermedades asociadas con los autoanticuerpos incluyen esclerosis, múltiple, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso discoide, tiroiditis de Hasrnimoto, soriasis, diabetes y artritis reumatoide. Existen I aproximadamente 80 diferentes enfermedades autoinmunes, y como un grupo, estas enfermedades afectan a millones de personas. Una teoría convencional con respecto a la etiología de las enfermedades autoinmunes ha sido que estas enfermedades se ocasionan por una ' sobreproducción de anticuerpos en el individuo enfermo, posiblemejnte debido a una sobre-expresión de un gen que codifica dichos autoanticuerpos. De conformidad con esta teoría, la sangre de un individuo afectado contiene un nivel elevado del autoanticuerpo particular que ocasiona la enfermedad, mientras que la sangre de un individuo normal no contiene ningún autaanticuerpo o solamente contiene una cantidad trivial. Esta teoría se apoya aparentemente por ensayos convencionales, en los cuales se pueden detectar autoanticuerpos abundantes en la sangre, o en los productos sanguíneos tales como el plasma o el suero, a partir de sujetos que tienen una enfermedad autoinmune, mientras que solamente cero o una cantidad mínima de autoanticuerpos se puede detectar en sangre o en productos sanguíneos a partir de sujetos que no tienen una enfermedad autoinmune. La presente invención se basa en el notable descubrimiento, reportado en la presente invención, de que la sangre a partir de individuos normales ¡de hecho contiene un número significativo de autoanticuerpos, en una amplia variedad equipos y especificidades. Es posible detectar y aislar estos autqanticuerpos a partir de la sangre o de un producto sanguíneo de un individuo normal y la sangre o el producto sanguíneo se trata mediante oxidación,; mediante, por ejemplo con un agente oxidante o corriente eléctrica, de conformidad con un método descrito en la presente invención. Este descubrimiento de autoanticuerpos en cantidades significativas en la sangre normal no se ha reportado previamente y, hasta donde sabe el inventor, la existencia¡de dichos autoanticuerpos en cantidades significativas en la sangre normal se desconocía completamente antes de la presente invención. ; El descubrimiento de autoanticuerpos en cantidades significativas en individuos normales generan la pregunta de porqué los autoanticujerpos no se detectan en un ensayo estándar (típicamente basado en la unión de un anticuerpo a su antígeno correspondiente) y porqué los autoanticu rpos no ocasionan síntomas de enfermedad en individuos normales. En los experimentos descritos en la presente invención, se muestra que mediante el método de la presente invención, los autoanticujerpos se pueden obtener a partir de fluidos biológicos tales como la sangre a partir de un sujeto normal mediante la exposición del fluido biológico a un agente oxidante o a una corriente eléctrica DC (por sus siglas en inglés), y el procejso es reversible. Además, se encontró que los autoanticuerpos se i pueden obtener mediante el tratamiento de productos comerciales Ivlg.

Basándose en estos experimentos, una teoría para cómo la sangre normal podría contener autoanticuerpos sin que dichos anticuerpos sean detectados a través de procedimientos de exploración ordinaria y sin que dichos anticuerpoß ocasionen enfermedad es que los autoanticuerpos circulan librementej junto con otros anticuerpos pero el sitio de unión al antígeno de los autoanticuérpos de alguna manera se enmascara o se inactivada en los individuos normales. Debido a la gran cantidad y variedad de anticuerpos enmascarados que se descubieron de conformidad con la presente invención, hay evidencia de que dichos anticuerpos enmascarados deben desempeñar un papel en los individuos sanos. Un papel benéfico en dichos anticuerpos marcados ¡se apoya en el hallazgo de anticuerpos marcados en la leche materna dé humano. Además, según la teoria de que el sitio de unión de los autoanticuerpos puede ser desenmascarado por un cambio en el estado redox, se puede teorizar que las enfermedades autoinmunes se activan o agravan por la oxidación que desenmascara el sitio de unión al antígeno de los autoanticuerpos. Además, el descubrimiento de los autoanticuerpos enmascarados en el fluido cerebro espinal sugiere que los autoanticuerpos pueden pajrticipar en las enfermedades neurodegenerativas tales como las enfermedades de Alzheimer y de Parkinson, que se pueden activar o agravar por el desenmascaramiento de los autoanticuerpos. Se sabe que la nitrosilación de las proteínas en el SNC es una de las mediciones más tempranas- del inicio del Alzheimer. Si esto sucede en el cerebro, entonces esto también podría liberar los autoanticuerpos reactivos redox a aPL. Estos autoanticuerpos aPL podrían a su vez empezar a interaccionar con los fosfolípidos en el cerebro y ocasionar muchas de las lesiones y encogimiento del cerebrp que se observan en los estudios de MRl de los cerebros de pacientes con Alzheimer. Además, esta teoría sugiere un mecanismo más general por medio del cual se puede alterar la especificidad de unión de ciertas proteínas plasmáticas. Un uso práctico inmediato del descubrimiento que forma la base de la presente invención es que permite obtener casi un abastecimiento ilimitado de los autoanticuerpos recientemente descubiertos, dichos autoanticuerpos se pueden utilizar como estándares en equipos diagnósticos para el diagnóstico de laboratorio de enfermedades autoinmunes u otras enfermedades relacionadas con aPL. Previamente, la recolección de grandes cantidades de autoanticuerpos para uso comercial ha sido difícil debido a que se pensaba que los autoanticuerpos se tenían que obtener a partir de individuos :que tenían una enfermedad autoinmune o que tenian resultados positivos para autoanticuerpos en ensayos estándares. La cantidad de dicha sangre que se puede obtener a partir de la flebotomía de pacientes individuales o mediante la sangre agrupada partir de un grupo de pacientes que se sabe que son positivos para los autoanticuerpos es limitada. Otros métodos para la obtención de autoanticuerpos, tales como las librerías de exploración de fago como se describen en la patente de E.U.A. No. 5,885,793 pueden s r difíciles y pueden consumir mucho tiempo. La evaluación de las muestras de sangre para la presencia o ausencia de anticuerpos enmascarados puede tener un valor diagnóstico importante puesto que puede presagiar o predecir que los anticuerpos podrían aparecer de manera subsecuente al estrés oxidativo en individuos particulares.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION Es el objetivo de esta invención el proveer un método para alterar de ¡manera reversible una especificidad de unión de una proteína que tiene una especificidad de unión que puede ser alterada de manera reversible por un carnbio en el estado redox. Es un objetivo adicional de la presente invención el proveer un método pajra obtener autoanticuerpos a partir de fluidos biológicos tales como sangre, suero, plasma, leche materna, fluido linfático, o fluido del SNC, particularmente dichos fluidos tomados a partir de individuos normales. Es un objetivo adicional de la presente invención el proveer un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune mediante :la administración al sujeto de un antioxidante adecuado para inactivar los autoanticuerpos en dicho sujeto.

Es un objetivo adicional de la presente invención el proveer un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune mediante ¡la inactivación de los autoanticuerpos de dicho sujeto de manera extracorp?ral. Es un objetivo adicional de la presente invención el proveer una inmunoglqbulina aislada que tiene un sitio de unión que se puede alterar mediante un cambio en las condiciones redox y un producto que comprende un fluido biológico o un extracto que contiene la proteína de un fluido biológico que se ha expuesto a un agente oxidante o a una corriente eléctrica DC suficiente para alterar la especificidad de unión de al menos una proteína contenida en éste. Es un objetivo adicional de la presente invención el proveer una muestra de un fluido biológico a partir de una o más personas que dan resultados negativos para la presencia de autoanticuerpos en ensayos clínicos de rutina y que han sido tratadas de manera que el fluido biológico demuestra subsecuentemente la presencia de autoanticuerpos. Estos y otros objetivos se lograron mediante un método para alterar la : especificidad de unión de al menos una proteína en un fluido biológico ó en un extracto que contiene proteina de un fluido biológico, la proteína teniendo un sitio de unión con una especificidad de unión que puede ser alterada de manera reversible mediante un cambio en un estado redox de la proteíná, mediante la exposición de la proteína en el fluido biológico o extracto a un agente oxidante o a una corriente eléctrica directa (DC) para llevar a cabo la alteración reversible de la especificidad de unión de la proteína en circulación. Los objetivos se lograron adicionalmente mediante un método que comprende los pasos de proveer una composición que comprende al menos una proteína suspendida o disuelta en un medio líquido, la proteína teniendo u(na especificidad de unión que se puede alterar mediante un cambio en su esta;do redox, y exponiendo la composición a un agente oxidante o a un potencial eléctrico DC suficiente para llevar a cabo la alteración de la especificidad de unión de la proteína. En otra modalidad, la invención se refiere a un método para detectar u obtener autoanticuerpos u otras proteínas enmascaradas a partir de un fluido biológico o a partir de un extracto de un fluido biológico mediante la exposición del autoanticuerpo u otra proteína enmascarada en circulación en el fluido biológico o extracto a un agente oxidante o a una corriente eléctrica DC adecuada para alterar la especificidad de unión del autoanticuerpo u otra proteína enmascarada en circulación de manera que el autoanticuerpo u otra proteína enmascarada en circulación se vuelve capaz de unirse a un antígeno o ligando, ¡volviéndose así detectable y recuperable a partir del fluido biológico o extracto( y recuperando el autoanticuerpo u otra proteína enmascarada en circulación a partir del fluido biológico. En otra modalidad, la presente ¡nvención se refiere a una ¡nmunoglobulina aislada que tiene un sitio de unión con una especificidad de unión que se puede alterar de manera reversible mediante un cambio en el estado redox. En otra modalidad, la presente ¡nvención se refiere a un método para tratar una enfermedad autoinmune mediante la administración a un sujeto qué tiene una enfermedad autoinmune de una cantidad de un antioxidante adecuada para inhibir o revertir una activación oxidativa de los sitios de ilinión de los autoanticuerpos en el sujeto. Un tratamiento de una persona que tiene una enfermedad autoinmune puede incluir el tratamiento extracorpcjral de la sangre para reducir las proteínas enmascaradas y reemplazarlas como proteínas enmascaradas. En otra modalidad, la presente invención se refiere un método para explorar un fluido biológico o extracto de un individuo normal para determinar cuáles autoanticuerpos están enmascarados y construir así un perfil potejncial de anticuerpo de los autoanticuerpos que podría ocasionar enfermedad autoinmune en ese individuo si se expone o desenmascara mediante l¡a oxidación o una fuerza electromotriz. Como un ejemplo particular, no limitante, un fluido biológico o extracto tal como una mezcla de inmunoglobulina se puede exponer a un agente oxidante o a una corriente eléctrica DC para llevar a cabo la alteración de la especificidad de unión de al menos un autoanticuerpo contenido en el fluido bioljógico o extracto, de manera que el autoanticuerpo se vuelve detectable y recuperable a partir de la sangre, plasma, suero o extracto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una gráfica que muestra el perfil de desviación por difracción ' hacia adelante (tamaño) y el perfil de desviación por difracción lateral (glanularidad) de la población de células monocitos como se define por los leucocitos de humano aislados por gradiente de densidad mediante citometría de flujo. Las figuras 2A-2D son histogramas de citometría de flujo que muestran actividad de monocito en diversos sueros. En los histogramas, la actividad del anticuerpo, si está presente, se midió mediante cambios en los valores del canal medio (escala logarítmica) a lo largo del eje horizontal. La figura 2A muestra la reactividad del monocito de los sueros agrupados normales de humano (NHS). La figura 2B muestra la actividad del monocito de un suero a partir de un sujeto normal particular. La figura 2C muestra la actividad del monocito de una muestra de sangre a partir del sujeto que se muestra en la figura 2B que se trató de conformidad con el método descrito en la sección del principio de los ejemplos. La figura 2D muestra la actividad del monocito de los sueros positivos control. La figura 3 es una gráfica que muestra la cantidad de aPS, aCL, aPE, y aPC (como se mide por densidad óptica, DO) detectada en una serie de preparaciones de Ivlg que se incubaron con hemina, como una función de la cantidad de suero de humano (en µl) añadida a las preparaciones.

La figura 4 es una gráfica que muestra la cantidad de aPS, aCL, aPE, y aPC (como se mide por densidad óptica, DO) detectada en una serie de preparaciones diluidas de suero de humano que se incubaron con hemina, como una función de la cantidad de hemina (en µl) añadida a las preparaciones. La figura 5 es una gráfica que muestra la cantidad de aPS, aCL, aPE, y aRC (como se mide por múltiples de las medias, MoMs) detectada en una serie de preparaciones de Ivlg que se incubaron con hemina y vitamina C, como una1 función de la cantidad de vitamina C (en µg) añadida a las preparaciones. La figura 6 es una gráfica que muestra la cantidad de aPS, aCL, aPE, y aPC (como se mide por múltiples de las medias, MoMs) detectada en una serie de preparaciones de Ivlg que se incubaron con hemina solubilizada en NaOH, i hematoporfirina IX solubílizada en DMSO (hplX), hplX solubilizada en NaOH, ¡NaOH solo, DMSO solo, y hemína solubilizada en DMSO. La figura 7 es una gráfica que muestra la cantidad de aPS (como se mide por densidad óptica, DO) detectada en una serie de preparaciones de Ivlg que se incubaron con cantidades incrementadas de hemina y cantidades incrementadas de hemina y hepomexina (hpx). Las figuras 8A-8C muestran los Western blots obtenidos por tres lisados celulares con Ivlg tratada con hemina e Ivlg no tratada utilizadas como anticuerpos primarios, junto con un blot en donde el conjugado marcado con HRP anti-humano se utilizó como control.

Las figuras 9A y 9B son gráficas que muestran la cantidad de aPL dependiente y aPL independiente de aPS, aCL, aPE, y aPC (como se mide por, múltiples de las medias, MoMs) detectada en una serie de preparaciones de Ivlg en las cuales los electrodos conectados a una batería de 9 voltios se sumergieron en una solución salina con pH regulado con fosfato qu¡e contenía la Ivlg por 2 minutos. ! La figura 10 es una gráfica que muestra la cantidad de aPL, aCL, aPE, y aPC (como se mide por múltiples de las medias, MoMs) detectada en I una serie ide preparaciones de Ivlg en las cuales los electrodos conectados a una batería de 6 voltios se sumergieron en una solución salina con pH regulado con fosfato que contenía la Ivlg por 60 segundos. La figura 11 es una gráfica que muestra la cantidad de aPL, aCL, aPE, y aPC (como se mide por múltiples de las medias, MoMs) detectada en una serie de preparaciones de Ivlg en las cuales los electrodos conectados a una batería de 6 voltios se sumergieron en una solución salina con pH regulado con fosfato que contenía la Ivlg, como una función del tiempo de inmersión. Las figuras 12A-12C son gráficas que muestran la cantidad de aCL, aPE, y aPS, respectivamente (como se mide por múltiples de las medias, MoMs), detectada en soluciones control antes y después de la exposición por 240 segundos a los electrodos conectados a una batería de 6 voltios. La figura 13 es una gráfica que muestra la cantidad de aPL y aCL, respectivamente (como se mide por múltiples de las medias, MoMs), detectada en el suero diluido en PBS de un paciente positivo a aPS y aCL. En el experimento, los electrodos de grafito conectados a una batería de 6 voltios se sumergieron en el suero diluido por una cantidad variable de tiempo. La figura 14 es una gráfica que muestra la cantidad de aPL, aCL, aPE, y aPC (como se mide por múltiples de las medias, MoMs), respectivamente, detectada en el suero diluido en PBS de un paciente positivo a aPE. Erj el experimento, los electrodos de grafito conectados a una batería de 6 voltios se sumergieron en el suero diluido por una cantidad variable de tiempo. La figura 15 es una gráfica que muestra la cantidad de aPS, aCL y aPE, (cómo se mide por densidad óptica, DO), respectivamente, detectada en el suero diluido en PBS de un paciente positivo a aPE. En el experimento, el plasma de bovino adulto al 10% (ABP) utilizado en la determinación de la unión de áPL dependiente de proteína se trató al sumergir los electrodos de grafito conectados a una batería de 6 voltios en el ABP por una cantidad variable de tiempo. La figura 16 es una gráfica que compara la cantidad de aPS, aCL, aPE, y aPC (como se mide por densidad óptica, DO) detectada en una muestra nó incubada de leche materna de humano con la cantidad detectada en una muestra de leche materna de humano que se incubó con hemina. Las figuras 17A y 17B son gráficas que muestran la cantidad de aPS, aCL y aPE (como se mide por densidad óptica, DO), respectivamente, detectada ' en el fluido CSF de un sujeto normal, tanto para las muestas no incubadas: como para las muestras que fueron incubadas con hemina. Los resultados se muestran tanto para las muestras diluidas con PBS como diluidas cfn ABP.

La figura 18 es una gráfica que compara la cantidad de IgG detectablé por anti-nitrotirosina en una muestra de IgG que ha sido tratada con heminja y una muestra de IgG que no ha sido tratada con hemina. ¡ Las figuras 19A-19D son histogramas de citometría de flujo que muestran actividad de neutrófilosen diversas preparaciones de Ivlg.

Las figuras 20A y 20B son una gráfica que compara la cantidad de aPS, aÍ L, aPE, y aPC (como se mide por densidad óptica, DO) detectada en una muestra no incubada de suero de caballo con la cantidad detectada en i una muestra de suero de caballo que se incubó con hemina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION ; \ La presente invención se refiere a un método para alterar la especificidad de unión de al menos una proteína en un fluido biológico o extracto dé un fluido biológico.

Típicamente, las proteínas que son el sujeto de la presente invención ¡ son aquellas que se encuentran naturalmente en el sistema circulatorio, sistema linfático, fluido cerebro espinal o leche materna de los animales. ¡ Los ejemplos de dichas proteínas incluyen anticuerpos y otras proteínas plasmáticas. Como un ejemplo no limitante, la proteína puede ser un anticuerpo1 o un autoanticuerpo del isotipo IgG, IgA o IgM. En particular, la presente ¡invención se dirige a una clase de proteínas recientemente descubiertas en la presente invención que tienen la propiedad de tener una especificidad de unión que se puede alterar de manera reversible mediante un cambio en el estado redox de la proteína. El descubrimiento por el inventor de que existen proteínas en circulación, tales como autoanticuerpos, que tienen esta propiedad forma una base de la invención. La presente invención no se limita a los anticuerpos o autoanticuerpos, puesto que se ha descubierto que ciertas pr teínas no anticuerpo tienen una especificidad de unión que se I puede alterar por un cambio en el estado redox. Estas proteínas no anticuerpo incluyen quininógeno y protrombina y/o beta2 glicoproteína. El término "proteína enmascarada" se utiliza en la presente invención para designar y describir una proteína tal como una proteína en circulación que, en individuos normales, está presente en la sangre o en otros fluidos corporales, pero no es detectable por los ensayos de unión convencionales basados en la unión del receptor-ligando debido a que su estado de unión está, en el individuo normal o en una muestra tomada a partir del individuo normal, enmascarado o bloqueado o se previene de otra manera que se una a un antígeno, y que, cuando una muestra que contiene la proteína enmascarada se trata mediante el cambio de su estado redox, tal como mediante la exposición a un agente oxidante o corriente eléctrica de conformidad con un método de la presente invención, se vuelve capaz de unirse a un antígeno y por lo tanto se vuelve detectable en una muestra. Un ejemplo de una proteína enmascarada es un autoanticuerpo de conformidad con la présente invención, incluyendo, pero no limitado a aquellos que se listan en el cuadro 1 , a continuación. Como se descubrió por el presente inventor, los autoanticuerpos enmascarados circulan en cantidades significativas en la sangre normal, pero no son detectables en los ensayos convencionales basados en la unión anticuerpo-antígeno. Como se discute en la presenté invención, un autoanticuerpo enmascarado se vuelve detectable y recuperable cuando el autoanticuerpo se somete a condiciones de oxidación-reducciónjadecuadas para alterar su especificidad de unión. Después del descubrimiento que forma la base de la presente invención,: ha sido posible explorar muestras tales como sangre, suero, leche materna, fluido cerebro espinal, y extractos de Ivlg con una variedad de antígenos propios y otros tipos de antígenos para identificar autoanticuerpos enmascarados que pueden ser desenmascarados mediante oxidación. Los autoanticuerpos que han sido desenmascarados mediante oxidación incluyen los siguientes en el cuadro 1 : CUADRO 1 Autoanticuerpos enmascarados identificados hasta la fecha después de la conversión redox del plasma normal o IgG Reactividad de la membrana basal del trofoblasto remarcablemente similar a aquella reportada por Faulk et al. utilizando eluidos i placentales [27].

Abreviaturas utilizadas en el cuadro 1 : aCL, anticardiolipina aPC, antifosfatidilcolina aPE, antifosfatidiletanolamina APPT, tiempo de tromboplastina parcial activada dRVVT, tiempo de veneno de serpiente de Russell diluido ELISA, ensayo inmunosorbente asociado a enzima RÍA, radioinmunoensayo Por consiguiente, la presente invención incluyen métodos para alterar la especificidad de unión de cualesquiera de las inmunoglobulinas anteriormente mencionadas a partir de un estado de no unión a un estado de unión con respecto a su antígeno particular. Además, se cree que las inmunoglóbulinas anteriormente mencionadas que son desenmascaradas por los métodos de la presente invención representan una clase no previamente descubiertja de autoanticuerpos. Por consiguiente, la presente invención incluye adicionalmente inmunoglobulinas aisladas que tienen un sitio de unión al antígeno con una especificidad de unión que se puede alterar reversiblemente por un cambio en el estado redox. El término "inmunoglobulina aislada" se refiere a una inmunoglobulina que ha sido removida de su estado natural. Por ejemplo, una inmunoglobulina de la presente invención típicamente es una que previamente no ha sido detectada en una muestra biológica debido a que su sitio de unión al antígeno se mantuvo en su ambiente natural en un estado de no unión. Sin embargo, con el tratamiento de la muestra para cambiar el estado redox, tal como el tratamiento con un agente oxidante o corriente eléctrica DC, la inmunoglojbulina se vuelve capaz de unir específicamente un antígeno respectivo! particular. Al explotar la capacidad modificada de la ¡nmunoglqbulina para unirse específicamente a un antígeno particular, la inmunoglo¡bulina se puede detectar, aislar y/o recuperar a partir de la muestra. Además, se ha encontrado que la sangre, suero o muestras de Ivlg que inicialmente son consideradas como negativas para HCV (virus de la hepatitis C) son evaluadas como positivas para HCV después de un tratamiento de conformidad con la presente invención, sugiriendo que los individuos normales tienen anticuerpos anti-HCV enmascarados en su circulación. El término "alterar la especificidad de unión" de una proteína se refiere a un procedimiento en donde una proteína se modifica o altera, tal como mediante oxidación o reducción, de manera que se vuelve capaz de unirse específicamente a un antígeno o ligando al cual no era capaz de unirse previamente de manera específica. El término también se puede aplicar a un procedimiento en donde una proteína se modifica o altera, tal como mediante oxidación o reducción de manera que se vuelve incapaz de unirse específicamente a un antígeno o ligando al cual había sido capaz previamente de unirse de manera específica, pero se debe entender que en este contexto, el término se refiere a un cambio reversible y no a un cambio permanente, irreversible tal como la desnaturalización de la proteína. El término "desenmascarar" se refiere a un procedimiento en donde la especificidad de unión de una proteína enmascarada se altera por un cambio en el estado redox de manera que la proteína se vuelve detectable mediante el ensayo de unión basado en la especificidad de unión alterada. En particular, la especificidad de unión de la proteína enmascarada se puede modificar a partir de un estado de no unión hacia un estado de unión con respecto a un antígeno o ligando, en donde la proteína se considera desenmascarada. El término "autoanticuerpo" se refiere a cualquier anticuerpo que se presenta de manera natural producido por el sistema inmune de un animal y que se; une a un auto-antígeno, es decir, a un compuesto o antígeno producido: por el animal mismo. Los términos "fluido corporal" o "fluido biológico" incluye cualquier fluido corporal incluyendo plasma, suero y sangre completa, saliva, orina, fluido de lactancia, fluido del sistema nervio central (SNC), tal como fluido cerebro espinal y otros fluidos y secreciones y pueden ser proteínas tales como proteínas en circulación. El fluido corporal puede ser a partir de cualquier vertebrado que produce anticuerpos, particularmente mamíferos y aves y r?ás particularmente humanos. El término "extracto de un fluido biológico que contiene proteína" se refiere a cualquier preparación que se recolecta o separa a partir de un fluido biológico, tales como fracciones de inmunogldbulina. Los fluidos biológicos incluyendo sangre, suero o plasma que se pueden utilizar en la presente invención se pueden obtener recientemente a partir de un sujeto, o se pueden obtener a partir de fuentes tales como preparaciones de sangre agrupada o de plasma obtenidas a partir de bancos de sangre o de otras instalaciones para recolección de sangre. Para los propósitos de la presente invención, la sangre, suero o plasma también pueden ser a partir de colecciones que están caducas o de otra manera qijje se encuentran clasificadas como subestándar por los bancos de sangre o ¡instalaciones de recolección de sangre. Aunque esta descripción se enfoca en la sangre de humano, plasma y suero y en otros fluidos biológicos, i el procedimiento idéntico de esta invención se puede aplicar a fluidos biológicos; obtenidos a partir de animales y debe resultar en la obtención de antícuerpqs animales análogos para propósitos que se relacionan con la medicina veterinaria. Por ejemplo, los autoanticuerpos análogos han sido detectados en muestras a partir de caballos y pollos (datos no mostrados).

Preferiblemente, los fluidos biológicos utilizados en el método de la invención se pueden diluir para reducir el efecto de cualesquiera antioxidantes que pueden estar contenidos en la presente invención. Además, el método de la presente invención se puede llevar a cabo en un extracto tal como una preparación de Ivlg o cualquier otro extracto aislado o concentración de inmunoglobulinas. Como se detalla en los ejemplos, >a continuación, dichas preparaciones cuando no están tratadas, muestran niveles mínimos de autoanticuerpos. Las proteínas enmascaradas tales como los autoanticuerpos enmascarados se pueden detectar y recuperar a partir dé dichas preparaciones después del tratamiento con un agente oxidante o corriente eléctrica DC de conformidad con un método de la presente ¡invención. En el método de la presente ¡nvención, la especificidad de unión de al menos una proteína en circulación o proteína plasmática en un fluido biológico $e altera mediante la exposición de la proteína a un oxidante o a una corriente eléctrica. Por ejemplo, la especificidad de unión de una proteína enmascarada en circulación se puede alterar de manera que la proteína se desenmascara, es decir, de manera que sea capaz de unirse a un antígeno que no er capaz de unirse antes de llevar a cabo el método. Una proteína que ha tenido su especificidad de unión alterada se puede aislar entonces y recuperar mediante cualquier método de separación basándose en la unión específica1. Si se utiliza un agente oxidante para llevar a cabo el método de la invención, el agente oxidante puede ser cualquier compuesto que es capaz de alterar él estado redox de una molécula biológica. Más específicamente, el agente oxidante es una molécula que tiene la capacidad de ser reducida mediante ¡la acción de un aceptor de electrones para otras moléculas que actúan como donantes de electrones. Los agentes oxidantes adecuados incluyen compuestos en anillo que contienen un metal coordinado, particularrriente un metal oxidante tal como hierro. Los ejemplos de agentes oxidantes incluyen, pero no se limitan a hemina y clorofila. Otros agentes oxidantes líales como peryodato de sodio (Nal04) o permanganato de potasio (KMn04). Típicamente, cuando se utiliza un agente oxidante, se debe incubar una mezcla del fluido biológico o extracto y el agente oxidante por un periodo de tiemp , típicamente de aproximadamente un día o durante toda la noche. El agente ¡oxidante se debe utilizar una concentración adecuada para alterar la especificidad de unión de una proteína que tiene una especificidad de unión que se puede alterar, pero no a una concentración que pueda destruir o desnaturalizar la proteína. En el caso de los autoanticuerpos, se ha encontrad^ que diferentes tipos de autoanticuerpos pueden ¡nteractuar de manera diferente con diferentes antioxidantes. Por ejemplo, para el desenmascaramiento de los autoanticuerpos aPC, los resultados son muy buenos co ¡n kMn04 y no tan buenos con hemina. Si se utiliza una corriente eléctrica DC para llevar a cabo el método de la invención, el método se puede llevar a cabo mediante cualesquiera medios para administrar una corriente eléctrica, tal como mediante la inmersión de los electrodos positivos y negativos dentro de una solución qonductora que contiene la muestra a ser tratada. Típicamente, una solución que contiene un fluido biológico se puede exponer a un potencial eléctrico de una magnitud adecuada y de una duración adecuada para alterar la especificidad de unión de una proteína que tiene una especificidad de unión que se pilede alterar. Se ha encontrado que resultados positivos se pueden obtener m;ed¡ante la exposición de una solución a un potencial eléctrico de 6 -24 voltios por unos pocos segundos a unos pocos minutos. Como se discute en los ejemplos, una exposición extendida a una corriente eléctrica puede resultar en la reversión de la alteración de la especificidad de unión.

Sin atenerse a una teoría específica, se prefiere, en el caso de un autoariticuerpo, que el autoanticuerpo se pueda exponer a un agente oxidante ó a una corriente eléctrica en una cantidad o por un tiempo adecuado para oxidar un sitio de unión del antígeno en una porción Fab del autoanticderpo. Se ha encontrado mediante experimentos adicionales utilizando )a detección por anticuerpos anti-nitrotirosina que la IgG que ha sido expuesta a la oxidación por la hemina tiene un mayor grado de nitrosilación ¡ que la IgG no tratada. Por consiguiente, se puede teorizar que la alteración del sitio de un'ión al antígeno de las proteínas, y particularmente la alteración de la especificidad de unión al antígeno de los autoanticuerpos se afecta por la nitrosilacion reversible de los residuos de tirosina y alrededor de la región hipervariable del anticuerpo, que puede producir cambios conformacionales en el sitio de unión del antígeno. Si una proteína de interés particular es una que tiene una especificidad de unión que se puede alterar mediante el cambio de su estado redox y lá efectividad de cualquier ajuste de condiciones para alterar la especificidad de unión de la proteína particular de interés, ésto se puede determinar fácilmente al someter ia proteína o fluido biológico que contiene una proteína a un cambio en el estado redox mediante, por ejemplo, la exposición de la proteína o del fluido biológico a un agente oxidante y luego utilizando ¡ ELISA u otros ensayos ligando-receptor para determinar si la especificidjad de unión de la proteína ha sido alterada. En otras palabras, un ensayo dé una muestra o de una serie de muestras tomadas a partir de un sujeto se puede llevar a cabo antes y después de que una proteína sea sometida a un cambio en las condiciones redox para observar si el procedimiento ha alterado la especificidad de unión de la proteína. Por ejemplo, él mejor agente oxidante para recuperar un autoanticuerpo específico se puede determinar fácilmente mediante experimentación simple. Un aspecto adicional de la presente invención es la posibilidad de tratar a un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune, basándose en el nuevo entendimiento de cómo se generan estas enfermedades. Por ejemplo, si se sabe que las enfermedades autoinmunes se generan mediante el desenmascaramiento de autoanticuerpos que están presentes en una forma enmascarada en individuos sanos, entonces el tratamiento y la prevención se pueden enfocar sobre la inhibición o la reversión del desenmascaramiento de los autoanticuerpos, tal como mediante el tratamiento del sujeto con un agente antioxidante o reductor para ocasionar que los autoanticuerpos se reviertan hacia un estado enmascarado. Los agentes que se ha encontrado que inhiben una reacción de desenmascaramiento de los autoanticuerpos incluyen antioxidantes tales como ácido ascórbico, hemopexina y apotransferrina. De manera similar, un método de tratamiento puede incluir la toma de una muestra de sangre a partir del sujeto, exponiendo la muestra de sangre a un antioxidante, agente reductor o corriente eléctrica adecuada para inactivar los autoanticuerpos en dicha muestra de sangre, y regresando la muestra de sangre al sujeto.

Un aspecto adicional de la presente invención es un método de exploración de un fluido biológico del individuo o extracto para determinar cuáles autoanticuerpos están enmascarados y construir así un perfil de anticuerpo potencial de los autoanticuerpos que podría ocasionar enfermedad autoinmu?e en ese individuo si se expone o es desenmascarado por la oxidación ¡o una fuerza electromotriz. Por ejemplo, en términos generales, se puede ensayar una muestra biológica a partir de un sujeto para determinar una cantidad y/o tipo de autoanticuerpos detectables en la muestra. Posteriornnente se puede tratar una muestra biológica a partir del sujeto mediante la exposición de la muestra a un agente oxidante o una corriente eléctrica DC, y la muestra a partir del sujeto se puede ensayar para determinar una cantidad y/o tipo de autoanticuerpos detectables en la muestra tratada. Posteriormente, la cantidad y/o tipo de autoanticuerpos detectables en la muestra antes del paso de tratamiento se puede comparar con la cantidad y/o tipo dé autoanticuerpos detectables en la muestra después del paso de tratamiento. Estos mismos pasos del método se pueden llevar a cabo para determinar^ la efectividad de cualquier compuesto particular, composición o condiciones para lograr una alteración de un estado de unión de las proteínas en cualquier muestra particular. Se ha encontrado que la sangre no tratada, plasma, suero o muestras de Ivlg y sangre, plasma o suero o muestras de Ivlg tratadas de conformid d con el método de la presente ¡nvención se pueden liofilizar o enviar o almacenar. Cuando las muestras se constituyen, éstas retienen su actividad respectiva.

EJEMPLOS Habiendo descrito la invención, los siguientes ejemplo se proporcionan para ilustrar las aplicaciones específicas de la invención, incluyendo el mejor modo actualmente conocido para llevar a cabo la invención. Los ejemplos se presentan en orden cronológico aproximado y por lo tanto muestran una progresión en el entendimiento de los componentes y procedimientos requeridos para lograr los efectos de la invención. No se pretende que estos ejemplos específicos limiten el alcance de la invención descrita en esta solicitud. Con respecto a cada uno de los ejemplos 1 a 17 descritos en la presente invención, a menos que se mencione de otra manera, típicamente se utilizó el siguiente procedimiento: una muestra de 10 ml de sangre completa o 5 ml de suero o plasma a partir de un sujeto normal negativo a aPL y 4-5 ml de eritrocitos de mamífero empaquetados se añadieron a un vial que contenía 30 ml de njiedio de crecimiento para cultivo bacteriano marca Biomerieux (que contiene al menos los siguientes ingredientes: agua destinada, caldo digerido soya-caseína, extracto de levadura; dextrosa; sacarosa; hemina; menadiona (vitamina K3); piridoxal HCi (vitamina B6); y polianetolsulfonato de sodio (SPS) y carbón activado. Posteriormente, la mezcla se incubó, con mecido y agitación, a 37°C con un período de 18 - 22 horas. Después de la incubación y centrifugación, se evaluó una muestra de la sangre incubada o suero/RBC para la pr sencia de anticuerpos antifosfolípidos (aPL) utilizando un formato comprehensivo ELISA de aPL realizado en el laboratorio que provee 24 resultados! separados de una prueba aPL. El procedimiento de prueba se describe cbn mayor detalle en las siguientes publicaciones, incorporadas en la presente invención como referencia: Wagenknecht DR, et al., The Evolution, Evaluation and Interpretaron of Antiphospholipid Antibody Assays, Clinícal Immunoloc^y Newsletter, Vol. 15, No. 2/3 (1995) pp. 28 - 38 y Mclntyre JA, et al., Frequéncy and Specificities of Antiphospholipid Antibodies (aPL) in Volunteer Blood Donors, Immunobiology 207(1 ): 59-63, 2003. El cuadro A muestra las 24 especificidades aPL separadas que fueron evaluadas mediante el uso del formato comprehensivo ELISA de aPL realizado en el laboratorio. Se ensayaron cuatro especificidades, 1 ) aPS = antifosfatidilserina, 2) aCL = anticardiolipina, 3) aPE antifosfatidiletanolamina, y 4) aPC = antifosfatidilcolina. Para cada una de estas especificidades aPL, se buscaron tres isotipos de inmunoglobulina, IgG, IgA e IgM: Cada especificidad y cada isotipo se evaluaron en la presencia (dependencia) y ausencia (independencia) de un suplemente diluyente de regulador e pH, 10% de plasma de bovino adulto (ABP), que contiene las proteínas plasmáticas para unión al fosfolípido) o 1 % de albúmina de suero de bovino, (BSA, que carece de proteínas plasmáticas para unión al fosfolípido), respectivamente. La dilución final de las muestras de sangre del sujeto fue entre 1/50 y 1/100. El cuadro A lista los anticuerpos antifosfolípido particulares (aPL) que fueron ensayados por el formato de ensayo inmunosorbente asociado a enzima realizado en el laboratorio (ELISA) utilizado en muchos de los ejemplos, Rescritos a continuación.

CUADRO A ELISA de aPL realizado en el laboratorio* PS CL PE PC IgG IgG IgG IgG IgA IQA IgA IgA IgM Ig IgM IgM * e|n la presencia (dependiente) y ausencia (independiente) de protcmas plasmáticas de unión a fosfobpidos Los resultados de las 24 especificidades aPL obtenidas a partir de los djversos experimentos descritos en la presente invención se proporcionan en las figuras anexas. Los hallazgos positivos/negativos se expresan en múltiplos de las medias (MoM) basadas en las muestras de plasma evaluadas a partir de 775 donantes normales de sangre, como se describe en Mclntyre JA, Immunobiology, anteriormente mencionado. La presencia de +++ indica una actividad fuerte del anticuerpo. Los marcadores de + y ++ indican una actividad baja e intermedia del anticuerpo, respectivamente. Las figuras también proveen los intervalos de valores normales para cada especificidad aPL y combinación del isotipo. Un resultado positivo en la columna indicada como "dependiente" de la proteína de unión PL significa que el anticuerpo antifosfolípido (aPL) se une realmente una proteína plasmática que inicialmente se ha unido al fosfolípido particular indicado. Las proteínas plasmáticas que típicamente se pueden unir por PS y CL incluyen las siguientes: beta2-gl¡coproteína I, protrombina, proteína C, proteína S, anexina V, y componentes del complemento factor H y C4 (véase, por ejemplo, i Mclntyre, J.A.Wagenknecht, D.R. y Faulk, W.P. Antiphospholipid antibodies: Discovery,, definition, detection and disease. Prog. Lipid Res. 42 (3): 176-237, en la página 182). La naturaleza fisiológica de la unión de la proteína plasmática no se conoce precisamente para todos los fosfolípidos, pero se piensa que dicha unión induce cambios conformacionales en la estructura de la proteíná plasmática, exponiendo así epítopes novedosos o crípticos que son dirigidos entonces por los autoanticuerpos del individuo. Las proteínas plasmáticas que típicamente se pueden unir por el fosfolípido PE incluyen las siguientes:; quininógenos de alto y bajo peso molecular, y el factor XI y precalicreína. Las últimas dos proteínas se pueden detectar en virtud de su fidelidad en la unión a quininógeno de alto peso molecular. Las proteínas plasmáticas que se unen a PC aún no han sido definidas. En ciertos experimentos, se han observado aPL independientes de la proteína plasmática (véase el cuadro C). Una explicación posible para esta actividad es que representa la presencia de proteínas plasmáticas residuales para unión al fosfolípido 'que están presentes en la muestra de sangre original.

EJEMPLO 1 Se incubó una muestra de sangre a partir de un sujeto normal y se evaluó de conformidad con el procedimiento anteriormente descrito. Los resultadosidel ELISA de aPL se muestran en el cuadro B. Como se muestra en el cuadro B, la muestra de sangre incubada muestra una presencia dramática ¡de actividad del autoanticuerpo, en comparación con la sangre normal, no tratada mostrada en la columna de intervalos normales. En particular, se muestra una fuerte actividad antianticuerpo en la categoría de dependiente a la proteína para aPS (IgG), aCL (todos los isotipos), y aPE (IgG). La baja actividad del autoanticuerpo aPC IgG o su ausencia fue un hallazgo característico en los ejemplos tempranos y en los procedimientos en los cuales ¡se utilizó hemina como el agente oxidante. Este resultado indica que los autoanticuerpos a PC, especialmente del isotipo IgG son diferentes y tal vez no se activan de la misma manera que otros. En experimentos posteriores, se encontró que se pueden detectar niveles significativos de aPC en muestras que estaban tratadas con KMn04 (datos no mostrados). El cuadro B es un cuadro que resume los resultados del ensayo de aPL para una muestra de sangre a partir de un sujeto normal negativo a aPL, incubada de conformidad con el método descrito en la sección del principio dé los ejemplos.

CUADRO B caldo no condicionado + sangre resultados del anticuerpo anrifosfolipido (aPL) proteína de unión PL intervalos normales - dependiente independiente aP IgG 12 oM+++ 2 MoM = 4 MoM aCL IgA 12Mo +++ 2 MoM < 4 MoM ig 15MoM+++ 1 MoM < 6 MoM IgG 2 MoM 4 MoM < MoM aPC IqA I oM 3 MoM <3MoM laM 6M0M+ 5Mo + < MoM EJEMPLO 2 : Se incubaron muestras de sangre retiradas de siete sujetos sanos y sé evaluaron de conformidad con el procedimiento anteriormente descrito. En particular, las siete muestras de sangre de los sujetos se retiraron en un período de 20 minutos y se incubaron por 20 horas en condiciones idénticas. El cuadro C es un cuadro compuesto que muestra el intervalo de seroconvérsión aPL para estas siete muestras. Estos resultados muestran que existen variaciones en los niveles de aPL detectados así como en los isotipos presentes entre los diferentes individuos. No obstante, como se muestra por la invención, cada individuo tuvo anticuerpos aPL que pudieron ser detectados después d¡e la incubación. El cuadro C es un cuadro compuesto que resume los resultados del ensayó aPL de muestras de sangre a partir de siete individuos normales negativos ¡a aPL, incubadas de conformidad con el método descrito en la sección dej principio de los ejemplos.

CUADRO C hiten alo de aPL para **** µeuonas sajía» Rt'suJUcloi del anticuerpo ajitifosfobpido (aJ'L) Pi oleína de unión PL Intervalos nórmale* Dependient e Independiente IgG ? ?5 + ' 5-14 +4 < 4 oM aPS IgA 4-1 + 4- 8 + < 3 oM IgM ^16 + 3-13 " < 5 MoM EJEMPLO 3 En un primer experimento, se incubó una muestra de suero a partir de un sujeto normal y se evaluó de conformidad con el procedimiento básico anjeriormente descrito. En la mezcla de incubación, los eritrocitos de caballo (R;BC) se utilizaron en lugar de los RBC de humano. Los resultados del ELISA aPL se muestran en el cuadro D. Como se muestra en el cuadro D, se obtuvo ¡una actividad aPL significativa, particularmente con respecto a aPL (IgG e Ig ) y aCL (IgA e IgM). El cuadro D es un cuadro que resume los resultados del ensayo de aPL para una muestra de suero a partir de un sujeto normal negativo a aPL, incubada de conformidad con el método descrito en la sección del principio de los ejemplos, con la característica de que los eritrocitos de caballo (RBC por sus siglas en inglés) fueron sustituidos por RBC de humano en el procedimiento.

CUADRO D RBC' de caballo, suero de humano, caldo Resultados del anticuerpo antifosfolipido (aPL) Proteína de unión PL Intervalos normales [Jependiente Independiente IgG 14 MoM +++ 1 MoM < 4 MoM aPS IgA 5 MoM 1 MoM < 3 MoM I M 19 MoM +*+ 1 MoM < 5 MoM IgG 2 MoM 1 MoM < 4 MoM aCL ? 13 oM ++? 1 MoM < 4 MoM ? 27 MoM +++ 1 MoM < 6 MoM En un segundo experimento, se incubó un suero de caballo, en lugar de suero de humano, con RBC de humano y se evaluó de conformidad con el procedimiento básico anteriormente descrito. Los resultados del ELISA aPL se muestran en el cuadro E. Como se muestra en el cuadro E, no se obtuvo actividad aPL. (El ensayo ELISA utilizado en este experimento utilizó sondas dé anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina específica para anticuerpo'de humano para detectar aPL, de manera que se desconoce si la muestra incubada contenía aPL de caballo).

El cuadro E es un cuadro que resume los resultados del ensayo de aPL para incubación de una muestra de suero que se llevó a cabo de conformidad con el método descrito en la sección del principio de los ejemplos, excepto que se sustituyó el suero de caballo por suero de humano.

CUADRO E RBC de caballo, suero de humano, caldo Resultados del anticuerpo antifosfohpido (aPL) Proreina de unión PL Intervalos normales De ndiente Independiente IgG 1 MoM 1 MoM < 4 MoM aPS Ig 1 MoM i MoM < 3 MoM IgM 1 MoM 1 MoM < 5 MoM IgG 1 MoM 1 MoM < 4 MoM aCL IgA 1 MoM 1 MoM = 4 MoM IgM 1 MoM 1 MoM < 6 MoM Ig6 1 MoM 1 MoM < 4 MoM aPE ¡gÁ 1 MoM 1 MoM = 3 MoM laM 1 MoM 1 MoM < 5 MoM IgG 1 MoM 1 MoM = 4 MoM aPC IgA 1 MoM 1 MoM < 3 oM iqM 1 MoM 1 MoM < 4 MoM Los resultados mostrados resumidos en los cuadros D y E demostraron de manera inequívoca que todos los aPL que se obtuvieron durante el procedimiento de seroconversión de la presente invención se originan a partir del suero de humano y no se liberaron a partir de RBC de humano, puesto que el primer experimento utiliza RBC de caballo, los cuales carecen d¡e anticuerpos de humano, en lugar de RBC de humano y aún así muestra resultados positivos, mientras que el segundo experimento utiliza suero de caballo en la presencia de RBC de humano y muestra resultados negativos, EJEMPLO 4 Se incubó una muestra de sangre a partir de un sujeto normal y se evaluó de conformidad con el procedimiento básico anteriormente descrito, excepto que la incubación se llevó a cabo a temperatura ambiente (22°C), en lugar de a¡ una temperatura elevada. El cuadro F muestra que la muestra no llevó a cabo seroconversión cuando se incubó a temperatura ambiente. Estos resultados1 sugieren que el procedimiento de seroconversión puede ser sensible aila temperatura. El cuadro F es un cuadro que resume los resultados del ensayo de aPL para una muestra de sangre a partir de un sujeto normal negativo a aPL, incubada de conformidad con el método descrito en la sección del principio de los ejemplos, excepto que la incubación se llevó a cabo a temperatura ambiente (22°C).

CUADRO F Sangre en un vial mecido a 2° C Resultados del anticuei-po aiitifosfolipido (aPL) Protema de unión PL Intervalos nonnales Dependiente Independiente IgG 6 MoM + 3 MoM < 4 MoM aPS !gA 1 MoM 1 MoM < 3 MoM IgM 1 MoM i MoM < 5 MoM IgG 2 MoM 2 MoM 4 MoM aCL IgA 1 MoM 1 MoM < 4 MoM IgM 1 MoM 1 MoM < 6 MoM ÍgG 4 MoM 1 MoM < 4 MoM aFE IgA 1 MoM 1 MoM < 3 MoM igM 1 MoM 1 MoM < 5 MoM IgG 2 MoM 2 MoM < 4 MoM aPC IQA 1 MoM 1 MoM 3 MoM IQM 1 MoM 6 MoM - < 4 MoM ? 1 MoM 1 MOM S q (ViOM EJEMPLO S Se incubó una muestra de sangre a partir de un sujeto normal y se evaluó de conformidad con el procedimiento básico anteriormente descrito, con la característica de que se utilizaron glóbulos Degalan de 0.7 mm (plástico) óomo la partícula sólida en la mezcla de incubación en lugar de carbón activado. Puesto que el carbón activado se utilizó en experimentos iniciales que mostraban seroconversión, este experimento se llevó a cabo para determinar si el carbón activado desempeña un papel específico en la seroconve¡rsión. El cuadro G muestra que la muestra exhibió seroconversión incluso cuando se utilizaron glóbulos plásticos en lugar de carbón activado. Estos resultados sugieren que el papel del carbón activado es mecánico, en lugar de cjuímico, en naturaleza, y que se puede utilizar cualquier partícula sólida, tal ¡como plástico, resina o glóbulos de vidrio. Sin limitarse a ninguna teoría part i icular, se puede teorizar que el componente de partícula actúa como un abrasivo sobre la membrana de los RBC, probablemente ocasionando la liberación del ion de NO a partir de los RBC, ya sea mediante la interacción con la proteína AE1 /Banda 3 de los RBC o con las moléculas de transición de SNO-hemoglobina o con ambas. La posibilidad de abrasión mecánica se apoya por la observación en el ejemplo 6, en donde los resultados¡ del ensayo negativo se muestran para una mezcla de incubación que no es sacudida o agitada. Las partículas sólidas también pueden servir a una función mecánica para ayudar a la liberación de autoanticuerpo. El cuadro G es un cuadro que resume los resultados del ensayo de aPL para una muestra de sangre a partir de un sujeto normal negativo a aPL, incubada de conformidad con el método descrito en la sección del principio de los ejemplos, con la característica de que los glóbulos Degalan de 0.7 mm (plástico) se utilizaron como la partícula sólida en la mezcla de incubación.

CUADRO G Reempkrzo de carbón activado: 0.7 nun Desalan Resultados del antic?eipo anrifosfolípido (aPL) Protema de unión PL Intervalos nonnales Dependiente Independiente ÍgG 31 MoM + 3 MoM < i MoM aPS IgA 3 MoM 1 MoM < 3 MoM IgM 2 MoM 1 MoM < 5 MoM i G 7 MoM * 2 MoM < 4 MoM aCL IfA 5 MoM * 2 MoM < 4 MoM IgM IO M0 ++* 1 MoM < 6 MoM 8 MoM + 1 MoM < 4 MoM aPE 1 A 2 MoM 1 MoM < 3 MoM IgM 1 MoM 1 MoM < 5 MoM EJEMPLO S Se incubó una muestra de sangre a partir de un sujeto normal y se evaluó de conformidad con el procedimiento básico anteriormente descrito excepto que la mezcla de incubación se mantuvo estacionaria, en lugar de ser agitada o ¡sacudida. El cuadro H muestra que la muestra no llevó a cabo seroconversión cuando se mantuvo estacionaria. Estos resultados sugieren que el movimiento puede facilitar la interacción entre las partículas sólidas y los RBC. Las condiciones de incubación estacionaria no facilitan la liberación de aPL, aunque una cantidad pequeña de movimiento tal como la producida por el transporte de las muestras a la incubadora puede producir pequeñas cantidades, de liberación de aPL. El cuadro H es un cuadro que resume los resultados del ensayo de aPL paira una muestra de sangre a partir de un sujeto normal negativo a aPL, incubada de conformidad con el método descrito en la sección del principio de los ejemplos, excepto que la mezcla de incubación se mantuvo estacionaria, en lugar de ser agitada o sacudida.

CUADRO H ali ere en un vial pstaripnarío a J ^ R esultado s d el anticuei"po antifosfolípido (aP L) _E E9 tjy nn_d e_.ini ón P . I ntervalo s n onnaJ es D e pendiente I ndependiente igG 1MoM 1 MoM = 4 MoM aPS Ig 1 MoM 1 oM < 3 MoM IgM 2 MoM 1 MoM < 5 MoM ÍgG 1 MoM 1 MoM < 4 MoM aCL IgA 1 MoM 1 MoM < 4 MoM IgM 7 MoM + 1 MoM < 6 MoM IgG i MoM 1 MoM 4 MoM aPE IgA ' MoM 1 MoM <3MoM IgM 4 MoM 3 MoM < 5 MoM EJEMPLO ? Se incubó una muestra de sangre a partir de un sujeto normal y se evaluó de conformidad con el procedimiento básico anteriormente descrito, con la característica añadida de que después de la incubación y de la remoción de RBC y del carbón activado mediante centrifugación, la mezcla de incubación, se calentó 56°C por 30 minutos. El cuadro I muestra que la cantidad de aPL detectada se incrementó significativamente mediante este procedimiejnto. El cuadro I es un cuadro que resume los resultados del ensayo de aPL para una muestra de sangre a partir de un sujeto normal negativo a i aPL, incubada de conformidad con el método descrito en la sección del principio dé los ejemplos, con la característica añadida de que la mezcla de incubación se calentó a 56°C por 30 minutos.

CUADRO 1 LGPGÍOS pi raJpntainipnto a 56°C Resullados del antirueipo antifosfobpido (aPL) Piotema de unjona PL Intervalos normales PipralpnfamiPiitn Calentada igG 47MoM++* 69Mo +++ < 4 MoM aPS !oA 12MoM+" I8 0M+++ < 3 MoM Ig 3 MoM 1 MoM < 5 MoM IqG 13 OM+H I6M0M+++ < 4 MoM aCL Iq? 16 MoM* 22 oM+*+ < 4 M0M1 IgM 12 MoM ++ 16MoM*++ < 6 MoM iaG 48 oM+++ 44Mo +*+ < 4 MoM aPE íq? 8 MoM + 8 MoM + < 3 MoM IgM 2 MoM 1 MoM < 5 MoM ÍgG 5 MoM + 6 MoM < 4 MoM aPC IgA 1 MoM 2 MoM < 3 MoM igM 1 MoM 3 MoM < 4 MoM EJEMPLO 8 Se incubó una muestra de sangre a partir de un sujeto normal y se evaluó de conformidad con el procedimiento básico anteriormente descrito, con la característica de que un medio para crecimiento de cultivo bacteriano a partir de un abastecedor diferente (Becton Dickinson, Sparks, MD) se utilizó en lugar del medio para crecimiento de cultivo bacteriano a partir de Biomepeux!. El cuadro J muestra que la muestra exhibió seroconversión en el medio Becton Dickinson, indicando que el método de la presente invención no es dependiente del medio para crecimiento de cultivo bacteriano para una fuente particular. El cuadro J es un cuadro que resume los resultados del ensayo de aPL para una muestra de sangre a partir de un sujeto normal negativo a aPL, incubada de conformidad con el método descrito en la sección del principio dé los ejemplos, con la característica de que se utilizó un medio de crecimiento para cultivo bacteriano a partir de un abastecedor diferente (Becton Diókinson, Sparks, Md) en lugar del medio de crecimiento para cultivo bacterianol a partir de Biomerieux. 1 CUADRO J Vial de ¡ cultivo Becton Dickinson* (' reemplazando Biomerieux) Resultados le) antdcueipo antifosfolipid 0 (aPL) Protema ' e unión PL Intervalos normales Dependipntp Independiente ÍgG 11 0 ++ + 3 oM < 4 MoM aPS IgA FAILURE FAILURE < 3 MoM : laM 4 MoM 1 MoM < 5 MoM ; igG 6 0M + 4 MoM = 4 MoM aGL IgA 5 oM * 5 oM + < 4 MoM : laM 9 MoM i 1 MoM < 6 MoM IgG 1 MoM 1 MoM < 4 MoM aPC IgA 1 MoM 1 MoM < 3 MoM • \? 1 MoM 1 MoM < MoM EJEMPLO 9 Se incubó una muestra de sangre a partir de un sujeto normal y se evaluó de conformidad con el procedimiento básico anteriormente descrito, con la característica de que la incubación se presentó bajo condiciones aeróbicas (bajo nitrógeno) en lugar de bajo condiciones aeróbicas (en la presencia de oxígeno y C02). El cuadro K muestra que la muestra exhibió seroconversión incluso bajo condiciones aeróbicas y que el método de la presente invención no es dependiente del ambiente aeróbico. El cuadro K es un cuadro que resume los resultados del ensayo de aPL para una muestra de sangre a partir de un sujeto normal negativo a aPL, incubada de conformidad con el método descrito en la sección del principio die los ejemplos, con la característica de que la incubación se llevó a cabo bajo condiciones anaeróbicas.

CUADRO K Vial para pilrivn annpi ohirn ron raido + sanci'P Resultados del anticuerpo antifosfobpido (aPL) Protema de unión PL Intervalo,!' nopnalps Dependiente Independiente IgG 16 MoM +" 10 M?M ++ + < 4 MoM aPS iqA 3 MoM 2 MoM < 3 MoM Ig 9 MoM * 5 MoM d MoM 1 i G 8 MoM + 3 MoM < 4 MoM aCL IqA 4 MoM 1 MoM < 4 MoM ; igM 17 MoM +++ 3 MoM < 6 MoM IgG 33 MoM ^ 10 MoM +++ < 4 MoM aPE IgA 4 MoM + 1 MoM < 3 MoM IgM 9 MoM + 3 MoM 5 MoM IgG 1 oM 2 MoM < 4 MoM aPC IgA 1 MoM 1 MoM < 3 MoM igM 3 MoM 5 MoM + < 4 MoM EJEMPLO 10 Se incubó una muestra de sangre a partir de un sujeto normal y se evaluó de conformidad con el procedimiento básico anteriormente descrito, con la característica de que las células K562 (una línea celular de tumor hematopoijético de humano) se utilizaron en lugar de eritrocitos. Además, solamente1 11.3 millones de células K562 estaban presentes en el medio de cultivo, en comparación con 3-4 ml de RBC empaquetados típicamente utilizados én el método de la invención. El cuadro L muestra que la muestra exhibió seroconversión. El cuadro L es un cuadro que resume los resultados del ensayo de aPL paYa una muestra de sangre a partir de un sujeto normal negativo a aPL, incubada de conformidad con el método descrito en la sección del principio de los ejemplos, con la característica de que se utilizaron las células K562 (una|línea celular de tumor de humano) en lugar de RBC.

CUADRO L Reemplazo de RBC por K562 * ¡ Resultados del anticuerpo anrifosfolípido (aPL) Prot pina de unión P Intervalos nopnalr s Dependiente Independiente IgG 1 MoM 2 MoM < 4 MoM aPC IqA 1 MoM 3 MoM < 3 MoM ÍgM 1 MoM 3 MoM < 4 MoM ' rostro r ehilar total 1 1 .3 \ 10ñ) 4 Otros experimentos han mostrado que las muestras que se incuban con otros tipos de células aisladas, linfocitos, monocitos y neutrófilos típicamente no exhiben una seroconversión aPL. En particular, los leucocitos de la serie1 linfoide y mieloide no apoya la liberación de aPL, ni lo hace la línea celular de !linfocitos B de porcino designada como L14 (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la hemoglobina puede ser un componente clave en la mezcla de incubación, puesto que las células K562 y RBC contienen hemoglobina, y los linfocitos, monocitos y neutrófilos no la contienen.

EJEMPLO 11 Se incubó una muestra de sangre a partir de un sujeto normal y se evaluó de conformidad con el procedimiento básico anteriormente descrito. excepto que el medio para crecimiento de cultivo bacteriano se reemplazó con un medio de cultivo celular utilizado para el crecimiento de las células de humano: RPMI. El cuadro M muestra que la seroconversión no se presentó. Este expenmento muestra la importancia de ciertos ingredientes en el medio para cultivo bacteriano para el propósito de esta invención. Aunque el RPMI es un medio de cultivo diseñado para células de humano, no apoya la liberación de aPL cuando se sustituye por un vial de caldo. Los listados y las comparaciones de los ingredientes en los dos diferentes viales de caldos para microbiología con RPMI muestra que RPMI carece de hemina y menadiona (una provijtamina K elaborada por el hombre) denominada vitamina K3. Se sabe que ja hemina es una porfirina quelante del hierro (Fe+++) derivada de RBC, y la jmenadiona es una vitamina soluble en grasa. Esto indica que las reacciones redox pueden desempeñar un papel en la liberación del autoanticujerpo. El cuadro M es un cuadro que resume los resultados del ensayo de aPL para una muestra de sangre a partir de un sujeto normal negativo a aPL, excepto que el medio de crecimiento para cultivo bacteriano se reemplazój con un medio de cultivo celular utilizado para crecimiento de células de jhumano.

CUADRO M Reemplazo del caldo ron RPM I y glóbulos Resultados del anticuerpo antifosfolipido (aPL) Proteína de unión PL Intervalos normales ' Dependiente Independiente : IgG MoM i MoM < 4 MoM aPS igA 1 MoM 1 MoM < 3 MoM ' í 2 MoM 2 MoM < 5 MoM : IgG 1 MoM 2 MoM < 4 MoM aGL IqA 1 MoM 1 MoM • < 4 MoM : loM 2 MoM 2 MoM < 6 MoM IgG 1 MoM 1 MoM < 4 MoM aFjE IgA 1 MoM 1 MoM < 3 MoM ! laM 2 MoM 4 MoM < 5 MoM : !gG 1 MoM 1 MoM < 4 MoM aHC IgA 1 MoM 1 MoM < 3 MoM ' laM 3 MoM 5 MoM+ < 4 MoM EJEMPLO 12 Se incubó una muestra de sangre de cordón placental y se evaluó de conformidad con el procedimiento básico anteriormente descrito. La sangre de cordón placental se retiró después del nacimiento del bebé, pero antes de que la placenta se separara de la pared uterina. Ni la sangre de la madre ni la sangre del cordón del bebé mostró la presencia de aPL en los ensayos convencionales de laboratorio. Cuando se procesó de conformidad con la invención descrita en la presente invención, se demostró una fuerte señal de anticuerpo aPL presente en las muestras de sangre del cordón, como se r?uestra en el cuadro N. Los anticuerpos fueron IgG solamente, una observación que es compatible con los anticuerpos de origen materno. Puesto que la madre transporta IgG al feto antes del nacimiento, este experimento parece indicar que los autoanticuerpos maternos enmascarados transportados al feto por medio de receptores especializados Fc? en el trofoblasto (Fc?Rn) permanecen enmascarados por el feto en la sangre fetal. Puesto que la sangre de la madre y la sangre del cordón mostrado ser negativos a aPL antes de la seroconversión mediante el método de la invención, y puesto que no se detectaron inmunoglobulinas IgM o IgA, estos hallazgos apoyan el argumento; de que los aPL IgG observados en la sangre del cordón subsecuente a la seroconversión son de origen materno. También es de interés que el trofoblasto que expresa el Fc?Rn no expresa antígenos HLA.

El cuadro N es un cuadro que resume los resultados del ensayo de aPL para una muestra de sangre de cordón umbilical a partir de una madre y un bebe normales negativos a aPL.

CUADRO N Sangre de cordón placental + caldo Resultados del anriruei o ajitifosfolípido (aPL) Proteína de 1 unión PL Intervalos normales Dependiente Independiente igG 42MoM+++ 27MoM+++ < 4 MoM aPS IgA 1Mo I oM < 3 MoM IgM 1 oM I oM 5Mo igG 14 o +++ 6M0M+ < 4 MoM aCL IgA 1 MoM 1 MoM <4MoM IgM 2 MoM 1 MoM < 6 MoM IgG 38 oM+++ 23 oM*++ < 4 MoM aPE loA I oM 1 MoM < 3 MoM IgM IMo 1MoM <5MoM EJEMPLO 13 Se incubó una muestra de sangre a partir de un sujeto normal y se evaluó de conformidad con el procedimiento básico anteriormente descrito; con la característica de que se utilizó nitroprusido de sodio (SNP, 200 micromolar) en lugar de RBC en la mezcla de incubación. El cuadro O muestra que la muestra exhibió seroconversión. El cuadro O es un cuadro que resume los resultados del ensayo de aPL paVa una muestra de sangre a partir de un sujeto normal negativo a aPL, incubada de conformidad con el método descrito en la sección del principio de los ejemplos, con la característica de que se utilizó nitroprusido de sodio en I gar de RBC en la mezcla de incubación.

CUADRO O Reemplazo de RBC con nitroprusido de sodio Resultados del anticuerpo antübsfolipido (aPL) Pvnto.M. ftO ,„>;nr. D I Intervalos normales Dependiente Independiente IgG 18 M?M*+* 5 MoM* 4 MoM aPS IgA 8 MoM 4 MoM4 = 3 MoM ¡ IgM ¡ MoM 1 MoM 5 MoM . IgG 23 MoM+" 9 oM ' < 4 MoM aPc" IgA 3 MoM HfoM< < 3 MoM IgM 1 MoM 1 McM < 5 MoM • IgG 1 MoM 2 MoM < 4 MoM aPC IgA 2 Mo!v1 i MoM < 3 MoM ig 1 MoM 1 MoM < 4 MoM ' 200 u-fví Puesto que el SNP es un donante de óxido nítrico (NO) potente, estos resultados proveen evidencia sustentadora de que el radical NO participa en la liberación de autoanticuerpo y apoya adicionalmente una teoría de que los RBC y las partículas sólidas cumplen el papel de proveer de donación ¡de NO- a partir de los RBC. Otras reacciones mediadas por radicales libres además del nitroprusido de sodio también pueden ocasionar la liberación del autoanticuerpo.

EJEMPLO 14 Se incubó una muestra de sangre a partir de un sujeto normal de conformidad con el procedimiento básico anteriormente descrito y se evaluó para actividad anticoagulante de lupus. El anticoagulante de lupus o inhibidor es otro tipo de aPL y típicamente es detectable solamente por ensayos funcionales de laboratorio. Los resultados en el cuadro P muestran una fuerte anticoagulante de lupus (LA) en la sangre seroconvertida tomada a partir de un individuo negativo el inhibidor de lupus y procesada mediante el método de esta invención. Aunque inicialmente se corrigió mediante la adición de plasma normal al caldo seroconvertido en el ensayo dRVVT, la incubación por 1-2 horas resultó en la reaparición del inhibidor. Esta ventana de tiempo se propone como el tiempo que se toma para que LA o los anticuerpos enmascarados se unan a las proteínas plasmáticas relevantes para unión al fosfolípido ! introducidas por el estudio de mezclado. También descarta la posibilidad1 de deficiencias del factor de coagulación puesto que una mezcla 1 :1 provee niveles adecuados de factores de coagulación para corregir los tiempos de coagulación en una muestra deficiente del factor. El tiempo de la protrombin'a diluida (dPT) no se corrige en la presencia de plasma normal y se observó un incremento en la prolongación de los tiempos de coagulación después de la incubación con plasma normal, lo cual es indicativo de un inhibidor fuerte de lupus.

El cuadro P es un cuadro que resume los resultados de un ensayo actividad anticoagulante de lupus para una muestra de sangre incubada de conformidad con el método descrito en la sección del principio de los ejemplos. La muestra de sangre se obtuvo a partir de un sujeto cuya sangre es negativa a anticoagulante de lupus antes de la seroconversión por el procedimiento de la presente invención.

CUADRO P Actividad anticoagulante del lupus Mezcla inmediata Mezcla incubada 1 :1 1 :1 1 -2 horas dRVVT 46.7 segundos* 104.4 segundos ¡dPT 42.5 segundos1 48.7 segundos * Normali = 28 - 49 segundos tNormal = 29 -41.8 EJEMPLO 15 Las muestras de sangre de cinco sujetos normales se incubaron de conformidad con el procedimiento básico anteriormente descrito y se evaluaron ¡mediante microscopía con fluorescencia para la presencia de otros tipos de autoanticuerpos. Las muestras de suero y de plasma partir de estos cinco individuos fueron negativas antes del procesamiento de conformidad con las enseñanzas de la invención. El cuadro Q lista especificidades adicionales del autoanticuerpo identificadas mediante el uso de la línea celular Hep-2. Sé identificaron anti-nucleolar (asociado con escleroderma) antiláminas (muy brillante en los poros nucleares), anti-mitocondrial, (citoplásmico) y anti-centholo. Los resultados muestran que los autoanticuerpos liberados por el método de la presente ¡nvención también se pueden detectar por un método diferente de detección, microscopía de fluorescencia, en oposición a la evaluación basada en ELISA. Los resultados confirman que muchos tipos de autoanticuerpos además de aPL están enmascarados de la sangre de individuos cuyos suero y plasma fueron evaluados como negativos para estos anticuerpos en los análisis rutinarios de laboratorio. El cuadro Q es un cuadro que lista otros tipos de autoanticuérpos que han sido identificados en las muestras de sangre que se incubaron de conformidad con el método descrito en la sección del principio de los ejemplos. Los anticuerpos listados se identificaron mediante microscopía por inmunofluorescencia.

CUADRO Q Autoanticuerpos identificados mediante inmunofluorescencia Patrones de fluorescencia observados en la línea celular Hep-2 o anti-nucleolar (asociado a escleroderma) <• anti-láminas (muy brillante en los poros nucleares) « anti-mítocondrial (citoplásmico) © anti-centriolo (importancia desconocida A partir de estos resultados, se puede esperar encontrar muchas más especificidades de autoanticuerpos por las sangres evaluadas procesadas mediante esta invención.

EJEMPLO 16 Una muestra de sangre a partir un sujeto normal se incubó de conformidad con el procedimiento básico anteriormente descrito y se evaluó para reactividad con monocitos utilizando citometría de flujo y anticuerpos IgG antihumano conjugados con fluorescencia. Se realizó la evaluación comparativa con los sueros de humano normal no tratados-agrupados (NHS), con suero a partir del mismo sujeto normal utilizado con la invención y con sueros dé humano control positivo. (La sangre tratada no mostró autoreactividad con linfocitos y neutrófilos; estos datos no se muestran). La figura 1 ilustra el perfil desviación por difracción hacia delante (tamaño) y desviación :por difracción lateral (granularidad) de la población de células de monocitos del sujeto como se define por citometría de flujo. Esta población de células de monocitos se confirmó al mostrar reactividad con los anticuerpos monoclonales CD 14. La figura 2A muestra reactividad anti-monocito con NHS. La reactividad media mostrada es de 743.50 en una escala lineal. La figura 2B njiuestra la actividad auto-anti-monocito del suero del sujeto normal; este sujeto no tiene actividad del anticuerpo a los monocitos autólogos. La reactividad; media mostrada es de 737.00. La figura 2C muestra la actividad de auto-anti-monocito de una muestra de sangre a partir del sujeto que se muestra en la figura 2B después de ser tratada de conformidad con el método de la invención. El valor medio mostrado es de 864.00, indicando una fuerte actividad de auto-anti-monocito. A pesar del hecho de que los plasmas procesado? de conformidad con las enseñanzas de la invención fueron utilizados á una dilución de 1/8, estos no mostraron una mayor reactividad con los monocitos en comparación con los sueros controles positivos no diluidos. Por lo tant|o, este ejemplo muestra que las muestras de sangre o de suero procesadas de conformidad con el método de esta ¡nvención liberan autoanticuerpos que específicamente se dirigen a los monocitos. Los mismos resultados fueron documentados para cuatro muestras adicionales a partir de otros individuos cuando se procesaron de conformidad con las enseñanzas de la invención EJEMPLO 17 Las pruebas comparativas para la presencia de anticuerpos antinucleares ¡(ANA) utilizando un ensayo de exploración RELISA® se llevaron a cabo sobre suero de sangre de cordón no tratada; sangre de cordón incubada de conformidad con el método de la invención, sin mecido; sangre de cordón tratada de conformidad con el método de la presente invención, con mecido; suero no tratado a partir de un donante sano negativo a ANA (identificado como ACS) y suero a partir del mismo donante sano negativo a ANA que se incubó de¡ conformidad con el método de la presente invención. Como se muestra en el cuadro R, se identificó una cantidad significativa de ANA en las muestras de sangre de cordón y de suero que se trataron mediante el método de la presente invención. A partir de los resultados en los cuadro P y Q, se espera encontrar muchas más especificidades de autoanticuerpos por las sangres evaluadas procesada mediante esta invención. El cuadro R es un cuadro que resume los resultados de la prueba de anticuerpo anti-nuclear (ANA) de diversas muestras utilizando un ensayo de exploración RELISA®.

CUADRO R Anticuerpos ANA identificados por Bmmunoconcepts Laboratories* usando el ensayo de exploración RELISA® Muestra Unidades Suero cordal 0 Suerojestacionario 27 Agitación cordal 75 Suero?CS 0 Agitación ACS + calor 90 *Sacrámento, California 1 < 10¡unidades = NEG 10-15 unidades = límite EJEMPLO 18 Para entender el papel de los eritrocitos en el fenómeno de la liberación de autoanticuerpo, se diseñaron experimentos para reemplazar los eritrocitos con ingredientes más simples que podrían imitar la acción de los eritrocitos. En el presente experimento, los eritrocitos y el carbón activado se reemplazaron con nitroprusido de sodio (SNP) y cloruro férrico. Esta sustitución ,se realizó debido a que el nitroprusido de sodio es un productor poderoso de óxido nítrico, y se sabe que los RBC son portadores de NO-. El cloruro férrico (solución de almacenamiento de FeCI3, 25 uM), se añadió como un sustituto para el hierro en la hemoglobina.

Las botellas de cultivo que contenían el medio para crecimiento de cultivo bacteriano y 5 ml de plasma de humano o suero y concentraciones variables de nitroprusido de sodio (SNP, 200 µm) y cloruro férrico exógeno (concentración final 4.1 µm) se utilizaron en lugar de eritrocitos y carbón activado, se incubaron a 37°C y luego se calentaron a 56°C por 30 minutos.

Las muestras mostraron seroconversión de aPL, pero solamente IgG (datos no mostrados). Los resultados sugieren que NO- puede participar en el desenmascaramiento del anticuerpo, y sugieren que la acción mecánica de un material ep fase sólida en la botella para cultivo fragmenta a los eritrocitos y libera el NO-. Alternativamente, la liberación o modificación de NO puede permitir que la molécula de hemoglobina participe en las reacciones redox.

EJEMPLO 19 En un esfuerzo por determinar si el efecto del desenmas?aramiento de los autoanticuerpos se debía al procesamiento de las estructuras' macromoleculares que contenían autoanticuerpo dentro del suero o de la sangre o si se debía a cambios directos en la especificidad de unión de los anticuerpos mismos, se llevaron a cabo una serie de experimentos en los cuales la ¡rjmunoglobulina intravenosa comercial (Ivlg) se sustituyó por plasma o suero dé humano. La Ivlg comercial es una fracción que se precipita en alcohol del plasma agrupado a partir de múltiples donantes, típicamente de 1 ,000 a 10,000 donantes. Típicamente, la Ivlg contiene principalmente IgG, y principalmente carece de IgA, IgM y otras proteínas plasmáticas. Cuando la Ivlg no tratada se ensaya para la presencia de autoanticuerpos mediante evaluación de ELISA, los resultados de la prueba son negativos. Debido a su manera dé preparación, la Ivlg también está libre de micelas de lipoproteína, vesículas !u otras estructuras macromoleculares. Por lo tanto, si Ivlg se evaluara cómo positiva para la presencia de autoanticuerpos después de un tratamiento de incubación, los autoanticuerpos se deberían obtener mediante una alteración de los anticuerpos IgG ya presentes en la preparación de Ivlg y no mediante un procesamiento de las estructuras o vesículas que ocultan los I autoanticuerpos. ¡ En los ejemplos a continuación, la preparación comercial de Ivlg utilizada fue Ivlg liofilizada (inmunoglobulina intravenosa (de humano) Gammar - ¡PI.V., Aventis behríng, Kankakee, Illinois). ; 5 gramos de una preparación comercial de Ivlg liofilizada se reconstituyó en solución salina estéril con pH regulado con fosfato (PBS, 100 mg/ml). 1.7 ml de la solución reconstituida de Ivlg se añadió a una botella para cultivo qué contenían el medio para crecimiento de cultivo bacteriano (sin eritrocitos ¡o carbón activado) y se incubó a 37°C por 20 horas. La mezcla incubada ¡mostró seroconversión y la presencia de aPL IgG (datos no mostrados). (Como se esperaba, solamente se detectó IgG, no IgA o IgM). En experimentos similares, los autoanticuerpos se detectaron en una mezcla que se incubó a temperatura ambiente en un vial con agitación, pero los resultados no fueron tan buenos como a 37 grados (resultados no mostrados). El calentamiento de la mezcla de Ivlg-medio para cultivo bacteriano por arriba de 37°C no resultó en incrementos adicionales en los autoanticuérpos. Como un control, se evaluó la Ivlg directamente de la botella para aPL y otros autoanticuerpos, y los resultados fueron negativos.

EJEMPLO 20 En el ejemplo 19, se muestra que los autoanticuerpos se pueden obtener mediante la incubación de una preparación comercial de Ivlg el medio para crecimiento bacteriano. El siguiente paso fue tratar de determinar cuáles ingredientes en el medio para crecimiento de cultivo bacteriano desempeñan un papel e;n la producción de autoanticuerpos detectables. Primero, la Ivlg en un caldo de soya tríptico al 2% (TSB), (que contiene peptonas en una relación de 17 a 3 del digerido pancreático de caseína con respecto al digerido de papaya - soya, respectivamente) (el remanente siendo agua) se incubó a 37°C por 20 horas con agitación. La mezcla incubada se evaluó para la presencia de aPL, y el resultado fue negativo. : A continuación, la Ivlg se incubó en un tubo de ensayo en caldo de soya, ¡nitroprusido de sodio (SNP) y hemina (una p roto porfirina que contiene hierro (férrico)) a 37°C por 20 horas con agitación. Las cantidades utilizadas fueron 60 microlitros de Ivlg, 5 microlitros de SNP y 5 mícrolitros de hemina en¡ un total de 1 ml de caldo de soya. La mezcla incubada se evaluó como positiva para la presencia de aPL, particularmente aPS (15 MoM) y aPE (41 MoM). ¡(Datos no mostrados).

EJEMPLO 21 Se llevó a cabo una serie de experimentos para determinar si la incubación' con hemina sola podría ser suficiente para ocasionar la aparición de autoanticuerpos en Ivlg o en plasma o suero. La Ivlg liofilízada reconstituida (a una concentración de 100 mg/ml) se ¡añadió a y se incubó en una solución salina con pH regulado con fosfato (PBS) con hemina por 20 horas a 37°C. Las cantidades utilizadas fueron 300¡ µl de solución de Ivlg y 5 µl de una solución de hemina (75 µg) en un volumen total de 1 ml. Como se muestra en el cuadro S, la mezcla incubada mostró cantidades; significativas de aPS y aPE IgG, y, en un menor grado, aCL IgG. ¡ El cuadro S es un cuadro que resume los resultados del ensayo aPL para una muestra de Ivlg que se incubó con hemina en un regulador de tris.

CUADRO S Resultados del anticuerpo antifosfolipido (aPL) Proteina de UJÜO? P L Intervalos nonnales Dependiente Independiente í igG 31 M?M+++ 4 MoM < 4 MoM aPS IgA 1 MoM 1 MoM < 3 MoM 1 !g 1 MoM 1 MoM < 5 o i igG 7 Mo + 1 MoM < 4 MoM aCli IgA 1 MoM 1 MoM < 4 MoM ! igM 1 MoM 1 MoM < 6 oM , lgG 32 MoM+++ 3 MoM < 4 MoM aPß IgA 1 MoM 1 MoM < 3 MoM ! iqM 1 MoM 1 MoM < 5 MoM i ÍgG 5 oM + 1 MoM <4 MoM aP(f íoA 1 MoM 1 MoM < 3 MoM ¡ Ig 1 MoM 1 MoM < MoM \ Cuando el suero o el plasma se incubaron con hemina bajo condicionen similares, no se detectaron autoanticuerpos.

EJEMPLO 22 El hecho de que se obtuvieron resultados positivos para la presencia r)e autoanticuerpos cuando la Ivlg se incubó con hemina, mientras que se obtuvieron resultados negativos cuando el suero o el plasma se incubaron con hemina sugiere que el suero o el plasma podrían contener sustancias que inhiben o interfieren con el procedimiento de la obtención de autoanticuerpos. En una serie de experimentos, la Ivlg se incubó en un regulador de pH Tris con hemina, por 20 horas a 37°C, similar al procedimiento del ejemplo 21 , con la característica añadida de que se añadió una cantidad en incremento de suero de humano (del inventor) a los lotes antes de la incubación'. Cada lote separado se evaluó para la presencia de autoanticuerpos aPS, aCL, aPE y aPC, y los resultados se muestran en la figura 3. Los resultados mostrados en la figura 3 demuestran que estas cantidades en incremento de suero tuvieron un efecto inhibidor sobre la liberación de los anticuerpos antifosfolípidos. Se mostraron resultados similares con la sustitución del plasma por suero (datos no mostrados). Una explicación posible para estos resultados es que la hemína, que contiene una molécula de hierro en el estado férrico y que se conoce como un agente oxidante gctivo, puede actuar para oxidar un sitio de unión de ciertas moléculas de inmunoglobulina de manera que el sitio de unión alterado es capaz de unir auto antígenos. Este procedimiento se puede inhibir por sustancias, tal vez antioxidantes, en la sangre.

EJEMPLO 23 El suero de humano (del inventor) se diluyó 1/10 en regulador de pH Tris. En una serie de experimentos, este suero diluido, en lotes de 1 ml, se incubó con cantidades en incremento de hemina, específicamente 0 µl, 10 µl, 25 µl y 50 Iµl. (Previamente, se había encontrado que la hemina por sí misma no era sufibiente para ocasionar la liberación de autoanticuerpos a partir de la sangre o del suero, aunque fue suficiente para ocasionar dicha liberación a partir de Ivlg. Por lo tanto, el propósito de la dilución del suero fue diluir el efecto de ¡cualesquiera sustancias que puedan interferir encontradas en la sangre, talles como antioxidantes). Los lotes fueron evaluados para la presencia jde autoanticuerpos aPL, aCL, aPE y aPC, y los resultados se muestran en la figura 4. Los resultados mostrados en la figura 4 muestran que aunque no¡ se detectaron cantidades significativas de autoanticuerpos de su diluido cuajndo se añadieron 0 ó 10 µl de hemina, se detectaron cantidades significativas con 25 µl de hemina. Por una razón desconocida, las cantidades í de autoanticuerpos detectados fueron menores con 50 µl de hemina.

EJEMPLO 24 Las siguientes series de experimentos se diseñaron para determinar! si un antioxidante tal como la vitamina C, que está presente en la sangre, podría inhibir la liberación de los autoanticuerpos. En una serie de experimentos, la Ivlg se incubó en un regulador de pH Tris con hemina, con la característica añadida de que una cantidad en incremento de ácido ascórbico (Vitamina (p) se añadió al regulador de pH que contenía hemina y se dejó mezcla por| 30 minutos antes de añadir la Ivlg y antes de la incubación. Como se muestra en la figura 5, se presentó una inhibición de aproximadamente 78% de l liberación de aPE inducida por hemina con 1 mg de Vitamina C, una cantidad representa una concentración fisiológica de Vitamina C. Existe i una curva ¡bifásica con una liberación de aPS, lo cual genera la posibilidad de que la Vitamina C a concentraciones bajas pueda actuar como un agente oxidante, pero se vuelve un agente antioxidante (reductor) a concentraciones elevadas.

EJEMPLO 25 Las siguientes series de experimentos se diseñaron para determinar! si el vehículo en que se disuelve la hemina tenía un impacto sobre los resultados obtenidos y si el átomo de hierro en la hemina es necesario. En una serie de experimentos, la Ivlg se incubó en un regulador de pH Tris con hemina, o pon otros aditivos. En particular, en un caso, la hemina se solubilizó con NaOH. En otro caso, se solubilizó con DMSO. En otros casos, la hematoporfirina IX (hplX), que es la misma molécula que la hemina, pero sin el hierro (Fte+++), se utilizó en lugar de la hemina y se solubílizó con NaOH o DMSO. En otros casos, el NaOH y DMSO se evaluaron como controles (sin hemina o hplX). Como se muestra en la figura 6, el uso de hemina solubilizada en NaOH produjo resultados positivos para la presencia de autoanticuérpos, mientras que la hemina + DMSO, hplX + NaOH, hplX + DMSO, Na H solo, y DMSO solo no produjeron resultados positivos.

EJEMPLO 26 Para establecer adicionalmente que la hemina ocasionaba la oxidación de los anticuerpos, se añadieron cantidades equimolares de hemopexiria (Hpx) a la mezcla de Ivlg PBS hemina. Hpx es una molécula antioxidante con una afinidad de unión extraordinariamente elevada para el hierro heme. Hpx liofilizada que se obtuvo a partir de SciPac (Kent, Inglaterra) se reconstituyó en PBS a 10 mg/ml. En la figura 7 se muestran los datos redox de aPS que resultan a partir de las concentraciones en incremento añadidas de la hemilna opuesta a la Ivlg con la adición de concentraciones equimolares de Hpx. D bido a que existe una interacción de unión 1 :1 entre la hemina y la Hpx, la Hp!x fue capaz de anular la capacidad redox del hierro férrico presente en la hemipa.

EJEMPLO 27 Para ilustrar el amplio intervalo y actividad de los autoanticuerpos que se pueden obtener mediante un tratamiento de oxidación de la Ivlg; se realizaron una serie de Western blots utilizando los lisados celulares a partir de 3 diferentes líneas celulares utilizando Ivlg tratada con hemina o Ivlg no tratada como anticuerpos primarios y utilizando conjugado anti-humano marcado con HRP como un control (HRP = peroxidasa de rábano). Los blots se muestran en las figuras 8A-8C. El lisado "B" es una línea celular de linfocito B denominada Raja a partir de un paciente con un linfoma. El lisado "T" es una línea celular derivada de linfocito T denominada Jurkat de nuevo a partir de un paciente leucémico. El lisado U87MG es una línea celular de blastos de glioblastoma (cáncer cerebral). Los lisados reducidos se procesaron en un gel a una concentración de 50 mg/ml. Para obtener la preparación de Ivlg tratada con hemina, se combinaron 75 µg de hemina con 1 ml de PBS que contenía 6 mg de IvIgG. La incubación fue por 20 horas a 37 grados. En las figuras 8A-8C, el blot en donde la Ivlg tratada con hemina se utilizó como el anticuerpo primario se marcó como "IgG prueba"; el blot en donde la lg no tratada se utilizó como el anticuerpo primario se marcó como "control", y el blot al cual se aplicó un conjugado anti-humano marcado con HRP sin anticuerpos primarios se marcó como "secundario". Las preparaciones de IgG tratada con hemina y no tratada se diluyeron 1 /1000 respectivamente. El conjugado anti-humano marcado con HRP se utilizó a una dilución del 1/5000. Estos datos claramente muestran que la Ivlg tratada con hemina tiene una ¡actividad abundante con respecto los componentes celulares de humano en comparación con la IvIgG no tratada y el control conjugado, que no poseemdicha actividad.

EJEMPLO 28 El siguiente experimento se llevó a cabo para determinar si los agentes oxidantes diferentes a la hemina, y en particular, los agentes oxidantes que no contienen hierro, podrían ser efectivos para desenmascarar los autoanticuerpos. Una mezcla de 25 µg de permanganato de potasio (KMn04) a una concentración de 100 µM, y 2 mg de Ivlg en un volumen total de 1 ml de solución salina con pH regulado con fosfato se incubó durante toda la noche a 37°C. En la mezcla incubada, se pudo detectar aPC y aPS. Usualmente se detectó aCL, pero no aPE (datos no mostrados). Posteriormente se determinó que una razón por la cual no se detectó aPE el debido a que KMn04 altera el antígeno del fosfolípido PE utilizado en la prueba de ELISA.

EJEMPLO 29 Después de que se mostró que los autoanticuerpos podrían ser desenmascarados medíante reacciones de oxidación, la siguiente cuestión fue si los métodos electroquímicos, tales como una fuerza electromotriz a partir de una batería, podría lograr el mismo efecto. La Ivlg se disolvió en una solución salina con pH regulado con fosfato, y, experimentos separados, se conectaron electrodos de acero galvanizado, electrodos de cobre, o electrodos de acero inoxidable a las terminales positivas y negativas de una batería de 9 voltios y se sumergieron dentro de! la solución por 1 - 2 minutos. Durante este periodo, se observó burbujeo en la solución y la solución de PBS cambió de color (azul cuando se utilizaron alambres de cobre, café cuando se utilizaron alambres de acero inoxidable! y verde cuando se utilizaron alambres de acero galvanizado). Como se ("nuestra en las figuras 9A y 9B, la solución tratada se evaluó como positiva p$ra la presencia de autoanticuerpos aPS, aCL, aPE y aPC, en una evaluación dependiente de aPL, y positiva para la presencia de autoanticüerpos aPS, aPE y aPC en una evaluación dependiente de aPL.

EJEMPLO 30 Para evitar la interacción de los metales con la solución y determinar así el efecto solamente de una corriente eléctrica, se utilizaron electrodos de grafito en lugar de los electrodos de metal. El grafito es inerte, pero es capaz de pasar electrones en soluciones conductoras sin participar en las reacciones. La Ivlg se disolvió en una solución salina con pH regulado con fosfato, y los electrodos de grafito conectados a las terminales positivas y negativas ¡de una batería de 6 voltios se sumergieron en la solución por 60 segundos. Como se muestra en la figura 10, la solución tratada se evaluó como positiva para la presencia de autoanticuerpos aPS, aPE y aPC.

EJEMPLO 31 En los experimentos que incluyen la aplicación de una corriente eléctrica a las soluciones de Ivlg en solución salina con pH regulado con fosfato, s observó un incremento significativo en el pH, posiblemente debido a la formajción de NaOH. Con el objeto de mantener las reacciones a niveles de pH fisiológico, se sustituyó un medio de cultivo celular, RMPI, por la solución salina con pH regulado con fosfato. La siguiente serie de experimento se llevó a cabo para determinar los efectos del tiempo de exposición a la corriente eléctrica sobre el desenmascaramiento de los autoanticuerpos. La Ivlg se disolvió en RMPI, un medio i de cultivo celular y los electrodos de grafito conectados a las terminales! positivas y negativas de una batería de 6 voltios se sumergieron en la solución por una cantidad variable de tiempo. Como se muestra en la figura 1 1 , la libfración máxima dependiente de aPL se obtuvo después de 60 segundos ¡de exposición a la corriente. Curiosamente, entre 2 y 4 minutos, la cantidad d¡e aPL, declinó o desapareció.

EJEMPLO 32 Puesto que el experimento previo ha mostrado que los anticuerpos aPL se podrían obtener a partir de Ivlg después de la exposición a una corriente eléctrica, pero que los anticuerpos aPL desaparen después de la exposición adicional a la corriente, la siguiente pregunta fue si el desenmascaramiento de los autoanticuerpos podría ser revertido por una corriente eléctrica. Es decir, ¿se podría tratar un suero control positivo de manera que los autoanticuerpos ya no fueran detectables? En experimentos separados, se expusieron un suero control positivo a ¡aCL, a una dilución de 1 :400, un suero control positivo a aPE a una dilución de 1 :75, y un aPS a una dilución de 1 :400 a una corriente eléctrica al sumergir los electrodos de grafito conectados a las terminales positivas y negativas ' de una batería de 6 voltios por hasta 240 segundos. Como se muestra en las figuras 12A - 12C, cada suero control se volvió negativo para su especificidad respectiva.

EJEMPLO 33 Basándose en los resultados en el ejemplo 32, la segunda pregunta que fue preguntada fue si los autoanticuerpos de un paciente que tiene una enfermedad autoinmune podrían ser re-enmascarados si el suero del paciente se expone a una corriente eléctrica. El suero a partir de un paciente gue tiene niveles elevados de aPS y aCL se diluyó 1/400 con solución s lina con pH regulado con fosfato (la dilución en PBS se realizó con una cantidad que podría lograr un valor de DO de 1.000 en 10-15 minutos) y los electrodos de grafito conectados a las terminales positivas y negativas de una batería de 6 voltios se sumergieron en la solución por una cantidad variable de tiempo. Como se muestra en la figura 13, la cantidad de aCL y aPS detec'table en las muestras del suero autoinmune del paciente declinaron significativamente después de 30 segundos y ya no fueron detectables i después 'de 2 minutos. Estos experimentos se repitieron para otros anticuerpo!s del paciente y se obtuvo el mismo resultado (datos no mostrados).

EJEMPLO 34 En un experimento temprano, una muestra de sangre a partir de un paciente que tuvo un título muy específico y elevado de IgA aPE se expuso a hemina en una botella de cultivo para estudio microbiológico de rutina. Se I observó que después de la exposición a hemina la IgA aPE desapareció, y se detectó el ¡surgimiento de IgG aPS, aCL y más espectacularmente, se detectó IgG aPE en el ELISA de aPL. En ese momento, o no era evidente de manera fácil una explicación para este fenómeno.

Con el descubrimiento de un procedimiento de desenmascaramiento más rápido utilizando corriente eléctrica, fue posible confirmar l¡os resultados tempranos con otro paciente que tenía un alto nivel de aPE. En este experimento, el suero a partir de un paciente que tiene un alto nivel de aPE se diluyó en PBS por 1/75 y los electrodos de grafito conectados a las terminales positivas y negativas de una batería de 6 voltios se sumergieron en la solución por una cantidad variable de tiempo. Como se muestra erji la figura 14, el aPE se volvió indetectable (enmascarado) dentro de los primeros 30 segundos de la aplicación de una corriente DC de 6 voltios, con un desenmascaramiento concomitante y la detección de aPS y aCL IgG. El aPL reqientemente desenmascarado que tuvo un pico alrededor de los 30 segundos ¡ solamente se volvió enmascarado de nuevo después de 2-4 minutos de exposición. Un aspecto técnico importante dirigido por experimento anteriormente mencionado fue que el paciente con aPE se trató aparte de la proteína plasmática diluida utilizada en el ensayo, en el presente caso, plasma de bovino ¡ adulto al 10% (ABP). En otros experimentos no mostrados, los sueros dilijiidos del paciente se expusieron a condiciones de EMF 6 voltios antes de añadir las proteínas plasmáticas utilizadas en el diluyente para ELISA. El aspecto importante de estos experimentos fue mostrar que los efectos EMF eran aplicables a los anticuerpos de los pacientes y no a los cambios EMF en las proteínas plasmáticas utilizadas en el diluyente. ; Estos datos experimentales apoyan las observaciones de que las reacciones redox determinan la aparición y desaparición de las diferentes especificidades. Lo que también se ha aprendido a partir de estos experimentos es que los efectos redox parecen estar limitados por el sitio(s) de unión al anticuerpo, la porción Fab de la molécula del anticuerpo. Esto es debido a ' que los conjugados heterólogos anti-humano marcados con anticuerpo ¡ utilizados en el ELISA no se afectan puesto que los conjugados continúan ¡reconociendo los diferentes blancos de la cadena pesada del anticuerpo ¡(porciones Fc) de las moléculas del anticuerpo. Por lo tanto, puesto que el anticuerpo de humano no se consume o destruye por redox, la explicación más plausible es que el sitio de unión al anticuerpo en la porción Fab de la ¡molécula del anticuerpo contiene electrones accesibles que pueden participar én el proceso de oxidación/reducción.

EJEMPLO 35 Los siguientes experimentos se llevaron a cabo para observar si las proteínas plasmáticas diferentes a los autoantícuerpos podrían tener alterada s'u especificidad de unión mediante oxidación-reducción. En estos experimentos, una solución de plasma de bovino adulto al 10% (ABP), la misma solución que contenía las proteínas de unión al fosfolípido que había sido utilizada para determinar la unión de aPL dependiente de la proteína, se expuso a una corriente eléctrica a partir de una batería de 6 voltios por un período de tiempo variable. Las muestras de ABP tratadas se utilizaron entonces én los ensayos de ELISA con un suero de paciente positivo a aPS, aCL y aPÉ para observar si el tratamiento del ABP podria afectar el resultado del ELISA. Como se muestra en la figura 15, en el tiempo cero (ABP no tratadas), el suero del paciente positivo produjo una respuesta aPL en ABP que se observa de manera rutinaria. Puesto que ABP al 10% se expuso a oxidación-reducción (EMF) durante un tiempo, la cantidad detectada de aPL disminuyó:y después de 2 minutos, el suero positivo a aPE ya no es positivo. Estos resultados indican que las proteínas plasmáticas que son responsables para la reactividad a aPL del paciente se alteran por la exposición a la corriente eléctrica. Por ejemplo, puesto que el quininógeno es la proteína plasmática1 responsable de proveer una señal positiva en ELISA para reacciones dependientes de aPE (el quininógeno se une a PE, luego el anticuerpo se une al quininógeno, sin embargo el aPE no se unirá ni a PE ni a quinínógeno de manera independiente), esto muestra que el quininógeno en la muestra de ABP se altera por la exposición redox. aCL también es negativo a los 240 segundos de exposición y puesto que este suero del paciente requiere ya sea de [protrombina y/o de beta2 glícoproteína (o ambas podrían participar) para la producción de una señal positiva en el ELISA de aPL, estas dos proteínas también deben ser alteradas por las reacciones redox. Las mismas dos proteínas plasmáticas participan en el ejemplo de aPS.

EJEMPLO 36 Se llevó a cabo un experimento para observar sí la leche materna dé humano contiene autoanticuerpos. En este experimento, se determinaron los niveles de aPS, aCL, aPE y aPC en leche materna tomada a partir de una madre de un bebé de 5 meses de edad antes y después de tratamiento! con hemina. Como se muestra en las figuras 17A-17B, la cantidad detectada de cada auto anticuerpo, como se determinó mediante DO se incrementó ¡dramáticamente en las muestras que fueron tratadas con hemina. Por consiguiente, se puede concluir que la leche materna de humano contiene anticuerpos enmascarados. Por lo tanto, la presente invención provee adicionalménte un producto que comprende leche no de humano tal como leche de vaca o de cabra que está suplementada con anticuerpos enmascarados de humano.

EJEMPLO 37 Se llevó a cabo un experimento para observar si el fluido cerebro espinal de humano contenía autoanticuerpos. En este experimento, el ruido espinal se tomó mediante perforación espinal a partir de un individuo normal y las muestras en reguladores de pH para dilución BSA y ABP se ensayaron para los niveles de aPS, aCL, aPE y aPC antes y después del tratamiento con hemina. Colmo se muestra en las figuras 17A y 17B, las muestras mostraron niveles nulos o mínimos de anticuerpos antifosfolípidos antes de tratamiento, y los incrementos sustanciales en los niveles después del tratamiento, con un aPE y aPC 'mostraron los mayores niveles en una regulador de pH de BSA y un aPS y aCL mostraron los niveles más elevados en el regulador de pH de ABP.

EJEMPLO 38 Se llevó a cabo un ensayo anti-nitrotirosina sobre IgG tratada con hemina y control para determinar si es la diferencia en la cantidad de residuos de nítrotirosina entre las muestras de IgG tratadas con hemina y control. Los pozos de la placa de ELISA se revistieron con IgG tratada con hemina y control, se secaron durante toda la noche, se bloquearon con BSA al 1 %, se lavaron y se hicieron reaccionar con anti-nitrotirosina de ratón (1/3000, Upstate, ÉUA, clona 1A6). Después del lavado, se añadió IgG antiratón de cabra conjugada a fosfatasa alcalina (Sigma, St. Louis, Missouri). El lavado adicional fue seguido por el desarrollo del sustrato por 2 horas a 37°C y las determinaciones cuantitativas. Como se muestra en la figura 18, se mostró una nitración considerablemente mayor en la IgG tratada. Este hallazgo provee apoyo a para la teoría de que la alteración de la especificidad de unión de los anticuerpos de conformidad con el método de la presente invención se afecta por' la nitrosilación de los residuos de tirosina en o cerca del sitio de unión del ántígeno, que puede inducir cambios conformacionales que afectan la especificidad de unión del sitio de unión.

EJEMPLO 39 Ivlg se incubó con hemina y se evaluó para reactividad con neutrófilosi utilizando citometría de flujo y anticuerpos IgG antihumano conjugados a fluorescencia. La evaluación comparativa se realizó con Ivlg no tratada. La figura 19A muestra la reactividad anti-neutrófilo sin Ivlg NHS. La figura 19B muestra la actividad auto-anti-neutrófilo de Ivlg no tratada. La figura 19C muestra la actividad auto-anti-neutrófilo de 1 mg de Ivlg tratada con hemina y la figura 19D muestra la actividad auto-anti-neutrófilo de 3 mg de Ivlg tratada con hemina, que muestra una fuerte actividad auto-anti-neutrófilo. Por consiguiente, se encontró que Ivlg procesada de conformidad con el método de esta ¡nvención libera autoanticuerpos que se dirigen específicamente los neutrófilos, que contienen peroxidasas unidas a la membrana, especialmente NADPH oxidasa. Estos resultados sugieren que los anticuerpos desenmascarados pueden participar en cualquier reacción que incluye uní "explosión respiratoria" (liberación rápida de especies reactivas de oxígeno) y la formación de iones superóxido.

EJEMPLO 40 Se llevaron a cabo los experimentos para observar si los autoanticuérpos podrían ser detectados en otros anímales. En estos experimenfos, se determinaron los niveles de aPS, aCL, aPE y aPC en plasma dé caballo antes y después de tratamiento con hemina. Como se muestra én las figuras 20A y 20B, la cantidad detectada de cada autoanticuerpo, como se determina mediante DO se incrementó dramáticamente en las muestras que se trataron con hemina. Por consiguiente, se puede concluir que el plasma de caballo contiene anticuerpos enmascarados. En experimentos similares, los autoanticuerpos de un isotipo IgY se detectaron en pollos (datos no mostrados).

Obviamente, son posibles muchas modificaciones y variaciones de la présente invención a la luz de las enseñanzas anteriormente mencionadas. Por lo tanto se entiende que, dentro del alcance de las reivindicaciones anexas, la invención se puede practicar de otra manera a la descrita específicamente.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método que comprende los pasos de proveer una composición de al menos una proteína suspendida o disuelta en leche cruda de mamífero o fluido de SNC, la proteína teniendo una especificidad de unión que se puede alterar de manera reversible por un cambio en su estado redox, y exponer ¡ la composición a un agente oxidante o a un potencial eléctrico adecuado para llevar a cabo de manera reversible la alteración del especificidad de unión de dicha proteína.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la proteína es un anticuerpo de isotipo IgG, IgA, o IgM. ,

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizando además porque la proteína es un autoanticuerpo de isotipo IgG, IgA. o IgM.'

4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la proteína es una proteína diferente a un anticuerpo.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el agente oxidante es un compuesto en anillo que contiene un átomo de metal coordinado.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el agente oxidante es un compuesto en anillo que contiene un átomo de hierro coordinado.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el agente oxidante es hemina.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el agente oxidante es KMn0 o Nal04.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el agente oxidante es clorofila.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el agente oxidante es una molécula que tiene la capacidad i ser reducida mediante la acción de un aceptor de electrones por otras moléculas que actúan como donantes de electrones.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la proteína contiene al menos un residuo de tirosina en un sitio de unión al antígeno o al ligando de la proteína y en donde el agente oxidante o potencial eléctrico altera la especificidad de unión de la proteína al! promover una nitrosilación reversible de la tirosína de al menos un residuo de irosina en el sitio de unión al antígeno o al ligando.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la especificidad de unión de la proteína alterada a partir de un estado en donde la proteína no tiene capacidad de unión con respecto a un antígeno específico o ligando hacia un estado en donde la proteína ti^ne una capacidad de unión con respecto al antígeno específico o ligando.

13.- Un método que comprende los pasos de proveer una composición que comprende leche cruda de mamífero o fluido de SNC o un extracto de leche cruda o fluido de SNC, en donde el fluido biológico o extracto contiene al menos una proteína enmascarada que tiene un sitio de unión con una especificidad de unión que se puede alterar por un cambio en su estado redox, exponer la composición a un agente oxidante o a un potencial eléctrico adecuado para afectar la alteración de la especificidad de unión de d,icha proteína enmascarada, desenmascarando así la proteína, y detectando! la proteína desenmascarada en la composición y/o recuperando la proteína desenmascarada a partir de la composición.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la proteína enmascarada es un anticuerpo.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la composición comprende leche cruda de mamífero y la proteína enmascarada es una IgA.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la composición comprende fluido de SNC y la proteína enmascarada es un autoanticuerpo IgG.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la proteína enmascarada se selecciona a partir del grupo que consiste de un anticuerpo específico para ácido glutámico descarboxilasa (GAD); un anticuerpo específico para tirosina fosfatasa (IA-2); un anticuerpo anticoagulante anti-lupus; un anticuerpo anti-fosfolípido; un anticuerpo, antinuclear (ANA); un anticuerpo anti-lámina; un anticuerpo anti-nucleolo; un anticuerpo anti-membrana nuclear; un anticuerpo anti-mitocondria; un anticuerpo anti-Golgi; un anticuerpo anti-granulocito; un anticuerpo 1 anti-neutrófilo; un anticuerpo anti-monocito; un anticuerpo anti-linfocito B; un anticuerpo anti-mieloperoxidasa; un anticuerpo anti-célula tumoral; un anticuerpo anti-trofoblasto; un anticuerpo anti-factor VIII; un anticuerpo ,anti-complejo factor plaquetario 4/heparina; y un anticuerpo anti-beta2-glicoproteína I. ,

18.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la proteína enmascarada se selecciona a partir del grupo que consiste de anticardiolipina, antifosfatidilcolina, antifosfatidi'letanolamina y antifosfatidilserina.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la proteína enmascarada contiene al menos un residuo de tirosina en sitio de unión al antígeno o al ligando de la proteína y en donde el agente oxidante o potencial eléctrico altera la especificidad de unión de la protelína mediante la promoción de una nitrosilación reversible de la tirosina de al menos un residuo de tirosina en el sitio de unión al antígeno o al ligando.

20.- Un método para detectar y/o proteína y aislar un autoanticuerpo a partir de leche cruda de mamífero o fluido del SNC, dicho fluido biológico extracto conteniendo autoanticuerpos que, antes de llevar a cabo el método, no son capaces de unirse a un antígeno propio y por lo tanto no se detectan por un ensayo basado en la unión receptor-ligando de un antígeno propio, el método comprendiendo los pasos de exponer la leche cruda de rnamífero o fluido del SNC a un agente oxidante o a una corriente eléctrica DC adecuada para alterar una especificidad de unión del autoanticuerpo de manera que dicho autoanticuerpo se vuelve capaz de unirse a un antígeno, volviéndose así detectable y recuperable a partir de la leche cruda de mamífero o del fluido del SNC mediante un método de separación mediante la unión del receptor-ligando, y detectando el autoanticu rpo en la leche cruda de mamífero o fluido del SNC y/o aislando y recuperando el autoanticuerpo a partir de la leche cruda de mamífero o del fluido del SNC.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el autoanticuerpo es de un isotipo IgG, IgA, o IgM.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el fluido biológico es leche de mamífero y el autoanticuerpo es un autoanticuerpo IgA.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el fluido biológico es fluido del SNC y el autoanticuerpo es un autoanticuerpo IgG.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el agente oxidante es un compuesto en anillo que contiene un metal coordinado. *

25.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el agente oxidante es un compuesto en anillo que contiene un hierro coordinado.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el agente oxidante es hemina.

27.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el agente oxidante es KMn04 o Nal04.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el agente oxidante es clorofila.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el agente oxidante es una molécula que tiene la capacidad de ser reducida mediante la acción como un aceptor de electrones por otras moléculas que actúan como donantes de electrones.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el autoanticuerpo se selecciona a partir del grupo que¡ consiste de un anticuerpo específico para ácido glutámico descarboxilasa (GAD); un anticuerpo específico para tirosina fosfatasa (IA-2); un anticuerpo anticoagulante anti-lupus; un anticuerpo anti-fosfolípido; un anticuerpo ¡antinuclear (ANA); un anticuerpo anti-lámina; un anticuerpo anti-nucleolo; Un anticuerpo anti-membrana nuclear; un anticuerpo anti- mitocondriá; un anticuerpo anti-Golgi; un anticuerpo anti-granulocito; un anticuerpoj anti-neutrófilo; un anticuerpo anti-monocito; un anticuerpo anti-linfocito B¡; un anticuerpo anti-míeloperoxidasa; un anticuerpo anti-célula tumoral; un anticuerpo anti-célula de isleta; un anticuerpo anti-trofoblasto; un anticuerpo¡ anti-factor VIII; un anticuerpo anti-complejo factor plaquetario 4/hepar¡na¡; y un anticuerpo anti-beta2-glicoproteína I. !

31.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el autoanticuerpo se selecciona a partir del grupo que consiste de anticardiolipina, antifosfatidilcolina, antifosfatidNetanolamina y antifosfatidilserina.

32.- Una inmunoglobulina aislada que tiene un sitio de unión al antígeno don una especificidad de unión que se puede alterar de manera reversible por un cambio en su estado redox, en donde la inmunoglobulina se selecciona! a partir del grupo que consiste de un anticuerpo específico para ácido glutámico descarboxilasa (GAD); un anticuerpo específico para tirosina fosfataea (IA-2); un anticuerpo anti-granulocito; un anticuerpo anti-neutrófilo; un anticuerpo anti-monocito; un anticuerpo anti-linfocito B; un anticuerpo anti-mieloperoxjdasa; un anticuerpo anti-célula tumoral; un anticuerpo anti-trofoblasto;: un anticuerpo anti-HLA; un anticuerpo anti-factor VIII; un anticuerpo ¡anti-complejo factor plaquetario 4/heparina; y un anticuerpo anti-beta2-glico[proteína I.

33.- La inmunoglobulina aislada de conformidad con la reivindicacijón 32, caracterizada además porque la molécula de inmunoglobulina se vuelve capaz de unirse de manera específica a un antígeno p¡ropio después de que la inmunoglobulina se expone a un agente oxidante.

34.- La inmunoglobulina aislada de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque la inmunoglobulina tiene al menos un residuo de tirosina en un sitio de unión al antígeno y en donde un cambio en el estado redox altera la especificidad de unión de la ¡nmunoglobulina al llevar a cabo la adición o remoción de un grupo de nitrato a partir de aljmenos un residuo de tirosina.

35.- La inmunoglobulina aislada de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque la adición o remoción de un grupo nitrato a partir de al menos un residuo de tirosina de la inmunoglobulina induce un cambio conformacional en el sitio de unión al antígeno de la ¡nmunoglobulina. ¡

36.- Un método que comprende los pasos de proveer una composición que comprende al menos una proteína suspendida o disuelta en un medio líquido que comprende un fluido corporal a partir de mamífero no humano o un ave, la proteína teniendo una especificidad de unión que puede ser alterada de manera reversible por un cambio en su estado redox, y exponiendo la composición a un agente oxidante o a un potencial eléctrico adecuado para afectar de manera reversible la alteración de la especificidad de unión dé dicha proteína.

37.- Un método que comprende los pasos de proveer una composición que comprende al menos una proteína suspendida o un medio líquido, la proteína teniendo una especificidad de unión que se puede alterar de manera reversible por un cambio en su estado redox y exponiendo la composición a un agente oxidante o a un potencial eléctrico adecuado para afectar de manera reversible la alteración de la especificidad de unión de dicha prote¡ína, en donde la proteína contiene al menos un residuo de tirosina en un sitio de unión al antígeno o al ligando de la proteína y en donde el agente oxidante o potencial eléctrico altera la especificidad de unión de la proteína aÜpromover una nitrosilación reversible de la tirosina de al menos un residuo de tirosina en el sitio de unión al antígeno o al ligando.

38.- El método que comprende los pasos de proveer una composición que comprende un fluido biológico o extracto de un fluido biológico, en donde el fluido biológico o extracto contiene al menos una proteína enmascarada que tiene un sitio de unión con una especificidad de unión que se puede alterar por un cambio en su estado redox, exponiendo la composición a un agente oxidante o a un potencial eléctrico adecuado para efectuar la alteración de la especificidad de unión de dicha proteína enmascarada, desenmascarando así la proteína, y detectando la proteína desenmascarada en la composición y/o recuperando la proteína desenmascarada a partir de la composición, en donde la proteína desenmascarada se selecciona a partir del grupo que consiste de un anticuerpo específico para ácido glutámico descarboxilasa (GAD); un anticuerpo específico para tirosina fosfatasa (IA-2); un anticuerpo anti-granulocito; un anticuerpo anti-neutrófilo; un anticuerpo anti-monocito; un anticuerpo anti-linfocito B; un anticuerpo anti-mieloperoxidasa; un anticuerpo anti-célula Humoral; un anticuerpo anti-trofoblasto; un anticuerpo anti-HLA; un anticuerpo anti-factor VIII; un anticuerpo anti-complejo factor plaquetario 4/heparina; y un anticuerpo anti-beta2-glicoproteína I.

39.- Un método para detectar y/u obtener y aislar un autoanticuerpo a partir de un fluido biológico o extracto de un fluido biológico o a partir de un extracto de un fluido biológico o extracto de un fluido biológico, dicho fluido biológico o extracto que contiene autoanticuerpos que, antes de llevar a cabo el método, no son capaces de unirse a un auto antígeno y por lo tanto no son detectables por un ensayo basado en la unión del receptor-ligando de un auto antígeno, el método comprendiendo los pasos de exponer el fluido biológico o extracto de un fluido biológico a un agente oxidante o a una corriente eléctrica DC adecuada para alterar una especificidad de unión del autoanticuerpo de manera que dicho autoanticuerpo se vuelve capaz de unirse a un antígeno, volviéndose así detectable y recuperable a partir del fluido biológico o extracto mediante un método de separación de la unión, y detectando ¡el autoanticuerpo en el fluido biológico y/o aislado y recuperando el autoanticuerpo a partir del fluido biológico, en donde el autoanticuerpo se selecciona a partir del grupo que consiste de un anticuerpo específico para ácido glutámico descarboxilasa (GAD); un anticuerpo específico para tirosina fosfatasa (IA-2); un anticuerpo anti-granulocito; un anticuerpo anti-neutrófilo; un anticuerpo anti-monocito; un anticuerpo anti-linfocito B; un anticuerpo anti-mieloperoxidasa; un anticuerpo anti-célula tumoral; un anticuerpo anti-trofoblasto; un anticuerpo anti-HLA; un anticuerpo anti-factor VIII; un anticuerpo i anti-complejo factor plaquetario 4/hepahna; y un anticuerpo anti-beta2-glicoproteína I.

40.- Una inmunoglobulina aislada que tiene un sitio de unión al antígeno cpn una especificidad de unión que se puede alterar de manera reversible por un cambio en su estado redox, la inmunoglobulina tiene al menos un residuo de tirosina en un sitio de unión del antígeno y, en donde un cambio e? el estado redox altera la especificidad de unión de la inmunoglobulina al efectuar la adición o remoción de un grupo nitrato a partir de al menos un residuo de tirosina.