CN101262774A - 通过氧化还原反应改变蛋白质结合特异性的方法 - Google Patents

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Abstract

至少一种悬浮或溶解于液体介质中的蛋白质的结合特异性通过将该蛋白质暴露于氧化剂或者电流来可逆地改变。通过让生物流体接受氧化剂或电流而改变包含于其中的屏蔽的蛋白质(masked protein)的结合特异性，可从该生物流体中检测、分离和回收屏蔽的蛋白质，如自身抗体。

Description

通过氧化还原反应改变蛋白质结合特异性的方法
发明领域
本发明涉及一种改变蛋白质的结合特异性的方法，该蛋白质具有可通过氧化还原反应而改变的结合特异性。本发明进一步涉及一种可逆地改变抗体，尤其是屏蔽的自身抗体的结合特异性的方法，所述的抗体天然存在于正常受试者的血液、血浆、血清或其它体液中。
发明背景
术语“自身免疫疾病”指的是免疫系统错误地攻击人自身身体的细胞、组织和器官的一类疾病。典型地，自身免疫疾病涉及身体自身成分，例如常见的蛋白质和脂类的抗体结合。与自身化合物(或者，更典型地，与在每种生物中都存在的如此常见的化合物)结合的抗体称作自身抗体。例如，磷脂和/或磷脂结合性血浆蛋白质的自身抗体结合与以下疾病相关，例如全身性红斑狼疮(SLE)、深部静脉及复发性动脉血栓形成、肺栓塞、复发性自然流产、血小板减少症、舞蹈病、癫痫、青斑、自发性肺动脉高压、风湿状况以及许多胶原性疾病。其它与自身抗体相关的疾病包括多发性硬化、克罗恩病、盘状红斑狼疮、淋巴瘤性甲状腺肿、牛皮癣、糖尿病以及类风湿性关节炎。大约有80种不同的自身免疫疾病，并且作为一类疾病，这些疾病影响着数百万人。
关于自身免疫疾病病原学的传统理论认为，这些疾病由在患病个体中产生了过量的自身抗体引起，可能是由于编码这些自身抗体的基因过度表达。根据这一理论，受影响个体的血液含有水平升高的引起该疾病的特定自身抗体，而正常个体血液中不含这种自身抗体或者仅仅含有微不足道的量。该理论表面上得到了传统检测的支持，在这些检测中含量丰富的自身抗体可在来自患有自身免疫疾病的受试者的血液或者血液制剂，如血浆或者血清中检测到，相反在来自没有患自身免疫疾病的受试者的血液或血液制剂中则检测到自身抗体为零或者极微量。
本发明是基于在此报道的一个惊人发现，即正常个体的血液中实际上也含有相当数量的多种类型及特异性的自身抗体。如果对血液或者血液制剂进行氧化处理，例如通过用氧化剂或者电流按照这里描述的方法进行处理，就能够从正常个体的血液或血液制剂中检测或分离出这些自身抗体。对于正常血液中显著数量的自身抗体的发现是以前没有报道过的，并且就发明人所知，这些自身抗体在正常血液中以显著量存在在本发明之前完全是未知的。
正常个体中显著数量的自身抗体的发现提出了一个问题，即为什么在标准的检测(通常基于抗体与其相应抗原的结合)中不能检测到自身抗体，并且为什么在正常个体中自身抗体不引起疾病。
在这里描述的实验中，显示通过本发明的方法，通过将生物流体暴露于氧化剂或DC电流，可从该生物流体例如正常受试者的血液中获得自身抗体，而且该过程是可逆的。此外，还发现自身抗体可通过处理商购的IvIg产品获得。基于这些试验，关于正常血液中如何能含有自身抗体，而这些抗体不能通过常规的筛选过程检测到，并且这些抗体不引起疾病的理论是，自身抗体随其它抗体一道自由循环，但在正常个体中，自身抗体的抗原结合位点以某种方式被屏蔽或者失活。因为根据本发明发现的屏蔽的抗体的显著数量和多样性，显然这些屏蔽的抗体肯定在健康个体中起作用。这些屏蔽的抗体的有利作用得到了屏蔽的抗体在人母乳中的发现的支持。此外，根据自身抗体的结合位点可通过改变氧化还原状态而去屏蔽的理论，可以推测，自身免疫疾病是由使自身抗体的抗原结合位点去屏蔽的氧化引起或加剧。而且，屏蔽的自身抗体在脑脊髓液中的发现表明，自身抗体可能与神经变性疾病例如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病有关，这些疾病可能由自身抗体的去屏蔽引起或加剧。已经知道CNC中的蛋白质的亚硝基化是阿尔茨海默氏病发作的其中一个最早的措施。如果这在脑中发生，则这也可以释放氧化还原活性自身抗体至aPL。这些aPL抗体可随后开始与脑中的磷脂反应并引起脑的许多损伤和收缩，这见于阿尔茨海默氏病患者脑的MRI研究中。而且，该理论提出了一种更普通的机制，通过该机制可改变某些血浆蛋白质的结合特异性。
构成本发明基础的上述发现的一种直接实际应用是，使得可以几乎无限制地提供想要获得的新发现的自身抗体，该自身抗体可在用于自身免疫疾病和其它aPL相关疾病的实验室诊断的诊断试剂盒中用做标准。以前，收集大量的自身抗体用于商业应用是十分困难的，因为人们认为自身抗体必须从患有自身免疫疾病或者在标准测定中自身抗体显示为阳性的个体中才能获得。通过对个体患者进行静脉切开放血术或者收集来自一组已知自身抗体检测为阳性的患者的血液能够获得的这种血液的量是有限的。其它获得自身抗体的方法，例如在美国专利US5885793中描述的筛选噬菌体文库的方法，可能是十分困难而且耗时的。
由于可预测或预示在特定个体中的氧化应激之后会出现什么抗体，因而测定血液样品中存在或不存在屏蔽的抗体具有重要的诊断价值。
发明概述
本发明的一个目的是提供一种可逆改变蛋白质的结合特异性的方法，该蛋白质的结合特异性可通过其氧化还原状态的变化而可逆地改变。
本发明的另一目的是提供一种从生物流体例如血液、血清、血浆、鲜奶、淋巴液或CNS液，尤其例如来自正常个体的这些流体中获得自身抗体的方法。
本发明的另一目的是提供一种通过对受试者施以足够使所述受试者体内的自身抗体失活的抗氧化剂，来治疗患有自身免疫疾病的受试者的方法。
本发明的另一目的是提供一种通过使受试者的自身抗体在体外失活来治疗所述患有自身免疫疾病的受试者的方法。
本发明的另一目的是提供一种分离的免疫球蛋白和一种包括生物流体或者含蛋白质的生物流体提取物的产品，所述分离的免疫球蛋白具有可通过氧化还原条件的改变而改变的结合位点，所述流体或流体提取物曾暴露于足以改变至少一种其中所含蛋白质的结合特异性的氧化剂或者DC电流。
本发明的另一目的是提供一种来自于一个或多个在常规临床检测中没有检测到自身抗体存在的人的生物流体样品，并且该生物流体样品已经过处理，从而之后证明该生物流体存在有自身抗体。
这些以及其它的目的可通过改变生物流体中或含蛋白质的生物流体提取物中至少一种蛋白质的结合特异性的方法来实现，该蛋白质带有具结合特异性的结合位点，所述的结合特异性可通过将该生物流体或提取物中的蛋白质暴露于氧化剂或者直流电流(DC)以使该循环蛋白质的结合特异性发生可逆改变，从而改变该蛋白质的氧化还原状态而得以可逆的改变。
这些目的可另外通过包含下述步骤的方法来实现：提供组合物，其包括至少一种悬浮或溶解于流体介质中的蛋白质，该蛋白质具有可通过改变其氧化还原状态而改变的结合特异性；以及将该组合物暴露于足以改变该蛋白质的结合特异性的氧化剂或者DC电势。
在另一实施方案中，本发明涉及一种从生物流体或者生物流体提取物中检测或获取自身抗体或者其它屏蔽的蛋白质的方法，其通过将生物流体或提取物中的自身抗体或者其它屏蔽的循环蛋白质暴露于足以改变自身抗体或其它屏蔽的循环蛋白质的结合特异性的氧化剂或DC电流，这样使自身抗体或者其它屏蔽的循环蛋白质变得能够与抗原或配体结合，由此变得可检测，并可从生物流体或提取物中回收，以及从该生物流体中回收该自身抗体或其它屏蔽的循环蛋白质来实现。
在另一实施方案中，本发明涉及一种带有具结合特异性的结合位点的分离的免疫球蛋白，所述的结合特异性可通过氧化还原状态的改变而可逆的改变。
在另一实施方案中，本发明涉及一种通过向患有自身免疫疾病的受试者施以足以抑制或逆转受试者中自身抗体结合位点的氧化激活作用的量的抗氧化剂，来治疗自身免疫疾病的方法。对患有自身免疫疾病的人的治疗可包括在体外处理血液，以减少未屏蔽的蛋白质并将它们替换为屏蔽的蛋白质。
在另一实施方案中，本发明涉及一种方法，即筛选正常个体的生物流体或提取物，以确定哪些自身抗体被屏蔽，并因此构建该个体中，如果通过氧化或电动势而被暴露或者去屏蔽，可能引起自身免疫疾病的自身抗体的潜在抗体谱。
作为特定的、非限制性的例子，生物流体或提取物例如免疫球蛋白混合物，可被暴露于氧化剂或者DC电流，以实现生物流体或提取物中所含的至少一种自身抗体的结合特异性的改变，以便使自身抗体变得在血液、血浆、血清或提取物中可检测，并可从血液、血浆、血清或提取物中回收。
附图简述
图1是列出了特定抗磷脂抗体(aPL)的表格，该抗磷脂抗体通过在下面描述的许多实施例中所使用的内部(in-house)酶联免疫吸附测定(ELISA)形式检测。
图2是概括了来自正常aPL-阴性受试者的血液样品的aPL测定结果的表格，该血液样品按照在实施例的开头部分所描述的方法孵育。
图3是概括了来自7个aPL-阴性正常个体的血液样品的aPL测定结果的复合式表格，该血液样品按照在实施例的开头部分所描述的方法孵育。
图4是概括了来自正常aPL-阴性受试者的血清样品的aPL测定结果的表格，该血清样品按照在实施例的开头部分所描述的方法孵育，特征是该过程中马红细胞(RBC)被替换成人RBC。
图5是概括了血清样品孵育的aPL检测结果的表格，所述的血清样品孵育按照在实施例的开头部分所描述的方法进行，只是马血清被替换成人血清。
图6是概括了来自正常aPL-阴性受试者的血液样品的aPL测定结果的表格，该血液样品按照在实施例的开头部分所描述的方法孵育，只是该孵育是在室温(22℃)下进行。
图7是概括了来自正常aPL-阴性受试者的血液样品的aPL测定结果的表格，该血清样品按照在实施例的开头部分所描述的方法孵育，特征是将0.7mm的Degalan(塑料)小珠用作孵育混合物中的颗粒状固体。
图8是概括了来自正常aPL-阴性受试者的血液样品的aPL测定结果的表格，除孵育混合物保持静止而不摇动或振荡以外，该血液样品按照在实施例的开头部分所描述的方法孵育。
图9是概括了来自正常aPL-阴性受试者的血液样品的aPL测定结果的表格，该血液样品按照在实施例的开头部分所描述的方法孵育，增加的特征是将该孵育混合物加热至56℃30分钟。
图10是概括了来自正常aPL-阴性受试者的血液样品的aPL测定结果的表格，该血液样品按照在实施例的开头部分所描述的方法孵育，特征为采用了来自不同供应商(Becton Dickinson，Sparks，Md)的细菌生长培养基来取代来自Biomerieux的细菌生长培养基。
图11是概括了来自正常aPL-阴性受试者的血液样品的aPL测定结果的表格，该血液样品按照在实施例的开头部分所描述的方法孵育，特征为培养在厌氧条件下进行。
图12是概括了来自正常aPL-阴性受试者的血液样品的aPL测定结果的表格，该血液样品按照在实施例的开头部分所描述的方法孵育，特征为用K562细胞(人肿瘤细胞系)替代RBC。
图13是概括了来自正常aPL-阴性受试者的血液样品的aPL测定结果的表格，但将细菌生长培养基替换为用于培养人细胞的细胞培养基。
图14是概括了来自正常aPL-阴性的母婴的脐带血样品的aPL测定结果的表格。
图15是概括了来自正常aPL-阴性受试者的血液样品的aPL测定结果的表格，该血液样品按照在实施例的开头部分所描述的方法孵育，特征是用硝普钠(SNP)替代温育混合物中的RBC。
图16是概括了血液样品的狼疮抗凝血剂活性测定结果的表格，所述的血液样品按照在实施例的开头部分描述的方法孵育。在采用本发明的步骤使血清转化之前从血液的狼疮抗凝血剂为阴性的受试者中获得血液样品。
图17是列出了血液样品中已鉴定出的其它类型的自身抗体的表格，所述血液样品按照在实施例的开头部分描述的方法孵育。列出的抗体通过免疫荧光显微镜检术来鉴定。
图18是表示单核细胞细胞群的前向散射(forward scatter)(大小)和侧向散射(side scatter)(粒度)分布图的图，该单核细胞细胞群通过对密度梯度分离的人白细胞采用流式细胞术而确定。
图19A-D为流式细胞术柱状图，显示了各种血清的单核细胞活性。在该柱状图中，如果存在的话，抗体活性可通过沿着水平轴的中值通道值(median channel value)(对数标度)的位移来测定。图19A显示了来自汇集的正常人血清(NHS)的单核细胞反应活性。图19B显示了来自单个正常受试者的血清的单核细胞活性。图19C显示了来自图19B中所示的受试者的血液样品的单核细胞活性，该血液样品按照在实施例的开头部分描述的方法处理。图19D显示了阳性对照血清的单核细胞活性。
图20是概括了采用RELISA
Figure A20068001330200181
筛选测定法的各种样品的抗核抗体(ANA)测试结果的表格。
图21是概括了在tris缓冲液中与氯高铁血红素一起孵育的IvIg样品的aPL测定结果的表格。
图22是表示在一系列与氯高铁血红素一起培养的IvIg制剂中测定的aPS、aCL、aPE以及aPC的量(通过光密度测定，OD)的图，该量作为加入到制剂中的人血清量(以μl为单位)的函数。
图23是表示在一系列与氯高铁血红素一起培养的稀释的人血清制剂中测定的aPS、aCL、aPE以及aPC的量(通过光密度测定，OD)的图，该量作为加入到制剂中的氯高铁血红素量(以μl为单位)的函数。
图24是显示在一系列与氯高铁血红素和维生素C一起培养的IvIg制剂中测定的aPS、aCL、aPE以及aPC的量(作为平均值的倍数测定，MoMs)的图，该量作为加入到制剂中的维生素C量(以μl为单位)的函数。
图25是表示在一系列与NaOH溶解的氯高铁血红素、DMSO溶解的血卟啉IX(hpIX)、NaOH溶解的hpIX、只有NaOH、只有DMSO以及DMSO溶解的氯高铁血红素一起培养的IvIg制剂中测定的aPS、aCL、aPE以及aPC的量(作为平均值的倍数测定，MoMs)的图。
图26是显示在一系列与渐增量的氯高铁血红素以及渐增量的氯高铁血红素和血液结合素(hpx)一起培养的IvIg制剂中测定的aPS的量(通过光密度测定，OD)的图。
图27显示了获得的三种细胞溶解产物的蛋白质印迹，用氯高铁血红素处理的IvIg以及未经处理的IvIg作为一级抗体，以及其中以抗人HRP标记的缀合物作为对照的印迹。
图28A和28B是显示了在一系列IvIg制剂中测定的aPL依赖型和aPL独立型aPS、aCL、aPE以及aPC的量(作为平均值的倍数测定，MoMs)的图，其中将连接着9伏特电池的电极浸入含有IvIg的磷酸缓冲盐溶液中2分钟。
图29是显示了在一系列IvIg制剂中测定的aPS、aCL、aPE以及aPC的量(作为平均值的倍数测定，MoMs)的图，其中将连接着6伏特电池的电极浸入含有IvIg的磷酸缓冲盐溶液中60秒。
图30是显示了在一系列IvIg制剂中测定的aPS、aCL、aPE以及aPC的量(作为平均值的倍数测定，MoMs)的图，其中将连接着6伏特电池的电极浸入含有IvIg的磷酸缓冲盐溶液中，作为浸入时间的函数。
图31A、31B和31C是分别显示了在暴露于连接着6伏特电池的电极240秒之前和之后，在对照溶液中测定的aCL、aPE以及aPS的量(作为平均值的倍数测定，MoMs)的图。
图32是分别显示了在用PBS稀释的aPS及aCL-阳性患者血清中测定的aPS以及aCL的量(作为平均值的倍数测定，MoMs)的图。在该实验中，将连接着6伏特电池的石墨电极浸入稀释的血清中不同的时间。
图33是分别显示了在用PBS稀释的aPE-阳性患者血清中测定的aPS、aCL、aPE以及aPC的量(作为平均值的倍数测定，MoMs)的图。在该实验中，将连接着6伏特电池的石墨电极浸入稀释的血清中不同的时间。
图34是分别显示了在用PBS稀释的aPE-阳性患者血清中测定的aPS、aCL以及aPE的量(通过光密度测定，OD)的图。在该实验中，通过将连接有6伏特电池的石墨电极浸入ABP中不同的时间，来处理用于测定蛋白质依赖型aPL结合性的10％的成年牛血浆(ABP)。
图35是将在未经孵育的人母乳样品中检测到的aPS、aCL、aPE以及aPC的量(通过光密度测定，OD)与在用氯高铁血红素孵育的人母乳样品中检测到的量比较的图。
图36A和36B是分别显示了在正常受试者的CSF液体的未孵育的样品和与氯高铁血红素孵育的样品中检测到的aPS、aCL以及aPE的量(通过光密度测定，OD)的图。显示的是PBS-稀释样品以及ABP-稀释样品两者的结果。
图37是比较用氯高铁血红素处理过的IgG样品和未曾用氯高铁血红素处理的IgG样品中，可通过单克隆的抗-硝基酪氨酸检测的IgG的量的图。
图38A-D是流式细胞术柱状图，显示了多种IvIg制剂的中性粒细胞活性。
图39A和39B是将在未曾孵育的马血清样品中检测到的aPS、aCL、aPE以及aPC的量(通过光密度检测，OD)与在用高氯铁血红素孵育的马血清样品中检测到的量相比较的图。
发明详述
本发明涉及改变生物流体或生物流体提取物中至少一种蛋白质的结合特异性的方法。
典型的，作为本发明对象的蛋白质是天然存在于动物循环系统、淋巴系统、脑脊髓液或母乳中的那些。这些蛋白质的实例包括抗体和其它血浆蛋白质。作为非限制性的实例，该蛋白质可以是一种1gG、IgA或IgM同种型的抗体或自身抗体。特别的，本发明针对在这里新发现的一类蛋白质，这类蛋白质具有其结合特异性可通过该蛋白质氧化还原状态的改变而可逆改变的特性。本发明者的发现，即存在具有该特性的循环蛋白质，例如自身抗体形成了本发明的基础。本发明不限于抗体或自身抗体，因为已经发现某些非-抗体蛋白质也具有可通过氧化还原状态的改变而改变的结合特异性。这些非-抗体蛋白质包括激肽原和凝血酶原和/或β2糖蛋白。
术语“屏蔽的蛋白质”在这里用于指明并描述在正常个体中存在于血液或其它体液中，但不能通过基于受体-配体结合的常规结合测定法检测的蛋白质例如循环蛋白质，因为在正常个体或者在取自正常个体的样品中，其结合位点被屏蔽或者阻断，或者被阻止与抗原结合，而且，当含有屏蔽的蛋白质的样品通过改变其氧化还原状态进行处理时，例如根据本发明的方法，通过暴露于氧化剂或者电流中，所述蛋白质变得能够与抗原结合，并因此在样品中变得可检测到。屏蔽的蛋白质的实例是根据本发明的自身抗体，包括但不限于在下面表2中列出的那些。如同本发明的发明人所发现的那样，屏蔽的自身抗体在正常血液中以显著的量循环，但是它们在基于抗体-抗原结合的常规测定中是不可检测到的。如这里所探讨的那样，当自身抗体受到足以改变其结合特异性的氧化-还原条件时，该屏蔽的自身抗体变得可检测并可回收。
在形成本发明基础的这一发现后，用多种自身抗原和其它类型的抗原筛选样品例如血液、血清、母乳、脑脊髓液以及IvIg提取物，用以鉴定可通过氧化去屏蔽的屏蔽的自身抗体成为可能。曾通过氧化去屏蔽的自身抗体包括下面表2中的那些：
表2：迄今在氧化还原转变正常血浆或IgG后确定的屏蔽的自身抗体
特异性测定               方法                评价
谷氨酸脱羧酶(GAD)        RIA                 非常强
酪氨酸磷酸酶(IA-2)       RIA                 中等强度
抗磷酯抗体：             ELISA               aPS、aPE、aPS、aPE、
                                             aCL非常强；aCL、
                                             aPC强；aPC弱
狼疮抗凝物(LA)           APPT、dRVVT         中等强度
抗核抗体(ANA)            RELISA              非常强
抗-核                    荧光免疫测定        强
抗-核纤层蛋白，核膜      荧光免疫测定        非常强
抗-线粒体                荧光免疫测定        中等强度
抗-Golgi                 荧光免疫测定        中等强度
抗-粒细胞、中性粒细胞    流式细胞测定(FACS)  非常强
                                             单核细胞
表2(续表)
特异性测定               方法                评价
抗-B淋巴细胞             FAGS                中等强度
抗-髓过氧化物酶          ELISA               非常强
抗-肿瘤细胞系            蛋白质印迹          非常强
抗-营养细胞              荧光免疫测定        非常强*
抗-HLA                   ELISA和FAGS         阴性
抗-凝血因子VIII          ELISA               强阳性
血小板因子4/肝素复合物   ELISA               强阳性
抗-β2-糖蛋白I           ELISA               强阳性
                                   
*营养细胞基膜反应性与由Faulk等人使用胎盘洗脱物报道的[27]惊人地相似。
表2中使用的缩写：
aCL，抗心磷脂
aPC，抗磷脂酰胆碱
aPE，抗磷脂酰乙醇胺
aPS，抗磷脂酰丝氨酸
APPT，活化部分凝血激酶时间
dRVVT，稀释印度蝰蛇毒时间
ELISA，酶-联免疫吸附测定
RIA，放射免疫测定法
因此，本发明包括改变任意上述免疫球蛋白的结合特异性的方法，从对它们的特定抗原的非-结合状态变成结合状态。而且相信，通过本发明方法去屏蔽的上述免疫球蛋白存在以前未被发现的一类自身抗体。因此，本发明进一步包括分离的免疫球蛋白，所述分离的免疫球蛋白具有其结合特异性可以通过氧化还原状态的改变而可逆改变的抗原结合位点。术语“分离的免疫球蛋白”指已经从其天然状态移出的免疫球蛋白。例如，本发明的免疫球蛋白通常是一种以前不能在生物样品中检测到的免疫球蛋白，因为在非-结合状态中它的抗原结合位点维持在它的天然环境中。然而，通过处理样品来改变氧化还原状态，例如用氧化剂或DC电流处理，该免疫球蛋白变得能够特异性结合各自特定的抗原。通过利用改变了的免疫球蛋白特异性结合特定抗原的能力，可从样品中检测、分离和/或回收免疫球蛋白。
此外，也已经发现，最初检验为HCV(丙型肝炎病毒)阴性的血液、血清或IvIg样品在进行根据本发明处理后检验为HCV阳性，这暗示着正常个体在他们的循环中具有屏蔽的抗-HCV抗体。
术语“改变蛋白质的结合特异性”指的是使蛋白质改变或变化的过程，例如通过氧化或者还原，使其变得能够特异性地结合先前不能特异性结合的抗原或者配体。该术语还可适用于借此蛋白质得以发生变化或改变的过程，例如通过氧化或还原使其变得不能够特异性结合其先前已经能够特异性结合的抗原或配体，但应该理解在本文中，该术语指的是可逆的改变而不是永久的、不可逆的改变例如蛋白质变性。术语“去屏蔽”指的是其中屏蔽的蛋白质的结合特异性通过改变氧化还原状态来改变的过程，使得该蛋白质变成可以通过基于改变了的结合特异性的结合测定而检测到。特别是，该屏蔽的蛋白质的结合特异性可以从对于一种抗原或配体的非-结合状态变成结合状态，由此该蛋白质认为是去屏蔽的。
术语“自身抗体”指的是由动物免疫系统产生并与自身抗原结合的任何天然存在的抗体，自身抗原也就是动物自身产生的化合物或者抗原。
术语“体液”或“生物流体”包括任何体液，包括血浆、血清和全血、唾液、尿液、乳液、中枢神经系统(CNS)液，例如脑脊髓液以及其它流体和分泌物，而且可以是蛋白质例如循环蛋白质。体液可以来自产生抗体的任何脊椎动物，尤其是哺乳动物和鸟类，并且最特别的是人。术语“含蛋白质的生物流体提取物”指的是任何从生物流体中收集或者分离的制剂，例如免疫球蛋白片段。可用于本发明的，包括血液、血清或血浆的生物流体可以从受试者中新鲜获得，也可以获自诸如从血库或者其它血液收集机构获得的汇集的血液或血浆制剂这样的来源。出于本发明的目的，血液、血清或血浆还可来自过期或者被血库或血液收集机构发现为不符合标准的收集物。尽管这一描述集中于人的血液、血浆和血清以及其它生物流体，但本发明的相同工序也可用于从动物获得的生物流体，并可获得类似的动物抗体以用于兽医学相关目的。例如，类似的自身抗体已经在来自马和鸡的样品中检测到(数据未显示)。优选地，可将本发明方法中采用的生物流体稀释用以减少可能包含于其中的任何抗氧化剂的作用。
而且，本发明方法可以在提取物例如一种IvIg制剂或者任何其它分离的提取物或免疫球蛋白浓缩物上实施。如在下面实施例中详细描述的，这些制剂在它们未经处理时显示出最低水平的自身抗体。一旦根据本发明的方法用氧化剂或DC电流处理这些制剂后，屏蔽的蛋白质例如屏蔽的自身抗体可从这些制剂中检测和回收。
在本发明的方法中，生物流体中的至少一种循环蛋白质或血浆蛋白质的结合特异性可通过暴露该蛋白质于氧化剂或电流而改变。例如，屏蔽的循环蛋白质的结合特异性可被改变，从而使该蛋白质去屏蔽，也就是说，使其能够与在采用本发明的方法之前不能结合的抗原结合。然后通过基于特异性结合的任何分离方法，将具有它的改变的结合特异性的蛋白质分离并回收。
如果采用氧化剂来实施本发明的方法，氧化剂可以是任何能够改变生物分子的氧化还原状态的化合物。更具体地，氧化剂是能够通过作为其它作为电子供体的分子的电子受体而被还原的分子。合适的氧化剂包括含有配位金属，特别是氧化金属例如铁的环状化合物。氧化剂的实例包括但不限于氯高铁血红素和叶绿素。其它氧化剂是例如高碘酸钠(NaIO4)或高锰酸钾(KMnO4)。通常，当采用氧化剂时，生物流体或其提取物与氧化剂的混合物必须孵育一段时间，通常约为一天或者一整夜。氧化剂应当以足以改变具有可改变的结合特异性的蛋白质的结合特异性的浓度施用，但不得以可能会使该蛋白质受到破坏或变性的浓度施用。在自身抗体的情况下，发现不同类型的自身抗体可与不同的抗氧化剂发生不同的相互作用。例如，对于aPC自身抗体的去屏蔽来说，与KMnO4的反应结果很好而与氯高铁血红素的反应结果不佳。
如果采用DC电流来实现本发明的方法，本方法可通过任何供给电流的装置，例如通过将阳极和阴极电极浸入含有待处理样品的导电溶液中来实现。通常，含有生物流体的溶液可暴露于足够大小和足够持续时间的电势，以便能改变具有可改变的结合特异性的蛋白质的结合特异性。已经发现，通过将溶液暴露于6-24伏特的电势下数秒到数分钟，就可得到阳性结果。如同在实施例中讨论的那样，在电流中的暴露时间延长可导致结合特异性的改变的可逆性。
不束缚于特定的理论，在自身抗体的情况下，优选地，该自身抗体以足以氧化该自身抗体的Fab部分的抗原结合位点的量或时间暴露于氧化剂或者电流。通过进一步用抗-硝基酪氨酸抗体检测的试验发现，已经暴露于氯高铁血红素氧化的IgG具有比未处理的IgG更高的亚硝基化水平。因此，可以推理，蛋白质抗原结合位点的改变，并且特别是自身抗体的抗原结合特异性的改变通过在抗体高可变区内和其周围的酪氨酸残基的可逆的亚硝基化而实现，该区域的可逆硝基化可引起抗原结合位点的构象改变。
特定的目标蛋白质是否为具有可通过改变其氧化还原状态而改变的结合特异性的蛋白质，以及任何改变该特定目标蛋白质的结合特异性的一系列条件的有效性，可以容易地例如通过将该蛋白质或生物流体暴露于氧化剂，而使该蛋白质或含有该蛋白质的生物流体受到氧化还原状态的改变，然后采用ELISA或者其它的配体-受体测定来检测是否蛋白质的结合特异性已经改变来确定。换而言之，来自受试者的一种样品或一系列样品的测定可在蛋白质受到氧化还原条件的改变之前和之后进行，以观察该过程是否改变了该蛋白质的结合特异性。例如，回收特定自身抗体的最好的氧化剂可以容易地通过简单的实验来确定。
本发明的另一方面是基于对这些自身免疫疾病会怎样产生的新的理解，来治疗患有自身免疫疾病的受试者的可能性。例如，如果已经知道自身免疫疾病是由以屏蔽的形式存在于健康个体中的自身抗体的去屏蔽引起，那么治疗和预防可集中在抑制或反转自身抗体的去屏蔽，例如通过用抗氧化剂或还原剂治疗受试者而引起自身抗体恢复到屏蔽的状态。已经发现可抑制自身抗体的去屏蔽反应的制剂包括抗氧化剂例如抗坏血酸、血液结合素和脱辅基转铁蛋白。同样，治疗方法可包括从受试者中提取血液样品，将该血液样品暴露于足以使所述血液样品中的自身抗体失活的抗氧化剂、还原剂或电流，并将血液样品返回给所述受试者。
本发明的另一方面是一种方法，即筛选正常个体的生物流体或提取物以测定哪些自身抗体被屏蔽，并由此构建如果经氧化或电动势而被暴露或去屏蔽，能在该个体中引起自身免疫疾病的自身抗体的潜在抗体谱。例如，概括地说，来自受试者的生物样品可通过检测来确定样品中可检测的自身抗体的量和/或类型。其后，来自受试者的生物样品可通过将样品暴露于氧化剂或者DC电流来进行处理，并且可以检测来自受试者的样品以确定该处理样品中可检测的自身抗体的量和/或类型。其后，可将处理步骤之前样品中可检测的自身抗体的量和/或类型，与处理步骤之后样品中可检测的自身抗体的量和/或类型进行比较。可执行这些相同的方法步骤来确定任意特定化合物、组合物或条件对于实现任何特定样品中蛋白质的结合位点的改变的效用。
研究发现，未处理的血液、血浆、血清或者IvIg样品，以及按照本发明方法处理的血液、血浆或血清或者IvIg样品可以低压冻干并运输或者储存。当样品复原时，它们保持它们各自的活性。
实施例
已经描述了本发明后，给出下列实施例来解释本发明的具体应用，包括现在已知的实现本发明的最佳方式。这些实施例大致按时间顺序呈现，并因此显示了达到本发明效果所需的成分和步骤的认识进程。这些具体的实施例并不意味着限制了本申请中所述的发明范围。
关于这里描述的实施例1-17中的每一个，除非另外指明，通常采用下列步骤：将取自aPL-阴性受试者的10ml全血样品或者5ml的血清或血浆样品，和4-5ml包装的哺乳动物红细胞，加入到含有30mlBiomerieux牌细菌生长培养基(至少含有下列成分：蒸馏水、大豆酪蛋白消化培养液(soybean-casein digest broth)、酵母提取物、葡萄糖、蔗糖、氯高铁血红素、甲萘醌(维生素K3)、盐酸吡哆醛(维生素B6)，以及磺酸聚茴香脑钠(sodium polyanetholesulfonate，SPS)和炭)的管形瓶中。然后，在37℃下摇动或振荡地孵育该混合物18-22小时。孵育并离心后，采用能提供24个分开的aPL检测结果的综合性内部ELISA aPL形式，来检测孵育后的血液或血清/RBC样品中抗磷脂抗体(aPL)的存在。该检测步骤在下列出版物中有更为详细的描述，这些出版物在此通过引用作为参考：Wagenknecht DR等，TheEvolution，Evaluation and Interpretation of AntiphospholipidAntibody Assays，Clinical Immunology Newsletter，Vol.15 No.2/3(1995)pp28-38和Mclntyre JA等，Frequency and Specificitiesof Antiphospholipid Antibodies(aPL)in Volunteer Blood Donors，Immunobiology 207(1)：59-63，2003。
图1显示了通过采用综合性内部ELISA aPL形式测得的24个分开的aPL特异性。评估了四种特异性，1)aPS＝抗磷脂酰丝氨酸，2)aCL＝抗心磷脂，3)aPE＝抗磷脂酰乙醇胺，以及4)aPC＝抗磷脂酰胆碱。对于这些aPL特异性中的每一种，找出了三种免疫球蛋白同种型IgG、IgA和IgM。分别在缓冲液稀释添加物，10％的成年牛血浆(ABP，其含有磷脂结合性血浆蛋白质)或者1％牛血清蛋白(BSA，其缺乏磷脂结合性血浆蛋白质)存在(依赖)和不存在(独立)时，评测每种特殊性和每种同种型。受试者血液样品的最终稀释度为1/50到1/100之间。
在附图中给出了从在这里描述的各种实验中获得的24个aPL特异性的结果。阳性/阴性判定结果以基于来自775位正常血液供体的测试血浆样品的平均值的倍数(MoM)表示，如在上述Mclntyre JA，Immunobiology中所描述的。“+++”的存在表示抗体的活性强。标记“+”和“++”分别表示抗体活性低和中等。这些图中还给出了每个aPL特异性和同种型组合的正常范围值。
在标示为PL结合蛋白质“依赖型”的列中的阳性结果意味着，抗磷脂抗体(aPL)实际上是与最初已结合于所示特定磷脂的血浆蛋白质相结合。通常可与PS和CL结合的血浆蛋白质包括如下：β2-糖蛋白I、凝血酶原、蛋白C、蛋白S、膜联蛋白V(annexinV)以及补体成分因子H和C4(例如，参见Mclntyre，J.A.，Wagenknecht，D.R.和Faulk，W.P.，Antiphospholipid antibodies：Discovery，definition，detection and disease。Prog.Lipid Res.42(3)：176-237，182页)。对于所有磷脂来说，血浆蛋白质结合的生理特性并没有知道得很精确，但是这种结合被认为诱导了血浆蛋白质结构的构象变化，因此将随后被个体的自身抗体靶定的新的或者隐蔽的表位暴露出来。通常可与磷脂PE结合的血浆蛋白质包括如下：高或者低分子量的激肽原，以及因子IX和前激肽释放酶。后两种蛋白质可通过它们与高分子量激肽原的结合中的重现精度(fidelity)来检测。与PC结合的血浆蛋白质至今还末确定。在一些实验中，对血浆蛋白质独立型aPL进行了观测(见图3)。对这种活性的一种可能的解释为，其表示了存在残余的原始血液样品中存在的磷脂结合性血浆蛋白质。
实施例1
将来自正常受试者的血液样品按照上述过程进行孵育并检测。aPLELISA的结果在图2中显示。如图2所示，与正常范围列中显示的正常、未处理的血液相比，孵育后的血液样品显示了自身抗体活性的显著存在。特别地，对于aPS(IgG)、aCL(所有同种型)和aPE(IgG)的蛋白质依赖型种类显示了强的自身抗体活性。IgG aPC的自身抗体活性低或者不存在是在较早采用氯高铁血红素作为氧化剂的实施例和过程中的一个特征性发现。该结果表明，PC的自身抗体，尤其是IgG同种型，是不同的，而且或许不能以与其它自身抗体相同的方式被活化。在后来的实验中，研究发现，在采用KMnO4处理的样品中也能检测到明显的aPC水平(数据未显示)。
实施例2
将从7位健康的受试者采集的血液样品按照上述过程孵育并检测。特别地，所有7位受试者的血液均在20分钟的时间段内抽取，并在相同的条件下孵育20小时。图3是表示这7份样品的aPL血清转化范围的综合表格。这些结果表明，检测到的aPL水平是变化的，同时在不同个体之间存在同种型。然而，如同本发明所显示的那样，每个个体都具有在孵育后可检测到的aPL抗体。
实施例3
在第一个试验中，将来自正常受试者的血清样品按照上述基本步骤进行孵育并检测。在孵育混合物中，采用马红细胞(RBC)来代替人RBC。aPL ELISA的结果显示于图4中。如图4所示，得到了明显的aPL活性，特别是与aPS(IgG和IgM)和aCL(IgA和IgM)相关的活性。
在第二个试验中，按照上述的基本步骤，将替代了人血清的马血清与人RBC一起孵育并检测。aPL ELISA的结果显示于图5中。如图5所示，未获得aPL活性。(用于该试验的ELISA采用了人-抗体-特异性碱性磷酸酶标记的抗体探针来检测aPL，因此孵育的样品中是否存在马aPL是未知的。)
在图4和5中概括性显示的结果明确地表明，在本发明的血清转化步骤过程中得到的所有aPL均来源于人血清，而且不是由人RBC释放出来的，因为第一个试验中采用了缺乏人抗体的马RBC来替代人RBC，但仍然显示了阳性结果，相反，在第二个试验中在存在人RBC的情况下使用马血清，但显示了阴性结果。
实施例4
将来自正常受试者的血液样品按照上述基本步骤孵育并检测，除孵育在室温(22℃)下进行，来代替较高的温度以外。图6显示，当在室温下孵育时，样品没有发生血清转化。这些结果表明，血清转化步骤可能是温度敏感的。
实施例5
将来自正常受试者的血液样品按照上述基本步骤孵育并检测，其特征在于采用0.7mm Degalan(塑料)小珠作为孵育混合物中的颗粒状固体来代替炭。由于在最初显示血清转化的试验中采用了炭，进行该试验用于确定炭是否在血清转化过程中起着特殊的作用。图7显示，即使在用塑料小珠替代炭时，样品也表现出了血清转化。这些结果表明，本质上，炭的作用是机械的，而不是化学的，而且任何颗粒状固体，例如塑料、树脂或者玻璃珠都可采用。不限于任何特定理论，可以推理出该颗粒状成分起到了RBC膜的磨料的作用，通过与RBCAE1/Band 3蛋白或者SNO-血红蛋白转运分子相互作用，或者与二者都相互作用，可能引起NO离子从RBC中释放。这种机械磨损的可能性得到了实施例6中的观察结果的支持，其中未摇动或振荡的孵育混合物显示了阴性检测结果。特定的固相还起到帮助自身抗体释放的机械作用。
实施例6
将来自正常受试者的血液样品按照上述基本步骤孵育并检测，但孵育混合物保持静止，而不是振荡或者摇动。图8显示，当保持静止时样品没有发生血清转化。这些结果表明，运动可有助于固体颗粒与RBC之间的相互作用。静止的孵育条件不促进aPL的释放，尽管少量的运动，例如通过将样品转移到培养箱中产生的运动，可引起少量aPL的释放。
实施例7
将来自正常受试者的血液样品按照上述基本步骤孵育并检测，增加的特征是在孵育以及通过离心除去RBC和炭后，将孵育混合物加热到56℃30分钟。图9显示通过该过程，检测到的aPL的量明显增加。
实施例8
将来自正常受试者的血液样品按照上述基本步骤孵育并检测，其特征在于采用来自不同供应商(Becton Dickinson，Sparks，MD)的细菌生长培养基来代替来自Biomerieux的细菌生长培养基。图10显示在Becton Dickinson培养基中的样品表现出血清转化，表明本发明的方法不依赖于来自特定供应源的细菌生长培养基。
实施例9
将来自正常受试者的血液样品按照上述基本步骤孵育并检测，其特征在于以厌氧条件下(氮气条件下)的孵育来代替需氧条件下(氧气和CO2存在的条件下)的孵育。图11显示，即使是在厌氧条件下，样品也表现出血清转化，因此本发明的方法不依赖于需氧的环境。
实施例10
将来自正常受试者的血液样品按照上述基本步骤孵育并检测，其特征在于采用K562细胞(人类造血肿瘤细胞系)来代替红细胞。此外，与在本发明的方法中通常采用3-4ml包装的RBC相比，在培养基中仅存在1130万个K562细胞。图12显示，样品呈现出血清转化。
其它实验显示，与其它分离的细胞类型，淋巴细胞，单核细胞以及嗜中性粒细胞一起孵育的样品通常不呈现aPL血清转化。特别地，不仅淋巴和骨髓系列的白细胞不支持aPL的释放，而且称为L14的猪B淋巴细胞的细胞系也不支持其释放(数据未显示)。这些结果表明，血红蛋白可能是孵育混合物中的关键成分，因为K562细胞和RBC都含有血红蛋白，而淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞不含。
实施例11
将来自正常受试者的血液样品按照上述基本步骤孵育并检测，但除细菌生长培养基被用于生长人细胞的细胞培养基RPMI代替以外。图13显示没有血清转化发生。该试验表明了用于本发明目的的细菌培养基中的一些成分的重要性。而RPMI是一种为人细胞设计的培养基，当其代替小瓶培养液时，它不能支持aPL的释放。这两种不同的微生物小瓶培养液(microbiology vial broth)与RPMI的成分列表和比较表明，RPMI中缺少氯高铁血红素和称为维生素K3的甲萘醌(一种人工制备的前维生素K)。众所周知，氯高铁血红素是源自RBC的离子(Fe+++)的卟啉螯合剂，甲萘醌是一种脂溶性维生素。这表明在自身抗体的释放中，氧化还原反应可能起作用。
实施例12
将胎盘脐带血样品按照上述基本步骤培养并检测。胎盘脐带血在婴儿出生后，但在胎盘与子宫壁分离前抽取。在传统的实验室测定中，母亲的血液和婴儿脐带血中都没有显示出有aPL存在。当按照这里描述的本发明的方法处理后，证明了脐带血样品中存在强的aPL抗体活性，如图14所示。这些抗体仅为IgG，这一观察结果是与抗体来源于母体相一致的。由于在出生前母亲将IgG输送给胎儿，该实验似乎表明，通过滋养层上的特定Fcγ受体(FcγRn)传递给胎儿的屏蔽的母体自身抗体，在胎儿血液中仍然保持被胎儿屏蔽。由于在通过本发明的方法进行血清转化之前，母亲的血液和脐带血都显示为aPL-阴性，而且由于没有检测到IgM或IgA免疫球蛋白，因此这些结果支持了在血清转化之后脐带血中观察到的IgG aPL是来源于母体的观点。而且有趣的是，表达FcγRn的滋养层并没有表达HLA抗原。
实施例13
将来自正常受试者的血浆样品按照上述基本步骤孵育并检测，其特征在于用硝普钠(SNP，200毫摩尔)代替了孵育混合物中的RBC。图15显示，样品呈现出血清转化。
由于SNP是强的一氧化氮(NO)供体，因此这些结果提供了在自身抗体释放中涉及NO自由基的支持证据，并进一步支持了RBC和固体颗粒起到从RBC供给NO-作用的理论。除硝普钠以外的其它自由基介导的反应也可引起自身抗体释放。
实施例14
将来自正常受试者的血液样品按照上述基本步骤孵育，并检测其狼疮抗凝血剂活性。狼疮抗凝血剂或者抑制剂是另一种类型的aPL，通常仅能通过功能性实验室测定而被检测到。图16中的结果显示，在取自狼疮抑制剂阴性的个体并按照本发明的方法处理的血清转化的血液中有强的狼疮抗凝血剂(LA)活性。在dRVVT测定中当通过将正常血浆加入到血清转化的培养液中以进行初始校正时，培养1-2小时会导致抑制剂的重新出现。建议该时间帧(time frame)为LA或者未屏蔽的抗体与通过混合研究所引入的相关磷脂结合血浆蛋白质结合所花费的时间由于按1∶1的混合提供了足够的凝血因子水平来校正凝血因子不足的样品中的凝血时间，因而其还排除了凝血因子不足的可能性。正常血浆存在时，稀释的凝血酶原时间(dPT)不校正，并在用正常血浆孵育后观察到凝血时间延长，这表明了强狼疮抑制剂的存在。
实施例15
将来自5位正常受试者的血液样品按照上述基本步骤孵育，并通过荧光显微镜检术来检测其它类型的自身抗体的存在。在按照本发明的教导处理之前，来自这5位个体的血清和血浆样品为阴性。图17中列出了采用Hep-2细胞系鉴定的另外的自身抗体的特异性。鉴定了抗-核仁(硬皮病相关)、抗-核纤层蛋白(在核孔处非常亮)、抗-线粒体(细胞质)以及抗中心粒抗体。结果显示，根据本发明的方法释放的自身抗体还可通过不同的检测方法，如与基于ELISA的检测相对的荧光显微镜检术来检测。结果证实，除aPL以外还有许多种类型的自身抗体，在其血清和血浆于常规的实验室分析中对于这些抗体检测为阴性的个体的血液中被屏蔽。
从这些结果可以预期，还有更多的自身抗体特异性等待通过检测经本发明处理的血液来发现。
实施例16
将来自正常受试者的血液样品按照上述基本步骤孵育，并采用流式细胞术和荧光缀合的抗人IgG抗体来检测其与单核细胞的反应性。采用未处理的集中的(untreated-pooled)正常人血清(NHS)，来自本发明使用的同一正常受试者的血清，和阳性对照人血清进行对比试验。(处理后的血液显示没有与淋巴细胞以及嗜中性粒细胞的自身反应性；这些数据没有显示。)图18示出了通过流式细胞术确定的正常受试者的单核细胞细胞群的前向散射(尺寸)和侧向散射(粒度)分布图。该单核细胞细胞群通过显示与CD 14单克隆抗体的反应性来确定。图19A显示了与NHS的抗-单核细胞反应性。在线性标尺上显示的中值反应性(median reactivity)为743.50。图19B显示了正常受试者血清的自身-抗-单核细胞活性；该受试者不具有对自身单核细胞的抗体活性。显示的中值反应性为737.00。图19C显示了按照本发明的方法处理后，取自图19B中显示的受试者的血液样品的自身-抗-单核细胞活性。中值显示为864.00，表明有强的自身-抗-单核细胞活性。尽管事实为按照本发明的教导处理的血浆按1/8的稀释度使用，但与未稀释的阳性对照血清相比，其显示了更高的与单核细胞的反应性。因此，该实施例表明，按照本发明的方法处理的血液或者血清样品释放了特异性靶标单核细胞的自身抗体。当按照本发明的教导进行处理时，同样的结果也从来自其他个体的另外4份样品中得到了证实。
实施例17
采用RELISA
Figure A20068001330200341
筛选测定法，就抗-核-抗体(ANA)的存在进行对比试验：未处理的脐带血清；按照本发明的方法进行无摇动孵育的脐带血；按照本发明的方法进行处理并摇动的脐带血；来自ANA-阴性健康供体(鉴定为ACS)的未处理血清；以及来自相同ANA-阴性健康供体并按照本发明的方法孵育的血清。如图20中所示，在通过本发明的方法处理的脐带血和血清样品中确定了显著数量的ANA。从图16和17中的结果可以预期，还有更多的自身抗体特异性等待通过检测经本发明处理的血液来发现。
实施例18
为了弄清红细胞在自身抗体释放现象中的作用，设计了采用可模仿红细胞行为的更简单的成分来取代红细胞的实验。在本实验中，红细胞和炭被硝普钠(SNP)和三氯化铁所替代。由于硝普钠是强的一氧化氮制造者，而且众所周知RBC是NO-的载体，因而进行这种替代。加入三氯化铁(FeCl3母液，25uM)作为血红蛋白中铁离子的替代物。
将装有细菌生长培养基和5ml人血浆或血清以及各种浓度的硝普钠(SNP，200μm)和外源三氯化铁(终浓度为4.1μm)(用于代替红细胞和炭)的培养瓶，在37℃下孵育然后加热到56℃30分钟。样品显示了aPL的血清转化，但仅有IgG(数据未显示)。
该结果表明，在抗体去屏蔽时可能涉及NO-，并表明培养瓶中的固相材料的机械作用使红细胞破碎并释放NO-。备选的，NO的释放和改变可导致血红蛋白分子参与氧化还原反应。
实施例19
为了确定将自身抗体去屏蔽的效果是否是由于血清或者血液中含自身抗体的大分子结构的降解引起，或者是否由抗体本身的结合特异性的直接改变所引起，进行了一系列采用商业静脉内免疫球蛋白(IvIg)来代替人血浆或者血清的实验。商业IvIg是来自多个供体的集中的血浆的酒精沉淀级分，通常来自1000-10000个供体。典型地，IvIg主要包含IgG，并通常没有IgA、IgM和其它血浆蛋白质。当通过ELISA测试来测定未处理的IvIg中的自身抗体的存在时，检测结果为阴性。由于其制备方式，IvIg还不含脂蛋白微球、囊泡或其它大分子结构。因此，如果孵育处理后IvIg的自身抗体的存在检测为阳性，则必然该自身抗体是通过已经存在于IvIg制剂中的IgG抗体的改变而获得的，而不是通过隐藏自身抗体的结构或者囊泡的降解来获得的。
在下面的实施例中，使用的商业IvIg制剂为冻干的IvIg(ImmuneGlobulin Intravenous(Human)Gammar-PI.V.，Aventis Behring，Kankakee，Illinois)。
5克商业的冻干IvIg的制剂在无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS，100mg/ml)中复原。将1.7ml复原的IvIg溶液加入到装有细菌生长培养基(不含红细胞或炭)的培养瓶中，并于37℃孵育20小时。经温育的混合物显示了血清转化和aPL IgG的存在(数据未显示)。(如同预期的那样，仅检测到IgG，而没有检测到IgA或者IgM)。
在相似的试验中，在室温下于摇瓶中孵育的混合物中检测到了自身抗体，但结果不如在37度下的那么好(结果未示出)。
将IvIg-细菌生长培养基混合物加热到37℃以上未导致自身抗体的进一步增加。
作为对照，直接将IvIg从培养瓶中取出来检测aPL和其它自身抗体，结果为阴性。
实施例20
在实施例19中，表明自身抗体可通过在细菌生长培养基中培养商业IvIg制剂来获得。下一步是试图测定细菌生长培养基中哪些成分在产生可检测的自身抗体中起作用。
首先，将2％胰胨豆胨培养液(TSB)(其含有酪蛋白的胰消化物(pancreatic digest)∶大豆的木瓜消化物(papaya digest)＝17∶3的蛋白胨)(余量为水)中的IvIg在37℃下振荡孵育20小时。检测经孵育的混合物中aPL的存在，结果为阴性。
接着，将IvIg在含有大豆培养液、硝普钠(SNP)和氯高铁血红素(一种含铁(三价铁)的原卟啉)的试管中于37℃下振荡孵育20小时。采用的量为在总量为1ml的大豆培养液中含60微升的IvIg，5微升的SNP和5微升的氯高铁血红素。经孵育的混合物中aPL的存在测定为阳性，特别是aPS(15MoM)和aPE(41MoM)。(数据未显示)。
实施例21
进行了一系列实验来测定只使用氯高铁血红素的孵育是否足以在IvIg中或者在血浆或血清中引起自身抗体的出现。
将复原的冻干IvIg(浓度为100mg/ml)加入含有氯高铁血红素的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中并在37℃下孵育20小时。使用量为300μl的IvIg溶液和5μl的氯高铁血红素溶液(75μg)，总体积为1ml。
如图21所示，经孵育的混合物显示出显著量的aPS和aPE的IgG，以及较少量的aCL的IgG。
当血清或者血浆与氯高铁血红素在相似的条件下孵育时，没有检测到自身抗体。
实施例22
当IvIg与氯高铁血红素一起培养可获得自身抗体存在的阳性结果，相反，当血清或者血浆与氯高铁血红素一起培养却获得阴性结果，这一事实表明，血清或者血浆可能含有抑制或者干扰获得自身抗体的过程的物质。
在一系列实验中，与实施例21中的步骤相似，IvIg在Tris缓冲液中与氯高铁血红素一起在37℃下孵育20小时，但增加了在孵育前将逐渐增加量的人血清(发明人的)加入到这些批料(batch)中这样的特征。检测每一批中aPS、aCL、aPE和aPC自身抗体的存在，结果显示于图22中。图22中显示的结果表明，增加量的血清对抗磷脂抗体的释放具有抑制效应。当以血浆代替血清时显示了相似的结果(数据未显示)。对于这些结果的一种可能的解释是，含有三价铁状态的铁分子并已知可作为活性氧化剂的氯高铁血红素，可起到氧化某些免疫球蛋白分子的结合位点的作用，从而使改变的结合位点能够与自身的抗原结合。该过程可被血液中的一些物质，可能是抗氧化剂所抑制。
实施例23
用Tris缓冲液将人血清(发明人的)稀释至1/10。在一系列实验中，1ml为一批的这种稀释的血清与逐渐增加量的氯高铁血红素一起孵育，具体是，0μl、10μl、25μl和50μl。(以前发现氯高铁血红素本身不足以引起自身抗体从血液或血清中释放，尽管其足以引起从IvIg中的释放。因此，对血清进行稀释的目的是稀释任何血液中存在的干扰物质的影响，例如抗氧化剂。)测定这些批中aPS、aCL、aPE和aPC自身抗体的存在，结果显示于图23中。图23中显示的结果表明，尽管当加入0或者10μl的氯高铁血红素时，在稀释的血清中没有检测到明显量的自身抗体，但加入25μl的氯高铁血红素时，可以检测到明显量的自身抗体。出于未知的原因，加入50μl的氯高铁血红素时，检测到的自身抗体的量较少。
实施例24
设计了下一系列试验来确定血液中存在的抗氧化剂如维生素C是否将会抑制自身抗体的释放。在一系列实验中，IvIg在Tris缓冲液中与氯高铁血红素一起孵育，但增加了在加入IvIg之前和孵育前将逐渐增加量的抗坏血酸(维生素C)加入到含氯高铁血红素的缓冲液中并使其混合30分钟这样的特征。如图24中所示，大约有78％的氯高铁血红素-诱导的aPE的释放被1mg的维生素C抑制，该维生素C的量代表了维生素C的生理浓度。
存在aPS释放的双相曲线(biphasic curve)，其增加了低浓度的维生素C可作为氧化剂，但在高浓度时变成抗氧化(还原)剂的可能性。
实施例25
设计了下一系列试验来确定氯高铁血红素溶解于其中的载体是否对获得的结果有影响，以及氯高铁血红素中的铁原子是否必须。在一系列实验中，IvIg在Tris缓冲液中与氯高铁血红素或与其它添加剂一起孵育。特别地，在一个例子中，氯高铁血红素用NaOH溶解。在另一个例子中，其用DMSO溶解。在其他例子中，采用一种与氯高铁血红素相同但不合铁(Fe+++)的分子，血卟啉IX(hpIX)来替代氯高铁血红素，并用NaOH或DMSO溶解。在其它例子中，以NaOH和DMSO作为对照进行检测(不加氯高铁血红素或者hpIX)。如图25所示，使用NaOH溶解的氯高铁血红素产生了自身抗体存在的阳性结果，而氯高铁血红素+DMSO、hpIX+NaOH、hpIX+DMSO、只有NaOH和只有DMSO都不产生阳性结果。
实施例26
为了进一步确认氯高铁血红素引起抗体的氧化，将等摩尔量的血红素结合蛋白(Hpx)加入到IvIg PBS氯高铁血红素混合物中。Hpx是一种对血红素铁具有极高结合亲和力的抗氧化分子。购自SciPac(Kent，England)的冻干Hpx以10mg/ml在PBS中复原。图26中显示的为加入逐渐增加浓度的氯高铁血红素到IvIgG中，并相应地加入等摩尔浓度的Hpx而得到的aPS的氧化还原数据。由于氯高铁血红素和Hpx的结合相互作用为1∶1，所以Hpx能够消除氯高铁血红素中存在的铁离子的氧化还原能力。
实施例27
为了说明可通过IvIg氧化处理得到的自身抗体的广泛范围和活性，采用氯高铁血红素处理的IvIg或者未处理的IvIg作为一级抗体，并采用抗-人HRP标记的缀合物作为对照(HRP＝辣根过氧化物酶)，使用来自3种不同细胞系的细胞裂解产物建立了一系列蛋白质印迹实验。印迹显示于图27中。“B”裂解产物是取自淋巴瘤患者的称为Raja的B淋巴细胞系。“T”裂解产物是再次取自白血病患者的称为Jurkat的T-淋巴细胞-来源的细胞系。U87MG裂解产物为恶性胶质瘤母细胞系(脑癌)。还原的裂解产物以50mg/ml的浓度在凝胶中进行电泳。为了获得氯高铁血红素处理的IvIg制剂，将75μg的氯高铁血红素与1ml含有6mg IvIgG的PBS结合。在37度下孵育20小时。在图27中，将其中采用氯高铁血红素-处理的IvIg作为一级抗体的印迹标记为“测试IgG”；其中采用未处理的IvIg作为一级抗体的印迹标记为“对照”，而将不采用一级抗体而施加了抗-人HRP-标记的缀合物的印迹标记为“Secondary”。氯高铁血红素-处理和未处理的IgG制剂分别稀释1/1000。采用的抗-人HRP-标记的缀合物稀释度为1/5000。
这些数据清楚的显示，与不显示活性的未处理的IvIgG和缀合物对照相比，氯高铁血红素-处理的IvIg对人细胞成分具有丰富的活性。
实施例28
进行了下一实验来确定除氯高铁血红素之外的氧化剂，特别是不含铁的氧化剂是否能有效地使自身抗体去屏蔽。将总体积为1ml的磷酸缓冲盐溶液中的100μM浓度的25μg高锰酸钾(KMnO4)和2mgIvIg的混合物于37℃下孵育过夜。在经温育的混合物中，可检测到aPC和aPS。aCL通常能检测到，但不能检测到aPE(数据未显示)。后来确定了为什么未检测到aPE的原因是由于KMnO4改变了在ELISA检测中使用的PE磷脂抗原。
实施例29
在说明了自身抗体可通过氧化反应去屏蔽以后，下一问题是是否电化学方法，例如电池提供的电动势能够达到同样的效果。
将IvIg溶解于磷酸缓冲盐溶液中，并且在每个试验中，将镀锌钢、铜、或者不锈钢电极与9伏电池的正极和负极端子连接，并浸入到溶液中1-2分钟。在该过程中，在溶液中观察到起泡现象，而且PBS溶液的颜色发生了改变(当采用铜导线时为蓝色，采用不锈钢导线时为棕色而采用镀锌钢导线时为绿色)。如图28A和28B中所示，处理的溶液在aPL依赖型测试中检测到aPS、aCL、aPE和aPC自身抗体的存在为阳性，在aPL独立型测试中检测到aPS、aPE和aPC自身抗体的存在为阳性。
实施例30
为了避免金属与溶液相互作用并从而确定只有电流的影响，采用石墨电极来代替金属电极。石墨是惰性的，但能够将电子传递到导电溶液中而不参与反应。
将IvIg溶解于磷酸缓冲盐溶液中，并将与6伏电池的正极和负极端子连接的石墨电极浸入到溶液中60秒。如图29所示，处理的溶液检测到aPS、aPE和aPC自身抗体的存在为阳性。
实施例31
在涉及将电流施加到磷酸缓冲盐溶液中的IvIg溶液中的实验之中，我们注意到pH明显增加，可能是由于形成了NaOH。为了保持反应在生理pH水平下进行，用细胞培养基RMPI来代替磷酸缓冲盐溶液。
进行了下一系列实验来测定暴露于电流中的时间对自身抗体的去屏蔽的影响。将IvIg溶解于RMPI这种细胞培养基中，并将与6伏电池的正极和负极端子连接的石墨电极以各种时间长度浸入溶液中。如图30所示，在暴露于电流中60秒后得到了依赖型aPL的最大释放。奇怪的是，在2分钟到4分钟的时间内，aPL的量下降或者消失。
实施例32
由于前面的实验已经表明aPL抗体能通过将IvIg暴露于电流后获得，但进一步暴露于电流后aPL抗体会消失，因此下一问题是，自身抗体的去屏蔽是否能通过电流来逆转。也就是说，阳性对照血清是否能处理成不再能检测到自身抗体呢？
在每个实验中，通过将与6伏电池的正极和负极端子连接的石墨电极浸入到按1∶400稀释的aCL阳性对照血清、按1∶75稀释的aPE阳性对照血清和按1∶400稀释的aPS中至多240秒，使它们暴露于电流中。如图31A-31C所示，每种对照血清各自的特异性都变成了阴性。
实施例33
基于实施例32中的结果，下一要问的问题是，如果将患者的血清暴露于电流中，患有自身免疫疾病的患者的自身抗体是否能够被重新屏蔽。将取自具有升高水平的aPS和aCL的患者的血清用磷酸缓冲盐溶液按1/400稀释(在PBS中的稀释的量以能使OD值在10-15分钟内达到1.000为准)，并将与6伏电池的正极端子和负极端子相连的石墨电极浸入到溶液中不同的时间。如图32所示，在自身免疫患者血清样品中可检测到的aCL和aPS的量在30秒后明显下降，并且在2分钟之后不再能够检测到。这些实验采用其他患者的抗体重复进行，并得到了相同的结果(数据未显示)。
实施例34
在早期的实验中，将取自具有非常特异性和高的滴度IgA aPE的患者的血液样品暴露于常规微生物培养瓶中的氯高铁血红素。我们观察到在暴露于氯高铁血红素之后，她的IgA aPE消失了，并且在aPLELISA中检测到出现了IgG aPS、aCL，而且最惊人的是，检测到了IgGaPE。那时，对这种现象的解释还不那么容易弄清楚。
在发现采用电流能更快地去屏蔽方法之后，使得通过另一位具有高aPE的患者来证明早期的结果成为可能。在本实验中，将取自具有高aPE的患者的血清在PBS中按1/75稀释，并将与6伏电池的正极和负极端子相连的石墨电极浸入到溶液中不同时间。如图33所示，在施加6伏的DC电流30秒内，伴随着去屏蔽和检测到aPS和aCL IgG，aPE变得不可检测(被屏蔽)。刚刚去屏蔽的aPL的峰值出现仅仅大约30秒，在暴露2-4分钟后又再次被屏蔽。
上述试验所提出的一个重要的技术方面是，对患者的PE进行处理使其从测定中所采用的血浆蛋白稀释液中除去，在本发明的情况下，血浆蛋白稀释液为10％的成年牛血浆(ABP)。在其他未显示的实验中，在加入ELISA稀释液中使用的血浆蛋白质之前，将稀释的患者血清暴露于6伏EMF条件下。这些实验的重要方面在于，表明了EMF影响患者的抗体，而不是稀释液中使用的血浆蛋白质的EMF改变。
这些实验数据支持了氧化还原反应决定了不同抗体特异性的出现和消失这一观察结果。从这些实验中我们还认识到，氧化还原作用似乎局限于抗体结合位点，即抗体分子的Fab部分。这是因为，在缀合物持续识别抗体分子的不同抗体重链靶标(Fc部分)时，在ELISA中使用的异源抗人抗体标记的缀合物没有受到影响。因此，当人抗体没有被氧化还原消耗或者破坏时，最令人信服的解释是，抗体分子的Fab部分中的抗体结合位点带有可获得的电子，其参与了氧化/还原过程。
实施例35
进行了下面的实验来观察除了自身抗体之外的血浆蛋白质的结合特异性是否能被氧化-还原所改变。在这些实验中，将10％成年牛血浆(ABP)溶液，即已用于测定蛋白质依赖型aPL结合的含有磷脂结合性蛋白质的相同溶液，暴露于6伏特电池的电流中不同时间。然后将处理后的ABP样品用于aPS-、aCL-和aPE-阳性患者血清的ELISA测定，来观察对ABP的处理是否对ELISA结果有影响。如图34所示，在时间为零时(未处理的ABP)，阳性患者的血清给出了通常见到的在ABP中的aPL响应。当10％的ABP暴露于氧化-还原(EMF)一段时间时，检测到的aPL的量减少，并且在2分钟后，aPE阳性血清不再为阳性。这些结果表明，对患者aPL反应性负责的血浆蛋白质通过暴露于电流中而改变。例如，由于激肽原是负责为aPE依赖型反应提供阳性ELISA信号的血浆蛋白质(激肽原与PE结合，然后抗体与激肽原结合，然而aPE将不会与PE或者激肽原单独结合)，因而这表明ABP样品中的激肽原通过氧化还原暴露而发生了改变。在暴露240秒时aCL也呈现阴性，并且由于该患者血清需要凝血酶原和/或β2糖蛋白(或者两种物质都涉及)以在aPL ELISA中产生阳性信号，因而这两种蛋白质也必须通过氧化还原反应来改变。同样的两种蛋白质均在aPS实施例中涉及到。
实施例35
进行了一项试验来观察人母乳中是否含有自身抗体。在这个试验中，取自5个月大婴儿的母亲的母乳中的aPS、aCL、aPE和aPC水平在用氯高铁血红素处理之前和之后测定。如图36所示，检测到的每种自身抗体的量，如通过CD测定的，在用氯高铁血红素处理过的样品中显著增加。从而，可得出结论，人母乳中含有屏蔽的抗体。因此，本发明进一步提供了含有补充有屏蔽的人抗体的非人奶，例如牛奶或羊奶产品。
实施例36
进行了一项试验来观察人脑脊髓液中是否含有自身抗体。在这个实验中，通过脊椎穿刺从正常个体中获取脊髓液，并在用氯高铁血红素处理之前和之后，检测BSA和ABP稀释缓冲液中的样品的aPS、aCL、aPE以及aPC水平。如图36A和36B所示，在处理之前，样品没有显示或显示极微的抗磷脂抗体水平，并且在处理后该水平明显增加，同时aPE和aPC在BSA缓冲液中显示出最高的水平，而aPS和aCL在ABP缓冲液中显示出最高的水平。
实施例37
对氯高铁血红素-处理的IgG和对照IgG进行抗-硝基酪氨酸测定，来确定在氯高铁血红素-处理的IgG和对照IgG样品之间是否存在硝基酪氨酸残基的量的不同。将ELISA平板孔用氯高铁血红素-处理的IgG和对照IgG包被，干燥过夜，用1％的BSA封闭，将其洗涤并与小鼠抗-硝基酪氨酸(1/3000，Upstate，USA，克隆1A6)起反应。洗涤后，加入缀合有碱性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG(Sigma，St.Louis，Missouri)。在另外的洗涤之后，在37℃下进行底物显影2小时并定量测定。如图37所示，在经处理的IgG中显示出明显更大的硝化作用。这一发现提供了对根据本发明方法改变抗体的结合特异性受到抗原结合位点处，或其附近的酪氨酸残基的亚硝基化作用的影响这一理论的支持，所述的亚硝基化作用可引起影响结合位点的结合特异性的构象变化。
实施例38
将IvIg与氯高铁血红素一起孵育，并采用流式细胞术和缀合有荧光的抗人IgG抗体检测与中性粒细胞的反应性。用未处理的IvIg进行对照实验。图38A显示了没有IvIg NHS的抗-中性粒细胞反应性。图38B显示了未处理的IvIg的自身-抗中性粒细胞活性。图38C显示了1mg氯高铁血红素-处理的IvIg的自身-抗-中性粒细胞活性，而图38D显示了3mg氯高铁血红素-处理的IvIg的自身-抗中性粒细胞活性，显示出强的自身-抗中性粒细胞活性。因而，可发现按照本发明方法处理的IvIg释放了特异性靶标中性粒细胞的自身抗体，其含有膜结合过氧化物酶，尤其含有NADPH氧化酶。这些结果表明，未屏蔽的抗体可参与任何涉及“突发性呼吸”和超氧离子形成的反应。
实施例39
进行一些实验来观察自身抗体是否能在其它动物中检测。在这些试验中，在用氯高铁血红素处理之前和之后测定马血浆中的aPS、aCL、aPE和aPC水平。如图39A和39B所示，检测到的每种自身抗体的量，如通过CD测定的，在用氯高铁血红素处理的样品中显著增加。因此，可得出结论，马血浆中含有屏蔽的抗体。在类似的试验中，在鸡中检测到IgY同种型的自身抗体(数据未显示)。
显然，按照上面的教导，本发明的许多修改和改变形式是可能的。因此应该理解，在附加的权利要求范围内，可以不同于具体描述的实践本发明。

Claims (56)

1.一种包括如下步骤的方法：
提供组合物，其含有至少一种悬浮或溶解于流体介质中的蛋白质，该蛋白质具有可通过改变其氧化还原状态而可逆地改变的结合特异性，以及
将该组合物暴露于足以可逆地改变所述蛋白质的结合特异性的氧化剂或者电势中。
2.权利要求1的方法，其中所述的流体介质包括天然含有所述蛋白质的体液。
3.权利要求2的方法，其中所述的体液来自脊椎动物。
4.权利要求2的方法，其中所述的体液来自哺乳动物或鸟类。
5.权利要求2的方法，其中所述的体液来自人。
6.权利要求2的方法，其中所述的体液包括稀释的或未经稀释的全血、血清、血浆、全牛乳、淋巴液或CNS液。
7.权利要求1的方法，其中所述组合物包含静脉内免疫球蛋白(IvIg)。
8.权利要求1的方法，其中所述蛋白质是IgG、IgA或者IgM同种型的抗体。
9.权利要求1的方法，其中所述蛋白质是IgG、IgA或者IgM同种型的自身抗体。
10.权利要求1的方法，其中所述蛋白质是除抗体之外的蛋白质。
11.权利要求1的方法，其中所述氧化剂是含有配位金属原子的环状化合物。
12.权利要求1的方法，其中所述氧化剂是含有配位铁原子的环状化合物。
13.权利要求1的方法，其中所述氧化剂是氯高铁血红素。
14.权利要求1的方法，其中所述氧化剂是KMnO4或NaIO4。
15.权利要求1的方法，其中所述氧化剂是叶绿素。
16.权利要求1的方法，其中所述氧化剂是具有被还原能力的分子，其通过作为其它起电子供体作用的分子的电子受体而被还原。
17.权利要求1的方法，其中所述蛋白质在该蛋白质的抗原或配体结合位点处含有至少一个酪氨酸残基，并且其中所述氧化剂或电势通过促进所述抗原结合位点或配体结合位点处的至少一个酪氨酸残基的可逆的酪氨酸亚硝基化作用，来改变该蛋白质的结合特异性。
18.权利要求1的方法，其中所述蛋白质的结合特异性从其中该蛋白质不具有对特定抗原或配体的结合特异性的状态，变成了其中该蛋白质具有结合所述特定抗原或配体的能力的状态。
19.一种方法，所述方法包括下列步骤：
提供包括生物流体或者生物流体提取物的组合物，其中该生物流体或提取物含有至少一种屏蔽的蛋白质，该蛋白质具有这样的结合位点，即该结合位点具有可通过改变其氧化还原状态而改变的结合特异性，
将该组合物暴露于足以改变所述屏蔽的蛋白质的结合特异性的氧化剂或者电势中，由此使该蛋白质去屏蔽，以及
检测组合物中的去屏蔽的蛋白质和/或从组合物中回收该去屏蔽的蛋白质。
20.权利要求19的方法，其中所述的生物流体包括稀释的或未经稀释的全血、血清、血浆、胎盘脐带血、奶、淋巴液或CNS液。
21.权利要求19的方法，其中所述的生物流体是来自多位受试者的汇集的全血、血清或血浆。
22.权利要求19的方法，其中所述的屏蔽的蛋白质是抗体。
23.权利要求19的方法，其中所述的屏蔽的蛋白质是IgA自身抗体，而所述的生物流体是哺乳动物的奶。
24.权利要求19的方法，其中所述的屏蔽的蛋白质是IgG自身抗体，并且其中所述的生物流体是CNS液。
25.权利要求19的方法，其中所述的屏蔽的蛋白质选自：
谷氨酸脱羧酶(GAD)特异性抗体；
酪氨酸磷酸酶(IA-2)特异性抗体；
抗-狼疮抗凝血剂抗体；
抗-磷脂抗体；
抗-核抗体(ANA)；
抗-核纤层蛋白抗体；
抗-核仁抗体；
抗-核膜抗体；
抗-线粒体抗体；
抗-Golgi抗体；
抗-粒细胞抗体；
抗-中性粒细胞抗体；
抗-单核细胞抗体；
抗-B淋巴细胞抗体；
抗-髓过氧化物酶抗体；
抗-肿瘤细胞抗体；
抗-营养细胞抗体；
抗-HLA抗体；
抗-因子VIII抗体；
抗-血小板因子4/肝素复合物抗体；以及
抗-β2-糖蛋白I抗体。
26.权利要求19的方法，其中所述的屏蔽的蛋白质选自抗心磷脂、抗磷脂酰胆碱、抗磷脂酰乙醇胺和抗磷脂酰丝氨酸的抗体。
27.权利要求19的方法，其中所述屏蔽的蛋白质在该蛋白质的抗原或配体结合位点处含有至少一个酪氨酸残基，并且其中所述氧化剂或电势通过促进所述抗原或配体结合位点处的至少一个酪氨酸残基的可逆的酪氨酸亚硝基化作用，来改变该蛋白质的结合特异性。
28.一种从含有抗体的生物流体或者含有抗体的生物流体提取物中检测和/或获得并分离自身抗体的方法，所述生物流体或提取物含有在进行该方法之前不能与自身抗原结合，因而不能通过基于自身抗原的受体-配体结合的测定来检测的自身抗体，该方法包括如下步骤：
将该生物流体或提取物暴露于足以改变该自身抗体的结合特异性的氧化剂或者DC电流中，使所述自身抗体变得能够与抗原结合，由此使其变得可检测，并可通过受体-配体结合分离方法从所述生物流体或者提取物中回收，以及
在生物流体中检测自身抗体和/或从生物流体中分离和回收该自身抗体。
29.权利要求28的方法，其中所述的生物流体来自脊椎动物。
30.权利要求28的方法，其中所述的生物流体来自哺乳动物或鸟类。
31.权利要求28的方法，其中所述的生物流体来自人。
32.权利要求28的方法，其中所述的生物流体包括稀释的或未经稀释的全血、血清、血浆、全牛乳、淋巴液或CNS液。
33.权利要求28的方法，其中所述生物流体包括从多位受试者汇集的，稀释的或未经稀释的全血、血清、血浆、全牛乳、淋巴液或CNS液。
34.权利要求28的方法，其中所述的组合物包含静脉内免疫球蛋白(IvIg)。
35.权利要求28的方法，其中所述的自身抗体是IgG、IgA或IgM同种型。
36.权利要求28的方法，其中所述的生物流体是哺乳动物的奶，而所述的自身抗体是IgA自身抗体。
37.权利要求28的方法，其中所述的生物流体是CNS液，而所述的自身抗体是IgG自身抗体。
38.权利要求28的方法，其中所述氧化剂是含有配位金属的环状化合物。
39.权利要求28的方法，其中所述氧化剂是含有配位铁的环状化合物。
40.权利要求28的方法，其中所述氧化剂是氯高铁血红素。
41.权利要求28的方法，其中所述氧化剂是KMnO4或NaIO4。
42.权利要求28的方法，其中所述氧化剂是叶绿素。
43.权利要求28的方法，其中所述氧化剂是具有被还原能力的分子，其通过作为其它起电子供体作用的分子的电子受体而被还原。
44.权利要求28的方法，其中所述的自身抗体选自：
谷氨酸脱羧酶(GAD)特异性抗体；
酪氨酸磷酸酶(IA-2)特异性抗体；
抗-狼疮抗凝血剂抗体；
抗-磷脂抗体；
抗-核抗体(ANA)；
抗-核纤层蛋白抗体；
抗-核仁抗体；
抗-核膜抗体；
抗-线粒体抗体；
抗-Golgi抗体；
抗-粒细胞抗体；
抗-中性粒细胞抗体；
抗-单核细胞抗体；
抗-B淋巴细胞抗体；
抗-髓过氧化物酶抗体；
抗-肿瘤细胞抗体；
抗-胰岛细胞抗体；
抗-营养细胞抗体；
抗-HLA抗体；
抗-因子VIII抗体；
抗血小板因子4/肝素复合物抗体；以及
抗-β2-糖蛋白I抗体。
45.权利要求28的方法，其中所述的屏蔽的蛋白质选自抗心磷脂、抗磷脂酰胆碱、抗磷脂酰乙醇胺和抗磷脂酰丝氨酸的抗体。
46.一种分离的免疫球蛋白，所述的免疫球蛋白的抗原结合位点具有可通过其氧化还原状态的改变而可逆地改变的结合特异性。
47.权利要求45的分离的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白暴露于氧化剂后，该免疫球蛋白分子变得能够特异性结合自身抗原。
48.权利要求45的分离的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白在抗原结合位点具有至少一个酪氨酸残基，并且其中氧化还原状态的改变通过实现添加或除去至少一个酪氨酸残基的硝酸基团，改变了该免疫球蛋白的结合特异性。
49.权利要求47的分离的免疫球蛋白，其中从至少一个所述免疫球蛋白的酪氨酸残基添加或除去硝酸基团诱导了该免疫球蛋白抗原结合位点的构象变化。
50.权利要求45所述的分离的免疫球蛋白，其中所述的免疫球蛋白选自：
谷氨酸脱羧酶(GAD)特异性抗体；
酪氨酸磷酸酶(IA-2)特异性抗体；
抗-狼疮抗凝血剂抗体；
抗-磷脂抗体；
抗-核抗体(ANA)；
抗-核纤层蛋白抗体；
抗-核仁抗体；
抗-核膜抗体；
抗-线粒体抗体；
抗-Golgi抗体；
抗-粒细胞抗体；
抗-中性粒细胞抗体；
抗-单核细胞抗体；
抗-B淋巴细胞抗体；
抗-髓过氧化物酶抗体；
抗-肿瘤细胞抗体；
抗-胰岛细胞抗体；
抗-营养细胞抗体；
抗-H LA抗体；
抗-因子VIII抗体；抗-platlet factor 4/肝素复合物抗体；以及
抗-β2-糖蛋白I抗体。
51.一种治疗受试者中的自身免疫疾病的方法，所述方法包括给患有自身免疫疾病的受试者施用一定量的抗氧化剂的步骤，该抗氧化剂的量足以抑制或改变所述受试者体内自身抗体结合位点的氧化激活作用。
52.一种治疗自身免疫疾病的方法，该方法包括如下步骤：
从患有自身免疫疾病的受试者中抽取血液样品，
将所述血液样品暴露于足以改变所述血液样品中的自身抗体结合位点的氧化激活作用的抗氧化剂或者DC电流中，以及
将血液样品返回受试者体内。
53.一种方法，所述方法包括下列步骤的方法：
检测取自受试者的第一份生物流体样品，以测定样品中可检测的自身抗体的量和/或类型，
通过将来自受试者的第二份相同类型的生物流体样品暴露于氧化剂或DC电流，来处理这第二份样品，并检测所述的第二份样品以测定第二份样品中可检测的自身抗体的量和/或类型，以及
将第一份样品中可检测的自身抗体的量和/或类型与第二份样品中可检测的自身抗体的量和/或类型进行比较。
54.一种确定化合物或氧化还原状态的改变对受试者生物流体中抗体的量或类型的影响的方法，所述的方法包括下列步骤：
检测取自受试者的第一份生物流体样品，以测定样品中可检测的自身抗体的量和/或类型
通过将来自受试者的第二份相同类型的生物流体样品暴露于该化合物或者改变所述样品的氧化还原状态，来处理这第二份样品，检测所述的第二份样品以测定该第二份样品中可检测的自身抗体的量和/或类型，以及
将第一份样品中可检测的自身抗体的量和/或类型与第二份样品中可检测的自身抗体的量和/或类型进行比较。
55.一种产品，包括已经暴露于足以使其中包含的至少一种蛋白质的结合特异性发生可逆改变的氧化剂或者DC电流的生物流体或者含蛋白质的生物流体提取物。
56.一种产品，所述的产品包括已经加入来自人母乳的屏蔽的抗体至其中的非-人奶。
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PB01 Publication
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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