MX2007011991A - Metodo para el analisis de una muestra de sangre, y aparato y reactivo para su implementacion. - Google Patents
Metodo para el analisis de una muestra de sangre, y aparato y reactivo para su implementacion.Info
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Abstract
La invencion se relaciona con un metodo para analizar una muestra de sangre que incluye las siguientes etapas: formar en un recipiente unico denominado de dilucion y analisis una solucion de analisis que contiene dicha muestra de sangre, un diluyente y por lo menos un compuesto para lisar electrocitos; y por lo menos un compuesto para estabilizar hemoglobina en forma de un complejo cromogenico; medir por espectrofotometria la concentracion de hemoglobina en la solucion de analisis en el recipiente despues de la lisis de los eritrocitos y extraer una cantidad apropiada de dicha solucion de analisis en el recipiente en el mismo se realiza un conteo diferencial leucocitica por un medio optico. La invencion esta caracterizada porque la solucion de analisis contiene ademas por lo menos un compuesto para proteger los leucocitos, permitir que se puedan diferenciar por lo menos cuatro subpoblaciones principales de leucocitos. La invencion tambien se relaciona con un aparato hematologico para implementar dicho metodo.
Description
MÉTODO PARA EL ANÁLISIS DE UNA MUESTRA DE SANGRE, Y APARATO Y REACTIVO PARA SU IMPLEMENTACION
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método para el análisis de una muestra de sangre asi como un aparato y reactivo para su implementación. Más particularmente, la invención se relaciona con el campo de el análisis automático de las muestras de sangre. El análisis de una muestra de sangre generalmente busca determinar: el número total de leucocitos; más específicamente, el número de leucocitos por subpoblaciones (basófilos, eosinófilos, neutrófilos, monocitos y linfocitos); el número de eritrocitos y plaquetas; y la concentración de hemoglobina. Se conocen diversas técnicas de análisis, en particular: - el análisis de la hemoglobina se lleva a cabo después de la lisis de los eritrocitos, es decir, la destrucción de la membrana de las células de eritrocitos y por medición de espectrofotometria de la hemoglobina liberada en el medio; el análisis y la hemoglobina también requiere la estabilización de la hemoglobina en forma complejada (oxihe- Ref . : 186278 moglobina o cianometahemoglobina) con el fin de medir de absorbancia de un compuesto único a la longitud de onda apropiada; el conteo de leucocitos total se lleva a cabo en la muestra de sangre por resistividad con lisis especifica de los eritrocitos y protección de los leucocitos; diferenciación de los leucocitos y conteo de los mismos por subpoblación, la cual se lleva a cabo: ya sea por resistividad de la medición volumé-trica después de lisis especifica de los eritrocitos, protección de los leucocitos y ajuste del pH; no obstante, esto no permite la diferenciación de todas las subpoblaciones en un análisis único; o por medios ópticos, en particular por citometria de flujo; después de lisis especifica de los eritrocitos y protección de los leucocitos, al medir parámetros diferentes (en particular difracción, fluorescencia, absorbancia), en un flujo de leucocitos en el eje de los ángulos estrecho, medio y amplio y opcionalmente después de la adición de un agente marcador (por ejemplo negro de clorazol o un colorante marcador de AND o ARN, o un colorante fluorescente) y al medir las longitudes de onda diferentes; esta técnica permite la diferenciación de las subpoblaciones de leucocitos; - el conteo eritrocitica y plaquetaria se lleva a cabo en una muestra diluida sin la adición de un reactivo especifico por medición de resistividad. Existen numerosos analizadores automáticos de células sanguíneas las cuales utilizan estas técnicas con el fin de obtener un análisis de muestra de sangre el cual sea tan completo como se pueda. En estos aparatos automáticos tradicionalmente coexisten dos circuitos de análisis diferentes: un primer circuito diseñado para medir la hemoglobina y/o el conteo leucocitica total; y un segundo circuito diseñado para llevar a cabo en la muestra de sangre la diferenciación y/o el conteo leucocitica por citometria de flujo. Cada circuito está caracterizado por una velocidad de dilución de la muestra de sangre adecuada para el medio de medición utilizado, la adición de uno o más reactivos y medios apropiados para implementación y medición. Asi, para la medición de hemoglobina y el conteo de leucocitos, el circuito típicamente comprende lo que se deno-mina un recipiente contador en el cual se diluye la muestra de sangre, un reactivo en particular comprende el compuesto de lisis de los eritrocitos, el compuesto de estabilización del complejo formado de la hemoglobina y el compuesto leucoprotector se agrega al mismo, y después se mide directamente en esta celda; la hemoglobina por espectrofotometria y el número de leucocitos por resistividad. La tasa de dilución se selecciona de manera que la solución de análisis sea perfectamente homogénea y de esta manera el aparato de detección no se sature. Esta tasa de dilución está comprendida entre 1/100 y 1/500, generalmente entre 1/160 y 1/180. Para diferenciación leucocitica por citometria de flujo, el circuito utiliza un recipiente para dilución de la muestra de sangre al cual uno o más reactivos que contienen un agente de lisis de eritrocitos y opcionalmente un agente de diferenciación (por ejemplo un colorante fluorescente para ADN o ARN de leucocitos) se agrega, después una fracción de esta solución de toma con el fin de inyectarla en un recipiente óptico de flujo pasante de un citómetro de flujo. La tasa de dilución utilizada aqui es menor de 1/100 lo que permite que se obtenga un tiempo de análisis óptimo con los citómetros disponibles actualmente en el mercado (del tipo de hidroenfoque) . Asi, convencionalmente, por lo menos dos reactivos habitualmente deben utilizarse para los dos circuitos de análisis y se llevan a cabo dos diluciones diferentes de la muestra de sangre en estos dos circuitos de análisis. Los objetivos principales de los fabricantes son simplificar el aparato automático existente al reducir el número de componentes y reactivos, lo que permite una reducción de la producción y costos de mantenimiento y el tamaño de los aparatos automáticos, no obstante sin reducir el tiempo de un análisis completo de una muestra de sangre. La presente invención en particular se propone lograr estos objetivos. El documento WO 2004/003517 para este propósito propone un método y equipo en el cual los dos circuitos de análisis tienen un medio en común. El principio es llevar a cabo una primera dilución de la muestra de sangre en un recipiente de dilución único y transferir sucesivamente fracciones de los volúmenes seleccionados de esta dilución a una unidad medidora o contadora, con el fin, cada vez, de medir los elementos diferentes de el conteo contenidos en la muestra de sangre. Con el fin de llevar a cabo un análisis completo, específicamente el conteo de eritrocitos y plaquetas, el conteo de leucocitos, la medición de la hemoglobina y la diferenciación leucocitica, el documento describe la siguiente solución: utilizar una primera transferencia para el conteo de eritrocitos y plaquetas, agregar un agente de lisis al recipiente de dilución y después llevar a cabo una segunda transferencia para el conteo de leucocitos, llevar a cabo una tercera transferencia de la solución de dilución lisada para medir la concentración de hemoglobina, agregar un reactivo de diferenciación leucocitica y llevar a cabo una cuarta transferencia para realizar la diferenciación leucocitica en la unidad de medición. Este principio puede permitir el uso de lo que se denomina un solo recipiente de dilución pero no permite un ahorro en el tiempo de análisis debido a que las mediciones o el conteo se lleven a cabo sucesivamente después de cada transferencia de una fracción de la dilución. Además, requiere un control perfecto de los volúmenes sucesivos de reactivos y diluyentes transferidos a la unidad de medición; además, también requiere el uso de varias jeringas y reactivos de lisis. El objetivo de la presente invención también es superar dichos inconvenientes. De acuerdo con un primer objetivo, la presente invención se relaciona con un método para el análisis automá-tico de una muestra de sangre y un aparato para implementar este método. En el método de acuerdo con la invención: una solución de análisis contiene la muestra de sangre, un diluyente, y - por lo menos un compuesto para lisar eritrocitos; por lo menos un compuesto para estabilizar la hemoglobina en forma de un complejo cromogénico; que se forma en un recipiente único de dilución y análisis, - la concentración de hemoglobina se mide en esta solución de análisis por espectrofotometria en el recipiente después de la lisis de los eritrocitos; y una cantidad apropiada de esta solución de análisis se toma del recipiente en el cual se ha llevado a cabo la diferenciación leucocitica, por un medio óptico. El método de acuerdo con la invención se caracteriza porque la solución de análisis también contiene por lo menos un compuesto para proteger a los leucocitos, lo que permite diferenciar entre las cinco subpoblaciones leucociticas principales. El conteo de los leucocitos se puede llevar a cabo de manera conjunta en el recipiente de análisis y/o con un medio óptico. El conteo de los eritrocitos y opcionalmente de las plaquetas se puede llevar a cabo, por ejemplo, en una etapa previa del método en la muestra llevada a cabo en el recipiente único de dilución y análisis. De esta manera, la presente invención se basa en el concepto de una solución de análisis única utilizada tal cual, para los dos tipos de análisis los cuales habitualmente se llevan a cabo en dos circuitos separados, específicamente por una parte la medición de la hemoglobina y opcionalmente el conteo de leucocitos y, por la otra, la diferenciación leucocitica por medios ópticos, la solución de análisis combina los compuestos "reactivos" capaces de llevar a cabo por lo menos estos análisis en virtud de su naturaleza y su cantidad. Los compuestos reactivos introducidos se seleccionan para ser químicamente compatibles entre si y en cantidades adecuadas a los análisis reactivos. Estas se pueden seleccionar de compuestos utilizados típicamente en la técnica anterior. También es posible utilizar una formulación comercial la cual se utiliza convencionalmente para llevar a cabo una diferenciación leucocitica, es decir, que contiene el compuesto para lisar los eritrocitos y un compuesto leuco-protector y para agregarlo al tercer compuesto reactivo diseñado para estabilizar la hemoglobina en forma de un complejo cromogénico . Debido a esta solución de análisis única, la presente invención en particular tiene las siguientes ventajas: el aparato automático puede comprender un recipiente único para preparación de la solución de análisis, la medición de la hemoglobina se puede llevar a cabo directamente en este recipiente y también el conteo global de los leucocitos por medición de resistividad de la solución de análisis; es posible utilizar un monorreactivo que combine la totalidad de los compuestos "reactivos" necesarios para la medición de la hemoglobina y la diferenciación leuco-citica por medios ópticos; esto en particular permite la simplificación de los circuitos hidráulicos como se verá posteriormente; una monodilución de la muestra de sangre se puede llevar a cabo directamente en el recipiente único de dilución y análisis, con una tasa de dilución determinada como una función del medio de medición y detección utilizado. El monorreactivo puede servir como un diluyente para llevar a cabo esta monodilución.
Preferiblemente, la tasa de dilución se seleccionará para estar comprendida entre 1/100 y 1/500, que corresponde a la tasa de dilución que se requiere para una medición de la concentración de hemoglobina, preferiblemente también una tasa de aproximadamente 1/175 (1/173 en la modalidad indicada en lo siguiente) . Con la posibilidad de utilizar una monodilución y un monorreactivo, por lo tanto es posible que, gracias al primer aspecto de la invención se simplifica en gran medida el equipo de análisis y aún asi se proporciona un análisis completo de la muestra de sangre. El medio para medición óptica que permite un análisis de los leucocitos (conteo y diferenciación por subpoblaciones) a una tasa de dilución mayor de 1/100 también se propone de acuerdo con la invención y se definen y describen en lo siguiente. El monorreactivo utilizado en el método de acuerdo con la invención permite la medición por espectrofotometria de la concentración de hemoglobina de una muestra de sangre y una diferenciación leucocitica por medios ópticos. Permite el conteo reisistivo y/u óptico de los leucocitos. Preferiblemente, se selecciona de manera que permite la diferenciación de por lo menos cinco subpoblaciones. Preferiblemente se selecciona de manera que no contiene cianuros. De acuerdo con la invención, el corrpuesto para lisar eritrocitos preferiblemente está constituido por al menos un tensioactivo catiónico. De una manera preferencial la cual es conocida por si misma, se selecciona para formar un complejo de oxihemoglobina (dado que es no tóxico en comparación con el complejo de cianometemoglobina el cual involucra iones cianuro) . Por lo tanto, el tensioactivo catiónico también se selecciona de manera que oxida la hemoglobina liberada de manera que forma únicamente un complejo de oxihemoglobina. La cantidad de tensioactivo catiónico por lo tanto se selecciona de manera que hemolise eficazmente los eritrocitos y oxide la hemoglobina liberada. Preferiblemente se selecciona de: - sales de amonio cuaternario, preferiblemente sales de alquiltrimetilamonio y de manera aún más preferible los bromuros y cloruros de cetil-, dodecil-, tetradecil- y hexadeciltrimetilamonio; sales de piridinio; - aminas etoxiladas de cadena larga; y sulfatos de alquilo (SDS) . El compuesto leucoprotector de acuerdo con la invención es un compuesto que retrasa o evita la destrucción de los leucocitos. Preferiblemente es un tensioactivo no iónico o anfotérico que preferiblemente se selecciona de: alcoholes etoxilados, en particular 2-fenoxietanol, polioxietilenalquilfeniléteres tales como productos comerciales IPEGAL990MR, TERGITOL NP9MR, TRITONMR X100 o X114, plurafacMR A38 o Brij35MR); - betainas y sulfobetainas de amonios cuaternarios, en particular lauramidopropilbetaina (LAB), y 1-propansulfonato de dodecildimetil-3-amonio (DDAPS) o 1-propansulfonato de tetradecildimetil-3-amonio (TDAPS); óxidos de amina terciaria tales como N, N-dimetil-laurilamina-N-óxido (LDAO) o sulfonato de 3- [ (colamido-propil) -dimetilamino] -1-propano (CHAPS o CHAPSO) ; compuestos de tipo glucosidico, de manera más particular una triterpeno saponina; compuestos de tipo glucidico (manitol, D-glucosa, trehalosa, sulfato de dextrano) . El compuesto el cual estabiliza la hemoglobina en forma de un complejo cromogénico preferiblemente se selecciona de: quelatos monodentados o polidentados que presentan átomos ligando (pares que no se unen: 0, N, S y grupos carboxi COO-, etc.), en particular: ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) o ácido etilenglicol-bis- (3-aminoetiléter) N,N' -tetraacético (EGTA) y en particular sus sales de sodio o dipotasio; • oxalato de potasio K20x 0X = C2042";
sales de hidroxilamina (preferiblemente hidrocloritos ) ; y ácidos orgánicos (en particular fórmico o acético) - los compuestos aromáticos (quelatos monodentados o polidentados) comprenden átomos de ligando
(que tienen pares que no se unen: 0, N, S, etc.), en particular : TironMR • 8-hidroxiquinolina y sus derivados; piridina o bipiridina y sus derivados; 1, 10-fenantrolina y sus derivados; • los compuestos fenólicos (mono o bis y sus derivados ) ; " pirazol y/o las pirazolonas y sus derivados; ° imidazol y sus derivados; ° ácido sulfosalicilico; y saponinas, óxidos de amina terciarios, betainas y sulfobetainas de amonios cuaternarios (tales como DDAPS, TDAPS, LAB) . Además de los tres compuestos definidos de acuerdo con la invención, es posible agregar a los monorreactivos : por lo menos un colorante (o mezclas) que marque específicamente ciertos leucocitos y más particular-mente eosinófilos (o basófilos) con el fin de permitir la diferenciación de por lo menos 5 subpoblaciones leucociticas principales que se seleccionan de: dañinas; 0 Oxazina 750; ° reactivos de Wright y Romanowsky; DAPI; Negro E de clorazol: Azul de toluidina 0 Azul Astra; ° naranja G tiazol o azul; otros reactivos fluorescentes. por lo menos un agente de fijación que permita la rigidificación de la membrana de los leucocitos, el cual preferiblemente es un aldehido y de manera más particular glutaraldehido o formaldehido; por lo menos un agente de humedecimiento con el fin de optimizar la fluidez y evitar la formación de burbujas el cual también actúa como solubilizantes de los residuos, que se seleccionan de: ° alcoholes (metanol, etanol y propan-2-ol) ; glicoles (etileno o propilenglicol); glicoles etoxilados (particularmente Tritón X100MR o Brij35MR) ; compuestos glucosidicos TWEEN80MR o TWEEN20MR; la concentración del agente de fijación y del solubilizante se limita de manera estricta, dado que un exceso puede evitar la lisis de los eritrocitos y modificar las propiedades ópticas de los leucocitos; y un sistema amortiguador para establecer el pH entre 5.0 y 10.0, y de manera preferible entre 6.0 y 8.0 y de manera óptima cercana a la neutralidad (7.0 + 0.4).
La selección de dicho pH tiene como objetivo respetar las condiciones originales de las células. Además, este pH permite una mejor disolución de los constituyentes utilizados de acuerdo con la invención. Dicho amortiguador está constituido por un par de sales (inorgánicas u orgánicas) ajustadas al pH mencionado antes por ácido clorhídrico o sosa
(4-6N), que se selecciona de: fosfato diácido de sodio o de potasio/fosfato ácido H2P04"/HP042~; ° carbonato ácido de sodio (carbonato NaHC03/Na2C03 amortiguador de ácido citrico/citrato de sodio (III) ° TRIS-HC1 trietanolamina (TEA) ° imidazol un ácido que se selecciona de: los ácidos orgánicos: ftálico, sulfosalicilico o fórmico, los cuales también contribuyen a la formación y estabilización del complejo cromogénico de la hemoglobina; y los ácidos minerales: HCl, H3P0 , etc. una sal de fondo que asegure la conductividad del orden de 10 a 50 ms/cm necesaria para la medición de resistividad y una osmolaridad en el orden de 120 a 500 mOsm y preferiblemente cercana a isotonicidad (290 + 5 mOsm) , se seleccionan de: cloruro de sodio NaCl; cloruro de potasio, KCl; ° cloruro de magnesio MgCl2; • cloruro de calcio CaCl2; 0 sulfato de sodio anhidro Na2S04; esta sal de fondo es capaz de estar comprendida en el sistema amortiguador; - por lo menos un conservador que tenga propiedades antioxidantes y/o antibióticas, que se selecciona de: • 2-fenoxietanol; parabenos; • BHT; isotiazolonas ( ProclinMR 150 o 300); • derivados de imidazol o urea; • antibióticos; un compuesto de penetración celular antibiótico natural (ionóforo) el cual facilite también la penetración del colorante o colorantes, que se selecciona de: ionóforo I para NH4+ (nonatina) ; ß ionóforo III para Ca2+ (calcimicina) ; ionóforo para Cl~; ionóforo I para K+ (valinomicina) . Los constituyentes de acuerdo con la invención se resumen en la tabla siguiente asi como los intervalos de concentraciones apropiadas.
La presente invención también propone un aparato para implementar el método de acuerdo con la invención, el cual está caracterizado por: - un recipiente de análisis el cual es capaz de recibir la solución de análisis; - un medio para medir la concentración de hemoglo-bina presente en la solución de análisis por espectrofotometria en dicho recipiente; - un medio para muestrear la solución de análisis; - un medio para medición óptica de la muestra con el fin de producir un análisis de leucocitos. De acuerdo con un segundo objetivo, la presente invención se relaciona con un dispositivo óptico para un aparato automático para el análisis automático de una muestra de sangre, de manera particularmente ventajosa también para la implementación del método de acuerdo con el primer obje-tivo de la invención. Como se menciona en lo anterior, ciertas subpoblaciones de leucocitos únicamente se pueden diferenciar por mediciones ópticas, por ejemplo una medición de la difracción de la célula en uno o más ángulos o una medición de la adsorbancia de la célula. Los sistemas ópticos para caracterización de una célula sanguínea tienen una base común en la cual una fuente de luz se localiza emitiendo un haz de luz, un recipiente óptico en el cual las células sanguíneas atraviesan el haz de luz, un sistema para ajuste del haz de luz al flujo de las células y un medio para medir la luz que se origina desde el recipiente óptico después de la intercepción por las células. En particular, en el caso de caracterización de leucocitos, los leucocitos se mueven en un flujo en el recipiente. Son iluminados en el mismo por un haz de luz enfocado sobre el flujo el cual se denomina flujo de muestra . Dichos dispositivos son costosos: en particular, los láseres utilizados como fuentes de luz los cuales también son luminosos y generalmente requieren un sistema de disipación térmica; los diodos láser, al igual que los láseres, requieren sistemas de alineación costosos. Los haces de luz emitidos por estas fuentes tienen una distribución transversal de luz la cual tiene una forma que sigue aproximadamente la curva de Gaussian. Asi, la intensidad es sólo aproximadamente constante y máxima en una parte estrecha y central del rayo. Los sistemas de alineación permiten que esta parte central se alinee con el flujo de muestra. Además, la anchura del flujo de muestra no debe exceder de su parte central y cuanto más cerca estén las dos anchuras, mayor será la precisión del sistema de alineación que deba existir. Como resultado, es necesario reducir la anchura del flujo de muestra tanto como se pueda. El flujo de muestra que contienen las células sanguíneas que se va a contar y/o que van a ser sometidas a cuenteo diferencial debe ser más estrecho que la luz que los enfoca. Por lo tanto, se utiliza un flujo en el cual la anchura de la sección es menor de 50 µm, la cual debe cruzar el haz de luz el cual en si mismo se enfoca dentro de un haz estrecho con una sección más grande que la del flujo de muestra. Esto requiere un sistema particularmente preciso y por lo tanto costoso para la inyección del flujo dentro del recipiente óptico. En la técnica anterior, dichos resultados se obtienen utilizando un sistema de tipo de hidroenfoque (abreviatura de la expresión en inglés "enfocado hidrodi-námico") . El flujo de muestra es rodeado con un flujo de tuberia. Un inyector para el flujo de muestra se sumerge en el centro del flujo de tuberia. El flujo de muestra generado de esta manera se amplia o enfoca conforme se desplaza desde el inyector a la zona iluminada por el haz de luz, de manera que tiene, en este punto, una anchura deseada de aproximadamente 5 a 50 µm de diámetro. Algunas veces es necesaria una tuberia sencilla o doble con el fin de obtener este objetivo. Además, como se ha mencionado previamente, dado el nivel de precisión que se requiere, es esencial un sistema de ajuste con el fin de que el flujo de las células coincida con el haz de luz. Son posibles dos soluciones: el flujo de células del haz de luz se puede mover. Si se selecciona para mover el flujo de células sanguíneas, debe moverse la totalidad de la unidad de recipiente óptico. Cuando se adopta esta opción, el recipiente se monta sobre una tabla de traslación la cual asegura un movimiento preciso y uniforme a lo largo de dos ejes debido a sus cojinetes de bola. Dicho ensamblado mecánico de precisión es muy costoso. También es posible mover el haz de luz con el fin de hacerlo coincidir con el flujo de células sanguíneas. Esto se obtiene de manera general utilizando varios prismas ajustables. Esta solución, la cual combina elementos ópticos con mecánica de precisión también involucran altos costos. Además, cuando se cruza el haz de luz, las células sanguíneas desvian la trayectoria de los rayos de luz. La intensidad y el ángulo de los rayos desviados permite que se obtenga información del tipo de célula. Generalmente se utilizan dos intervalos de ángulos: los ángulos estrechos menores de 10 grados con respecto al eje óptico y ángulos amplios de aproximadamente perpendiculares al eje óptico. En el intervalo de los ángulos estrechos, son útiles dos artículos de información: las pérdidas en el eje y en la difracción. Perpendicular al eje óptico generalmente se mide a difusión y la fluorescencia. Para los dos intervalos de ángulos, la luz por lo tanto debe estar distribuida en dos canales diferentes. Esto generalmente se obtiene con espejos dicroicos o con filtros de interferencia. Los componentes ópticos son producidos por deposición de películas delgadas sobre un sustrato de vidrio. Tienen buena eficiencia pero existe una gran disparidad entre un filtro y otro y su vida útil es limitada. Por lo tanto deben ser sustituidos regularmente . La totalidad de estos dispositivos generalmente voluminosos también es frágil y requiere mantenimiento, lo cual también es muy costoso. Por lo tanto, dichos dispositivos se limitan a laboratorios analíticos los cuales son suficientemente grandes para ser capaces de invertir en dichos aparatos automáticos. El propósito de la invención es proponer un dispositivo para la diferenciación leucocitica y/o el conteo leucocitica el cual sea más sencillo y más económico de producir y mantener, lo que permite el uso de un aparato automático equipado con el dispositivo por laboratorios más pequeños y al mismo tiempo retener una calidad de medición adecuada . De acuerdo con el segundo objetivo de la invención, se propone un dispositivo óptico para el conteo y/o diferenciación de leucocitos en un analizador de sangre automático caracterizado porque comprende una fuente de luz de un tipo de diodo electroluminiscente con el fin de iluminar una muestra de sangre que circula en el recipiente óptico de acuerdo con el eje de inyección utilizando un haz de luz de fuente. Dicho diodo permite que el haz de luz que se obtiene sea mucho más homogéneo respecto a su anchura de su sección y por lo tanto con una zona de lectura más grande y más homogénea . Preferiblemente, el diodo emite luz con una longitud de onda la cual es menor de 600 nanómetros y de manera aún más preferible menor de 500 nanómetros. Dicha longitud de onda permite una mejor eficiencia de difracción y por lo tanto una mejor precisión de mediciones utilizando difracción . Además, la anchura del haz emitido por el disposi-tivo óptico, es decir, el haz de fuente el cual ilumina el flujo de muestra ventajosamente está constituido entre 50 y 200 micrómetros (µm) , cercano al eje de inyección lo cual permite la iluminación de un flujo de muestra más ancho y al mismo tiempo permite que se lleven a cabo una precisión adecuada en las mediciones. De manera aún más ventajosa, esta anchura está constituida entre 90 y 120 micrómetros. Dicha anchura de flujo en particular se permite por el uso de diodos electroluminiscentes. Preferiblemente, el haz de luz fuente es emitida aproximadamente en la dirección del recipiente, aproximadamente transversal a la dirección de flujo de la muestra. Un portaobjetos transparente diseñado de manera que el haz de fuente pase a través del mismo entre dos superficies opuestas, las cuales se montan giratoriamente y se distri-buyen entre el diodo y el recipiente pueden permitir que el haz de luz se pueda mover en dirección transversal, gracias a su refracción doble cuando pasa a través del portaobjetos. La rotación del portaobjetos permite la modificación del ángulo de incidencia del haz sobre el portaobjetos y de esta manera se ajusta el valor del desplazamiento transversal. Preferiblemente, el portaobjetos transparente se monta giratoriamente alrededor de un eje el cual es aproximadamente paralelo al movimiento de la muestra de sangre en el recipiente. Más allá del recipiente óptico se utiliza ventajosamente un medio para la separación por pérdidas de Fresnel para un haz de luz resultante incidente que se origina desde el haz de luz fuente, y por lo tanto separa el haz en un haz resultante axialmente y por lo menos un haz que resulta de la pérdida constituida por pérdidas de Fresnel mientras pasa a través del medio de separación. El medio de separación comprende por lo menos una superficie de separación la cual es una superficie en un material de separación transparente, el haz axial ha pasado a través del material transparente y el haz que se origina desde las pérdidas Fresnel ha sido reflejado por la superficie de separación, dicha superficie está inclinada en relación al haz de luz más allá del recipiente. Un único portaobjetos de vidrio barato puede servir como un medio de separación. Además, tiene una vida útil virtualmente ilimitada y sin mantenimiento, a diferencia de los espejos dicroicos o filtros de interferencia. El dispositivo también puede comprender un aparato para medir la luz del haz resultante axialmente y por lo menos otro aparato para medir la luz de por lo menos un haz que se origina a partir de las pérdidas Fresnel. Estos aparatos de medición en particular pueden comprender un medio para la medición ya sea de la fluorescencia, las pérdidas de luz cercanas al eje de la difracción cercana al eje. También puede comprender un medio para medir la difracción del haz de luz en los ángulos amplios por la muestra en el recipiente. A modo de ejemplo, estos ángulos amplios pueden ser ángulos comprendidos entre 60 grados y 150 grados. El dispositivo también puede comprender, en la trayectoria del haz en la parte frontal del recipiente, por lo menos un diafragma que bloquee luz espuria. La invención también se relaciona con un aparato hematológico, en particular un analizador automático de sangre equipado con dicho dispositivo. De acuerdo con un tercer objetivo la presente invención también se relaciona con un recipiente óptico de flujo pasante para un dispositivo óptico adecuado para el conteo y diferenciación de leucocitos, por ejemplo un citómetro de flujo asi como un aparato de análisis equipado con dicho recipiente. El objetivo de la invención es proponer un recipiente el cual sea más sencillo y más económico de producir y mantener, lo que permita el uso del aparato automático equipado con este recipiente por laboratorios más pequeños, y al mismo tiempo retener una calidad de medición adecuada. De acuerdo con esta invención, un recipiente de flujo pasante para un dispositivo óptico para el conteo y diferenciación de leucocitos en un analizador de sangre automático se caracteriza porque en una zona de análisis del recipiente la sección del recipiente tiene por lo menos una dimensión transversal comprendida entre 1 y 5 milimetros. Esta sección puede ser aproximadamente rectangular y la dirección transversal se puede medir en uno y/o el otro de los lados del rectángulo. Por lo tanto, dicho recipiente se puede producir, por lo menos parcialmente, a partir de un material plástico inyectado. Dicho recipiente se produce de una manera particularmente ventajosa en comparación con los recipientes de la técnica anterior, generalmente formados de paredes de cuarzo ensambladas por unión. El recipiente también puede comprender por lo menos un lente moldeada en una pieza con el recipiente. Por lo menos un lente puede comprender un lente diseñada para ser colocada lateralmente en relación a un eje óptico. Puede comprender un lente semiesférica.
El recipiente puede comprender a lo largo de un eje óptico una ventana para la introducción del haz de luz y una ventana para que salga el haz. Por lo menos una ventana se puede moldear en una pieza con el recipiente o se puede insertar en un material transparente, por ejemplo cuarzo o vidrio . Ventajosamente, el recipiente puede comprender un inyector para un flujo de muestra y un medio para formar un flujo de tuberia alrededor del flujo de inyección. El inyector puede comprender un orificio de salida cuyo diámetro está constituido entre 20 micrómetros y 150 micrómetros lo que permite que se obtenga un flujo de muestra el cual es perceptiblemente mayor que los flujos de la técnica anterior. En contraste con los dispositivos de la técnica anterior, no es el flujo de tuberia el cual determina la anchura del flujo de muestra estrechándolo, sino la forma y sección de la salida del inyector. El flujo de tuberia, por lo tanto no juega un papel activo sino simplemente un papel pasivo en particular, por ejemplo, para el centrado del flujo de muestra en un recipiente ancho. De acuerdo con una primera modalidad, este inyector se puede formar en una pieza, en un material más o menos rigido. Este material puede ser, por ejemplo acero inoxidable, un material cerámico, rubi sintético o un material de plástico o varios de estos materiales.
De acuerdo con una segunda modalidad, este inyector puede comprender un tubo estructural rigido, por ejemplo elaborado de metal, por ejemplo elaborado de acero inoxidable y en el interior del tubo estructural, un tubo con cubierta de plástico que termina en una boquilla formada en una pieza con el tubo con cubierta. El material plástico del inyector puede ser politetrafluoroetileno lo cual permite que la muestra circule más fácilmente en el tubo y reduce el riesgo de incrustaciones. La invención también se relaciona con un inyector para un recipiente de acuerdo con la invención, inyector el cual se produce de acuerdo con una de estas modalidades. La invención también se relaciona con un aparato hematológico, en particular un analizador automático de sangre equipado con un recipiente de acuerdo con la invención . De acuerdo con un cuarto objetivo, la presente invención también se relaciona con un dispositivo hidráulico para un aparato de análisis hematológico el cual es más sencillo y más económico de producir y mantener y el cual permite el uso de un aparato automático equipado con dicho dispositivo por laboratorios más pequeños y al mismo tiempo se retiene una calidad de medición adecuada. La presente invención también se relaciona con un método de análisis adecuado para dicho dispositivo.
Por lo tanto, la presente invención propone un dispositivo hidráulico para un aparato de análisis de sangre, en particular un aparato automático que comprende un medio para inyectar bajo presión un flujo de muestra dentro de un recipiente óptico de flujo pasante y para crear un flujo de tuberia liquido alrededor del flujo de muestra, con un liquido de tuberia, caracterizado porque comprende un medio para ajustar un caudal del flujo de muestra con respecto al caudal del liquido de tuberia. Dicho ajuste puede posibilitar mantener flujos homogéneos y aproximadamente no turbulentos en el recipiente. El medio de inyección puede comprender jeringas, un circuito hidráulico y válvulas solenoides. Este medio puede comprender un medio para inyectar la muestra bajo presión en relación al flujo de tuberia. Este dispositivo ventajosamente puede comprender un medio para formar un pistón para que la muestra se inyecte con un liquido de desplazamiento. Dicho liquido de desplazamiento vuelve posible utilizar únicamente una muestra pequeña suficiente para el análisis, el resto del liquido necesario para la inyección es un liquido disponible en el aparato de análisis y no es tan valioso como la muestra. La tuberia es particularmente útil cuando se utiliza un recipiente con una sección amplia y al mismo tiempo mantiene una sección pequeña de flujo de muestra. Como uno de los medios para ajustar el flujo de muestra en relación al flujo de tuberia, el dispositivo ventajosamente puede comprender un medio para ajustar el caudal del liquido de desplazamiento con respecto al caudal del liquido de tuberia. El medio de ajuste puede comprender un medio para una caida de presión en un circuito de ramificación para el desplazamiento de liquido y/o un medio para una caida de presión en un circuito de ramificación para el liquido de tuberia. Por ejemplo, el medio de caida de presión se puede seleccionar a partir de una longitud conocida de un tubo calibrado, una resistencia hidráulica fija y una resistencia variable . El dispositivo hidráulico puede comprender únicamente una motorización, por ejemplo un motor eléctrico único, con el fin de generar el flujo de muestra y el flujo de tuberia simultáneamente. Además, puede comprender por lo menos dos jeringas con el fin de generar el flujo de muestra y el flujo de tuberia, los pistones de jeringa están unidos firmemente entre si. Por lo tanto tienen un movimiento común y la muestra y la tuberia fluyen de manera en realidad simultánea . En particular, un recipiente de hidroenfoque de la técnica anterior se puede utilizar con un circuito tal como el descrito previamente de acuerdo con la invención, la inyección de la muestra en el recipiente se puede llevar a cabo sin la presión relativa del flujo de tuberia. De acuerdo con la invención también se propone un método para el análisis de una muestra de sangre en un citó-metro de flujo pasante, caracterizado porque se inyecta una muestra de sangre, opcionalmente bajo presión, en un recipiente de flujo pasante de citómetro, la muestra forma un flujo de muestra en el mismo y se genera un flujo de tuberia liquido alrededor del flujo de muestra, en donde el liquido de tuberia, caracterizado porque el caudal del flujo de muestra se ajusta con respecto al caudal del liquido de tuberia . En particular, es posible introducir la muestra en una rama de inyección de un circuito hidráulico e introducir corriente arriba de la muestra en la ramificación de inyección un liquido de desplazamiento, el liquido de desplazamiento sirve para empujar la muestra durante su inyección en el recipiente. Este liquido de desplazamiento se puede seleccionar a partir de un reactivo y un diluyente, preferiblemente un reactivo. Por lo tanto, no hay interés en proporcionar un liquido diferente del cual sea estrictamente necesario para la preparación de la muestra con el objetivo de su análisis o de los análisis. También es posible crear alrededor del flujo de muestra en el recipiente un flujo de tuberia con un liquido de tuberia. Este liquido de tuberia también se puede seleccionar de un reactivo y un diluyente, preferiblemente un diluyente. En este caso también no tiene caso proporcionar un liquido diferente de aquel el cual sea estrictamente necesario para la preparación de la muestra con el objetivo de su análisis o los análisis. En el caso en donde se utiliza el método de hidroenfoque o un recipiente de acuerdo con el tercer objetivo de la invención, es ventajoso ajustar el caudal del liquido de desplazamiento con respecto al caudal del liquido de tuberia, por ejemplo al introducir una caida de presión en un circuito de ramificación para el liquido de desplazamiento y/o un medio de caida de presión en un circuito de ramificación para el liquido de tuberia. En un método de acuerdo con la invención, en particular para un recipiente de acuerdo con el tercer objetivo de la invención, se puede proporcionar fácilmente que la muestra de sangre tenga una tasa de dilución de por lo menos 1/100. De hecho, en dicho método, la muestra se puede introducir bajo presión en relación al liquido de tuberia, dentro del recipiente, a una velocidad mayor que la de los métodos de la técnica anterior y con anchuras de sección mayores para el flujo de muestra en el recipiente. Asi, sin incrementar el tiempo de análisis para una diferenciación y un conteo de los leucocitos, se puede utilizar una tasa de dilución la cual es idéntica a la utilizada convencionalmente para la medición de hemoglobina, en particular tasa de dilución comprendidas entre 1/100 y 1/500, particularmente entre 1/160 y 1/180. La invención también se relaciona con una aparato hematológico, en particular un aparato automático de análisis de sangre caracterizado porque comprende un dispositivo hidráulico de acuerdo con la invención. La presente invención se comprenderá mejor y otras ventajas se volverán evidentes en base en la siguiente descripción de las modalidades, descripción la cual se realiza en particular con referencia a los dibujos que se anexan, los cuales: - la figura 1 ilustra diagramáticamente un ejemplo de un equipo de acuerdo con el primer objetivo de la invención; la figura 2a-2e son gráficas de pruebas de linealidad de la medición de hemoglobina por espectrofotometria de acuerdo con el método de la invención; las figuras 2f-2i son citografias correspondientes; la figura 3 es una vista diagramática de un aparato automático para análisis de una muestra de sangre utilizando un dispositivo hidráulico de acuerdo con el cuarto objetivo de la presente invención; - la figura 4 es una vista longitudinal diagrama-tica de una unidad de dispositivo óptico de acuerdo con el segundo objetivo de la invención; - la figura 5 es una vista longitudinal diagramática más detallada del dispositivo óptico de la figura 4 en un plano perpendicular al de la figura 4; - la figura 6 es una vista en perspectiva de un recipiente óptico de acuerdo con un tercer objetivo de la invención; - la figura 7 es una vista en sección longitudinal de una primera modalidad de un inyector para un recipiente óptico de acuerdo con la invención; - la figura 8 es una vista en sección longitudinal de una segunda modalidad de un inyector para un recipiente óptico de acuerdo con la invención; - la figura 9 es una vista en sección longitudinal de un extremo del inyector de la figura 8; - la figura 10 es una vista en sección longitudinal de un recipiente que ilustra un método de la técnica anterior para inyectar la muestra de sangre en el recipiente; y las figuras lla-llc son gráficas que ilustran los resultados que se obtienen con un aparato automático utilizando el método de la invención y utilizando un citógrafo con el dispositivo óptico y el recipiente de acuerdo con la invención . La figura 1 ilustra diagramáticamente una dilución única y un recipiente 1 de análisis el cual se puede suministrar con una muestra 2 de sangre que se va a analizar, un diluyente 3 y un reactivo 4 que juntos forman una solución de análisis. Este recipiente 1 está equipado con un medio para medir por fotometría 5 la concentración de hemoglobina en la solución de análisis y un medio 6 para medir la resistividad de la solución de análisis con el fin de contar el número total de leucocitos. Generalmente se proporcionan medios para tomar una fracción de la solución de análisis del recipiente 1 de análisis y para inyectarla en un recipiente 7 óptico equipado con un medio 8 de medición óptica (por ejemplo un citómetro de flujo) para un análisis de los leucocitos. De acuerdo con el ejemplo seleccionado, también se proporciona un medio para tomar una fracción de una presolución constituida por la muestra de sangre y diluyente e introducirla dentro de un recipiente 9 de conteo y dilución equipado con un medio para medir la resistividad 10 de la fracción con el fin de contar los eritrocitos y las plaquetas. El equipo está equipado convencionalmente con un medio de calentamiento con el fin de obtener una temperatura controlada termostáticamente de aproximadamente 35°C. Esta temperatura permite un tiempo de reacción de lisis óptimo y una calidad de los eritrocitos. El equipo opera de la siguiente manera: - se inyecta una alícuota de sangre (15.6 µl ) dentro del taque 1 de análisis y se diluye con 2 ml de diluyente de manera que forma una presolución de análisis; la tasa de dilución es 1/130; - se toma una fracción muy pequeña (aproximadamente 20 µl) de esta presolución de análisis y se deposita en el recipiente 9 para conteo de eritrocitos y plaquetas; después se agregan 0.7 ml de reactivo a la presolución remanente en el recipiente 1 de análisis: la lisis dura por aproximadamente 10 segundos (con el fin de destruir los eritrocitos, forma y estabiliza el complejo de oxihemoglobina) la solución de análisis formada de esta manera tiene una tasa de dilución final de aproximadamente 1/173; una fracción de la solución de análisis se toma e inyecta dentro del recipiente 7 óptico en donde se lleva a cabo el análisis de los leucocitos (conteo y/o diferenciación de los leucocitos por subpoblaciones); simultáneamente en el recipiente 1 de análisis se conteon los leucocitos por una medición de resistividad y la hemoglobina por una medición por absorbencia a la longitud de onda del complejo de oxihemoglobina formado. Un dispositivo óptico de acuerdo con la invención, particularmente adecuado para análisis leucocitico de una solución de análisis que tiene una tasa de dilución menor de 1/100 se describe a continuación, más particularmente adecuada para una dilución comprendida entre 1/160 y 1/180.
Convencionalmente una tasa de dilución de 1/160 se considera que es menor que una tasa de 1/100. Por supuesto son posibles modalidades variantes del método y del equipo descrito en lo anterior: para el equipo: se puede proporcionar un medio para introducir de manera separada el compuesto de lisis, el compuesto leucoprotector y el compuesto que estabiliza el complejo formado con la hemoglobina en el recipiente 1 de análisis, y por lo tanto más en forma de un monorreactivo; el medio 6 para medición de la resistividad de la solución de análisis son opcionales; el número total de leucocitos que se pueden obtener por análisis óptico de la solución de análisis; de manera similar, el recipiente 9 de conteo y el medio para medir 10 la resistividad en este recipiente se puede proporcionar únicamente si se desea un análisis completo de la muestra de sangre; de igual manera para el método: la introducción de los compuestos de reacción se puede considerar de manera independiente o colectiva en lugar de un monorreactivo, la introducción es capaz de llevarse a cabo de manera simultánea o sucesiva; la etapa previa de conteo de los eritrocitos y plaquetas y la etapa de conteo global de los leucocitos se puede omitir; además se pueden llevar a cabo dos diluciones sucesivas de la bolsa de sangre: una primera dilución la cual es particularmente adecuada para diferenciación de leucocitos (aproximadamente a 1/80) conforme se lleva a cabo en un citó-metro de tipo de hidroenfoque estándar conocido, a partir del cual se toma una fracción requerida para esta diferenciación de leucocitos, después en un segundo momento en el tiempo una segunda dilución adecuada para medición de la hemoglobina (comprendida entre 1/100 y 1/500) según sea posible con los espectrómetros conocidos. De acuerdo con otra variante adicional, el recipiente 1 puede servir en un segundo momento en el tiempo para llevar a cabo el conteo de eritrocitos y plaquetas después de limpieza, mediante llenado el recipiente con una muestra que espera en un aguja de jeringa. Los resultados obtenidos ahora se describirán con un ejemplo especifico de un (mono) -reactivo de acuerdo con la invención: se prepara un monorreactivo utilizando la formulación EosinofixMR de la compañía ABX, comercializado para determinación de leucocitos en citometria de flujo y que contiene para este propósito un compuesto para lisar los eritrocitos y un compuesto leucoprotector (véase la patente EP0430750 por ABX) . De acuerdo con la invención se agrega un compuesto que estabiliza el complejo de hemoglobina.
Medición de la hemoglobina por espectrofotometria Se llevan a cabo pruebas de linealidad utilizando un espectrofotómetro a 542 nm. Las gráficas se muestran en las figuras 2a-2e. Representan las concentraciones de hemoglobina medidas en relación a las concentraciones esperadas. De manera más especifica: la figura 2a corresponde a una lisis de referencia para medición de la hemoglobina por espectrofotometria (LMGMR vendido por la compañía ORPHEE) ; las figuras 2b, 2c y 2d corresponden al monorreactivo de acuerdo con la modalidad número 4 en la cual, como agente de estabilización del complejo de hemoglobina, respectivamente se utilizan Tirón, DDAPS e imidazol; y la figura 2e corresponde al método de la invención implementado utilizando como monorreactivo EosinofixMR solo, es decir, que no contiene agente de estabilización del complejo de hemoglobina de acuerdo con la presente invención. Para las tres pruebas llevadas a cabo de acuerdo con la invención se obtiene una prueba de linealidad positiva para cada una, con un coeficiente de correlación, R2 de 1 ± 10~4 (mostrado en la figura) . Este resultado concuerda con el obtenido con la lisis de referencia de la figura 2a. Esto significa que el método de la invención en realidad permite la medición de la concentración de hemoglobina real en una muestra de sangre. En contraste, como se observa en la figura 2e, con el reactivo (Eosinofix) sin un estabilizante de hemoglobina no se obtiene una relación lineal. Esto significa que este reactivo solo, no puede utilizarse para medir la concentración de hemoglobina.
Diferenciación leucocitica por citometria de flujo Las figuras 2f a 2i son citografias obtenidas utilizando citómetro de flujo BD FACScanMR, que corresponde respectivamente a Eosinofix solo y Eosinofix al cual se le han agregado DDAPS, Tirón e imidazol. En estas figuras, se observa que la diferenciación de las subpoblaciones en realidad se obtiene de una manera la cual es comparable con un reactivo estándar para diferenciación de leucocitos (matriz obtenida con Eosinofix en la figura 2f ) . También puede hacerse referencia a la citografia de la figura llb (descrita en lo siguiente) en particular obtenida con un citómetro de acuerdo con la invención. El dispositivo hidráulico de acuerdo con el cuarto objeto de la invención ahora se describirá. La figura 3 representa parcialmente el diagrama de un sistema 100 hidráulico y parte del equipo de un analizador 20 de sangre automático en la medida en que permite la comprensión del dispositivo hidráulico de acuerdo con la invención . El aparato automático que se ilustra en la figura 3 en particular comprende una aguja 101 para la toma de muestra de sangre que se va a analizar en un tubo el cual se utiliza para su almacenamiento y su transporte al aparato automático. La sangre que se toma se vierte por la aguja en forma de una muestra dentro de un recipiente 102. En particular, el recipiente 102 está diseñado para la dilución y/o la lisis de los eritrocitos de la muestra de sangre. La totalidad o parte de la muestra, antes o después de la dilución, se pueden tomar con el objetivo de análisis en otra parte del aparato automático, por ejemplo un dispositivo 120, descrito posteriormente. Un dispositivo para análisis de la hemoglobina 110 (por ejemplo un espectrofotómetro) se coloca cercano al recipiente 102. Un almacén 103 para un producto de dilución y un almacén 104 para un reactivo, en particular un reactivo de lisis se conectan al recipiente 102 via un circuito 100 hidráulico. Otro dispositivo 120 de análisis se dedica más específicamente al conteo y diferenciación de los leucocitos, por ejemplo en su totalidad o en parte de la muestra tomada desde el recipiente 102. Posteriormente la muestra también se referirá a esto en su totalidad o en esta parte. El dispositivo para análisis de los leucocitos 120 en particular comprende un dispositivo 200 óptico y un recipiente 300 óptico. El recipiente óptico está conectado al recipiente 102 via el circuito hidráulico.
Un conjunto de jeringas permite el movimiento de los líquidos en el circuito hidráulico. De estas jeringas, una jeringa 105 dedicada al diluyente y la jeringa 106 dedicada al reactivo están representadas de manera que la invención se entienda bien. Otras jeringas las cuales no están representadas debido a que no son necesarias con el fin de comprender la invención pueden completar el dispositivo. Además de los tubos para la circulación de los líquidos, el circuito hidráulico comprende válvulas solenoides para el recambio de diferentes circuitos en el circuito 100 hidráulico, de acuerdo con su uso en un momento dado del análisis. En la figura 3 se ilustran ocho válvulas solenoides 111-119 de las válvulas solenoides del circuito 100 hidráulico. Cada válvula solenoide comprende dos posiciones, cada una marcada respectivamente con la letra A o B. El diseño del circuito hidráulico se discutirá posteriormente y permite el uso de únicamente una motorización M para las jeringas ilustradas. La misma motori-zación también se puede utilizar para otras jeringas. De esta manera, los pistones de las jeringas 105, 106 se unen firmemente entre si. Por lo tanto su movimiento es simultáneo, ya sea utilizando empuje P, cuando son impulsadas dentro del cilindro respectivo de cada jeringa o por jalado T cuando son retiradas.
La distribución y después el funcionamiento hidráulico del aparato automático se describirá a continuación. El recipiente 300 comprende un cuerpo 301 externo y un inyector 302 dentro del cuerpo 301, se forma un volumen 303 de tuberia entre el cuerpo y el inyector. El circuito 100 hidráulico comprende: - una rama 131 de inyección la cual se extiende corriente arriba del inyector, entre el inyector y la válvula
111; - una rama 132 de muestra la cual está conectada a un punto 142 de ramificación de muestra a la rama de inyección y que se extiende al recipiente 102; - una rama 133 de succión la cual está conectada a un punto 143 de ramificación de succión a la rama de inyección, corriente arriba del punto 142 de ramificación de muestra via la válvula 113 y se extiende a una fuente 107 de vacio, por ejemplo una jeringa o una bomba peristáltica; - una rama 134 de descarga la cual está conectada a un punto 144 de ramificación de descarga a la rama de inyección, corriente arriba del punto 143 de ramificación por succión y se extiende al almacenamiento 104 de producto de reactive- una rama 135 de tuberia la cual se extiende corriente arriba del cuerpo 301 y conecta el volumen de tuberia y la válvula 115;
- una rama 136 de dilución la cual se extiende entre la válvula 116 y un uso 108 para el diluyente via la válvula 115; - una rama 137 de diluyente la cual se extiende entre el depósito 103 diluyente y la válvula 116; - una rama 140 de reactivo la cual se extiende entre el depósito 104 de reactivo y la válvula 117; - una rama 141 de reacción la cual se extiende entre la válvula 117 y el uso 109 para el reactivo via la válvula 111; - una rama 138 de drenado para el recipiente 102 la cual se extiende entre el recipiente 102 y la fuente 107 de vacio via la válvula 118, la rama 132 de muestra se conecta a la rama de drenado entre el recipiente 102 y la válvula 118 y la rama de succión se conecta a la rama 132 de salida más allá de la válvula 118 en relación al recipiente; y - una rama 139 de salida la cual conecta la parte corriente abajo del recipiente 300 via la válvula 119 a un recipiente de desperdicio, por ejemplo a presión atmosférica o via una fuente de succión, una jeringa o una bomba peristáltica . En una primera posición 116A de la válvula 116, la jeringa 105 de dilución está en comunicación con el depósito de diluyente de manera que el movimiento T de jalado permite que la jeringa 105 se llene con el diluyente.
En un primer caso la jeringa de dilución contiene diluyente, con la válvula 116 que se encuentra en su segunda posición 116B la cual conecta la jeringa 105 a la rama 136 de dilución y la válvula 115 está en su primera posición 115A la cual conecta la rama de dilución al uso 108 para el diluyente, un movimiento P de empuje permite que el diluyente se mueva a este uso 108, por ejemplo en el recipiente 102, por ejemplo para una dilución de la muestra completa. En un segundo caso, con la válvula 116 que se encuentra en su segunda posición 116B y la válvula 155 que está en su segunda posición 115B el cual conecta la rama de dilución a la rama 135 de tuberia, un movimiento P de empuje permite que el diluyente se mueva dentro del recipiente 300 óptico con el fin de formar en ese lugar un flujo de tuberia. La utilidad de este flujo de tuberia en el contexto de la invención se analizará en una descripción del recipiente 300 posterior . La válvula 117 está en una primera posición 117A la cual conecta la jeringa del reactivo al depósito 104 de reac-tivo y la válvula 114 está en una primera posición 114A la cual desconecta la rama 134 de descarga, un movimiento T de jalado permite que la jeringa 106 de reactivo se llene con reactivo . En el primer caso, la jeringa de reactivo que contiene reactivo, con la válvula 117 que se encuentra en su segunda posición 117B la cual se conecta con la jeringa 104 de reactivo a la rama 141 de reacción y la válvula 111 que se encuentra en una primera posición 111A la cual conecta la rama de reacción con el uso 109 para el reactivo, un movi-miento P de empuje permite que el reactivo se mueva a este uso 109, por ejemplo en el recipiente 102, por ejemplo para la lisis de la muestra completa. En el segundo caso, la válvula 117 está en su segunda posición 117B y la válvula 111 está en su segunda posición 111B la cual conecta la rama 141 d reacción con la rama 131 de inyección, la jeringa 106 de reactivo está conectada directamente al inyector 302. La válvula 118 está en una primera posición 118A la cual aisla la rama 133 de succión de la rama 132 de muestra a través de la rama de drenado, la válvula 112 está en una primera posición 112A la cual conecta la parte corriente arriba con la parte corriente abajo de la rama 132 de muestra, la válvula 113 está en una primera posición 113A la cual conecta la parte corriente abajo con la parte corriente arriba de la rama 133 de succión, por lo tanto a la fuente 107 de vacio, la muestra que va a ser analizada es succionada dentro de la rama 131 de inyección, entre el punto 142 de ramificación de muestra y el punto 143 de ramificación de succión . Esta rama 134 de descarga comprende una resistencia 150 de fluido variable o calibrada. Cuando la jeringa 105 diluyente contiene diluyente, la jeringa 106 de reactivo contiene el reactivo y la muestra de sangre que a va ser analizada está en la rama 131 de inyección; y cuando las válvulas 112 y 113 están en sus segundas posiciones 112B y 113B las cuales aislan la parte corriente arriba y la parte corriente abajo de sus brazos respectivos; y cuando las válvulas 115 y 116 están en sus segundas posiciones 115B y 116B las cuales conectan la jeringa 105 de diluyente con el volumen 303 de tuberia; cuando finalmente las válvulas 111 y 117 están en sus segundas posiciones 111B y 117B las cuales conectan la jeringa 106 de reactivo con el inyector 302 y la válvula 114 está en su segunda posición 114B; un único movimiento P de empuje generado por la motorización M único permite el impulso del diluyente, el reactivo y la muestra de sangre en la dirección hacia y a través del recipiente 300 mientras parte del reactivo, el cual es una función de la resistencia 150 de fluido se regresa al depósito 104 de reactivo. La resistencia 150 en particular permite el ajuste de los caudales de los líquidos de tuberia y de desplazamiento uno con respecto al otro. Esto permite que estos caudales se adapten a las diferentes funciones de estos líquidos. En particular, esto permite que se obtengan veloci-dades de flujo similares para la tuberia y la muestra en la zona 304 de análisis cuando se utiliza un recipiente de hidroenfoque estándar. En particular, la rama 134 de descarga y las distribuciones descritas previamente posibilitan el uso de una motorización única y por lo tanto se reduce en particular el costo de un aparato de análisis automático asi como su volumen . Las formas diluyentes en una zona 304 de análisis del recipiente 300 de un flujo de tuberia para la muestra (véase en particular las figuras 4 y 5) . El reactivo, situado corriente arriba de la muestra en la rama 131 de inyección sirve como un liquido de desplazamiento, es decir, permite que el movimiento de pistón de la jeringa de reactivo se transmita a la muestra. Por lo tanto, no hay punto en el llenado de la jeringa de reactivo con la muestra con el fin de que sea capaz de llevar a cabo su análisis. Por lo tanto, incluso una muestra de volumen pequeña se puede analizar y la totalidad de esta muestra se puede inyectar y analizar sin que permanezca una parte de la misma en la rama 131 de inyección o en la jeringa 106. Por supuesto, otras jeringas, válvulas y ramas no representadas en la figura 3 pueden constituir el circuito 100 hidráulico con el fin de que el aparato 20 de análisis automático funcione de manera completa y bien. El dispositivo 200 óptico de acuerdo con la invención se describirá ahora, en particular con respecto a las figuras 4 y 5. El dispositivo óptico comprende una fuente 201 de luz aproximadamente monocromática. Esta fuente de luz es un diodo electroluminiscente. La luz es emitida principalmente a lo largo de un eje X200 óptico. Este eje X200 óptico está distribuido aproximadamente perpendicular a un eje X300 de inyección para movimiento de la muestra en un recipiente 300 óptico. LOs dos ejes X200 y X300 juntos definen un plano óptico. Con el fin de evitar que el haz 311 de luz de la fuente producido por la fuente 201 se contamine por luz espuria, se colocan un conjunto de tres diafragmas, cada uno perpendicular a la trayectoria del haz. Estos diafragmas 202 están perforados con orificios cuyo diámetro es aproximadamente igual al haz y se incrementan progresivamente en cada diafragma con el fin de adaptarlo al diámetro del haz de medición conforme el diámetro aumenta alejándose de la fuente 201. El haz después pasa a través del dispositivo 203 de enfoque constituido por uno o más lentes. Más allá del dispositivo de enfoque, el haz se encuentra en un dispositivo de ajuste el cual permite que el eje óptico se mueva en un plano perpendicular al eje X300 de inyección, es decir, en una dirección transversal en relación al movimiento de la muestra en el recipiente. Un desplazamiento lateral del haz puede generar una iluminación parcial o nula de la muestra lo cual tiene influencia directa en el resultado del análisis. En el contexto del ejemplo descrito, el dispositivo de ajuste está constituido por un portaobjetos 220 transparente montado giratoriamente alrededor de un eje 220. El eje 221 es aproximadamente paralelo al eje X300 de inyección. Si el portaobjetos se coloca perpendicular al X200 óptico, el haz pasa a través del mismo sin que se desvié. En contraste, si el portaobjetos forma un ángulo con el eje óptico, una refracción doble, en la entrada y la salida del portaobjetos, desvia el haz en un plano perpendicular al eje X220 de ajuste. El eje X220 de ajuste es aproximadamente paralelo al eje X300 de inyección, únicamente se genera un desplazamiento transversal por la refracción en el portaobjetos. Cuanto mayor sea el espesor y/o el Índice de refracción del portaobjetos y más inclinado esté el portaobjetos con respecto al eje óptico, mayor es el desplazamiento. De esta manera, para un portaobjetos con un espesor y un Índice de refracción seleccionados, es suficiente hacer girar el portaobjetos 220 alrededor de su eje X220 con el fin de ajustar la posición del haz en relación a la muestra la cual se mueve en la zona 304 de análisis del recipiente 300 óptico. Dicho dispositivo de ajuste es particularmente económico en comparación con los dispositivos de la técnica anterior, especialmente dado que una rotación precisa generalmente es más fácil de llevar a cabo en comparación con una translación precisa, utilizando mecánica de alta precisión. Después de haber penetrado en el recipiente y de haber pasado a través de la muestra, el haz 211 de fuente se vuelve por lo menos parcialmente un haz 212 resultante axialmente el cual sale del recipiente aproximadamente a lo largo del eje óptico. El haz 212 resultante axialmente transporta información acerca de la muestra a través de la cual ha pasado. Con el fin de permitir mediciones simultáneas de varios de estos artículos de información, debe ser posible analizar el haz con varios aparatos 222, 223 de medición. En particular, el análisis óptico se basa en la detección de la luz desviada de acuerdo con dos intervalos de ángulos: ángulos estrechos y ángulos amplios. En cada uno de estos intervalos de ángulos, los dos artículos diferentes de información se utilizan. Por lo tanto, es necesario distribuir la luz en dos canales diferentes para cada intervalo. Por lo tanto, se utiliza un medio 205 para separar el haz 212 resultante en dos haces 213 u 214 resultantes. El medio de separación está constituido principalmente por un divisor 205 de haz. Este divisor de haz es un portaobjetos de vidrio transparente. Se coloca a 45 grados respecto al eje óptico. Se forma un haz 213 axialmente resultante secundario por la luz que pasa a través del divisor de haz y el haz que resulta de las pérdidas 214 formadas por las pérdidas Fresnel, es decir, por la luz reflejada por el divisor de haz y se produce de esta manera. Dicho divisor de haz tiene un costo muy bajo en comparación con el medio de separación utilizado en la técnica anterior en dispositivos de análisis ópticos de este tipo. En particular, debido a que no comprende ningún recubrimiento reflejante adicional, es virtualmente resistente al envejecimiento y prácticamente no requiere mantenimiento. Dadas las múltiples reflecciones dentro del portaobjetos y la polarización de la radiación incidente del haz resultante axialmente, se refleja entre 5 y 15% de la energia, el resto se transmite en forma de un haz axialmente resultante secun-dario. Entre el recipiente y el divisor de haz, el haz 212 axialmente resultante se vuelve paralelo por el medio 206 adecuado. Más allá del divisor de haz, los haces 213, 214 resultantes nuevamente se enfocan por el medio 207, 208 ade-cuado respectivo con un observador para su análisis por el aparato 222, 223 de medición respectivos. En el ejemplo descrito, el aparato 222 de medición el cual analiza el haz 213 axialmente resultante secundario es un aparato para la medición de la difracción cercana al eje óptico por las células de la sangre (denominada una medición FSC) . En el ejemplo descrito, el aparato 223 de medición, el cual analiza el haz producido por las pérdidas 214 Fresnel es un aparato para medición de las pérdidas de luz en el eje (denominado medición ALL), es decir, el oscure-cimiento de la luz por las células en la muestra. La figura 5 representa diagramáticamente una sección del recipiente en un plano perpendicular al eje X300 de inyección y que contiene un eje X200 óptico. Como se ilustra particularmente en esta figura, la luz reemitida lateralmente por la muestra en un flujo 315 resultante lateralmente, enfocado más allá del recipiente en un aparato 224 de medición también se analiza. Un recipiente óptico de acuerdo con la invención, en particular diseñado para uso con un circuito hidráulico tal como el descrito previamente se describirá en lo siguiente, en particular con referencia a la figura 6. El funcionamiento de este recipiente se puede comparar con una operación de tipo de hidroenfoque de la técnica anterior, el cual está representado de manera muy diagramática en la figura 10. El recipiente 350 de la figura 10 comprende un cuerpo 351, un inyector 302 y una zona 354 de análisis. Una dimensión D354 transversal interna del recipiente es de aproximadamente 250 micrómetros. Esta dimensión puede ser un diámetro si el recipiente tiene una sección circular, o un lado, si el recipiente tiene una sección cuadrada o rectangular. Como se ilustra por las lineas discontinuas, el flujo 362 de tuberia se utiliza para reducir el diámetro particular de un flujo 361 de muestra de manera que en la zona 354 de análisis el flujo de muestra tiene, en la técnica anterior, un diámetro D361 de menos de 50 micrómetros. El recipiente 300 de acuerdo con la invención, que se ilustra en las figuras 4-6, comprende el cuerpo 301 y el inyector 302, distribuidos de manera aproximada coaxialmente a lo largo del eje X300 de inyección. La zona 304 de análisis está distribuida corriente abajo del inyector. El cuerpo se produce a partir de un material inyectado, preferiblemente de un material plástico. Tal método de producción permite que se obtengan formas complejas. En particular, se moldea en el cuerpo un lente 305. Este lente permite que la luz la cual es oscurecida, difractada o difundida en las células de la sangre sea recolectada. Este lente debe tener dimensiones, en particular diámetro suficiente para posibles heterogeneidades locales en el material inyectado para que sea despreciable en relación a estas dimensiones. En el ejemplo que se ilustra, el lente 305 tiene un diámetro de aproximadamente 3 mm. Este lente inyectado es un lente 305 lateral el cual permite que pase a través del mismo el haz 315 resultante lateralmente. Además, el lente lateral debe permitir que se recolecte la luz en tantas direcciones como se pueda, es decir, con un campo direccional el cual sea tan grande como se pueda. Por lo tanto, cuanto más cerca esté el lente en la muestra mayor será el campo direccional. En el ejemplo que se ilustra, el lente es un lente semiesférico denominado lente de 90 grados. Además, el lente es parte de la pared del recipiente, y existe un contacto directo con el liquido en el recipiente, es decir, no hay espacio con aire, con un bajo Índice de refracción entre la muestra y el lente. Esto mejora la medición. Con el fin de resolver las deficiencias de homogeneidad se utiliza vidrio cuando la luz se enfoca particularmente, por ejemplo, un vidrio del tipo BK7. Este es el caso en particular para las ventanas axiales 306, en donde el haz 211 de fuente penetra en el recipiente y en donde el haz 212 axialmente resultante sale del mismo. Con el fin de poder producir un lente inyectado con dichas dimensiones, es necesario que en la zona de análisis para el recipiente 300 tenga las menores dimensiones comparables. Además, estas dimensiones grandes permiten que las ventanas de vidrio se integren en las paredes de plástico mientras que los recipientes de la técnica anterior, que tienen dimensiones pequeñas, se fabrican con paredes completamente de vidrio o cuarzo. En el ejemplo ilustrado en particular en las figuras 5 y 6, la menor sección del recipiente es de 4.5 mm a lo largo del eje óptico por 3 mm en la dirección perpendicular. Esta sección rectangular con dimensiones grandes asociado con un volumen pequeño de la muestra la cual transporta las células sanguíneas que van a ser analizadas, requiere el uso de una tuberia hidrodinámica de la muestra. A modo de comparación, un recipiente de la técnica anterior que tiene una dimensión D354 transversal interna de esta zona de análisis cercana a 250 micrómetros. Corriente arriba de la zona 304 de análisis, el cuerpo 301 del recipiente rodea al inyector 302 y forma alrededor del inyector el volumen 303 de tuberia. Las paredes del inyector separan un flujo 311 que se forma por la muestra, dentro del inyector, del flujo 312 de tuberia, en el volumen de tuberia. El flujo de la muestra se origina desde la rama 131 de inyección del circuito 100 hidráulico. El flujo de tuberia se origina desde la rama 135 de tuberia del circuito hidráulico. En la zona de análisis los dos flujos entran en contacto, permaneciendo concéntricos y fluyendo de manera simultáneamente en el recipiente. Con el fin de reducir los costos de producción del aparato automático, puede ser ventajoso reducir la precisión de la producción de las partes. Como se ha mencionado en lo anterior, dicho objetivo se puede obtener al generar un flujo de muestra con una sección más grande. No obstante, si se utiliza la técnica anterior en donde el flujo de muestra es estrechado por un flujo de tuberia, el flujo de muestra con una sección grande será turbulento, lo cual en particular perjudica la precisión de las mediciones. Además la sección del flujo de muestra se reducirá progresivamente, lo cual es opuesto al efecto deseado, el cual es tener un flujo de muestra con una sección grande. Dicho objetivo se obtiene mediante la utilización del circuito 100 hidráulico de acuerdo con la invención, descrito previamente con referencia a la figura 1. Dicho circuito posibilita obtener velocidades seleccionadas independientemente para el flujo del flujo de tuberia y para el del flujo de muestra con el fin de que aparezca poca turbulencia en el flujo de muestra y que esta turbulencia no tenga un efecto notable sobre el resultado de análisis. Cada uno de los dos flujos puede ser aproximadamente uniforme, opcionalmente laminar en ciertos intervalos de velocidad apropiados. Además, un inyector 302, como se ilustra en la figura 7 o la figura 8, también permite la limitación de la turbulencia en el flujo de muestra. Además, permite una alta velocidad de inyección de la muestra dentro del recipiente óptico mientras retiene su flujo aproximadamente uniforme. Un inyector 302 como se ilustra en la figura 7 comprende un tubo 320 estructural, por ejemplo elaborado de acero inoxidable que asegura la rigidez del inyector. El tubo estructural está cubierto en el interior con un tubo 321 elaborado de un plástico, por ejemplo, un politetrafluoroetileno (PTFE) . En el ejemplo que se ilustra, los tubos estructural y con cubierta son cilindricos. El tubo con cubierta se extiende corriente abajo del tubo estructural por una boquilla elaborada del mismo material plástico. El hecho de diferenciar la función estructural del tubo estructural y la función de inyección de la boquilla, asociada con el uso de un material plástico permite que se obtengan formas suficientemente precisas a bajo costo. La boquilla tiene una sección la cual se estrecha progresivamente desde un diámetro D321 interno del tubo de cubierta a un diámetro D323 interno de un orificio 329 de salida en el extremo 324 corriente abajo de la boquilla 322. En el ejemplo descrito, el extremo 324 corriente abajo es un cilindro con una longitud L324. La pared de la boquilla inicialmente es cóncava hacia adentro, después se desvia para volverse convexa hacia adentro. La sección de la boquilla de esta manera progresivamente se estrecha desde la parte corriente arriba a la corriente abajo, desde el diámetro D321 al diámetro D324. La superficie cóncava es tangente a la superficie interior del tubo con cubierta cilindrico. La superficie convexa es tangente a la superficie interior del extremo 324 cilindrico. En el ejemplo descrito el diámetro D323 del orificio 323 es de aproximadamente 60 micrómetros, el diámetro D321 interno del tubo con cubierta es de aproximadamente 1 milímetro, la longitud L322 de la boquilla es de aproximadamente 2.5 milimetros, en donde L320 del tubo estructural es aproximadamente 6 milimetros y en donde el extremo L324 cilindrico es de aproximadamente 200 micrómetros. Un inyector 302, tal como el ilustrado en las figuras 8 y 9 es una pieza única y se elabora de un material único sustancialmente rigido. Este material puede ser, por ejemplo, acero inoxidable, un material cerámico, rubí sinté-tico o un material plástico. El material plástico ventajosamente puede ser politetrafluoroetileno. El inyector comprende un tubo 331 aproximadamente cilindrico el cual se extiende corriente abajo por una boquilla 332. La boquilla se estrecha progresivamente hacia adentro, desde un diámetro D331 interno para el tubo 331 a un diámetro D 333 interno de un orificio 333 de salida para la muestra, en el extremo 334 corriente abajo de la boquilla 332. En el ejemplo que se ilustra, el estrechamiento se lleva a cabo de acuerdo con un cono truncado abierto en un ángulo comprendido preferiblemente entre 9 y 10 grados. Más allá del cono truncado y arriba del orificio 333 de salida el diámetro permanece constante en una parte 335 cilindrica con una longitud L335 y un diámetro D333. En el exterior de la boquilla, su diámetro externo es progresivamente más grande de acuerdo con un cono truncado cubierto en un ángulo comprendido entre aproximadamente 8 y
9 grados, después, en el extremo más reducido perceptiblemente de acuerdo con un cono truncado abierto en un ángulo A334 comprendido entre aproximadamente 35 y 45 grados, en un diámetro D334 externo alrededor del orificio 333 de salida. D334 es aproximadamente 3 a 4 veces más grande que D333. A modo de ejemplo, D333 = 60 µm, D334 = 200 µm y A334 = 40°. Gracias a las diferentes distribuciones descritas previamente, es posible obtener una alta velocidad de inyección. Asi, en el ejemplo descrito es posible inyectar una muestra de más de 200 microlitros en menos de
10 segundos. En particular, dicha velocidad de inyección posibilita el uso de una alta velocidad de dilución de la muestra de sangre sin incrementar la duración del análisis en comparación con aparatos automáticos a la técnica anterior. En particular, se puede utilizar la misma dilución, por ejemplo 1/160 para el análisis de la hemoglobina por el dispositivo 110 (véase la figura 3) y para el análisis de leucocitos por el dispositivo 120 óptico, en vez de 1/80 utilizado generalmente para el análisis de los leucocitos. Las figuras lla-llc ilustran los resultados que se obtienen utilizando el método y el equipo de acuerdo con el primer objetivo de la invención, dicho equipo utiliza un recipiente 7 óptico de acuerdo con el tercer objetivo de la invención y un dispositivo 8 óptico de acuerdo con el segundo objetivo de la invención. La figura lia muestra una prueba de linealidad positiva de la medición de hemoglobina y por lo tanto demuestra la medición posible y confiable de la concen-tración de hemoglobina de una muestra de sangre de acuerdo con la invención. La figura llb muestra una matriz óptica obtenida de la muestra de prueba de sangre con 30% de eosinófilos a la cual se le ha agregado la formulación de acuerdo con la invención. En esta matriz, las cinco subpobla-dones están presentes y diferenciadas (grupos delimitados por la citografia: E para eosinófilos, N para neutrófilos, M para monocitos, B para basófilos y L para linfocitos) . La figura llc muestra la prueba de linealidad positiva de la medición por resistividad del nivel de leucocitos. Estas figuras muestran que gracias a la invención es posible llevar a cabo un análisis de por lo menos la concentración de hemoglobina y el nivel de leucocitos y una diferenciación de leucocitos utilizando la formulación de acuerdo con la invención, en particular en forma de un monorreactivo. Por supuesto, la invención no se limita a los ejemplos que se acaban de describir y se pueden aplicar numerosas modificaciones a estos ejemplos sin exceder el alcance de la invención. Por ejemplo se pueden utilizar productos además del diluyente o el reactivo con el fin de formar respectivamente el flujo de tuberia y el pistón fluido, particularmente si están disponibles en el aparato automático para otros usos. Además, en vez de estar colocada únicamente sobre el circuito de inyección, se puede colocar una resistencia de fluido sobre el circuito de tuberia o en ambos de estos, simultáneamente. Esto se puede llevar a cabo como una función del caudal máximo dado via el medio para desplazamiento de los líquidos diseñados respectivamente para desplazamiento o para tuberia. Varios o la totalidad de los lentes del recipiente óptico y/o del dispositivo óptico de esta manera se pueden producir por inyección con el cuerpo del recipiente, en vez de uno único como se ilustra previamente. En particular, se pueden inyectar las ventanas de vidrio. Particularmente si la carencia de homogeneidad en el material inyectado es más o menos despreciable con respecto a la precisión deseada para las mediciones. Un dispositivo de ajuste y/o un medio de separación descrito previamente puede utilizarse independientemente entre si y opcionalmente con una fuente de luz diferente al diodo electroluminiscente. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (1)
- REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para el análisis automático de una muestra de sangre, en el cual: una solución de análisis contiene la muestra de sangre, un diluyente y: por lo menos un compuesto para lisar los eritrocitos; por lo menos un compuesto para estabilizar la hemoglobina en forma de un complejo cromogénico, se forma en un recipiente único de dilución y análisis, se mide el nivel de hemoglobina en la solución de análisis por espectrofotometria en el recipiente después de la lisis de los eritrocitos; y se toma una cantidad apropiada de esta solución de análisis del recipiente en el cual se lleva a cabo la diferenciación leucocitica por un medio óptico, caracterizado porque la solución de análisis también contiene por lo menos un compuesto para proteger los leucocitos, lo que permite diferenciar por lo menos cuatro subpoblaciones principales de leucocitos. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la solución de análisis contiene por lo menos un compuesto para estabilizar la hemoglobina en forma de oxihemoglobina. 3. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque también se agrega a la solución de análisis un colorante o mezcla de colorantes que marcan específicamente por lo menos una subpoblación de leucocitos. . El método de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los compuestos son químicamente compatibles, se agregan para formar la solución de análisis en forma de un monorreactivo. 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el monorreactivo es adecuado para llevar a cabo la función de diluyente con el fin de producir una monodilución de la muestra de sangre. 6. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la solución de análisis tiene una tasa de dilución de la muestra de sangre adecuada para medir la hemoglobina por espectrofotometria . 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la tasa de dilución de la solución de análisis está comprendida entre 1/100 y 1/500, y de manera preferible entre 1/160 y 1/180. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el número de leucocitos en la solución de medición en el recipiente se conteo por resistividad. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el número de leucocitos en la solución de medición en el recipiente se conteo utilizando el medio ópt ico. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el muestreado de una cantidad apropiada de solución de análisis para llevar a cabo la diferenciación de leucocitos se lleva a cabo antes de la medición de la hemoglobina en el recipiente, la tasa de dilución de la solución de medición muestreada es adecuada para la medición por medios ópticos y en donde el diluyente se agrega a la solución de análisis remanente de manera que se incrementa la dilución en el recipiente con el fin de obtener una dilución adecuada para una medición de la hemoglobina por e spect ro fot orne tria . 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el medio óptico es un citómetro de flujo de tipo hidroenfoque y la tasa de dilución de la solución de análisis muestreada para medición por citometria es menor de 1/100. 12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el medio óptico es un citómetro con tuberia pasiva y la tasa de dilución de la solución muestreada para medición por citometria es mayor de 1/100. 13. El método de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque la tasa de dilución de la solución de medición para la medición de la hemoglobina por espectrofotomet ria está comprendida entre 1/100 y 1/500. 14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en una etapa antes de la adición de dichos compuestos, se toma una fracción de una presolución constituida por la muestra de sangre y diluyente en la cual se lleva a cabo por resistividad el conteo de eritrocitos y/o plaquetas. 15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el compuesto de lisis es un tensioactivo iónico que se selecciona de: sales de amonio cuaternario, preferiblemente sales de alquiltrimetilamonio y de manera aún más particular bromuros y cloruros de cetil-, dodecil-, tetradecil- y hexadeciltrimetilamonio; sales de piridinio; aminas etoxiladas de cadena larga; y sulfatos de alquilo (SDS). 16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el compuesto el cual estabiliza la hemoglobina en forma de un complejo cromogénico preferiblemente se selecciona de: quelatos monodentados o polidentados que presentan átomos de ligando (pares sin unión: 0, N, S y grupos carboxi COO-, etc.), compuestos aromáticos (quelatos monodentados o polidentados) que comprenden átomos de ligando (que tienen pares no unidos: 0, N, S, etc.), y saponinas, óxidos de amina terciarias, betainas y sulfobetainas de amonio cuaternario. 17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el compuesto leucoprotector es un tensioactivo no iónico o anfotérico que preferiblemente se selecciona de: alcoholes etoxilados, betainas y sulfobetainas de amonio cuaternario, óxidos de amina terciaria, compuestos de tipo glucosidico y compuestos de tipo glucidico. 18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el agente de fijación de la membrana de los depósitos también se agrega a la solución de análisis. 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque un amortiguador de pH capaz de establecer el pH de la solución de análisis entre 5.0 y 8.0, de manera preferible en un pH de 7 también se agrega a la solución de análisis. 20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque también se agrega a la solución de análisis una sal de fondo para asegurar su conductividad. 21. Un aparato de análisis hematológico para la implementación del método de conformidad con la una de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque comprende: una dilución única y un recipiente de análisis adecuado para recibir dicha solución de análisis; un medio para medición por espectrofotometria en el recipiente del nivel de hemoglobina en la solución de análisis; un medio de muestreado de la solución de análisis; y un medio para la solución óptica de la muestra con el fin de llevar a cabo el análisis de leucocitos. 22. El aparato de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque comprende un medio para contar los leucocitos por resistividad en el recipiente. 23. El aparato de conformidad con la reivindicación 21 ó 22, caracterizado porque comprende medios para llevar a cabo el conteo de eritrocitos y plaquetas. 24. El aparato de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado porque comprende un recipiente de conteo para los eritrocitos y plaquetas y medios para medir la resistividad en el recipiente de conteo.
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