MX2007010493A - Compuestos que tienen propiedades reductoras de lipidos. - Google Patents

Abstract

Se proporciona una terapia para reducir los niveles en sangre de un lipido seleccionado del grupo que comprende colesterol LDL, trigliceridos, colesterol total y mezclas de los mismos, la terapia comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva de uno o mas derivados de fosfato de uno o mas agentes de transferencia de electrones.

Description

COMPUESTOS QUE TIENEN PROPIEDADES REDUCTORAS DE LÍPIDOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a una terapia que utiliza la capacidad de agentes de interferencia de electrones modificados para reducir los niveles circulantes en sangre de uno o más de los siguientes lípidos: colesterol LDL, triglicéridos y sobre todo colesterol.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En esta descripción cuando se hace referencia o se describe un documento, acto o artículo de conocimiento, esta referencia o descripción no es una admisión de que el documento, acto o artículo de conocimiento o cualquier combinación del mismo fuera en la fecha de prioridad, disponible públicamente, conocido por el público, parte del conocimiento general común o conocido como relevante para un intento por resolver cualquier problema con el cual esté relacionada esta descripción.

Aunque la siguiente descripción se refiere a una enfermedad cardiovascular, se debe entender que es simplemente ilustrativa y que la invención no está limitada a enfermedades cardiovasculares sino que la invención también se refiere similarmente a cualquier condición que implique niveles de l ípidos incrementados.

La enfermedad cardiovascular (CVD) que incluye enfermedad del corazón y apoplejía es el número uno de causa de muerte en las sociedades occidentales. Se cree que esto se debe a un número de factores que incluyen, una excesiva proliferación de células de músculo liso vasculares (SMC), colesterol total elevado y colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL). Aunque cambios en el estilo de vida, incluyendo dieta y ejercicio, se recomiendan como primeras líneas de intervención, la terapia con fármacos no sólo se usa comúnmente, y también se garantiza comúnmente.

Aunque comúnmente se considera al mismo tiempo la misma cosa, la enfermedad cardiaca y cardiovascular son diferentes, incluyendo diferentes partes del cuerpo. Enfermedad cardiaca se refiere sólo a enfermedades del corazón y el sistema de vasos sanguíneos dentro del corazón. Enfermedad cardiovascular se refiere a enfermedades del corazón y enfermedades del sistema de vasos sanguíneos (arterias, capilares, venas) dentro del cuerpo completo de una persona, tal como el cerebro, piernas y pulmones. "Cardio" se refiere al corazón y "vascular" se refiere a vasos sanguíneos.

El corazón es una fuerte bomba muscular ligeramente más grande que un puño. Bombea sangre continuamente a través del sistema circulatorio, la red de tubos elásticos y permite que la sangre fluya a lo largo del cuerpo. El sistema circulatorio incluye los órganos principales, el corazón y pulmones, y vasos sanguíneos (arterias, capilares y venas). Las arterias y capilares llevan sangre rica en oxígeno y nutrientes del corazón y pulmones a todas las partes del cuerpo. Las venas llevan la sangre agotada en oxígeno y nutrientes de regreso al corazón y los pulmones. Los problemas del corazón y los vasos sanguíneos no ocurre rápidamente. Con el tiempo, las arterias que llevan sangre al corazón y cerebro pueden volverse bloqueadas a partir de una acumulación de células, grasa y colesterol (placas). Un flujo de sangre reducido al corazón a partir del bloqueo en las arterias causa ataques cardiacos. La falta de flujo sanguíneo al cerebro a partir de un coágulo de sangre, o sangrado en el cerebro a partir de un vaso sanguíneo roto, ocasiona una apoplej ía.

Existen muchas formas de enfermedad cardiovascular y cardiaca, y a continuación se da una lista de las más comunes de estas enfermedades. • enfermedad cardiaca coronaria (o enfermedad de arterias coronarias) • Angina • Apoplej ía • Alta presión sanguínea (o hipertensión) • Insuficiencia cardiaca Muchas cosas pueden poner a una persona en riesgo de enfermedad cardiaca y cardiovascular. Los principales factores de riesgo (o cosas que incrementan el riesgo) que una persona tiene, entre mayor sea la probabilidad de que una enfermedad del corazón o cardiovascular se desarrolle.

Los factores incluyen los siguientes: • edad; • fumador (activo o pasivo); • alta presión sanguínea; • alto colesterol en sangre; • inactividad física; • peso corporal excesivo y • diabetes.

Existen algunos factores que no pueden controlarse tales como envejecer, el historial de salud familiar y la raza. Sin embargo, es posible controlar los tres principales factores de riesgo para enfermedad cardiaca y cardiovascular -fumar, alta presión sanguínea y alto colesterol en sangre. Tener una dieta baja en grasas saturadas y colesterol y hacer ejercicio regular son hábitos de salud excelentes. Estos buenos hábitos de salud reducirán la presión sanguínea y mantendrán los niveles de colesterol y azúcar en sangre saludables.

El colesterol es una sustancia grasa hecha por el hígado y que se encuentra en todas las partes del cuerpo. El cuerpo usa el colesterol para producir membranas celulares, hormonas, vitamina D y los ácidos biliares que ayudan a digerir la grasa. Toma sólo una pequeña cantidad de colesterol en la sangre para satisfacer estas necesidades, y el hígado hace a todo el colesterol las necesidades del cuerpo.

El colesterol también es acumulado a partir de alimentos. Comer demasiado colesterol en alimentos animales tales como carnes, productos lácteos enteros, yemas de huevo, aves de corral y pescado puede incrementar los niveles de colesterol. Sin embargo, la grasa saturada en dietas es el principal culpable que ocasiona que los niveles de colesterol se eleven.

El colesterol viaja a través de la sangre en paquetes llamados lipoproteínas. Lipoproteína de baj a densidad (LDL) y lipoproteína de alta densidad (HDL) son dos tipos de lipoproteínas. LDL es comúnmente llamada el tipo "malo" de colesterol porque puede ocasionar la acumulación y bloqueo en las arterias que llevan sangre al corazón. HDL se conoce como colesterol "bueno" porque ayuda a remover el colesterol de la sangre, evitando la acumulación y bloqueo en las arterias.

Las medicinas usadas para reducir los niveles de colesterol, si se requieren, se usan como con cambios en estilo de vida. La principal meta del tratamiento para la reducción del colesterol es la de reducir los niveles de LD L (colesterol malo) lo suficiente como para reducir el riesgo de adquirir enfermedad cardiaca o tener un infarto. Existen varios tipos de fármacos disponibles para reducir el colesterol, incluyendo estatinas, secuestrantes de ácidos biliares, ácido nicotínico y ácidos fíbricos. Cada clase de fármacos tiene sus propios beneficios, efectos secundarios y precauciones.

* Todos los tipos de fármacos reductores de colesterol -con la posible excepción de inhibidores de colesterol- pueden causar anormalidades en la función hepática.

Aunque estos fármacos reductores de colesterol son muy importantes para reducir el riesgo de enfermedad cardiaca, existe el problema con todos ellos de que una vez que el nivel deseado ha sido logrado, es necesario continuar tomando los fármacos independientemente para mantener ese nivel.

Existe entonces la necesidad de una sustancia farmacéutica que puede usarse para reducir los niveles de lípidos que tenga menos efectos secundarios que los fármacos actuales y que no lleve a una necesidad indefinida de administrar el fármaco.

Tocoferol Bajos niveles de a-tocoferol (vitamina E) han estado asociados con incidencia incrementada de enfermedad cardiaca coronaria. De manera inversa, un consumo incrementado de alta-tocoferol ha demostrado tener efectos protectores contra enfermedad cardiaca. Ya que la vitamina E es un antioxidante, se cree que se dirige a la causa de aterosclerosis al evitar la oxidación de LDL. Estudios también se han llevado a cabo para examinar mecanismos no antioxidantes potenciales de vitamina E que podrían prevenir la formación de placas ateroscleróticas. Estas respuestas incluyen la inhibición de proliferación de células de músculo liso, la conservación de función endotelial, inhibición de la adherencia monocito-endotelial, inhibición de especies de oxígeno reactivas en monocitos y liberación de citocinas, así como la inhibición de la adherencia y agregación plaquetaria. Pruebas clínicas con vitamina E han sin embargo sido equívocas para demostrar tratamiento de aterosclerosis. Los suplementos de vitamina E actuales son por lo tanto no una opción clínica útil para combatir aterosclerosis.

En la solicitud de patente internacional No. WO 03/026673 , hay una descripción de que tener niveles de almacenamiento incrementado de vitaminas, incluyendo fosfato de tocoferilo, podría ser benéfico para aliviar o tratar condiciones inflamatorias tales como enfermedad coronaria, aterosclerosis y diabetes. Sin embargo, no hay descripción de reducir los niveles de lípidos en sangre tales como colesterol. El proceso de inflamación implica un conjunto de vías complicado. Estas vías no están implicadas en las vías de metabolismo de lípidos, consumo de colesterol, etc.

El fosfato de tocoferilo también se ha descrito en la solicitud de patente internacional No. WO 2004/06483 1 como teniendo propiedades relacionadas a inhibir la proliferación de monocitos/macrófagos, proliferación de células de músculo liso, la expresión de receptores CD36 y la captación de LDL oxidado. Sin embargo, no hay descripción de reducir los niveles de sangre de lípidos tales como colesterol. Existen demasiados estudios que han demostrado que CD36 promueve cambios en respuesta a proteínas que se acumulan en enfermedad de Alzheimer y aterosclerosis. Estos procesos no tienen nada que ver con el metabolismo de lípidos. Por ejemplo, fármacos tales como tratamientos contra la malaria y tratamientos contra el mal de Alzheimer están enfocados a la expresión de CD36 pero no alteran los perfiles de lípidos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha encontrado ahora sorprendentemente que los derivados de fosfato de agentes de transferencia de electrones son más efectivos que los agentes de transferencia de electrones no fosforilados para reducir los niveles en sangre de uno o más de los siguientes lípidos: • colesterol LDL, • triglicéridos y • colesterol total.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona una terapia para reducir los niveles en sangre de un lípido seleccionado del grupo que comprende colesterol LDL, triglicéridos, colesterol total y mezclas de los mismos, la terapia comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva de uno o más derivados de fosfato de uno o más agentes de transferencia de electrones.

Una persona capacitada en la técnica entenderá que la terapia de la invención será útil en relación con el tratamiento terapéutico de enfermedades que estén asociadas con niveles en sangre incrementado de uno o más de los siguientes lípidos: colesterol LDL, triglicéridos y colesterol total. Ejemplos de estas enfermedades incluyen, pero no están limitados a, enfermedad cardiovascular, aterosclerosis, diabetes mellitus, enfermedad renal crónica, hiperlipidemias primarias y secundarias y dislipidemia, retinopatías, agrandamiento de hígado y bazo y xantomas.

La invención incluye entonces una terapia para aliviar síntomas, tratar o prevenir una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad cardiovascular, aterosclerosis, diabetes mellitus, enfermedad renal crónica, hiperlipidemias primarias y secundarias y dislipidemia, retinopatías, agrandamiento de hígado y bazo, xantomas y combinaciones de los mismos, la terapia comprende administrar a una formulación farmacéutica que comprenda una cantidad efectiva de uno o más derivados de fosfato de uno o más agentes de transferencia de electrones a un sujeto que tenga o esté en riesgo de desarrollar la enfermedad.

En un aspecto más, la invención proporciona una composición farmacéutica cuando se usa para reducir los niveles en sangre de un grupo seleccionado del grupo que consiste en colesterol LDL, triglicéridos, colesterol total y mezclas de los mismos, la composición comprende una cantidad efectiva de uno o más derivados de fosfato de uno o más agentes de transferencia de electrones.

En un aspecto más, la invención proporciona el uso de una cantidad efectiva de uno o más derivados de fosfato de uno o más agentes de transferencia de electrones junto con un vehículo o diluyente adecuado en la fabricación de un medicamento para reducir los niveles en sangre de un lípido seleccionado del grupo que consiste en colesterol LDL, triglicéridos, colesterol total y mezclas de los mismos.

En otro aspecto de la invención, se proporciona una terapia para reducir los niveles en sangre de un lípido seleccionado del grupo que consiste en colesterol LDL, triglicéridos, colesterol total y mezclas de los mismos, la terapia comprende la etapa de suministrar una cantidad efectiva de uno o más derivados de fosfato de uno o más agentes de transferencia de electrones. En una modalidad de este aspecto, la cantidad efectiva de uno o más derivados de fosfato de uno o más agentes de transferencia electrónica se deriva como un profármaco. De preferencia, el sujeto es un animal, muy preferiblemente el animal es un humano.

El término "cantidad efectiva" se usa en la presente par referirse a una cantidad que es suficiente para reducir los niveles circulantes en sangre de uno o más de los siguientes lípidos: colesterol LDL, triglicéridos y colesterol total. Una persona capacitada en la técnica entenderá que esta cantidad variará de paciente en paciente y se determina normalmente a partir de experiencia con administración clínica a pacientes particulares.

El término "agente de transferencia de electrones" se usa en la presente para referirse a la clase de químicos que pueden ser fosforilados y los cuales (en la forma no fosforilada) pueden aceptar un electrón para generar un radical molecular relativamente estable o aceptar los electrones para permitir que el compuesto participe en un sistema de óxido reducción reversible. Ej emplos de clases de compuestos de agentes de transferencia de electrones que pueden fosforilarse incluyen hidroxicromanos incluyendo alfa, beta, gama y delta tocóles en formas enantiomérica y racémica; quinóles que son las formas reducidas de vitamina K l y ubiquinona; hidroxicarotenoides incluyendo retinol; calciferol y ácido ascórbico. De preferencia, el agente de transferencia de electrones se selecciona del grupo que consiste en tocoferol y otros tocóles, retinol, vitamina K l y mezclas de los mismos.

Muy preferiblemente, el agente de transferencia de electrones se selecciona del grupo que consiste en los tocóles y mezclas de los mismos. Los tocóles incluyen todos los isómeros de derivados de 6:hidroxi 2:metilcromano (véase estructura abajo) en donde Rl s R2 y R3 pueden ser hidrógeno o grupos metilo, es decir, los derivados a-5 :7:8 tri-metilo; ß-5 : 8 di-metilo; ?-7 : 8 di-metilo y d 8 metilo. En los tocoferoles, R4 es sustituido por 4:8 : 12 tri-metil tridecilo e incluye varios esteroisómeros e isómeros ópticos (los centros quirales se indican por el *). En los tocotrienoles, R4 es sustituido por 4:8 : 12 tri-metil trideca-3 :7: l 1 trieno y la posición 2 puede ser estereoactiva como estereoisómeros R o S. Muy preferiblemente, el agente de transferencia de electrones se selecciona del grupo que consiste en a-tocoferol, d-tocoferol, ?-tocoferol, a-tocotrienol, d-tocotrienol y ?-tocotrienol y mezclas de los mismos.

El término "derivados de fosfato" se usa en la presente para referirse a compuestos sólidos covalentemente por medio de un oxígeno al átomo de fósforo de un grupo fosfato formando de esta manera un enlace carbono-oxígeno-fósforo. El átomo de oxígeno se deriva típicamente de un grupo hidroxilo en el agente de transferencia de electrones. El término incluye las formas acidas de agentes de transferencia de electrones fosforilados, sales de los fosfatos incluyendo sales metálicas tales como sodio, potasio, magnesio y calcio, y cualquier otro derivado en el que el protón de fosfato sea reemplazado por otros sustituyentes tales como grupos etilo o metilo o grupos fosfatidilo. El término incluye mezclas de derivados de fosfato, especialmente aquellas que resultan de reacciones de fosforilación, así como cada uno de los derivados de fosfato solos. Por ejemplo, el término incluye una mezcla de fosfato de mono-tocoferilo (TP) y fosfato de di-tocoferilo (T2P) así como cada uno de TP y T2P solo.

Mezclas adecuadas se describen en la solicitud de patente internacional No . PCT/AU01 /0145.

De preferencia, el uno o más derivados de fosfato de uno o más agentes de transferencia de electrones se selecciona del grupo que consiste en fosfato de mono-tocoferilo, fosfato de di-tocoferilo, fosfato de mono-tocotrienilo, fosfato de di-tocotrienilo y mezclas de los mismos. En una modalidad preferida, el uno o más derivados de fosfato de uno o más agentes de transferencia de electrones es una mezcla de uno o más de fosfato de mono-tocoferilo, fosfato de di-tocoferilo, fosfato de mono-tocotrienilo y fosfato de di-tocotrienilo.

En algunas situaciones, podría ser necesario usar un derivado de fosfato tal como un fosfátido cuando propiedades adicionales tales como solubilidad en agua incrementada se prefieran. Los derivados de fosfatidilo son derivados aminoalquilo de fosfatos orgánicos. Estos derivados pueden prepararse a partir de aminas que tengan una estructura de R?R2N(CH2)nOH en donde n es un entero entre 1 y 6 y Ri y R2 pueden ser ya sea H o cadenas alquilo cortas con 3 o menos carbonos. Ri y R2 pueden ser el mismo o diferente. Los derivados fosfatidilo se preparan al desplazar el protón hidroxilo del agente de transferencia de electrones con una entidad fosfato que luego es hecha reaccionar con una amina, tal como etanolamina o N,N'-dimetiletanolamina, para generar el derivado fosfatidilo del agente de transferencia de electrones. Una terapia de preparación de los derivados de fosfatidilo usa un solvente básico tal como piridina o trietilamina con oxicloruro de fósforo para preparar intermediario que luego se hace reaccionar con el grupo hidroxi de la amina para producir el derivado hidroxi correspondiente, tal como fosfato diácido de P-colilo P-tocoferilo.

En algunas situaciones, complejos de derivados de fosfato de los agentes de transferencia de electrones también pueden utilizarse cuando propiedades adicionales tales como estabilidad o capacidad de suministro mejoradas puedan ser útiles. El término "complejos de derivados de fosfato" se refiere al producto de reacción de uno o más derivados de fosfato de agentes de transferencia de electrones con uno o más agentes de complej os seleccionados del grupo que consiste en agentes tensioactivos anfotéricos, agentes tensioactivos catiónicos, aminoácidos que tienen grupos funcionales nitrógeno y proteínas ricas en estos aminoácidos como las descritas en la solicitud de patente internacional No. PCT/AU01/01476, incorporada en la presente a manera de referencia. Ejemplos de proteínas ricas en estos aminoácidos son aquellas proteínas que tienen al menos 1 en 62 aminoácidos como arginina, o por lo menos 1 en 83 como histidina, o por lo menos 1 en 65 como lisina, tales como las diferentes formas de la proteína caseína. Otros ejemplos incluyen insulina, hormona paratiroides, (PTH), glucagón, calcitonina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), prolactina, interferón a, ß y ?, hormona luteinizante (LH) (también conocida como hormona liberadora de gonadotropina), hormona estimuladora de folículos (FHS) y factor estimulador de colonia (CSF). La composición de aminoácidos de la mayoría de estos ejemplos se lista en la tabla.

Aminoácidos en proteína Aminoácidos Relación de aminoácidos totales Insulina 110 arg 5 len22 his 2 len55 lys 2 1 en 55 PTH 84 arg 5 lenl7 his 0 0 lys 5 1 en 17 Glucagón 180 arg 16 lenll his 4 1 en 45 lys 10 lenl8 Calcitonina 93 Arg 6 lenl6 his 3 len31 lys 5 1 en 19 ACTH 41 arg 3 lenl4 his 1 len41 lys 4 lenlO Aminoácidos en proteína inoácidos Relación de aminoácidos totales Prolactina 220 arg 12 1 en 18 his 9 1 en 13 lys 11 lenll Interferón - alfa y beta 133 arg 7 1 en 19 his 2 len83 lys 7 1 en 19 Interferón - gama 166 arg 8 1 en 21 his 2 len83 lys 21 1 en 8 LH 92 arg 5 1 en 18 his 2 1 en 46 lys 7 lenl3 FSH 129 arg 5 1 en 26 his 2 1 en 65 lys 9 lenl4 CSF 144 arg 6 1 en 24 his 3 len48 lys 6 1 en 24 Aminoácidos en proteína Aminoácidos Relación de aminoácidos totales Dominio GH AOD9604 16 arg 2 1 en 80 Los agentes formadores de complej o que se prefieren se seleccionan del grupo que consiste en arginina, lisina y aminas sustituidas terciarias, tales como aquellas de acuerdo con la siguiente fórmula: NR*R2R3 en donde R1 se selecciona del grupo que consiste en radicales alquilo mixtos de cadena recta o ramificada de C6 a C22 y derivados carbonilo de los mismos; R y R se seleccionan del grupo que consiste en H, CH2COOX, CH2CHOHCH2S03X, CH2CHOHCH2OP03X, CH2CH2COOX, CH2COOX, CH2CH2CHOHCH2SO3X o CH2CH2CHOHCH2OPO3X y X es H, Na, K o alcanolamina siempre y cuando R2 y R3 no sean ambos H y en donde cuando R es RCO entonces R puede ser CH3 y R puede ser (CH2CH2)N(C2H4OH)-H2CHOP?3 o R2 y R3 juntos pueden ser N(CH2)2N(C2H4OH)CH2COO-.

Los agentes formadores de complejos que se prefieren incluyen arginina, lisina o ácido lauriliminodipropiónico en donde la formación de complejos ocurre entre el centro de nitrógeno alcalino y el éster de ácido fosfórico para formar un complej o estable.

El derivado fosfato del agente de transferencia de electrones puede administrarse a humanos o animales a través de una variedad de formas de dosis tales como complementos, alimentos entérales, formas de dosis parenterales, supositorios, formas de dosis orales, formas de suministro pulmonar y nasal, suministro térmico incluyendo parches y cremas.

Por ejemplo, el derivado de fosfato del agente de transferencia de electrones puede administrarse por una forma de dosis administrada oralmente o parenteralmente. Estas incluyen tabletas, polvos, tabletas masticables, cápsulas, suspensiones orales, suspensiones, emulsiones o fluidos, formulaciones para niños, alimentos centrales, neutracéuticos y alimentos funcionales.

La forma de dosis puede incluir además cualquier aditivo usado rutinariamente en la preparación de esa forma de dosis tales como aglutinantes de almidón o poliméricos, edulcorantes, agentes colorantes, emulsionantes, recubrimientos y similares. Otros aditivos adecuados serán fácilmente aparentes para aquellos expertos en la técnica.

En una modalidad, la forma de dosis tiene un recubrimiento entérico como el descrito en la solicitud de patente internacional PCT/AU01 /01206, incorporada en la presente a manera de referencia.

En otra modalidad, la forma de dosis es una formulación tópica como la descrita en la solicitud de patente internacional PCT/AU02/01003 , incorporada en la presente a manera de referencia.

La forma de dosis puede contener otros compuestos farmacéuticos que no antagonizan la actividad de los derivados de fosfato de agentes de transferencia de electrones. El otro compuesto farmacéutico puede administrarse antes, después del uno o más derivados de fosfato de uno o más agentes de transferencia de electrones. De preferencia, los demás compuestos farmacéuticos son fármacos para enfermedad cardiaca y cardiovascular y compuestos hipercolesterolémicos y dislipidémicos. Muy preferiblemente, los demás compuestos farmacéuticos se seleccionan del grupo que consiste en inhibidores de absorción de colesterol tales como ezetimibe, inhibidores de proteína de transferencia de éster colesterol tales como torcetrapib, otros compuestos farmacéuticos que incrementen HDL, estatinas, derivados de fosfato de estatinas y mezclas de los mismos. Ejemplos de estatinas adecuadas incluyen provastatina, lovastatina y atorvastatina y fosfatos de los mismos.

De preferencia, el sujeto es un animal. Muy preferiblemente, el animal es un mamífero, más preferiblemente, el mamífero es un humano.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Varias modalidades/aspectos de la invención se describirán ahora con referencia a los siguientes dibujos, en los cuales: La figura 1 muestra los resultados del ejemplo 1 a 2 semanas.

La figura 2 muestra los resultados del ej emplo 1 a 4 semanas.

La figura 3 muestra los resultados del ejemplo 2.

EJEMPLOS Varias modalidades/aspectos de la invención se describirán ahora con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLO 1 Este ejemplo evalúa los efectos potenciales anti-CVD de una mezcla de fosfato de tocoferilo en un modelo de ratón CVD bien aceptado, el ratón de apolipoproteína E (APOE). Los efectos anti-CVD son evaluados por reducciones en el colesterol en triglicéridos y niveles de LDL elevados en plasma.

El modelo de ratón con gen suprimido APOE se ha usado ampliamente en investigación cardiovascular porque imita muchas de las propiedades observadas clínicamente como parte de la enfermedad humana.

El ratón con gen suprimido APOE despliega niveles de lípidos circulantes elevados de alrededor de 6 meses de edad. Poner estos animales en una dieta alta en grasas, dieta alta en colesterol (es decir, 21 % de grasa, 0. 15% de colesterol), exacerba la CVD, y por lo tanto estos síntomas se observan más pronto.

Métodos Animales: Ratones con gen suprimido APOE macho ( 1 5-20g) fueron obtenidos de Animal Resource Centre, Perth, Australia. Fueron alimentados con una dieta escasa en vitamina E que contenía 21 % de grasa y 0. 1 5% de pellas para roedor de colesterol de Glen Forest Stockfeeders, W.A., Australia. Los ratones se aloj aron en jaulas de laboratorio estándares con iluminación natural y se aclimataron durante al menos 7 días antes de usarlos. En el estudio actual los ratones APOE fueron puestos en una dieta alta en grasas y alta en colesterol durante un total de 8 semanas. Cuatro semanas en esta dieta los animales se tratan diariamente, por medio de lavado oral, ya sea con vehículo ( 1 % de CMC), acetato de tocoferol (TA) a 100 mg/kg o mezcla TP (TPm) a 33.25 , 66.5 ó 133 mg/kg. La evaluación de cualquier mejora en la CVD de estos ratones implicó la toma de sangre a intervalos regulares durante el tratamiento, para evaluar los niveles de lípidos y seccionar el arco aórtico, para la evaluación de la formación de placa al final del periodo de tratamiento.

Reactivos: Acetato de Tocoferol ( TA) (Sigma catálogo No. T-3001 ) Mezcla de fosfato de tocoferilo (TPm) que contiene fosfato de monotocoferilo y fosfato de ditocoferilo en una relación de 2 : 1 (hecha en el lote de casa No. SGNaTPm/21 - 10-04) Carboximetilcelulosa (Sigma catálogo No. C-5678) Agua Milli Q (suministro en casa) Preparación de la formulación: Se prepararon soluciones de TPm y TA en 1 % de carboximetilcelulosa (CMC) a las siguientes concentraciones: Para TA, 1 5 mg/ml y para TPm, 4.99, 9.98 y 19.95 mg/ml para dosificar ratones a TA 100 mg/kg y TPm a 33.25 , 66.5 y 1 33 mg/kg, respectivamente. Al preparar estas soluciones, la cantidad adecuada de cada compuesto se constituyó en el 1 % de CMC y luego se pusieron en un sonificador de baño de agua con agua caliente (aproximadamente 50°C) durante 15 minutos. (La dosis TPm de 133 mg/kg se usa como la dosis equivalente de TA 100 mg/kg. Por lo tanto, las dosis 66.5 y 33.25 mg/kg son 50 y 25% equivalentes a dosis TA 100 mg/kg, respectivamente).

Dosificación: Los ratones fueron pesados semanalmente, y las dosis para cada compuesto fueron calculadas con base en este peso para esa semana de dosificación. Los animales fueron dosificados entre 7 :30 am - 1 1 :00 am, cada mañana del tratamiento con una aguja de lavado de acero inoxidable.

Toma de sangre : En tres ocasiones los ratones fueron restringidos firmemente y la cola mellada y aproximadamente 50 µl de sangre se colectaron en tubos Capiject™. Los tubos fueron después centrifugados a 8,000 x g y se recolectó el plasma para análisis de lípidos (es decir, mediciones de colesterol total, triglicéridos, HDL y LDL, llevadas a cabo por Gribbles Pathology). Los ratones fueron sangrados antes de iniciar el estudio (pre-sangrado) al final de cuatro semanas en las dietas respectivas (antes del inicio de los tratamientos con compuestos) y 2 semanas en el periodo de tratamiento. Al final del periodo de tratamiento, se tomó sangre de los animales directamente del corazón después de haber sido sacrificados mediante asfixia con CO2. Los ratones APOE puestos en la dieta alta en grasas y alta en colesterol, incrementaron 2-3 veces sus niveles de colesterol, LDL y triglicéridos en plasma durante este periodo de alimentación. Este nivel se considera muy alto, toda vez que estos ratones ya tenían niveles bastante elevados de lípidos en ayunas sin haber sido puestos en una dieta heterogénica. Esto se consideró un buen punto de inicio para evaluar la efectividad de TPm para reducir estos niveles elevados de lípidos.

Análisis de triglicéridos en plasma: La medición de triglicéridos en plasma tomó lugar con el uso del equipo de determinación de triglicéridos (Sigma, catálogo No. TR0100). El procedimiento incluye hidrólisis enzimática por lipasa de los triglicéridos a glicerol y ácidos grasos libres. El glicerol producido es después medido mediante reacciones enzimáticas acopladas mostradas abaj o: Los reactivos en el equipo se preparan según las direcciones de los fabricantes. El reactivo estándar libre de glicerol y muestras se calentaron a la temperatura ambiente. Un conjunto de cubetas se preparan para blanco, estándar y muestras. Se añaden 0.8 mi de glicerol libre reactivo a cada cubeta, seguido por 10 µl de agua, estándar de glicerol o plasma, respectivamente. Las muestras se mezclan, mediante inversión, y se incuban a 37°C durante 5 minutos. La absorbancia se lee después a 540 nm y se registra como absorbancia inicial (IA). Después se añaden 0.2 mi de reactivo de triglicéridos a cada cubeta y luego se mezclan de nuevo por inversión, y se incuban durante 5 minutos más a 37°C. Después se lee la absorbancia final (FA) y se registra a 540 nm. La concentración total de triglicéridos en plasma se calcula entonces como sigue: de estándar (r estándar " r ^blanco.) Análisis de colesterol en plasma: La medición del colesterol en plasma tuvo lugar con el uso del equipo reactivo de colesterol Infinity™ (Thermo Electron Corp., catálogo No. 2 TR1321 ). El reactivo se basa en las siguientes reacciones: (1 ). Los esteres de colesterol son hidrolizados enzimáticamente por colesterol esterasa a colesterol y ácidos grasos libres. (2). El colesterol libre incluyendo aquél presente originalmente, es oxidado después por colesterol oxidasa a colesterol 4-en-3-ona y peróxido de hidrógeno. (3). El peróxido de hidrógeno se combina con HBA y 4-aminoantipirina para formar un cromóforo (colorante de quinonaimina) el cual puede ser cuantificado a 500-550 nm.

El plasma se incuba con Colesterol Reagent™ ( 1 : 100). Por ejemplo un volumen de muestra de 3 µl se incuba con 300 µl de Colesterol Reagent™, en una placa de microtitulación y se incuba a 37°C durante 5 minutos. Esto se lleva a cabo para un calibrador también suministrado en el equipo. El colesterol total se calcula después como sigue: _, , , , ... , Colesterol de calibrado min de calibrador Ejemplo: Absorbancia de calibrador = 0.35 Absorbancia de desconocido = 0.25 Valor de calibrador = 7.0 mmoles/L Colesterol = 0.25/0.35 X 7.0 = 5.0 mmoles/L Análisis de HDL en plasma: La medición de HDL tuvo lugar con el uso de equipo reactivo de colesterol HDL Infinity™ (Thermo Electron Corp. , Catálogo No. TR39601 ).

El plasma (4 µl) se coloca en una placa de microtitulación, y se incuba a 37°C durante 5 minutos con 300 µl de reactivo 1 , seguido por 3 minutos más de incubación después de la adición de 100 µl de reactivo 2. La absorbancia se lee después a 600 nm. Al igual que para el equipo de colesterol se suministra también un calibrador en el equipo se usa también para el cálculo.

Análisis de LDL en plasma: La medición del LDL tuvo lugar con el uso del equipo reactivo más colesterol LDL Infinity™ (Thermo Electron Corp. Catálogo No. 3365-030).

El plasma (4 µl) se pone en una placa de microtitulación, y se incuba a 37°C durante 5 minutos con 300 µl de reactivo 1 , seguido por 5 minutos más de incubación después de la adición de 100 µl de reactivo 2. La absorbancia se lee después a 600 nm. Al igual que para el equipo de colesterol se suministra también un calibrador en el equipo y se usa también para el cálculo.

Análisis estadístico: Los resultados se expresan como media ± SD. Se llevó a cabo una prueba T del estudiante para determinar si había diferencias significativas en ratones tratados con TA o TPm (ya sea que sea un colesterol, triglicéridos, HDL, LDL o tamaño de placa) comparado con sin tratamiento o grupos de control testigos. Para un estudio de este tipo P<0.05, (*) se consideró significativo.

Resultados y Discusión La figura 1 muestra los resultados obtenidos después de dos semanas de tratamiento.

La figura 2 muestra los resultados obtenidos después de 4 semanas de tratamiento. La administración de TPm, en particular a 33.25 mg/kg, dio una reducción significativa en concentraciones totales de colesterol y LDL en plasma en comparación a sin tratamiento o los ratones tratados sólo con vehículo, después de dos semanas de tratamiento. Después de las cuatro semanas de tratamiento, la dosis de 33.25 mg/kd de TPm proporcionó aún una reducción significativa en los niveles de triglicéridos en plasma en comparación a los controles sin tratamiento de un solo vehículo. Estos resultados sugieren que TPm (en particular a 33.25 mg/kg) es potencialmente efectivo para reducir colesterol y niveles elevados de colesterol, triglicéridos y LDL en sangre circulante.

EJEMPLO 2 Este ejemplo evalúa los efectos de la mezcla de fosfato de tocoferilo (TPm) (fosfato de mono-tocoferilo y fosfato de di-tocoferilo) en el desarrollo de lesiones atersoclerósicas en ratones deficientes en APOE macho.

Metodología Veintiocho ratones se dividieron en 4 grupos: 2 grupos de control, un grupo de acetato de tocoferol (TA) (alimentación de 1 50 mg TA/kg) y un grupo TPm (alimentación de 200 mg TPm/kg que contenia 7% de grasa).

Dietas: "Fase de inducción"- La fase de inducción consistió en las primeras 16 semanas del periodo de tratamiento. Durante este periodo los animales fueron alimentados con una dieta de pella para ratón baja en vitamina E (que contenía 20 mg de vitamina E por kg de alimento, con un contenido de grasa del 7% total; versión modificada de la dieta para roedores AIN 93G estándar (SF05-040, Specialty Feeds, Glen Forrest, WA Australia). Los animales de control fueron alimentados con la dieta sola, mientras que la alimentación TA contenía 1 50 mg de alimento TA/kg y el alimento TPm contenía 200 mg de alimento TPm/kg. Estos alimentos suministrados en dosis promedio de 21 y 26 mg/kg de peso corporal, respectivamente. La dosis de 26 mg/kg TPm se calculó como la equivalencia de tocoferol de la dosis TA.

"Fase de ataque" - Esta fase consistió en las 8 semanas finales del periodo de tratamiento. Durante este periodo los animales fueron alimentados con una dieta de pella de roedor especializada baja en vitamina E, alta en grasas (21 %), alta en colesterol (0. 1 5%) (HFHC; dieta para ratón SF04-055 es una versión de la dieta SF00-219 estándar que contiene menos de 20 mg de vitamina E por kg; Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia).

Los 4 grupos de animales se pusieron en los regímenes de dieta delineados en la siguiente tabla: De los dos grupos de animales de control sólo uno se puso en la dieta SF04-055 , H FHC, mientras que el otro grupo de control se mantuvo en la dieta de pella para ratón SF05-040 (sólo 7% de grasa) durante el periodo completo de tratamiento de 24 semanas de tratamiento (C24). Esto se hizo para establecer el efecto de la dieta HFHC sola en los diferentes parámetros aterosclerósicos que se está midiendo, y para evaluar si los tratamientos con los diferentes compuestos eran o no tan buenos como los animales mantenidos en dietas normales. Los ratones tratados con TA fueron alimentados con pellas con 150 mg de TA/kg de alimento y los ratones tratados con TPm fueron alimentados con pellas con 200 mg de alimento TPm/kg. Estos alimentos suministraron dosis que promediaron 21 y 26 mg/kg de peso corporal, respectivamente. La dosis 26 mg/kg de TPm se calculó como siendo el equivalente de tocoferol a la dosis de TA.

Durante la fase de inducción, los ratones de control desarrollaron lesiones de hipercolesterolemia y aterosclerósicas leves. Luego de 16 semanas de tratamiento con TPm, los ratones mostraron una reducción del 34% de colesterol total ( 1 1 .44+/- 1 .37 vs 17.38+/- 1 .47 mmoles/L), 5 1 % de reducción de triglicéridos (0.99 +/-0. 14 vs 2.00 +/-0.58 mmoles/L) y una reducción del 44% en LDL-C (4.67+/-0.70 vs 8.38+/-0.76 mmoles/L) en comparación con los animales de control. Estas reducciones fueron significativamente diferentes a las de los animales de control, y fueron mucho mayores que aquellas observadas con el tratamiento con TA.

Luego de la fase de ataque, los ratones de control desarrollaron severa hipercolesterolemia y lesiones aterosclerósicas avanzadas. Los ratones tratados con TA no mostraron reducción significativa en los niveles de lípidos en plasma o evidencia de regresión de lesiones; aunque hubo una reducción de 12% promedio en área de lesión (esto no fue significativo). Sin embargo, el tratamiento con TPm dio una reducción de 1 5%> en colesterol total (43.8+/-4.38 vs 37.08+/-5. 1 5 mmoles/1), 28% de reducción en triglicéridos ( 1 .63+/-0.22 vs 2.27+/-0.20mmoles/L) y 16%» de reducción en LDL-C ( 1 5.02 +/-2.61 vs 17.95+/- 1 .51 mmoles/L) así como una reducción significativa (58%) en la formación de lesiones aórticas.

TABLA 1 Comparaciones de niveles total es de colest ero 1 en ratón (media ± SD; moles/L) durante la inducción Y las fases de inducción y ataque del estudio # indica ratones de control mantenidos en dieta HFHC (para las 8 semanas finales del tratamiento) tuvieron niveles de colesterol en plasma significativamente más altos a los de los ratones de control en la dieta normal (P<0.05). * indica significado (P<0.05) para animales de control.

TABLA 2 Comparaciones de niveles de triglicéridos en ratones (media 1 SD; moles/L) durante las fases de inducción y ataque del estudio # indica ratones de control mantenidos en dieta HFHC (durante las 8 semanas finales del tratamiento) tuvieron niveles de colesterol en plasma significativamente más altos que los ratones de control en la dieta normal (P<0.05) * indica significado (P<0.05) de animales de control.

TABLA 3 Comparaciones de niveles de LDL-C en ratones (media ± SD; molIes/L) durante las fases de inducción y ataque del estudio # indica que los ratones de control mantenidos en dieta HFHC (durante las 8 semanas finales del tratamiento) tuvieron niveles de colesterol en plasma significativamente más altos que los ratones de control en la dieta normal (P<0.05) * indica significado (P<0.05) a partir de animales de control.

TABLA 4 Área de lesión ateromatosa (media ± SD, % de cobertura de lesión.), al final del periodo de tratamiento * indica significativo (P<0.05) a partir de animales de control.

La figura 3 muestra la formación de lesiones aórticas de aortas por tinción con Oil red O.

La raíz aórtica, aortas torácica y abdominal fueron teñidas con Oil red O (ORO), (el cual tiñe a los lípidos de rojo), mostró depósitos lípidos sustanciales en lesiones aterosclerósicas vasculares. La tabla 4 muestra los tamaños de lesión al final del periodo de tratamiento de 24 semanas a través de cada uno de los grupos de tratamiento. En promedio al final del periodo de inducción (en la semana 16) cada ratón tuvo aproximadamente 5% en lesiones ateromatosas de cobertura por región aórtica (datos no mostrados). El área de la lesión se incrementó 8.9% al final del periodo de 24 semanas en animales mantenidos en la dieta de inducción sola (7% de grasa sola). Los animales que fueron puestos en la dieta aterogénica durante las ocho semanas finales mostraron en promedio 10.7% de lesiones ateromatosas por región aórtica en comparación con 9.4% en ratones tratados con TA y 4.5% en ratones tratados con TPm. El tratamento con TA observó una mejora del 12% en lesiones aterosclerócicas (esto no fue estadísticamente significativo), mientras que el tratamiento con TPm mostró una reducción del 58% significativa en la formación de lesión en comparación con los ratones de control mantenidos en el mismo régimen de dieta.

Conclusión Los descubrimientos demuestran una reducción significativa en los perfiles de lípidos (LDL, colesterol total y triglicéridos) en animales tratados con TPm, indicando que el tratamiento con TPm puede tratar hiperdislipidemia y enfermedades relacionadas. Como un resultado secundario, los descubrimientos demuestran una reducción significativa en el tamaño de lesión aterosclerósica en ratones deficientes en APOE tratados con TPm, indicando que el tratamiento con TPm puede tratar o reducir la progresión de lesiones aterosclerósicas en esta cepa de ratón.

La palabra 'que comprende' y formas de la palabra ' que comprende' según se usa en esta descripción y en las reivindicaciones no limitan la invención reclamada para excluir ninguna variante o adición.

Modificaciones y mejoras a la invención se harán fácilmente aparentes para aquellos expertos en la técnica. Estas modificaciones y mejoras están destinadas a estar dentro del alcance de esta invención.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1 . Un método para reducir los niveles en sangre circulante de un lípido seleccionado del grupo que consiste en colesterol LDL, triglicéridos, colesterol total y mezclas de los mismos, caracterizado porque comprende administrar a un suj eto una cantidad efectiva de uno o más derivados de fosfato de uno o más agentes de transferencia de electrones, con la condición de que el derivado de fosfato del agente de transferencia de electrones no sea fosfato de ascorbilo-tocoferilo.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el agente de transferencia de electrones se selecciona del grupo que consiste en tocóles, retinol, vitamina Kl y mezclas de los mismos.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el agente de transferencia de electrones se selecciona del grupo que consiste en tocóles y mezclas de los mismos.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3 , caracterizado porque el agente de transferencia de electrones se selecciona del grupo que consiste en a-tocoferol, d-tocoferol, ?-tocoferol, a-tocotrienol, d-tocotrienol, ?-tocotrienol y mezclas de los mismos.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el derivado de fosfato del agente de transferencia de electrones se selecciona del grupo que consiste en derivados de fosfato de mono-tocoferilo, derivados de fosfato de di-tocoferilo, derivados de fosfato de mono-tocotrienilo, derivados de fosfato de di-tocotrienilo y mezclas de los mismos.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el derivado de fosfato del agente de transferencia de electrones es una mezcla derivados de fosfato de mono-tocoferilo y derivados de fosfato de di-tocoferilo.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende además administrar uno o más de otros compuestos farmacéuticos que no antagonicen la actividad del derivado de fosfato del agente de transferencia de electrones.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el otro compuesto farmacéutico se selecciona del grupo que consiste en inhibidores de absorción de colesterol, inhibidores de proteína de transferencia de éster de colesterol, compuestos farmacéuticos que incrementan HDL, estatinas, sus derivados de fosfato y mezclas de los mismos.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la reducción de los niveles en sangre circulante alivia síntomas de, trata y/o previene una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad renal crónica, hiperlipidemias primarias y secundarias y dislipidemia, retinopatías, agrandamiento de hígado y bazo, xantomas y combinaciones de los mismos.

10. Un método para reducir los niveles en sangre circulante de un lípido seleccionado del grupo que consiste en colesterol LDL, triglicéridos, colesterol total y mezclas de los mismos, caracterizado porque comprende administrar a un suj eto una cantidad efectiva de uno o más profármacos de uno o más derivados de fosfato de uno o más agentes de transferencia de electrones, con la condición de que el derivado de fosfato del agente de transferencia de electrones no sea fosfato de ascorbilo-tocoferilo.

1 1 . Uso de una cantidad efectiva de uno o más derivados de fosfato de uno o más agentes de transferencia de electrones, en la preparación de un medicamento para reducir los niveles en sangre circulante de un lípido seleccionado del grupo que consiste en colesterol LDL, triglicéridos, colesterol total y mezclas de los mismos, con la condición de que el derivado de fosfato del agente de transferencia de electrones no sea fosfato de ascorbilo-tocoferilo.

12. Uso de una cantidad efectiva de uno o más derivados de fosfato de uno o más agentes de transferencia de electrones para aliviar síntomas de, tratar y/o prevenir una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad cardiovascular, aterosclerosis, diabetes mellitus, enfermedad renal crónica, hiperlipidemias primarias y secundarias y dislipidemia, retinopatías, agrandamiento de hígado y bazo, xantomas y combinaciones de los mismos, mediante la reducción de niveles en sangre circulante, con la condición de que el derivado de fosfato del agente de transferencia de electrones no sea fosfato de ascorbilo-tocoferilo.