MX2007009911A - Metodos y sistemas para el diagnostico, pronostico y seleccion del tratamiento de la leucemia. - Google Patents

Abstract

La presente invencion suministra metodos, sistemas y equipos para el pronostico, el diagnostico y la seleccion de tratamiento de AML u otros tipos de leucemia. Los genes del pronostico de resultados clinicos de pacientes con leucemia se pueden identificar de acuerdo con la presente invencion. Los genes de la enfermedad de leucemia tambien se pueden identificar de acuerdo con la presente invencion. Estos genes se expresan diferencialmente en los PBMC de los pacientes con AML con relacion a humanos libres de la enfermedad. Estos genes se pueden usar para el diagnostico o el monitoreo del desarrollo, la progresion o el tratamiento del AML.

Description

MÉTODOS Y SISTEMAS PARA EL DIAGNOSTICO, PRONOSTICO Y SELECCIÓN DEL TRATAMIENTO DE LA LEUCEMIA REFERENCIAS CRUZADAS A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud serie U.S. No. 60/653,117, presentada en Febrero 16, 2005.

CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona con genes para diagnóstico y pronóstico de la leucemia y métodos para usarlos en el diagnóstico, pronóstico y selección de tratamiento del AML u otros tipos de leucemia.

ANTECEDENTES La leucemia mieloíde aguda (AML) es un desorden clonal heterogéneo tipificado por la hiper proliferación de células reticulares leucémicas inmaduras en la médula del hueso. Aproximadamente 90% de todos los casos de AML exhiben proliferación de células reticulares CD33+, y CD33 es un antígeno de Súper ficie celular que parece ser expresado específicamente en mieloblastos y progenitores de mieloide pero está ausente en las células no diferenciadas ematopoyéticas. Gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg® o GO) es un anticuerpo anti-CD33 conjugado a la calicheamicina específicamente diseñado para objetivar células reticulares CD33+ de pacientes con AML para su destrucción. Para información, ver Matthews, LEUKEMIA, 12(Suppl 1):S33-S36 (1998); y Bernstein, LEUKEMIA, 14:474-475 (2000).

Aunque el gemtuzumab ozogamicina ha demostrado eficacia en pacientes con AML avanzado, algunas veces no es completamente efectivo como agente de línea único. Estudios tanto en Vitro como en vivo han demostrado que la expresión de la p-glicoproteína y el fenotipo de resistencia a las multi drogas (MDR) están asociados con una respuesta reducida a la terapia con gemtuzumab ozogamicina, lo que sugiere que extrusión del gemtuzumab ozogamicina mediante este mecanismo puede ser uno de los varios trayectos moleculares importantes de la resistencia al gemtuzumab ozogamicina (Naito, el al ., LEUKEMIA, 14:1436-1443 (2000); y Linenberger, el al ., BLOOD, 98:988-994 (2001)). Sin embargo, el fenotipo MDR falla en recontar para todos los casos encontrados con resistencia al gemtuzumab ozogamicina. Aunque el gemtuzumab ozogamicina exhibe un perfil de seguridad favorable en la mayoría de pacientes que reciben la terapia con Mylotarg® (Sievers, el al, J CLIN. ONCOL., 19(13):3244-3254 (2001)), un número pequeño pero significativo de casos de enfermedad veno oclusiva hepática se han reportado luego de la exposición a esta terapia (Neumeister, el al, ANN. HEMATOL., 80:119-120 (2001)). Recientemente, el GO ha sido también evaluado en combinación con una antraciclina y citarabina en un intento para incrementar la efectividad del GO administrado como terapia de agente único (Alvarado, el al., CÁNCER CHEMOTHER FARMACOL, 51 :87-90 (2003)).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por lo tanto es un objeto de la presente invención suministrar un análisis farmacogenómico efectivo para determinar cualquier relación entre la expresión de genes y la respuesta a la terapia.

Es un objeto de la presente invención identificar los genes de pronóstico de leucemia cuyos niveles de expresión son predictivos del resultado clínico de pacientes con leucemia quienes están bajo una terapia anticáncer.

Es un objetivo adicional de la presente invención suministrar un método para predecir un resultado clínico de un paciente con leucemia lo mismo que un método para seleccionar un tratamiento para un paciente con leucemia con base análisis farmacogenómico.

Es otro objetivo de la presente invención identificar genes de diagnóstico de leucemia y suministrar un método para el diagnóstico, o el monitoreo de ocurrencia, desarrollo, progresión o tratamiento, de una leucemia con base en el análisis de los niveles de expresión de los genes de diagnóstico.

Así, en un aspecto, la presente invención suministra un método para predecir un resultado clínico en respuesta a un tratamiento de una leucemia. El método incluye las siguientes etapas: (1) medir los niveles de expresión de uno o más genes de pronóstico de la leucemia en una muestra de células mononucleares de sangre periférica derivada de un paciente antes de tratamiento; y (2) comparar cada uno de los niveles de expresión con un nivel de control correspondiente, en donde el resultado de la comparación es predictivo de un resultado clínico. Los "genes de pronóstico" a los que se refiere aquí en la solicitud incluyen, pero no se limitan a, cualesquier genes que se expresan diferencialmente en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) u otros tejidos de pacientes con leucemia con diferentes resultados clínicos. En particular, los genes de pronóstico incluyen genes cuyos niveles de expresión en los PBMC o en otros tejidos de pacientes con leucemia están correlacionados con los resultados clínicos de los pacientes. Los genes de pronóstico ilustrativos se muestran en la tabla 1 , la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5 y la tabla 6. Un "resultado clínico" como se ha llamado en la solicitud incluye, pero no se limita a, cualquier respuesta a cualquier tratamiento de la leucemia.

La presente invención es adecuad para el pronóstico de cualquier leucemias, incluyendo leucemia aguda, leucemia crónica, leucemia linfocítica o leucemia no linfocítica. En particular, la presente invención es adecuada para el pronóstico de la leucemia mieloide aguda (AML). Típicamente, el resultado clínico se mide mediante una respuesta a una terapia anticáncer. Por ejemplo, la terapia anticáncer ¡ncluye administrar uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de un anticuerpo anti-CD33, una daunorubicina, una citarabina, gemtuzumab ozogamicina, una antraciclina, y un análogo de nucleótido de piridimidina o purina. En un ejemplo particular, la presente invención se puede usar para predecir una respuesta a una terapia de combinación con gemtuzumab ozogamicina (GO).

En una modalidad, los uno o más genes de pronóstico adecuados para la invención incluyen por lo menos un primer gen seleccionado de una primera clase y un segundo gen seleccionado de una segunda clase. La primera clase ¡ncluye genes que tienen niveles de expresión mayores en células periféricas mononucleares de sangre en pacientes a los que se predijo tener un resultado clínico menos deseable en respuesta al tratamiento. Ejemplos de genes de primera clase se muestran en la tabla 1 y la tabla 3.

La segunda clase incluye genes que tienen niveles de expresión más altos en células periféricas mononucleares de sangre en pacientes a los que se predicho que tienen un resultado clínico más deseable a la respuesta del tratamiento. Ejemplos de los genes de segunda clase se muestran en la Tabla 2 y 4. En una modalidad, el primer gen se selecciona de la Tabla 3 y el segundo gen se selecciona de la tabla 4.

En una modalidad particular, el primer gen se selecciona del grupo que consiste de la proteína de dedo zinc 217, el transportador de péptido 3, la caja cabeza de tenedor 03A, un locus alfa receptor de célula T y un receptor quimiocina putativo/proteína ligada por GTP, y el segundo gen se selecciona del grupo que consiste de metalotioneina, desaturasa de ácido graso 1 , un gen no caracterizado correspondiente a Affymetrix ID 216336, el factor auto regulatorio epidérmico deformado 1 y detención de crecimiento y alfa inducible por daño en ADN. En otra modalidad, el primer gen es una quinasa regulada por glucocorticoide del suero y el segundo gen es metalotioneina IX/1 L.

En algunas modalidades, cada uno de los niveles de expresión de los genes de pronostico se compara con el nivel de control correspondiente que es un umbral numérico.

En algunas modalidades, el método de la presente invención se puede usar para predecir el desarrollo de un evento adverso en un paciente con leucemia en repuesta a un tratamiento. Por ejemplo, el método se puede usar para determinar la posibilidad de desarrollo de la enfermedad veno oclusiva (VOD). Genes de pronóstico predictivos del VOD ilustrativos se muestran en la tabla 5 y la tabla 6. En una modalidad particular, el nivel de expresión del ligando p-selectina se mide para predecir el riesgo de adquirir VOD.

En otro aspecto, la presente invención suministra un método para predecir un resultado clínico de una leucemia mediante hacer las siguientes etapas: (1) generar un perfil de expresión de gen de una muestra de sangre periférica de un paciente que tiene leucemia; y (2) comparar el perfil de expresión de gen con uno o más perfiles de expresión de referencia, en donde el perfil de expresión de gen y el uno o más perfiles de expresión de referencia contienen patrones de expresión de uno o más genes de pronóstico de la leucemia en células mononucleares de sangre periférica, y en donde la diferencia o similitud entre el perfil de expresión de gen y el uno o más perfiles de expresión de referencia es indicativo del resultado clínico para el paciente.

En una modalidad, el perfil de expresión de gen del uno o más genes de pronóstico se puede comparar con uno o más perfiles de expresión de referencia mediante, por ejemplo, un análisis del vecino más cercano o un algoritmo de peso de votación. Típicamente, los uno o más perfiles de expresión de referencia representan resultados clínicos conocidos o determinables. En algunas modalidades, el perfil de expresión de gen del paciente se puede comparar con por lo menos dos perfiles de expresión de referencia, cada uno de los cuales representa un resultado clínico diferente. Por ejemplo, cada perfil de expresión de referencia puede representar un resultado clínico diferente seleccionado entre el grupo que consiste de remisión a menos de 5% de células reticulares en respuesta a la terapia anticáncer, remisión a no menos de 5% de células reticulares e respuesta a la terapia anticáncer; y no remisión en respuesta a la terapia anticáncer. En algunas modalidades uno o más perfiles de expresión de referencia pueden incluir un perfil de expresión de referencia que representa un humano libre de leucemia.

En algunas modalidades, el perfil de expresión del gen se puede generar mediante usar un arreglo de ácido nucleico. Típicamente, el perfil de expresión de gen es generado de la muestra de sangre periférica del paciente antes de la terapia anticáncer.

En una modalidad, el uno o más genes de pronóstico incluye uno o más genes seleccionados de la tabla 3 y la tabla 4. En otro modalidad, el uno o más genes de pronóstico incluye 10 o más genes seleccionados de la tabla 3 y la tabla 4. Todavía en otra modalidad, en uno o más genes de pronóstico incluyen 20 o más genes seleccionados de la tabla 3 o la tabla 4.

Todavía en otro aspecto, la presente invención suministra un método para seleccionar el tratamiento para un paciente con leucemia. El método incluye las siguientes etapas: (1) generar un perfil de expresión de una muestra de sangre periférica derivada de un paciente con leucemia; (2) comparar el perfil de expresión de gen con una pluralidad de perfiles de expresión de referencia, cada uno representando un resultado clínico en respuesta a uno entre una pluralidad de tratamientos; y (3) seleccionar entre la pluralidad de tratamientos un tratamiento que tenga un resultado clínico favorable para el paciente con leucemia con base en la comparación en la etapa (2), en donde el perfil de expresión y el uno o más perfiles de expresión de referencia comprende patrones de expresión de uno o más genes de pronóstico de la leucemia en células mononucleares de sangre periférica. En una modalidad, el perfil de expresión de genes se puede comparar con la pluralidad de perfiles de expresión de referencia mediante, por ejemplo, un análisis del vecino más cercano o un algoritmo de peso de votación.

En una modalidad, el uno o más genes de pronóstico incluye uno o más genes seleccionados de la tabla 3 o de la tabla 4. En otra modalidad, el uno o más genes de pronóstico incluye 10 o más seleccionados de la tabla 3 y la tabla 4. Todavía en otra modalidad, el uno o más genes de pronóstico incluye 20 o más genes seleccionados de la tabla 3 o la tabla 4.

En otro aspecto, la presente invención suministra un método para el diagnóstico, o monitoreo de la ocurrencia, desarrollo, progresión o tratamiento, de un leucemia. El método incluye las etapas siguientes: (1) generar un perfil de expresión de gen de una muestra de sangre periférica de un paciente que tiene la leucemia; y (2) comparar el perfil de expresión de gen con uno o más perfiles de expresión de referencia, en donde el perfil de expresión de gen y el uno o más perfiles de expresión de referencia contienen los patrones de expresión de uno o más genes de diagnóstico de la leucemia en células mononucleares de sangre periférica, y en donde la diferencia o similitud entre el perfil de expresión de gen y el uno o más perfiles de expresión de referencia es indicativo de la presencia, ausencia, ocurrencia, desarrollo, progresión, o efectividad del tratamiento de la leucemia en el paciente. En una modalidad, la leucemia es AML. "Genes de diagnóstico" como se llaman aquí en la solicitud incluyen, pero no se limitan a, cualesquier genes que son expresados diferencialmente en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) u otros tejidos de pacientes con leucemia con diferentes estados de enfermedad. En particular, los genes de diagnóstico incluyen genes que se expresan diferencialmente en los PBMC u otros tejidos de pacientes con leucemia con relación a los PBMC de pacientes libres de leucemia. Los genes de diagnóstico ilustrativos se muestran en la tabla 7, la tabla 8 y la tabla 9. Los genes de diagnóstico también se les llaman genes de la enfermedad en esta solicitud.

Típicamente, el uno o más perfiles de expresión de referencia incluye un perfil de expresión de referencia que representa a un humano libre de la enfermedad. Típicamente, el uno o más genes de diagnóstico incluyen uno o más genes seleccionados de la tabla 7. Preferiblemente, el uno o más genes de diagnóstico comprenden uno o más genes seleccionados de la tabla 8 o la tabla 9. En algunas modalidades, el uno o más genes de diagnóstico incluyen 10 o más genes seleccionados de la tabla 7. Preferiblemente, el uno o más genes de diagnóstico comprenden 10 o más genes seleccionados de la tabla 8 o la tabla 9.

En otro aspecto, la presente invención suministra un arreglo para uso en un método para predecir un resultado clínico para un paciente con AML. El arreglo de la invención incluye un sustrato que tiene una pluralidad de direcciones, cada una de las cuales tiene una probeta distinta dispuesta en estas. En algunas modalidades, por lo menos 15% de la pluralidad de direcciones tienen dispuestas en ellas probetas que pueden detectar genes de pronóstico del AML en células mononucleares de sangre periférica. En algunas modalidades, por lo menos el 30% de la pluralidad de direcciones tienen dispuestas sobre ellas probetas que pueden detectar específicamente genes de pronóstico del AML en células mononucleares de sangre periférica. En algunas modalidades, por lo menos 50% de la pluralidad de direcciones tienen dispuestas sobre ellas probetas que pueden detectar específicamente genes de pronóstico del AML en células mononucleares de sangre periférica. En algunas modalidades, los medios de pronóstico se seleccionan de la tabla 1 , la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5 o la tabla 6: La probeta adecuada para la presente invención puede ser una probeta de ácido nucleico. Alternativamente, la probeta adecuada para la invención puede ser una probeta de anticuerpo.

En un aspecto adicional, la presente invención suministra un arreglo para uso en un método para el diagnóstico del AML que incluye un sustrato que tiene una pluralidad de direcciones, cada una de las cuales tiene una probeta distinta dispuesta sobre estas. En algunas modalidades, por lo menos 15% de la pluralidad de direcciones tienen dispuestas sobre ellas probetas que pueden detectar específicamente genes de diagnóstico del AML en células mononucleares de sangre periférica. En algunas modalidades, por lo menos el 30% de la pluralidad de direcciones tienen dispuestas sobre ellas probetas que pueden detectar específicamente genes de diagnóstico del AML en células mononucleares de sangre periférica. En algunas modalidades, por lo menos el 50% de la pluralidad de direcciones tienen dispuestas sobre ellas probetas que pueden detectar específicamente genes de diagnóstico del AML en células mononucleares de sangre periférica. En algunas modalidades, los genes de diagnostico se seleccionan de la tabla 7, la tabla 8, la o la tabla 9. La probeta adecuada para la presente invención puede ser una probeta de ácido nucleico. Alternativamente, la probeta adecuada para la invención puede ser una probeta de anticuerpo.

En todavía otro aspecto adicional, la presente invención suministra un medio legible por computadora que contiene un perfil de expresión codificado digitalmente que tiene una pluralidad de señales de expresión codificadas digitalmente, cada una de las cuales incluye un valor que representa la expresión de un gen de pronóstico del AML en una célula mononuclear de sangre periférica. En algunas modalidades, cada una de la pluralidad de señales de expresión codificadas digitalmente tiene un valor que representa un gen de pronóstico seleccionado de la tabla 1 , la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5 o la tabla 6. En algunas modalidades, cada una de la pluralidad de señales de expresión codificadas digitalmente tiene un valor que representa la expresión del gen de pronóstico del AML en una célula mononuclear de sangre periférica de un paciente con un resultado clínico conocido o determinable. En algunas modalidades, el medio legible por computadora de la presente invención contiene un perfil de expresión codificado digitalmente que incluye por los menos 10 señales de expresión codificadas digitalmente.

En otro aspecto, la presente invención suministra un medio legible por computadora que contiene un perfil de expresión codificado digitalmente que tiene una pluralidad de señales de expresión codificadas digitalmente, cada una de las cuales tiene un valor que representa la expresión de un gen de diagnóstico del AML en una célula mononuclear de sangre periférica. En algunas modalidades, cada una de la pluralidad de señales de expresión codificadas digitalmente tiene un valor que representa un gen de diagnóstico seleccionado de la Tabla 7, la tabla 8 o la tabla 9. En algunas modalidades, cada una de la pluralidad de señales de expresión codificadas digitalmente tiene un valor que representa la expresión del gen de diagnóstico del AML en una célula mononuclear de sangre periférica en un humano libre de AML. En algunas modalidades, el medio legible por computadora de la presente invención contiene un perfil de expresión codificado digitalmente que incluye por lo menos 10 señales de expresión codificadas digitalmente.

Todavía en otro aspecto, la presente suministra un kit para el pronóstico de una leucemia, por ejemplo, AML. El kit incluye a) una o más probetas que pueden detectar específicamente genes de pronóstico del AML en células mononucleares de sangre periférica; y b) uno o más controles, cada uno representa un nivel de expresión de referencia de un gen de pronóstico detectable por una o más probetas. En algunas modalidades, el kit de la presente invención incluye una o más probetas que pueden detectar específicamente genes de pronóstico seleccionados de la tabla 1 , tabla 2, tabla 3, tabla 4, tabla 5 o tabla 6.

En otro aspecto, la presente invención suministra un kit para el diagnóstico de un leucemia, por ejemplo, AML. El kit incluye a) una o más probetas que pueden detectar específicamente genes de diagnóstico de AML en células mononucleares de sangre periférica; y b) uno o más controles, cada uno representa un nivel de expresión de referencia de un gen de pronóstico detectable por una o más probetas. En algunas modalidades, el kit de la presente invención incluye una o más probetas que pueden detectar específicamente genes de diagnóstico seleccionados de la tabla 7, la tabla 8, o la tabla 9.

Otros rasgos, objetivos, y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción detallada que sigue. Deberá entenderse, sin embargo, que la descripción detallada, aunque indica las modalidades de la presente invención, está dada como ilustración solamente, y no como limitación. Diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención serán evidentes para aquellos versados en la técnica a partir de la descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los dibujos se han suministrado para ilustración, y no limitación.

La figura 1A demuestra los niveles de expresión relativo de los PBMC de 98 clases de genes correlacionados seleccionados de las Tablas 1 y 2. Entre los 98 genes, 49 genes tenían niveles de expresión elevada en los PBMC de pacientes quienes respondieron a la terapia de combinación con Mylotarg (R) con relación a pacientes que no respondieron a la terapia (NR), y los otros 49 genes tenían niveles de expresión elevados en los PBMC de pacientes que no respondieron (NR) comparado con los pacientes que respondieron (R).

La figura 1 B muestra los resultados de validación cruzada para cada muestra usando un predictor de clase de 154 genes que consiste de los genes en las Tablas 1 y 2, en donde una validación cruzada que deja uno por fuera se llevó a cabo y las fuerzas de la predicción se calcularon para cada muestra. Las muestras están ordenadas en el mismo orden que la Figura 1A.

La figura 2 ilustra una agrupación jerárquica no supervisada de perfiles de expresión de genes en PBMC de pacientes normales, pacientes con AML, o pacientes con MDS usando los 7879 transcriptos detectados en uno o más perfiles con una frecuencia máxima mayor que o igual a 10 ppm. Los datos se transformaron por logaritmos y los valores de expresión de gen fueron promediados hacia el centro, y los perfiles se agruparon usando un modelo de agrupación por enlace promedio con una similaridad de correlación no centrada métrica. Los dos grupos principales de normal y no normal se marcaron como grupos 1 y 2. El subgrupo en el grupo 2 posee una preponderancia de AML según se indicó como "similar a AML", mientras que el subgrupo en el grupo 2 que posee una preponderancia de MDS está indicado como "similar a MDS".

La figura 3 ilustra una ontología de gen con base en la anotación de transcriptos alterados durante la terapia de combinación con GO de pacientes con AML. Los 52 transcriptos que exhiben tres veces o más represión sobre el tratamiento se anotaron dentro de cada una de las 12 categorías listadas. Los transcriptos en la categoría de respuesta inmune fueron los más representados significativamente en el grupo de los transcriptos elevados sobre la terapia, mientras que transcriptos no categorizados fueron los más sobrerepresentados significativamente en el grupo de transcriptos represados durante la terapia.

La figura 4 ilustra los niveles del trascripto del ligando p-selectina en el pretratamiento de los PBMC de 4 pacientes con AML quienes eventualmente experimentaron la enfermad veno oclusiva (VOD) (panel, izquierdo) y en pretratamiento de los PBMC de 32 pacientes quienes no experimentaron el VOD (panel derecho). La frecuencia (en ppm) con base en el análisis de micro arreglo está graficada sobre el eje Y y el nivel del ligando p-selectina en cada muestra individual en cada grupo está graficado como un símbolo discreto.

La figura 5 ¡lustra los niveles del trascripto MDR1 en el pretratamiento de PBMC de 8 pacientes con AML quienes fallaron en responder (NR) y el pretratamiento de PBMC de 28 pacientes quienes respondieron (R). La frecuencia (en ppm) basada en el análisis de micro arreglo está graficada sobre el eje Y y el nivel del trascripto MDR1 en cada uno de las 36 muestras de pretratamiento PBMC individuales se indica en cada columna. El valor p se basa en un ensayo T de Student no apareado asumiendo varianzas desiguales.

La figura 6 ilustra los niveles de trascripto de varios trasportadores de casette ABC en muestras PBMC de pacientes con AML antes de la terapia. La frecuencia (en ppm) con base en un análisis de micro arreglo está graficada sobre el eje Y y el nivel promedio más la desviación estándar de cada transportador en los grupos NR y R se ha indicado. No hay diferencias significativas en la expresión entre NR y R que se pudieran detectar para cualquiera de los transportadores ABC que codifican las secuencias evaluadas en U133A.

La figura 7 ilustra los niveles de trascripto de antígeno de Súper ficie celular CD33 en PBMC de pretratamiento de 8 pacientes quienes fallaron en responder (NR) y en PBMC de pretratamiento de 28 pacientes quienes respondieron (RO). La frecuencia (en ppm) con base en el análisis de micro arreglo está graficada sobre el eje Y y el nivel del trascripto CD33 en cada una de las 36 muestras de pretratamiento de PBMC individuales se ha indicado por cada columna. El valor p está basado en un ensayo T de Student no apareado asumiendo varianzas no iguales.

La figura 8 ilustra la precisión de un clasificador de 10 genes para distinguir PBMC de pretratamiento de respondedores eventuales y no respondedores eventuales a la terapia. Los datos de los perfiles de la línea base de PBMC de pacientes con AML fueron normalizados a escala de frecuencia juntos usando un total de 11382 secuencias que poseen por lo menos una llamada presente y un valor de mayor que o igual a 10 ppm a través de los perfiles de línea base de cada uno de dos estudios clínicos independientes que involucran terapias con base en GO. Los análisis se condujeron siguiendo una etapa de normalización de registro Z en gen cluster. El panel A ¡lustra la precisión general en un conjunto de entrenamiento de 36 miembros para modelos que contiene números increméntales de rasgos (secuencias de trascriptos) construidos usando un modelo de clasificación binaria con una similaridad 2N que usó valores medios para el estimado de la clase. El resultado del clasificador más pequeño (10 genes) la precisión general más baja es indicada (flecha). El panel B ilustra la precisión de validación cruzada 10 veces del clasificador de 10 genes. Un algoritmo de votación pesada se usó para asignar la membresía de clase usando el clasificador de 10 genes. Las calificaciones de confianza para cada llamada de predicción se indican por las columnas en donde una deflección hacia abajo indica una llamada de "NR" y una deflección hacia arriba indica una llamada de "R". No respondedores verdaderos se indican por las columnas claras y respondedores verdaderos se indican por columnas oscuras. En la validación cruzada 4/8 de no respondedores se identificaron correctamente y 24/28 respondedores se identificaron correctamente.

La Figura 9 ilustra el uso del clasificador de 10 genes para evaluar los PBMC de línea base de los pacientes con AML desde un ensayo clínico independiente. El algoritmo pesado por votación se uso para asignar la membresía a la clase usando el clasificador de 10 genes. Las marcas de confianza para cada llamada de predicción son indicadas por columnas en donde una deflección hacia abajo indica una llamada de "NR" y una deflección hacia arriba indica una llamada de "R". No respondedores verdaderos se indican por las columnas claras y respondedores verdaderos se indican por columnas oscuras. En este conjunto de ensayo independiente, 4/7 de no respondedores se identificaron correctamente y 7/7 respondedores se identificaron correctamente.

La figura 10 ilustra los niveles de expresión de dos genes en PBMC de AML correlacionados inversamente con la respuesta a terapias con baseen GO. El panel A representa un gráfico bidimensional de niveles de expresión con baseen Affymetrix (en ppm) de quinasa regulada con suero/glicorticoide (ejes Y) y metalotioneina 1X, 1 L (eje X) en las muestras de PMBC de los pacientes con AML. Los niveles de cada trascripto en cada paciente se grafican en donde los no respondedores se indican por cuadrados y los respondedores se indican por círculos. La sombra indica el área del gráfico XY que involucra el número más grande de no respondedores y el número más pequeño de respondedores, definiendo los límites pare este clasificador basado en ares. Los requerimientos para la implementación para los niveles de expresión de menos de 30 ppm para quinasa regulada por suero glucocorticoide y los niveles de expresión de más de 30 ppm para metalotioneina 1X, 1 L, se habrían identificado exitosamente 6/8 de no respondedores y solamente identificados falsamente 2 de 28 respondedores como no respondedores en el conjunto de datos original de 36 muestras. El panel B ilustra una evaluación del clasificador de dos genes en 14 muestras de AML de un ensayo clínico independiente. La implementación de los mismos requerimientos identificaron correctamente 4/7 de no respondedores y todos los respondedores (7/7) se identificaron correctamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención suministra métodos, reactivos y sistemas útiles para el pronóstico o selección de tratamiento del AML u otros tipos de leucemia. Estos métodos, reactivos y sistemas emplean genes de pronóstico de leucemia que se expresan diferencialmente en muestras de sangre periférica de pacientes con leucemia quienes han tenido resultados clínicos diferentes. La presente invención también suministra métodos, reactivos y sistemas para el diagnóstico, o monitoreo de ocurrencia, desarrollo, progresión o tratamiento del AML u otros tipos de leucemia. Estos métodos, reactivos y sistemas emplean genes de diagnóstico que se expresan diferencialmente en muestras de sangre periférica de pacientes con leucemia con diferentes estados de enfermedad. Así, la presente invención representa un avance significativo en la farmacogenómica clínica y el tratamiento de la leucemia.

Diversos aspectos de la invención se describen en mayor detalle en las siguientes subsecciones. El uso de las subsecciones no tiene el significado de limitar la invención. Cada subsección puede aplicar a cualquiera aspecto de la invención. En esta solicitud el uso de "O" significa "y/o" a menos que se diga lo contrario.

Leucemia v tratamiento de la leucemia Los tipos de leucemia que son manejables por la presente invención incluyen, pero no se limitan a, leucemia agudas, leucemia crónicas, leucemia linfocítica, o leucemia no linfocítica (por ejemplo, mielogenosa, monolítica o eritroide). La leucemia aguda incluye, por ejemplo, AML o ALL (leucemia linfoblástica aguda). La leucemia crónica incluye, por ejemplo, CLL (leucemia mielogenosa crónica), CLL (leucemia linfocítica crónica), o leucemia de células bellotas. La presente invención también contempla genes que son pronóstico de resultados clínicos de pacientes que tienen síndromes mielodisplásicos (MDS): Cualquier régimen de tratamiento para la leucemia se puede analizar de acuerdo con la presente invención. Ejemplos de estos tratamientos de leucemia incluyen, pero no se limitan a, quimioterapia, terapia con drogas, terapia con genes, inmunoterapía, terapia biológica, terapia por radiación, transplante de médula de hueso, cirugía o una combinación de ellos. Otras terapias convencionales, no convencionales, novedosas o experimentales que incluyen tratamientos bajo ensayos clínicos, también se pueden evaluar de acuerdo con la presente invención.

Una variedad de agentes anticáncer se pueden usar para tratar la leucemia.

Ejemplos de estos agentes incluyen, pero no se limita, alquilatores, antraciclina, antibióticos, disfosfonatos, antagonistas de folato, arcenatos inorgánicos, inhibidores de microtúbulos, nitrosourias, análogos de nucleótidos, retinoides, o inhibidores de topoisomeraza.

Ejemplos de alquilatores incluyen, pero no se limitan a, busulfan (Mueran, Busulfex), clorambucil (Leuqueran), cíclof osf amida (Citoxan, Neosar), melfalan, L-PAM (Alqueran), dacarbazina (DTIC-Dome), y temozolamida (Temodar). Ejemplos de antraciclinas incluyen, pero no se limitan a, doxorubicina (Adriamicina, Doxil, Rubex), mitoxantrona (Novantrona), idarubicina (Idamicina), valrubicina (Valstar), y epirubicina (Elence). Ejemplos de antibióticos incluyen, pero no se limitan a, dactinomicina, actinomicina D (Cosmegen), bleomicina (Blenoxane), y daunorubicína, daunomicina (Cerubidina, DanuoXome). Ejemplos de inhibidores de bifosfonato incluyen, pero no se limita a, zoledronato (Zometa). Ejemplos de antagonistas de folato incluyen, pero no se limitan a, metotrexato y tremetrexato. Ejemplos de arsenatos inorgánicos incluyen, pero no se limitan a, trióxido de arsénico (Trisenox). Ejemplos de inhibidores microtúbulo, que pueden inhibir sea conjuntos de microtúbulos o sea desensambles, incluyen, pero no se limitan a, vincristina (Oncovin), vinblastina (Velban), paclitaxel (Taxol, Paxene), vinorelbina (Navelbina), docetaxel (Taxotere), epotilona B o D o un derivado de cualquiera, y discodermolida o sus derivados. Ejemplos de nitrosoureas incluyen, pero no se limitan a, procarbazina (Matulane), lomustina, CCNU (CeeBU), carmustina (BCNU, BiCNU, Gliadel Wafer), y estramustina (Emcyt). Ejemplos de análogos de nucleósidos incluyen, pero no se limitan a, mercaptopurina, 6-MP (Purinatol), fluorouracilo, 5-FU (Adrucil), tioguanina, 6-TG (Tioguanína), hidroxiurea (Hidrea), citarabina (Citosar-U, DepoCit), floxuridina (FUDR), fludarabina (Fludara), pentostatina (Nípent), cladribina (Leustatin, 2-CdA), gemcitabína (Gemzar), y capecitabina (Xeloda). Ejemplos de retinoides incluyen, pero no se limitan a, tretinoina, ATRA (Vesanoid), alitretinoina (Panretin), y bexaroteno (Targretin). Ejemplos de inhibidores de topoisomerasa incluyen, pero no se limitan a, etoposida, VP-16 (Vepesid), teniposida, VM-26 (Vumon), fosfato de etoposida (Etopofos), topotecan (Hicamtin), y irinotecan (Camptostar). Las terapias que incluyen el uso de cualquiera de estos agentes anticáncer se pueden evaluar de acuerdo con la presente invención.

La leucemia se puede tratar también mediante anticuerpos que reconocen específicamente células enfermas o indeseadas de otra manera. Los anticuerpos adecuados para este propósito incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, mono específicos, poli específicos, humanizados, humanos, de cadena única, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados, injertados o generados en Vitro. Los anticuerpos adecuados pueden también ser Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, u otros fragmentos de anticuerpo que retenga la función de ligado al antígeno. En muchos casos, un anticuerpo empleado en la presente invención puede ligar a un antígeno específico sobre las células enfermas o no deseadas (por ejemplo, el antígeno CD33 sobre células de mioblastos o progenitoras de mieloide) con una afinidad de ligado de por lo menos 10_6 M^, 10.7 M.?, 10.8 M^, 10.9 M^, o más fuertes.

Muchos anticuerpos empleados en la presente invención se conjugan con un agente citotóxico u otro agente de otra manera anti celular que pueda matar o suprimir el crecimiento o la división de la célula. Ejemplos de agentes citotóxicos o anti celulares incluyen, pero no se limitan a, los agentes antineoplásicos descritos anteriormente, y otros agentes quimioterapéuticos, de radio isótopos o de cito toxinas. Dos o más partes citotóxicas diferentes se pueden acoplar a un anticuerpo, acomodando así actividades variables mejoradas anticáncer.

Enlazar o acoplar una o más partes citotóxicas a un anticuerpo se puede lograr mediante una variedad de mecanismos por ejemplo, ligado covalente, ligado por afinidad, intercalación, ligado coordinado y complejación. Los métodos de ligado preferidos son aquellos que involucran el ligado covalente, tal como usar reticuladores químicos, péptidos naturales o enlaces de disulfuro.

El enlace covalente se pude lograr, por ejemplo, mediante condensación directa de las cadenas laterales existentes o mediante la incorporación de moléculas de puentes exteARN s. Muchos agentes divalentes o polivalentes son útiles en acoplar moléculas de proteína a otras proteínas, péptidos o funciones amino. Ejemplos de agentes de acoplamiento son, sin limitación, las carbodiimidas, los diisocianatos, el glutaraldehído, los diasobencenos, y las hexametilendiaminas.

En una modalidad, un anticuerpo empleado en la presente invención, es primero derivado antes de ser sujetado con una parte citotóxica. "Derivados o derivar" significa modificación o modificaciones químicas del sustrato del anticuerpo con un agente reticulante adecuado. Ejemplos de agentes de reticulación para uso en esta manera incluyen los enlaces de disulfuro que contienen enlazadores SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato) y SMPT (4-succinimidil-oxicarbonil-a-metil-a(2-piridildit¡o)tolueno). Los enlaces liberables biológicamente también se pueden usar para construir un anticuerpo clínicamente activo, tal que una parte citotóxica se pueda liberar del anticuerpo una vez que se liga a o entra en la célula objetivo. Numerosos tipos de construcciones de enlaces se conocen para este propósito (por ejemplo, enlaces de disulfuro).

Ela agente o agentes antineoplásicos empleados en un régimen de tratamiento de leucemia se pueden administrar mediante cualquier vía común siempre que el tejido objetivo o la célula objetivo esté disponible por esa ruta. Esto incluye, pero no se limita administración intravenosa, por cateterización, ortotópica, ¡ntradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal intratumoral, oral, nasal, bucal, rectal, vaginal, o administración tópica. La selección de losa gentes antineoplásicos y los regímenes de dosificación pueden depender de varios factores, tal como la combinación de drogas empleada, la enfermedad particular a ser tratada, y la condición e historia previa del paciente. Los regímenes de dosis específicos para agentes antineoplásicos conocidos y aprobados se pueden encontrara en la versión actual Physician's Desk Reference, Medical Economics Company, Inc., Oradell, N.J.

En adición, un régimen de tratamiento de leucemia puede incluir una combinación de diferentes tipos de terapias, tal como quimioterapia más terapia anticuerpo. La presente invención contempla la identificación de genes de pronóstico para todos los tratamientos de regímenes de tratamiento de leucemia.

En un aspecto, la presente invención caracteriza la identificación de genes que son pronósticos de resultados clínicos de pacientes con AML que están bajo un tratamiento anticáncer. Un tratamiento AML puede incluir una terapia de inducción remisión, una terapia post remisión, o una combinación de ellas. El propósito de la terapia de remisión por inducción es el de lograr la remisión mediante matar las células de leucemia en la sangre o en la médula del hueso. El propósito de la terapia de post remisión es de mantener la remisión mediante matar cualquier células de leucemia restantes que pueden no estar activas pero que podrían comenzar a volver a crecer y causar un decaimiento.

Las terapias de inducción por remisión estándar para pacientes de AML incluyen, pero no se limitan a, quimioterapia de combinación, transplante de células no diferenciadas, combinación de alta dosis de quimioterapia, los ácidos transretinóicos (ATRA) más quimioterapia, o quimioterapia intratecal. Las terapias de post remisión estándar incluyen, pero no se limitan a, quimioterapias de combinación, quimioterapias de alta dosis y transplante de células no diferenciadas usando células no diferenciadas donoras, o quimioterapia de alta dosis y transplante de células no diferenciadas usando las células no diferenciadas de los pacientes con o sin terapia de radiación. Para pacientes recurrentes de AML, los tratamientos estándar incluyen, pero no se limitan a, quimioterapia de combinación, terapia biológica con anticuerpos monoclonales, transplante de células no diferenciadas, terapia de radiación de baja dosis como terapia paliativa para aliviar los síntomas y mejorar la calidad de vida, o terapia con trióxido de arsénico. Las terapias no estándar, incluyen tratamientos bajo ensayos clínicos, también se contemplan por la presente invención.

En muchas modalidades, los regímenes de tratamiento descritos en la solicitud de patente U.S Publicación No. 20040152632 se emplean para tratar el AML o MDS. Los genes de pronóstico de los resultados de los pacientes bajo estos regímenes de tratamiento se pueden identificar de acuerdo con la presente invención. En un ejemplo, el régimen de tratamiento incluye la administración de por lo menos una droga de quimioterapia y un anticuerpo anti-CD33 conjugado con un agentes citotóxico. La droga de quimioterapia se puede seleccionar, sin limitación, del grupo que consiste de una antraciclina y una pirimidina o análogo de nucleósido de purina. El agente citotóxico puede ser, por ejemplo, una calicheamicina o una esperamicina.

Las antraciclinas adecuadas para el tratamiento de AML o MDS incluyen, pero no se limitan a, doxorubicinaa, daunorubicina, idarubicina, aclarubicina, zorubicina, mitoxantrona, epirubicina, carubicina, nogalamicina, menogaril, pitarubicina, y valrubicina. Los análogos de nucleósidos de Pirimidina o purina útiles para tratar el AML o el MDS incluyen, pero no se limitan a, citarabina, gemcitabina, trifluridine, ancitabina, enocitabina, azacitidina, doxifluridina, pentostatina, broxuridina, capecifabina, cladribina, decitabina, floxuridina, fludarabina, gougerotina, puromicina, tegafur, tiazofurina, o tubercidina. Otras antraciclinas y análogos de nucleósidos de pirimidina/purina se pueden también usar en la presente invención.

En un ejemplo adicional, el régimen de tratamiento para el AMIJMDS incluye la administración de gemtuzumab ozogamicina (GO), daunorubicina y citarabina a un paciente que necesita el tratamiento. La Gemtuzumab ozogamicina se puede administra, sin limitación, en una cantidad entre 3 mg/m2 a cerca de 9 mg/m2 por día, tal como cerca de t 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mg/m2 por día. La Daunorubicina se puede administrar, por ejemplo, en una cantidad entre cerca de 45 mg/m2 a cerca de 60 mg/m2 por día, tal como cerca de 45, 50, 55 o 60 mg/m2 por día. La Citarabina se puede administrar, sin limitación, en una cantidad entre cerca de 100 mg/m2 a cerca de 200 mg/m2 por día, tal como cerca de 100, 125, 150, 175 o 200 mg/m2 por día. En un ejemplo, la daunorubicina empleada en el régimen de tratamiento es el hidrocloruro de daunorubicina.

Resultado clínico El resultado clínico de pacientes con leucemia se puede determinar mediante un número de criterios. Ejemplos de mediciones de resultado clínico incluyen, pero no se limitan a, remisión completa, remisión parcial, no remisión, Súper vivencia, desarrollo de eventos adversos, o cualquier combinación de ellos. Los pacientes con remisión completa muestran menos de 5% de células reticulares en la médula del hueso después del tratamiento. Los pacientes con remisión parcial exhiben una disminución en el porcentaje de células reticulares a cierto grado pero no logran hematopoyesis normal con menos de 5% de células reticulares. El porcentaje reticular en la médula de hueso de pacientes con no remisión no disminuye de manera significativa en la respuesta del tratamiento.

En muchos casos, las muestras de sangre periférica usadas para la identificación de los genes de pronóstico son muestras "de línea base " o muestras de pretratamiento". Estas muestras se aislan de los pacientes con leucemia respectivos antes de un tratamiento terapéutico y se pueden usar para identificar genes cuyos perfiles de expresión de la línea base de la sangre periférica están correlacionados con el resultado clínico de estos pacientes con leucemia en la respuesta del tratamiento. Las muestras de sangre periférica aisladas en otros tratamientos o etapas de enfermedad se pueden también usar para identificar los genes de pronóstico de la leucemia.

Una variedad de tipos de muestras de sangre periférica puede ser usadas en la presente invención. En una modalidad, las muestras de sangre periféricas son muestras de sangre completas. En otra modalidad, las muestras de sangre periférica comprenden PBMC enriquecidos. Por "enriquecido", se quiere significar que el porcentaje de PBMC en las muestras es más alto que en la sangre completa. En algunos casos, el porcentaje de PBMC en la muestra enriquecida es por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5 o más veces mayor que aquella en la sangre completa. En algunos otros casos, el porcentaje de PBMC en una muestra enriquecida es de por lo menos 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, o más. Las muestras de sangre que contienen el PBMC enriquecido se pueden preparar usando cualquier método conocido en la técnica tal como centrifugación de gradientes ficol o CPT (tubos de purificación celular) Análisis de la expresión de penes La relación entre los perfiles de expresión de genes de sangre periférica y el resultado de pacientes se puede evaluar mediante usar análisis de expresión de genes global. Los métodos adecuados para este propósito incluyen, pero no se limitan a, arreglos de ácido nucleico (tal como arreglos de cADN o oligonucleótidos), electroforesis bidimensional SDS-gel de poliacrilamida/espectrometría de masa, y otras técnicas de alto rendimiento para la detección de nucleótidos o polipéptidos.

Los arreglos de ácido nucleicos permiten detracción cuantitativa de los niveles de expresión y un número grande de genes en un solo momento. Ejemplos de arreglos de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, los micro arreglos Genechip® microarrays from Affymetrix (Santa Clara, CA), micro arreglos de cADN de Agilent Technologies (Palo Alto, CA), y arreglos de perlas descritas en la Patente Estadounidense números. 6, 288,220 y 6, 391 ,562.

Los polinucleótidos a se hibridizados en un arreglo de ácido nucleico se pueden marcar con uno o más partes de marcación para permitir la detección de los complejos de polinucleótidos hibridizados. Las partes de marcación pueden incluir composiciones que son detectable s por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, bioelectrónicas, inmuno químicos, eléctricos, ópticos o químicos. Partes de marcación ilustrativas incluyen radio isótopos, compuestos quimio luminiscentes, proteínas de ligado marcadas, átomos de metales pesados, marcadores espectroscópícos tales como marcadores fluorescentes y tinturas, marcadores magnéticos, enzimas ligadas, etiquetas de espectrometría de masa, etiquetas de eje, donores de transferencia electrónica y aceptores de transferencia electrónica, y similares. Los polinucleótidos no marcados también se pueden emplear. Los polinucleótidos pueden ser ADN, ARN, o formas modificadas de ellos.

Las reacciones de hibridización se pueden llevar a cabo en formatos de hibridización absolutos o diferenciales. En el formato de hibridización absoluta, los polinucleótidos derivados de una muestra, tal como los PBMC de un paciente en una clase de resultado seleccionada, se hibridizan en las probetas sobre un arreglo de ácido nucleico. Las señales detectadas después de la formación de los complejos de hibridización se correlacionan a los niveles del polinucleótido de la muestra. En el formato de hibridización diferencial, los polinucleótidos derivados de dos muestras biológicas, tal como una de un paciente en una primera clase de resultado y la otra de un paciente en una segunda clase de resultado, se marcan con diferentes partes de marcación. Una mezcla de estos polinucleótidos diferentemente marcados se agrega a un arreglo de ácido nucleico. El arreglo de ácido nucleico se examina entonces bajo condiciones en las cuales las emisiones desde las dos marcas diferentes se detectan individualmente. En una modalidad, los fluoróforos Cy3 y Cy5 (Amersham Farmacia Biotech, Piscataway N.J.) se usan como las partes de marcación para el formato de hibridización diferencial.

Las señales recogidas de un arreglo de ácidos nucleicos se pueden analizar usando el software comercialmente disponible, tal como aquellos suministrados por Affymetrix o Agilent Technologies. Los controles, tales como la sensibilidad de barrido, la marcación de probetas y la cuantificación de cADN/cARn, se pueden incluir en los experimentos de hibridización. En muchas modalidades, las señales de expresión de los arreglos de ácido nucleico se miden a escala o normalizados antes de ser sometidos a análisis adicionales. Por ejemplo, las señales de expresión para cada gen se pueden normalizar para tomar en cuenta las variaciones en las intensidades de hibridización cuando más de un arreglo es usado bajo condiciones de ensayo similares. Las señales para la hibridización del complejo de polinucleótidos individual se pueden también normalizar usando las intensidades derivadas de los controles de normalización internos contenidos en cada arreglo. En adición, los genes con niveles de expresión relativamente consistes a lo largo de las muestras se pueden usar para normalizar los niveles de expresión de otros genes. En una modalidad, los niveles de expresión de los genes son normalizados a través de las muestras tal que la media sea cero y la desviación estándar sea 1. En otra modalidad, los datos de expresión detectados por los arreglos de ácidos nucleicos se someten a un filtro de variación que excluye genes que muestran variación mínima o insignificante en todas las muestras.

Los Análisis de correlación Los datos de expresión de genes recolectados de los arreglos de ácidos nucleicos se pueden correlaciona r con el resultado clínico usando una variedad de métodos. Los métodos adecuados para este propósito incluyen, pero no se limitan a, métodos estadísticos (tales como la correlación de ranqueo Spearman's, el modelo de regresión de peligro proporcional Cox, ANOVA/ensayo t, y otros ensayos de ranqueo o modelos de Súper vivencia) y métricas de correlación con base en la clase (tal el análisis del vecino más cercano).

En una modalidad, los pacientes con una leucemia específica (por ejemplo, AML) se dividen en por lo menos dos clases con base en sus respuestas a un tratamiento terapéutico. La correlación entre la expresión de genes de la sangre periférica (por ejemplo expresión de genes PBMC) y las clases de resultado del paciente son entonces analizadas por un grupos Súper visado o algoritmo de aprendizaje. Los algoritmos utilizados adecuados para este propósito incluyen, pero no se limitan a, el análisis del vecino más cercano, máquinas de vector de soporte, el método SAM. Las redes neurales artificiales, y SPLASH. Bajo un análisis Súper visado, el resultado clínico de cada paciente es conocido o determinable. Los genes que se expresan diferencialmente en células de sangre periférica (por ejemplo PBMC) de una clase de pacientes con relación a otra clase de pacientes se pueden identificar. Estos genes se pueden usar como marcadores subrogados para predecir el resultado clínico de un paciente con leucemia de interés. Muchos de estos genes así identificados se correlaciona n con una distinción de clase que representa un patrón de expresión idealizado de estos genes en pacientes de diferentes clases de resultados.

En otra modalidad, los pacientes con una leucemia especificada (por ejemplo AML) se pueden dividir en por lo menos dos clase con base en sus perfiles de expresión de genes de sangre periférica. Los métodos adecuados en este propósito incluyen algoritmos de agrupación no Súper visada, tal como mapas auto organizados (SOM), medias K, análisis de componente principal, y agrupación jerárquica. Un número sustancial (por ejemplo por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o más) de los pacientes en una clase pueden tener un primer resultado clínico, y un número sustancial de pacientes en otra clase pueden tener un segundo resultado clínico. Los genes que se expresan diferencialmente en las células de sangre periféricas de una clase de pacientes con relación a la otra clase de pacientes se pueden identificar. Estos genes también se pueden usar como marcadores de pronóstico para predecir el resultado clínico de un paciente con leucemia de interés.

Todavía en otra modalidad, los pacientes con una leucemia especificada (por ejemplo AML) se pueden dividir en tres o más clases con base en sus resultados clínicos o perfiles de expresión de genes de sangre periférica. Las métricas de correlación multi clase se pueden emplear para identificar los genes que se expresan diferencialmente en una clase de pacientes con relación a otra clase. Métricas de correlación multi clase y las nativas incluyen, pero no se limitan a, aquellas empleadas por el software GeneCluster 2 suministrado por MIT Center for Genome Research at Whitehead Institute (Cambridge, MA).

En una modalidad adicional, el análisis del vecino más cercano (también conocido como el análisis de la vecindad) es usado para correlaciona r perfiles de expresión de genes de sangre periférica con el resultado clínico de pacientes con leucemia. El algoritmo para el análisis de la vecindad se describe en Golub, el al ., SCIENCE, 286: 531-537 (1999); Slonim, el al ., PROCS. OF THE FOURTH ANNUAL INTEARN CIÓNAL CONFERENCE ON COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Tokyo, Japan, April 8-11 , p263-272 (2000); y la patente U.S. No. 6, 647,341. Bajo una versión del análisis de la vecindad, el perfil de expresión de cada gen se puede representar por un vector de expresión g = (e^ e2, e3l. . ., en), en donde e¡ corresponde al nivel de expresión del gen "G" en la iésima muestra. Una distinción de clase se puede representar por un patrón de expresión idealizado c = (c^ c2, c3 cn), en donde c¡ = 1 o -1 , dependiendo de si la iésima muestra se aisla de la clase 0 o la clase 1. La clase 0 puede incluir pacientes que tienen un primer resultado clínico y la clase 1 incluye pacientes que tienen un segundo resultado clínico. Otras formas de distinción de clase también se pueden emplear. Típicamente, una distinción de clases representa un patrón de expresión idealizado, en donde el nivel de expresión de un gen es uniformemente alto para muestras en una clase y uniformemente bajo para muestras en la otra clase.

La correlación entre el gen "G" y la distinción de clase se puede medir medíante una calificación señal a ruido: P(g-c) = [µ1 (g) - µ2(g)]/[s1(g) + s2(g)] En donde µ1 (g) y µ2(g) representan las medias de los niveles de expresión transformados por logaritmo del gen "G" en la clase 0 y en la clase 1 , respectivamente, y s1 (g) y s2(g) representan las desviación estándar de los niveles de expresión transformados por logaritmo del gen "G" en la clase 0 y en la clase 1 , respectivamente. Un valor absoluto mayor de una calificación señal a ruido indica que el gene es más altamente expresado en una clase que en la otra. En un ejemplo, las muestras usadas para derivar las calificaciones señal a ruido comprende los PBMC enriquecidos o purificados y, por lo tanto, la calificación señal a P(g,c) representa una correlación entra la distinción de clase y el nivel de expresión del gen (G) en los PBMC.

La correlación entre en gen "G" y la distinción de clase también se puede medir por otros métodos, tal como por el coeficiente de correlación Pearson o la distancia eucleriana, como se puede apreciar por aquellos versados en la técnica.

La significancia de la correlación entre los perfiles de expresión de los genes de sangre periférica y la distinción de clase se puede evaluar usando un ensayo de permutación aleatoria. Una densidad de genes inusualmente alta dentro de las vecindades de la distinción de clase, comparado con patrones aleatorios, sugiere que muchos genes tienen patrones de expresión que están correlacionados significativamente con la distinción de clase. La correlación entre los genes y la distinción de clase se puede visualizar diagramáticamente a través de un gráfico de análisis de vecindad, en el cual el eje Y representa el número de genes dentro de varias vecindades alrededor de la distinción de clase y el eje X indica el tamaño de la vecindad (es decir P(g,c)). Las curvas que muestran niveles de significancia diferentes para el número de genes dentro de las vecindades correspondientes de las distinciones de clase permutadas aleatoriamente pueden también ser incluidas en el gráfico.

En muchas modalidades, los genes de pronóstico empleados en la presente ¡nvención están por encima del nivel de significancia medio en el gráfico de análisis de vecindad. Estos significa que la medida de correlación P(g,c) para cada gen de pronóstico es tal que el número de genes dentro de la vecindad de la distinción de clase que tiene el tamaño de P(g,c) es mayor que el número de genes dentro de las correspondientes vecindades de las distinciones de clase permutadas aleatoriamente en el nivel de significancia medio. En muchas otras modalidades, los genes de pronóstico empleados en la presente invención están por encima de un nivel de significancia de 40%,30%, 20%, 10%, 5%, 2%, o 1%. Como se usa aquí, el nivel de significancia x% significa que x% de las vecindades aleatorias contiene tantos genes como la vecindad real alrededor de la distinción de clase.

Los predictores de clase se pueden construirse usando genes de pronóstico de la presente invención. Estos predictores de clase se pueden usar para asignar a un paciente con leucemia de interés a una clase de resultado. En una modalidad, los genes de pronóstico empleados en un predictor de clase se limitan a aquellos mostrados que sean correlacionados significativamente con una distinción de clase mediante el ensayo de permutación, tal como aquellos que están por encima de un nivel de significancia de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, o 50%. En otra modalidad, el nivel de expresión PBMC de cada gen de pronóstico en un predictor de clase es sustancíalmente mayor o sustancialmente menor en una clase de pacientes que el la otra clase de pacientes. En todavía otra modalidad, los genes de pronóstico en un predictor de clase tienen valores Súper iores absolutos de P(g,c). Todavía en otra modalidad, el valor T bajo un ensayo T de Student (por ejemplo la distribución de dos colas, la varianza desigual de dos muestras) para cada gen de pronóstico en un predictor de clase no es mas que 0.05, 0.01 , 0.005, 0.001 , 0.0005, 0.0001 , o menos. Para cada gen de pronóstico, el valor p sugiere la significancia estadística de la diferencia observada entre los perfiles de expresión PBMC promedio de los genes en una clase de pacientes contra otra clase de pacientes. Valores de p menores indican mayor o más significancia estadística para las diferencias observadas entre las clases diferentes de pacientes con leucemia.

El método SAM también se puede usar para correlaciona r perfiles de expresión de genes de sangre periférica con diferentes clases de resultado. El método del análisis de predicción de micro arreglos (PAM) se puede también usar para identificar predictores de clase que pueden caracterizar mejor una clase de resultado predefinido y predecir la clase de membresía de las nuevas muestras. Ver Tibshirani, el al ., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 99:6567-6572 (2002).

En muchas modalidades, un predictor de clase de la presente invención tiene una precisión de predicción alta bajo la validación cruzada dejando por fuera 1 , la validación cruzada 10 veces, o la validación cruzada de 4 veces. Por ejemplo, un predictor de clase de la presente invención puede tener por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 99% de precisión bajo la validación cruzada dejando uno por fuera, la validación cruzada 10 veces, o la validación cruzada de 4 veces. En una validación cruzada de K veces típica, el dato se divide en K subconjuntos de aproximadamente igual tamaño. El modelo se entra K veces, cada vez dejando por fuera uno de los subconjuntos del entrenamiento y usando el subconjunto omitido como las muestras de ensayo para calcular el error de predicción. Si K es igual al tamaño de muestra, este convierte en la validación cruzada dejando por fuera uno.

Otras métricas de correlación con base en clase o métodos estadísticos también pueden ser usados para identificar los genes de pronóstico cuyos perfiles de expresión en las muestras de sangre periféricas están correlacionados con el resultado clínico de los pacientes con leucemia. Muchos de estos métodos se pueden llevar a cabo mediante usar software accesible comercial o públicamente.

Otros métodos capaces de identificar los genes de pronóstico de la leucemia incluyen, pero no se limitan, al RT-PCR, el Northern Blot, la hibridización en situ, y los inmuno ensayos tales como ELISA, RÍA o Western Blot. Estos genes son expresados diferencialmente en células de sangre periférica (por ejemplo PBMC) de una clase de pacientes con relación a otra clase de pacientes. En muchos casos, el nivel de expresión de sangre periférica promedio de cada uno de estos genes en una clase de pacientes es diferente estadísticamente de aquel en otra clase de pacientes. Por ejemplo, el valor p bajo un ensayo de significancia estadística apropiado (por ejemplo el ensayo T de Student) para la diferencia observada puede que no sea más de 0.05, 0.01 , 0.005, 0.001 , 0.0005, 0.0001 , o menos. En muchos otros casos, cada gen de pronóstico que es identificado tiene por lo menos 2-, 3-, 4-, 5-, 10-, o 20- veces de diferencia en el nivel de expresión del PBMC promedio entre una clase de pacientes y otra clase de pacientes.

Identificación de los penes de pronóstico del AML usando micro arreglos HG-U133A Como un ejemplo, la presente invención caracterizó firmas en la sangre periférica de los pacientes de AML que son indicativas de remisión en la respuesta a un régimen de quimioterapia que consiste de terapia de inducción con daunorubicina y citarabina con administración concomitante de GO. En particular, la presente invención empleó un modelo farmacogenómico para identificar los patrones transcripción ales en las muestras de sangre periférica tomadas de pacientes con AML antes del tratamiento que fueron correlaciona das con la respuesta positiva al régimen de terapia.

De los 36 pacientes con AML que consintieron para el análisis farmacogenómico, 28 lograron una respuesta positiva y 8 fallaron al responder al régimen de tratamiento luego de 36 días de terapia de inducción. La métrica de correlación por defecto Genecluster's (Golub, el al, SCIENCE, 286: 531-537 (1999)) se usó para identificar los genes con niveles de expresión altamente correlacionados con los perfiles del que responde y el que no responde en el conjunto completo de muestras. El bajo número de no respuestas en los pacientes que consintieron el farmacogenómico precluyó la división de las muestras de sangre en pretratamiento en un entrenamiento y un conjunto de ensayo. Por lo tanto todas las muestras se usaron para identificar clasificadores de genes que mostraron altas precisiones para la clasificación de las muestras que responden contra las muestras de los que no responden.

La tabla 1 lista los genes que tenían niveles de expresión en PBMC en pretratamiento más altos en pacientes de AML quienes fallaron eventualmente en responder a la quimioterapia de combinación de GO (no remisión o remisión parcial), comparado con pacientes AML quienes respondieron a la terapia (remisión a menos de 5% de células reticulares). Los genes que muestran la mayor veces en elevación en pacientes que no responden en PBMC de línea base se dan en la tabla 3. La tabla 2 describe los transcriptos que tenían niveles de expresión de pretratamiento mayores en los PBMC de los pacientes con AML quienes eventualmente responden a la quimioterapia de combinación con GO, comparado con pacientes de AML que no respondieron a la terapia. Los genes que muestran las veces de elevación mayores en pacientes que responden en los PBMC de línea base se dan en la tabla 4. "Veces de cambio" (NR/R)" denota la proporción del nivel de expresión medio de un gen en los PBMC de los pacientes con AML que no responden sobre los pacientes con AML que responden. "Veces de cambio (R/NR)" representa la proporción del nivel de expresión medio de un gen en los PBMC de los pacientes con AML que responden con respecto a los pacientes de AML que no responden. En cada tabla, los transcriptos están presentados en orden de calificación señal a ruido calculada por el algoritmo Súper visado descrito en los ejemplos. Cada gen ilustrado en las tablas 1 a 4 y los unigenes correspondientes se identificaron de acuerdo con las anotaciones Affymetrix.

Los clasificadores consistentes de genes seleccionados de las tablas 1 y 2 se 10 construyeron y evaluaron para la precisión de la predicción de clase. Cada clasificador incluyó el gen Súper ¡or n en la tabla 1 y el gen Súper ior n en la tabla 2, en donde n representa un entero no menor a 1. Por ejemplo, un primer clasificador evaluado incluyó los genes números 1 y 78, un segundo clasificador ¡ncluyó los genes números 1-2 y 78- 79, un tercer clasificador incluyó los genes números 1-3 y 78-80, un cuarto clasificador 15 ¡ncluyó los genes números 1-4 y 78-81 , etc. Cada clasificador así construido produjo una precisión de predicción significativa. Por ejemplo, un clasificador que consiste de todos los 154 genes en las tablas 1 y 2 proporcionó 81% de la precisión de predicción general por la validación cruzada de 4 veces sobre los perfiles de sangre periférica usados en el presente estudio. 20 El análisis de correlación entre los patrones transcripción ales de pretratamiento y los resultados clínicos, incluyendo la ocurrencia de eventos adversos, se discuten adicionalmente en los ejemplos. Los clasificadores adicionales también se divulgan en los ejemplos. 25 Tabla 1. Genes que tienen niveles de expresión en la sangre periférica de línea de base mayores en pacientes que no responden Tabla 2. Genes que tienen niveles de expresión en la sangre periférica de línea base mayores en pacientes que responden Tabla 3. Primeros 50 transcriptos significativamente elevados (p < 0.05) en la línea base en PBMC de pacientes que no respondieron Tabla 4. Primeros 50 transcriptos significativamente elevados (p < 0.05) en ia línea base en PBMC de pacientes que respondieron Genes asociados con el establecimiento de la enfermad veno oclusiva La enfermedad Veno oclusiva (VOD) es una de las más serias complicaciones luego del trasplante de células no diferenciadas ematopoyéticas y está asociada con una muy alta mortalidad en su forma severa. La comparación de los perfiles de PBMC en pretratamiento de los pacientes con leucemia quienes experimentaron VOD con los perfiles PBMC de los pacientes que no experimentaron VOD identifica transcriptos significativos que parecen estar correlacionados con este serio evento adverso antes de la terapia.

Para identificar los transcriptos con diferencias significativas en la expresión en la línea base entre los pacientes que experimentaron VOD y los pacientes que no experimentaron VOD, las veces de diferencias promedio entre perfiles de pacientes VOD y pacientes no VOD se calcularon mediante dividir el nivel medio de expresión en los perfiles VOD de línea base por el nivel medio de expresión en los perfiles no VOD de línea base. Un ensayo T de Student (dos muestras, varianza desigual) se usó para determinar la significancia de la diferencia en la expresión entre los grupos.

Los genes cuyos niveles de expresión son significativamente elevados (p menor a 0.05) en la línea base en pacientes VOD se muestran en la tabla 5. Los genes cuyos niveles de expresión son significativamente represados (p menor 0.05) en la línea base en pacientes VOD se muestran en la tabla 6. De interés, el ligando p-selectina fue uno de los transcriptos más elevados significativamente en la línea base en pacientes que experimentaron VOD. Sin desear estar ligado por ninguna teoría, la elevación en este trascripto puede ser un indicativo biomarcador del daño endotelial que se ha sugerido que juega un papel en las enfermedades Asociadas a trasplantes tales como la enfermedad de injerto vs. Anfitrión, sepsis, y VOD.

Tabla 5. Primeros 50 transcriptos significativamente elevados (p < 0.05) en ia línea base en PBMC de pacientes VOD Tabla 6. Primeros 50 transcriptos significativamente represados (p < 0.05) en la línea base en PBMC de pacientes VOD Identificación de los penes de diapnóstico de leucemia Los métodos anteriormente descritos pueden también ser usados para identificar los genes de diagnóstico de leucemia (también referidos como genes de la enfermedad). Cada uno de estos genes es expresado diferencialmente en los PBMC de los pacientes con leucemia con relación a los PBMC de humanos libres de leucemia o libres de la enfermedad. En muchos casos, el nivel de expresión promedio de PBMC de un gen de enfermedad de leucemia en pacientes con leucemia es diferente estadísticamente de aquel en humanos libres de leucemia o libres de la enfermedad. Por ejemplo, el valor p de un ensayo T de Student para la diferencia observada no es más de 0,005, 0.01 , 0.005, 0.001 , 0.0005, 0.0001 , o menos. En muchos otros casos, la diferencia entre los niveles de expresión de PBMC promedio de un gen de enfermedad de leucemia en pacientes con leucemia y aquel en humanos libres de leucemia es de por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, o más veces. Los genes de la enfermedad de leucemia de la presente invención se pueden usar para detectar la presencia o ausencia, o monitorear el desarrollo, progresión o tratamiento de la leucemia en un humano de interés Los genes de la enfermedad de leucemia también se pueden identificar mediante correlaciona r perfiles de expresión en PBMC con una distinción de clase bajo una métrica de correlación con base en clase (por ejemplo, el análisis del vecino más cercano o el método de significancia de micro arreglos (SAM)). La distinción de clase representa un patrón de expresión de gen idealizado en los PBMC de pacientes con leucemia y humanos libres de la enfermedad. En muchos ejemplos, la correlación entre el perfil de expresión PBMC de un gen de la enfermedad de leucemia y la distinción de clase está por encima del 1 %, 5%, 10%, 25%, o 50% de nivel de significancia bajo un ensayo de permutación. Los clasificadores de genes se pueden construir usando los genes de la enfermedad de leucemia de la presente invención. Estos clasificadores pueden predecir efectivamente la membresía de clase (por ejemplo leucemia vs. Libre de leucemia) de un humano de interés.

Identificación de los penes de diagnóstico de usando micro arreplos HG-U133A Como un ejemplo, los patrones de expresión asociados al AML en sangre periférica se identificaron mediante usar la plataforma de pastilla gene U133A. Los niveles medios de la expresión de los genes de la línea base en los PBMC de un grupo de voluntarios libres de la enfermedad (n=20) se compararon con los niveles medios de la expresión de genes de línea base correspondientes en los PBMC de los pacientes con AML (n=36). Los trascriptos mostraron niveles elevados o disminuidos en los PBMC de los pacientes con AML con relación a los controles saludables que se identificaron. Ejemplos de estos trascriptos se ilustran en la tabla 7. Cada trascripto en la tabla 7 tiene por lo menos dos veces de diferencia en el nivel medio de expresión entre los PBMC AML y los PBMC libres de enfermedad ("AML/libre de enfermedad"). El valor p del ensayo T de Student (varianzas desiguales) para la diferencia observada ("valor p") también se muestra en la tabla 7. "COV" se refiere al coeficiente de varianza.

Tabla 7. Ejemplo de genes de la enfermedad AML expresados diferencialmente en los PBMC De pacientes con AML en relación con voluntarios libres de la enfermedad Cada calificador HG-U133A representa una probeta de oligonucleótido establecida sobre el chip del gen HG-U133A. Los transcriptos de ARN de un gen que corresponden a un calificador HG-U133A pueden hibridizar bajo condiciones de hibridízación en un arreglo de ácido nucleico a por lo menos una probeta de oligonucleótido (PM o probeta de case perfecto) del calificador. Preferiblemente, los transcriptos del ARN del gen no híbridizan bajo condiciones de hibridizacíón de un arreglo de ácido nucleico en una probeta que no case (MM) de la probeta PM. Una probeta dispar es idéntica a la probeta PM correspondiente excepto por una única sustitución homomérica en o cerca del centro de la probeta dispar. Para una probeta PM 25-mer, la probeta MM tiene un cambio de base homomérico en la posición 13.

En muchos cases, los transcriptos de ARN de un gen que corresponde a un calificador HG-U133A se pueden hibridizar bajo condiciones de hibridización de arreglo de ácido nucleico en por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de todas las probetas PM del calificador, pero no a las probetas dispares de estas probetas PM. En muchos otros casos, la calificación de discriminación (R) para cada una de las probetas PM, según se midió por la proporción de la diferencia de intensidad de hibridización del par de probetas correspondientes (es decir, PM - MM) sobre la intensidad de hibridización general (es decir, PM + MM), no es menos que 0.015, 0.02, 0.05, 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 o mayor. En un ejemplo. Los transcriptos de ARN de los genes, cuando hibridizaron en el chip de gen HG-U133A de acuerdo con las instrucciones del fabricante, producen una llamada "presente" bajo las calibraciones por defecto, es decir, el umbral Tau es 0.015 y el nivel de significancia O es 0.4. Ver GeneChip® Expression Analysis - Data Analysis Fundamentáis (Parte No. 701190 Rev. 2, Affymetrix, Inc., 2002), cuyo contenido completo se incorpora aquí como referencia.

Las secuencias de cada probeta PM sobre el chip del gen HG-U133A, y las secuencias objetivo correspondientes de las cuales las probetas PM se derivan, pueden ser obtenidas de las bases de datos de secuencias Affymetrix. Ver, por ejemplo, www.affymetrix.com/support/technical/byproduct.affx?product=hgu133. Todas estas secuencias de probetas objetivo y de oligonucleótidos se incorporan aquí como referencia.

Adicionalmente, los genes cuyas niveles de expresión son elevados significativamente (p<0.001) en los PBMC de los pacientes con AML con relación a sujetos libres de la enfermedad se muestran en la Tabla 8. Los genes cuyos niveles de expresión son significativamente disminuidos (p<0.001 ) en los PBMC de los pacientes con AML con relación a los sujetos libres de la enfermedad se muestran en la Tabla 9.

Cada gen descrito en las Tablas 7, 8 y 9 y los unigenes correspondientes son identificados con base en las anotaciones del chip de gen HG-U133A. Un unigen esta compuesto de un conjunto no redundante de grupos orientados a genes. Cada grupo unígen se cree que incluye secuencias que representan un gen único. La información para cada gen dada en las Tablas 7, 8 y 9 y sus unigenes correspondientes también pueden ser obtenidos de las bases de datos Entrez Gene y Unigene en el Centro Nacional para la información de Biotecnología (NCBl), Bethesda, MD.

En adición a las anotaciones Affymetrix, los genes que corresponden a un calificador HG-U133A pueden ser identificados por búsqueda por BLAST que busca la secuencia objetivo del calificador contra una base de datos de secuencias de genoma humano. Las bases de datos de secuencias de genoma humano adecuadas para este propósito incluyen, pero no se limitan a, la base de datos del genoma humano NCBI. NCBl también suministra programas BLAST, tal como "blastn," para buscar en sus bases de datos secuencias. En una modalidad, la búsqueda de BLAST de la base de datos del genoma humano NCBl se lleva a cabo mediante usar un segmento no ambiguo (por ejemplo, el segmento no ambiguo más largo) de la secuencia objetivo del calificador. Los genes que se alinean al segmento no ambiguo con una identidad de secuencia significativa puede ser identificado. En muchos casos, los genes identificados tienen por lo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más de identidad de secuencia con respecto al segmento no ambiguo.

Como se usa aquí, los genes listados en todas las Tablas involucran no solamente los genes que son ilustrados explícitamente, si no también genes que no están listados en la tabla pero que sin embargo corresponden a un calificador en la tabla. Todos estos genes pueden ser usados como marcadores biológicos para el diagnóstico o monitoreo del desarrollo, progresión, o tratamiento del AML.

Tabla 8. Primeros 50 transcriptos en niveles significativamente elevados (p < 0.001) en los PBMC de los pacientes AML con relación a sujetos libres de la enfermedad Tabla 9. Primeros 50 transcriptos en niveles significativamente más bajos (p < 0.001) en los PBMC de los pacientes con AML con relación a sujetos libres de la enfermedad Pronóstico, Diapnóstico v Selección del Tratamiento de AML o de Otras Leucemias Los genes de pronóstico de la presente invención pueden ser usado para la predicción del resultado clínico de un paciente con leucemia de interés. La predicción típicamente involucra la comparación del perfil de expresión de la sangre periférica de uno o más genes de pronóstico en el paciente con leucemia de interés a por lo menos un perfil de expresión de referencia. Cada gen de pronóstico empleado en la presente invención esta expresado diferencialmente en muestras de sangre periférica de pacientes con leucemia que tienen resultados clínicos diferentes.

En una modalidad, los genes de pronóstico empleados para la predicción del resultado son seleccionados de modo que el perfil de expresión de sangre periférica de cada gen de pronóstico es correlacionado con una distinción de clase bajo un análisis de correlación con base en la clase (tal como el análisis del vecino más cercano), en donde la distinción de clases representa un patrón de expresión idealizado de los genes seleccionados en las muestras de sangre periférica de pacientes con leucemia que tienen resultados clínicos diferentes. En muchos casos, los genes de pronóstico seleccionados son correlacionados con la distinción de clase por encima del 50%, 25%, 10%, 5%, o 1 % del nivel de significancia bajo un ensayo de permutación aleatoria.

Los genes de pronóstico también pueden ser seleccionados de modo que el perfil de expresión promedio de cada gen de pronóstico en las muestras de sangre periférica de una clase de pacientes con leucemia es diferente estadísticamente de aquel en otra clase de pacientes con leucemia. Por ejemplo, el valor p bajo el ensayo t de Student para la diferencia observada no puede ser más de 0.05, 0.01 , 0.005, 0.001 , o menos. En adición, los genes de pronóstico pueden ser seleccionados de modo que el nivel de expresión de sangre periférica promedio de cada gen de pronóstico en una clase de pacientes es por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, o 20 veces diferente de aquel en otra clase de pacientes.

El perfil de expresión de un paciente de interés puede ser comparado con uno o más perfiles de expresión de referencia. Los perfiles de expresión de referencia pueden ser determinados concurrentemente con el perfil de expresión del paciente de interés.

Los perfiles de expresión de referencia también pueden ser determinados o prerregistrados en medios de almacenamiento electrónicos o de otro tipo.

Los perfiles de expresión de referencia pueden incluir perfiles de expresión promedio, o perfiles individuales que representan patrones de expresión de genes de sangre periférica en pacientes particulares. En una modalidad, los perfiles de expresión de referencia incluyen un perfil de expresión promedio de los genes de pronóstico en muestras de sangre periférica de pacientes con leucemia de referencia quienes tienen resultados clínicos conocidos o determinantes. Cualquier método de promediado puede ser usado, tal como la media aritmética, media armónica, promedio de valores absolutos, promedio de valores transformados a logaritmo, o promedios pesados. En un ejemplo. Los pacientes con leucemia de referencia tienen el mismo resultado clínico. En otro ejemplo, los pacientes con leucemia de referencia pueden ser divididos en por lo menos dos clases, cada clase de pacientes tiene un resultado clínico respectivo diferente. Los perfiles de expresión de sangre periférica promedio en cada clase de pacientes constituye un perfil de expresión de referencia separado, y el perfil de expresión del paciente de interés es comparado con cada uno de estos perfiles de expresión de referencia.

En otra modalidad, los perfiles de expresión de referencia incluyen una pluralidad de perfiles de expresión, cada uno de los cuales representa el patrón de expresión de sangre periférica de los genes de pronóstico en un paciente con leucemia particular cuyo resultado clínico es conocido o determinable. Otros tipos de perfiles de expresión de referencia también pueden ser usados en la presente invención. Todavía en otra modalidad, la presente invención usa un umbral numérico como un nivel de control.

El perfil de expresión del paciente de interés y los perfiles de expresión de referencia pueden ser construidos de cualquier forma. En una modalidad, los perfiles de expresión comprenden el nivel de expresión de cada gen de pronóstico usado en la predicción del resultado. Los niveles de expresión pueden ser absolutos, normalizados o de niveles relativos. Los procedimientos de normalización adecuados incluyen, pero no se limitan a aquellos usados en análisis de expresión de genes en arreglos de ácido nucleico o aquellos descritos en Hill, et al., GENOME BIOL, 2:research0055.1-0055.13 (2001). En un ejemplo, los niveles de expresión son normalizados de modo que la media es cero y la desviación estándar en uno. En otro ejemplo, los niveles de expresión son normalizados con base en controles internos o externos, como lo pueden apreciar aquellos versados en la técnica. Todavía en otro ejemplo, los niveles de expresión son normalizados contra uno o más transcriptos de control con abundancias conocidas en las muestras de sangre. En muchos casos, el perfil de expresión del paciente de interés y los perfiles de expresión de referencia con construidos usando las mismas metodologías o metodologías comparables.

En otra modalidad, cada perfil de expresión que es comparado comprende una o más proporciones entre los niveles de expresión de diferentes genes de pronóstico. Un perfil de expresión puede también incluir otras medidas que son capaces de representar patrones de expresión de genes.

Las muestras de sangre periférica usadas en la presente invención pueden ser muestras de sangre completas, o muestras que comprenden PBMC enriquecidas. En un ejemplo, las muestras de sangre periféricas usadas para preparar los perfiles de expresión de referencia comprenden PBMC enriquecidos o purificados, y la muestra de sangre periférica usada para preparar el perfil de expresión del paciente de interés es una muestra de sangre completa. En otro ejemplo todas las muestras de sangre periférica empleadas en la predicción del resultado comprenden PBMC enriquecidos o purificados. En muchos casos, las muestras de sangre periféricas son preparadas del paciente de interés y de los pacientes de referencia usando los mismos procedimientos o procedimientos comparables.

Otros tipos de muestras de sangre también pueden ser empleados en la presente invención, y los perfiles de expresión de gen en estas muestras de sangre son correlacionados estadísticamente de manera significativa con el resultado del paciente.

Las muestras de sangre periférica usadas en la presente invenció pueden ser aisladas de pacientes respectivos de cualquier estado de enfermedad o de tratamiento, y la correlación entre los patrones de expresión de genes en estas muestras de sangre periférica y resultados clínicos es estadísticamente significativo. En muchas modalidades, el resultado clínico es medido por la respuesta de los pacientes a un tratamiento terapéutico, y todas las muestras de sangre usadas en la predicción del resultado son aisladas antes del tratamiento terapéutico. Los perfiles de expresión derivados de estas muestras de sangre son por lo tanto los perfiles de expresión de la línea base para el tratamiento terapéutico.

Construcción de los perfiles de expresión típicamente involucra la detección de los niveles de expresión de cada gen de pronóstico usado en la predicción del resultado. Numerosos métodos están disponibles para este propósito. Por ejemplo, el nivel de expresión puede ser determinado mediante medir el nivel de transcriptos de ARN del gen. Los métodos adecuados incluyen, pero no se limiran a, RT-PCT cuantitativo, Northern Blot, hibridización in situ, slot-blotting, ensayo de protección de nucleasa, y arreglo de ácido nucleico (incluyendo el arreglo perla). El nivel de expresión de un gen puede ser también determinado mediante medir el nivel del polipéptido codificado por el gen. Los métodos adecuados incluye, pero no se limita a, inmunoensayos (tales como ELISA, RÍA, FACS, o Western blot), eelectroforesis de de gel 2-dimensional, espectrometría de masa, o arreglos de proteína.

En un aspecto, el nivel de expresión de un gen de pronóstico es determinado mediante medir el nivel de Transcriptos de ARN del gen en una muestra de sangre periférica. El ARN puede ser aislado de la muestra de sangre periférica usando una variedad de métodos. Métodos ilustrativos incluyen el método de isotiocianato de guanidina/fenol acídico, el Reactivo TRIZOL® (Invitrogen), o el Micro-FastTrack™ 2.0 o FastTrack™ 2.0 los kits de aislamiento de mARN (Invitrogen). El ARN aislado puede ser ARN total o mARN. El ARN aislado puede ser amplificado a cADN o cARN antes de la detección o cuantificación subsiguiente. La amplificación puede ser específica o no específica. Métodos adecuados de amplificación incluyen, pero no se limitan a, PCR de transcriptaza inversa (RT-PCR), amplificación isotérmica, reacción de cadena de ligasa, y Qbeta replicasa.

En una modalidad, el protocolo de amplificación emplea la transcriptaza inversa. El mARN aislado puede ser trascrito de manera inversa en cADN usando una transcriptaza inversa, y un amortiguador consistente de oligo (dT) y una secuencia que codifica el promotor del pago T7. El cADN así producido es de cadena única. La segunda cadena del cADN es sintetizada usando polimerasa de ADN, combinada con RNasa para romper el híbrido ADN/ARN. Después de la síntesis del cADN de doble cadena, la polimerasa T7 de ARN es agregada, y el cARN es entonces trascrito desde la segunda cadena del cADN de doble cadena. El cADN amplificado o el cARN amplificado pueden ser detectados o cuantificados por hibridización a probetas marcadas. El cADN o el cARN pueden también ser marcados durante el proceso de amplificación y luego detectados o cuantificados.

En otra modalidad, se uso el RT-PCR cuantitativo (tal como TaqMan, ABI) para detectar o comparar el nivel de Transcriptos del ARN de un gen de pronóstico de interés. El RT-PCR cuantitativo involucra la transcripción inversa (RT) de ARN en cDNA seguido por la cuantificación relativa de PCR (RT-PCR).

En el PCR, el número de moléculas del ADN objetivo amplificado se incrementa por un factor que se acerca a dos con cada ciclo de la reacción hasta que algún reactivo se vuelve limitante. De ahí en adelante, la rata de amplificación se vuelve incrementalmente disminuida hasta que ya no hay incremento en el objetivo amplificado entre ciclos. Si se hace un gráfico sobre el cual el número de ciclos esta en el eje X y el logaritmo de la concentración del ADN objetivo amplificado esta sobre el eje Y, una línea curva de forma característica puede ser formada mediante conectar los puntos graficados. Iniciando con el primer ciclo, la pendiente de la línea es positiva y constante. Esto se dice que es una porción lineal de la curva. Después de que algún reactivo se vuelve limitante, la pendiente de la línea empieza a disminuir y eventualmente se vuelve cero. En este punto la concentración del ADN objetivo amplificado se convierte asintótica en algún valor fijo. Esto se dice que es la porción de placa de la curva.

La concentración del ADN objetivo en la posición lineal del PCR es proporcional a la concentración de partida del objetivo antes de que el PCR se iniciara. Mediante determinar la concentración de los productos PCR del ADN objetivo en las reacciones PCR que hayan completado el mismo número de cíelos y estén en sus engos lineales, es posible determinar las concentraciones relativas de la secuencia objetivo específica en la mezcla de ADN original. Si las mezclas de ADN son cADN sintetizados de ARN aislados de diferentes tejidos o células, las abundancias relativas del mARN específico desde el cual la secuencia objetivo fue derivada puede ser determinada para los tejidos o células respectivos. Esta proporcionalidad directa entre la concentración de los productos PCR y las abundancias de mARN relativas es verdad en la posición de rango lineal de la reacción PCR.

La concentración final del ADN objetivo en la porción de placa de la curva es determinada por la disponibilidad de los reactivos en la mezcla de reacción y es independiente de la concentración original del ADN objetivo. Por lo tanto, en una modalidad, el muestreo y cuantificación de los productos del PCR amplificados se lleva a cabo cuando las reacciones del PCR están en la porción lineal de sus curvas. En adición, las concentraciones relativas de los cADN amplificables puede ser normalizada a algún estándar independiente, que puede basado sea en las especies de ARN internamente existentes o especies de ARN externamente introducidas. La abundancia de una especie particular de mARN puede también ser determinada en relativo a la abundancia promedio de todas las especies de mARN en la muestra.

En una modalidad, la amplificación PCR utiliza estándares internos PCR que son aproximadamente tan abundantes como el objetivo. Esta estrategia se hace efectiva si los productos de las amplificaciones PCR son muestreados durante sus fases lineales. Si los productos son muestreados cuando las reacciones se acercan a la fase de placa, entonces los productos menos abundantes pueden convertirse en sobre representados. Las comparaciones de abundancias relativas hechas para muchas muestras diferentes de ARN, tal como en el caso cuando se examinan muestras de ARN para la expresión diferencial, pueden volverse distorsionadas de tal manera que hace hacer diferencias en abundancias relativas de los ARN parece menos de lo que ellas realmente son. Esto puede ser mejorado si el estándar interno es mucho más abundante que el objetivo. Si el estándar interno es más abundante que el objetivo, entonces las comparaciones lineales directas pueden ser hechas entre las muestras de ARN.

Un problema inherente en las muestras clínicas es que ellas son de cantidad o calidad variable. Este problema puede solucionarse si el RT-PCR es llevado a cabo como un RT-PCR cuantitativo relativo con un estándar interno en el cual el estándar interno es un fragmento de cADN amplificable que es más grande que el fragmento de cADN objetivo, y en el cual la abundancia del mARN que codifica el estándar interno es aproximadamente 5-100 veces mayor que el mARN que codifica el objetivo. Este ensayo mide la abundancia relativa, no la abundancia absoluta de las especies de mARN respectivas.

En otra modalidad, el RT-PCR cuantitativo relativo usa un protocolo estándar externo. Bajo este protocolo, los productos PCR son muestreados en la porción lineal de sus curvas de amplificación. El número de ciclos PCR que son óptimos para muestrear puede ser determinado empíricamente para cada fragmento de cADN objetivo. Adicionalmente, los productos de transcriptaza inversa de cada población de ARN aislada de las varias muestras puede ser normalizada para concentraciones iguales de cADN amplificables. Aunque la determinación empírica del rango lineal de la curva de amplificación y normalización de las preparaciones de cADN son tediosas y procesos que consumen muchos tiempo, los ensayos RT-PCR resultantes pueden, en ciertos casos, ser Superiores a aquellos derivados de un RT-PCR cuantitativo relativo con un estándar interno.

Todavía en otra modalidad, arreglos de ácido nucleico (incluyendo arreglos perla) son usados para detectar o comparar los perfiles de expresión de un gen de pronóstico de interés. Los arreglos de ácido nucleico pueden ser arreglos de cADN o de oligonucleótidos comerciales. Estos también pueden ser arreglos adaptados que comprenden probetas concentradas para los genes de pronóstico de la presente ¡nvención. En muchos ejemplo, por lo menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, o más de las probetas totales en un arreglo adaptado de la presente invención son probetas para genes de pronóstico de leucemia. Estas probetas pueden hibridizar bajo condiciones de hibridización estrictas o de arreglos de ácido nucleico en transcriptos de ARN, o complementos de ellos, de los genes de pronóstico correspondientes.

Como se usa aquí, "condiciones estrictas" son por lo menos tan estrictas como, por ejemplo, condiciones G-L mostradas en la Tabla 10. "Condiciones altamente estrictas" con por lo menos tan estrictas como las condiciones A-F mostradas en la Tabla 10. La hibridización se lleva a cabo bajo las condiciones de hibridización (temperatura y amortiguamiento de hibridización) durante cerca de cuatro horas, seguido por dos lavadas de 20 minutos bajo las condiciones de lavado correspondientes (temperatura y amortiguación de lavado.

TablalO. Condiciones de Rigurosidad 1: La longitud del híbrido es aquella anticipada para las región es hibridizadas de los polinucleótidos de hibridizantes. Cuando se hibridiza un polinucleótido en un polinucleótido objetivo de secuencia desconocida, la longitud del híbrido es asumida que es aquella del polinucleótido hibridizante. Cuando los polinucleótidos de secuencia conocida son hibridizados, la longitud del híbrido puede ser determinada mediante alinear las secuencias de los polinucleótidos e identificar la región o región es de complementariedad de secuencia óptima.

H: SSPE (1x SSPE es 0.15M de NaCI, 10 mM de NaH2PO4, y 1.25 mM de EDTA, pH 7.4) puede ser sustituido por SSC (1x SSC es 0.15M de NaCI y 15 mM de citrato de sodio) en la hibridización y los amortiguadores de lavado.

TB* - TR*: La temperatura de hibridización para los híbridos se anticipa que es menor a 50 pares de base en longitud deverian ser 5-10° C menos que la temperatura de fusión (Tn) del híbrido, en donde Tm es determinada de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos menores a 18 pares de base en longitud, Tm(°C) = 2(# de A + T bases) + 4(# de G + C bases). Para híbridos entre 18 y 49 de base en longitud, Tm(°C) = 81.5 + 16.6(log10[Na+]) + 0.41 (%G + C) - (600/N), donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración molar de iones de sodio en el amortiguador de híbridízación ([Na+] para 1x SSC = 0.165 M).

En un ejemplo, un arreglo de ácido nucleico de la presente invención incluye por lo menos 2, 5, 10, o más probetas diferentes. Cada una de estar probetas es capaz de hibridizar bajo condiciones de hibridización rigurosas o de arreglo de ácido nucleico en un gen de pronóstico respectivo diferente de la presente invención. Múltiples probetas para el mismo gen de pronóstico pueden ser usadas sobre el mismo arreglo de ácido nucleico. La densidad de probetas en el arreglo puede ser de cualquier rango.

Las probetas para un gen de pronóstico de la presente invención pueden ser una probeta de ácido nucleico tal como, ADN, ARN, APN, o una forma modificada de ellos. Los residuos de nucleótido en cada probeta pueden residuos de ocurrencia natural (tal como deoxiadenilato, deoxicitidilato, deoxiguanilato, deoxitimidilato, adenilato, cifidilato, guanilato, y uridilato), o análogos producidos sintéticamente que sean capaces de formar relaciones de base par deseadas. Ejemplos de estos análogos incluye, pero no se limitan a análogos aza y deaza pirimidina, análogos de aza y deaza purina, y otros análogos de base heterocíclicos, en donde uno o más de los átomos de carbono y nitrógeno de los anillos de purina y pirimidina son sustituidos por heteroátomos, tales como oxígeno, azufre, selenio, y fósforo. Similarmente, las estructuras del polinucleótido de las probetas pueden ser de ocurrencia natural (tal como por enlaces 5' a 3'), o modificada. Por ejemplo, las unidades del nucleótido pueden ser conectadas vía enlaces no típicos tal como enlace 5' a 2', siempre que el enlace no interfiera con la hibridización. En otro caso, los ácidos nucleicos del péptido, en el cual las bases constituyentes son unidas por enlaces de péptido en ligar de enlaces de fosfodiéster, pueden ser usadas.

Las probetas para los genes de pronóstico pueden ser sujetas establemente a región es discretas sobre el arreglo de ácido nucleico. Por "sujetadas establemente" se quiere decir que una probeta mantiene su posición relativa a la región discreta sujetada durante la hibridización y la detección de la señal. La posición de cada región discreta sobre el arreglo de ácido nucleico puede ser conocida o determinable. Todos los métodos conocidos en la técnica pueden ser usados para hacer los arreglos de ácido nucleico de la presente invención.

En otra modalidad, los ensayos de protección de nucleasa son usados para cuantificar los niveles de transcripto de ARN en muestras de sangre periférica. Hay muchas versiones diferentes de ensayos de protección de nucleasa. La característica común de estos ensayos de protección de nuclesasa es que ellos involucran la hibridización de un ácido nucleico antisentido con un ARN que va a ser cuantificado. La molécula de doble hélice híbrida resultante es entonces digerida con una nucleasa que digiere los ácidos nucleicos de cadena única más eficientemente que las moléculas de cadena doble. La cantidad de ácido nucleico antisentido que sobrevive a la digestión es una medida de la cantidad de las especies de ARN objetivo que van a ser cuantificadas. Ejemplos de ensayos de protección con nucleasa adecuados incluyen el ensayo de protección con RNasa provisto por Ambios, Inc. (Austin, Texas).

Las probetas de hibridización o cebadores de amplificación para los genes de pronóstico de la presente invención pueden ser preparadas mediante usar cualesquíer métodos conocidos en la técnica. Para los genes de pronóstico cuyas localizaciones genómicas no han sido determinadas o cuyas identidades son basadas solamente en datos EST o mARN, los cebadores de probetas para estos genes pueden ser derivados de las secuencias objetivo de lois calificadores correspondientes, o las secuencias correspondientes de EST o mARN.

En una modalidad, las probetas/cebadores para un gen de pronóstico significativamente divergen de las secuencias de otros genes de pronóstico. Esto puede ser logrado mediante verificar las secuencias de la probeta potencial/cebador contra una base de datos de secuencias de ganoma humano, tal como la base de datos Entrez de la NBCI. Un algoritmo adecuado para este propósito es el algoritmo BLAST. Este algoritmo involucra primero identificar pares de secuencias de alta marcación (HSP) mediante identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia de búsqueda, que case o satisfaga alguna marca de umbral valuada positiva cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en la secuencia de la base de datos. T se refiere a un umbral de marca de palabra de la vecindad. La palabra de la vecindad actúa como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengas. Los golpes de palabra son entonces extendidos en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia para incrementar la marcación de alineamiento copulativa. Las marcaciones acumulativas son calculadas usando, para las secuencias de nucleótido, los parámetros M (marcación de premio para un par de residuos de case; siempre >0) y M (marcación de multa para residuos que no casen; siempre <0). Los parámetros W, T, y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. Estos parámetros pueden ser ajustados para diferentes propósitos, como puede ser apreciado por aquellos versados en la técnica.

En otra modalidad, las probetas para losa genes de pronóstico pueden ser un polipéptido en la naturaleza, tal como, probetas de anticuerpos. Los niveles de expresión de los genes de pronóstico de la presente invención son entonces determinados medíante medir los niveles de los polipéptidos codificados por los genes de pronóstico. Los métodos adecuados para este propósito incluyen. Pero no se limitan a, inmunoensayos tales como ELISA, RÍA, FACS, dot blot, Western Blot, ¡nmunohistoquímica, y producción de radioimágenes con base en anticuerpo. En adición, el secuenciamiento de alto rendimiento de proteínas, la electroforesís de gel bidimensional SDS-poliacrilamida, la espectrometría de masa, o los arreglos de proteínas pueden ser usados.

En una modalidad, los ELISA son usados para detectar los niveles de las proteínas objetivo. En un ELISA ilustrativo, los anticuerpos capaces de ligar a las proteínas objetivo son inmovilizadas en superficies seleccionadas que exhiben afinidad a la proteína, tal como pozos en una placa microtítulo de poliestireno o polivinilcloruro. Las muestras son ensayas y luego agregadas a los pozos. Después de ligar y lavar para remover los inmunocomplejos ligados no específicamente, los antígenos ligados pueden ser detectados. La detección puede ser lograda mediante la adición de un segundo anticuerpo que es específico para las proteínas objetivo y se liga a una etiqueta detectabla. La detección también puede ser lograda mediante la adición de un segundo anticuerpo, seguido por la adición de un tercer anticuerpo que tiene afinidad de ligado para el segundo anticuerpo, con el tercer anticuerpo ligado a una etiqueta detectabla. Antes de ser agregado a la placa microtítulo, las células en las muestras pueden usadas o extraídas para separar las proteínas objetivo de sustancias que potencialmente interfieran.

En otro ELISA ilustrativo, las muestras que se sospecha que contienen las proteínas objetivo son inmovilizadas en la superficie de los pozos y luego puestas en contacto con los anticuerpos. Después de ligar y lavar para remover los inmunocomplejos ligados no específicamente, los antígenos ligados son detectados. En donde los anticuerpos iniciales son ligados a una etiqueta detecfabla, los ¡nmunocomplejos pueden ser detectados directamente. Los inmunocomplejos también pueden ser detectados usando un segundo anticuerpo que tiene afinidad de ligado por el primer anticuerpo. Con el segundo anticuerpo ligado a una etiqueta detectabla.

Otro ELISA ilustrativo involucra el uso de la competición de anticuerpos en la detección. En este ELISA, las proteínas objetivo son inmovilizadas sobre la superficie del pozo. Los anticuerpos marcados son agregados al pozo, se les permite ligarse a las proteínas objetivo, y son detectadas mediante sus etiquetas. La cantidad de proteínas objetivo en ua muestra desconocida es entonces determinada mediante mezclar la muestra con los anticuerpos marcados o etiquetados antes o durante la incubación con los pozos recubiertos. La presencia de las proteínas objetivo en la muestra desconocida actúa para reducir la cantidad de anticuerpo disponible para ligado en el pozo y por lo tanto reduce la última señal.

Diferentes formatos ELISA pueden tener ciertos rasgos en común, tal como cubrimiento, incubación o ligado, lavado para remover especies no específicamente ligadas, y detectar los inmunocomplejos ligados. Por ejemplo, al recubrir una placa sea con antígeno o anticuerpo. Los pozos de la placa pueden ser incubados con una solución de antígeno o anticuerpo, sea durante la noche o durante un periodo especificado de horas. Los pozos de la placa son entonces lavados para remover el material absorbido incompletamente. Cualesquier superficies disponibles restantes del pozo son entonces "cubiertas" con una proteína no específica que es neutral antigénicamente con respecto a las muestras de ensayo. Ejemplos de estas proteínas no específicas incluyen la albúmina de suero bovino (BSA), caseína y soluciones de leche en polvo. El recubrimiento permite bloquear los ciclos de absorción no específicos sobre la superficie inmovilizada y por lo tanto reduce el fondo causado por ligado no específico del antisuero en la superficie.

En los ELISA, un medio de detección secundario o terciario puede ser usado.

Después del ligado de una proteína o anticuerpo en pozo, recubrir con un .material no reactivo para reducir el fondo, y lavar para remover el material no ligado, la superficie inmovilizante es puesta en contacto con la muestra de control, clínica o biológica para ser ensayada bajo condiciones efectivas para permitir la formación del ¡nmunocomplejo (antígeno/anticuerpo). Estas condiciones pueden incluir, por ejemplo, diluir los antígenos y los anticuerpos con soluciones tales como BSA, gamma globulina bovina (BGG) y salina amortiguada con fosfato (PBS)/Tween e incubar los anticuerpos y antígenos a temperatura ambiente durante 1 a 4 horas o a 4o C durante la noche. La detección del inmunocomplejo es facilitada mediante usar un ligando de ligado secundario marcado o anticuerpo, o un ligando de ligado secundario o anticuerpo en conjunto con un anticuerpo terciario marcado o un tercer ligando de ligado.

Siguiendo todas las etapas de incubación en una ELISA, la superficie contactada puede ser lavada de modo que se remueva el material no complejado. Por ejemplo, la superficie puede ser lavada por una solución tal como PBS/Tween o amortiguar de borato. Luego de la formación de inmunocomplejos específicos entre la muestra de ensayo y el material originalmente ligado, y el lavado subsiguiente, la ocurrencia de la cantidad de inmunocomplejos puede ser determinada.

Para suministrar un medioa de detección, el segundo o tercer anticuerpo puede tener un etiqueta asociada para permitir la detección. En una modalidad la etiqueta es una enzima que genera un desarrollo de color sobre la incubación con un sustrato apropiado cromogénico. Así, por ejemplo, uno puede poner en contacto e incubar el primer y segundo inmunocomplejo con una ureasa, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina o hidrogen peroxidasa-anticuerpo conjugado durante un periodo de tiempo y bajo condiciones que favorezcan el desarrollo de la formación de inmunocomplejo (por ejemplo incubación durante 2 horas a temperatura ambiente en una solución que contiene PBS tal como PBS/Tween).

Después de la incubación con el anticuerpo marcado, y el lavado subsiguiente para remover el material no ligado, la cantidad de etiqueta puede ser cuantificada, por ejemplo, mediante incubación con un sustrato cromogénico tal como uria y bromocresol púrpura o ácido 2,2'-azido-di-(3-etil)-benztuazolina-6-sulfónico (ABTS) y H2O2, en el caso de peroxidasa como etiqueta de enzima. La cuantificación puede ser lograda mediante medir el grado de generación de color, por ejemplo usando un espectofotómetro.

Otro método adecuado para detectar niveles de polipéptido es el RÍA (radioinmunoensayo). Un RÍA ilustrativo esta basado en la competencia entre polipéptidos radiomarcados y polipéptidos no marcados para el ligado a una cantidad limitada de anticuerpos. Los rediomarcados adecuados incluyen, pero no se limitan a, I125. En una modalidad, una concentración fijada de polipéptido marcado con I125 es incubada con una serie de diluciones de un anticuerpo específico al polipéptido. Cuando el polipéptido no marcado es agregado al sistema, la cantidad de polipéptido con I125 que se liga al anticuerpo se disminuye. Una curva estándar puede por lo tanto ser construida para representar la cantidad de I125 polipéptido ligado al anticuerpo como una función de la concentración del polipéptido no marcado. De estar curva estándar, la concentración del polipéptido en muestras desconocidas puede ser determinada. Los protocolos para conducir el RÍA son bien conocidos en la técnica.

Anticuerpos adecuados para la presente invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricps, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena única, fragmentos Fab, o fragmentos producidos por una librería de expresión Fab. Anticuerpos neutralizantes (es decir, aquellos que inhiben la formación de dímero) también pueden ser usados. Los métodos para preparar estos anticuerpos son bien conocidos en la técnica. En una modalidad, los anticuerpos de la presente invención pueden ligarse a los productos de gen de pronóstico correspondientes o a otros antígenos deseados con afinidades de ligado de por lo menos 104 M-1 , 105 M"1, 106 M_1, 107 M"1, O más.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser marcados con una o más partes detectablas para permitir la detección de los complejos anticuerpo-antígeno. La partes detectablas pueden incluir composiciones detectablas por medios espectroscópicos, enzimáticos, fotoquímicos, bioquímicos, bioelectrónícas, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Las partes detectablas incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos, compuestos quimioluminiscentes, proteínas de ligado marcadas. Átomos de metal pesado, marcadores espectroscópicos tales como marcadores fluorescentes y tinturas, etiquetas magnéticas, enzimas ligadas, etiquetas de espectrometría de masa, etiquetas de giro, donores y aceptares de transferencia de electrones, y similares.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser usados como probetas para construir arreglos de proteínas para la detección de perfiles de expresión de los genes de pronóstico. Los métodos para hacer los arreglos de proteína o los biochips son bien conocidos en la técnica. En muchas modalidades, una porción sustancial de las probetas en un arreglo de proteínas de la presente invención son anticuerpos específicos para los productos de genes de pronóstico. Por ejemplo, por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, o más probetas en el arreglo de proteínas pueden ser anticuerpos específicos para los productos de genes de pronóstico.

Todavía en otro aspecto, los niveles de expresión de los genes de pronóstico son determinados mediante medir las funciones biológicas o actividades biológicas de estos genes. En donde una función o actividad biológica de un gen es conocida, en ensayos en vitro o en vivo pueden ser desarrollados para evaluar la función o actividad. Estos ensayos pueden subsiguientemente ser usados para determinar el nivel de expresión del gen de pronóstico.

Después de que el nivel de expresión de cada gen de pronóstico es determinado, numerosos modelos pueden ser empleados para comparar los perfiles de expresión. La comparación de los perfiles de expresión de una paciente de interés con respecto a los perfiles de expresión de referencia pueden ser conducidos manual o electrónicamente. En un ejemplo, la comparación se lleva a cabo mediante comparar cada componente en un perfil de expresión al componente correspondiente en un perfil de expresión de referencia. El componente puede ser el nivel de expresión de un gen de pronóstico, una proporción entre los niveles de expresión de dos genes de pronóstico, u otra medida capaz de representar los patrones de expresión de genes. El nivel de expresión de un gen puede tener un valor absoluto o un valor normalizado o relativo. La diferencia entre dos componentes correspondientes puede ser determinada mediante las veces de cambios, diferencias absolutas u otros medios adecuados.

La comparación del perfil de expresión de un paciente de interés con los perfiles de expresión de referencia también puede conducirse usando patrones de reconocimiento o programas de comparación, tales como el algoritmo k de vecinos más cercanos como se describió en Armstrong, ef al., NATURE GENETICS, 30:41-47 (2002), o un algoritmo pesado por votación como se describe más adelante. En adición, el análisis serial de la tecnología de expresión de genes (SAGE), el programa de análisis de expresión de genes GEMTOOLS (Incyte Pharmaceuticals), el GeneCalling y la tecnología de Análisis de Expresión Cuantitativa (Curagen), y ogros métodos adecuados, programas o sistemas también pueden ser usados para comparar los perfiles de expresión.

Múltiples genes de pronóstico pueden ser usados en la comparación de los perfiles de expresión. Por ejemplo, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 o más genes de pronóstico pueden ser usados. En adición, los genes de pronóstico usados en la comparación pueden ser seleccionados para tener valores p relativamente pequeños (por ejemplo valores p de doble lado). En muchos ejemplos, los valores p indican la significancia estadística de la diferencia entre los niveles de expresión del gen en diferentes clases de pacientes. En muchos otros ejemplos, los valores p sugieren la significancia estadística de la correlación entre los patrones de expresión de genes y el resultado clínico. En una modalidad, os genes de pronóstico usados en la comparación tienen calores p no mayores a 0.05, 0.01 , 0.001 , 0.0005, 0.0001 , o menores. Los genes de pronóstico con valores p mayores de 0.05 también pueden ser usados. Estos genes pueden ser identificados, por ejemplo, mediante usar un número relativamente pequeño de muestras de sangre.

La similaridad o diferencia entre el perfil de expresión de un paciente de interés y un perfil de expresión de referencia es indicativa de la membresía de clase del paciente de interés. La similaridad o diferencia puede ser determinada mediante cualquier medio adecuado. La comparación puede ser cualitativa, cuantitativa, o ambas.

En un ejemplo, un componente en un perfil de referencia es un valor medio, y el componente correspondiente del perfil de expresión del paciente de interés cae dentro de la desviación estándar del valor medio. Tal caso, el perfil de expresión del paciente de interés puede ser considerado similar al perfil de referencia con respecto a ese componente particular. Otro criterio, tal como una desviación estándar múltiple o de fracción de un cierto grado de incremento o disminución de porcentaje, puede ser usado para medir la similaridad.

En otro ejemplo, por lo menos 50% (por ejemplo por lo menos 60%, 70%, 80%, 90% o más) de los componentes en el perfil de expresión del paciente de interés son considerados similares a los componentes correspondientes en el perfil de referencia. Bajo estas circunstancias, el perfil de expresión del paciente de interés puede ser considerado similar al perfil de referencia. Los componentes diferentes en el perfil de expresión pueden tener diferentes pesos para la comparación. En algunos casos, los umbrales de menor porcentaje (por ejemplo menos del 50% del total de los componentes) es usado para determinar la similaridad.

Los genes de pronóstico y el criterio de similaridad puede ser seleccionado de modo que la presición de la predicción de los resultados (la proporción de llamadas correctas sobre el total de llamadas correctas e incorrectas) sea relativamente alta. Por ejemplo, la presición de la predicción puede ser por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más.

La efectividad de la predicción del resultado también puede ser determinada mediante sensibilidad y especificidad. Los genes de pronóstico y el criterio de comparación pueden ser seleccionados de modo que tanto la sensibilidad como la especificidad de la predicción del resultado sean relativamente altas. Por ejemplo, la sensibilidad y especificidad pueden ser de por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más. Como se usa aquí, "sensibilidad" se refiere a la proporción de llamadas positivas correctas sobre el total de llamadas positivas verdaderas más llamadas negativas falsas, y "especificidad" se refiere a la proporción de llamadas negativas correctas sobre el total de llamadas negativas verdaderas más llamadas positivas falsas.

Más aún. La predicción del resultado con base en el perfil de expresión de sangre periférica puede ser combinada con otra evidencia clínica o métodos de pronóstico para mejorar la efectividad o presición de la predicción del resultado.

En muchas modalidades, el perfil de expresión de un paciente de interés es comparado con por lo menos dos perfiles de expresión de referencia. Cada perfil de expresión de referencia puede incluir un perfil de expresión promedio, o un conjunto de perfiles de expresión individuales cada uno de los cuales representa el patrón de expresión del gen en sangre periférica en un paciente con AML particular o en un humano libre de la enfermedad. Los métodos adecuados para comparar un perfil de expresión con dos o más perfiles de expresión de referencia incluyen, pero no se limitan a, el algoritmo de pesado por votación o el algoritmo k de vecino más cercano. El software capaz de llevar a cabo estos algoritmos incluye, pero no limitan a, el software GeneCluster 2. El software GaneCluster 2 está disponible del Centro para Investigación MIT de Whitehead Institute (por ejemplo, www-enome.wi.mit.edu/cancer/software/genecluster2/gc2/.html).

Tanto los algoritmos de pesado por votación y el k de vecino más cercano emplean clasificadores de genes que pueden ser asignados efectivamente a un paciente de interés o a una clase de resultado. Mediante "efectivamente", se quiere decir que la asignación de la clase es significante estadísticamente. En un ejemplo, la efectividad de la asignación de clase es evaluada por la validación cruzada dejando fuera uno o por la validación cruzada k veces. La presición de la predicción bajo estos métodos de validación cruzada puede ser, por ejemplo, por lo menos de 505, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o más. La sensibilidad o especificidad de la predicción bajo estos métodos de validación cruzada pueden también ser de por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más. Los genes de pronóstico o los predoctores de clase con baja sensibilidad/especificidad de asignación o baja presición de validación cruzada, tal como menos de 50%, también pueden ser usados en la presente ¡nvención.

Bajo una versión del algoritmo de peso por votación, cada gen en un predictor de clase tiene un peso de voto para una de dos clases (clase 0 y clase 1). El voto del gen "g" puede ser definido como vg = ag (xg-bg), en donde ag igual a P(g,c) y refleja la correlación entre el nivel de expresión del gen "g" y la distinción de clases entre las dos clases, bg es calculado como bg = [x?(g) + x1(g)]/2 y representa el promedio de la media de los logaritmos de los niveles de expresión del gen "g" en las clases 0 y en la clase 1 , y xg es el logaritmo normalizado del nivel de expresión del gen "g" en la muestra de interés. Un vg positivo indica un voto por la clase 0, y un vg negativo indica un voto para la clase 1. V0 denota la suma de todos los votos positivos, y V1 denota el valor absoluto de todos los votos negativos. Una fuerza de predicción PS es definida como PS = (VO - V1)/(V0 + V1). Así, la fuerza de la predicción varia entre -1 y 1 y puede indicar el soporte para una clase (por ejemplo, PS positivo) o la otra (por ejemplo, PS negativo). Una fuerza de predicción cercana a "0" sugiere un margen estrecho de victoria, y una fuerza de predicción cercana a "1" o "-1 " indica un amplio margen de victoria. Ver Slonim, et al., PROCS. OF THE FOURTH ANNUAL INTERNATIONAL CONFERENCE ON COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Tokyo, Japón, Abril 8-11 , p263-272 (2000); y Golub, ef al., SCIENCE, 286: 531-537 (1999).

Los umbrales de fuerza de predicción adecuada (PS) pueden ser determinados mediante graficar la rata de error de validación cruzada acumulativa contra la fuerza de predicción. En una modalidad, una predicción positiva es hecha si el valor absoluto de PS para la muestra de interés no es menos de 0.3. Otros umbrales PS, tales como no menos de 0.1 , 0.2, 0.4 o 0.5, también pueden ser seleccionados para la predicción de clase. En muchas modalidades, un umbral es seleccionado de modo que la presición de la predicción es optimizada y la incidencia tanto de los resultados falsos positivos y falsos negativos sea minimizada.

Cualquier predictor de clase construido de acuerdo con la presente invención puede ser usado para la asignación de clase de un paciente con leucemi de interés. En muchos ejemplos, un predictor de clase empleado en la presente invención incluye n genes de pronóstico identificados por el análisis del vecino, en donde n es un entero mayor a 1. Una mitad de estos genes de pronóstico tiene las calificaciones P(g,c) más grandes, y la otra mitad tiene las calificaciones -P(g,c) más grandes. El número n por lo tanto es el único parámetro libre en definir el predictor de clase.

El perfil de expresión de un paciente de interés también puede ser comparado con dos o más perfiles de expresión de referencia por otros medios. Por ejemplo, los perfiles de expresión de referencia pueden incluir un perfil de expresión de sangre periférica promedio para cada clase de pacientes. El hecho de que el perfil de expresión de un paciente de interés sea más similar a un perfil de referencia que a otro sugiere que el paciente de interés tendrá más probablemente un resultado clínico asociado con el perfil de referencia anterior que asociado con el perfil de referencia último.

En una modalidad particular, la presente invención caracteriza la predicción del resultado clínico de en Paciente con AML de interés. Los paciente con AML pueden ser divididos en por lo menos dos clases con base en sus respuestas a un régimen de tratamiento especificado. Una clase de pacientes (los que responden) tiene una remisión completa en la respuesta al tratamiento, y la otra clase de pacientes (que no responden) no tiene remisión o tiene una remisión parcial en la respuesta al tratamiento. Los genes de pronóstico AML que don correlacionados con la distinción de clase entre estas das clases de pacientes pueden ser identificados y luego usados para asignar al paciente de interés a una de estas dos clases de resultados. Ejemplos de genes de pronóstico de AML adecuados para este propósito se ilustran en las Tablas 1 y 2.

En un ejemplo, el régimen de tratamiento incluye la administración de por lo menos un agente de quimioterapia (por ejemplo, daunorubicina o citarabina) y un anticuerpo anti-CD33 conjugado con un agente citotóxico (por ejemplo, gemtuzumab ozogamicina), y el perfil de expresión de un paciente con AML de interés es comparado con dos o más perfiles de expresión de referencia mediante usar un algoritmo de pesado por votación o k de vecino más cercano. Todos estos perfiles de expresión son perfiles de línea base que representan los patrones de expresión de genes de sangre periférica antes del régimen del tratamiento. Un clasificador que incluye por lo menos un gen seleccionado de la Tabla 1 y por lo menos un gen seleccionado de la Tabla 2 puede ser empleado para la predicción del resultado. Por ejemplo, un clasificador puede incluir por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 o más genes seleccionados de la Tabla 1 , y por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 o más genes seleccionados de la Tabla 2. El número total de genes seleccionados de la Tabla 1 puede ser igual a, o diferente de, aquel seleccionado de la Tabla 2.

Genes de pronóstico o predictores de clases capaces de distinguir tres o más clases de resultado también pueden ser empleados en la presente invención. Estos genes de pronóstico pueden ser identificados usando métricas de correlación de multi-clase. Los programas adecuados para llevar a cabo el análisis de correlación de multi-clase incluyen, pero no se limitan a, el software GeneCluster 2 (MIT Center for Genome Research at Whitehead Institute, Cambridge, MA). Bajo el análisis, los pacientes que tienen un tipo específico de leucemia son divididos en por lo menos tres clases, y cada clase de pacientes tiene un resultado clínico respectivo diferente. Los genes de pronóstico identificados bajo el análisis de correlación multí-clase son expresados diferencialmente en los PBMC de una clase de pacientes con relación a los PBMC de otra clase de pacientes. En una modalidad, los genes de pronóstico identificados son correlacionados con una distinción de clase por encima del 1%, 5%, 10%, 25%, o 50% de nivel de significancia bajo un ensayo de permutación. La distinción de clase representa un patrón de expresión idealizada de los genes identificados en muestras de sangre periférica de pacientes que tiene diferentes resultados clínicos.

Por ejemplo, las Figuras 1A y 1 B ilustran la identificación y la validación cruzada de clasificadores de genes para la distinción de los PBMC de pacientes que respondieron o no a la terapia de combinación Mylotarg. Las Figuras 1A muestra los niveles de expresión relativa de 98 genes correlacionados con clase. Como se presentó gráficamente, 49 genes fueron elevados en PBMC de pacientes que responden con relación a los PBMC de pacientes que no responden y los otros 49 genes fueron elevados en PBMC de pacientes que no responden con relación a PBMC de pacientes que responden. La Figura 1 B demuestra los resultados de validación cruzada para cada muestra usando un predictor de clase que consiste de los 154 genes ilustrados en las Tablas 1 y 2. Una validación cruzada dejando por fuera uno fue llevada a cabo y las fuerzas de predicción fueron calculadas para cada muestra. Las muestras son ordenadas en el mismo orden del análisis del vecino más cercano en la Figura 1A.

El clasificador de 154 genes exhibió una sensibilidad del 82%, identificando correctamente 24 de los 28 que respondieron verdad en el estudio El clasificador de genes también exhibió una especificidad del 75%, identificando correctamente 6 de los 8 que no respondieron verdad en el estudio. Sensibilidades, especificidades y precisiones generales similares fueron observadas con clasificadores de gen óptimo identificado por modelos de validación cruzada de 10 veces y dejando uno por fuera.

La investigación anterior evaluó patrones de expresión en muestras de sangre periférica muestras de pacientes con AML antes de la terapia e identifico firmas transcripcionales correlacionadas con la respuesta inicial a la terapia. El resultado de este estudio demuestra que las estrategias de perfilación de sangre periférica farmacogenómica permite la identificación de pacientes con altas probabilidades de resultados positivos o negativos en respuesta a la terapia de combinación GO.

Diapnóstico o monitoreo del desarrollo, propresión, o tratamiento del AML Los métodos descritos anteriormente, incluyendo la preparación de las muestras de sangre, el conjunto de clases de predictores de clase, y la construcción y comparación de los perfiles de expresión, puede ser adaptada fácilmente para el diagnóstico o monitoreo del desarrollo, progresión o tratamiento del AML. Este puede ser logrado mediante comparar el perfil de expresión de uno o más genes de la enfermedad AML en un sujeto de interés con por lo menos un perfil de expresión de referencia de los genes de la enfermedad AML. Los perfiles de expresión de de referencia pueden incluir un perfil de expresión promedio, o un conjunto de perfiles de expresión individuales cada uno de los cuales se presenta en la expresión del gen de sangre periférica de los genes de la enfermedad AML en un paciente con AML particular o en un humano libre de la enfermedad. La similaridad entre el perfil de expresión del sujeto de interés y los perfiles de expresión de referencia es indicativo de la presencia o ausencia o estado de la enfermedad de AML. En muchas modalidades, los genes de la enfermedad empleados para el diagnóstico de AML son seleccionados de la Tabla 7.

Uno o más genes de la enfermedad AML seleccionados de la Tabla 7 pueden ser usados para Diagnóstico de AML o el monitoreo de la enfermedad. En una modalidad, cada Gen de la enfermedad AML tiene valor p menor de 0.01 , 0.005, 0.001 , 0.0005, 0.0001 , o menor. En otra modalidad, los genes de la enfermedad AML comprenden por lo menos un gen que tiene una proporción "AML/Libre de Enfermedad" de no menos de 2 y por lo menos un gen que tiene una proporción "AML/Libre de Enfermedad" de no más de 0.5.

Los genes de la enfermedad de leucemia de la presente invención pueden ser usados solos, o en combinación con otros ensayos clínicos, para el diagnóstico de la leucemia o del monitoreo de la enfermedad. Los métodos convencionales para detectar o diagnosticas leucemia incluyen, pero no se limitan a, aspiración de médula de hueso, biopsia de médula de hueso, ensayo de sangre para niveles anormales de células blancas de sangre, plaquetas o hemoglobina, citogenéticas, tapa espinal, rayos X del pecho, o examen físico para detectar inchamiento de los nodos linfáticos., del vaso o del hígado. Cualquiera de estos métodos, lo mismo que cualquiera de otro método convencional o no convencional, pueden ser usados, en adición a los métodos de la presente invención, para mejorar la presición del diagnóstico de la leucemia.

La presente invención también caracteriza sistemas electrónicos útiles para el pronóstico, diagnóstico o selección del tratamiento de la AML o de otras leucemias. Estos sistemas incluyen un dispositivo de entrada o de comunicación para recibir el perfil de expresión de un paciente de interés o los perfiles de expresión de referencia. Los perfiles de expresión de referencia pueden ser almacenados en una base de datos u otro medio. La comparación entre los perfiles de expresión puede ser conducida electrónicamente, tal como mediante un procesador o una computadora. El procesador o computadora puede ejecutar uno o más programas que comparan los perfiles de expresión del paciente de interés con los perfiles de expresión de referencia. Los programas pueden ser almacenados en una memoria o bajarse de alguna otra fuente, tal como un servidor de Internet. En un ejemplo, los programas incluyen un algoritmo k de vecino más cercano o un algoritmo de pesado por votación. En otro ejemplo, el sistema electrónico está acoplado a un arreglo de ácido nucleico y puede recibir o procesar los datos de expresión generados por el arreglo de ácido nucleico.

Kits para el pronóstico, diapnóstico o selección del tratamiento de la leucemia En adición, la presente invención caracteriza kits útiles para el pronóstico, diagnóstico o selección del tratamiento del AML o de otras leucemias. Cada kit incluye o consiste esencialmente de por lo menos una probeta para u pronóstico de leucemia o un gen de la enfermedad (por ejemplo, un gen seleccionado de las Tablas 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9). Los reactivos o amortiguadores que facilitan el uso del kit también pueden estar incluidos. Cualquier tipo de probeta puede ser usada en la presente invención, tal como probetas de hibridización, cebadores de amplificación, o anticuerpos.

En una modalidad, un kit de la presente invención incluye o consiste esencialmente de por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más probetas o cebadores de polinucleótido. Cada probeta/cebador puede hibridizar bajo condiciones rigurosas o condiciones de hibridización de arreglos de ácido nucleico en diferentes pronósticos de leucemia o genes de la enfermedad. Como se usa aquí, un polinucleótido puede hibridizar a un gen si el polinuleótido puede hibridizar a un transcripto de ARN, o a su complemento, del gen. En otra modalidad, un kit de la presente invención incluye uno o más anticuerpo, cada uno de los cuales es capaz de ligarse a un polipéptido codificado por un pronóstico de leucemia respectivo diferente o un gen de la enfermedad.

En un ejemplo, un kit de la presente invención incluye o consiste esencialmente de probetas (por ejemplo probetas de amplificación PCR o de hibridización o anticuerpos) para por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 o más genes seleccionados de la Tabla 2a, y probetas de por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 o más genes seleccionados de la Tabla 2b. El número total de probetas para los genes seleccionados de la Tabla 2a pueden ser idénticos a, o diferentes de, a aquellos para los genes seleccionados de la Tabla 2b.

Las probetas empleadas en la presente invención pueden ser marcadas o no marcadas. Las probetas marcadas pueden detectables por medios espectroscópícos, fotoquímicos, bioquímicos, bioelectrónicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos, químicos, u otros medios adecuados. Partes marcadas ilustrativas para una probeta incluyen los radioisótopos, los compuestos quimioluminiscentes, las proteínas de ligado marcadas, los átomos de metal pesado, los marcadores espectroscópicos, tales como marcadores fluorescentes y tinturas, las etiquetas magnéticas, las enzimas ligadas, las etiquetas de espectrometría de masa, las etiqueta de giro, los donores y aceptores de transferencia de electrones, y similares.

Los kits de la presente invención también pueden tener contenedores que contienen amortiguadores o medios reporteros. En adición, los kits pueden incluir reactivos para conducir controles positivos o negativos, En una modalidad, las probetas empleadas en la presente invención están sujetadas establemente a uno o más soportes de sustrato. La hibridización de ácido nucleico o los inmunoensayos pueden ser llevados a acabo directamente sobre los soportes de sustrato. Soportes de sustrato adecuados para este propósito, incluyen, pero no se limitan a, soportes de vidrio, sílice, cerámica, nylon, galletas de cuarzo, geles, metales, papeles, perlas, tubos, fibras, películas, membranas, matrices de columna, o pozos de placas microtítulo, Los kits de la presente invención pueden también contener uno o más controles, cada uno representando un nivel de expresión de referencia de un pronóstico o de un gen de diagnóstico detectable por una o más probetas contenidas en los kits.

La presente invención también permite el tratamiento personalizado del AML o de otras leucemias. Numerosas opciones de tratamiento o regímenes pueden ser analizados de acuerdos con la presente invención para identificar genes de pronóstico para cada régimen de tratamiento. En los perfiles de expresión de sangre periférica de estos genes de pronóstico en un paciente de interés son indicativos del resultado clínico del paciente y, por lo tanto, pueden ser usados para la selección de los tratamientos que tengan pronósticos favorables para los pacientes. Como se uso aquí, un pronóstico "favorable" es un pronóstico que es mejor que los pronósticos de la mayoría de todos los otros tratamientos disponibles para el paciente de interés. El régimen de tratamiento con el mejor pronóstico tambie'm puede ser identificado.

La selección del tratamiento puede ser conducida manual o electrónicamente. Los perfiles de expresión de referencia o los clasificadores de genes pueden ser almacenados en una base de datos. Programas capaces de llevar a cabo los algoritmos tales como los algoritmos k de vecino más cercano o el de pesado por votación pueden ser usados para comparar los perfiles de expresión de sangre periférica de un paciente de interés con la base de datos para determinar que tratamiento debe ser usado para el paciente.

Debería entenderse que las modalidades descritas anteriormente y los siguientes ejemplos se dan como vía de ilustración, yt no de limitación. Diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la presente invención serán evidentes para aquellos versados en la técnica a partir de la presente descripción.

EJEMPLOS Eiemplo 1. Ensayo clínico y recolección de datos Diseño experimental Pacientes con AML (13 hembras y 23 machos) fueron exclusivamente de descendencia Caucasiana y tenían una edad promedio de 45 años (rango de 19 a-66 años). La inclusión de criterios para los pacientes de AML incluyeron células reticulares en exceso de 20% en la médula ósea, diagnóstico morfológico de AML de acuerdo con el sistema de clasificación FAB y el análisis de citometría de flujo que índica el estado positivo de CD33+. La participación en el ensayo clínico requirió diagnóstico patológico concordante de AML tanto desde el establecimiento por el patologista seguido de la evaluación histológica de los aspirados de la médula del hueso. Un resumen de las características citogenéticas de los pacientes se presenta en la Tabla 11.

Tabla 11. Caracteristicas citogenéticas de pacientes AML que consintieron con el PG contribuyendo las muestras de linea base en 0903B1-206-US.

Todos los pacientes recibieron el siguiente curso estándar de inducción de quimioterapia y fueron entonces evaluados a los 36 días. En los Días 1 a 7, los pacientes recibieron una infusión continua de citarabina en 100 mg/m2/día. La Daunorubicina se dio intravenosamente (bolos IV) en los Días 1 a 3 a razón de 45 mg/m2. En el Día 4, se administró gemtuzumab ozogamicina (6 mg/m2) durante aproximadamente 2 horas en una infusión IV.

Purificación v almacenamiento de los PBMC Todas las muestras de sangre periférica libre de enfermedad y con AML fueron enmarcadas durante la noche y procesadas ara la purificación por el gradiente Ficoll de los PBMC. Las cuentas de células en la sengra completa y los granulos de PBMC aislados fueron medidos por analizadores hematológicos y los PBMC aislados fueron almacenados a -80° C hasta que el ARN fuera extraído de esas muestras.

Extracción del ARN La extracción del ARN se llevó a cabo de acuerdo con un método mini kit RNeasy modificado (Qiagen, Valencia, CA, USA). Brevemente, los granulos de PBMC fueron digeridos en amortiguador de lisis RLT que contiene 0.1% de beta-mercaptoetanol y se proceso para el aislamiento total del ARN usando el mini kit RNeasy. Una extracción de fenol:cloroformo fue entonces llevad a acabo, y el ARN fue repurificado usando en los reactivos del moni kit RNeasy. El ARN eluído fue cuantificado usando un lector UV de placa de 96 pozos Spectramax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) monitoreando valores OD A260/280. La calidad de cada muestra de ARN fue determinada por electroforesis de gel.

Amplificación del ARN v peneración de las probetas de hibridización GeneChip Los objetivos marcados para los arreglos de oligonucleótidos fueron preparados de acuerdo con un método de laboratorio estándar. En breve, dos microgramos de ARN total fueron convertidos en cADN usando un cebador oligo-(dT)24 que contiene el promotor de polimerasa de ADN T7 en el extremo 5'. El cADN fue usado como la plantilla para la transcripción in vitro usando un kit de polimerasa de ADN T7 (Ambio, Woodlands, TX, USA) y CTP biotinilado y UTP (Enzo, Farmingdale, NY, USA). El cRNA marcado fue fragmentado en 40 mM de Tris-acetato pH 8.0, 100 mM de KOAc, 30 mM de MgOAc durante 35 min a 94° C en un volumen final de 40 mL. Diez microgramos del objetivo marcado fueron diluidos en un amortiguador 1X MES con 100 mg/mL de ADN de esperma herring y 50 mg/mL de BSA acetilado. Los transcriptos sintetizados in vitro de 11 genes bacterianos fueron incluidos en cada reacción de hibridización. La abundancia de estos transcriptos vario desde 1 :300000 (3 ppm) a 1 :1000 (1000 ppm) establecido en términos del número de transcriptos de control por el total de transcriptos. Las probetas marcadas fueron desnaturalizadas a 99° C durante 5 min y luego 45° C durante 5 min y se hibridizaron a arreglos de oligonucleótidos HG_U133A que comprendía por encima de 22000 genes humanos (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) de acuerdo con la Guía de Usuario del Paquete de Análisis GeneChip de Affymetrix (Affymetrix). Los arreglos fueron hibridizados durante 16h a 45° C con rotación a 60 rpm. Después de la hibridización, las mezclas de hibridización fueron removidas y almacenadas, y las arreglos fueron lavados y manchados con streptavidina R-ficoeritrina (Probetas Moleculares) usando la Estación Fluídíca 400 de GeneChip (Affymetrix) y escaneados con un Escáner GeneArray HP (Hewlett Packard, Palo Alto, CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Estas condiciones de hibridización y lavado se refieren colectivamente como "condiciones de hibridización de arreglo de ácido nucleico".

Generación de las señales Affymetrix Las imágenes del arreglo fueron procesadas usando el Paquete MicroArray Affymetrix (MAS5) que es un software tal que los datos de imágenes del arreglo en bruto (.dat) eran archivos producidos por el escáner del arreglo que fueron reducidos para probar los resúmenes de intensidades de nivel característico (archivos .cel) usando una versión de mesa del MAS5. Usando el Gene Expression Data System (GEDS) como una interfase de usuario gráfica, los usuarios suministraron una descripción de la muestra al Expression Profiling Information y al Knowledge System (EPIKS) de la base de datos Oracle y se asociaron con los archivos correctos .cel con la descripción. Los procesos de la base de datos invocaron el software MAS5 para crear el resumen probeset; las intensidades de la probeta fueron resumidas para cada secuencia usando el algoritmo de Señal Affymetrix Affy y la métrica de Detección Affymetrix Absoluta (Ausente, Presente, o Marginal) para cada conjunto probeta. El MAS5 fue también usado para el primer pase de normalización mediante medir la media arreglada a un valor de 100. Los valores de "diferencia promedio" para cada transcripto fueron normalizados a los valores de "frecuencia" usando el método de normalización de frecuencia medida (Hill, ef al., Genome Biol., 2(12):research0055.1-0055.13 (2001 )) en el cual las diferencias promedio para 11 control cARN de control con picos de abundancia conocidos en cada solución de hibridización fueron usados para generar una curva de calibración global. Esta calibración fue entonces usada para convertir los valores diferencia promedio para todos los transcriptos a estimados de frecuencia, establecidos en unidades de partes por millón que varían entre 1 :300,000 (3 partes por millón (ppm)) a 1 :1000 (1000 ppm) Los procesos de las bases de datos también calcularon una serie de métricas de control de calidad del chip y se almacenaron en los datos en bruto y los cálculos de control de calidad en la base de datos. Solamente las muestras hibridizadas que pasan el criterio QC fueron incluidas en el análisis.

Eiemplo 2. Transcriptos asociados con la enfermedad en los PBMC del AML Los perfiles transcripcionales derivados del U133A de las 36 muestras de PBMC del AML fueron co-normalizadas usando un método de normalización de frecuencia medida con 20 PBMC de MDS y 45 PBMC de voluntarios saludables. Un total 7879 transcriptos fueron detectados en uno o más perfiles con una frecuencia máxima mayor que o igual 10 ppm (marcada como 1 P, 1 > 10 ppm) a través de los perfiles.

Para identificar los transcriptos asociados con AML, las veces de diferencias promedio entre los PBMC con AML y los normales fueron calculados mediante dividir el nivel medio de expresión en los perfiles AML por el nivel medio de expresión en perfiles normales. Un ensayo t de Student (variancia desigual, de dos muestras) fue usado para determinar la significancia de la diferencia en la expresión entre los grupos.

Para la agrupación jerárquica no supervisada, los 7879 transcriptos que cumplieron con el filtro de expresión 1 P, 1 > 10 ppm fueron usados. Los datos fuerojn transformados por logaritmo y los valores de expresión de genes fueron centrados por mediana, y los perfiles fueron agrupados usando un modelo de agrupación por enlace promedio con una métrica de similaridad de correlación no centrada.

El análisis no supervisado que usa agrupación jerárquica demostró que los PMRC de AML, MDS y de individuos normalmente saludables agrupados en dos grupos principales, con el primer subgrupo compuesto exclusivamente de PBMC normales y el segundo subgrupo compuesto de AML, MDS y PBMC normales (Figura 2). El segundo subgrupo se rompió adicionalmente en dos subgrupos distinguibles compuestos de un grupo similar a AML poblado principalmente con perfiles PBMC de AML, un grupo similar a MDS poblado principalmente con perfiles de PBMC de MDS.

Los transcriptos asociados con AML en la sangre periférica fueron identificados mediante comparar los niveles medios de expresión en los PBMC de los grupos de voluntarios saludables (n=45) con los niveles medios de expresión en los PBMC de los pacientes con AML (n=36). Los números de transcriptos que exhiben por lo menos una diferencia promedio de dos veces entre los PBMC normales y los de AML en niveles incrementados de significancia se presentan en la Tabla 12. Un total de 660 transcriptos procesados por lo menos un promedio de 2 veces la diferencia entre los perfiles de PBMC con AML y los perfiles PBMC normales y una significancia en un ensayo t Student no emparejado menor de 0.001. Estos transcriptos son presentados en la Tabla 7, anterior. De estos, 382 transcriptos exhibieron un nivel elevado medio de expresión de 2 veces o más en AML y los 50 genes con las mayores veces de elevación se presentan en la Tabla 8. Un total de 278 transcriptos exhibieron un nivel reducido medio de expresión 2 veces o menor en AML y los 50 genes con mayor veces de reducción en AML se presentan en la Tabla 9.

Tabla 12. Números de genes cambiados dos veces entre PBMC de AML y libre de enfermedad que cumplen con niveles incrementados de significancia Número de trascriptos con un promedio de cambios de dos veces en los PBMC de Nivel de significancia AML En estos estudios un total de 382 trascriptos poseían niveles significativamente más altos de expresión en los PBMC de AML. Los niveles elevados de expresión pueden ser debidos a 1 ) activación trascripciónal incrementada en los PBMC circulantes o 2) niveles elevados de ciertos subtipos de células en los PBMC circulantes. Muchos de los trascriptos que son elevados en los PBMC de AML en este estudio parecen ser contribuidos por las células reticulares leucémicas presentes en la circulación periférica de estos pacientes. Muchos de los trascriptos se conocen como expresados específicamente y/o ligados procesos de enfermedad en células reticulares leucémicas o inmaduras (mieloperoxidasa, v-myb mieloblastosis proto-oncogen, v-kit proto-oncogen, msm relacionado con tirosina quinasa 3, CD34). En adición, muchos de los trascriptos con el nivel más alto de expresión en los PBMC de AML son indetectables o niveles extremadamente bajos en poblaciones purificadas de monocitos, células B, células T, y neutrofilo (datos no mostrados) y se clasificaron como expresores bajos en un estudio observacional de voluntarios saludables. Así la mayoría de trascriptos observados presentes en cantidades más altas en PMRC de AML no parecen ser principalmente debido a activación trascripciónal si no en su lugar debido a la presencia de células • reticulares leucémicas en la circulación de los pacientes con AML.

De otro lado, los trascriptos asociados con la enfermedad en niveles significativamente más bajos en los PBMC de AML parecen ser trascriptos que exhiben altos niveles de expresión en uno o más de tipos normales de células típicamente aisladas por tubos de purificación de células (monocitos, células B, células T, y neutrófilos de copurificación). Por ejemplo, 8 de los primeros 10 trascriptos en los niveles inferiores en los PBMC de AML poseen niveles promedio de expresión en sus tipos de células purificados respectivamente mayor a 50 ppm; y se clasificaron como expresores altos en un estudio observaciónal de voluntarios saludables. Así la mayoría de trascriptos observados como presentes en cantidades inferiores en los PBMC de AML no parecen ser principalmente debido a represión trascripciónal sino en su lugar debido a una presencia disminuida de células mononucleares normales en la circulación rica en células reticulares de pacientes con AML.

Eiemplo 3: Efectos transcripción ales de la terapia Un total de 27 pacientes con AML suministraron la línea base evaluable y muestras de PBMC post tratamiento en el día 36. Los perfiles transcripción ales derivados del U133A de las 27 muestras emparejadas de PBMC con AML se conormalizaron usando el método de normalización de frecuencia medida. Un total de 8809 trascriptos se detectaron en uno o más perfiles con una frecuencia máxima mayor que o igual a 10 ppm (denotada como 1 P >10 ppm) a través de los perfiles.

Para identificar los trascriptos alterados durante el curso de la terapia, las veces de diferencias promedio entre el día 0 y el día 36 en los perfiles de PBMC se calcularon mediante dividir el nivel medio de expresión en la línea base en el día 0 de los perfiles por el nivel medio de expresión en los perfiles post tratamiento en el día 36. Un ensayo T de Student (varianza desigual, dos muestras) se usó para determinar la significancia de la diferencia en la expresión entre los grupos.

Los trascriptos asociados con la terapia basada en GO en sangre periférica se identificaron por medio de comparar los niveles medios de expresión en los PBMC de las muestras de línea base (n=27) con los niveles medios de expresión en los PBMC de las muestras post tratamiento emparejadas (n=27) de los niveles de expresión en los PBMC de las muestras post tratamiento emparejadas (n=27) de los mismos pacientes AML. Los números de trascriptos que exhiben por lo menos una diferencia promedio de dos veces entre los PBMC de línea base y los de post tratamiento con niveles incrementados de significancia se presentan en la tabla 13. Un total de 607 trascriptos poseyeron por lo menos un promedio de diferencia de dos veces entre las muestras de línea base y las de post tratamiento, y la significancia en el ensayo T Student emparejado de menos de 0,001. De estos, 348 trascriptos exhibieron un nivel de expresión medio reducido de dos veces o mayor sobre el curso de la terapia y los 50 genes con las veces de reducción más grande luego de la terapia GO se presentan en la tabla 14. Un total de 259 trascriptos exhibieron un nivele elevado medio de expresión dos veces o mayor sobre el curso de la terapia y los 50 genes con las veces de elevación mayor luego de la terapia GO se presentan en la tabla 15. Los genes más fuertemente alterados sobre el curso de la terapia (inducción o represión media de tres veces o más) se anotaron con respecto a sus funciones celulares de acuerdo con sus anotaciones de ontología de genes y el porcentaje de trascriptos en cada categoría se presentan en la Figura 3.

Tabla 13. Número de genes cambiados dos veces entre el día 0 (línea de base) y el día 36 (visita final) que cumplían niveles increméntales de significancia Tabla 14. Primeros 50 trascriptos represados significativamente (p < 0.001) en los PBMC de AML luego de 36 días de régimen de terapia Tabla 15. Primeros 50 trascriptos significativamente elevados (p < 0.001) en los PBMC de AML luego de 36 días de régimen de terapia Comparación de perfiles de Pre y post tratamiento de pacientes con AML reveló un gran número de diferencias en los niveles de trascripto sobre el curso de la terapia. La anotación de los genes aparentemente represados durante el curso de la terapia usando la anotación de Gen Ontology (ver La figura 3) demostró que muchos de los trascritos con niveles inferiores luego de la terapia cayeron en una categoría no caracterizada Una evaluación adicional reveló que la basta mayoría de estos trascriptos que estaban asociados con la enfermedad y estaban presentes en cantidades bajas e muestras post tratamiento debido a la desaparición de las células reticulares leucémicas en estos pacientes luego de la terapia. Consistente con esta observación, 45 de los primeros 50 trascriptos regulados hacia abajo luego del régimen de GO eran genes asociados con la enfermedad (células reticulares). Así la regulación hacia debajo de los v-kit, triptasa, aldo-ceto reductasa 1C3, horneo caja A9, meisi , mieloperoxidasa, y la mayoría de otros trascriptos exhiben la mayor reducción en veces aparentemente debido a la desaparición de las células reticulares leucémicas en la circulación, en vez de efectos transcripción ales directos del régimen de quimioterapia.

La evaluación de los trascriptos en el PBMC en niveles mayores luego de la terapia revelo la tendencia opuesta y mostró que la basta mayoría de estos trascriptos estaban asociados con la expresión en PBMC normal y que estaban presentes en cantidades más altas en muestras post tratamiento debido a la reaparición de células mononucleares normales en la mayoría de los pacientes tratados. Un total de 31 de los primeros 50 trascriptos que regularon hacia arriba luego del régimen GO fueron trascriptos asociados con la expresión de células mononucleares normales. Así, la regulación hacia arriba de la proteína inducida por TGF-beta (68 kDa), la trombomodulina, el Gen cambiante en G0/G1 de linfocito putativo, y la mayoría de los otros trascriptos similarmente eran debido a la desaparición de las células reticulares leucémicas y la remoción de células normales en la circulación en vez de efectos transcripción ales directos del régimen de quimioterapia.

Para un número de genes más pequeño, la activación o represión transcripción al puede ser la causa para las diferencias en los niveles de trascripto. Por ejemplo, el citocromo P4501A1 (CYP1A1) es inducido luego de la terapia pero no está asociado significativamente con expresión de células mononucleares normales (es decir, el CYP?A1 no fue significativamente represado en los PBMC de AML en comparación con los PBMC normales). El CYP1A1 está involucrado en el metabolismo de la daunorubicina, y la daunorubicina es un inactivador con base en mecanismo de la actividad del CYP1A1. Así la elevación del mARN del CYP1A1 puede representar una respuesta transcripción al de realimentación al régimen terapéutico presente. Las proteínas inducibles por interferón también se elevaron durante el curso de la terapia (la proteína 30 inducible por interferón, la proteína 2 de transmembrana inducida por interferón), y estos efectos pueden también representar inducciones transcripción ales de los trayectos de señalización dependiente del interferón activados durante el curso de la terapia.

Sea debido a la desaparición de las células reticulares, las elevaciones en la cuenta de células normales o la activación o represión transcripción al real, las alteraciones en diversos trascriptos del PBMC pueden tener consecuencias funcionales en la progresión del AML. La detención del ciclo de las células inducidas por TGF-beta y la proliferación de células leucémicas inducidas por FLT3 antagonistas, y una proteína inducida por TGF-beta fue el trascripto regulado hacia arriba más fuertemente (mayor a siete veces de elevación en los PBMC durante el curso de la terapia).

Eiemplo 4: Patrones de expresión pretratamiento asociados con la enfermedad veno-oclusiva Los perfiles transcripción ales derivados de U133A de las 36 muestras de PBMC de AML fueron conormalizadas usando el método de normalización de frecuencia medida. Un total de 7405 trascriptos se detectaron en uno o más perfiles con una frecuencia máxima mayor que o igual a 10 ppm (denotada como 1 p, 1 > 10 ppm) a través de los perfiles.

La enfermedad veno-oclusiva (VOD) es una de las más serias complicaciones luego del trasplante de células no diferenciadas ematopoyéticas y está asociada con una muya alta mortalidad en su forma severa. Para identificar los trascriptos con diferencias significativas en su expresión en la línea base entre los 4 pacientes que eventualmente experimentaron VOD y los 32 pacientes que no tenían VOD, las veces de diferencia promedio entre los perfiles de pacientes con VOD y los que no tenía VOS se calculó mediante dividir en nivel medio de expresión en los 4 perfiles de línea base VOD por el nivel medio de expresión en los 32 perfiles de línea base no VOD. Un test T de Student (varianza desigual, dos muestras) se usó para determinar la significancia de la diferencia en la expresión entre los grupos.

Los trascriptos en los PBMC de línea base asociados significativamente con el establecimiento del VOD se identificaron mediante comparar los niveles medios de expresión en los PMBC de las muestras de línea base VOD (n=4) con los niveles medios de expresión en los PBMC de las muestras de línea base no VOD (n=32). Los números de trascriptos que exhibieron por lo menos una diferencia de dos veces promedio entre los PBMC de línea base VOD y los no VOD con niveles incrementados de significancia se presentan en la tabla 16. Un total 161 trascriptos poseyeron por lo menos una diferencia en promedio de dos veces entre las muestras de línea base VOD y las no VOD, y la significancia en un test T de Student apareado de menos de 0,05. De los 161 trascriptos, solamente tres trascritos exhibieron un nivel medio elevado de expresión de dos veces o mayor en los PBMC VOD en la linea base. Estos y 47 otros trascriptos mostraron menos de dos veces pero exhibieron mayores veces de elevación en los pacientes VOD en la línea base y se presentan en la tabla 5. Los niveles del ligando p-selectina, un trascripto relevante biológicamente potencialmente que parece ser significativamente elevado en los PBMC de pacientes que eventualmente experimentaron el VOD, se presenta en la Figura 4.

Tabla 16. Números de genes cambiados dos veces entre las muestras de Bónea base de pacientes con VOD (n=4) y pacientes sin VOD (n=32) que cumplen niveles increméntales de significancia El resto de los 158 trascriptos exhibieron un nivel medio reducido de expresión dos veces o mayor en los PBMC con VOD en la línea base, y los 50 genes con las veces de reducción más grande en los PBMC de pacientes con VOD en la línea base se presentan en la tabla 6. La evaluación de este conjunto de este conjunto de trascriptos reveló una mayoría de marcadores asociados con células reticulares leucémicas. Este hallazgo no anticipado por el análisis de micro arreglo realmente sugiere que los pacientes con cuentas de células reticulares periféricas más bajas pueden ser más susceptibles al VOD en el contexto de la terapia con base en GO.

Eiemplo 5: Patrones transcripción ales de pretratamiento asociados con la respuesta clínica Como en el ejemplo precedente, 7405 trascriptos detectados con una frecuencia máxima mayor que o igual a 10 ppm en uno o más perfiles se seleccionaron para evaluación adicional.

Para identificar los trascriptos con diferencias significantes en la expresión en la línea base entre los 8 pacientes que no respondieron (NR) y los 28 pacientes que respondieron (R), las veces promedio de diferencias entre perfiles de pacientes NR y pacientes R se calculó mediante dividir el nivel medio de expresión en los 8 perfiles NR de línea base por el nivel medio de expresión en los 28 perfiles R de línea base. Un ensayo T de Student (varianza desigual, dos muestras) se usó para determinar la significancia de la diferencia en la expresión entre los grupos. Los números de trascriptos que exhibieron por lo menos una diferencia promedio de dos veces entre los PBMC de línea base R y NR con niveles incrementados de significancia se presentan en la tabla 17. Un total de 113 trascriptos poseyeron por lo menos una diferencia promedio de dos veces entre las muestras de línea base R y NR, y la significancia en un estudio T de Student emparejado de menos de 0,05. De los 113 trascriptos, 6 trascriptos exhibieron un nivel medio elevado de expresión dos veces o mayor en PBMC de los que no respondieron en la linea base. Estos y 48 otros transcriptos mostraron menos de dos veces pero exhibieron las veces de elevación más gran de en pacientes que respondieron en la línea base y se presentan en la tabla 3. Un total de 107 trascriptos exhibieron un nivel reducido medio de expresión dos veces o mayor en PBMC de los que no respondieron en la línea base, y los 50 genes con las veces de reducción más grande se presentaron en la tabla 4.

Tabla 17. Números de genes cambiados dos veces entre muestras de línea base de pacientes que no respondieron (n=8) y pacientes que respondieron (n=28) que cumplen niveles increméntales de significancia Los niveles de pretratamiento de los trascriptos codificados por genes con papeles potenciales en el metabolismo o el mecanismo de acción de GO fueron interrogados específicamente también. Los niveles del transportador de flujo de la droga MDR1 fueron bajos en todas las muestras PBMC y no fueron significativamente distintos entre los que respondieron y los que no respondieron en la línea base (Figura 5). El resto de miembros de la familia transportadora ABC contenidos en el chip gen Affymetrix 133A Fueron también interrogados en el evento de que otro transportador ABC pudiera ser expresado diferencialmente, pero ninguno de los transportadores ABC fueron distintos significativamente entre los PBMC de los que respondieron y los que no respondieron en la línea base (Figura 6). Los niveles de trascriptos que codifican el receptor de Súper ficie celular CD33 se detectaron en niveles generalmente mayores en los PBMC de AMI, pero similar al MDR1 , el trascripto CD33 tampoco fue distinto significativamente entre los PBMC R y NR en la línea base (Figura 7).

Para identificar un clasificador de gen capaz de clasificar los que responden y los que no responden sobre la base de patrones de expresión de genes de línea base, la selección de genes y la predicción de clase Súper visada se llevó a cabo usando la versión Genecluster 2.0 previamente descrita y disponible en (http://www.qenome.wi.mit.edu/cancer/software/qenecluster2.html). Para el análisis del vecino más cercano, los perfiles de expresión para 36 PBMC de AMI de línea base fueron normalizados usando el método de frecuencia medida con 14 PBMC de AML de línea base de un ensayo clínico independiente de GO en combinación con daunorubicina. Todos los datos de expresión fueron normalizados con calificaciones Z antes del análisis. Un total de 11382 secuencias se usaron en este análisis, con base en la inclusión de todos los trascriptos con frecuencias que poseían por lo menos un valor mayor que o igual a 5 ppm a través de los perfiles de línea base. Los 36 perfiles de línea base del PBMC desde donde fueron tratados como un conjunto de entrenamiento, y los modelos que contienen números increméntales de rasgos (secuencias de trascriptos) fueron construidos usando 1 vs. Todo modelo con una métrica de similaridad S2N que usó valores medianos para el estimado de la clase. Todas las comparaciones fueron distinciones binarias, y cada modelo (con números increméntales de rasgo) fueron evaluados en los 36 perfiles de PBMC por validación cruzada 10 veces. El modelo predictivo óptimamente que surge de la validación cruzada 10 veces de los 36 perfiles de PBMC fue entonces aplicad a los 14 perfiles conormalizados del otro ensayo clínico para evaluar la precisión de los clasificadores de genes en un conjunto independiente de muestras clínicas tomadas de los pacientes con AML antes de la terapia.

Un clasificador de 10 genes se encontró que producía la precisión de la predicción general más alta (78%) mediante la validación cruzada 10 veces sobre los perfiles con AML de sangre periférica en el presente estudio (Figura 8 y tabla 18). Este clasificador de gen exhibió una sensibilidad de 86%, una especificidad de 50%, un valor predictivo positivo de 86% y un valor predictivo negativo de 50%. Este clasificador también se aplicó a los 14 perfiles no probados del estudio independiente en el cual el GO más la daunorubicina compuso el régimen de terapia; los resultados se presentan en la Figura 9. Para aquellos 14 perfiles, el clasificador de 10 genes demostró una precisión de predicción general del 78%, una sensibilidad del 100%, una especificidad de 57%, un valor predictivo positivo de 70% y un valor predictivo negativo del 100%.

Tabla 18. Transcriptos en el clasificador de 10 genes asociado con niveles de PBMC elevados en los que responden (panel Súper ior) o los que no responden (panel inferior) antes de la terapia.

Algunos codiagnósticos farmacogenómicos desarrollados en el futuro seguramente descansarán en los ensayos con base qRT-PCR que pueden utilizar combinaciones pequeñas (pares inteligentes o mayores) de genes que permiten clasificación precisa. Para identificar un clasificador más pequeño en los niveles de expresión con base en Affymetrix de dos genes (Tabla 19), metalotioneina 1X/1 L y quinasa regulada por suero glucocorticoide, que se sobre expresaron en los PBMC de AML de los que no respondieron y los que respondieron respectivamente, se graficaron para determinar si una combinación par-inteligentes de trascriptos podría permitir la clasificación (Figura 10, panel A). Los clasificadores de dos genes emplean metalotioneina 1X/1 L y quinasa regulada por suero glucocorticoide preseleccionados sobre la base de sus 1 ) veces de diferenta represada o significativamente elevada entre las categorías que responden y las que no responden, respectivamente; y 2) anotación conocida. Los valores de expresión individual (en términos de ppm) de cada trascripto en cada muestra de AML de línea base se graficaron para identificar los cortes para la expresión que dio la sensibilidad más alta y la especificidad má alta para la asignación de clase. De los 36 pacientes originales 6 de 8 no respondedores tenían niveles de quinasa regulada por suero glucocorticoide menor a 30 ppm y niveles de metalotíoneina 1X 1 L mayor a 30 ppm. Solamente dos de los 28 que respondieron poseyeron niveles similares de expresión de genes. Para estas 36 muestras, el clasificador de dos genes por lo tanto exhibió una precisión general aparente de 88%, una sensibilidad de 93%, una especificidad de 75%, un valor predictivo positivo de 93%, y un valor predictivo negativo de 75%.

Tabla 19. Transcriptos en el clasificador de dos genes asociados con niveles elevados en los que responden (quinasa regulada por suero/glucocortico?de) o los que no responden (metalotioneina 1 L, 1X) antes de la terapia Este clasificador de dos genes (quinasa regulada por suero glucocorticoide menor a 30 ppm, metalotioneina 1X, 1 L mayor a 30 ppm) también se aplicó a los 14 perfiles no probados del ensayo clínico más el GO y la daunorubicina comuelo el régimen de terapia (Figura 10, panel B). En este estudio, el clasificador de dos genes demostró un desempeño general idéntico que el clasificador de 10 genes, con una precisión de predicción general de 78%, una sensibilidad de 100%, una especificidad de 57%, un valor predictivo positivo de 70% y un valor predictivo negativo del 100%.

Las características de desempeño aparente de ambos clasificadores de 10 genes y de dos genes para el primer conjunto de datos de 36 muestras y las características de desempeño real de ambos clasificadores en la evaluación de las 14 muestras independientes se dan en la tabla 20.

Tabla 20. Características de desempeño de los clasificadores de 2 genes y 10 genes mediante validación cruzada y un conjunto de ensayo Validación cruzada Clasificador de 2 Clasificador de 10 genes genes Precisión 78% 88% Sensibilidad 86% 93% Especificidad 50% 75% Valor predictivo Positivo 86% 93% Valor predictivo negativo 50% 75% Conjunto de ensayo Clasificador de 2 Clasificador de 10 genes genes Precisión 78% 78% Sensibilidad 100% 100% Especificidad 57% 57% Valor predictivo Positivo 70% 70% Valor predictivo negativo 100% 100% En este análisis el perfilado trascripciónal se aplicó a las muestras de sangre periférica de línea base para caracterizar los patrones transcripción ales que pudieran suministrar detalles en, o biomarcadores para, la habilidades de los pacientes con AML para responder o fallar en responder a un régimen de quimioterapia de combinación con GO. El porcentaje más grande de pacientes en este estudio poseyó un cariotipo normal (33%), mientras que otras anormalidades cromosomales se distribuyeron relativamente uniformemente entre los pacientes restantes. Esta heterogeneidad de antecedentes cítogenéticos nos permitió analizar el grupo entero de perfiles AML sin segregarlos en grupos con base en el cariotipo, que a su vez nos permitió buscar patrones transcripción ales que se puedan correlaciona r con la respuesta al régimen de combinación con GO sin importar las anormalidades moleculares involucradas en esta enfermedad compleja. A pesar de la descripción reciente de las firmas de expresión asociadas con las varias anormalidades cromosomales en AML, es claro que la expresión de muchos de los trascriptos individuales en las firmas hallmark no son únicas a cariotípos específicos. En adición, Bullinger el al. (2004) N. Engl. J. Med. 350:1605-16, demostró de manera importante en su estudio reciente que los patrones transcripción ales homogéneos relativamente correlacionados con la Súper vivencia general fueron detectables en muestras de AML de pacientes a pesar de sus diversos antecedentes citogenéticos, y estos perfiles de pronóstico segregaron muestras de un conjunto de ensayos de pacientes en categorías de resultado bueno y pobre que poseyeron diferencias significativas en la Súper vivencia general Un objetivo del presente Studio no fue necesariamente identificar perfiles generalmente de pronóstico asociados con Súper vivencia general, si no en vez de eso identificar un patrón transcripción al en la sangre periférica que, si es validado, podría permitir la identificación de pacientes que pudieran o no beneficiarse (es decir remisión inicial lograda) de un régimen de quimioterapia de combinación con GO. La comparación de los que perfiles de los que responden (es decir remisión) y los que no responden en la línea base identificó un número de trascriptos significativamente alterados entre los grupos.

Los trascriptos presentes en niveles más altos en pacientes que responden antes de la terapia incluyen el locus alfa de receptor de célula T, la quinasa regulada por suero/glucocorticoide, acuaporina 9, caja 03 cabeza de tenedor, IL8, TOSO (regulador de apoptosis inducida por fas), antagonista receptor del IL1 , p21/cip1 , un subconjunto específico de trascriptos inducibles por IFN, otras moléculas regulatorias. La lista de trascriptos elevados en la sangre periférica de los que responden parece contener marcadores tanto de células de sangre periférica normal (linfocitos, monocitos y neutrófilos) y transcriptos específicos de células reticulares similares. Un porcentaje mayor de moléculas relaciona das con pro apoptótico se elevaron en la sangre periférica de pacientes quienes al final respondieron a la terapia. El FOX03 es una molécula proapoptótica crítica que es inactivada durante la Súper vivencia de la célula T mediada por IL2 y recientemente ha mostrado que se inactiva durante la estimulación de la proliferación dependiente de PI3 quinasa inducida por FLT3 en células mieloídes. El hallazgo de que el FOX03 se eleva en la sangre periférica de pacientes con AML que al final respondieron a la terapia de combinación GO soporta la teoría de que las células (cebadas) apoptóticamente serán más sensibles a los regímenes de terapia con base en CO y posiblemente otras quimioterapias también. Los niveles FOX01A fueron positivamente correlacionados con la Súper vivencia en pacientes con AML que recibieron dos regímenes diferentes.

Un número de trascriptos se elevaron también en muestras de sangre de pacientes con AML quienes fallaron en responder a la terapia. Una comparación se hizo entre los transcriptos asociados con la falla a responder al régimen de combinación GO actual y los transcriptos reportados recientemente como predictivos de un resultado pobre con respecto a la Súper vivencia general. La elevación en los niveles de horneo caja B6 en muestras de sangre periférica de los que no responden en este estudio fue consistente con la sobre expresión de los genes horneo caja múltiples en pacientes con pobres resultados relacionados con Súper vivencia. El horneo caja B6 se eleva durante granuloCitopoyesis y monoCitopoyesis, normal, pero normalmente se apaga luego de la maduración celular. El horneo caja B6 se encontró que es desregulado en un porcentaje sustancial de muestras AML y se ha propuesto que juega un papel en la leuquemogenesis.

El presente análisis también identificó varias familias de trascriptos donde la sobre expresión parece estar correlaciona da con la falla a responder al régimen de combinación GO y no parece estar correlacionado a la Súper vivencia general. Varias isoformas de metalotioneina se elevaron en las muestras de sangre periférica de pacientes que fallaron en responder al régimen de combinación GO. Basado en el mecanismo de acción del GO, las defensas antioxidantes elevadas se esperarían que impacten adversamente la eficacia del conjugado citotóxico dirigido a la calicheamicina. Estos hallazgos sin embargo contrastan con aquellos reportados por Goasguen el al. (1996) Leuk. Lvmphoma. 23(5-):567-76, quien identificó la sobre expresión de metalotioneina como asociada fuertemente con la remisión completa en el contexto de la ausencia o presencia de otros fenotipos resistentes a las drogas en pacientes con leucemia. La sobre expresión de la isoforma de metalotioneina se ha caracterizado recientemente como hallmark de la traslocación cromosomal t(15;17) en AML pero ninguno de los pacientes en el presente estudio estuvo caracterizado como que poseyera esta anormalidad citogenética. Sin embargo, en ese estudio la sobre expresión de la isoforma de metalotioneina no fue específica a la traslocación t(15;17), que ocurrió en diversos otros cariotipos también.

La anterior descripción de la presente invención suministra ilustración y descripción, pero no tiene el propósito de ser exhaustiva o limitar la invención a lo precisamente descrito. Modificaciones y variaciones son posibles consistentes con las anteriores enseñanzas o se pueden adquirir de la práctica de la invención. Así, se debe notar que el alcance de la invención está definido por las reivindicaciones y sus equivalentes.

Claims (62)

1. REIVINDICACIONES Un método para predecir un resultado clínico en respuesta a un tratamiento de una leucemia, el método comprende las etapas de: (1 ) Medir los niveles de expresión de uno o más genes de pronóstico de la leucemia en una muestra de célula mononuclear de sangre periférica derivada de un paciente antes del tratamiento; y (2) Comparar cada uno de los niveles de expresión con un nivel de control correspondiente, en donde el resultado de la comparación es predictivo de un resultado clínico. El método de la reivindicación 1 , en donde uno o más genes de pronóstico comprende al menos un primer gen seleccionado de un primera clase y un segundo gen seleccionado de un segunda clase, en donde la primera clase comprende genes que tienen niveles de expresión más altos en células mononucleares de sangre periférica en pacientes que predijeron tener un resultado clínico menos deseable en respuesta a el tratamiento y la segunda clase comprende genes que tienen niveles de expresión más altos en células mononucleares de sangre periférica en pacientes que predijeron tener un resultado clínico más deseable en respuesta a el tratamiento. El método de la reivindicación 2, en donde primer gen es seleccionado de la Tabla 3 y el segundo gen es seleccionado de la Tabla 4. El método de la reivindicación 2, en donde el primer gen es seleccionado del grupo que consiste de proteína de dedo zinc 217, transportador de péptido 3, caja cabeza de tenedor O3A, Locus alfa de receptor de célula T y proteína que liga a receptor de quimiosina putativo /GTP, y el segunda gen es seleccionado del grupo que consiste de metalotioneina, desaturasa 1 de ácido graso, gen no caracterizado correspondiente a Affymetrix ID 216336, Factor auto regulatorio epidérmico deformado 1 y detención de crecimiento y Daño inducible por ADN alfa. El método de la reivindicación 2, en donde el primer gen es quinasa regulada por suero glucocorticoide y el segundo gen es metalotioneina 1X/1 L El método de la reivindicación 1 , en donde el resultado clínico es el desarrollo de un evento adverso El método de la reivindicación 6, en donde el evento adverso es la enfermedad veno-oclusiva El método de la reivindicación 7, en donde uno o más genes de pronóstico comprende uno o mas genes seleccionados de la Tabla 5 o la Tabla 6 El método de la reivindicación 8, en donde uno o más genes de pronóstico comprende el ligando p-selectina El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el tratamiento comprende una terapia de combinación con gemtuzumab ozogamicina (GO) El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el nivel de control correspondiente es un umbral numérico Un método para predecir un resultado clínico de una leucemia, el método comprende las etapas de (1 ) Generar un perfil de expresión de gen de una muestra de sangre periférica de un paciente que tienen la leucemia, y (2) Comparar el perfil de expresión de genes con uno o más perfiles de expresión de referencia, En donde el perfil de expresión de genes y el uno o más perfiles de expresión de referencia comprenden patrones de expresión de uno o mas genes de pronóstico de la leucemia en células mononucleares de sangre periférica, y en donde la diferencia o similaridad entre el perfil de expresión de genes y el uno o más perfiles de expresión de referencia es indicativo del resultado clínico para el paciente. 13. El método de la reivindicación 12, en donde la leucemia es leucemia aguda, leucemia crónica, leucemia linfocítica o leucemia no linfocítica. 14. El método de la reivindicación 13, en donde la leucemia es leucemia aguda mieloide (AML). 15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en donde el resultado clínico es medido por una respuesta a una terapia anticáncer. 16. El método de la reivindicación 15, en donde la terapia anticáncer comprende administrar uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de un anticuerpo anti-CD33, una daunorubicina, una citarabina, un gemtuzumab ozogamicina, una antraciclina, y un análogo de nucleótido de pirimidina o purina. 17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12-16, en donde uno o más genes de pronóstico comprende uno o más genes seleccionados de la Tabla 3 o la Tabla 4. 18. El método de la reivindicación 17, en donde uno o más genes de pronóstico comprenden 10 o más genes seleccionados de Tabla la 3 o la Tabla 4. 19. El método de la reivindicación 18, en donde uno o más genes de pronóstico comprende 20 o más genes seleccionados de la Tabla 3 o la Tabla 4. 20. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12-19, en donde la etapa (2) comprende comparar el perfil de expresión de genes con uno o más perfiles de expresión de referencia mediante un análisis k de vecino más cercano o un algoritmo pesado por votación. 21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12-19, en donde uno o más perfiles de expresión de referencia representa resultados clínicos conocidos o determinables. 22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12-19, en donde la etapa (2) comprende comparar el perfil de expresión de genes con al menos dos perfiles de expresión de referencia, cada uno de los cuales representa un resultado clínico diferente. 23. El método de la reivindicación 22, en donde cada perfil de expresión de referencia representa un resultado clínico diferente seleccionado del grupo que consiste de remisión a menos de 5% de células reticulares en respuesta a la terapia anticáncer; remisión a no menos de 5% de células reticulares en respuesta a la terapia anticáncer; y no remisión en respuesta a la terapia anticáncer. 24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12-19, en donde uno o más perfiles de expresión de referencia comprende un perfil de expresión de referencia que representa un humano libre de leucemia. 25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12-19, en donde la etapa (1) comprende generar el perfil de expresión de genes usando un arreglo de ácido nucleico. 26. El método de la reivindicación 15, en donde la etapa (1 ) comprende generar el perfil de expresión de genes de la muestra de sangre periférica de un paciente antes de la terapia anticáncer. 27. Un método para seleccionar un tratamiento para un paciente con leucemia, el método comprende las etapas de: (1 ) generar un perfil de expresión de gen de una muestra de sangre periférica derivada del paciente con leucemia; (2) Comparar el perfil de expresión de genes con una pluralidad de perfiles de expresión de referencia, cada uno representa un resultado clínico en respuesta a una pluralidad de tratamientos; y (3) Seleccionar de la pluralidad de tratamientos un tratamiento que tenga un resultado clínico favorable para el paciente con leucemia con base en la comparación en la etapa (2), En donde el perfil de expresión de genes y uno o más perfiles de expresión de referencia comprenden patrones de expresión de uno o más genes de pronóstico de la leucemia en células mononucleares de sangre periférica. El método de la reivindicación 27, en donde uno o más genes de pronóstico comprende uno o más genes seleccionado de la Tabla 3 o la Tabla 4. El método de la reivindicación 28, en donde uno o más genes de pronóstico comprende 10 o más genes seleccionados de la Tabla 3 o la Tabla 4. El método de la reivindicación 29, en donde uno o más genes de pronóstico comprende 20 o más genes seleccionados de la Tabla 3 o la Tabla 4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 27-30, en donde la etapa (2) comprende comparar el perfil de expresión de genes con la pluralidad de perfiles de expresión de referencia mediante un análisis k de vecino más cercano o un algoritmo pesado por votación. Un método para el diagnóstico, o el monitoreo de la ocurrencia, desarrollo, progresión, o tratamiento de una leucemia, el método comprende las etapas de: (1 ) generar un perfil de expresión de gen de una muestra de sangre periférica de un paciente que tiene la leucemia; y (2) Comparar el perfil de expresión de genes con uno o más perfiles de expresión de referencia, En donde el perfil de expresión de genes y uno o más perfiles de expresión de referencia comprenden patrones de expresión de uno o más genes de diagnóstico de la leucemia en células mononucleares de sangre periférica, y en donde la diferencia o similaridad entre el perfil de expresión de genes y uno o más perfiles de expresión de referencia es indicativo de la presencia, ausencia, ocurrencia, desarrollo, progresión o efectividad del tratamiento de la leucemia en un paciente. 33. El método de la reivindicación 32, en donde la leucemia es AML. 34. El método de la reivindicación 33, en donde uno o más genes de diagnóstico comprende uno o más genes seleccionados de la Tabla 7. 35. El método de la reivindicación 33, en donde uno o más genes de diagnóstico comprende uno o más genes seleccionados de la Tabla 8 o la Tabla 9. 36. El método de la reivindicación 33, en donde uno o más genes de diagnóstico comprende 10 o más genes seleccionados de la Tabla 7. 37. El método de la reivindicación 33, en donde uno o más genes de diagnóstico comprende 10 o más genes seleccionados de la Tabla 8 o la Tabla 9. 38. El método de la reivindicación 32, en donde uno o más perfiles de expresión de referencia comprende un perfil de expresión de referencia que representa un humano libre de la enfermedad. 39. Un arreglo para uso en un método para predecir un resultado clínico para un paciente con AML que comprende un sustrato que tienen una pluralidad de direcciones, cada dirección comprende una probeta distinta dispuesta sobre ella, en donde al menos 15% de la pluralidad de direcciones tiene dispuesto sobre ellas probetas que pueden detectar específicamente genes de pronóstico de AML en células mononucleares de sangre periférica. 40. El arreglo de la reivindicación 39, en donde al menos 30% de la pluralidad de direcciones tienen dispuesto sobre ellos probetas que pueden detectar específicamente genes de pronóstico del AML en células mononucleares de sangre periférica. 41 El arreglo de la reivindicación 39, en donde al menos 50% de la pluralidad de direcciones tiene dispuesto sobre ellas probetas que pueden detectar específicamente genes de pronóstico del AML en células mononucleares de sangre periférica. 42. El arreglo de una cualquiera de las reivindicaciones 39-41 , en donde the genes de pronóstico son seleccionados de las Tablas 3, 4, 5 o 6. 43. El arreglo de una cualquiera de las reivindicaciones 39-41 , en donde la probeta es una probeta de ácido nucleico. 44. El arreglo de una cualquiera de las reivindicaciones 39-41 , en donde la probeta es una probeta de anticuerpos. 45. Un arreglo para uso en un método para el diagnóstico del AML que comprende un sustrato que tiene una pluralidad de direcciones, cada dirección comprende una probeta distinta dispuesta sobre ella, en donde al menos 15% de la pluralidad de direcciones tiene dispuesto sobre ellas probetas que pueden detectar específicamente genes de diagnóstico de AML en células mononucleares de sangre periférica. 46. El arreglo de la reivindicación 45, en donde al menos 30% de la pluralidad de direcciones tiene dispuesto sobre ellas probetas que pueden detectar específicamente genes de diagnóstico de AML en células mononucleares de sangre periférica. 47. El arreglo de la reivindicación 45, en donde al menos 50% de la pluralidad de direcciones tiene dispuesto sobre ellas probetas que pueden detectar específicamente genes de diagnóstico de AML en células mononucleares de sangre periférica. 48. El arreglo de una cualquiera de las reivindicaciones 45-47, en donde los genes de diagnóstico son seleccionados de la Tabla 7. 49. El arreglo de una cualquiera de las reivindicaciones 45-47, en donde la probeta es una probeta de ácido nucleico. 50. El arreglo de una cualquiera de las reivindicaciones 45-47, en donde la probeta es una probeta de anticuerpos. 51. Un medio legible por computadora que comprende un perfil de expresión codificado digitalmente que comprende una pluralidad de señales de expresión codificadas digitalmente, en donde cada una de la pluralidad se señales de expresión codificadas digitalmente comprende un valor que representa la expresión de un gen de pronóstico del AML en una célula mononuclear de sangre periférica. 52. El medio legible por computadora de la reivindicación 51 , en donde el gen de pronóstico es seleccionado de las Tablas 3, 4, 5 o 6. 53. El medio legible por computadora de la reivindicación 51 , en donde el valor representa la expresión del gen de pronóstico de AML en una célula mononuclear de sangre periférica un paciente con un resultado clínico conocido o determinable. 54. El medio legible por computadora de la reivindicación 51 , en donde el perfil de expresión codificado digitalmente comprende al menos 10 señales de expresión codificadas digitalmente. 55. Un medio legible por computadora que comprende un perfil de expresión codificado digitalmente que comprende una pluralidad de señales de expresión codificadas digitalmente, en donde cada una de la pluralidad de señales de expresión codificadas digitalmente comprende un valor que representa la expresión de un gen de diagnóstico de AML en una célula mononuclear de sangre periférica. 56. El medio legible por computadora de la reivindicación 55, en donde el gen de diagnóstico es seleccionado de la Tabla 7. 57. El medio legible por computadora de la reivindicación 55, en donde el valor representa la expresión del gen de diagnóstico de AML en una célula mononuclear de sangre periférica de un humano libre de AML. 58. El medio legible por computadora de la reivindicación 55, en donde el perfil de expresión codificado digitalmente comprende al menos 10 señales de expresión codificadas digitalmente. 59. Un kit para el pronóstico de AML, el kit comprende: a) una o más probetas que pueden detectar específicamente genes de pronóstico de AML en células mononucleares de sangre periférica; y b) uno o más controles, cada uno representa un nivel de expresión de referencia de un gen de pronóstico detectable por una o más probetas. 60. El kit de la reivindicación 59, en donde los genes de pronóstico son seleccionados de las Tablas 3, 4, 5 o 6. 61. Un kit para el diagnóstico del AML, el kit comprende: a) una o más probetas que pueden detectar específicamente genes de diagnóstico de AML en células mononucleares de sangre periférica; y b) uno o más controles, cada uno representa un nivel de expresión de referencia de un gen de pronóstico detectable por una o más probetas. 62. El kit de la reivindicación 61 , en donde los genes de diagnóstico son seleccionados de la Tabla 7.