CN112852964B - 一种环状RNA hsa_circ_0059707及其特异性扩增引物和应用 - Google Patents

一种环状RNA hsa_circ_0059707及其特异性扩增引物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种环状RNA hsa_circ_0059707及其特异性扩增引物，所述环状RNA对应的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述特异性扩增引物包括上游引物和下游引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明的环状RNA在急性髓系白血病患者的骨髓单个核细胞中低表达，因此可以作为筛查急性髓系白血病的分子标志物。

Description

一种环状RNA hsa_circ_0059707及其特异性扩增引物和应用
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种用于急性髓系白血病诊断的环状RNA。
背景技术
急性髓系白血病(AML)是起源于髓系祖细胞的一类造血系统恶性克隆性疾病，在骨髓等造血组织中白血病细胞大量增殖，使正常造血受抑制，是血液系统恶性肿瘤最常见的类型。其发病涉及细胞分化、增殖、凋亡等多方面的异常改变，非随机性染色体异常、癌基因和抑癌基因突变等在AML的发生发展过程中起着重要作用，近年的研究表明在该过程中表观遗传学改变也发挥重要作用。尽管多种药物联合化疗和造血干细胞移植等治疗手段已有巨大的突破，急性髓系白血病的复发和转移仍频繁地发生，成为晚期急性髓系白血病患者死亡的主要原因。早期诊断、早期治疗能够大大减少急性髓系白血病恶化的进一步发生，随着分子水平的发展以及对急性髓系白血病发生、发展、治疗相关机制的进一步研究，对靶向诊断和靶向治疗分子标志物的筛选和研究成为急性髓系白血病研究最受关注的领域之一。
环状RNA(Circular RNA，circRNA)是一类共价闭合的环状RNA，无5′–3′极性和多聚腺嘌呤尾巴。circRNA可能作为miRNA海绵或竞争性内源RNA(ceRNA)起作用，以调节miRNA靶标的表达。circRNA在真核生物中高度丰富和进化保守，在特定的细胞类型及不同阶段具有特异性。
近年来，越来越多的研究发现环状RNA与急性髓系白血病的发生发展密切相关。Wang J报道circ_0075451的异常表达可能导致AML的不良预后的独立危险因素，也可能是AML治疗的潜在靶点。Circ_HIPK2在APL患者中的表达明显低于正常外周单核细胞和其他AML亚型，其作为分化相关miR-124-3p的海绵，影响ATRA诱导的杀伤细胞分化，表明其作为APL生物标志物的潜在作用。因此发现和筛选白血病相关的circRNA标志物，对早期防治白血病具有重要的意义和价值。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明包括以下几个方面：
本发明提供一种环状RNA，所述环状RNA对应的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中，起始两个核苷酸与最末两个核苷酸为成环结合位点。
所述环状RNA在circ-RNA数据库中的全称为hsa_circ_0059707，简称circ_0059707，定位于人类20号染色体正义链30193855-30194317区域，由ID1基因转录后经剪切环化而成。
本发明还提供一种用于扩增所述环状RNA的特异性扩增引物，所述特异性扩增引物包括上游引物和下游引物，其中，
所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
具体地，所述上游引物的核苷酸序列为：5’-CGTTTGGTGCTTCTCAGATTTC-3’；
所述下游引物的核苷酸序列为：5’-CATGCCGCTTACCACCATCTAA-3’。
优选的，所述上游引物的GC含量为45％，所述下游引物的GC含量为50％。
优选的，所述上游引物的TM值为56.26，所述下游引物的TM值为58.13。
优选的，验证后上下游引物RQ-PCR使用时的最适合TM值为55.2。
本发明还提供一种扩增所述环状RNA的方法，包括以下步骤：
(1)合成cDNA：所述原料包括总RNA、随机引物、RNase free ddH2O、dNTP混合液、5×PrimeScript II Buffer、RNA酶抑制剂和反转录酶；首先将随机引物，dNTP混合液，总RNA和RNase free ddH2O在65℃条件下反应5min，冰上迅速冷却；上述混合液中加入5×PrimeScript II Buffer，RNA酶抑制剂，反转录酶和RNase free ddH2O，在30℃条件下反应10min，45℃条件下反应45min，95℃条件下反应5min，4℃保持；使用effendoff PCR扩增仪进行反转录，所述cDNA置于-80℃储存备用；
(2)获得的cDNA进行实时荧光定量聚合酶链式反应(RQ-PCR)扩增：配制扩增体系，所述扩增体系包括步骤(1)制备的cDNA、所述上游引物、所述下游引物、ddH2O以及RQ-PCR扩增荧光染料Mix(含SYBGREEN染料和ROX)。
优选的，所述步骤(1)中将1μl随机引物，1μl dNTP混合液，2μl总RNA和6μl RNasefree ddH2O在65℃条件下反应5min。
优选的，所述步骤(1)中的混合液中再加入4μl 5×PrimeScript II Buffer，0.5μl RNA酶抑制剂，1μl反转录酶和4.5μl RNase free ddH2O。
优选的，所述步骤(2)中的扩增体系包括2μl cDNA，0.4μl上游引物，0.4μl下游引物，7.2μl ddH2O以及10μl RQ-PCR扩增荧光染料Mix。
优选的，所述步骤(2)中的程序控温反应如下：95℃预变性5min，然后以95℃反应10s、55.2℃反应32s、进行40个循环，以95℃反应15s，60℃反应60s，95℃反应15s，最后终止反应。
本发明还提供一种用于筛查急性髓系白血病的试剂盒，所述试剂盒包括所述的特异性扩增引物和扩增体系。
本发明还提供所述试剂盒在制备检测骨髓单个核细胞中circ_0059707表达水平的试剂中的应用。
本发明还提供所述试剂盒在制备用于筛查急性髓系白血病的试剂中的应用。
本发明产生的有益效果：
通过生物信息学预测，发明人发现环状RNA circ_0059707存在与miR-29b结合位点，miR-29b与急性髓系白血病的发生、发展、治疗、预后显著相关。研究发现相对于健康对照组，在急性髓系白血病患者骨髓标本中环状RNA circ_0059707表达显著下调，因此所述环状RNA circ_0059707可用于急性髓系白血病筛查。其次，使用本申请提供的特异性扩增引物对所述环状RNA circ_0059707进行扩增，将扩增结果进行分析，得到的ROC曲线下面积为0.986，表明该引物的敏感度高、特异性强。最后，使用本申请提供的特异性扩增引物得到的扩增产物为单一条带，无非特异性扩增。
附图说明
图1示出RQ-PCR检测circ_0059707在急性髓系白血病患者血液及健康人群骨髓中差异表达图；
图2示出急性髓系白血病组织中circ_0059707检测结果的ROC曲线。
具体实施方式
试验例1、RQ-PCR反应检测circ_0059707在急性髓系白血病组织中的表达
RQ-PCR扩增混合体系(Mix)、qPCR(含荧光染料)扩增混合体系(Mix)、反转录酶、dNTP混合液购自TAKARA公司。
一、试验方法
1、设计特异性扩增引物
本发明所设计的特异性扩增引物序列及相关信息如表1所示：
表1环状RNA circ_0059707特异性扩增引物序列及相关信息
Figure BDA0002965423000000051
2、骨髓有核细胞的分离
(1)离心乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝血，2000r/min，离心5min，下层注入红细胞裂解液中注入5ml红细胞裂解液，颠倒混匀，直至试管内液体清亮，低速离心机中离心10min，转速2000r/min，离心倒扣去除上清；
(2)于沉淀物中继续加入5ml红细胞裂解液，上下颠倒直至混匀，室温静置至液体透亮；
(3)再于离心机中离心10min，转速2000r/min，离心去上清；
(4)试管中加入1ml NS，用1ml枪头吹打混匀，将1ml混合液吸置1.5ml EP管内；
(5)将混合液高速离心3min，转速为13000r/min，吸取并弃去上清，留白色沉淀，暂不用时存放至-80℃冰箱备用。
3、总RNA的提取
(1)在2步骤(5)的白色沉淀物中加入TRIZOL裂解液1000μl，使用1ml移液枪充分吹打液体，吹打直至EP管中液体清透无肉眼可见沉淀且呈透明粉色水样，吹打完成置于冰盒中放置使细胞充分裂解；
(2)加三氯甲烷200μl，可见液体分层，此时盖紧EP管盖子，在震荡器上充分快速振荡30s，静置可见分层，再次震荡EP管，于室温静置10min；
(3)高速离心10min，转速12000r/min，离心后可见EP管液体分三层，上层无色透明，中间层为白膜层，下层粉色透明层，其中白膜以上为RNA，白膜之下为蛋白质；
(4)吸取白膜层以上的无色透明层加入新EP管中；加入异丙醇600μl；
(5)轻柔颠倒混匀RNA管，离心10min，12000r/min，弃去液体，留下的沉淀物为RNA；
(6)加入70％乙醇1000μl，轻柔颠倒使沉淀物悬浮于液体中，上下颠倒数次，高速12000r/min离心10min，弃上清；加入100％乙醇1000μl，方法同上一步，尽量吸去乙醇，留取白色沉淀物；
(7)取上述步骤留取的白色沉淀物，于37℃金属干浴锅干燥，约5-10min烤近快干时，加入适量焦碳酸二乙酯(DEPC)水混匀；冰上孵育裂解30min；
(8)用NanoDrop One分光光度计检测样本的总RNA的纯度和浓度，其中以DEPC作为空白对照进行调零，根据所测浓度和剩余液体体积将各样本中的RNA稀释至同一浓度；稀释后的样本可进行逆转录实验，或将RNA放置于-80℃冰箱保存。
4、逆转录方法
“二步法”逆转录体系与操作步骤如下：第一步，取PCR管配置反转录体系，反转录体系为：1μl随机引物，1μl dNTP混合液，2μl总RNA，6μl RNase free ddH2O，65℃条件下反应5min，冰上迅速冷却；上述混合液中加入4μl 5×PrimeScript II Buffer，0.5μl RNA酶抑制剂，1μl反转录酶，4.5μl RNase free ddH2O，在30℃条件下反应10min，45℃条件下反应45min，95℃条件下反应5min，4℃保持。使用effendoff PCR扩增仪进行反转录，所述cDNA置于-80℃储存备用。逆转录全套试剂，购于Takara公司。
5、circ_0059707基因RQ-PCR扩增反应
获得的cDNA进行实时荧光定量聚合酶链式反应(RQ-PCR)扩增：配制扩增体系，所述扩增体系包括上述步骤制备的cDNA、上游引物、下游引物、ddH2O、RQ-PCR扩增荧光染料Mix(含SYBGREEN染料和ROX)，按照下述程序控温反应。配制体系如下：2μl cDNA，0.4μl上游引物，0.4μl下游引物，7.2μl ddH2O，10μl qPCR扩增荧光染料Mix。扩增程序为：95℃预变性5min，然后以95℃反应10s、55.2℃反应32s、进行40个循环，以95℃反应15s，60℃反应60s，95℃反应15s，最后终止反应。扩增反应在实时荧光定量PCR仪ABI 7500上进行，在扩增目的基因的同时扩增ABL1作为内参对照，并通过2(-△△CT)法计算基因的相对表达量。
二、试验结果
1、基因表达分析
采用RQ-PCR方法检测23例对照组和75例AML患者骨髓单个核细胞中circ_0059707水平结果如图1所示。与对照组相比，环状RNA circ_0059707在急性髓系白血病骨髓单个核细胞中表达显著下调，提示环状RNA circ_0059707可用于急性髓系白血病的筛查。
2、ROC曲线分析
采用SPSS软件对上述实验数据进行分析，得到ROC曲线，如图2所示。其中，曲线下面积AUC为0.986，表示检测靶点能够作为检测该环状RNA的特异性标志物，并且检测灵敏度可达100％，特异性可达82.7％以上。
序列表
<110> 镇江市第一人民医院
<120> 一种环状RNA hsa_circ_0059707及其特异性扩增引物和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 462
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
gcggcatgcg ttcctgcgga cgatcgcatc ttgtgtcgct gaagcgcctc ccccagggac 60
cggcggaccc cagccatcca gggggcaaga ggaattacgt gctctgtggg tctcccccaa 120
cgcgcctcgc cggatctgag ggagaacaag accgatcggc ggccactgcg cccttaactg 180
catccagcct ggggctgagg ctgaggcact ggcgaggaga gggcgctcct ctctgcacac 240
ctactagtca ccagagactt tagggggtgg gattccactc gtgtgtttct attttttgaa 300
aagcagacat tttaaaaaat ggtcacgttt ggtgcttctc agatttctga ggaaattgct 360
ttgtattgta tattacaatg atcaccgact gaaaatattg ttttacaata gttctgtggg 420
gctgtttttt tgttattaaa caaataattt agatggtggt aa 462
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtttggtgc ttctcagatt tc 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catgccgctt accaccatct aa 22

Claims (2)

1.一种用于扩增环状RNA的特异性扩增引物在制备检测骨髓单个核细胞中circ_0059707表达水平的试剂中的应用，其特征在于，所述特异性扩增引物包括上游引物和下游引物，其中，
上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述上游引物的GC含量为45%，所述下游引物的GC含量为50%；
所述上游引物的TM值为56.26，所述下游引物的TM值为58.13；
所述环状RNA在circ-RNA数据库中的全称为hsa_circ_0059707，其对应的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种用于扩增环状RNA的特异性扩增引物在制备用于筛查急性髓系白血病的试剂中的应用，其特征在于，所述特异性扩增引物包括上游引物和下游引物，其中，
上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述上游引物的GC含量为45%，所述下游引物的GC含量为50%；
所述上游引物的TM值为56.26，所述下游引物的TM值为58.13；
所述环状RNA在circ-RNA数据库中的全称为hsa_circ_0059707，其对应的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
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