CN106841624B - 抗人cd4和抗人cd184单克隆抗体作为标志物的应用 - Google Patents
抗人cd4和抗人cd184单克隆抗体作为标志物的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了抗人CD4单克隆抗体和抗人CD184单克隆抗体的组合作为标志物的应用，具体地，用作诊断结缔组织病相关间质性肺炎的标志物，用于制备诊断结缔组织病相关间质性肺炎的试剂或试剂盒；或用于制备判定结缔组织病相关间质性肺炎严重程度、转归或预后的试剂或试剂盒。本发明还提供相应的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域，具体涉及一种可用于检测结缔组织病相关间质性肺炎的标记物及其用途。
背景技术
结缔组织病是一组以自身结缔组织损害为特点的自身免疫性疾病。结缔组织病(Connective tissuedisease,CTD)有许多具体类型,如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)、系统性硬化症(SSc)、干燥综合征(pSS)、多发性肌炎和皮肌炎(PM/DM，如无肌病性皮肌炎ADM)、混合性结缔组织病(MCTD)、脊柱关节病(SpA)等。
结缔组织病(Connective Tissue Disease，CTD)临床表现复杂多变，累及多器官组织，其中肺受累最为常见，也是严重威胁患者生命的高致死率疾病，是CTD急性期死亡的重要原因之一。
以上各种CTD均可并发间质性肺炎,称为结缔组织病相关间质性肺炎(ConnectiveTissue Disease Associtated with Interstitial Lung Disease,CTD-ILD)。根据文献报道，约15％-25％的间质性肺炎病人患有基础CTD疾病。CTD-ILD最常见于PM/DM/ADM、RA及SSc。在CTD中，ILD既可以是CTD的首发表现，也可为CTD的远期并发症。
目前临床上对于ILD诊断的生物标记物尚缺乏，较为特异的血清学标记物为酶联免疫分析检测KL-6，但此指标在我国并未大规模应用于临床，且ELISA检测法本身结果不稳定，阳性率偏高，且现有报道称，KL-6与疾病的活动度并无明显相关关系，且对于CTD-ILD并无特定诊断价值。
目前，本领域尚需针对临床CTD-ILD诊断以及疾病严重程度和转归等的判断进行深入研究。
发明内容
本发明的目的在于提供抗人CD4单克隆抗体和抗人CD184(又名CXCR4)单克隆抗体双抗联合的用途和相应的检测试剂盒。
本发明的第一方面，提供抗人CD4单克隆抗体和抗人CD184单克隆抗体组合的用途，
(a)用于制备诊断结缔组织病相关间质性肺炎的试剂或试剂盒；
(b)用于制备判定结缔组织病相关间质性肺炎严重程度的试剂或试剂盒；
(c)用于制备判定结缔组织病相关间质性肺炎转归的试剂或试剂盒；
(d)用于制备判定结缔组织病相关间质性肺炎预后的试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述抗人CD4单克隆抗体和/或所述抗人CD184单克隆抗体有可检测标记。
在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
在另一优选例中，所述诊断或所述判定是基于外周血进行诊断或判定。
在另一优选例中，所述诊断或所述判定是基于外周血单个核细胞PBMC进行诊断或判定。
本发明的第二方面，提供试剂盒，所述试剂盒含有一容器，所述容器中含有抗人CD4单克隆抗体和抗人CD184单克隆抗体；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于诊断结缔组织病相关间质性肺炎；和/或判定结缔组织病相关间质性肺炎严重程度、转归和/或预后。
在另一优选例中，所述抗人CD4单克隆抗体和/或所述抗人CD184单克隆抗体有可检测标记。
在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
在另一优选例中，所述标签或说明书注明基于外周血或外周血单个核细胞PBMC进行诊断或判定。
本发明的第三方面，提供抗人CD4单克隆抗体和抗人CD184单克隆抗体组合的用途，用作(a)诊断结缔组织病相关间质性肺炎的标志物；(b)判定结缔组织病相关间质性肺炎严重程度的标志物；(c)判定结缔组织病相关间质性肺炎转归的标志物；(d)判定结缔组织病相关间质性肺炎预后的标志物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为外周血单个核细胞PBMC中CD4+CD184+T细胞比例、CD8+CD184+T细胞比例、CD19+CD184+T细胞比例以及CD14+CD184+T细胞比例检测结果图，其中NC为正常体检组，Pneumonia为肺炎，IPF为特发性肺纤维化。CTD为结缔组织病，CDT-ILD为结缔组织病相关性间质性肺炎。
图2为单病种患者的外周血单个核细胞PBMC中CD4+CD184+T细胞、CD8+CD184+T细胞比例、CD19+CD184+T细胞比例以及CD14+CD184+T细胞比例比例检测结果图，其中NC为正常体检组，PM/DM/ADM为多发性肌炎/皮肌炎/无肌病性皮肌炎，PM/DM/ADM+ILD为多发性肌炎/皮肌炎/无肌病性皮肌炎相关间质性肺炎，RA为类风湿关节炎，RA+ILD为类风湿关节炎相关间质性肺炎，SSc为系统性硬化症，SSc+ILD为系统性硬化症相关间质性肺炎，SLE为系统性红斑狼疮，SLE+ILD为系统性红斑狼疮相关间质性肺炎。
图3为CTD-ILD患者的外周血单个核细胞PBMC中CD4+CD184+T细胞比例与疾病严重程度(患者肺功能及HRCT评分)的相关性分析图，其中，FVC为用力肺活量，DLCO SB/VA为肺弥散功能检查。
图4为CTD-ILD患者的外周血单个核细胞PBMC中CD4+CD184+T细胞比例，与KL-6相比，其诊断效能ROC曲线。
图5为CTD-ILD患者的外周血单个核细胞PBMC中CD4+CD184+T细胞比例与患者生存率的相关性分析。结果提示，CD4+CD184+T细胞比例大于45％时，预后差。
各附图中，CXCR4表示CD184。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，发现CTD-ILD外周血PBMC中CD4+CD184+T细胞比例(以CD4+T细胞为100％)明显高于正常对照组、肺炎病人及单纯CTD病人组，且CD4+CD184+T细胞比例与CTD-ILD患者肺功能呈负相关，与HRCT评分(评分越高，肺功能越差)呈现明显的正相关关系。因此，CD4+CD184+T细胞比例可以作为CTD-ILD患者临床诊断及评价疾病严重程度、转归及预后的有效指标(或辅助指标)。抗人CD4单克隆抗体和抗人CD184单克隆抗体的组合可以用作诊断结缔组织病相关间质性肺炎的标志物。在此基础上，完成了本发明。
T细胞
T淋巴细胞(或T细胞)是免疫系统中具有具有免疫活性的一类细胞。T细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原和表面受体。
CD4蛋白
在本发明中，术语“CD4蛋白”、“CD4多肽”、“CD4抗原”可互换使用，都指在哺乳动物(如人)淋巴细胞表面的一种蛋白。CD4主要表达于辅助T(Th)细胞，是Th细胞TCR识别抗原的供受体，与MHCⅡ类分子的非多肽区结合，参与Th细胞TCR识别抗原的信号传导。
CD184蛋白
在本发明中，术语“CD184蛋白”、“CD184多肽”、“CD184抗原”可互换使用，都指在哺乳动物(如人)淋巴细胞表面的蛋白CD184。CD184是一种存在细胞表面的受体，也称为C-X-Cchemokine receptor type 4或CXCR-4)。
抗CD4特异性抗体
在本发明中，术语“本发明抗体”和“抗CD4的特异性抗体”可互换使用。
本发明还包括对人CD4多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人CD4基因产物或片段。较佳地，指那些能与人CD4基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗CD抗体包括那些能够结合并抑制人CD4蛋白的分子，也包括那些并不影响人CD4蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人CD4基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人CD4基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人CD4蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：292,1976；Hammerl ing等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier，N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人CD4蛋白功能的抗体以及不影响人CD4蛋白功能的抗体。
本发明的各类抗体可以利用人CD4基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人CD4基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗CD184特异性抗体
在本发明中，术语“本发明抗体”和“抗CD184的特异性抗体”可互换使用。
本发明还包括对人CD184多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人CD184基因产物或片段。较佳地，指那些能与人CD184基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗CD抗体包括那些能够结合并抑制人CD184蛋白的分子，也包括那些并不影响人CD184蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人CD184基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人CD184基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人CD184蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人CD184蛋白功能的抗体以及不影响人CD184蛋白功能的抗体。
本发明的各类抗体可以利用人CD184基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人CD184基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
检测方法
在本发明中，抗人CD4蛋白的抗体和抗CD184的抗体可联合用于检测标本(尤其是外周血样本)中的细胞表面上带有CD4蛋白和CD184蛋白的T细胞(CD4+CD184+T细胞)。
基于本发明，利用CD4+CD184+T细胞存在于外周血中，CD4+CD184+T细胞的数量(或相对百分比，以CD4+T细胞为基准)与CTD-ILD患者肺功能呈负相关并与HRCT评分(评分越高，肺功能越差)呈现明显的正相关关系的特点。本发明还提供了检测或判断诊断结缔组织病相关间质性肺炎的方法，尤其是血液学检测方法。
在一个优选例中，本发明提供一种检测血液中CD4+CD184+T细胞进而用于评价CTD-ILD患者肺功能或进行HRCT评分(评分越高，肺功能越差)的方法。一种优选的方法是采用双抗体，通过流式细胞仪进行流式细胞检测。
检测试剂盒
本发明还提供了一种检测结缔组织病相关间质性肺炎的试剂盒，它含有本发明的(a)抗CD4的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段；(b)抗CD184的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段。
用本发明的试剂盒检测为阳性的对象(或TD-ILD患者)，显示出肺功能较差，以及HRCT评分较高的趋势，且预后更差。
在代表性的例子中，当CD4+CD184+T细胞大于(≥)40％，如40-80％或45-85％时，则提示，该对象的肺功能差，并且预后差；当CD4+CD184+T细胞≥20％，如约20-40％时，则提示该对象的肺功能较差，建议进一步进行诊断或治疗。当CD4+CD184+T细胞为约5-15％时，则提示该对象的肺功能属于或基本上属于正常。
本发明首次提供了通过抗人CD4单克隆抗体和抗人CD184单克隆抗体组合诊断结缔组织病相关间质性肺炎的方法，可以通过抗人CD4单克隆抗体和抗人CD184单克隆抗体组合判定结缔组织病相关间质性肺炎严重程度、转归和预后，有助于尽早确诊并采取相应治疗措施。
本发明的主要优点包括：
(1)首次提供了通过抗人CD4单克隆抗体和抗人CD184单克隆抗体组合诊断结缔组织病相关间质性肺炎的方法，可以通过抗人CD4单克隆抗体和抗人CD184单克隆抗体组合判定结缔组织病相关间质性肺炎严重程度、转归和预后，有助于尽早确诊并采取相应治疗措施。
(2)两种抗原一次完成检测，检测方法方便快速，更容易为病人接受。
(3)便于动态监察结缔组织病相关间质性肺炎患者的病情进展。
(4)检测灵敏度和特异性优于目前市售的血清学标记物，即酶联免疫分析检测KL-6。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
材料和通用方法
1.材料：除非特别说明，所有的材料(包括抗体)均为市售产品。
2.评价方法
2.1肺功能评估：
HRCT评分标准(六分类，六区域分类法)
2.2实验分组
实验设计分组主要分为四组：(1)正常体检组；(2)疾病对照组，选取肺炎、特发性肺纤维化(IPF)；(3)CTD组，具体包括PM/DM/ADM、RA、SSc及SLE患者；(4)CTD-ILD组。患者样本均来源于明确诊断的住院病人。
实施例1
患者外周血PBMC的分离
取患者肝素抗凝血5ml，反复颠倒混匀；等量PBS对血液样本进行稀释。
将稀释后的血液样本倾斜缓慢沿壁注入4ml淋巴分离液上方；以1200g，慢升慢降的方式离心10min。
吸取离心管中浑浊带部分细胞，移至另一管加入PBS的离心管中，600g，快升快降离心7min；
弃上清，200μl重悬，进行细胞计数，稀释至淋巴细胞计数为0.5×109/g，备用。
实施例2
混合荧光抗体的制备
分别调整抗人CD4单克隆抗体(Abcam公司)浓度为15mg/ml、抗人CD184单克隆抗体(Abcam公司)浓度为25mg/ml，置于冰槽中磁力搅拌10min，搅拌过程中不能起泡沫。
按照0.01mg/mg蛋白称取FITC(Sigma公司)，用于标记CD184。
按照0.05mg/mg蛋白称取APC(Sigma公司)，用于标记CD4。
在搅拌下将荧光素缓慢加入至抗体蛋白溶液中，此步骤在5min内完成，将混合液放置4度，继续磁力搅拌18h。
将蛋白混合液取出，以2500rpm/min的速度离心25min，使用PH值为8.0的缓冲盐水4度透析过夜。
将透析过夜的蛋白混合物过葡萄糖凝胶G50柱，去除游离的荧光素。
收集标记的荧光抗体进行鉴定。
将制备完毕的抗CD4抗体及抗CD184抗体按照1：0.5均匀混合，加入浓度为1：5000叠氮钠以1ml棕瓶分装，-20度保存备用。
实施例3
基于外周血PBMC中CD4+CD184+T等细胞比例的双抗流式联合检测方法
抽取患者新鲜肝素抗凝血5ml，反复颠倒混匀；提取患者外周血PBMC。
将抽提出的PBMC进行血细胞分析仪计数，以淋巴细胞数量为主，将PBMC稀释至0.5×109/g。
吸取100μl稀释后的PBMC，加入实施例2制备混合抗体10μl，避光孵育15min。
加入200μl PBS,混匀，上机流式检测。
实施例4
基于外周血中CD4+CD184+T细胞等比例的双抗流式联合检测方法
抽取患者EDTA抗凝血2ml，反复颠倒混匀。
吸取抗凝血50μl，加入实施例2制备的混合抗体10μl，避光孵育15min。
加入红细胞裂解液1ml，避光反应10min；1200rpm,5min离心。
弃去上清，加入2ml PBS，1200rpm,5min再次离心；弃上清，加入300μl PBS，流式检测。
实施例5
评分方法
根据HRCT评分标准，对CTD-ILD患者进行CT评分，与CD4+CD184+T细胞比例进行相关性分析。
实施例6
生存评价
观察纳入研究的患者60天的生存率，是否与外周PBMC中CD4+CD184+T细胞比例有一定的相关性。
检测结果分析
检测结果表明：CTD-ILD患者外周血PBMC中CD4+CD184+T细胞比例显著高于健康对照组及CTD组，且在单病种CTD中也有相同的趋势(如图1和2所示)。
CD4+CD184+T细胞比例与患者肺功能及HRCT评分有明显的正相关关系。对CTD-ILD病人的CD4+CD184+T细胞比例做ROC曲线，曲线下面积为0.7845，表明有很强的诊断效能(如图3和图4所示)。
在CTD与CTD-ILD组间比较，CD4+CD184+T比例与生存率无明显相关性；但在CTD-ILD组内，当CD4+CD184+T比例>45％时，预后差，死亡率明显增高(如图5所示)，具有统计学意义。
本发明的实验表明，CD4+CD184+T细胞比例是CTD-ILD患者进行疾病诊断的生物学标记，尤其在判定病情严重程度及预后上，CD4+CD184+T细胞比例(以CD4+T细胞为基准)凸显了其绝对优势。
统计数据提示，
(a)当CD4+CD184+T细胞大于(≥)40％，如40-80％或45-85％时，则提示，该对象的肺功能差，并且预后差；
(b)当CD4+CD184+T细胞≥20％，如约20-40％时，则提示该对象的肺功能较差，建议进一步进行诊断或治疗。
(c)当CD4+CD184+T细胞为约5-15％时，则提示该对象的肺功能属于或基本上属于正常。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (4)
1.抗人CD4单克隆抗体和抗人CD184单克隆抗体组合的用途，其特征在于，(a)用于制备诊断结缔组织病相关间质性肺炎的试剂或试剂盒；(b)用于制备判定结缔组织病相关间质性肺炎严重程度的试剂或试剂盒；(c)用于制备判定结缔组织病相关间质性肺炎转归的试剂或试剂盒；或(d)用于制备判定结缔组织病相关间质性肺炎预后的试剂或试剂盒；且所述诊断或判定是基于外周血CD4+CD184+双阳性T细胞进行诊断或判定。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗人CD4单克隆抗体和/或所述抗人CD184单克隆抗体有可检测标记。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述可检测标记选自下组：化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述可检测标记为生色团。
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