MX2007009896A - Peptido poliepitopico derivado de timidilato sintetasa que tiene actividad inmunologica y antitumoral. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un peptido que tiene actividad antitumoral y a sus composiciones farmaceuticas relacionadas. En particular, la invencion se refiere a un peptido con actividad antitumoral preventiva y terapeutica, tambien en combinacion con otros compuestos antitumorales conocidos, tales como por ejemplo, el 5-fluorouracilo.

Description

PEPTIDO POLIEPITOPICO DERIVADO DE TIM IDILATO SINTETASA QUE TIENE ACTIVIDAD INM U NOLOGICA Y ANTITUMORAL Campo Técnico de la Invención La presente invención se refiere a un péptido que tiene actividad antitumoral y a sus composiciones farmacéuticas relacionadas. En particular, la invención se refiere a un péptido con actividad antitumoral preventiva y terapéutica, también en combinación con otros compuestos antitumorales conocidos, tales como por ejemplo el 5-fluorouracilo. Antecedentes de la Invención La timidilato síntetasa (TS) es una enzima intracelular capaz de regularse a sí misma en respuesta a la expresión de niveles de sus cofactores y sus sustratos. La TS es la fuente principal de timidina en las células eucaríótícas, y es necesaria para la síntesis de ADN y su duplicación. Esta enzima sintetiza timidina agregando una unidad de monocarbonato al desoxiuracílo, en presencia de folatos reducidos [1 ,2]. Por lo tanto, participa estrictamente en la duplicación del ADN y en la proliferación celular y, por lo tanto, en células normales, su expresión es rigurosamente controlada por genes involucrados en el ciclo celular, y es expresada temporalmente sólo durante la fase S [3,4]. En contraste, en células tumorales, la TS se expresa constitutivamente y su intensidad de expresión es un índice de proliferación. Basándose en estas consideraciones, algunos de los fármacos antitumorales más activos, incluyendo los antimetabolitos, actúan directa y/o indirectamente inhibiendo esta enzima [5]. Además, la TS es el blanco enzímátíco crítico inhibido por el monofosfato de 5-fluorodesoxiuridína (5-Fd UM P), que es un metabolito del 5-fluorouracilo (5-FU ) el cual es uno de los fármacos citotóxicos más activos y que está incluido en casi todos los reg ímenes de tratamiento de poliquimioterapia utilizados para tratar neoplasias malignas del aparato gastroentérico, carcinoma de mama y neoplasias malignas de la cabeza y el cuello [6] . El 5-FU es un profármaco de fluoropirimidina que tiene que ser activado en el citoplasma de las células neoplásicas, en dos metabolitos citotóxicos: trifosfato de 5-fluorouridina (5-FUTP) y 5-Fd UM P. Éste último es en particular responsable de la permanente inhibición de la TS, con lo cual , también en asociación con folato reducido, forma un complejo terciario estable que es rápidamente degradado en el citoplasma celular por el sistema de proteosomas responsable de la formación de epítopos peptídicos derivados de los antígenos tumorales. En la actualidad , muchos estudios han demostrado que la expresión excesiva, constitutiva o adquirida, de la TS , así como sus mutaciones, son mecanismos de escape válidos para las células tumorales, debido a que confieren resistencia al 5-FU [7]. A este respecto, numerosos estudios ya han demostrado que la detección de altos niveles de TS o sus mutaciones, en pacientes con carcinomas gástricos o de colon, son predictivos de resistencia al fármaco y se consideran como factores de pronóstico negativos [8,9]. Incluso en las células tumorales que expresan constitutivamente concentraciones bajas o intermedias de TS, la enzima está, en cualquier caso, sujeta a una potente actividad autorregulatoria, debido a que después de sólo cinco horas de exposición al 5-FU, estas células pueden mostrar una respuesta adaptativa, con una clara e inmediata expresión excesiva de la enzima [10]. Por lo tanto, está claro que existe la necesidad de desarrollar una herramienta terapéutica que pueda resolver la incapacidad del 5-FU, por sí solo o en combinación con otros agentes quimioterapéuticos, de erradicar por completo la enfermedad neoplásica y, por lo tanto, curar pacientes con neoplasias malignas, en particular de las mamas y del aparato gastroentérico. Breve Descripción de la Invención Los autores de la presente invención han desarrollado un agente peptídíco antitumoral, con actividad inmunoterapéutica, 0 designado TS/PP, que también se puede combinar con la quimioterapia convencional basada en fluoropirimidina, y es capaz de obtener, in vivo e in vitro, una respuesta citotóxica poliepitópica de linfocitos T, capaz de destruir las células tumorales que expresan en exceso la enzima TS. Como la expresión de la proteína TS es una de las primeras alteraciones que ocurre en todos los tumores humanos durante la carcinogénesis, el péptido de la invención también tiene una acción inmunoprotectora preventiva, además de su actividad terapéutica . El TS/PP es un péptido sintético 28américo caracterizado por el hecho de que contiene varias secuencias de aminoácido de naturaleza eptitópica, algunas de las cuales siendo potencialmente capaces de unirse a diferentes haplotípos de moléculas HLA clase I (incluyendo los tres epítopos conocidos específicos para moléculas HLA-A(*)02.01 : TS-1 , TS-2 y TS-3) [1 1 ] , y moléculas H LA clase I I . La actividad inmunológica y antitumoral del TS/PP, ha sido demostrada en modelos humanos in vitro en ratones manipulados por ingeniería genética (ratones transgénicos-HH D), con moléculas humanas clase I del sistema mayor de histocompatibilidad (haplotipo HLA-A(*)02.01 ) que expresan una TS , la cual es muy similar a la TS humana (similitud del 90-95% de los aminoácidos). En el modelo humano, el TS/PP se ha utilizado para generar l íneas de línfocitos T citotóxicos (LTC) in vitro, al estimular cíclicamente células mononucleares de sangre periférica humana (CMSP) (derivadas tanto de donadores normales como de donadores con neoplasias malignas), con dosis bajas de interleucína 2 , y en cocultivo con células dendríticas autólogas previamente expuestas a TS/PP. Estas l íneas linfocíticas manifiestan una significativa actividad citotóxica contra células tumorales ( HLA-A(*)02.01 +) de carcinoma de mama y de colon. Esta actividad citotóxica se incrementa drásticamente si las células tumorales son expuestas previamente a dosis subletales de 5-FU capaz de incrementar la expresión endógena de TS. En el modelo animal , el TS/PP administrado a ratones H H D inoculados con células leucémicas autólogas (EL-4 HHD) que expresan TS, tiene una potente actividad antitumoral (preventiva y terapéutica), que se incrementa por el tratamiento combinado con 5- FU . La actividad ¡nmunogénica y antitumoral del TS/PP, no está asociada con el surgimiento de ningún efecto adverso o de autoinmunídad , pero tanto en el modelo murino como en el humano, es mucho mayor que la ejercida por los péptido epitópicos conocidos de la TS (TS-1 , TS-2 y TS-3), utilizados individualmente o en combinación . La presente invención también se refiere a un método para generar, in vitro, líneas de LTC específicas de TS (y poliepitópicas), con actividad antitumoral, para ser utilizadas para la inmunoterapia de pacientes neoplásicos. Las l íneas linfocíticas por ser reinfundidas en pacientes neoplásicos, de hecho son generadas por medio de estimulación cíclica ex vivo de células mononucleares de sangre periférica (CMSP). Células (HLA(*)02.01 + , cosechadas por medio de leucoféresis) con dosis bajas de I L-2 y células dendríticas autólogas expuestas al péptido TS/PP. La presente invención también se refiere a la capacidad del péptido TS/PP de prevenir el surgimiento de tumores en ratones transgénicos positivos para HLA-(*)02.01 (H HD) e inoculados con células tumorales autólogas (EL-4/H HD). La presente invención también se refiere a la capacidad del péptido TS/PP, de inducir una respuesta inmunitaria con actividad antitumoral en ratones transgénicos positivos para H LA-(*)02.01 (HHD) e inoculados con células tumorales autólogas (EL-4/HHD), en ausencia de una respuesta autoinmunitaria y/o tóxica. Además, la presente invención se refiere a la terapia antitumoral combinada de TS/PP y 5-FU , como tratamiento quimioinmunoterapéutico de carcinomas sensibles a la fluoropirimidina (carcinomas gastroentéricos, de mama y de cabeza y cuello). Descri pción Detallada de la Invención El objetivo de la presente invención , por lo tanto, es un péptido incluido en la secuencia YM IAHITGLFLDSLGFSTTLGDAH IYL (SEQ I D NO: 2) para uso médico . De preferencia, el péptido tiene la secuencia del aminoácido 1 9 al aminoácido 27 de la SEQ I D NO: 2 , TLGDAH IYL. Alternativamente, tiene la secuencia del aminoácido 1 al aminoácido 9 de la SEQ I D NO: 2, YM IAH ITGL. Alternativamente, el péptido tiene la secuencia del aminoácido 1 0 al aminoácido 1 8 de la SEQ I D NO: 2, FLDSLGFST. En una modalidad preferida alternativa, el péptido tiene la secuencia YM IAH ITGLFLDSLG FSTTLG DAH IYL (SEQ I D NO: 2). Otro objetivo de la invención, es un vector que incluye, y es capaz de expresar de manera efectiva en una célula eucariótíca, una secuencia de nucleótidos que codifica para el péptido de la invención , en donde la secuencia de nucleótidos de preferencia es TACATGATTGCGCACATCACGGGCCTGTTTTTGGACAGCCTGGGATT CTCCACCACTTTGGGAGATGCACATATTTACCTG (SEQ I D NO: 1 ). Otro objetivo de la invención, es una composición farmacéutica con actividad antitumoral preventiva que incluye una cantidad farmacéuticamente efectiva del péptido de conformidad con la invención y excipientes y/o diluyentes y/o agentes solubilizantes apropiados. Otro objetivo de la invención es una composición farmacéutica con actividad quimioterapéutica , que incluye una cantidad farmacéuticamente efectiva del péptido de conformidad con la invención y excipientes y/o diluyentes y/o agentes solubilizantes apropiados. De preferencia, la composición farmacéutica incluye otro ingrediente antitumoral activo y, más preferiblemente, el otro ingrediente activo antitumoral es el 5-fluorouracilo. Otro objetivo de la invención , es un método para obtener linfocitos T citotóxicos (LTCs) in vitro, activados para TS, en donde el método incluye los siguientes pasos: a) tomar CMSP de un sujeto y cultivarlos in vitro; b) estimular los CMSP in vitro, al exponerlos a células dendríticas autólogas irradiadas, previamente expuestas, durante tiempos oportunos, a concentraciones eficaces del péptido de conformidad con la invención . Otro objetivo de la invención , son linfocitos T citotóxicos activados para TS, que se obtienen por medio del método descrito, de preferencia para inmunoterapia, la presente invención ahora se describirá mediante ejemplos no limitantes, con referencia particular a las siguientes figuras: Figura 1 A - Líneas de LTC generados utilizando cada péptido epitópico individual de TS (TS-1 , TS-2 y TS-3), capaces de lisar células blanco CI R-A2 expuestas al péptido TS/PP. Estos resultados sugieren que el TS/PP es procesado por las células blanco en forma de los epítopos peptídicos i ndividuales. La actividad l ítica de estos LTCs ha sido examinada (por medio de la liberación de 51 Cr) en pruebas de citotoxicidad contra CI R-A2 expuestas a 25 µg/mL de TS/PP durante 4 horas. Los controles positivos consistieron de las mismas células, pulsadas con 25 µg/mL de cada uno de los péptidos individuales (TS/1 , TS/2 ó TS/3) específícamente utilizados para generar las l íneas transfectadas con un plásmido que contiene el gen TS (pcTS) que induce la expresión excesiva de la enzima. Los controles negativos consistieron de las mismas células CI R-A2, no expuestas a ningún reactivo, transfectadas con el armazón estructural del plásmido (pcDNA3) (datos no mostrados en la figura), o pulsadas con un péptido epitópico conocido (PTR-4, proteína relacionada con la hormona paratiroidea) derivado de un antígeno no expresado en estas células y no relacionada con TS. Los resultados se expresan como el porcentaje de lisis específica a diferentes relaciones de efector/blanco (E/B) (valores medio y desviaciones estándar de experimentos individuales por triplicado). Los símbolos representan : células CI R-A2 blanco no tratadas [.. o ..]; células CI R-A2 transfectadas con pcTS [ — o — ]; células CI R-A2 previamente expuestas al péptido TS/PP [ — m — ]; células CI R-A2 pulsadas con epítopos peptídicos específicos de TS utilizados para generar las l íneas celulares [ — ? — ]; células CI R-A2 pulsadas con el péptido de control (PTR-4) [-- -a- - -]. Figu ra 1 B - Especificidad multiepitópica de las líneas de LTC generadas utilizando TS/PP. En pruebas de citotoxícidad , las l íneas de LTC generadas utilizando el péptido TS/PP, son capaces de lisar células blanco CI R-A2 pulsadas con 25 µg/mL de cada uno de los tres epítopos peptídícos de la TS (TS/1 , TS/2 ó TS/3). Se utilizaron células CI R-A2 expuestas a 25 µg/mL de TS/PP durante 4 horas, y aquellas transfectadas con el plásmido recombinante para el gen TS (pcTS), como controles positivos, mientras que los controles negativos fueron las mismas células CI R-A2 no expuestas a ningún reactivo ni transfectadas con el armazón estructural del plásmido (pcDNA3) (datos no mostrados en la figura), pulsadas con PTR-4 ó con un péptido epitópíco derivado de la matriz del virus de la influenza (I FN ). Los resultados se expresan como el porcentaje de lisis específica a diferentes relaciones de efector/blanco (E/B ) (valores de la media y desviaciones estándar de experimentos individuales por triplicado). Los símbolos representan : células blanco CI R-A2 no expuestas a ningún reactivo [.. o ..]; células CI R-A2 transfectadas con pcTS [ — ? — ]; células CI R-A2 expuestas al péptido TS/PP [ — •— ]; células CI R-A2 pulsadas con TS-1 [ — 0 — ]; células CI R-A2 pulsadas con TS-2 [ — •— ]; células CI R-A2 pulsadas con TS-3 [ — * — ]; células CI R-A2 pulsadas con PTR-4 [-- -a-- -]; células CI R-A2 pulsadas con el péptido I FN [— ?— ]. Figura 2 - La actividad l ítica de l íneas de linfocitos T citotóxicos generadas utilizando el péptido TS/PP, contra células de carcinoma mamario, se incrementa mediante un tratamiento previo con 5-FU de las células blanco. Examinadas en pruebas de cítotoxicidad in vitro, las líneas LTC generadas utilizando TS/PP, fueron capaces de matar células blanco derivadas del carcinoma mamario HLA-A(*)02.01 + (la l ínea celular M DA-M B-231 ). La actividad l ítica de los linfocitos efectores fue significativamente mayor que aquella inducida por las líneas de linfocitos generadas in vitro utilizando cada uno de los tres epítopos peptídicos anteriormente mencionados de la TS, y se incrementó significativamente si la célula blanco había sido sometida a dosis subletales de 5-FU , capaces de incrementar la expresión endógena de TS. La actividad l ítica de los linfocitos específicos de TS/PP se restringió a moléculas HLA clase I , debido a que ésta era eliminada si el experimento de citotoxicidad se realizaba en presencia de anticuerpos anti-HLA-(*)02.01 (A2.69 y W6.32) (datos no mostrados). La lísis, entonces, no fue cambiada por el anticuerpo U PC-1 0 utilizado como control negativo que no reaccionaba con las células blanco (datos no mostrados en la figura). Los resultados se expresan como el porcentaje de lisis específica a diferentes relaciones de efector/blanco (E/B ). Los símbolos representan: células blanco M DA-M B-231 [ — o — ]; células M DA-M B-231 expuestas al anticuerpo monoclonal A2.69 [— ?— ]; célula M DA-MB-231 previamente tratadas con 5-FU [ — •— ]; células M DA-MB-231 previamente tratadas con 5-FU y expuestas al anticuerpo monoclonal A2.69 [-- -o-- -]. Figura 3 - La actividad l ítica contra células de carcinoma de colon de l íneas de linfocitos T citotóxicos generadas utilizando el péptido TS/PP, se incrementó mediante un tratamiento previo con 5-FU de las células blanco. Las líneas linfocíticas generadas in vitro utilizando TS/PP, fueron capaces de destruir las células blanco derivadas del carcinoma de colon (las l íneas celulares HT-29 y SW-1 463). La l ínea celular HT-29, es una línea de células de carcinoma de colon que no expresa HLA-A(*)02.01 y, por lo tanto, se pueden utilizar como células blanco de nuestros LTCs, esta l ínea celular fue inducida a expresar moléculas HLA-A(*)02.01 por medio de una transfección (el gen pc-HLA-A(*)02.01 ). La lisis inducida por las l íneas de linfocitos generadas utilizando el péptido TS/PP, fue mayor que aquella inducida por las otras l íneas de linfocitos generadas utilizando cada uno de los tres epítopos individuales, y se incrementó significativamente cuando las células blanco eran sometidas a dosis subletales de 5-FU, capaces de incrementar su producción endógena de TS. La lisis se restringió a moléculas HLA clase I , debido a que se eliminaba mediante el uso de los anticuerpos A2.69 y W6.32 en las pruebas de citotoxicidad (datos no mostrados en la figura), y también debido a que estos LTCs eran capaces de matar las células HT-29 no transfectadas con el gen HLA-(*)02.01 , ni transfectadas con el armazón estructural del plásmido (datos no mostrados en la figura). Los resultados se expresan como el porcentaje de lisis específica a diferentes relaciones de efector/blanco (E/B). Los símbolos representan : células blanco HT-29 [.. o ..]; células HT-29 transfectadas con el gen HLA-(*)02.01 [ • ] ; células HT-29 previamente tratadas con 5-FU , transfectadas con el gen HLA-A(*)02.01 [ — • — ]; células blanco SW-1463 [-- -p- - -]; células SW-1463 previamente tratadas con 5-FU [—•—]. Figura 4 - Especificidad peptídica de las l íneas de linfocitos evaluadas por medio de un ensayo de competencia en frío de LTC. La figura muestra la especificidad peptídica de las dos líneas de linfocitos generadas utilizando el péptido TS/PP, examinadas por medio de un ensayo de competencia en frío , midiendo las relaciones de efector/blanco de 25/1 y 12.5/1 , y utilizando células CI R-A2 pulsadas con TS/PP como células blanco de los LTCs (cargados con 51 Cr) y células HT-29 [transfectadas con el gen HLA-A(*)02.01 ó previamente tratadas con 5-FU y después transfectadas con el gen HLA-A(*)02.01 ] como competidores en frío, utilizados a relaciones escalares de blanco marcado/competidor frío (L/C). La figura muestra que la actividad citotóxíca de los LTCs contra las células CI R-A2 cargadas con 25 µg/mL de TS/PP, fue reducida por los competidores fríos y fue completamente eliminada a relaciones de L/C bajas [1 /5] [P<0.05]. La figura también muestra que las células HT-29 previamente tratadas con 5-FU y después transfectadas con el gen HLA-A(*)02.01 , fueron mucho más eficientes, ya que eliminaron la lisis de las células blanco a una relación L/C cinco veces más alta [1 /1 ] [P<0.05]. Esto sugiere que el efecto inmunosensibilízador del 5-FU , de hecho está relacionado con el incremento en la cantidad de epítopos TS en las células blanco. Los símbolos representan las células blanco CI R-A2 cargadas con TS/PP en presencia de: sin competidor [ — o—]; células HT-29 transfectadas con HLA-A(*)02.01 y utilizadas como competidores fríos, a relaciones L/C de 1 /1 [—•—], 1 /2 [ — m — ] y 1 /5 [ — * — ]; células HT-29 previamente tratadas con 5-FU y después transfectadas con el gen HLA-A(*)02.01 y utilizadas como competidores fríos a relaciones de L/C de 1 /1 [- - -o- - -]; 1 /2 [-- -«- - -] y 1 /5 [— ?— ]- Figura 5 - El crecimiento tumoral en ratones H H D inoculados con células leucémicas autólogas, se torna significativamente más lento o se elimina en su totalidad , por el tratamiento combinado con TS/PP y 5-FU . El crecimiento tumoral fue monitoreado semanalmente, midiendo su diámetro máximo. Los resultados se presentan como el valor de la media ±DE del diámetro máximo. Los ratones vacunados con TS/PP, mostraron un retraso significativo en el crecimiento tumoral , el cual se volvió incluso más evidente en los ratones que recibieron TS/PP junto con el tratamiento quimioterapéutíco con 5-FU . En estos experimentos, el tratamiento quimioterapéutico por sí solo, la vacunación con el péptido de control (derivado del virus de las paperas) y la vacunación con una combinación de los tres epítopos peptídicos de TS (+/- 5-FU) no fueron capaces de prevenir el crecimiento neoplásico. Los símbolos representan un grupo de ratones tratados con: el péptido de control [ — p — ]; una combinación de los epítopos del péptido TS [ — a — ]; el péptido TS/PP [ — o — ]; el péptido de control y quimioterapia con 5-FU [ — m — ]; la combinación de epítopos del péptido TS y quimioterapia con 5-FU [ — * — ]; el péptido TS/PP y quimioterapia con 5-FU [ — • — ]. Figura 6 - La figura muestra la apariencia del tumor en cada ratón perteneciente a diferentes grupos, 30 d ías después de la inoculación subcutánea con 2 x 1 06 células leucémicas autólogas (EL4/H HD). Este experimento muestra que el tratamiento combinado con TS/PP y 5-FU , tiene la actividad antitumoral y protectora más grande. La fotografía muestra ratones anestesiados. El experimento fue repetido dos veces con los mismos resultados. A: Ratones vacunados con el péptido de control (paperas).

B: Ratones vacunados con el péptido de control y tratados con 5-FU . C : Ratones vacunados con la combinación de epítopos del péptido TS . D: Ratones vacunados con la combinación de epítopos del péptido TS y tratados con 5-FU . E: Ratones vacunados con el péptido TS/PP. F : Ratones vacunados con el péptido TS/PP y tratados con 5-FU . Figu ra 7 - La figura muestra los resultados de un estudio anatomopatológico del tejido tumoral obtenido de los animales sacrificados. La fotografía grande muestra una inmunotinción para TS ( IS), mientras que la fotografía pequeña muestra la tinción con hematoxilina y eosina (HES) en la misma muestra. Cada fotografía proviene de un solo animal y es representativa de la condición anatomopatológica encontrada en el grupo de animales que recibieron el mismo tratamiento. A: Ratones vacunados con el péptido de control (paperas). IS: presencia de células tumorales altamente positivas para la expresión de TS ; HES: capa de células tumorales con algunos cuerpos apoptóticos. B: Ratones vacunados con el péptido de control y tratados con 5-FU . IS: Aumento en el número de células tumorales positivas para la expresión de TS; H ES: alteraciones degenerativas en células tumorales y presencia de espacios intercelulares.

C : Ratones vacunados con la combinación de epítopos del péptido TS. IS: raras células tumorales positivas para la expresión de TS y grupos de linfocitos pequeños alrededor de las áreas negativas para TS; HES: numerosos cuerpos apoptóticos, espacios intercelulares y presencia de una reacción desmoplásica. D: Ratones vacunados con la combinación de epítopos del péptido TS y tratados con 5-FU . IS : raras células tumorales TS-positivas y aglomerados de linfocitos pequeños alrededor de las áreas TS-negativas; HES: espacios pseudoquísticos en áreas con cambios degenerativos conspicuos. E : Ratones vacunados con el péptido TS/PP. Raras células TS-positivas y aglomerados de linfocitos pequeños alrededor de las áreas TS-negativas e infiltrando los espacios entre las células tumorales restantes; HES: áreas pseudoquísticas difusas a lo largo del tejido neoplásico. F: Ratones vacunados con el péptido TS/PP y tratados con 5-FU . Casi no hay células TS-positívas y numerosos aglomerados de linfocitos pequeños alrededor de las áreas TS-negativas; HES: aglomeraciones de linfocitos pequeños entre las células; áreas pseudoqu ísticas grandes y difusas a lo largo del tejido neoplásico. MATERIALES Y MÉTODOS Cultivos Celulares. La línea de células de carcinoma mamario M DA-MB-231 , y las l íneas de células carcinoma de colon HT29 y SW-1 463, se compraron en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo (ATCC). La línea de células linfoblastoides CI R-A2 [1 2] fue donada por el Dr. Jeffrey Schlom (EOS, LTIB, NCI, NIH, Bethesda, MD, EUA). Todas las líneas de células tumorales fueron mantenidas en cultivo de la manera previamente descrita [12]. Síntesis peptídica. Los péptidos derivados de TS, TS-1 (TLGDAHIYL) (aa. 19-27 de la SEQ ID NO: 2, correspondiendo a los aa. 245-253 de la TS), TS-2 (YMIAHITGL) (aa. 1-9 de la SEQ ID NO: 2, correspondiente a los aa. 229-237 de la TS) y TS-3 (FLDSLGFST) (aa. 10-18 de la SEQ ID NO: 2, correspondiente a los aa. 111-119 de la TS) y TS/PP (YMIAHITGLFLDSLGFSTTLGDAHIYL) (SEQ ID NO: 2) se sintetizaron químicamente y se caracterizaron de la manera previamente descrita [14]. Los péptidos TS-1, TS-2 y TS-3 se seleccionaron basándose en su fuerte unión con HLA-A(*)02.01 , calculada utilizando el algoritmo sugerido por Parker eí al. [15]. Generación de células dendríticas y cultivos de LTC. Los CMSP se obtuvieron separando la capa leucocitaria en gradientes de Ficoll-Hypaque, o de muestras de sangre tomadas de donadores sanos con el haplotipo HLA-A(*)02.01 y pacientes con cáncer de colon. Las células dendríticas utilizadas para estimular los linfocitos T in vitro, se generaron a partir de CMSP autólogos crecidos en presencia de GM-CSF e interleucina 4, tal como se describió previamente [16]. Las CMSP utilizadas para generar la línea de LTC, se cultivaron de la manera descrita en estudios previos [17], excepto por el hecho de que las células dendríticas empleadas para estimular los LTCs, fueron expuestas a TS/PP durante cuatro horas antes de ser utilizadas para la estimulación (cocultivo de CMSP/LTC). Las células dend ríticas autólogas irradiadas se cargaron con los péptidos y se agregaron al cultivo de linfocitos, para obtener una concentración final de 1 :5 células dendríticas por LTC. Ensayos citotóxicos. La liberación de cromo radioactivo (51 Cr), se ensayó de la manera descrita en estudios previos [1 8]. La expresión de HLA-A(*)02.01 fue inducida por transfección génica en la membrana de células blanco HT29 , antes de cualquier experimento. La lisis específica se calculó de la siguiente manera: Liberación observada - liberación espontánea % de lisis específica = - x 100 Liberación total - liberación espontánea La liberación espontánea se determinó en las placas a las cuales se les agregaron 1 00 µL del medio sin células efectoras. La liberación de radioactividad total fue determinada después de tratar las células blanco con Tritón x-1 00. Las moléculas HLA se bloquearon utilizando un anticuerpo anti-HLA-A2 (A2.69, One Lambda, Inc. , Chanog Park, CA, EUA) o el anticuerpo contra H LA clase I (pan A, B , C) W6.32, el cual se incubó con las células blanco durante una hora antes del ensayo de citotoxícidad . El control negativo fue un anticuerpo monoclonal U PC-1 0. Citofluorometría de flujo. El procedimiento del análisis citofluorométrico de cada tinción , se ha descrito previamente [1 9].

Los anticuerpos conjugados fueron suministrados por Becton Dickinson (San José, CA, EUA), mientras que los anticuerpos W6/32 (contra HLA clase I ), A9 (contra HLA-A2.1 ), COL-1 (anti-CEA) y MOPC-21 , fueron suministrados, respectivamente por Sera (Sussex, I nglaterra), One Lambda, y Cappel/Organon Teckníca Corporation , West Chester, PA, EUA). Las muestras se analizaron utilizando un aparato Becton Dickinson FACScan , equipado con láser azul con un nivel de excitación de 1 5 nW, a 488 nm . Determinación de la frecuencia precursora. El paquete del ensayo de citofluorometría de d ímero y reactivos relacionados, fueron proporcionados por Pharmigen BD, y las pruebas se llevaron a cabo de la manera descrita por el fabricante [20] . Cálculos estadísticos. Las diferencias fueron analizadas estad ísticamente con el software estadístico Stat View (Abacus Concepts, Berkeley, CA, EUA). Los resultados se expresaron como los valores de la media ±DE de cuatro determinaciones hechas en tres diferentes experimentos, y las diferencias se analizaron por medio de una prueba de t de Student de dos colas o por muestras apareadas. Un valor de P menor de 0.05, se consideró como estad ísticamente significativo. RESULTADOS Caracterización inmunológica del péptido poliepitópico Los autores caracterizaron la actividad inmunológica de un nuevo péptido poliepitópico (TS/PP), que contiene en sucesión , la secuencia de aminoácidos de los tres epítopos peptídicos de la enzima TS , conocidos como TS-1 , TS-2 y TS-3 [21 ] , con una porción de unión específica para la molécula HLA-A(*)02.01 . En estudios previos, los autores demostraron que estos péptidos se pueden unir a la molécula HLA-A(*)02.01 utilizando una prueba T2 , que es una técnica citofluorométrica capaz de evaluar indirectamente la unión del péptido a las moléculas HLA sobre las células T2 , lo cual se manifiesta como un incremento en la expresión de estas moléculas en la membrana celular. Cada uno de los tres epítopos peptídícos (TS-1 , TS-2 y TS-3) por lo tanto, se podría utilizar para generar l íneas de LTC específicas de TS in vitro, con actividad antitumoral moderada contra células de carcinoma mamario y de colon . El péptido TS/PP de nueva generación , fue desarrollado al unir las secuencias de aminoácidos de los tres epítopos de TS previamente descritos, en una sucesión no progresiva, dando de esta manera origen a un péptido con una secuencia desconocida. En su forma nativa, el péptido TS/PP de 28 aminoácidos es incapaz de unirse a la molécula HLA-A 0.2.01 en la prueba en células T2, y requiere procesamiento por las células presentadoras de antígeno (por ejemplo, línfocitos B ó células dendríticas), con el fin de dar origen a una respuesta linfocítica multiepitópica específica de TS . Otros análisis del péptido 28américo (TS/PP) utilizando el algoritmo de Ken Parker, reveló que también conten ía secuencias de aminoácidos que pertenecían a otros epítopos potencíales, con porciones de unión específica a otros haplotipos comunes de las moléculas HLA clase I y clase I I (Tabla 1 ).

Tabla 1 apredicho por el algoritmo de Ken Parker; bpredicho por el algoritmo de H .G . Rammensee (H .G . Rammensee, J .

Bachmann , y S. TEvanovic, en el libro "M HC Ligands and Peptide Motifs"). Generación y caracterización de líneas de linfocitos T citotóxicos específicos de TS, utilizando TS/PP Con el fin de evaluar la actividad inmunológica del péptido TS/PP, se generaron varias líneas de LTC. Las CMSP de dos diferentes donadores de HLA-A (02.01 )+ fueron estimuladas cíclicamente con células dendríticas autólogas expuestas a TS/PP (cinco días de cocultivo) y posteriormente se hicieron crecer durante diez d ías en un medio que contenía dosis bajas de interleucina 2 (I L-2), antes de ser estimuladas nuevamente. Los cinco días de cocultivo más diez d ías de estimulación proliferativa con I L-2, representan un ciclo de estimulación in vitro (E lV). Con el propósito de obtener un control comparativo, se generaron líneas de linfocitos T citotóxicos in vitro, utilizando los tres epítopos peptídicos TS-1 , TS-2 y TS-3, partiendo de las CMSP de los mismos donadores y utilizando la misma metodología. Después de 4 ciclos de E lV (dos meses de cultivo), las l íneas de LTC se consideraron suficientemente estables como para ser caracterizadas por inmunocitofluorometría y por funcionalidad (actividad citotóxica).

Procesamiento del antígeno e inmunogenicidad del péptido TS/PP En estudios previos, los autores demostraron que otro péptido trentamérico que contenía múltiples epítopos para el antígeno específico de próstata (AEP), se podían procesar en las membranas de células dendríticas y células blanco, para formar péptidos epitópicos individuales. Este oligopéptido de AEP se pod ía utilizar para generar l íneas de linfocitos específicos de AEP multiepitópicos, mostrando actividad antitumoral en modelos humanos in vitro, y después se pod ían utilizar para dar origen a una respuesta linfocítica específica de AEP , en ratones transgénicos que expresaban la molécula HLA-A(*)02.01 [22]. Sin embargo, no quedó claro si estos resultados se podían extrapolar a otros sistemas. Los autores ahora estudiaron el procesamiento de TS/PP en células blanco y evaluaron su capacidad para dar origen a una ° respuesta de LTC específica de TS multiepitópica, in vitro. Después, los autores investigaron si las células blanco CI R-A2 cargadas con el péptido TS/PP , eran reconocidas, en pruebas de cítotoxicidad , por las l íneas de LTC generadas utilizando cada uno de los tres epítopos peptídicos de la enzima TS (TS-1 , TS-2 y TS-3). Los autores observaron que cada una de estas líneas linfocíticas, era capaz de matar las células blanco expuestas a TS/PP. En este experimento, las células CI R-A2 cargadas con el mismo péptido epitópíco (TS-1 , TS-2, TS-3) que el utilizado para generar la l ínea de LTC examinada , o transfectadas con un plásmido que conten ía el gen TS (pcTS), se utilizaron como controles positivos. Las células CI R-A2 no expuestas a ningún agente, o expuestas a péptídos no relacionados con TS, o transfectadas con un marco estructural de plásmido (pcDNA3), se utilizaron como controles negativos (Figura 1 y datos no mostrados). Los resultados de estos experimentos, demostraron que las tres l íneas de LTC (T-TS-1 , T-TS-2, T-TS-3) eran capaces de destruir las células blanco expuestas al TS/PP y los controles positivos (Figura 1 A, pero no eran capaces de destruir los controles negativos. Estos resultados sugieren que el TS/PP es procesado por las células blanco CI R-A2 , las cuales, posteriormente, son capaces de exponer los epítopos derivados unidos a HLA-A(*)02.01 , permitiendo de esta manera su reconocimiento por los LTCs específicos del epítopo. Como se describió previamente, se utilizó TS/PP para generar líneas de LTC partiendo de donadores HLA-A02.01 + ; estos LTCs, designados como T3939/TS/PP y T4756/TS/PP, tuvieron los siguientes inmunofenotipos: CD3+=90-95% ; CD56+ = 1 0-22% , CD4+ = 37-40% ; CD8+=40-50% . Estas líneas de linfocitos también tuvieron actividad citol ítica multiepitópica, por lo que fueron capaces de destruir células blanco CI R-A2 individualmente expuestas a cada uno de los tres epítopos conocidos de la TS , y también fueron capaces de destruir las células blanco cargadas con TS/PP o transfectadas con el plásmido anteriormente mencionado que contenía el gen TS . Sin embargo, los mismos LTCs fueron incapaces de matar las células blanco utilizadas como control negativo (Figura 1 B). Estos datos indican que el péptido TS/PP también puede ser procesado por células dendríticas y se puede utilizar para estimular, in vitro, una respuesta de linfocitos T citotóxicos específica de TS y multiepitópica. Actividad anti-tumoral de las líneas de linfocito T citotóxicos generadas utilizando TS/PP La actividad l ítica de las l íneas de LTC generadas utilizando TS/PP se examinó contra células de carcinoma mamario de colon HLA-A(*)02.01 J Los autores también ensayaron la actividad l ítica de las l íneas de LTC generadas utilizando TS/PP contra las mismas células blanco tumorales, después de un tratamiento con dosis subletal de 5-FU . Los autores también compararon la actividad citotóxica contra las mismas células blanco tumorales de las líneas de LTC generadas utilizando TS/PP, con aquella de las l íneas generadas utilizando los epítopos peptídicos individuales TS-1 , TS-2 y TS-3.

Las pruebas citotóxicas llevadas a cabo utilizando la técnica de liberación 51 Cr, se llevaron a cabo utilizando células blanco provenientes de l íneas celulares derivadas de carcinoma mamario (M DA-M B-231 ) y de carcinoma de colon (HT-29 y SW-1 463), antes y después de un tratamiento con dosis subletales de 5-FU . Las células HT-29 no expresan de manera constitutiva HLA-A(*) 02.01 y, de esta manera, se utilizaron como blanco después de ser transfectadas con el gen HLA-A(*)02.01 . Los autores demostraron que las l íneas de LTC generadas utilizando TS/PP, fueron capaces de matar las células M BA-MB-231 (Figure 2), las células HT29 transfectadas con el gen HLA-A(*)02.01 y las células SW-1463 (Figura 3). La actividad l ítica de los LTCs se restringió a las moléculas HLA-A(*)02.01 + , debido a que se eliminó al bloquear los anticuerpos (A2.69 y W6.32), y también debido a que los LTCs eran incapaces de matar las células blanco HT29 no transfectadas con H LA 02.01 , o transfectadas con el armazón estructural del plásmido. La actividad anti-tumoral de las l íneas de LTC generadas utilizando el péptído TS/PP, fue significativamente mayor que la de las tres líneas de LTC generadas utilizando los péptidos epitópicos de la enzima TS ( Figuras 2 y 3). Estudios recientes encontraron que la expresión de TS es modulada por sus cofactores y por los niveles de sustrato y, por lo tanto, después de la inhibición inducida por los metabolitos de 5-FU en células tumorales, la expresión de su gen se incrementa significativamente (datos no mostrados en las figuras) [23]. Por lo tanto, los autores investigaron si el tratamiento con 5-FU podría sensibilizar células de cáncer mamario y de cáncer de colon a la actividad l ítica inducida por LTCs específicos de TS . Con el uso de las mismas pruebas de citotoxicidad anteriormente descritas, los autores demostraron que, cuando se exponen a dosis subletales de 5-FU durante 48 horas, las mismas células tumorales de carcinoma mamario y de colon fueron significativamente más sensibles a la actividad citotóxica de los LTCs generados utilizando TS/PP y/o los otros epítopos de la enzima TS . La actividad lítica de los LTCs contra las células blanco tratadas con 5-FU , siempre se restringió a moléculas HLA clase I , debido a que se reducía o resultaba eliminada durante el uso de un anticuerpo bloqueador (A2.69). También en este caso, la actividad l ítica de las l íneas linfocíticas generadas utilizando TS/PP, fue mayor que aquella de las líneas linfocíticas generadas con el uso de los epítopos peptídicos individuales TS-1 , TS-2 y TS-3 (Figuras 2 y 3). La viabilidad de las células blanco expuestas a 5-FU , se examinó por medio de una cuenta hemocitométrica después de una tinción y nunca fue menor del 90% , excluyendo de este modo la posibilidad de que la inmunosensibilización se debiera al gran número de células muertas o ya degeneradas en el ensayo de citotoxicidad .

Los análisis citofluorométrico y de inmunoblot de las células blanco, demostraron que el tratamiento con 5-FU no indujo ningún cambio en la expresión de H LA clase I , pero fue capaz de inducir un incremento significativo en la expresión de TS en las células blanco M DA-MB-231 , HT-29 y SW-1 463 (datos no mostrados). La lisis mediada por L TC de células de carcinoma mamario y de colon, está condicionada por la presencia de epítopos peptídicos de la enzima TS En un intento por demostrar que la actividad citolítica de los linfocitos generados utilizando TS/PP contra células tumorales de carcinoma mamario y de colon es un fenómeno específico de la interacción entre TS y moléculas HLA-A(*)02.01 , los autores realizaron ensayos de competencia de antígeno frío, llevando a cabo pruebas de citotoxicidad en las cuales las células CI R-A2 expuestas a TS/PP (marcadas con 51 Cr) se utilizaron como blanco de los efectores LTC y las células de carcinoma de colon HT29 transfectadas con HLA-A(*)02.01 , o transfectadas y subsecuentemente expuestas a dosis subletales de 5-FU , se utilizaron como competidores fríos (no marcados). En las pruebas de citotoxicidad , las células blanco y los competidores fríos se utilizaron en diferentes relaciones de L/C. Estos experimentos demostraron que la lisis mediada por LTC de las células CI R-A2 cargadas con TS/PP, se redujo mediante la adición de los competidores fríos, en las pruebas de citotoxicidad , y se abolió por completo cuando la relación L/C alcanzaba el valor de 1 /5. Si se agregaban competidores tratados con 5-FU a la prueba de citotoxicídad , la lisis mediada por LTC de las células blanco (células CI R-A2 cargadas con TS/PP), ocurría a una relación de L/C cinco veces menor ( 1 /1 ) ( Figura 4). Se han obtenido resultados similares previamente, con el uso de células de carcinoma mamario M DA-MB-231 (datos no mostrados). Los resultados de estos experimentos sugieren que las l íneas linf?cíticas generadas utilizando TS/PP reconocen (en la membrana de las células CI R-A2 cargadas con TS/PP y en las células tumorales), los mismos epítopos peptídicos unidos a moléculas HLA-A(*)02.01 que aquellos contenidos en la secuencia TS/PP. Estos resultados sugieren que la inmunosensibilización inducida por 5-FU , está relacionada con un aumento en la producción de TS y, por lo tanto, con una mayor accesibilidad de los epítopos peptídicos a las moléculas HLA, como consecuencia directa de la regulación excesiva de TS en el citoplasma de las células blanco. Estudio in vivo de ratones manipulados por ingeniería genético para expresar moléculas HLA-A(*)02.01 Los autores examinaron las actividades inmunológica , toxicológica y anti-tumoral de TS/PP en ratones transgénicos (H H D) manipulados por ingeniería genética para expresar moléculas HLA-A(*)02.01 . Los autores también compararon las actividades inmunológicas, toxicológica y antitumoral de TS/PP con aquellas inducidas por una combinación de los tres epítopos peptídicos conocidos a TS (TS-1 , TS-2 y TS-3). En este estudio, seis grupos de cinco ratones recibieron diferentes tratamientos inmunológicos con o sin tratamiento quimioterapéutico con 5-FU . A los ratones de los grupos A y B se les administró un péptido de control derivado del virus de las paperas ( 1 00 µg por ratón); a los ratones de los grupos C y D se les administró una combinación de los péptidos TS-1 , TS-2 y TS-3 ( 1 00 µg por ratón); y a los ratones de los grupos E y F se les administró el péptido TS/PP ( 1 00 µg por ratón). Los ratones recibieron la primera administración del péptido por vía subcutánea en el tiempo 0, con refuerzos en la tercera y sexta semana. Dos semanas después de la última administración, a todos los animales se les inoculó por vía subcutánea 2x1 06 células EL-4/H HD. Antes de la inoculación de las células EL-4/H HD, células linfoblásticas autólogas para ratones HH D que expresan haplotipo HLA-A(*)02.01 fueron probadas con respecto a la expresión endógena de TS y HLA, por medio de pruebas citofluorométricas, que revelaron una baja expresión constitutiva de TS murina (35% ). Sin embargo, esta expresión se pod ía incrementar significativamente mediante un tratamiento con dosis subletales de 5-FU (hasta 55-70%). Con el fin de evaluar la posible interacción entre TS y el tratamiento con 5-FU para propósitos de vacunación , siete d ías después de la inoculación de células tumorales, los ratones de los grupos B , D y F fueron sometidos a un tratamiento quimíoterapéutico basado en la administración intraperitoneal semanal de 5-FU ( 1 00 µg/ml por ratón). Los resultados del estudio demostraron que el tratamiento con TS/PP retrasó significativamente el tratamiento neoplásico, mientras que cuando el tratamiento TS/PP además inclu ía un tratamiento quimioterapéutico, la mayoría de los ratones se curó (Figuras 5 y 6). Por el contrario, la quimioterapia por sí sola y el tratamiento con la combinación de epítopos de TS , con o sin quimioterapia, no alteró el crecimiento neoplásico de ninguna manera . De hecho, 30 d ías después de la inoculación de células tumorales, los ratones de los grupos A, B, C y D (tratados con el péptido de control o con la combinación de péptidos +/-quimioterapia) desarrolló una gran masa tumoral y su condición cl ínica declinó con rapidez; por esta razón , fueron sacrificados. El efecto anti-tumoral más evidente, se observó en el grupo de ratones tratados con TS/PP. Algunos de estos ratones empezaron a desarrollar un tumor pequeño sólo 35-40 d ías después de la inoculación, tiempo para el cual los ratones control tratados o no con 5-FU ya habían muerto de la enfermedad , o habían sido sacrificados. El efecto anti-tumoral de la vacuna TS-PP fue incluso más eficiente en ratones que habían recibido un tratamiento con 5-FU . De hecho, en este grupo, la masa tumoral estuvo total mente ausente en 3 de 5 ratones. En los ratones de este grupo que desarrollaron un tumor, la masa no se adhirió al tejido subcutáneo ni a la fascia muscular, y se podrían remover radicalmente por cirugía. En este caso, el ratón podría mantenerse vivo y podría permanecer en buenas condiciones sin ningún signo patológico adicional por otros 30 d ías, cuando fueran sacrificados para los estudios ¡nmunológicos y anatomopatológicos. La actividad anti-tumoral de los esplenocítos derivados de los ratones vacunados con TS/PP o la combinación de péptidos, y después sacrificados, se demostró en pruebas de citotoxicidad (51 Cr) contra células EL-4/HHD (datos no mostrados en la figura). La citofluorometría dimérica de los ratones vacunados con TS/PP o la combinación de los tres péptidos, demostró una inmunización específica efectiva contra los tres epítopos de la enzima TS. TABLA 2: TRATAMIENTOS EN RATONES Los resultados se expresan como el porcentaje de CD8+/péptido dimérico específico* (PE/d ímero) en relación con la fluorescencia promedio por célula. Los números entre paréntesis corresponden a las desviaciones estándar. El estudio anatomopatológico del tejido tumoral de los animales del grupo control , reveló una expresión moderada de TS en las células neoplásicas, la cual fue incrementada por el tratamiento quimioterapéutico. Sin embargo, aunque capaz de incrementar la necrosis y la apoptosis, esta última no tuvo ningún efecto significativo sobre el crecimiento tumor, mientras que la vacunación con la combinación de epítopos de TS o TS/PP, produjo una significativa infiltración linfocítica y una reducción o desaparición de las células tumorales que expresaban TS. El tratamiento combinado con TS/PP y quimioterapia , no sólo produjo la desaparición de TS de las células neoplásicas, sino que también la destrucción inmunorregulada del tejido tumoral , el cual era rico en pseudoquistes degenerativos e infiltración linfocítica (Figura 7). El estudio anatomopatológico de órganos tales como pulmones, h ígados, vaso, ríñones y cerebro, piel y mucosa , no reveló ningún signo de degeneración o autoinmunidad en ninguno de los grupos examinados. Todos estos resultados sugieren que TS/PP es capaz de inducir una respuesta mediada por las células con una potente actividad anti-tumoral in vivo que es mejor que la inducida por la combinación de TS1 , TS2 y TS3. TS/PP funciona mejor sí es administrado de manera concomitante con un tratamiento con 5-FU . Por lo tanto, el 5-FU por sí solo no puede regular el crecimiento tumoral pero, en sinergia con TS/PP, tiene una potente actividad inmunosensíbilizante en células blanco, debido a su modulación de TS.

Además, los resultados obtenidos no indican ningún fenómeno de autoinmunidad o toxicidad, inducido por el tratamiento con TS/PP, en ausencia de efectos secundarios. REFERENCIAS 1. Van der Wilt CL, Peters GJ, Pharm World Sci 1994; 84- 103 2. Chu E, Allegra CJ. Bioassay 1996; 18:191-1968. 3. Parsel LA, Chu E.. Cáncer J Sci Am 1998: 4:287-295. 4. Ju J, Pedersen.Lane J, Maley F, Chu E. Proc Natl Acad Sci 1999; 96; 3769-3774. 5.6. Chu E, Mota AC, Fogarasi MC (2001) Antimetabolites. In: De Vita V, Hellman S, Rosenberg SA. Cáncer Principies and Practice of Oncology. 6th Edition. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins pg.388-415. 7. Van der Wilt CL, Peters GJ. Pharm World Sci 1994; 84- 103. 8. Peters GJ, Jansen G. Resistence to antidetabolites. In: Schilsky RL, Milano GA, Ratain MJ, eds. Principies of Antineoplastic Drug Development and Pharmacology. New York: Marcel Dekker, Inc. 1996:543-585 9. Landis DM, Loeb LA. J. Biol Chem 1998; 273:31209-31214. 10. Chu E, Mota AC, Fogarasí MC (2001) Antimetabolites. In: De Vita V, Hellman S, Rosenberg SA. Cáncer Principies and Practice of Oncology. 6th Edition. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins pg.388-415. 11. Storkus WJ, Howell DN, Salter RD, et al. J. Immunol. 1987; 138:1657-9. 12. Corréale P, Aquino A, Pellegrini M, et al. Int J Cáncer in Press, 2003 13. Corréale P, Sabatino M, Cusi MG, et al. J Chemother, Oct;13(5):519-526,2001 14. Parker, K. C, Bednarek, M. A. y E. Coligan. J Immunol 152:163-175, 1994. 15. Francini G, Scardino A, Kosmatopoulos K, et al. J.

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Claims (1)

1. REIVINDICACION ES 1 . Un péptido multiepitópico que consiste de la secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 9 al aminoácido 27 de la SEQ I D NO: 2 y del aminoácido 1 al aminoácido 9 de la SEQ I D NO: 2 y del aminoácido 1 0 al aminoácido 18 de la SEQ I D NO: 2, para uso médico. 2. El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , que consiste en la secuencia YM IAH ITGLFLDSLGFSTTLGDAH IYL (SEQ I D NO: 2). 3. Un péptido que tiene la secuencia YM IAH ITGLFLDSLGFSTTLGDAH IYL (SEQ I D NO: 2). 4. Un vector que incluye y es capaz de expresar de manera eficaz en una célula eucariótica, una secuencia de nucleótidos que codifica para el péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes. 5. El vector de conformidad con la reivindicación 4, cuya secuencia de nucleótidos es TACATGATTGCGCACATCACGGGCCTGTTTTGGACAGCCTGGGATTC TCCACCACTTTGGGAGATGCACATATTTACCTG (SEQ I D NO: 1 ). 6. Una composición farmacéutica con actividad anti-tumoral preventiva, que incluye una cantidad farmacéuticamente efectiva del péptido de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3, y excipientes y/o diluyentes y/o agentes solubilizantes apropiados. 7. Una composición farmacéutica con actividad quimioterapéutica, que incluye una cantidad farmacéuticamente efectiva del péptido de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3, y excipientes y/o diluyentes y/o agentes solubilizantes apropiados. 8. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, que incluye otro fármaco con actividad anti-tumoral . 9. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, en donde el otro ingrediente con actividad antitumoral el 5-fluorouracilo. 10. Un método para obtener linfocitos T citotóxicos (LTCs) in vitro, activados para TS, que incluye los siguientes pasos: a) tomar células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de un sujeto y cultivarlas in vitro; b) estimular in vitro las CMSP, exponiéndolas a células dendríticas autólogas irradiadas previamente expuestas por un tiempo oportuno a concentraciones eficaces del péptido de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3. 1 1 . Linfocitos T citotóxicos activados para TS, que se obtienen por medio de conformidad con la reivindicación 10. 12. El uso de los linfocitos T citotóxicos activados para TS de conformidad con la reivindicación 1 1 , para inmunoterapia.