MX2007006478A - Ensayo de inmunoabsorcion con enzimas ligadas de alto rendimiento (ht-elisa) para identificar un modulador de la quinasa rho (rok). - Google Patents
Ensayo de inmunoabsorcion con enzimas ligadas de alto rendimiento (ht-elisa) para identificar un modulador de la quinasa rho (rok).Info
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Abstract
La invencion se refiere a un ensayo para medir la actividad de una proteina ROK (quinasa Rho) mediante un peptido biotinilado.
Description
ENSAYO DE INMUNOABSORCIÓN CON ENZIMAS LIGADAS DE ALTO RENDIMIENTO (HT-ELISA) PARA IDENTIFICAR UN MODULADOR DE LA QUINASA RHO (ROK)
La invención se refiere a un ensayo para medir la actividad de una proteína ROK (quinasa Rho) mediante un péptido biotinílado. La ¡nvención se refiere a un ensayo para identificar un compuesto que modula (estimula, disminuye, mantiene) la actividad de la proteína ROK, en el que a] se proporciona un péptido que puede ser fosforilado por la proteína ROK; b] se proporciona la proteína ROK; c] se proporciona un anticuerpo que puede reconocer el péptido de a] si este péptido esta fosfoplado; d] se proporciona un compuesto químico; e] el péptido de a] se incuba con la proteína ROK de b] así como con el compuesto químico de d] en condiciones que permitan la fosforilación del péptido; f] el anticuerpo de c] se usa después de terminar la incubación realizada según e] para detectar la fosforilación del péptido; g] el resultado de f] se puede comparar con el resultado de un experimento en el que la incubación del péptido de a] con la proteína ROK se lleva a cabo sin tener presente compuesto químico según d].
Dicho ensayo se puede llevar a cabo fácilmente en un formato ELISA o RÍA (radioinmunoensayo). El péptido de la etapa a] con respecto al ensayo descrito antes, puede consistir en un tamaño entre 15 y 25 aminoácidos. Este péptído puede comprender o consistir en la siguiente secuencia de aminoácidos: GGGGAKRRRLSSLRASTS. El péptido de acuerdo con la etapa a] del ensayo se puede usar en una forma químicamente modificada, como por ejemplo, biotinilado o unido a un ADN o anticuerpo. La proteína ROK de la etapa b] con respecto al ensayo descrito antes, puede comprender la secuencia de aminoácidos de la correspondiente proteína humana o se puede obtener o coger de material biológico humano. Dicha proteína ROK se puede fabricar por diferentes técnicas, como por ejemplo, por un procedimiento que tenga incluido material biológico o etapas de elaboración de naturaleza recombinante. El ensayo de la invención como se ha descrito antes se puede usar, por ejemplo, para un cribado de alto rendimiento de un compuesto que modula la actividad de la proteína ROK. La invención también se refiere a un kit de partes que comprende a] un péptido que puede ser fosforilado por la proteína ROK; b] proteína ROK; c] un anticuerpo que puede reconocer el péptido de a] si este péptido esta fosforilado; d] posiblemente un segundo anticuerpo que puede reconocer el
anticuerpo de c] y/o se une a un sistema marcador (p. ej., fosfatasa alcalina, ß-glucuronidasa, peroxidasa, otra enzima); e] posiblemente reactivos, tampones y/o equipo para realizar la fosforilación del péptido de a] y/o una preparación de ELISA. El péptído de la etapa a] con respecto al kit de partes mencionado antes consiste en un tamaño entre 15 y 25 aminoácidos. Este péptido puede comprender o consistir en la siguiente secuencia de aminoácidos: GGGGAKRRRLSSLRASTS. El péptido de acuerdo con la etapa a] del ensayo se puede usar en una forma químicamente modificada, como por ejemplo, biotinilado o unido a un ADN o un anticuerpo. La proteína ROK de la etapa b] con respecto al ensayo descrito antes puede comprender la secuencia de aminoácidos de la correspondiente proteína humana o se puede obtener o coger de material biológico humano. Dicha proteína ROK se puede fabricar por diferentes técnicas, como por ejemplo, por un procedimiento que tenga incluido material biológico o etapas de elaboración de naturaleza recombinante. La invención se refiere además a la fabricación de un kit de partes como se ha mencionado antes, en el que a] se proporciona un péptido que puede ser fosforilado por la proteína ROK; b] se proporciona la proteína ROK; c] se proporciona un anticuerpo que puede reconocer el péptido de a] si este péptido esta fosforilado;
d] se proporciona posiblemente un segundo anticuerpo que puede reconocer el anticuerpo de c] y/o se une a un sistema marcador (p. ej., fosfatasa alcalina, ß-glucuronidasa, peroxidasa, otra enzima); e] se proporcionan posiblemente reactivos, tampones y/o equipo para realizar la fosforilación del péptido de a] y/o una preparación de ELISA. f] los compuestos de a] a e] se empaquetan en consecuencia y se combinan con un protocolo que menciona en el mismo, entre otras cosas, los componentes del kit de partes así como las etapas de procedimiento para el ensayo de proteína ROK resultante. El kit de partes mencionado antes se puede usar, por ejemplo, para determinar la actividad de una proteína ROK, o para identificar un componente que modula la actividad de una proteína ROK, o para el cribado de alto rendimiento. La invención se refiere además a un péptido que comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácidos: GGGGAKRRRLSSLRASTS.
Dicho péptido puede estar químicamente modificado, como p. ej. biotinilado.
La invención se refiere también al uso de dicho péptido para medir la actividad de una proteína ROK. Un compuesto químico en el contexto de esta invención significa cualquier compuesto orgánico y/o de tipo carbohidrato que se produce por síntesis química o se aisla de una fuente natural. Dicho compuesto puede tener un peso molecular entre 50 y 50.000 Dalton. Una proteína se considerará como funcional en el contexto de
esta invención cuando está en un estado para realizar una actividad en un contexto biológico, en particular como parte de una célula viva. Dicha actividad se puede detectar, por ejemplo, por un ensayo. Un transportador es funcional por ejemplo cuando este transportador mueve un compuesto, en particular el sustrato biológico del transportador, del exterior de una célula al compartimiento interior de esta célula o viceversa. Un sustrato biológico de una proteína transportadora de iones consiste, por ejemplo, en un ¡ón monovalente y/o uno divalente u otros iones. El sustrato de una proteína transportadora de glucosa es, por ejemplo, glucosa. El sustrato de una proteína de resistencia a múltiples fármacos es, por ejemplo, un fármaco solo o conjugado con glutatión o gluconato. El experto en la técnica puede manejar las proteínas en el contexto de esta invención, aplicando los correspondientes protocolos de "Current Protocols in Protein Science" publicado por John Wíley & Sons (editado por: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L., Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield; 0-471 -11184-8-Looseleaf; 0-471 -14098-8-CDROM). El experto en la técnica puede manejar las técnicas relacionadas con la biología molecular tales como, por ejemplo, clonación, transformación de células, secuenciación, promotores de modificación, proteínas de expresión u otros, aplicando los correspondientes protocolos de "Current Protocols in Molecular Biology" publicado por John Wiley & Sons (editado por: Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, J.G.
Seídman, John A. Smith, Kevin Struhl; 0-471 -50338-X-Looseleaf; 0-471-306614CDROM). Material biológico significa cualquier material que contiene información genética y se puede reproducir por sí mismo o puede ser reproducido en un sistema biológico. Material biológico recombinante es cualquier material biológico que se ha producido, se ha cambiado o modificado mediante técnicas recombinantes. Las técnicas recombinantes se definen en libros de texto tales como, p. ej., "Current Protocols in Molecular Biology", publicado por John Wiley & Sons; ISBN: 0471-50338-X-Looseleaf o 0-471 -30661 -4-CD-ROM". El experto en la técnica puede manejar células biológicas aplicando los protocolos adecuados de "Current Protocols in Cell Biology" publicado por John Wiley & Sons (editado por: Juan S. Bonifacíno, Mary Dasso, Jennifer Lippincott-Schwartz, Joe B. Harford, Kenneth M. Yamada; 0-471-24108-3-Looseleaf; 0-471 -24105-9-CDROM). Ejemplos La quinasa rho (ROK) representa un objetivo bien confirmado para las enfermedades cardiovasculares. Por lo tanto, la búsqueda de inhibidores de ROK específicos es el centro de muchos grupos de trabajo del área cardiovascular. Aquí se describe el desarrollo de un ELISA específico para la actividad de la ROK. El ELISA para ROK detecta la cantidad de un péptido fosforilado por ROK. Los inhibidores de ROK inhiben la actividad de la
ROK y de esta forma reducen la cantidad de fosforilación de péptido mediada por ROK. El ELISA para ROK se desarrolló en un formato de 96 pocilios de rendimiento medio así como en un formato de 384 pocilios de alto rendimiento. Protocolo: Soluciones madre: Péptido S6 biotinilado: se almacena a -20°C en partes alícuotas de 1 ml en tampón Tris 25 mM pH 8,0 (5 mg/ml) ROK activa recombinante: se almacena a -20°C en partes alícuotas de 10 µl (1 mg/ml)
1) Revestimiento de pocilios revestidos de estreptavidina con el péptido S6 biotinilado 0,5 ng/pocillo durante 2 horas o durante una noche a temperatura ambiente 2) Lavado triple del exceso de péptido S6 con PBS 100 µl/pocillo 3) Preparación de una solución de ATP 10 x en la concentración deseada en el tampón de reacción con MgCI2 en hielo 4) Se diluye ROK en el tampón de reacción en hielo, concentración final: 10 ng/pocillo 5) Se prepara una solución de sustancia 10 x en la concentración deseada Formato de 96 pocilios de ELISA para ROK Volumen total = 100 µl 1 ) Preincubación de los inhibidores (10 µl de una solución concentrada 10 x) en las concentraciones finales deseadas 80 µl de ROK durante 10 minutos 2) Se añaden 10 µl de ATP de una solución concentrada de ATP 10 x en la concentración final deseada 3) Se incuba la placa durante 1 hora a 30°C 4) Se para la reacción de la quinasa con 100 µl de una solución de EDTA 500 mM 5) Se separa el líquido sobrenadante de todos los pocilios 6) Se añaden 100 µl/pocillo de anticuerpo fosfoespecífico monoclonal primario (1 :1000) y se incuba durante 15 minutos a temperatura
ambiente 7) Se añaden 100 µl/pocillo de un anticuerpo secundario (1 :2000) y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente 8) Se separa el líquido sobrenadante y se lava 5 veces con PBS 200 µl/pocillo 9) Se añaden 100 µl de solución de sustrato a todos los pocilios y se incuban durante 10 minutos a temperatura ambiente 10) Se añaden 100 µl de solución de parada a todos los pocilios 11) Se mide la DO a 492 nm Formato de 384 pocilios de ELISA para ROK Volumen total = 10 µl 1) Preincubación de los inhibidores (1 µl de una solución concentrada 10 x) en las concentraciones finales deseadas con 8 µl de ROK durante 10 minutos 2) Se añade 1 µl de ATP de una solución concentrada de ATP 10 x en la concentración final deseada 3) Se incuba la placa durante 1 hora a 30°C 4) Se para la reacción de la quinasa con 10 µl de una solución de EDTA 500 mM 5) Se separa el líquido sobrenadante de todos los pocilios 6) Se añaden 10 µl/pocillo del anticuerpo fosfoespecífico monoclonal primario (1 :1000) y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente
7) Se añaden 100 µl/pocillo de un anticuerpo secundario (1 :2000) y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente 8) Se separa el líquido sobrenadante y se lava 5 veces con PBS 30 µl/pocillo 9) Se añaden 10 µl de solución de sustrato a todos los pocilios y se incuban durante 10 minutos a temperatura ambiente 10) Se añaden 10 µl de solución de parada a todos los pocilios 11) Se mide la DO a 492 nm. Material ROK (ROKa/ROCK-ll (aa recombinante activo de 11-550 o más largo), Péptido S6 biotinilado (Biotína-GGGGARRRLSSLRASTS), Placas de 96 ó 384 pocilios revestidos con estreptavidina (p. ej. Roche StreptaWell, High Bind (transparente) 1989685/1989677, Roche Diagnostics, Mannheim), Anticuerpo fosfoespecífico monoclonal de Transduction Labs (clon 22a, BD Biosciences, Heidelberg), IgG-HRP anti-ratón de cabra 200 µg/0,5 ml (Santa Cruz Cat. n° sc-2005). Descripción de las Figuras: La fig.: 1 representa la secuencia de aminoácidos de acuerdo con el ID SEC N°. 1. La fig.: 2 representa una disposición típica para el ELISA para ROK
Las filas H 1-6 sirven como pocilios de control para la reacción de la quinasa. Los pocilios de las filas H1-3 no tenían quinasa y tenían ATP y representan la señal mínima. Los pocilios de las filas H4-6 tenían quinasa y ATP y representan el señal máxima. Los pocilios de las files H7-12 servían para la relación de concentración para el compuesto de referencia. Todos los demás pocilios se usaron para obtener una relación de concentración para el compuesto de interés. Por favor, obsérvese el color pálido de los pocilios de las filas E1-7 que indica que un inhibidor muy potente inhibió la fosforilación del sustrato mediada por ROK en todo el intervalo de concentraciones usado. En el caso del cálculo de CI50 con un solo punto de determinación, se pueden ensayar al mismo tiempo 14 compuestos más un compuesto de referencia en el formato de 96 pocilios. Las fig.: 3 y 4 A y B ¡lustran los resultados (% de inhibición y cálculo de CI50) del ELISA para ROK
Claims (22)
1.- Ensayo para identificar un compuesto que modula la actividad de la proteína ROK, en el que a] se proporciona un péptido que puede ser fosforilado por la proteína ROK b] se proporciona la proteína ROK; c] se proporciona un anticuerpo que puede reconocer el péptido de a] si este péptido está fosforilado; d] se proporciona un compuesto químico; e] el péptido de a] se incuba con la proteína ROK de b] así como con el compuesto químico de d] en condiciones que permitan la fosforilación del péptido; f] el anticuerpo de c] se usa después de terminar la incubación realizada según e], para detectar la fosforilación del péptido; g] el resultado de f] se puede comparar con el resultado de un experimento en el que la incubación del péptido de a] con la proteína ROK de b], se lleva a cabo sin tener presente compuesto químico según d].
2.- Ensayo según la reivindicación 1 , en el que la incubación según las etapas e], f] y g] se lleva a cabo como ensayo ELISA.
3.- Ensayo según la reivindicación 1 , en el que la incubación según las etapas e], f] y g] se lleva a cabo como ensayo RÍA.
4.- Ensayo según las reivindicaciones 1 a 3, en el que el péptido según la etapa a] tiene un tamaño de 15 a 25 aminoácidos.
5.- Ensayo según las reivindicaciones 1 a 4, en el que el péptido según la etapa a] tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: GGGGAKRRRLSSLRASTS.
6.- Ensayo según la reivindicación 5, en el que el péptido está biotinilado.
7.- Ensayo según a una o más de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la proteína ROK es de ser humano.
8.- Ensayo según a una o más de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteína ROK se ha fabricado de forma recombinante.
9.- Uso de un ensayo según una o más de las reivindicaciones 1 a 8, para el cribado de alto rendimiento de un compuesto que modula la actividad de la proteína ROK.
10.- Kit de partes que comprende a] un péptido que puede ser fosforilado por la proteína ROK; b] proteína ROK; c] un anticuerpo que puede reconocer el péptido de a] si este péptido esta fosforilado; d] posiblemente un segundo anticuerpo que puede reconocer el anticuerpo de c] y/o se une a un sistema marcador; e] posiblemente reactivos, tampones y/o equipo para realizar la fosforilación del péptido de a] y/o una preparación de ELISA.
11.- Kit de partes según la reivindicación 10, en el que el péptido de a] tiene un tamaño de 15 a 25 aminoácidos.
12.- Kit de partes según las reivindicaciones 10 u 11 , en el que el péptido de a] tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: GGGGAKRRRLSSLRASTS.
13.- Kit de partes según la reivindicación 12, en el que el péptido está biotínilado.
14.- Ensayo según una o más de las reivindicaciones 10 a 13, en el que la proteína ROK es de ser humano.
15.- Ensayo según a una o más de las reivindicaciones 10 a , en el que la proteína ROK se ha fabricado de forma recombinante.
16.- Fabricación de un kit de partes según las reivindicaciones a 15, en el que a] se proporciona un péptído que puede ser fosforilado por la proteína ROK; b] se proporciona la proteína ROK; c] se proporciona un anticuerpo que puede reconocer el péptido de a] si este péptido esta fosforilado; d] se proporciona posiblemente un segundo anticuerpo que puede reconocer el anticuerpo de c] y/o se une a un sistema marcador; e] se proporcionan posiblemente reactivos, tampones y/o equipo para realizar la fosforilación del péptido de a] y/o una preparación de ELISA; f] los componentes de a] a e] se empaquetan como corresponde y se combinan con un protocolo que menciona en el mismo, los componentes del kit de partes así como las etapas de procedimiento para el ensayo de proteína ROK resultante.
17.- Uso de un kit de partes según las reivindicaciones 10 a , para determinar la actividad de una proteína ROK.
18.- Uso de un kit de partes según las reivindicaciones 10 a 16, para identificar un compuesto que modula la actividad de una proteína ROK.
19.- Uso de un kít de partes según las reivindicaciones 10 a 16, para el cribado de alto rendimiento.
20.- Péptido que consiste en la siguiente secuencia de aminoácidos: GGGGAKRRRLSSLRASTS.
21.- Péptido de la reivindicación 21 que está biotinilado.
22.- Uso de un péptido según las reivindicaciones 20 a 21 , para medir la actividad de una proteína ROK.
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