JP5001167B2 - Rhoキナーゼ(rok)調節物質を同定するための、ハイスループット酵素免疫吸着アッセイ法(ht−elisa) - Google Patents
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Description
a)ROKタンパク質によりリン酸化を受けることができるペプチドを準備し;
b)ROKタンパク質を準備し;
c)a)からのペプチドがリン酸化されていた場合にこのペプチドを認識することができる抗体を準備し;
d)化学的化合物を準備し;
e)a)からのペプチドを、このペプチドのリン酸化を可能にする条件下で、b)からのROKタンパク質およびd)からの化学的化合物と共にインキュベーションし;
f)e)に従って行ったインキュベーションが終了した後、c)からの抗体をこのペプチドのリン酸化を検出するために使用し;
g)f)からの結果を、場合により、d)からの化学的化合物を存在させないでa)からのペプチド、b)からのROKタンパク質のインキュベーションを行った試験からの結果と比較する、
各工程を含む。
a)ROKタンパク質によりリン酸化を受けることができるペプチド;
b)ROKタンパク質;
c)a)からのペプチドがリン酸化されていた場合にこのペプチドを認識することができる抗体;
d)場合により、c)からの抗体を認識でき、および/または、標識系(例えば、アルカリ・ホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、ペルオキシダーゼ、他の酵素)に結合している二次抗体;
c)場合により、a)からのペプチドのリン酸化を実現するための試薬、緩衝液および/または器具、および/またはELISA装置、
からなる部品のキットにも関する。
a)ROKタンパク質によりリン酸化を受けることができるペプチドを準備し;
b)ROKタンパク質を準備し;
c)a)からのペプチドがリン酸化されていた場合にこのペプチドを認識することができる抗体を準備し;
d)場合により、c)からの抗体を認識することができ、および/または、標識系(例えば、アルカリ・ホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、ペルオキシダーゼ、他の酵素)に結合した、第二抗体を準備し;
e)場合により、a)からのペプチドのリン酸化を実現するための試薬、緩衝液および/または器材、および/またはELISA装置を準備し、
f)a)〜e)からの成分を適宜包装し、そして部品のキットの成分と同時に、それにより提供されるROKタンパク質のアッセイ方法の操作手順を記述した手順書と組み合わせる。
Rho−キナーゼ(ROK)は、心血管系疾患のための非常に良く確認された標的を意味する。それゆえに、特異的なROK阻害剤の検索は、心血管領域で仕事をしている多くのグループの中心課題である。今回、我々は、ROK活性に特異的な、ELISAの開発をここに記載する。このROK−ELISAはROKリン酸化ペプチドの量を検出する。ROK阻害剤は、ROK活性を阻害し、そしてそれによりROKが介在するペプチドのリン酸化の量を減少させる。ROK−ELISAは、中規模スループットの96穴フォーマットで、ならびに、ハイスループットの384穴フォーマットで開発された。
保存溶液:
ビオチニル化S6ペプチド:トリス緩衝液25mM pH8.0中に1ml(5mg/ml)のアリコットで、−20℃で保存。
組換え活性型ROK:10μl(1mg/ml)のアリコットで、−20℃で保存。
2)PBSを100μl/ウエル用いて、過剰のS6ペプチドを三回洗い流す。
3)MgCl2を含む反応用緩衝液中で所望の濃度で10×ATP溶液を、氷上で調製する。
4)ROKを反応用緩衝液中に氷上で希釈し、最終濃度を10ng/ウエルとする。
5)所望の濃度で10×基質溶液を調製する。
総体積=100μl
1)所望の最終濃度の阻害剤(10×濃縮溶液の10μl)をROKの80μlと共に10分間、プレインキュベートする。
2)所望の最終濃度で10×濃縮ATP溶液の10μl ATPを加える。
3)プレートを30℃で1時間インキュベートする。
4)500mM EDTA溶液の100μlを用いてキナーゼ反応を停止する。
5)全てのウエルの上清を取り除く。
6)一次モノクローナルリン酸化特異的抗体(phosphospecific antibody)(1:1000)を100μl/ウエル加え、そして室温で15分間インキュベートする。
7)二次抗体(1:2000)を100μl/ウエル加え、そして室温で1時間インキュベートする。
8)上清を取り除き、そしてPBSを200μl/ウエル用いて5回洗浄する。
9)基質溶液を100μl全てのウエルに加え、そして室温で10分間インキュベートする。
10)停止溶液を100μl全てのウエルに加える。
11)492nmで光学的濃度(OD)を測定する。
総体積=10μl
1)所望の最終濃度の阻害剤(10×濃縮溶液の1μl)をROKの8μlと共に10分間、プ
レインキュベートする。
2)所望の最終濃度で10×濃縮ATP溶液の1μl ATPを加える。
3)プレートを30℃で1時間インキュベートする。
4)500mM EDTA溶液の10μlを用いてキナーゼ反応を停止する。
5)全てのウエルの上清を取り除く。
6)一次モノクローナルリン酸化特異的抗体(1:1000)を10μl/ウエル加え、そして室温で15分間インキュベートする。
7)二次抗体(1:2000)を100μl/ウエル加え、そして室温で1時間インキュベート
する。
8)上清を取り除き、そしてPBSを30μl/ウエル用いて5回洗浄する。
9)基質溶液を10μl全てのウエルに加え、そして室温で10分間インキュベートする。
10)停止溶液を10μl全てのウエルに加える。
11)492nmで光学的濃度(OD)を測定する。
ROK(ROKα/ROCK−II(活性型組換えaa 11−550またはそれ以上)、
ビオチン化S6ペプチド(ビオチン−GGGGARRRLSSLRASTS)、
ストレプトアビジン被覆96−または384−穴プレート(例えば、ロシュのストレプタウエル、高結合(透過性)1989685/1989677、ロシュ・デアグノステクス、マンハイム)、
モノクローナルリン酸化特異的抗体、トランスダクション・ラブスより(クローン22a、BDバイオサイエンス、ハイデルベルグ)、
ヤギ抗マウスIgG−HRP抗体、200μg/0.5ml(サンタクルツ、カタログ番号sc−2005)。
Claims (18)
- Rhoキナーゼ(ROK)タンパク質の活性を調節する化合物の同定のためのアッセイ方法であって、ここで、
a)ROKタンパク質によりリン酸化を受けることができる、以下のアミノ酸配列:GGGGAKRRRLSSLRASTSを有するペプチドを準備し;
b)ROKタンパク質を準備し;
c)a)からのペプチドがリン酸化されていた場合にこのペプチドを認識することができるリン酸化特異的抗体を準備し;
d)化学的化合物を準備し;
e)a)からのペプチドを、このペプチドのリン酸化を可能にする条件下で、b)からのROKタンパク質およびd)からの化学的化合物と共にインキュベーションし;
f)e)に従って行なったインキュベーションが終了した後、c)からの抗体をこのペプチドのリン酸化を検出するために使用し;
g)f)からの結果を、場合により、d)からの化学的化合物を存在させないでa)からのペプチド、b)からのROKタンパク質のインキュベーションを行なった試験からの結
果と比較する、
上記方法。 - 工程e)、f)およびg)によるインキュベーションがELISAアッセイ法として行われ
る、請求項1に記載のアッセイ方法。 - 工程e)、f)およびg)によるインキュベーションがRIAアッセイ法として行われる、請求項1に記載のアッセイ方法。
- ペプチドがビオチニル化されている、請求項1〜3のいずれかに記載のアッセイ方法。
- ROKタンパク質がヒト由来である、請求項1〜4のいずれかに記載のアッセイ方法。
- ROKタンパク質が組換え方法により製造される、請求項1〜5のいずれかに記載のアッ
セイ方法。 - ROKタンパク質活性を調節する化合物のハイスループットスクリーニングのための、請
求項1〜6のいずれかに記載のアッセイ方法の使用。 - a)ROKタンパク質によりリン酸化を受けることができる、以下のアミノ酸配列:GGGGAKRRRLSSLRASTSを有するペプチド;
b)ROKタンパク質;
c)a)からのペプチドがリン酸化されていた場合にこのペプチドを認識することができるリン酸化特異的抗体;
d)場合により、c)からの抗体を認識することができ、および/または、標識系に結合した、第二抗体;
e)場合により、a)からのペプチドのリン酸化を実現するための試薬、緩衝液および/または器材、および/またはELISA装置、
から成る部品のキット。 - ペプチドがビオチニル化されている、請求項8に記載の部品のキット。
- ROKタンパク質がヒト由来である、請求項8または9に記載の部品のキット。
- ROKタンパク質が組換え方法により製造される、請求項8〜10のいずれかに記載の部品のキット。
- a)ROKタンパク質によりリン酸化を受けることができる、以下のアミノ酸配列:GGGGAKRRRLSSLRASTSを有するペプチドを準備し;
b)ROKタンパク質を準備し;
c)a)からのペプチドがリン酸化されていた場合にこのペプチドを認識することができるリン酸化特異的抗体を準備し;
d)場合により、c)からの抗体を認識することができ、および/または、標識系に結合した、第二抗体を準備し;
e)場合により、a)からのペプチドのリン酸化を実現するための試薬、緩衝液および/または器材、および/またはELISA装置を準備し、
f)a)〜e)からの成分を適宜包装し、そして部品のキットの成分と同時に、それにより提供されるROKタンパク質のアッセイ方法の操作手順を記述した手順書と組み合わせ
る、
請求項8〜11のいずれかに記載の部品のキットの製造方法。 - ROKタンパク質活性を測定するための、請求項8〜11のいずれかに記載の部品のキ
ットの使用。 - ROKタンパク質活性を調節する化合物を同定するための、請求項8〜11のいずれか
に記載の部品のキットの使用。 - ハイスループットスクリーニングのための、請求項8〜11のいずれかに記載の部品のキットの使用。
- 以下のアミノ酸配列:GGGGAKRRRLSSLRASTSから成るペプチド。
- ビオチニル化されている請求項16に記載のペプチド。
- ROKタンパク質の活性を測定するための、請求項16または17に記載のペプチドの使
用。
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