ME00404B

ME00404B - Tečne formulacije stabilizovanog interferona bez hsa (humani serumski albumin)

Info

Publication number: ME00404B
Application number: MEP-2008-604A
Authority: ME
Inventors: Fabrizio Samaritani; Rio Alessandra Del
Original assignee: Ares Trading Sa
Priority date: 2003-05-01
Filing date: 2004-04-29
Publication date: 2011-10-10
Also published as: WO2004096263A3; ES2417061T3; NO335674B1; ZA200708484B; KR20060011976A; AU2004233603A1; PT1617861E; JP4870550B2; JP5346065B2; PL1617861T3; BRPI0410488A; RS52869B; ZA200508124B; NO20055666L; CA2521560A1; US20070059285A1; EA200501699A1; MY151121A; HK1088847A1; JP2011225599A

Description

POLJE TEHNIKE

Ovaj pronalazak se uglavnom odnosi na farmaceutske sastave koji sadrže interferon, i to preciznije na stabilizovane formulacije interferona-beta koje ne sadrže humani serumski albumin kao dodati farmaceutski ekscipijens.

STANJE TEHNIKE

Interferoni su citokini, t.j. rastvorljivi proteini koji prenose poruke između ćelija i igraju ključnu ulogu u imunom sistemu tako što pomažu da se unište mikroorganizmi koji izazivaju infekcije i popravljaju nastalu štetu. Interferoni prirodno sekretuju inficirane ćelije i prvi put su identifikovani 1957. godine. Ime im je izvedeno iz čuinjenise da “interferiraju” sa replikacijom virusa i njihovom produkcijom.

Interferoni ispoljavaju i antivirusnu i antiproliferativnu aktivnost. Na bazi biohemijskih i imunoloških svojstava, interferoni koji prirodno nastaju kod ljudi grupišu se u tri glavne klase: interferon-alfa (leukociti), interferon-beta (fibroblasti) i interferon-gama (imuni). Alfa-interferon je trenutno odobren u Sjedinjenim Amevvričkim Državama i drugim zemljama za lečenje leukemije vlasastih ćelija, genitalnih bradavica, Kapošijevog sarkoma (raka koji često pogađa pacijente obolele od Sindroma stečene imunodeficijencije - AIDSa) i hroničnog hepatitisa ne-A, ne-B.

Dalje, interferoni (IFNs) su glikoproteini koje produkuje telo kao odgovor na virusnu infekciju. Oni inhibiraju razmnožavanje virusa u zaštićenim ćelijama. Budući da se sastoje od proteina niže molekulske težine, IFNs imaju upadljivo ne-specifično dejstvo, t.j. IFN koje indukuje jedan virus je efikasan protiv širokog spectra drugih virusa. Međutim, oni su specifični za vrstu, t.j. IFN koje produkuje jedna vrsta će samo da stimuliše antivirusnu aktivnost u ćelijama iste ili veoma bliske vrste. IFNs su bili prva grupa citokina koja je eksploatisana zbog svojih potencijalnih anti-tumorskih i antivirusnih aktivnosti.

Tri glavna IFNs nazivaju se IFN-α, IFN-β i IFN-γ. Ovakve glavne klase IFNs inicijalno su klasifikovane po ćelijama iz kojih nastaju (leukociti, fibroblasti ili T ćelije). Međutim, postalo je jasno da jedna ćelija može da proizvodi nekoliko vrsta. Zbog toga se leukocitni IFN sada naziva IFN-α, fibroblastni IFN je IFN-β, a T ćelijski IFN je IFN-7. Postoji i četvrti tip IFN, limfoblastoidni IFN, koji je proizvodi u ćelijskoj liniji “Namalwa” (izvedenoj iz Burkittovog limfoma), koji izgleda produkuje mešavinu leukocitnih i fibroblastnih IFN.

Jedinica interferona ili Internacionalna jedinica za interferon (U ili IU, što je skraćenica za internacionalne jedinice) je određena kao mera aktivnosti IFN koja se definiše kao količina koja je neophodna da se zaštiti 50% ćelija od virusnog oštećenja. Esej koji se može koristiti za merenje biološke aktivnosti jeste esej dejstva citopatske inhibicije kako je već opisan (Rubinstein, i sar. 1981; Familletti, P. C., i sar., 1981). U ovom antivirusnom eseju za interferon oko 1 jedinica/ml interferona jeste količina koja je neophodna da se izazove citopatsko dejstvo od 50%. Ove jedinice su određene u odnosu na međunarodni referentni standard za Hu-IFN-beta koji daju nacionalni institute za zdravlje (Pestka, S. 1986).

Svaka klasa IFN sadrži nekoliko tipova koji se jasno razlikuju. IFN-β i IFN-γ are su svaki ponaosob proizvod jednog gena.

Belančevine koje su klasifikovane kao IFNs-a su najraznolikija grupa i sadrži oko 15 tipova. Postoji grupa IFN-α gena na hromozomu 9, koja sadrži najmanje 23 članova, od kojih su 15 aktivni i transkribovani. Zreli IFNs-a nisu glikozilirani.

IFNs-a i IFN-β su svi iste dužine (165 ili 166 amino kiselina) sa sličnim biološkim aktivnostima. IFNs-y su dužine 146 amino kiselina, i manje liče na klase a i p. Samo IFNs-y mogu da aktiviraju makrofage ili da indukuju sazrevanje T ćlija, koje se nazivaju i ćelije ubice. Ovi novi tipovi terapijskih agenasa ponekad mogu da se nazivaju i modifikatorima biološkog odgovora (BRMs), jer imaju dejstva na odgovor organizma na tumor, štoo upiće na prepoznavanje imunomodulacije.

Humani fibroblastni interferon (IFN-Β) ima antivirusnu aktivnost i može da stimulira ćelije prirodne ubice protiv neoplastičnih ćelija. To je jedan polipeptid od oko 20,000 Da koji je indukovan virusima i dvolančanom RNK. Iz nucleotidne sekvence gena za fibroblastni interferon, koji je kloniran tehnologijom rekombinacije DNK, (Derynk i sar. 1980) zaključuje se kakva je kompletna aminokiselinska sekvenca ovog proteina. Ona je dužine 166 amino kiselina.

Shepard i sar. (1981) opisali su mutaciju na bazi 842 (Cys -> Tyr na položaju 141) koja ukida anti-virusnu aktivnost, kao i varjantni klon with sa delecijom nukleotida 1119-1121.

Mark i sar. (1984) su umetnuli insercijom jednu veštačku mutaciju zamenom baze 469 (T) sa (A) uzrokujući amino kiselinsko prebacivanje sa Cys Ser na položaju 17. Zabeleženo je da je dobijeni IFN-β aktivan kao i ‘nativni’ IFN-β i stabilan tokom dugotrajnog čuvanja (-70°C).

Rebif® (Serono - rekombinantni humani interferon-p), najnovije dostignuće u terapiji interferonom za multiplu sklerozu (MS), je interferon(IFN)-beta-1a, proizveden iz ćelijskih linija sisara. Njegovo preporučeno internationalno nezaštićeno ime (INN) je "Interferon beta-1a”.

Kao što je to slučaj i sa svim drugim farmaceutskim proizvodima na bazi proteina, mora se prevazići jedna glavna prepreka za upotrebu IFN-beta kao terapijskog agensa, a to je gubitak farmaceutske efikasnosti što može da bude posledica nestabilnosti farmaceutske formulacije.

Fizička nestabilnost koja preti polipeptidnoj aktivnosti i efikasnosti farmaceutskih formulacija uključuje i denaturaciju i formiranje rastvorljivih i nerastvorljivih agregata, dok u hemijske nestabilnosti spadaju hidroliza, formiranje imida, oksidacija, racemizacija, i dearnidacija. Neke od tih promena su poznate i dovode do gubitka ili smanjenja farmaceutske aktivnosti proteina koji nas interesuje. IU drugim slučajevima, precizno dejstvo ovih promena nije poznato, ali dobijeni produkti razgradnje se i dalje samtraju farmaceutski neprihvatljivima zbog potencijala za neželjena sporedna dejstva.

Stabilizacija polipeptida u farmaceutskim formulacija ostaje oblast u kojoj metoda pokušaja i pogreške igra glavnu ulogu ( Pregled pripremio Wang (1999) Int. J. Pharm. 185:129-188; Wang i Hanson (1988) J. Parenteral Sci. Tech. 42:S3-S26). U ekscipijense koji se dodaju polipeptidnim farmaceutskim formulacijama da se poveća njihova stabilnost spadaju puferi, šećeri, surfaktanti, amino kiseline, polietilen glikoli, i polimeri, ali stabilizujuće dejstvo ovih hemijskih dodataka varira zavisno od samog proteina.

Tekuće IFN-beta formulacije koriste upotrebu HSA kao agensa koji poboljšava rastvorljivost IFN-beta. Međutim, upotreba HSA je skoipčana sa određenim nedostacima. HSA je proizvod humane krvi is toga se mora ubirati od ljudi, lako se preduzimaju koraci da se rizik smanji, upotreba krvnih proizvoda od humane krvi ostaje rizik od nosilaca HSA sa potencijalnim uvođenjem humanih virusa kao što su HIV i HCV.

Zbog toga postoji potreba za dodatnim IFN-beta farmaceutskim preparatima koji bi obuhvatili fiziološki kompatibilne stabilizatore koji poboljšavaju solubiinost ovog proteina i stabilizuju ga protiv stvaranja agregata, povećavajući na taj način njihovu farmaceutsku upotrebljivost.

OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na stabilizovane farmaceutske preparate koji obuhvataju jedan interferon (IFN) i metode za njihovu pripremu. Ovi sastavi se pripremaju bez humanog serumskog albumina (HSA), is toga ne sadrže ovaj farmaceutski ekscipijens. Ovakvi sastavi se u8 daljem tekstu nazivaju farmaceutski sastavi IFN "bez HSA " i oni obuhvataju interferon (IFN) ili an izoform, mutein, fuzirani protein, funkcionalni derivat, aktivnu frakciju ili njihovu so, naznačeno time da pomenuti sastav bude rastvor koji obuhvata pufer, surfaktant, n agens za izotoničnost i antioksidans.

U skladu sa osnovnom idejom ovog pronalaska, ovi sastavi obuhvataju i neki bakteriostatski agens.

Izraz “interferon” ili "IFN”, u smislu u kome se ovde koristi, treba da obuhvati svaki molekul koji je kao takav definisan u literaturi, koji obuhvata na primer sve vrste IFNs koje su pomenute u gornjem odeljku pod naslovom “STANJE TEHNIKE”. U gornju definiciju su pre svih uključeni, IFN-α, IFN-β i IFN-γ. IFN-β je preporučeni IFN u skladu sa ovim pronalaskom. IFN-β koji je pogodan u skladu sa ovim pronalaskom je komercijalno dostupan na pr. kao Rebif® (Serono), Avonex® (Biogen) ili Betaferon® (Schering). Upotreba interferona humanog porekla takođe se preporučuje u skladu sa ovim pronalaskom. Izraz interferon, u smislu u kome se ovde koristi, ima za cilj da obuhvati izoform, mutein, fuzirani protein, funkcionalni derivat, aktivnu frakciju ili njihovu so.

Izraz “interferon-beta (IFN-beta ili IFN-β)”, u smislu u kome se ovde koristi, treba da uključi fibroblastni interferon posebno humanog porekla, koji se dobija izolacijom iz bioloških tečnosti ili se dobija tehnikom rekombinacije DNK iz prokariotskih ili eukariotskih ćelija domaćina, kao i njihove soli, funkcionalni derivati, varijante, analozi i aktivni fragmenti. Po mogućstvu, IFN-beta treba da znači Interferon beta-1a.

U smislu u kome se ovde koristi uzraz "muteini" odnosi se na analoge IFN u kojima jedan ili više amino kiselinskih ostataka prirodnog IFN biva zamenjen drugim amino kiselinskim ostacima, ili biva izbrisan, ili se jedan ili više amino kiselinskih ostataka dodaje u prirodnu sekvencu IFN, ne menjajući značajnije aktivnost rezultujućeg proizvoda u poređenju sa IFN divljeg tipa. Ovi muteini su pripremljeni poznatom sintezom i/ili tehnikama mutageneze usmerene na to mesto, ili ma kojom drugom tehnikom koja je za to pogodna. U preporučene muteine spadaju na pr. Oni koje su opisani Shepard i sar. (1981) ili Mark i sar. (1984).

Dvaki takav mutein po mogućstvu ima sekvencu amino kiseline koja dovoljno podražava onu koju ima IFN, i to tako da ima supstancijalno istu ili čak bolju aktivnost od IFN. Biološka funkcija interferona je dobro poznata stručnjacima za ovu oblast, i biološki standardi su usvojeni i mogu se dobiti od na pr. Nacionalnog institute za biološke standarde i kontrolu (http://immunology.org/links/NIBSC).

Opisani su i bioeseji za određivanje aktivnosti IFN have been described. IFN esej, na primer, može da se obavi kako su to opisali Rubinstein i sar., 1981. Tako, iz pomoć rutinskih eksperimentalnih metoda može se utvrditi da li bilo koji dati mutein ima supstancijalno sličnu, ili čak bolju aktivnost nego IFN.

Muteini IFN, koji se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom, ili njihovo kodiranje nukleinskih kiselina, uključuju konačni skup supstancijalno odgovarajućih sekvenci kao supstitucionih peptida ili polinukleotida koji se rutinski mogu dobiti od strane osobe koja je stručna za ovu oblast, bez nepotrebnog eksperimentisanja, na osnovu učenja i usmerenja sadržanih u ovom tekstu.

Preporučene promene muteina u skladu sa ovim pronalaskom su ono što se naziva "konzervativne" supstitucije. Konzervativne amino kiselinske supstitucije polipeptidea ili proteina ovog pronalaska, mogu da uključe sinonimne amino kiseline u okviru jedne grupe, koje imaju dovoljno slične fizikohemijske osobine da će supstitucija između članova ove grupe očuvati biološku funkciju molekula. Jasno je da insercije i delecije amino kiselina mogu da se rade i u gore dfinisanim sekvencama ne menjajući njihovu funkciju, posebno ako te insercije ili delecije uključuju samo nekoliko amino kiselina, na pr., manje od trideset, ili po mogućstvu manje od deset, i ne uklanjaju ili dislociraju amino kiseline koje su ključne za funkcionalnu konformaciju, na pr., cisteinske ostatke. Proteini i muteini koji se proizvode takvim delecijama i/ili insercijama spadaju u okvire ovog pronalaska.

Po mogućstvu, sinonimne grupe amino kiselina su one koje su definisane na Tabeli I. Još bolje, sinonimne grupe amino kiselina su one koje su definisane na Tabeli II; i najbolje sinonimne grupe amino kiselina su one koje su definisane na Tabeli III.

U primere amino koselinske supstitucije u proteinima koji se mogu koristiti za dobijanje muteina IFN, za upotrebu u ovom pronalasku spadaju sve poznate medote i koraci kao što su oni prikazani u patentima SAD br. 4,959,314, 4,588,585 i 4,737,462, autora Mark et al; 5,116,943 autora Koths i sar., 4,965,195 autora Namen et al; 4,879,111 autora Chong et al; i 5,017,691 autora Lee et al; i lizinski supstituisani proteini koji su prikazani u patentima SAD br. 4,904,584 (Shaw et al). Specifične muteine IFN-beta opisali su, na primer by Mark i sar., 1984.

Izraz "fuzirani protein" odnosi se na polipeptid koji obuhvata jedan IFN, ili njegov mutein, fuzionisan za drugi protein, koji na pr., ima produženo vreme boravka u telesnim tečnostima. Na taj način, jedan IFN može da se fizioniše za drugi protein, polipeptid ili slično, na pr., imunoglobulin ili njegov fragment.

"Funkcionalni derivati" u smislu u kome se ovde koristi obuhvataju derivate IFN, i njihove muteine i fuzirane proteine, koji mogu da se pripremaju iz funkcionalnih grupa koje nastaju kao bočni lanci na ostacima ili N- ili C-terminalnim grupama, na način poznat u struci, i uključeni su u ovaj pronalazak sve dok ostaju farmaceutski prihvatljivi, t.j. ne uništavaju aktivnost proteina koji je supstancijalno sličan aktivnosti IFN, i ne nosi toksična svojstva na sastave koji ga sadrže. Ovi derivati mogu, na primer, da uključe polietilen glikolne bočne lance, koji mogu da maskiraju antigena mesta i produže boravak IFN u telesnim tečnostima. U ostale derivate spadaju alifatični estri karboksilnih grupa, amidi karboksilnih grupa reakcijom sa amonijakom ili sa primarnim ili sekundarnim aminima, N-acil derivati slobodnih amino grupa amino kiselinskih ostataka formiranih sa acilnim delovima (na pr. alkanoil ili karbociklične aroil grupe) ili O-acil derivati slobodnih hidroksilnih grupa (na primer serilni ili treonilni ostaci) formirani sa acilnim delovima.

Kao "aktivne frakcije" IFN, ili muteina i fuziranih proteina, ovaj pronalazak obuhvata svaki fragment ili prekursore polipeptidnog lanca samog molekula proteina ili zajedno sa pratećim molekulima izi ostacima koji su povezani sa njima, na pr., šećer ili fosfatni ostaci, ili agregati molekula proteina ili sami šećerni ostaci, pod uslovom da pomenuta frakcija nema značajno smanjenu aktivnost u poređenju sa odgovarajućim IFN.

Izraz "soli" u ovom tekstu odnosi se na soli of karboksilne grupe i na kiseli dodatak soli amino grupe proteina koji su gore opisani ili njihove analoge. Soli karboksilne grupe mogu da se formiraju na način poznat u struci i uključuju neorganske soli, na primer, natrijumove, kalcijumove, amonijumove, fero ili cinkove soli, i slično, i soli sa organskim bazama kao što su one formirane sa, na primer, aminima, kao što su trietanolamin, arginin ili lizin, piperidin, prokain i slično. Kiseli dodatak soli uključuje, na primer, soli sa mineralnim kiselinama, kao što su, na primer, hlorovodonična kisleina ili sumporna kiselina, i soli sa organskim kiselinama, kao što su, na primer, sirćetna kiselina ili oksalična kiselina. Naravno, sve takve soli moraju da zadrže biološku aktivnost proteina (IFN) relevantu za ovaj pronalazak, t.j., sposobnost da se vezuju za odgovarajući receptor i iniciraju receptorsku signalizaciju.

U skladu sa ovim pronalaskom, posebno se daje prednost upotrebi rekombinantnog humanog IFN-beta i jedinjenja iz okvira ovog pronalaska.

Nedavno je opisana jedna posebna varijanta interferona. Takozvani “konsenzus interferoni" koji su varijanta IFN koji ne nastaju prirodno (US 6,013,253). U skladu sa preporučenim oblikom ovog prolnalaska, jedinjenja ovog pronalaska se korist u kombinaciji sa konsenzus interferonom.

U smislu u kome se ovde koristi, humani interferon konsenzus (IFN-con) će označavati jedan polipeptid koji ne nastaje prirodno, koji prevashodno uključuje one amino kiselinske ostatke koji su zajednički za podgrupu IFN-αlfa odnosno one predstavnike većine prirodno nastajućih sekvenci podtipa humanih leukocitnih interferona i koji uključujena jednoj ili više onih pozicija na kojima nema amino kiseline zajedničke za sve podtipove, jednu aminu kiselinu koja predomiantno postoji na tom položaju i ni u kom slučaju ne uključuje nijedan amino kiselinski ostatak koji ne postoji na tom položaju u najmanje jednom podtipu koji nastaje prirodno. IFN-con obuhvata, ali se ne ograničava na amino kiselinske sekvence koje su označene sa IFN-con1, IFN-con2 i IFN-con3 koje su otkrivene u patentima SAD br. 4,695,623, 4,897,471 i 5,541,293. DNK sekvence koje enkodiraju IFN-con mogu da se proizvedu kako je opisano u gore pomenutim patentima, ili drugim standardnim metodama.

U još jednom preporučenom obliku, ovaj fuzirani protein obuhvata i jednu fuziju Ig. Ova fuzija može biti direktna, ili preko kratkog veznog peptida koji može biti sasvim kratak, odnosno samo 1 do 3 amino kiselinska ostatka dužine ili duži, na primer, 13 amino kiselinskih ostataka dužine. Pomenuti vezni peptid može biti tripeptide sekvence E-F-M (Glu-Phe-Met), na primer, ili jedna 13-amino kiselinska vezna sekvenca koja obuhvata Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met koji se umeću između sekvence IFN i imunoglobulinske sekvence. Dobijeni fuzionisani protein može da ima poboljšana svojstva, kao što su produženo zadržavanje u telesnim tečnostima (polu-život), pojačana specifična aktivnost, povišeni nivo ekspresije, ili se olakšava prečišćavanje fuzionog fusion proteina.

U još jednom preporučenom obliku, IFN se fuzioniše za jedna konstantni region molekula Ig. Po mogućstvu, on se fuzioniše za regione teških lanaca, kao što su, na primer, CH2 i CH3 domeni humanog lgG1. Drugi izoformi molekula Ig su takođe pogodni za generisanje fuzionih proteina u skladu sa ovim pronalaskom, kao što su izoformi lgG2, lgG3 ili lgG4, ili druge klase Ig, kao što su, na primer IgM ili IgA. Fuzioni proteini mogu biti monomerni ili multimerni, hetero- ili homomultimerni.

U još jednom preporučenom obliku, ovaj funkcionalni derivat obuhvata najmanje jedan deo koji je pripojen za jednu ili više funkcionalnih grupa, koje nastaju kao jedan ili kao više bočnih lanaca na amino kiselinskim ostacima. Po mogućstvu, ovaj deo je polietilenski (PEG) deo. PEGilacija se može obaviti poznatim metodama, kao što su, na primer, one opisane u VV099/55377.

Doza koja se daje pojedincu, bilo u vidu pojedinačne ili višestrukih doza, zavisiće od čitavog niza različitih faktora, uključujući farmakokinetička svojstva, način davanja, stanje pacijenta i njegove osobine (pol, godine starosti, telesna težina, zdravstveno stanje, veličina), težina simptoma, prateća terapija, učestalost terapije i željeni efekat.

Standardne doze humanog IFN-beta kreću se u rasponu od 80.000 lU/kg do 200.000 lU/kg na dan ili 6 MIU (miliona internacionalnih jedinica) i 12 MIU po osobi na dan ili 22 do 44 pg (mikrograma) po osobi. U skladu sa ovim pronalaskom, IFN može da se po mogućstvu daje u dozi od oko 1 do 50 pg, ili bolje od 10 do 30 pg ili oko 10 do 20 pg po osobi na dan.

Davanje aktivnog sastojka u skladu sa ovim pronalaskom može se obaviti intravenskim, intramuskularnim ili supkutanim putem. Preporučeni način davanja IFN jeste supkutani (potkožni).

IFN se može davati i svakodnevno ili svaki drugi dan, ili još rede. Po mogućstvu, IFN se daje jednom, dva ili tri puta nedeljno

Preporučeni način davanja jeste supkutani (potkožni) i to na pr. tri puta nedeljno. Drugi preporučeni način davanja jeste intramuskularni koji se može primenjivati na pr. jednom nedeljno.

Po mogućstvu 22 do 44 pg ili 6 MIU do 12 MIU IFN-beta daje se tri puta nedeljno u vidu potkožne injekcije.

IFN-beta može da se daje supkutano, u doznom rasponu od 25 do 30 pg ili 8 MIU do 9.6 MIU, svakog drugog dana. 30 pg ili 6 MIU IFN-beta mogu dalje da se daju intramuskularno jednom nedeljno.

Izraz "stabilnost" odnosi se na fizičku, hemijsku i konformacijsku stabilnost formulacija interferona za ovaj pronalazak (uključujući održavanje biološke snage). Nestabilnost proteinske formulacije izazvana hemijskom razgradnjom ili agregacijom molekula proteina da se formiraju polimeri višeg reda, deglikozilacijom, modifikacijom glikozilacije, oksidacijom ili ma kojom drugom strukturnom modifikacijom koja smanjuje najmanje jednu biološku aktivnost interferon polipeptida uključenog u ovaj pronalazak.

"Stabilni" rastvor ili formulacija, jeste onaj naznačen time da da stepen razgradnje, modifikacije, agregacije, gubitka biološke aktivnosti i slično, proteina sadržanih u njemu bude kontrolisan na prihvatljiv način, in nepotrebno se ne smanjuje tokom vremena. Po mogućstvu, ovakva formulacija zadržava najmanje tačno ili oko 60%, još bolje najmanje tačno ili oko 70 %, najbolje najmanje tačno ili oko 80% obeležene aktivnosti interferona tokom perioda od 12 do 24 meseci. Stabilizovani sastavi IFN bez HSA u ovom pronalasku po mogućstvu imaju polu-život od najmanje oko 6 meseci, 12 meseci, 18 meseci, još bolje najmanje 20 meseci, i još bolje najmanje oko 22 meseci, a najbolje najmanje oko 24 meseci kada se čuva na 2-8°C.

Metode za praćenje stabilnosti farmaceutskih sastava IFN bez HSA u ovom pronalasku postoje opisane u struci, uključujući i one metode koje su opisane u primerima koji su ovde otkriveni. Prema tome, formiranje IFN agregata tokom čuvanja tečnih farmaceutskih sastava u ovom pronalasku iako se može odrediti merenjem promene u rastvorljivom IFN u rastvoru u funkciji vremena. Količina rastvorljivog polipeptida u rastvoru može se kvantifikovati brojnim analitičkim esejima koji su podešeni tako da se otkriva IFN. U ovakve eseje spadaju, na primer, referzno-fazni (RP)-HPLC i UV apsorpciona spektroskopija, kao što je opisano u primerima, dole.

Određivanje i rastvorljivih i nerastvorljivih agregata tokom čuvanja u tečnim formulacijama može se postići, na primer, korišćenjem analitičkog ultracentrifugiranja kao što je navedeno u Primerima, dole, da se napravi razlika između onog dela rastvorljivog polipeptida koji je prisutan u vidu rastvorljivih agregata i onog dela koji je prisutan u neagregatnom, biološki aktivnom molekularnom obliku.

Izraz “multi-dozna upoteba” treba da uključi upotrebu jedne bočice, ampule ili punjenja formulacije interferona za više od jedne injekcije, na primer 2, 3, 4, 5, 6 ili više injekcija. Ove injekcije se o mogućstvu daju tokom perioda od najmanje tačno ili oko 12 časova, 24 časova, 48 časova, i td., po mogućstvu do perioda od tačno ili oko 12 dana. Ove injekcije mogu biti razdvojene u vremenu, na primer, za period od 6, 12, 24, 48 ili 72 časova.

Izraz "pufer" ili "fiziološki prihvatljivi pufer" odnosi se na rastvore jedinjenja za koja se zna da su bezbedna za farmaceutsku ili veterinarsku upotrebu u formulacijama i da imaju dejstvo održavanja ili kontrole pH formulacije u rasponu pH koji je poželjan za datu formulaciju. Prihvatljivi puferi za kontrolu pH pri umereno kiselom pH umereno baznog pH uključuju, ali se ne ograničavaju na sledeća jedinejnja kao što su fosfati, acetati, citrati, arginin, TRIS, i histidin. "TRIS" se odnosi na 2-amino-2-hidroksimetil-1,3,-propanediol, i to svaka njihova farmakološki prihvatljiva so. U prihvatljive pufere spadaju acetatni pufers sa slanim rastvorom ili nekom prihvatljivom solju.

"Agens za izotoničnost" jeste jedinjenje koje se fiziološki podnosi i dodaje odgovarjuću toničnost u formulaciju da se spreči neto protok vode kroz ćelijske membrane koje su u kontaktu sa ovom formulacijom. Jedinjenja kao što je glicerin, često se koristi za ove namene u poznatim koncentracijama. U ostale pogodne agense za izotoničnost spadaju, ali to nisu jedini, amino kiseline ili proteini (na pr. glicin ili albumin), soli (na pr. natrijum hlorid), i šećeri (na pr. dekstroza, manitol, saharoza i laktoza). Preporučeni agens za izotoničnost je manitol.

Izraz “antioksidans” odnosi se na jedinjenje koje prečava kiseonik ili slobodne kiseoničke radiale da stupe u interakciju sa drugim supstancama. Antioksidansi spadaju u brojne ekscipijense koji se uobičajeno dodaju u farmaceutske sisteme da se pojačaju fizička i hemijska stabilnost. Antioksidansi se dodaju da se na najmanju meru svedu ili uspore oksidativni procesi koji nastaju sa nekim lekovima ili ekscipijensima po izlaganju kiseoniku ili u prisustvu slobodnih radikala. Ovi procesi često mogu da budu katalizovani svetlom, temperaturom, koncentrisanim vodonikom, prisustvom metala u tragovima ili peroksidima. Sulfiti, bisufiti, tioureja, metionin, soli etilendiaminetetra sirćetne kiseline (EDTA), butilirani hidroksitoluen (BHT), i butilirani hidroksi anisol (BHA) se često koriste kao antioksidansi u lekovima. Pokazano je da natrijum EDTA pojačava aktivnost antioksidansa helacijom metalnih jona koji bi inače katalizovali rekaciju oksidacijeoksidacija reaction. Najbolji antioksidans je metionine.

Izraz “bacteriostatic” refers to a compound ili compositions added to a formulacija to act as an anti-bacterial agent. A preserved interferon-sa sadržajem formulacija ovog pronalaska preferably meets statutory ili regulatory guidelines for preservative effectiveness to be a commercially viable multi-use product. Primeri of bacteriostatics include fenol, m-kresol, p-kresol, o-kresol, hlorokresol, benzil alkohol, alkilparaben (metil, etil, propii, butil i slično), benzalkonium hlorid, benzethonium hlorid, natrijum dehidroacetate i thimerosal. Preporučuje se da bakteriostatski agens bude benzil alkohol.

Izraz “surfaktant” odnosi se na rastvorljivo jedinjenje koje smanjuje opovršinski napon tečnosti, ili smanjuje napon na dodirnoj površini između dve tečnosti ili tečnosti i čvrste materije, gde je taj površinski napon zapravo sila koja deluje na površini tečnosti, koja teži da na najmanju meru svede tu površinu. Surfaktanti se ponekad koriste u farmaceutskim formulacijama, uključujući lekove male molekulske mase i polipeptidee, da bi se izmenila apsorpcija leka ili njegovo dopremanje do ciljnih tkiva. U dobro poznate surfaktante spadaju polisorbati (derivati polioksietilena; Tvveen) kao i Pluronic.

U skladu sa preporučenim oblikom ovog pronalaska, utvrđeno je da se formulisanjem interferona sa surfaktantom koji je odabran iz sledećih: Pluronic® F77, Pluronic F87, Pluronic F88 i Pluronic® F68, a posebno preporučeno Pluronic F68 (BASF, Pluronic F68 je poznat i kao Poloxamer 188) dobijaju stabilne formulacije koje minimalizuju gubitak aktivnog principa koji je izazvan adsorpcijom na površini bočice i/ili naprave kojom se preparat daje (na pr. Špric, pumpa, kateter, i td.). Takođe je utvrđeno da formulisanjem interferona sa surfaktantom koji je odabran iz sledećih: Pluronic® F77, Pluronic F87, Pluronic F88 i Pluronic® F68, i posebno Pluronic F68 (BASF, Pluronic F68 je poznat i kao Poloxamer 188) se dobija stabilna formulacija, koja je rezistentnija na oksidaciju in a stvaranje proteinskih agregata.

Pluronic surfaktanti su blok kopolimeri etilen oksida (EO) i propilen oksida (PO). Blok propilen oksida (PO) je u sendviču između dva bloka etilen oksida (EO).

Pluronic surfaktanti se sintetizuju u jednom dvostepenom procesu:

1. Hidrofob željene molekulske težine stvara se kontrolisanim dodavanjem propilen oksida u dve hidroksilne grupe propilen glikola; i

2. Etilen oksid se dodaje u sendvič hidrofoba između hidrofilnih grupa.

U Pluronic® F77, procenat polioksietilena (hidrofila) je 70%, a molekulska težina hidrofoba (polioksipropilen) iznosi približno 2,306 Da.

U Pluronic F87, procenat polioksietilena (hidrofil) je 70%, a molekulska težina hidrofoba (polioksipropilen) iznosi približno 2,644 Da.

U Pluronic F88, procenat polioksietilena (hidrofil) je 80%, a molekulska težina hidrofoba (polioksipropilen) iznosi približno 2,644 Da.

U Pluronic F68, procenat polioksietilena (hidrofil) je 80%, a molekulska težina hidrofoba (polioksipropilen) iznosi približno 1,967 Da.

Dole su navedena tipična svojstva Pluronic F77:

Prosečna molekulska težina: 6600;

Tačka topljenja/sipanja: 48°C ;

Agregatno stanje @ 20°C : čvrsto;

Viskoznost (Brookfield) cps: 480 [tečnosti na 25°C, paste na 60°C i čvrste materije na 77°C];

Površinski napon, dina/cm @ 25°C;

0.1% Konc. : 47.0 0.01% Konc. : 49.3 0.001% Konc.: 52.8

Napon na dodirnoj površini, dina/cm @ 25°C vs. Nujol;

0.1% Konc.: 17.7 0.01% Konc. : 20.8 0.01% Konc. : 25.5 Dravesovo vlaženje, Sekundi 25°C 1.0% Konc.: > 360 0.1% Konc.: > 360 Visina pene

Ross Miles, 0.1%, mm @ 50°C: 100 Ross Miles, 0.1%, mm @ 26°C: 47 Dinamička, 0.1%, mm @ 400 ml/min: > 600 Tačka zamagljivanja u vodenom rastvoru, °C 1% Konc.: >100

10% Konc.: >100 HLB (hidrofil-lipofil balans): 25

Dole su navedena tipična svojstva Pluronic F87:

Prosečna molekulska težina: 7700;

Tačka topljenja/sipanja: 49°C ;

Agregatno stanje @ 20°C : čvrsto;

Viskoznost (Brookfield) cps: 700 [tečnosts na 25°C, pastes na 60°C i solids na 77°C]; Površinski napon, dina/cm @ 25°C;

0.1% Konc. : 44.0 0.01% Konc. : 47.0 0.001% Konc.: 50.2

Napon na dodirnoj površini, dina/cm @ 25°C vs Nujol;

0.1% Konc. : 17.4 0.01% Konc. : 20.3 0.01% Konc. : 23.3 Dravesovo vlaženje, Sekundi 25°C 1.0% Konc.: > 360 0.1% Konc.: > 360 Visina pene

Ross Miles, 0.1%, mm @ 50°C: 80 Ross Miles, 0.1%, mm @ 26°C: 37 Dinamička, 0.1%, mm @ 400 ml/min: > 600 Tačka zamagljivanja u vodenom rastvoru, °C 1% Konc.: >100 10% Konc.: >100 HLB (hidrofil-lipofil balans): 24

Dole su navedena tipična svojstva Pluronic F88 are listed below:

Prosečna molekulska težina: 11400;

Tačka topljenja/sipanja: 54°C ;

Agregatno stanje @ 20°C : čvrsto;

Viskoznost (Brookfield) cps: 2300 [tečnosti na 25°C, paste na 60°C i čvrsto stanje na 77°Cj;

Površinski napon, dina/cm @ 25°C;

0.1% Konc. : 48.5 0.01% Konc. : 52.6 0.001% Konc.: 55.7

Napon na dodirnoj površini, dina/cm @ 25°C vs Nujol;

0.1% Konc. : 20.5 0.01% Konc. : 23.3 0.01% Konc. : 27.0 Dravesovo vlaženje, Sekundi 25°C 1.0% Konc.: > 360 0.1% Konc.: > 360 Visina pene

Ross Miles, 0.1 %, mm @ 50°C: 80 Ross Miles, 0.1%, mm @ 26°C: 37 Dinamička, 0.1%, mm @ 400 ml/min: > 600 Tačka zamagljivanja u vodenom rastvoru, °C 1% Konc.: >100 10% Konc.: >100 HLB (hidrofil-lipofil balans): 28

Dole su navedena tipična svojstva Pluronic F68:

Prosečna molekulska težina: 8400;

Tačka topljenja/sipanja: 52°C ;

Agregatno stanje @ 20°C : čvrsto;

Viskoznost (Brookfield) cps: 1000 [tečnosti na 25°C, paste na 60°C i čvrste materije na 77°C];

Površinski napon, dina/cm @ 25°C;

0.1% Konc. : 50.3 0.01% Konc.: 51.2 0.001% Konc.: 53.6

Napon na dodirnoj površini, dina/cm @ 25°C vs Nujol;

0.1% Konc. : 19.8 0.01% Konc. : 24.0 0.01% Konc. : 26.0 Dravesovo vlaženje, Sekundi 25°C 1.0% Konc.: > 360 0.1% Konc.: > 360

Visina pene

Ross Miles, 0.1%, mm @ 50°C: 35

Ross Miles, 0.1%, mm @ 26°C: 40

Dinamička, 0.1%, mm @ 400 ml/min: > 600 Tačka zamagljivanja u vodenom rastvoru, °C

1% Konc.: >100

10% Konc.: >100 HLB (hidrofil-lipofil balans): 29

U formulacijama ovog pronalaskamogu se koristiti i drugi polimeri koji imaju svojstva slična navedenima. Preporučeni surfaktant je Pluronic F68, i surfaktanti koji nimaju slična svojstva.

Pluronic, a posebno Pluronic F68, po mogućstvu treba da bude prisutak u koncentraciji koja je dovoljna da se održi stabilnost interferona tokom željenog perioda čuvanja (na primer 12 do 24 meseci), i takođe u koncentraciji koja je dovoljna da se spreči gubitak proteina zbog adsorpcije na površine kao što su bočica, ampula ili punjenje ili špric.

Po mogućstvu, koncentracija Pluronica, a posebno Pluronica F68, u tečnim formulacijama je tačno ili oko 0.01 mg/ml do tačno ili oko 10 mg/ml, još bolje tačno ili oko 0.05 mg/ml do tačno ili oko 5 mg/ml, i još bolje tačno ili oko 0.1 mg/ml do tačno ili oko 2 mg/ml, najbolje tačno ili oko 1 mg/ml.

Po mogućstvu, koncentracija IFN-beta u ovoj formulaciji je tačno ili oko 10 pg/ml do tačno ili oko 800 pg/ml, još bolje tačno ili oko 20 pg/ml do tačno ili oko 500 pg/ml, i još bolje tačno ili oko 30 do tačno ili oko 300, najbolje tačno ili oko 22, 44, 88 ili 264 pg/ml.

Po mogućstvu, formulacije ovog pronalaska imaju pH betvveen između 3.0 i tačno ili oko 5.0, još bolje tačno ili oko 3.7 ili 4.7. Preporučeni pufer je acetat, gde su preporučeni kontrajoni natrijum ili kalijumovi joni. Acetatni slani puferi su dobro poznati u struci. Puferske koncentracije u ukupnom rastvoru mogu da variraju između tačno ili oko 5 mM, 9.5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, i 500 mM. Po mogućstvu je koncentracija pufera tačno ili oko 10mM. Posebno se preporučuje pufer 10 mM u acetatnim jonima sa pH od 3.5 ± 0.2 ili 4.5 ± 0.2.

Po mogućstvu u sastavu ovog pronalaska prisutan je i antioksidans, na primer metionin, u koncentraciji od tačno ili oko 0.01 do tačno ili oko 5.0 mg/ml, još bolje tačno ili oko 0.05 do tačno ili oko 0.3 mg/ml, najbolje tačno ili oko 0.1 mg/ml.

Po mogućstvu koncentracija agensa za izotoničnost (na primer manitol) u tečnim formulacijama je tačno ili oko 0.5 mg/ml do tačno ili oko 500 mg/ml, još bolje tačno ili oko 1 mg/ml do tačno ili oko 250 mg/ml, i još bolje tačno ili oko 10 mg/ml do tačno ili oko 100 mg/ml, najbolje tačno ili oko 55 mg/ml.

Ovaj pronalazak uključuje tečne formulacije. Preporučeni rastvarač je voda za injekcije.

Tečne formulacije mogu biti mono-dozne ili multi-dozne. One tečne formulacije interferona ovog pronalaska koje su namenjene za multi-doznu upotrebu po mogućstvu uključuju i bakteriostatski agens kao što je fenol, m-kresol, p-kresol, o-kresol, hlorokresol, benzil alkohol, alkilparaben (metil, etil, propil, butil i slično), benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, natrijum dehidroacetat i timerosal. Posebno se preporučuju fenol, benzil alkohol i m-kresol, a još bolje benzil alkohol. Ovaj bakteriostatski agens se koristi u količini koja će dati koncentraciju koja je delotvorna da održi formulaciju suštinski bez bakterija (pogodnu za injekcije) tokom multidoznog perioda doziranja, koji može biti tačno ili oko 12 ili 24 časova do tačno ili oko 12 dana, po mogućstvu tačno ili oko 6 do tačno ili oko 12 dana. Ovaj bakteriostatski agens je po mogućstvu prisutan u koncentraciji od tačno ili oko 0.1% (masa bakteriostatika/masa rastvarača) do tačno ili oko 2.0%, još bolje tačno ili oko 0.2% do tačno ili oko 1.0%. U slučaju benzil alkohola, posebno se preporučuju koncentracije od 0.2 ili 0.3%). Međutim, upotreba konzervansa, na pr. benzil alkohola, nije oganičena na multi-dozne formulacije, vež se mogu dodavati i u mono-dozne formulacije.

Raspon interferona u formulacijama ovog pronalaska uključuje količine koje po rekonstituisanju daju koncentracije od oko 1.0 pg/ml do oko 50 mg/ml, iako se mogu koristiti i više i niže koncentracije što zavisi na koji način će se davati, odnosno u kom nosaču, na pr., rastvor formulacija će se razlikovati za transdermalni flaster, pulmonarne, transmukozne, ili osmoske metode ili pak za mikro pumpu. Koncentracija interferona je po mogućstvu tačno ili oko 5.0 pg/ml do tačno ili oko 2 mg/ml, još bolje tačno ili oko 10 pg/ml do tačno ili oko 1 mg/ml, najbolje tačno ili oko 30 pg/ml do tačno ili oko 100 pg/ml.

Po mogućstvu formulacije ovog pronalaska zadržavaju najmanje tačno ili oko 60%, još bolje najmanje tačno ili oko 70 %, najbolje najmanje tačno ili oko 80% aktivnosti interferona u vreme pakovanja tokom perioda od 24 meseci.

U još jednom preporučenom obliku, ovaj pronalazak obezbeđuje metodu za proizvodnju tečnog farmaceutskog sastava koji je gore opisan.

U još jednom preporučenom obliku, ovaj pronalazak pruža metodu za proizvodnju pakovanog farmaceutskog preparata koji obuhvata stavljanje rastvora koji sadrži aktivni sastojak i ekscipijense kako je gore opisano.

U još jednom preporučenom obliku, ovaj pronalazak obezbeđuje jedan artikal za proizvodnju za farmaceutsku upotrebu kod ljudi, u koji spadaju bočica sa farmaceutskim preparatima kako je gore opisano, i pisani material koji navodi da takav rastvor može da se čuva tokom perioda od tačno ili oko 24 časa ili duže posle prve upotrebe. Po mogućstvu, ovaj pisani material navodi i da se ovaj rastvor može čuvati do tačno ili oko 12 dana.

Posle prve upotrebe multi-dozne formulacijr ona se može čuvati i koristiti najmanje tačno ili oko 24 časova, po mogućstvu najmanje tačno ili oko 4, 5 ili 6 dana, još bolje i do 12 dana. Posle prve upotrebe ove formulacije najbolje je da se čuva na temperature ispod soble (t.j. odnosno na tačno ili oko 25°C), još bolje ispod tačno ili oko 10°C, još bolje tačno ili oko 2-8°C, najbolje tačno ili oko 4-6°C.

Formulacijvv ovog pronalaska mogu se pripremiti procesom koji obuhvata dodavanje izračunatih količina ekscipijensa u puferovani rastvor i zatim dodavanje interferona.

Dobijeni rastvor se onda puni u bočice, ampule ili punjenja. Varijacije ovog procesa biće prepoznate od strane osobe koja je stručna za ovu oblast. Na primer, redosleed kojim se dodaju komponente, bilo da se dodaju i aditivi, temperatura i pH na kojoj se ova formulacija priprma, sve predstavljaju gfaktore koji se moraju optiumalizovati za datu koncentraciju i način davanja koji se koristi.

U slučaju formulacije za multi-doznu upotrebu, može se dodati i bakteriostatski agens u rastvor sa sadržćajem aktivnog sastojka (interferon) ili alternativno može sečuvati u odvojenoj bočici ili punjenju i potom umešati u rastvor sa sdržajem aktivnog sastojka u trenutku upotrebe.

Formulacije ovog pronalaska mogu se davati korišećnjem sredstava koja su poznata. U primere koji obuhvataju ove sisteme sa jednom bočicom spadaju naprave za samoubrizgavanje, i tzv. olovka špric kojim se daje rastvor kao što je Rebiject®.

U proiuzvode za koje se ovde traži zaštita spada i material za pakovanje. Taj material za pakovanje obezbeđuje, uz informacije koje su potrebne po zahtevu regulatornih vlasti, i uslove pod kojima se proizvod može koristiti. Materijal za pakovanje ovog pronalaska uključuje i uputstva za pacijenta, ako je potrebno, da pripremi finalni rastvor i id a upotrebi takav finalni rastvor tokom perioda od dvadeset četiri časa ili dužem za dve bočice, mokra/suva, proizvoda. Kada se radi o samo jednoj bočici, rastvoru proizvoda, na etiketi piše da takav rastvor može da se koristi tokom perioda od period od dvadeset četiri časa ili dužem. Proizvodi za koje se sada traži zaštita su korisni za upotrebu kao farmaceutski proizvodi za upotrebu kod ljudi.

Stabilne formulacije sa konzervansom mogu se obezbeđivati za pacijente kao bistri rastvori. Ovakav rastvor može biti za pojedinačnu upotrebu ili se može ponovo koristiti više puta i može biti dovoljan za samo jedan ili više ciklusa terapije pacijenta, i na taj način obezbediti pogodniji terapijski režim od onoga koji trenutno postoji.

interferon u bilo stabilnim formulacijama ili rastvorima ili sa sadržajem konzervansa onako kako je to ovde predstavljenomože da se daje pacijentu u skladu sa ovim pronalaskom korišćenjem različitih metoda kao što su SC ili IM injekcije; transdermalno, pulmonarno, transmukozno, u vidu implanta, osmotske pumpe, punjenja, mikro pumpe, oralno, ili na druge načine koje osmisle stručnjaci, koji su poznati u struci.

Izraz “bočica" u širem smislu označava posudu koja je pogodna da se u njoj čuva interferon u čvrstom ili tečnom stanju u zatvorenom, sterilnom pakovanju form. U primere bočice u smislu u kome se taj izraz ovde koristi spadaju ampule, punjenja, blister pakovanja, ili druga slična pakovanja koja su pogodna za davanje interferona pacijentu uz pomoć šprica, pumpe (uključujući osmotsku), katetera, transdermalnog flastera, pulmonarnog ili transmukoznog spreja. Bočice koje su pogodne za pakovanje proizvoda za parenteralno, pulmonarno, transmukozno, ili transdermalno davanje dobro su poznate i priznate u struci.

Izraz “terapija” u kontekstu ovog pronalaska odnosi se na svako korisno dejstvo na progresiju bolesti, uključujući njeno smanjenje, ublažavanje, slabljenje ili povlačenje patološkog razvoja po početku bolesti.

Farmaceutski sastavi ovog pronalaska koji obuhvataju IFN ili izoform, mutein, fuzirani protein, funkcionalni derivat, aktivnu frakciju ili so su korisni za dijagnostiku, prevenciju, i terapiju (lokalnu ili sistemsku) kliničkih indikacija koje reaguju na terapiju ovim polipeptidom. U ovakve kliničke indikacije spadaju, na primer, pormećaji ili oboljenja centralnog nervnog sistema(CNS), mozga, i/ili kičmene moždine, uključujući multiplu sklerozu; autoimune bolesti, uključujući reumatoidni artritis, psorijazu, Kronovu bolest; i razne vrste raka, uključujući dojku, prostatu, bešiku, bubrege i debelo crevo.

Sva literature koja je ovde citirana, uključujući i članke iz časopisa ili apstrakte, objavljene ili neobjavljene u SAD ili prijave za patente u inostranstvu, patente koji su registrovani u SAD ili u inostranstvu samim pozivanjem na njih u potpunosti su uključeni u ove zahteve, uključujući i sve podatke, tabele, slike i tekst koji su dati u tim citiranim referentnim jedinicama. Uz to, celokupni sadržaj citirane literature takođe je samim citiranjem uključenn u ovaj tekst.

Pozivanje na poznate korake metoda, konvencionalne korake metoda, poznate metode ili konvencionalne metode ni na koji način ne predstavlja priznanje da je ma koji aspect, opis ili oblik ovog pronalaska opisan, pokazan ili predložen u relevantnoj struci.

Gore prikazani opis specifičnih oblika će tako u celini otkriti opštu prirodu ovog pronalaska tako da i drugi mogu, koristeći znanja koja su već poznata u struci (uključujući sadržaj citiranih literaturnih jedinica), da lako modifikuju i/ili adaptiraju za različite primene ove specifične oblike, bez nepotrebnog eksperimentisanja, i n e udaljavajući se od opšteg koncepta ovog pronalaska. Prema tome, ovakve adaptacije i modifikacije imaju za cilj da ostanu u smislu raspona ekvivalenata otkrivenih oblika, na osnovu znanja i usmerenja koji su izneti ovde. Razume se takođe da izrazi ili terminologija koji su ovde dati služe samo za svrhe opisa, a ne za ograničavanje, tako da izrazi ili terminologija koji su korišćeni u ovoj speciifkaciji treba da se tumače od strane stručnjaka za ovu oblast u svetlu znanja i smernica koji su sadržani, u kombinaciji sa stručnim znanjima uopšte.

OPIS SLIKA

Slika 1: Beleži procenat oksidizovanih formi koje su prisutne u multidoznim formulacijama Interferona beta-1a sa različitim koncentracijama benzil alkohola po čuvanju na 40°C.

Slika 2: Beleži procenat oksidizovanih formi koje su prisutne u multidoznim formulacijama Interferona beta-1a sa različitim koncentracijama benzil alkohola po čuvanju na 25°C.

Slika 3: Beleži procenat oksidizovanih formi koje su prisutne u multidoznim formulacijama Interferona beta-1a sa različitim koncentracijama benzil alkohola po čuvanju na 2-8°C.

Slika 4: Beleži procenat ukupnih agregata, koji su prisutni u multidoznim formulacijama Interferona beta-1a sa različitim koncentracijama benzil alkohola po čuvanju na 40°C. Slika 5: Beleži procenat ukupnih agregata, koji su prisutni u multidoznim formulacijama interferona beta-1a sa različitim koncentracijama benzil alkohola po čuvanju na 25°C. Slika 6: Beleži procenat ukupnih agregata, koji su prisutni u multidoznim formulacijama Interferona beta-1a sa različitim koncentracijama benzil alkohola po čuvanju na 2-8°C.

Slika 7: Beleži procenat oksidizovanih formi koje su prisutne u multidoznim

formulacijama Interferona beta-1a sa alternativnim bakteriostatskim agensima po čuvanju na 25°C.

Slika 8: Beleži procenat oksidizovanih formi koje su prisutne u multidoznim

formulacijama Interferona beta-1a sa alternativnim bakteriostatskim agensima po čuvanju na 2-8°C.

Slika 9: Beleži procenat ukupnih agregata, koji su prisutni u multidoznim formulacijama Interferona beta-1a sa alternativnim bakteriostatskim agensima .

Slika 10: Beleži procenat oksidizovanih formi koje su prisutne u multidoznim

formulacijama Interferona beta-1a sa sadržajem EDTA po čuvanju na 25°C.

Slika 11: Beleži procenat ukupnih agregata koji su prisutni u multidoznim formulacijama Interferona beta-1a sa sadržajem EDTA po čuvanju na 25°C.

Slika 12: pokazuje delotvornost 0.012% L-Metionina kao antioksidansa (na 2-8°C)

Slika 13: pokazuje delotvornost 0.012% L-Metionina kao antioksidansa (na 25 ± 2°C)

PRIMERI

Primer 1 - Tečna mono-dozna formulacija Interferona beta-1a Bez HSA u već napunjenim špricevima

1.1 Preliminarno ispitivanje kompativbilnosti

Preliminarni eskperimenti su sprovedeni da se zaštitno dejstvo koje su pokazali neki ekscipijensi kao što su antioksidanti i surfaktanti, budući da se očekuje da bi eliminacija humanog serumskog albumina (HSA) iz tekućeg proizvoda mogla da utiče na proizvod u smislu oksidacije, stvaranja agregata i adsorpcije na površine.

Interferon beta-1a je formulisan u koncentracijama od 44 mcg/ml i 88 mcg/ml u natrijum acetatnom puferu sa sadržajem 54.6 mg/ml manitola u kombinaciji sa nekoliko ekscipijenasas kao što su 0.4% HSA, 0.012% L-Metionin, Tvveen 20 (0.005%, 0.007%, 0.01%), Poloxamer 188 (u konc. od 0.05%, 0.1%, 0.5%). Ove različite kombinacije su izložene stresnim uslovima (bilo čuvanje na 40°C ili u morteks mikseru) i onda su testirani na oskidaciju (pomoću RP-HPLC) i agregaciju (pomoću SE-HPLC).

Tabele DEP-1 i -2 rezumiraju nivoe oksidacije i aggregcije posle 2 nedelje čuvanja na 40°C. Ova kombinacija Interferona beta-1a sa oba testirana surfaktanta (Tvveen 20 i Poloxamer 188) dovela je do povećanja nivoa oksidacije koja je, za svaki od ovih tipova surfaktanta, zavisna od koncentracije (Tabela DEP-1, kombinacije #4-6 i #7-9); na nivou od 0.5% Poloxamer 188 (koji se pominje i kao pluronic F-68 ili F-68), supstanca leka se potpuno razgrađuje (Tabela DEP-1, #9). Veća brzina razgradnje se beleži za 20, kao što je i očekivano, zbog vrste koja oksidiše (na pr. peroksidi) koja može da bude prisutna kao ostatak od sinteze.

Oba surfaktanta u različitim testiranim koncentracijama ne utiču na nivo agregacije po čuvanju na temperaturi od 40°C (Tabela DEP-2).

Tabela DEP-1 oksidizovane forme (%) pomoću RP-HPLC posle čuvanja na 40°C

Tabela DEP-3 pokazuje da oba surfaktanta,Tween 20 i Poloxamer 188 (F-68), koji se koriste u kritičnim micelarnim koncentracijama (CMC), pomažu da se spreči agregacija koja se inače izaziva S.ominutnim mešanjem u vorteksu.

1.1.1 Fiziko-hemiiske osobine

Fizikohemijske osobine za koje se zna da su kritične za kvalitet medicinskog proizvoda predstavljaju količinu oksidacije i dimera/agregata. Ove osobine su proučavane u ispitivanjima kompatibilnosti, i gore su ukratko prikazane.

1.2 Ekscipiiensi

1.2.1 10 mM natriium acetatni pufer. pH 3.5

10 mM natrijum acetatnog pufera na pH 3.5 sa sadržajem 54.6 mg/mi manitola kao agensa za izotoničnost stabilizuje proizvod, kao šzto je pokazano tokom prethodnog razvoja proizvoda koji se trenutno nalazi na tržištu (Rebif®) i kao što je prikazano u EP 759,775.

1.2.2 Poloxamer188

Poloxamer 188 (ili Pluronic F-68) je uključen u formulaciju na nivou od 0.1% (kritična micelarna koncentracija) da bi se sprečila adsorpcija lekovite supstance na površinu posuda tokom procesa proizvodnje; veće koncentracije mogu negativno da utiču na stabilnost proizvoda (jača oksidacija); nića koncentracija može da bude manje efikasna u ogrtaničavanju adsorpscije.

Delotvornost Poloxamera 188 za sprečavanje adsorpcije lekovite supstance tokom procesa proizvodnje pokazana je u narednoj studiji:

rastvori sa sadržajem 44 mcg/ml interferona beta-1a kombinovani su sa 3 različite koncentracije surfaktanta (Tvveen 20 ili Poloxamer 188) ili HSA, podržavajući process proizvodnje; uzorci su uzeti u različitim koracima (objedinjavanje, aseptična filtracija, punjenje) i testirani kvantitativno metodom RP-HPLC.

Uzeti su sledeći uzorci:

- pre filtracije (BF)

- posle prve filtracije (AF1)

- posle druge filtracije (AF2)

- posle punjenja (gotov proizvod u T=0)

Ovi rezultati su priokazani na Tabeli DEP-4 i izraženi su kao zadržana vrednost (%) u poređenju sa inicijalno mvrednošću (t.j. objedinjeni rastvor prefiltracije): Poloxamer 188 je delotvorniji od Tvveen 20, ali jednako delotvoran kao HSA za sprečavanje adsorpcije lekovite supstance tokom proizvodnje.

Rzličiti gradusi Poloxamera 188 dobijeni od različitih snabdevača ispitivani su u smislu proizvoda oksidacije po ubrzanim uslovima (2 nedelje na 40°C) da se definiše kvalitet koji će se koristiti: Poloxamer 188 proizvođača BASF je odabran zato što on daje najniži nivo oksidacije i usporučuje se u obliku farmaceutski čistog gradusa. Rezultati su ukratko prikazani na Tabeli DEP-5:

1.2,3 L-Metionin

L-Metionin (L-Met) je uključen u formulaciju na nivou od 0.012% da ograniči oksidaciju. Delotvornost ove koncentracije je prikazana u predenju sa formulacijom koja ne sadrži L-Metionin; veće koncentracijae (0.05%, 0.1% ) L-Metionina pkkazuju uporedivo dejstvo na stabilnost. Proizvodi oksidacije koji su otkriveni po čuvanju na temperature od 40°C prikazani su na Tabeli DEP-6.

Tokom razvoja ove formulacije, delotvornost formulacije L-Metionin kao antioksidansa potvrđena je podacima o 3 meseca stability na 2-8°C i 25 ± 2°C, što je dobijeno sa formulacijama koje su sadžale L-Metionin u kombinaciji sa surfaktantima: L-Metionin je delotvoran kao antioksidans na nivou od 0.012% i može da garantuje

stabilnost uporedivu sa onom koja je registruje sa tekućim proizvodom (vidi Slike 12 i

13).

1.3 Medicinski proizvod

1.3.1 Razvoj formulacije

Razvoj nove formulacije Interferona beta-1a bez HSA fokusira se na potvrđivanje rezultata preliminarnih istraživanja (delotvornost L-metionina kao antioksidana, uključivanje Poloxamera 188 da se spreče gubici tokom procesa proizvodnje) u krajnje pakovanje (posudu).

Pripremljeni su rastvori Interferona beta-1a na 44 mcg/ml i 88 mcg/ml sa sadržajem 54.6 mg/ml manitola u 10 mM natrijum acetatnog pufera na pH 3.5 uključeni su sledeći ekscipijensi:

• Tvveen 20 (0.003%, 0.007%, 0.02%)

• Poloxamer 188 (0.05%, 0.1%, 0.2%)

• L-Metionin (0%, 0.012%)

• HSA (0.4%, tekuća formulacija, obeležena kao "ref")

The composition of the formulacijas that were investigated is shovvn in Tabela

DEP-7.

Ove formulacije su proizvedene u skladu sa dole opisanom procedurom:

90 ml svake od formulacija proizvedeno je u aseptičnim uslovima, tako što su kombinovane potrebne ekscipijensa rastvarane u void za injekcije (VZI) s lekovitom supstancom (Interferon beta-1a); ove formulacije su potom filtrirane kroz membranu od 0.22 pm (filtrirane dva puta kroz dva membranska filtera) i 0.5 ml od svakog rastvora punjeno u staklene špriceve Hypak od 1 ml. Veličina ove serije iznosila je otprilika 180 špriceva.

Ove formulacije su potom čuvane na 2-8°C, 25 ± 2°C i 40 ± 2°C, i testirana im je stabilnost posle do 12 nedelja (do 6 nedelja za uzorke koji su čuvani na 40 ± 2°C).

Tokom razvoja korišćeni su sledeći analitički testovi i metode (Za detaljniji opis ovih testova vidi Primer 2):

- bioaktivnost (CPE bioesej)

- esej (RP-HPLC metod)

- proizvodi oksidacije (RP-HPLC metod)

- dimeri/agregati (SE-HPLC metod i SDS-PAGE)

- pH (potenciometrijska metoda)

- osmolalnost (krioskopsko merenje)

Rezultati I njihova procena prikazani sun a Tabelama DEP-8 do DEP-17.

Nagibi izračunati linearnom regresionom analizom koji su ukratko prikazani na Tabeli DEP-9 pokazuju smanjenje biološke aktivnosti za sve formulacije sa sadržajem Tween 20 (#1, 2, 3, 9) i koje su čuvane na 40°C; smanjenje bioaktivnosti je takođe

zabeleženo za formulacije #3 i 6 (najveće koncentracije of surfaktanata) posle čuvanja

na temperaturi od 25°C i 2-8°C.

Nagibi izračunati linearnom regresionom analizom I rezimirani na Tabeli DEP-11 pokazuj veći gubitak sadržaja proteina za formulacije sa sadržajem Tween 20 (#1, 2, 3, 9) koje se čuvaju na 40°C; isti trend je zanbeležen I na 25°C kao I za formulacije

#5 i 6. Do značajnog smanjenja sadržaja proteina dolazi na 2-8°C za formulacije #1,2, 3 (sa Tween 20), 4, 5 (sa Poloxamer 188) i 9 (sa Tween 20 i L-Metionin).

Nagibi izračunati linearnom regresionom analizoma koji su ukratko prikazani na Tabeli DEP-13 pokazuju da formulacije sa sadržajem Tvveen 20 imaju veću brzinu oksidacije u poređenju sa formulacijama sa sadržajem Poloxamer 188 dok ovaj nivo oksidacije zavisi od koncentracije Tvveen 20.

Delotvornost L-Metionina za ograničavanje oksidacije na različitim temperaturama koje su ovde ispitivane pokazan je poređenjem formulacija #9 (Tvveen 20+L-Metionin) sa #3 (Tvveen 20) i formulacija #10 (Poloxamer 188+L-Metionin) sa #6 (Poloxamer 188).

* by SDS-PAGE

Nagibi izračunati pomoću linearne regressione analize i dati u rezumiranom obliku na Tabeli DEP-15 pokazuju da nema značajnijeg porasta ukupne količine agregata u sadržaju po čuvanju na različitim temperaturama.

Posle čuvanja nije primećena promena pH

Osmolality testiranih formulacija je odgovarajuća.

Na osnovu rezultata razvijanih formulacija, odabrana je formulacija bez HSA:

• 44 ili 88 mcg/ml Interferona beta-1a u natrijum acetatnom puferu pH 3.5 sa sadržajem

• 54.6 mg/ml manitola,

• 1 mg/ml Poloxamera 188

• 0.12 mg/ml L-Metionina.

1.3.2 Viškovi

Nikakvi viškovi nisu korišćeni.

1.3.3 Fizikohemiiska i biološka svojstva

Ove osobine u u razvoju ove formulacije uzete u obzir i korišćene na način koji je opisan gore.

1.4 Razvoj procesa proizvodnje

14.1 Razvoj procesa proizvodnje

Tekući process proizvodnje adaptiran je iz preprata nove formulacije na laboratorijskom nivou: supstance leka je direktno kombinovana sa sastojcima; zatim je rađena dvostruka; filtracije da bi se podržavao process koji se obavlja kada se radi industrijski i kada se predviđaju aseptične filtracije posle čega idu filtracije tokom samog procesa, a pre punjenja u špriceve.

Both the filtracije steps i the syringe filling were performed under laminarflovv.

A description of each step of the process is given hereposle.

1.4.2 Preliminarna izračunavanja

Količina supstance leka Interferon beta-1a D(mg) koja je potrebna da se dobije rastvor od 44 mcg/ml:

D(mg) = 44 mcg/ml x 90 ml = 3960 mcg = 3.96 mg Zapremina Interferona beta-1a kao lekovite suspstance B(ml) odgovara količini D(mg): B(ml) = 3.96 mg: skupni titar (mg/ml)

Zapremina ekscipijensa rastvora V(ml) koja je potrebna da se dobije 90 ml rastvora 44 mcg/ml:

V(ml) = 90 ml - B(ml) *

* (d s 1 g/ml)

1.4.3 Priprema 1 M rastvora natriium hidroksida Rastvor 1 M natrijum hidroksida pripremljen je u VZI.

1.4.4 Priprema 0.01 M natriium acetatnog pufera pH 3.5

Odgovrajuća količina giacijalne sirćetne kiseline dodata je u VZI, a pH je doteran do 3.5 ± 0.2 korišćenjem 1 M NaOH ili 50% razblaženu sirćetnu kiselinu. Ovaj rastvor raztvro je dopunjen do pune zapremine korišćenjem VZI.

1.4.5 Priprema rastvora ekscipijensa

Izračunata količina ekscipijensa (manitol, Tvveen 20 ili Poloxamer 188, L-Metionin) izmerena je i rastvorena u potrebnoj količini 0.01 M natrijum acetatnog pufera pH 3.5; zatim je ovaj pH provrene i podešen, po potrebi, do vrednosti od 3.5 ± 0.2 korišćenjem 1M NaOH ili 50% razblažene sirćetne kiseline; Ovaj rastvor je onda dopunjen do konačne težine sa 0.01 M natrijum acetatnog pufear.

1.4.6 Kombinovanie rastvora lekovite supstance

Potrebna količina B(g) lekovite supstance Interferona beta-1a dodaje se u potrebnu količinu rastvora ekscipijena V(g) i blago mesa do homogenosti.

1.4.7 Prve filtraciie rastvora lekovite supstance

The compounded rastvor is then filtered through a 0.2 pm nylon membrane (Ultipor N66 0.2 pm, 0 2.5 cm, Pali), mounted into a stainless Steel holder, under nitrogen pressure (1 bar max) i collected into a glass beaker.

1.4.8 Druge filtraciie rastvora lekovite supstance

Rastvor iz prthodne filtracije se zatim ponovo filtrira kroz novu najlonsku membranu 0.2 pm pod istim uslovima.

1.4.9 Punjenje špriceva

Stakleni špricevi od 1 ml aseptično su ponjeni sa 0.5 ml ovog finalnog rastvora.

1.4.10 Temperature tokom procesa

Tokom celog procesa temperatura je održavana najbliže moguće uslovima u frižideru, tako što se koristila VZI koja je držana u frižiderum kao i tako što su rastvor ekscipijensa i pomešani rastvori držani na 2-8°C.

Primer 2 - Tečna multi-dozna formulacija Interferona beta-1a bez HSA u puneiniima koiia su pogodna za napravu za samoubrizaavanie

Potreba da se razvije jedan multi-dozni proizvod product u punjenjima pojavila se tokom razvoja nove formulacije bez HSA koja je imala za cilj da se eliminiše HSA iz proizvoda koji se trenutno iznose na tržište u špricevima . Ovakva multi-dozna formulacija bi povećala konfor i lakoću davanja za pacijenta, tako što bi se omogućilo da sam sebi daje injekciju napravom za samoubrizgavanje.

Najčešće korišćeni bakteriostatski agensi (0.3% m-kresol, 0.5% fenol i 0.9% benzil alkohol) inicijalno su ispitivani u kombinaciji sa aktivnom supstancom i upoređeni sa mono-doznom formulom u špricu koji je odabran u svetlu razvoja mono-dozne formulacije (44 ili 88 mcg/ml Interferon beta-1a, 54.6 mg/ml manitol, 1 mg/ml Poloxamer 188, 0.12 mg/ml L-metionin u 10 mM natrijum acetatnog pufera na pH 3.5); Zabeleženo je sledeće:

• Uključivanje svakog od bakteriostatskih agenasa, u koncentracijama koje se uobičajeno koriste da se spreči mikrobiološka kontaminacija određuju povećanje oksidizovanih oblika i dovode do dramatičnog povećanja agregacije;

• 0.3% m-kresol i kombinacija 0.5% fenola sa 0.1% Poloxamer 188 dovela je do dramatičnog povećanja agregacije.

Na osnovu informacija dobijenih tokom pred-formulacije, razvoj ove formulacije inicijalno je bio fokusiran na benzil alkohol i fenol (bez Poloxamera 188) kao in a dodatne bakteriostatske agense (hlorobutanol, feniletanol); EDTA je takođe ispitivan u kombinaciji sa benzil alkoholom: oksidacija i agregacija aktivnog leka bili su gralni putevi razgradnje koji su proučavani; pokazano je da redukcija količine benzil alkohola u ovoj formulaciji produžava rok trajanja samog proizvoda.

Nijedan drugi agens od svih koji su u funkciji konzervansa ispitivani tokom ove faze koje se doveo po značajnog poboljšanja stabilnosti proizvoda.

Na kraju razvoja ove formulacije izdvojene su sledeće moguće, kandidatske multi-dozne formulacijt:

• Formulacija B - 264 mcg Interferona beta-1a, 163.8 mg manitola, 3 mg Poloxamera 188, 0.36 mg L-metionina, 6 mg benzil alkohola u 3 ml 10 mM natrijum acetatnog pufera pH 3.5

• Formulacija A - 264 mcg Interferona beta-1a, 163.8 mg manitola, 3 mg Poloxamera 188, 0.36 mg L-metionina u 2.7 ml 11 mM natrijum acetatnog pufera pH 3.5 što treba pomešati sa 0.3 ml 3% benzil alkohola u VZI dobijajući na taj način finalnu multi-doznu formulaciju.

Za svaku od ovih kandidatskih formulacija napravljene su serije na laboratorijskom nivou i testirana je stabilnost korišćenjem mmetoda koje stabiulnost ispituju za period do to 6 meseci: ni u jednoj od kandidatskih formulacija nije došlo do značajnije razgradnje po čuvanju na 2-8°C; glavna degradacija nastaje u uslovima ubrzanja (25“C) i to je oksidacija.

Na kraju ove studije, identifikovane su dve kandidatske multi-dozne formulacije koje su imale sličan profil stabilnosti:

• Formulacija B je multi-dozna formulacija spremna za upotrebu sa sadržajem 0.2% benzil alkohola;

• Formulacija A is multi-dozna formulacija sa sadržajem 0.3% benzil alkohola koja se dobija po mešanju sadržaja 2 punjenja (jedno sa sadržajem aktivnog principa i ekscipijensa i jedno sa sadržajem potrebne količine benzil alkohola da se dobije finalni oblik).

2.1 Čili studije

2.2 Eksperimentalni deo

2.2.1 Materijali lnterferon-beta-1a (Serono S.A.)

Manitol DAB, Ph Eur, BP, USP, FCC, E421 (Merck)

Glacijalna sirćetna kiselina 100 % GR (Merck)

Natrijum hidroksid pelete GR (Merck)

Poloxamer 188 (Lutrol F 68 DAC, USP/NF, BASF)

L-Metionin za biohemiju (Merck) m-kresol za sintezu (Merck)

Fenol za sintezu (Merck)

Benzil alkohol Ph Eur, BP, NF (Merck)

Hlorobutanol (Aldrich)

Feniletanol (Sigma)

Natrijum metilparaben BP, USP/NF (Formenti)

Natrijum propilparaben BP, USP/NF (Formenti)

EDTA dinatrijum so (Fluka)

1,2-Propanediol ekstra čisti DAB, Ph Eur, BP, USP (Merck)

Acetonitril (Merck)

Trifluorosirćetna kiselina (Baker)

Heptafluorobutirična kiselina (Pierce)

2.2.2 Oprema HPLC sistemi (Vodaš)

Millenium 32 Softvvare (Vodaš)

Osmometer (Osmomat 030-D, Gonotec) pH metar (mod. 654, Metrohm)

Kalibrisane pipete (Gilson)

Ultipor N66 0.2 pm najlon membrane, FTKNF, 0 4.7 cm (Pali)

Ultipor N66 0.2 pm najlon membrane, NR14225, 0 14.2 cm (Pali)

Držači od nerđajućeg čelika, 0 4.7 cm i 0 10 cm (Sartorius)

Rezervoar od nerđajućeg čelika (Sartorius)

C4 kolona 5pm (0.46x25cm) (Baker)

C4 kolona, Supelcosil LC-304 5|j.m (0.46x25cm) (Supelco)

TSK kolona, G2000SWXL (0.46x25cm) (TosoHaas)

2.3 Pred formulaciisko ispitivanje

Najčešće korišćeni bakteriostatski agenss (0.3% m-kresol, 0.5% fenol i 0.9% benzil alkohol) inicijalno su ispitivani u kombinaciji sa aktivnom supstancom i različitim mešavinama ekscipijenasa u finalnoj posudi/pakovanju (punjenja od 3 ml): acetatni pufer, acetatni pufer/manitol, acetatni pufer/manitol/L-Met/Poloxamer 188. Kompativilnost aktivne supstance u ovim različitim okruženjima ispitivana je u smislu oksidacije (pomoću RP-HPLC) i agregacije (pomoću SE-HPLC) po čuvanju na 40°C. Rezime formulacija koje su ispitivane tokom različitih koraka u ovoj preliminarnoj fazi prikazanje na Tab. 1.

Dejstvo uključivanja svakog od ovih bakteriostatskih agenasa upoređivano je sa mono-doznom formulom (referentna) koja je odabrana u okviru razvoja mono-dozne formulacije u špricu (44 ili 88 mcg/ml Interferona beta-1a, 54.6 mg/ml manitola, 1 mg/ml Poloxamear 188, 0.12 mg/ml L-metionina u 10 mM natrijum acetatnog pufera na pH 3.5).

Ace = 10 mM natrijum acetatni pufer pH 3.5; Man = 54.6 mg/ml; Plu = 1 mg/ml Poloxamer 188; Meti =0.12 mg/ml L-metionin; Met2 = 0.24 mg/ml L-metionin; CR = 3 mg/ml m-kresol; PH = 5 mg/ml fenol; BA = 9 mg/ml benzil alkohol

2.4 Razvoj formulacije

Na bazi informacija dobijenih tokom perioda pred formulacije, razvoj same formulacije inicijalno se fokusirao na benzil alkohol i fenol; ispitivani su i drugi potencijalni konzervanski kao što su hlorobutanol, feniletanol, kao i EDTA u kombinaciji sa benzil alkoholom. Jedna komparativna formulacija (MS-3), koja odgovaran novoj

mono-doznoj formulaciji Interferona beta-1a Bez HSA pripremljena je takođe u puinjenjima i korišćena referentna.

Sastav (izražen u mg/ml) ovih formulacija proizvedenih tokom ove faze prikazan je na Tabelama 2 do 5:

Na kraju razvoja ovih formulacija identifikovane su sledeće kandidatske multi-dozne formulacije:

• Formulacija B - 264 mcg Interferona beta-1a u 3 ml acetatnog pufera na pH 3.5 sa sadržajem 54.6 mg/ml manitola, 1 mg/ml Poloxamera 188, 0.12 mg/ml L-Metionina i 2 mg/ml benzil alkohola (0.2% benzil alkohol)

• Formulacija A - 264 mcg Interferona beta-1a u 2.7 ml acetatnog pufera na pH 3.5 sa sadržajem 54.6 mg/ml manitola, 1 mg/ml Poloxamera 188 i 0.12 mg/ml L-Metionina što treba pomešati sa 0.3 ml 3% benzil alkohola u VZI in a taj način dobiti finalnu multi-doznu formulaciju (0.3% benzil alkohol)

2.5 Test efikasnosti konzervansa

Multi-dozne formulacije sa sadržajem različitih koncentracija benzil alkohola (0.2% do 0.9%) ispitivane su da se utvrdi efikasnost konzervansa korišćenjem testova koje propisuju EP i USP Pharmacopeia.

Preliminarni testovi were urađeni su tako što su kao indikatori odabrani Staphylococcus aureus, Aspergillus niger i Candida albicans: dokaz da kiseli pH ove formulacije sam po sebi ima bakteriostatsko dejstvo na bakterije (Staphylococcus aureus) i i činjenica da je zabeleženo da neki sojevi Candida albicans preživljavaju in a veoma niskim vrednostima pH (pH oko 2) doveli su do toga da se odabere Candida albicans kao kritični indikator za ovaj test. Primenjeni su kriterijumi za prihvatanje testa efikasnosti konzervansa koji su opisani i u EP, i u USP Pharmacopeia.

2.6 Kandidatske formulacije

2.6.1 Formulacija A

Proizvedene su tri serije laboratorijske veličine od oko 140 punjenja/seriji; sama formula data je na Tab. 6:

Tab. 6: Sastav multi-dozne formulacije A Interferona beta-1a

Aktivni sastojak je pomešan sa rastvorom ekscipijensa i potom filtriran kroz 0.22 pm najlonsku membranu; punjenja su punjena sa 2.7 ml finalnog rastvora. Uzorci su uzimani pre, posle filtracije i posle punjenja da se prati gubitak aktivnog principa tokom ovog procesa.

Uzorci su čuvani, a njihova stabilnost je testirana na 2-8°C (6 meseci), 25±2°C (3 meseci) i 40±2°C (1 month).

Proizvedene su tri laboratorisjke serije 3% benzil alkohola u VZI da bi se pomešao sa punjenjima koja su sadržajem aktivnog sastojka; Sastav ovih serija prikazanje na Tab. 7:

Tab. 7: Sastav 3% benzil alkohola u VZI

Potrebna količina benzil alkohola dodata je u VZI i potom filtrirana kroz 0.22 pm Durapore membranu; pounjenja su zatim napunejna sa 0.5 ml i terminalno sterilizovana u autoklavu.

Uzorci su potom čuvani na 25±2°C i testirani na sadržaj benzil alkohola i pH posle do mesec dana.

2.6.2 Formulacija B

Proizvedene su tri laboratorijske serije od oko 500 punjenja/seriji; njihov sstav prikazan je na Tab. 8;

Aktivni sastojak je pomešan sa rastvorom ekscipijensa i potom filtriran kroz 0.22 pm najlonsku membranu; onda su punjenja napunjena sa 3 ml finalnog rastvora. Uzorci su uzimani pre, posle filtracije i posle punjenja da bi se mogao pratiti gubitak aktivnog principa tokom ovog procesa.

Uzorci su čuvani I njihova stabilnost testirana na 2-8°C (6 meseci), 25±2°C (6 meseci) i 40±2°C (3 nedelje).

2.6.3 Test efikasnosti konzervansa

Ove kandidatske formulacije testirane su na efikasnost konzervansa prateći uputstva sadržana u EP i USP Pharmacopeia.

2.7 Analitički testovi i metode

Analitički testovi i metode koji su dole opisani korišćeni su da se prati stabilnost formulacija na laboratorijskom nivou: pH (potenciometrijska merenja)

Esej kvantitativnog određivanja proteina (RP-HPLC)

Kvantitativno određivanje proteina obavljano je na C4, Wide-Pore Butil 5 pm koloni (Baker); talasna dužina je podešena na 214 nm i elucija je obavljana na 1 mL/min korišćenjem sledeće mobilne faze i gradijenta:

A = voda/trifluorosirćetna kiselina 0.1% - B = acetonitril/trifluorosirćetna kiselina 0.1% -

C = acetonitril

Gradijent:

Trajanje prolaska = 65 min

Uzorci su analizirani tako što je ubrizgavano 100 jiL tih uzoraka u stanju u kome su bili (uzorci 44 mcg/mL) ili ili po diluciji (1:1) u ekvivalentnom placebu za uzorke koji su bili na 88 mcg/mL.

Kvantifikacija ovih uzoraka obavljana je u odnosu na standardnu krivu u rasponu od 0.0125 mg/mL-0.2 mg/mL koja je pripremljena sa standardnim referentnim materijalom.

Oksidizovane forme (RP-HPLC)

Kvantitativno određivanje oksidizovanih formi obavljeno je na C4, Supelcosil LC-304 koloni (Supelco) termostatom podešenoj na 40°C; talasna dužina je podešena na 208 nm i elucija je obavljana na 1 mL/min korišćenjem sledeće mobilne faze i gradijenta:

A = voda 60%/acetonitril 40%/Heptafluorobutirična kiselina 0.14% - B = voda 20% /Acetonitril 80%/ Heptafluorobutirična kiselina 0.14% - C = voda 20%/Acetonitril 80%/Triflurosirćetna kiselina 0.1%

Gradijent:

69’ 70%A 30%B 0%C Kriva 6

Trajanje prolaska: 96 minuta (70 min+ 26 min ekvilibracije)

Uzorci su analizirani u stanju u kome su bili ubrizgavanjem 200 pL (uzorci od 88 mcg/mL) ili 400 pL (uzorci od 44 mcg/mL).

Ukupno agregata (SE-HPLC)

Detekcija ukupne količine agregata u sadržaju obavljena je na TSK G2000SWXL koloni (TosoHaas); elucija je obavljena ma iizokratskom načinu rada na 0.5 mL/min korišćenjem acetonitrilivoda (30:70) + 0.2% trifluorosirćetna kiselina; talasna dužina je podešena na 214 nm. The trajanje prolaska je 20 min.

Uzorci su analizirani u stanju u kome su bili ubrizgavanjem 100 (aL (uzorci od 88 mcg/mL) ili 200 pL (uzorci od 44 mcg/mL).

Biološka aktivnost (in vitro bioesej)

Biološka aktivnost je merena antivirusnim esejem na bazi INF-p indukovane zaštite ćelija (WISH ćelije-humano amniotsko tkivo) u odnosu na citopatsko dejstvo virusa (Vezikularni virus stomatitisa).

Osmolalnost (kriooskopsko merenje)

Određivanje osmolalnosti obavljano je krioskopskim merenjem na osnovu depresije tačke mrženjenja koja je zabeležćena za testirani rastvor.

Određivanje benzil alkohola (GC)

Metoda GC za detekciju benzil alkohola koristi pristup kalibracije samo jedne tačke, a kao reference koristi se benzil alkohol koji proizvodi Merck. Uz to, koristi se i jedan interni standard (feniletii alkohol) da se normalizuju oblasti oko maksimalnih (vršen) u oba testitana uzorka, kontrolnom rastvoru uzorka i standardnom rastvoru. Ova metoda se obavlja na čeličnoj koloni od 6 stopa x 2mm ID sa 10% Carbowax 20M na mreži supelcoport 80/100. Detector je FID (plameni jonizujući detektor).

Rezultati su prikazani kao mg benzil alkohola na mL.

2.7.1 Resultati

2.7.1.1 _Pred-formulaciia

Nivoi oksidizovanih formi i ukupnih agregata koji su izmereni u uslovima stresa (40°C) prikazani su na Tabelama 9 i 10:

Ace = 10 mM natrijum acetatni pufer pH 3.5; Man = 54.6 mg/ml; Plu = 1 mg/ml Poloxamer 188; Meti = 0.12 mg/ml L-metionin; Met2 = 0.24 mg/ml L-metionin; CR = 3 mg/ml m-kresol; PH = 5 mg/ml fenol; BA = 9 mg/ml benzil alkohol

Ace =10 mM natrijum acetatni pufer pH 3.5; Man = 54.6 mg/ml; Plu = 1 mg/ml Poloxamer 188;Met1 =0.12 mg/ml L-metionin; Met2 = 0.24 mg/ml L-metionin; CR = 3 mg/ml m-kresol; PH = 5 mg/ml fenol; BA = 9 mg/ml benzil alkohol

Uvođenje svakog od bakteriostatskih agensa, u koncentracijama koje se uobičajeno koriste da se spreči mikrobiološka kontaminacija, odredilo je povećanje oksidizovanih formi i i dovelo do dramatičnog povećanja agregacije u poređenju sa mono-doznom formulacijom (Referentna).

Kombinacija 0.5% fenola i 0.1% Poloxamera 188 je imala negativno dejstvo na stabilnost ovog proizvoda budući da je doško do agregacije od oko 40% (formulacije P-Q-R).

0.3% m-kresol je isključen iz daljeg razvoja jer je on negativno delovao na stailnost proizovda zbog povećanja agredavije (formulacija I).

2.7.1.2_Razvoj formulacije

Svi podaci o stabilnosti (sirovi podaci) prikupljeni su u odgovarajućim Tabelama; za procenu ovih podataka korišćena je linearna regresiona analiza.

2,7.1.2.1_Formulacije sa sadržajem benzil alkohola

Visoka koncentracija benzil alkohola (0.9%) negativno je uticala na stabilnost proizvoda i u smislu oksidizovanih formi i sadržaja agregata, kao što je to prikazano na Slikama 1 do 6:

• Po izlaganju stresnim uslovima (40°C), povećanje oksidacije je veće kod formulacija sa sadržajem 0.9% benzil alkohola (MS-1 i MS-2), kao što to pokazuje Slika 1;

• Po izlaganju uslovima ubrzanja (25°C), povećanje oksidacije je veće kod svih formulacija sa sadržajem benzil alkohola u poređenju sa formulacijom bez benzil alkohola (MS-3, referentna), kao što to pokazuje Slika 2;

• Po dugoročnom čuvanju (2-8°C), veće stope oksidacije zabeležene su za formulacije sa sadržajem 0.9% benzil alkohola (MS-1 i MS-2); uporedive stope razgradnje bile su otkrivene za formulacije sa sadržajem benzil alkohola manjim od 0.45% (Slika 3).

Što se tiče nivoa agregata zabeleženo je siedeće:

• Po izlaganju stresnim uslovima (40°C), povećanje agregacije zabeleženo je za formulacije sa sadržajem 0.9% benzil alkohola (MS-1 i MS-2), kao što to pokazuje Slika 4;

Po ubrzanju I uslovima dužeg stajanja (25°C i 2-8°C), nije zabeleženo povećanje agregacije za sve formulacije, kao što to pokazuju Slike 5 i 6;

• Smanjenje bioaktivnosti zabeleženo je za formulacije sa 0.9% benzil alkohola (MS-1 i MS-2) na 40°C; ovo nije zabeleženo za iste uzorke koji su čuvani na temperaturama od 25°C i 2-8°C.

• Nije zabeleženo smanjenje titra po čuvanju na svim temperaturama.

• Nije došlo ni do kkave promene vrednosti pH shift po čuvanju na svim temperaturama.

2.7.1.2.2 Formulacije sa sadržajem alternativnog bakteriostatskog agensa (fenol. hlorobutanol. feniletanol)

Fenol (MS-4 i MS-5) je negativno uticao na stabilnost proizvoda u smislu oksidizovanih formi dok su hlorobutanol (MS-35) i feniletanol (MS-34 i MS-34b) pokazali stabilnost koja je bila slična sa referentnim rastvorom (MS-3, bez bakteriostatskog agensa), kao što to pokazuju Slike 7 i 8:

Što se tiče nivoa ukupnih agregata, zabeleženo je dramatično povećanje agregacije po izlaganju stresnim uslovima (40°C) za formulacije sa sadržajem fenola (MS-4 i MS-5) kao što to pokazuje Slika 9; nije zabeleženo povećanje agregacija po izlaganju nižim temperaturama (25°C i 2-8°C).

2.7.1.2.3 _Formulacije sa sadržajem EDTA

Dodavanje EDTA u formulacije sa sadržajem 0.1%-0.2% benzil alkohola (MS-32, MS-33, MS-36) nije dovelo do smanjenja nivoa oksidacije (Slika 10); povećanje nivoa aggegata zabeleženo je po izlaganju uslovima ubrzanja za formulacije sa sadržajem 0.1% EDTA i 0.2% benzil alkohola (MS-32, MS-33) (Slika 11); a slična razgradnja zabeležena je i na 2-8°C:

2.7.1.2.4 Rezultati efikasnosti konzervansa

Rezultati skrining studije su pokazali da su kroterijumi koje propisuju USP i EP Pharmacopoeia najmanje zadovoljeni za koncentracije benzil alkohola koje su jednake ili veće od 0.3% (za Candida albicans).

2.8 Kandidatske formulacije

Praćena svih ovih podataka obavljena je na sledeći način: urađena je linearna regresiona analiza za svaku seriju, posle čega je rađena analiza kovarijanse (vrednost P > 0.25) da se promeni varijabilnost između serija; nije rađena nikakva formalna statistička analiza kada nije primećena varijabilnost tokom perioda čuvanja.

2.8.1 Kandidat A

2.8.1.1 Zadržavanje tomok procesa proizvodnje

Zadržavanje Interferona beta-1a u obrađivanim uzorcima (pre i posle filtracije, u rezimiranom obliku prikazani su na Tab. 11: nije zabeležen značajan gubitak aktivnog sastojka.

2.8.1.2 Stabilnost aktivnog leka

Za nivoe oksidisanih formi u tri serije koje su čuvane na različitim temperaturama izračunavana je zajednička kriva i njihovi preseci; rezultati ove statističke analiza prikazani su na Tab. 12:

Nije utvrđena značajnija variabilnist za ukupni nivo agfregata u ovom eseju: šrema tome nije rađena nikakva formalna statistička analiza. Različiti nivoi agregata u serijama, za ove tri serije, potiču od njihovih različitih nivoa u serijama koje su korišćene za proizvodnju..

2.8.2 Kandidat B

2.8.2,1 Zadržavanje tokom proizvodnje

Zadržavanje Interferona beta-1a u uzorcima tokom obrade (pre i posle filtracije, gotovi proizvod) koji su prikupljeni tokom proizvodnje kandidata B ukratko su prikazani na Tab. 15: nisu zabeleženi zančajniji gubici aktivnog sastojka .

2.8.2.2 Stabilnost aktivnog leka

Statistička analiza obaveljena za oksidizovane form pokazala je sledeće:

• Zajednička kriva i presek izračunati su za tri serije na 40°C: objedinjena kriva jednaka je 1,42%/nedelja a pbjedinjeni presek jednak je 2.72%;

• Nije se mogla izračunati zajednička kriva za tri serije na temperaturi od 25°C (Vrednost P=0.095); prema tome, primenjen je pristup najgorem slučaju (serija MS-03): povećanje oksidizovanih formi od 1.17% zabeleženo je posle 1 mesec dana čuvanja (0.27%/nedelja);

• Nije se mogla izračunati zajednička kriva za tri serije na temperaturi od 2-8°C (Vrednost P=0.016); prema tome, primenjen je pristup najgorem slučaju (serija MS-03): povećanje oksidizovanih formi od 0.2% zabeleženo je posle 1 mesec dana čuvanja (0.047%/nedelja).

Nije zabeležena značajnija varijabilnost u podacima o stabilnosti za nivo ukupnih agregata i esej; prema tome, nije rađena nikakva formalna statistička analiza.

Nije zabeležen smanjenje bioaktivnosti po čuvanju, čak ni po izlaganju stresnim uslovima (40°C).

2.9 Zaključci

Na kraju ove studije, identifikovane su dve kandidatske multi-dozne formulacije sa veoma sličnim profilom stabilnosti:

• Kandidatska Formulacija B je spremna za upotrebu multi-dozna formulacija sa sadržajem 0.2% benzil alkohola;

• Kandidatska Formulacija A je multi-dozna formulacija sa sadržajem 0.3% benzil alkohola koja se dobija posle međanja sdržaja 2 punjenja (jedan sa sadržajem aktivnog principa i ekscipijensa i jedna sa sadržajem potrebne količine benzil alkohola da se dobije konačni oblik).

• Ovi kandidatski rastvori su testirani i na većim vrednostima pH (4.5 ± 0.2), i ni ovde nisu utvrđene značajnije promene profila stabilnosti. Podnosilac prijave je utvrdio da neznatno veća vrednost pH u formulacijama IFN povećava lokalnu podnošljivost kod supkutanih injekcija. Prema tome, gore navedena dva 2 kandidatska rastvora na pH 4.5 ili 4.7 mogu da ponude i dodatne koristi u smislu redovnog uzimanja od strane pacijenata.

Primer 3: Metoda proizvodnje multi-dozne - kandidatske Formulacije A

Prvo je rastvor natrijum hidroksida 1 N was pripremljen rstvaranjem 20 g natrijum hidroksid peleta u 500 g VZI.

Zatim je 0.011 M natrijum acetatnog pufera na pH 3.5±0.2 pripremljen dodavanjem 1.32 g glacijalne sirćetne kiseline do oko 1,800 g VZI. Vrenost pH ovog rastvora do pH 3.5±0.2 podešena je korišćenjem 1 N NaOH. Zatim je taj rastvor doveden do finalne težine od 2000 g. Onda je pH ponovo podešen do 3.5+0.2 sa 1 N NaOH ili 50% razblažene sirćetne kiseline. Ovaj rastvor je onda doveden do finalne težine od 2000 g.

Taj finalni rastvor je onda pripremljen na sledeći način.

Izračunata količina ekscipijena je izmerena i i rastvorena u traženoj količini 11 mM natrijum acetatnog pufera na pH 3.5±0.2, i pH tog rastvora je proveren i podešen (ako je to potrebno); zatim se dodaje potrebna količina r-h lnterferona-beta-1a (rekombinantno proizvedena iz CHO ćelija); finalna težina se dostiže dodavanjem 11 mM natrijum acetatnog pufera na pH 3.5+0.2.

1 ml ovog finalnog rastvora uzorkuje se da bi se testiralo kvantitativnom RP HPLC (uzorak BF = Pre prve filtracije).

Ovaj final rastvor je onda filtriran kroz 0.2 pm membranu koja je postavljena na držač od nerđajućeg čelika, pa je rastvor prikupljan u staklenu posudu.

1 ml ovog finalnog rastvora uzorkovan je da bi se podvrgao kvantitativnog određivanju pomoću RP HPLC.

Ovaj final rastvor je onda filtriran kako je opisano u prethodnoj tačci kroz drugu

0.2 pm membranu koja je postavljena na držač od nerđajućeg čelika.

3 ml staklena punjenja napunjena su sa 2.7 ml finalnog rastvora i začepljena.

Ovaj rastvor je spreman da se pomeša sa punjenjem sa sadržajem 3% rastvora benzil alkohola u VZI.

Primer 4_Metoda proizvodnje multi-dozne - kandidatske Formulacije B

Prvo je pripremljen natrijum hidroksid 1 N rastvor rastvaranjem 20 g natrijum hidroksid peleta u 500 g VZI.

Zatim je pripremljen 0.011 M natrijum acetatni pufer na pH 3.5±0.2 dodavanjem 1.32 g glacijalne sirćetne kiseline do oko 1800 g VZI. Onda je pH ovog rastvora podešen do pH 3.5+0.2 korišćenjem 1 N NaOH. Zatim je taj rastvor doveden do finalne težine od 2000 g. Potom je ponovo pH podešen do vrednosti od 3.5±0.2 pomoću 1 N NaOH ili 50% razblažene sirćetne kiseline. Ovaj rastvor je onda doveden do finalne težine od 2000 g.

Ovaj final rastvor je pripremljen na sledeći način.

Izračunata količina ekscipijensa je izmerena i rastvorena u potrebnoj količini 10 mM natrijum acetatnog pufera na pH 3.5±0.2, a onda je pH tog rastvora proveren i podešen (ako je to potrebno); zatim se dodaje potrebna količina r-h lnterferon-beta-1a (rekombinantno proizvedenog iz CHO ćelija); finalna težina se dobija dodavanjem 10 mM natrijum acetatnog pufera na pH 3.5±0.2.

Ovaj final rastvor se onda filtrira kroz 0.2 pm membranu koja je postavljena na držač od nerđajućeg ćelija i prikuplja se u staklenu posudu.

Ovaj final rastvor je onda filtriran kako je opisano u prethodnoj tačci kroz drugu 0.2 pm membranu koja je postavljena na držač od nerđajućeg čelika.

3 ml staklena punjenja napunjena su sa 3 ml finalnog rastvora i začepljena.

LITERATURA

1. Study Group. The Lancet 1998; 352, 1498-1504.

2. Clegg i Bryant, Exp. Opin. Pharmacother 2001; 2(4): 623-639.

3. Derynk R. i sar., Nature 1980; 285, 542-547.

4. Familletti, P. C., Rubinstein, S., i Pestka, S. 1981 “A Convenient and Rapid Cytopathic Effect Inhibition Assay for Interferon," in Methods in Enzymology, Vol. 78 (S. Pestka, ed.), Academic Press, New York, 387-394;

5. Hultgren C, Milich DR, VVeiland O, Sallberg M. (1998). The antiviral compound ribavirin modulates the T helper (Th) 1/Th2 subset balance in hepatitis B i C virus-specific immune responses. J Gen Virol 1998; 79 .2381-2391.

6. McCormick JB, King IJ, Webb PA, Scribner CL, Craven RB, Johnson KM, Elliott LH, Belmont-VVilliams R. Lassa fever. Effective therapy with ribavirin. N Engl J Med. 1986 Jan 2; 314(1):20-6.

7. Mark D.F. i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81 (18) 5662-5666 (1984).

8. Pestka, S. (1986) "Interferon Standards i General Abbreviations,in Methods in Enzymology (S. Pestka, ed.), Academic Press, New York 119,14-23.

9. Rubinstein, S.,Familletti, P.C., i Pestka, S. Convenient Assays for Interferons. J. Virol 1981; 37, 755-758.

10. Shepard H. M. i sar., Nature 1981; 294, 563-565.

Claims

1. Stabilizovana, tečna farmaceutska formulacija bez sadržaja HSA koja sadrži inferferon-beta (IFN-beta), naznačeno time da je ta formulacija rastvor koji sadrži pufer, poloksamer 188 surfaktant, agens izotoničnosti i antioksidant koji je metionin.

2. Sastav iz zahteva 1, naznačeno time da je IFN-beta humani rekombinantni IFN-beta.

3. Sastav iz ma kog od prethodnih zahteva, naznačeno time da je pomenuti pufer prisutan u količini koja je dovoljna da održi pH pomenutog sastava u okviru plus ili minus 0.5 jedinica navedenog pH, gde taj navedeni pH ima vrednost od 3.0 do 5.0.

4. Sastav iz prethodnog zahteva, naznačeno time da je pomenuti pH 3.5 ± 0.2.

5. Sastav iz prethodnog zahteva, naznačeno time da je pomenuti pH 4.5 ± 0.2.

6. Sastav iz ma kog od prethodnih zahteva, naznačeno time da je pomenuti pufer prisutan u koncentraciji od 5 mM do 500 mM.

7. Sastav iz ma kog od prethodnih zahteva, naznačeno time da je pomenuti pufer prisutan u koncentraciji od 10 mM.

8. Sastav prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time da je pomenuti pufer acetatni pufer.

9. Sastav iz ma kog od prethodnih zahteva, naznačeno time da je pomenuti agens izotoničnosti manitol.

10. Sastav iz ma kog od prethodnih zahteva, naznačeno time da je pomenuti agens izotoničnosti prisutan u koncentraciji od 0.5 mg/ml do 500 mg/ml.

11. Sastav iz ma kog od prethodnih zahteva, naznačeno time da je pomenuti agens izotoničnosti prisutan u koncentraciji od 55 mg/ml.

12. Sastav iz ma kog od prethodnih zahteva, naznačeno time da je pomenuti poloksamer 188 surfaktant prisutan u koncentraciji od 0.01 mg/ml do 10 mg/ml.

13. Sastav iz ma kog od prethodnih zahteva, naznačeno time da je pomenuti poloksamer 188 surfaktant prisutan u koncentraciji od 1 mg/ml.

14. Sastav iz ma kog od prethodnih zahteva, naznačeno time da je pomenuti metionin antioksidant prisutan u koncentraciji od 0.01 do 5.0 mg/ml.

15. Sastav iz ma kog od prethodnih zahteva, naznačeno time da je pomenuti metionin antioksidant prisutan u koncentraciji od 0.1 mg/ml.

16. Sastav iz ma kog od prethodnih zahteva, naznačeno time da je pomenuti interferon-beta prisutan u koncentraciji od 10 pg/ml do 800 pg/ml.

17. Sastav iz ma kog od prethodnih zahteva, naznačeno time da je pomenuti interferon-beta prisutan u koncentraciji od 22, 44, 88 ili 264 pg/ml.

18. Sastav iz ma kog od prethodnih zahteva, naznačeno time da je pomenuti sastav vodeni rastvor.

19. Sastav iz ma kog od prethodnih zahteva, koji dodatno sadrži i bakteriostatski agens.

20. Sastav iz ma kog od prethodnih zahteva, naznačeno time da je pomenuti bakteriostatski agens benzil alkohol.

21. Sastav iz ma kog od prethodnih zahteva, naznačeno time da je pomenuti bakteriostatski agens prisutan u koncentraciji od 0.1% do 2.0%.

22. Sastav iz ma kog od prethodnih zahteva, naznačeno time da je pomenuti bakteriostatski agens prisutan u koncentraciji od 0.2 do 0.3%.

23. Metoda za pripremu stabilizovanog tečnog farmaceutskog sastava bez sadržaja HSA u skladu sa zahtevima 1-22, naznačeno time da pomenuta metoda uključuje dodavanje izračunate količine poloksamera 188 surfaktanta, metionin antioksidansa i i agensa izotoničnosti u rastvor, i potom dodavanja interferona-beta (IFN-beta).

24. Posuda koja je hermetičKi zatvorena u sterilnim uslovima i primerena za čuvanje pre upotrebe, u kojoj se nalazi i tečna farmaceutska formulacija u skladu sa ma kojim od zahteva, od 1 do 22.

25. Posuda iz zahteva 24, naznačeno time da je pomenuta posuda već napunjeni špric za davanje jedne doze.

26. Posuda iz zahteva 24, naznačeno time da je pomenuta posuda bočica.

27. Posuda iz zahteva 24, naznačeno time da je pomenuta posuda patrona(kertruidž)za samoubrizgavanje (auto-injekciju).

28. Posuda iz zahteva 25 ili 26, naznačeno time da je pomenuta posuda namenjena za davanje jedne ili više doza.

29. Komplet za davanje više doza farmaceutskog sastava u skladu sa ma kojim od zahteva, od 18 do 21, naznačeno time da taj komplet sadrži prvo posudu napunjenu farmaceutskim sastavom u skladu sa ma kojim od zahteva od 1 do 17 i drugu patronu koja je napunjena rastvorom koji sadrži bakteriostatski agens.