MD4870C1 - Tetra(izotiocianat)cobaltat(II) de tris(dietil piridin-2,6-dicarboxilat)calciu cu proprietăţi de stimulator al activităţii lipolitice la tulpina de fungi Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la chimia coordinativă şi microbiologie, în special la un compus nou tetra(izotiocianat)cobaltat(II) de tris(dietil piridin-2,6-dicarboxilat)calciu, care poate fi utilizat în calitate de stimulator al activităţii lipolitice la tulpina de fungi Rhizopus arrhizus CNMN FD 03.Conform invenţiei, se revendică compusul coordinativ tetra(izotiocianat)cobaltat(II) de tris(dietil piridin-2,6-dicarboxilat)calciu cu formula [CaL3][Co(NCS)4], în care L reprezintă esterul dietilic al acidului 2,6-piridindicarboxilic. Compusul stimulează cu 37% producerea lipazelor exocelulare la tulpina de fungi Rhizopus arrhizus CNMN FD 03.

Description

Invenţia se referă la chimie şi microbiologie, în special la un compus nou tetra(izotiocianat)cobaltat(II) de tris(dietil piridin-2,6-dicarboxilat)calciu - ([CaL3][Co(NCS)4]), care poate fi utilizat în calitate de stimulator al activităţii lipolitice la micromiceta Rhizopus arrhizus CNMN FD 03.

Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 reprezintă o tulpină de fungi miceliali (micromicetă), care este producător de lipaze exocelulare cu semnificaţie biotehnologică şi poate fi utilizată în industria microbiologică pentru obţinerea enzimelor pectolitice sau lipolitice exocelulare cu spectru larg de aplicare (MD2458 F1 2004.05.31). Pentru cultivarea tulpinilor de micromicete producătoare de lipaze se utilizează medii nutritive, care includ săruri minerale (diferite modificări ale mediului Czapek) şi inductori ai sintezei lipazelor - ingrediente naturale cu conţinut de componente lipidice - făină de soia, făină de porumb, extract de porumb, extract de drojdii, tărâţe de grâu etc. Componentele lipidice prezente în cantităţi mici în ingredientele din compoziţia mediului stimulează efectiv biosinteza lipazelor (Fogarty W.M. Микробные ферменты и биотехнология. Москва: Агропромиздат, 1986, с. 189-190).

La multe microorganisme o parte considerabilă de lipaze exocelulare sunt legate de peretele celular, ce poate afecta secreţia lipazelor în mediul de cultură şi inhibarea biosintezei acestora. Includerea în mediul nutritiv a substanţelor cu abilităţi de stimulare a eliberării lipazelor legate din peretele celular, spre exemplu, surplus de ioni ai unor metale, accelerează secreţia lipazelor legate în mediul de cultură ce favorizează procesul de biosinteză a lipazelor exocelulare.

Un efect de stimulare a biosintezei lipazelor exocelulare poate asigura şi includerea în mediul nutritiv a anumitor compuşi coordinativi ai unor metale, în special al cobaltului. De exemplu, este cunoscută utilizarea în calitate de biostimulator al producerii de enzime lipolitice la tulpina Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 a compusului de cobalt: bis(trietanolamin)-cobalt(II) diizobutirat). Dezavantajul acestui complex constă în faptul că sinteza necesită utilizarea unui compus auxiliar mai puţin accesibil ca 3,6-di-2-piridil-1,3,4,5,-tetrazină [1].

Este necesar de menţionat că unii compuşi ai metalelor nu posedă proprietăţi de biostimulatori ai sintezei enzimelor, ci din contra, se manifestă ca inhibitori ai biosintezei acestor lipaze (Bulhac I. et al. Structure and some biological properties of Fe(III) complexes with nitrogen-containing ligands. Chemistry Journal of Moldova. General, Industrial and Ecological Chemistry, 2016, vol. 11(1), pp. 39-49).

Spre exemplu, utilizarea în mediul nutritiv a compuşilor coordinativi ai cobaltului(III) cu structuri foarte apropiate - [Co(DH)2(Thio)2]3F[SiF6]·1,5H2O şi [Co(DH)2(Thio)2]2[SiF6]·3H2O în calitate de biostimulatori, asigură creşterea capacităţii biosintetice a micromicetei Rhizopus arhizus producătoare de enzime pectolitice [2]. Deşi fiecare biostimulator este activ, compuşii nu sunt stabili la păstrare, sunt corozivi - interacţionează cu sticla datorită prezenţei fluorurii şi a anionului hidrolizabil de hexafluorsilicat.

De asemenea, este cunoscută utilizarea în mediul nutritiv în calitate de biostimulator a nanoparticulelor de Fe3O4, care asigură o creştere sporită a capacităţii biosintetice a micromicetelor producătoare de lipaze exocelulare [3]. Dezavantajul acestui mediu nutritiv constă în faptul că este necesară dispersarea prealabilă riguroasă cu ultrasunet a nanoparticulelor de Fe3O4, operaţie, care prezintă riscuri de sănătate prin inhalarea sau contactul direct a nanoparticulelor cu pielea. Astfel, utilizarea nanoparticulelor de Fe3O4 în calitate de biostimulator necesită condiţii speciale, care pot conduce la ridicarea preţului produsului final. Alt dezavantaj constă în faptul că, deşi activitatea lipolitică este destul de înaltă, maximul de activitate a tulpinii de fungi miceliali Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 se atinge în a 2-a zi de cultivare, pe când în cazul compusului revendicat aceasta se manifestă în prima zi de cultivare.

Este cunoscut un compus, cel mai apropiat după structură şi activitatea biologică, dioximatul de Co(III) cu formula [Co(DH)2(An)2]2[ZrF6]·2H2O [4]. Activitatea maximală lipolitică a tulpinii Rhizopus arrhizus CNMN FD 03, datorită utilizării acestui analog proxim, se manifestă în a doua zi de cultivare, care la concentraţia de 10 mg/L constituie 81250 U/mL, ceea ce constituie 144,4% faţă de martor, pe când compusul revendicat - [CaL3][Co(NCS)4] manifestă o activitate maximală în prima zi de cultivare, chiar la concentraţia de 5 mg/L - 41125,0 U/mL, ceea ce constituie 198,6% faţă de martor. Aceste date demonstrează că activitatea compusului revendicat este mai superioară comparativ cu cea a analogului proxim. În plus, acest dioximat de Co(III) conţine anionul de fluorură în sarea de cobalt iniţială şi care la fel se conţine şi în contraanionul complex [ZrF6]- al analogului proxim. Datorită hidrolizei cu formarea acidului fluorhidric chimic agresiv, care reacţionează cu sticla, atât la sinteză cât şi la utilizările ulterioare a analogului proxim, sinteza şi păstrarea dioximatului necesită condiţii speciale. Mai mult ca atât, pentru sinteza compusului dat se reiese din sarea comercială de CoZrF6·6H2O, reactiv care practic în prezent nu se mai produce de firmele specializate, fapt ce complică sinteza dioximaţilor respectivi de Co(III).

Problema tehnică soluţionată de invenţie constă în extinderea gamei de compuşi coordinativi ai cobaltului - biostimulatori ai activităţii lipolitice la tulpina de micromicete Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 prin sinteza unui nou compus heterometalic de Co şi Ca în formă cristalină, uşor separabil prin filtrare, stabil şi noncoroziv care ar conţine într-un singur compus chimic individual mai multe macro- şi microelemente: Co, Ca, N, şi S. Totodată compusul să asigure reducerea duratei de cultivare submersă cu 24 de ore.

Esenţa invenţiei constă în obţinerea unui compus chimic nou - tetra(izotiocianat)cobaltat(II) de tris(dietil piridin-2,6-dicarboxilat)calciu ([CaL3][Co(NCS)4]) caracterizat prin aceea că manifestă activitate de stimulator al activităţii lipolitice la cultivarea micromicetei Rhizopus arrhizus CNMN FD 03, totodată se reduce durata de cultivare cu 24 de ore.

Rezultatul tehnic al invenţiei constă în obţinerea unui complex bimetalic nou cristalin - tetra(izotiocianat)cobaltat(II) de tris(dietil piridin-2,6-dicarboxilat)calciu - [CaL3][Co(NCS)4], stabil şi noncoroziv care manifestă activitate stimulatorie a activităţii lipolitice la cultivarea micromicetei Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 şi asigură atingerea maximului de producere a lipazelor exocelulare în prima zi de cultivare a micromicetei menţionate.

Avantajele invenţiei constau în faptul că:

- caracterul bimetalic al compusului înaintat ca invenţie - [CaL3][Co(NCS)4] conţine în componenţa sa cobaltul şi calciul, care sunt cunoscuţi ca microelemente necesare pentru dezvoltarea normală a plantelor superioare şi inferioare;

- compusul revendicat se obţine în formă cristalină, ceea ce face posibilă separarea uşoară a compusului, precum spălarea şi uscarea lui;

- compusul este stabil şi noncoroziv faţă de sticlă.

Compusul coordinativ revendicat [CaL3][Co(NCS)4], atât şi procedeul de sinteză a lui, datele spectrale cât şi proprietăţile sale biologice nu sunt descrise în Stadiul tehnicii.

În literatura ştiinţifică sunt descrişi complecşi ce au ligand şi structură apropiată cu cea a invenţiei însă conţin în calitate de metal Cd(II), cationul complex [CdL3]2+ şi anionul complex [CdI4]2-/ [CdBr4]2- (Hakimi M., Mardani Z., Moeini K., Mohr F. Coordination behavior of dimethyl pyridine-2,6-dicarboxylate towards mercury(II), cadmium(II) and chromium(III) in the solid- and gaseous state supported by CSD studies. Polyhedron, 2015, vol. 102. pp. 569-577).

Dezavantajul acestor complecşi ai cadmiului constă în faptul că: 1) aceştea conţin metalul cadmiu, cunoscut prin toxicitatea pronunţată a acestuia; 2) cadmiul este prezent în componenţa complecşilor în concentraţie ridicată (şi în cationul complex şi în anionul complex); 3) sinteza complecşilor cadmiului menţionaţi se efectuiază în două etape (prima etapă - obţinerea ligandului şi a doua etapă - sinteza complecşilor cadmiului); 4) în literatura de specialitate examinată nu sunt cunoscute date referitor la vreo activitate biologică a compuşilor cadmiului.

Exemple de realizare a invenţiei

Exemplul 1. Sinteza tetra(izotiocianat)cobaltat(II) de tris(dietil piridin-2,6-dicarboxilat)calciu.

Amestecul mecanic din 0,05 g (0,025 mmol) de tiocianat de calciu tetrahidrat, 0,06 g (0,025 mmol) tiocianat de cobalt trihidrat şi 0,15 g (0,075 mmol) de 2,6-bis(carbonilclorură)piridină într-un raport molar de 1:1:3 a fost suspendat în 15 mL etanol şi refluxat timp de 3 ore. Toate componentele sunt solubile în alcool. Soluţia formată, de culoare albastră-violetă, s-a filtrat şi s-a lăsat la temperatura camerei pentru cristalizare. Peste 24 de ore în soluţie s-au format cristale mărunte albastre în formă de prisme. Randamentul constituie 45% (0,09 g).

Găsit, %: C 44,46; H 4,08; Ca 4,07; Co 5,94; N 9,87; S 12,89.

Pentru: C37H39CaCoN7O12S4

calculat, %: C 44,39; H 3,93; Ca 4,00; Co 5,89; N 9,79; S 12,81.

Spectru IR (ν, cm-1): 3413 f.s, 3079 f.s, 2983 s, 2939 f.s, 2902 f.s, 2823 f.s, 2296 s, 2058 f.p, 1700 f.p, 1587 p, 1469 m, 1445 s, 1396 m, 1373 p, 1320 f.p, 1265 f.p, 1195 m, 1153 s, 1113 s, 1082 m, 1012 p, 964 f.s, 857 m, 818 f.s, 794 f.s, 754 p, 727 m, 692 p, 658 m, 561 f.s, 506 f.s, 480 s, 431 s, 409 s (f.p - foarte puternică, p - puternică, m - medie, s - slabă, f.s - foarte slabă).

Compusul este stabil, noncoroziv faţă de sticlă şi poate fi păstrat în recipiente standarde de sticlă.

Compoziţia chimică şi structura compusului înaintat au fost determinate prin datele analizei elementale şi spectrale în IR, dar şi prin comparaţie cu structura determinată cu metoda difracţiei razelor X a compusului similar tetra(izotiocianat)cobaltat(II) de tris(dimetil piridin-2,6-dicarboxilat)calciu (brevet acordat MD4853, data depozit 2021.10.11). În spectrele IR ale acestor doi compuşi majoritatea benzilor de absorbţie importante coincid, ceea ce confirmă faptul că structura compuşilor este asemănătoare sau chiar identică. Aceste benzi sunt (cm-1): 2983 νas(CH3), 2902 νs(CH3), 2058 ν(NCS), 1700 ν(C=O), 1587 ν(C=C)arom., 1469 δas(CH3), 1373 δs(CH3), 1265 νas(C-O-C)ester, 1014 νs(C-O-C)ester, 754 şi 692 δnepl.(CH) în inelul aromatic 1,2,3-substituit (3 atomi de hidrogen alăturaţi), 480 δ(NCS) în cazul coordinării grupei NCS- la metal prin intermediul atomului de azot (Co-NCS). Pe de altă parte, compoziţia compusului revendicat se deosebeşte prin prezenţa grupării -CH2- în ligand care lipseşte în componenţa compusului similar, fapt confirmat cu metoda spectroscopiei IR. Astfel, în spectrul IR se manifestă benzile de absorbţie: 2939, 2823 şi 794 cm-1 care sunt atribuite diferitelor tipuri de oscilaţii a grupei -CH2-, care nu se observă în spectrul compusului similar. Datele respective dovedesc că în componenţa complexului revendicat sunt grupări de atomi -CH2- ce fac parte din grupa etil. Aceste diferenţe de structură în ligand sunt cauzate de particularităţile de sinteză a complexului revendicat obţinut în mediu de alcool etilic (C2H5OH), spre deosebire de compusul analog, sinteza căruia s-a petrecut în alcool metilic (CH3OH), care nu conţine gruparea -CH2-. În cazul dat metoda spectrală IR este indicată pentru elucidarea acestei diferenţe de structură a ligandului.

Exemplul 2. Aplicarea compusului revendicat [CaL3][Co(NCS)4] în cultivarea tulpinii de micromicete Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 producătoare de lipaze exocelulare.

Cultivarea tulpinii Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 se efectuează în pahare Erlenmeyer cu capacitatea de 0,5 L care conţin 0,1 L de mediu nutritiv lichid steril cu următoarea compoziţie, (g): făină de soia - 35,0; K2HPO4 - 5,0; (NH4)2SO4 - 1,0; [CaL3][Co(NCS)4]- 0,005...0,015; apă potabilă până la 1,0 L; pH-ul iniţial al mediului - 8,0. Mediul nutritiv se inoculează cu suspensie de spori şi miceliu în cantitate de 10% din volumul mediului nutritiv inoculat cu densitatea de (2...3)x106 spori/mL. Suspensia de spori şi miceliu se obţine prin spălarea cu apă distilată sterilă a culturii de Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 crescută timp de 30 de zile pe suprafeţe oblice de malţ-agar. Compusul revendicat se include în mediul nutritiv concomitent cu materialul semincer. Nemijlocit înainte de utilizare, compusul revendicat, dizolvat în cantitate minimă de apă distilată sterilă, se tratează cu ultrasunet pe baie de apă de tipul DA-968 DADI discret a câte 1-2 minute până la obţinerea soluţiei străvezii.

Cultivarea se efectuează în condiţii de agitare continuă la 180...200 rot/min, timp de 24 de ore. Temperatura de cultivare - 28ºC. Martor a servit proba cultivată în mediu nutritiv în absenţa compusului revendicat.

Activitatea enzimatică, determinată prin metoda titrimetrică Otto-Iamada (Грачева И.М. şi al. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов. Москва, «Легкая и пищевая промышленности», 1982, p.75-76), a fost dozată în dinamică în zilele a 1-3-a de cultivare, perioadă în care micromiceta manifestă cote superioare de acumulare a enzimelor.

Conform datelor obţinute nivelul maxim al activităţii lipolitice în proba de referinţă a fost înregistrat în a doua zi de cultivare, activitatea constituind 30000 U/mL, comparativ cu valoarea de 20708,3 U/mL, respectiv 22083,3 U/mL marcată în prima şi a treia zi de cultivare (tabel).

Tabel

Influenţa compusului revendicat asupra activităţii lipolitice a micromicetei

Rhizopus arrhizus CNMN FD 03

Compusul Conc., g/L 1-a zi a 2-a zi a 3-a zi Activitatea, U/mL %, faţă de martor Activitatea, U/mL %, faţă de martor Activitatea, U/mL %, faţă de martor [CaL3][Co(NCS)4] 0,005 41125,0 198,6/137,1 19375,0 64,6 2083,3 9,4 0,010 28291,7 136,6/94,3 25000,0 83,3 2083,3 9,4 0,015 20125,0 97,2 23750,0 79,2 1250,0 5,7 Martor - 20708,3 100,0 30000,0 100,0 22083,3 100,0

198,6/137,1 - faţă de martorul zilei/faţă de maxima martorului (ziua a 2-a)

Analiza datelor, privind influenţa compusului revendicat asupra activităţii lipolitice a tulpinii producătoare pune în evidenţă o intensificare semnificativă a procesului de acumulare a enzimelor, efectul pozitiv fiind constatat deja în prima zi de cultivare. La această etapă, activitatea lipolitică în variantele cu compusul revendicat [CaL3][Co(NCS)4] a constituit 41125,0 U/mL (0,005 g/L), 28921,7 U/mL (0,010 g/L) şi 20125,0 U/mL (0,015 g/L) în funcţie de concentraţia aplicată, depăşind nivelul maximal al probei martor, ziua 1-a de cultivare - cu 37,1% la concentraţia de 0,005 g/L cu reducerea ciclului tehnologic cu 24 ore.

Cercetările au fost efectuate în cadrul Programului de Stat 2020-2023 al Republicii Moldova prin proiectul cu titlul: ”Elaborarea noilor materiale multifuncţionale şi tehnologii eficiente pentru agricultură, medicină, tehnică şi sistemul educaţional în baza complecşilor metalelor „s” şi „d” cu liganzi polidentaţi”, (cifrul: 20.80009.5007.28) cu finanţarea de către ANCD.

1. MD a 2020 0002 A2 2020.08.31

2. MD 1748 F1 2001.09.30

3. MD 4532 B1 2017.11.30

4. Coropceanu E., Deseatnic A., Stratan M., Rija A., Bologa O., Tiurin J., Labliuc S., Clapco S., Bulhac I. The study of the biological activity of some cobalt(III) dioximates with fluorine containing anions. Chemistry Journal of Moldova. General, Industrial and Ecological Chemistry, 2008, vol. 3 (2), p. 70-80, găsit în Internet la data 05.05.2023, URL: <http://www.cjm.asm.md/the-study-of-the-biological-activity-of-some-cobalt-iii-dioximates-with-fluorine-containing-anions>

Claims (2)

1. Tetra(izotiocianat)cobaltat(II) de tris(dietil piridin-2,6-dicarboxilat)calciu cu formula [CaL3][Co(NCS)4], unde L reprezintă esterul dietilic al acidului 2,6-piridindicarboxilic.

2. Compus, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că manifestă activitate de stimulator al activităţii lipolitice la tulpina de fungi Rhizopus arrhizus CNMN FD 03.