MD4301770T2 - Agonişti ai receptorului de amilină cu acţiune prelungită şi utilizările acestora - Google Patents

Abstract

Prezenta divulgare se referă la domeniul medicinei. Mai special, divulgarea este în domeniul diabetului, obezitaţii şi/sau gestionării greutăţii, dislipedimei şi/sau NASH. Divulgarea se referă la compuşi care activează receptorul de amilină şi pot reduce aportul alimentar, greutatea corporală, glucoza şi/sau trigliceridele, astfel că pot fi utilizaţi pentru a tratat diabetul, obezitatea, şi/sau dislipedimia. Prezenta divulgare include de asemenea compoziţii farmaceutice care conţin astfel de compuşi, şi utilizări terapeutice ale unor astfel de compuşi şi compoziţii.

Description

[0001] Prezenta dezvăluire se referă la domeniul medicinei. Mai exact, prezenta dezvăluire se referă la tratarea diabetului şi obezităţii şi/sau gestionarea greutăţii cronice, dislipidemiei şi/sau steatohepatitei nealcoolice (NASH). Dezvăluirea se referă la compuşi care agonizează receptorul de amilină şi, prin urmare, pot reduce aportul alimentar, greutatea corporală, glucoza, HbA1c (hemoglobina glicată) şi/sau trigliceridele şi pot fi utilizaţi pentru tratarea diabetului şi obezităţii şi/sau pentru gestionarea greutăţii cronice, dislipidemiei şi/sau NASH. Prezenta dezvăluire include, de asemenea, compoziţii farmaceutice care conţin astfel de compuşi şi utilizări terapeutice ale unor astfel de compuşi şi compoziţii farmaceutice.

[0002] În ultimele decenii, prevalenţa diabetului a continuat să crească. Diabetul zaharat de tip 2 („T2DM») este cea mai frecventă formă de diabet, reprezentând aproximativ 90 % din toate formele de diabet. T2DM se caracterizează prin niveluri ridicate de glucoză din sânge şi este asociat în principal cu rezistenţa la insulină. Tratamentele dorite pentru pacienţii cu diabet zaharat ar trebui să reducă glicemia şi să stabilizeze HbA1c.

[0003] Obezitatea este o tulburare medicală complexă care duce la acumularea excesivă de masă tisulară adipoasă. În prezent, obezitatea este o preocupare globală de sănătate publică, asociată cu rezultate nedorite în materie de sănătate şi morbidităţi. Tratamentele dorite pentru pacienţii cu obezitate ar trebui să reducă excesul de greutate corporală, să amelioreze comorbidităţile legate de obezitate şi/sau să menţină reducerea greutăţii pe termen lung.

[0004] Dislipidemia reprezintă un nivel anormal de colesterol şi alte lipide, numite şi grăsimi, în sânge. Dislipidemia creşte riscul de artere înfundate (ateroscleroză) şi atacuri de cord, accident vascular cerebral sau alte probleme circulatorii, în special la persoanele care fumează.

[0005] NASH înseamnă steatohepatită non-alcoolică. Este manifestarea hepatică a unei tulburări metabolice şi este cea mai gravă formă de boală hepatică grasă nealcoolică (NAFLD). NASH este strâns legată de comorbidităţile diabetului şi obezităţii.

[0006] Amilina este un hormon peptidic de 37 aminoacizi care este co-secretat cu insulina din celulele β pancreatice şi este deficitar la persoanele cu diabet zaharat. Aceasta inhibă secreţia de glucagon, întârzie golirea gastrică şi acţionează ca agent de saţietate. Prin urmare, amilina contribuie la reglarea cantităţii de glucoză din organism după mese. Cu toate acestea, proprietăţile fiziochimice ale amilinei umane îngreunează utilizarea sa ca medicament farmaceutic. De exemplu, amilina este dificil de formulat, deoarece este instabilă din punct de vedere chimic şi se precipită la pH fiziologic, necesitând formularea sa în soluţie acidă. În plus, timpul de înjumătăţire al acestui medicament este mai mic de o oră şi este utilizat în timpul mesei, astfel încât un pacient ar avea nevoie de mai multe doze într-o singură zi pentru a utiliza acest medicament în terapie.

[0007] Pramlintida este o peptidă agonistă a amilinei disponibilă în comerţ, utilizată pentru tratarea diabetului zaharat ca adjuvant la insulină. Pramlintida este instabilă chimic la pH neutru, din cauza prezenţei unei legături disulfurice (-S-S-) şi a deamidării. Prin urmare, este furnizat într-o formulare acidă. Comparativ cu amilina umană, aminoacizii din poziţiile 25, 28 şi 29 din pramlintidă sunt substituiţi cu prolină. Aceste modificări reduc tendinţa peptidei către fibrilogeneză. Cu toate acestea, pramlintida are un timp de înjumătăţire plasmatic foarte scurt şi, prin urmare, trebuie injectată de două până la trei ori pe zi, ceea ce poate duce la neplăceri şi respectarea inaecvată a tratamentului şi, ulterior, la o eficacitate incompletă sau sub nivelul optim. În plus, formula sa cu pH scăzut nu este compatibilă cu formula cu pH neutru utilizată pentru insulină şi analogii GLP-1, ceea ce complică administrarea concomitentă cu astfel de compuşi, ceea ce ar putea avea eficacitate clinică sinergică şi astfel îmbunătăţită.

[0008] Amilina umană se leagă de două complexe receptoare distincte. Aceste două complexe conţin, de asemenea, receptorul de calcitonină plus proteine de activitate a receptorilor, RAMP1 sau RAMP3. Receptorul de calcitonină se găseşte în multe ţesuturi din organism şi se crede că este implicat în reglarea metabolismului osos. Cu toate acestea, în afară de reglarea osoasă, se cunosc foarte puţine lucruri despre fiziologia receptorilor de calcitonină la om şi, prin urmare, riscul de toxicitate în afara ţintei poate fi crescut cu o moleculă cu afinitate ridicată pentru receptorii de calcitonină. Prin urmare, se consideră că polipeptidele pe bază de amilină care au o selectivitate crescută pentru receptorul de amilină în comparaţie cu receptorul de calcitonină ar putea oferi un profil farmacocinetic şi farmacologic avantajos.

[0009] Din relaţia strânsă dintre receptorul de calcitonină şi receptorul de amilină, se poate aştepta o anumită reactivitate încrucişată la receptorul de calcitonină de la agoniştii receptorilor de amilină. De exemplu, pramlintida, o peptidă agonistă a amilinei, are o anumită afinitate cu receptorul de calcitonină, deşi este de 14 ori mai puternică pentru receptorul de amilină.

[0010] Au fost dezvăluite polipeptide care cuprind peptide agoniste ale amilinei umane şi care au un radical de legare a albuminei. Vezi WO 2010/046357, WO 2009/034119 şi WO 2009/034119. Chiar dacă aceste polipeptide cu fracţiuni de legare la albumină au proprietăţi farmacocinetice (PK) sau farmacodinamice (PD) îmbunătăţite în comparaţie cu pramlintida, pot avea totuşi o stabilitate fizică inadecvată în anumite condiţii. În plus, polipeptidele, în general, nu prezintă selectivitate pentru receptorul de amilină faţă de receptorul de calcitonină. US2014/0087995 se referă la polipeptide care conţin peptide agoniste de amilină cu selectivitate pentru receptorul de amilină faţă de receptorul de calcitonină. Cu toate acestea, sunt necesari candidaţi medicamentoşi peptidici pe bază de agonist al amilinei cu potenţă mai mare, risc mai mic de dezvoltare, risc mai mic de imunogenitate, stabilitate chimică îmbunătăţită şi compatibilitate cu formula la un pH neutru.

[0011] Există o nevoie de compuşi (de exemplu, peptide) care să prezinte selectivitate pentru agonismul receptorului de amilină faţă de receptorul de calcitonină. În plus, există necesitatea unor agonişti ai receptorilor de amilină cu timp prelungit de acţiune şi potenţă conservată. Compuşii dezirabili din punct de vedere terapeutic ar agoniza receptorul de amilină şi ar oferi una sau mai multe proprietăţi avantajoase, cum ar fi scăderea oricăreia dintre următoarele: aportul alimentar, greutatea corporală, nivelurile de glucoză din sânge, HbA1c, trigliceridele şi/sau nivelurile de insulină. În plus, compuşii dezirabili terapeutic pot avea una sau mai multe proprietăţi avantajoase suplimentare, cum ar fi timp prelungit de acţiune cu potenţă conservată sau îmbunătăţită în agonizarea receptorului de amilină, un risc scăzut de răspuns imunogen şi/sau un risc scăzut de fibrilaţie.

[0012] În plus, se doreşte combinarea opţională a unui agonist al receptorului de amilină din prezenta dezvăluire cu o incretină sau un analog de incretină, pentru a oferi tratament pentru diabet, obezitate, NASH şi/sau dislipidemie. O astfel de combinaţie va fi, de asemenea, preferabil mai eficientă decât oricare dintre moleculele individuale. De exemplu, un astfel de tratament cu o astfel de combinaţie poate permite utilizarea unor doze mai mici din una sau ambele molecule în comparaţie cu fiecare moleculă în parte, ceea ce poate duce la efecte secundare mai mici (sau o durată mai scurtă a uneia sau a celeilalte terapii), menţinând în acelaşi timp eficacitatea. Se consideră că noile combinaţii dezvăluite în prezentul document vor fi tratamente eficace pentru diabet, obezitate, NASH şi/sau dislipidemie.

[0013] Prin urmare, prezenta dezvăluire oferă o metodă de tratare a diabetului, obezităţii, NASH şi/sau dislipidemiei, care cuprinde administrarea la un pacient care are nevoie de un astfel de tratament a unei cantităţi eficace de agonist al receptorului de amilină din prezenta invenţie şi a unei cantităţi eficace de agent suplimentar.

[0014] Prin urmare, prezenta dezvăluire dezvăluie noi compuşi (peptide) care agonizează receptorul de amilină şi au una sau mai multe dintre următoarele proprietăţi: (1) reducerea eficace a aportului alimentar şi a greutăţii corporale; (2) scăderea glucozei şi a insulinei; (3) risc scăzut de imunogenitate şi risc scăzut de fibrilaţie comparativ cu pramlintida; (4) timp de înjumătăţire mult mai mare comparativ cu pramlintida. Timpul de înjumătăţire extins al compuşilor dezvăluiţi în prezent va permite dozarea o dată pe săptămână a acestor compuşi pentru utilizare în terapie.

[0015] Un exemplu de realizare al prezentei dezvăluiri este un compus care cuprinde: Xaa1-C-Xaa3-TATCAT- Xaa10- Xaa11-Xaa12-AE-Xaa15-LVRSS-Xaa21-Xaa22-FGP-Xaa26-LPPTEVGSNTY-NH2, în care Xaa1 este K sau γE; Xaa3 este E, N sau G; Xaa10 este G sau Q; Xaa11 este Orn sau K; Xaa12 este L sau αMeL; Xaa15 este αMeF sau F; Xaa21 este N sau H; Xaa22 este NMeD, NMeN sau N; Xaa26 este I sau K sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic. (NR. ID. SECV.:14). Opţional, compuşii care cuprind NR. ID. SECV.: 14 mai cuprind un element suplimentar pentru a prelungi profilul de acţiune în timp al acestui compus. Aceste elemente suplimentare includ, cu sau fără un linker şi în orice poziţie adecvată din secvenţă, porţiunea Fc a unei imunoglobuline, fragmente din porţiunea Fc a imunoglobulinei, albumina serică umană (HSA), o variantă de VHH (domeniu variabil al anticorpilor cu lanţ greu)), nanocorpi, fragmente de albumină serică umană, monoacid C20, un diacid C20 şi o fracţiune de polietilenglicol (PEG) sau alte tipuri de polimeri cu greutate moleculară mare. Preferabil, elementul suplimentar este ataşat opţional cu un linker la o lizină de pe compus. Mai mult, în oricare dintre exemplele de realizare dezvăluite în prezentul document, peptidele agoniste ale amilinei şi compuşii care cuprind peptidele agoniste ale amilinei pot cuprinde în plus astfel de elemente, fie în plus faţă de orice elemente deja prezente care sunt ataşate sau legate de secvenţa peptidică şi care extind profilul de acţiune în timp, fie ca alternativă la un element existent.

[0016] În unele exemple de realizare ale compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.:14, Xaa26 este lizină. În unele exemple de realizare ale compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.:14, lizina din poziţia 26, dacă este prezentă, este ataşată la un acid gras printr-un linker conform formulei: (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H. În unele exemple de realizare ale compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.:14, lizina din poziţia 26, dacă este prezentă, este ataşată la un acid gras printr-un linker conform formulei: AEEA2-γE-CO-(CH2)18-CO2H. În unele exemple de realizare ale compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.:14, lizina din poziţia 26, dacă este prezentă, este ataşată la un acid gras printr-un linker conform formulei: γE-AEEA2-CO-(CH2)18-CO2H. În unele exemple de realizare ale compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.:14, lizina din poziţia 26, dacă este prezentă, este ataşată la un acid gras printr-un linker conform formulei: (γE)2-AEEA-CO-(CH2)18-CO2H. În alte exemple de realizare ale compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.:14, lizina din poziţia 26, dacă este prezentă, este ataşată la un acid gras prin intermediul unui alt linker cunoscut în stadiul tehnicii. În plus, în oricare dintre exemplele de realizare dezvăluite în prezentul document, peptidele agoniste ale amilinei şi compuşii care cuprind peptidele agoniste ale amilinei pot cuprinde un alt linker pentru a ataşa acidul gras conform formulelor din prezentul document.

[0017] În unele exemple de realizare ale compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.:14, Xaa1 este lizină. În unele exemple de realizare ale compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.: 14, lizina din poziţia 1, dacă este prezentă, este ataşată la un acid gras printr-un linker conform formulei: (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H. În alte exemple de realizare ale compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.:14, lizina din poziţia 1, dacă este prezentă, este ataşată la un acid gras prin intermediul unui alt linker cunoscut în stadiul tehnicii.

[0018] În unele exemple de realizare ale compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.:14, există o punte de disulfură între cisteinele din poziţiile 2 şi 7. Într-un exemplu de realizare preferat al compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.:14, există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7.

[0019] Unul dintre exemplele de realizare din prezentul document cuprinde următoarea secvenţă: γE-CNTATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeN-FGPKLPPTEVGSNTY-NH2 (NR. ID. SECV.:1). Un exemplu de realizare alternativ din prezentul document constă din următoarea secvenţă: γE-CNTATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeN-FGPKLPPTEVGSNTY-NH2 (NR. ID. SECV.:1). Mai jos prezentăm o reprezentare a compusului I folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia acidului glutamic (γE) în poziţia 1 (unde legătura peptidică este formată folosind grupul său de acid carboxilic cu catenă laterală în poziţia gamma şi nu în poziţia alfa tipică), cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, Orn în poziţia 11, αMeF în poziţia 15, NMeN în poziţia 22 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0020]

[0021] În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin de la aproximativ 90 % la aproximativ 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:1. În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin aproximativ 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % sau 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:1.

[0022] În unele exemple de realizare ale compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.: 1, lizina din poziţia 26 este ataşată la un acid gras printr-un linker. Într-un exemplu de realizare preferat al compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.: 1, lizina din poziţia 26 este ataşată la un acid gras printr-un linker conform formulei: (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H.

[0023] Unul dintre exemplele de realizare din prezentul document cuprinde următoarea secvenţă: γE-CNTATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeN-FGPKLPPTEVGSNTY-NH2, în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7 şi în care lizina din poziţia 26 este ataşată la un acid gras printr-un linker conform formulei: (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H (NR. ID. SECV.:2). Un exemplu de realizare alternativ din prezentul document constă din următoarea secvenţă: γE-CNTATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeN-FGPKLPPTEVGSNTY-NH2, în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7 şi în care lizina din poziţia 26 este ataşată la un acid gras printr-un linker conform formulei: (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H (NR. ID. SECV.:2). Mai jos prezentăm o reprezentare a compusului I folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia acidului glutamic (γE) în poziţia 1 (unde legătura peptidică este formată folosind acidul său carboxilic cu catenă laterală în poziţia gamma şi nu în poziţia alfa tipică), cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, Orn în poziţia 11, αMeF în poziţia 15, NMeN în poziţia 22, lizinei în poziţia 26 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0024]

[0025] În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin de la aproximativ 90 % la aproximativ 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:2. În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin aproximativ 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % sau 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:2.

[0026] Unul dintre exemplele de realizare din prezentul document cuprinde următoarea secvenţă: γE-CNTATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeD-FGPKLPPTEVGSNTY-NH2 (NR. ID. SECV.:3). Un exemplu de realizare alternativ din prezentul document constă din următoarea secvenţă: γE-CNTATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeD-FGPKLPPTEVGSNTY-NH2 (NR. ID. SECV.:3). Mai jos prezentăm o reprezentare a compusului I folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia acidului glutamic (γE) în poziţia 1 (în care legătura peptidică este formată folosind grupul său de acid carboxilic cu catenă laterală în poziţia gamma şi nu în poziţia alfa tipică), cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, Orn în poziţia 11, αMeF în poziţia 15, NMeD în poziţia 22 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0027]

[0028] În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin de la aproximativ 90 % la aproximativ 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:3. În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin aproximativ 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % sau 99 % similaritate de secvenţă cu Compusul III (NR. ID. SECV.:3).

[0029] În unele exemple de realizare ale compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.: 3, lizina din poziţia 26 este ataşată la un acid gras printr-un linker. Într-un exemplu de realizare preferat al compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.: 3, lizina din poziţia 26 este ataşată la o fracţiune de linker a unui acid gras cu formula: (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H.

[0030] Unul dintre exemplele de realizare din prezentul document cuprinde următoarea secvenţă: γE-CNTATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeD-FGPKLPPTEVGSNTY-NH2, în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7 şi în care lizina din poziţia 26 este ataşată la o fracţiune de linker a unui acid gras conform formulei: (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H (NR. ID. SECV.: 4). Un exemplu de realizare alternativ din prezentul document constă din următoarea secvenţă: γE-CNTATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeD-FGPKLPPTEVGSNTY-NH2, în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7 şi în care lizina din poziţia 26 este ataşată la o fracţiune de linker a unui acid gras conform formulei: (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H (NR. ID. SECV.: 4). Mai jos prezentăm o reprezentare a Compusului IV folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia acidului glutamic (γE) în poziţia 1 (unde legătura peptidică este formată folosind grupul său al acidului carboxilic cu catenă laterală în poziţia gamma şi nu în poziţia alfa tipică), cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, Orn în poziţia 11, αMeF în poziţia 15, NMeD în poziţia 22, lizinei în poziţia 26 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0031]

[0032] În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin de la aproximativ 90 % la aproximativ 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:4. În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin aproximativ 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % sau 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:4.

[0033] Unul dintre exemplele de realizare din prezentul document cuprinde următoarea secvenţă: KCETATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeD-FGPILPPTEVGSNTY-NH2 (NR. ID. SECV.:5). O variantă de realizare alternativă aici constă din următoarea secvenţă: KCETATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeD-FGPILPPTEVGSNTY-NH2 (NR. ID. SECV.:5). Mai jos prezentăm o reprezentare a compusului V folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, Orn în poziţia 11, αMeF în poziţia 15, NMeD în poziţia 22 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0034]

[0035] În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin de la aproximativ 90 % la aproximativ 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:5. În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin aproximativ 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % sau 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:5.

[0036] În unele exemple de realizare ale compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.: 5, lizina din poziţia 1 este ataşată la un acid gras printr-un linker. Într-un exemplu de realizare preferat al compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.: 5, lizina din poziţia 1 este ataşată la un acid gras printr-un linker conform formulei: (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H.

[0037] Unul dintre exemplele de realizare din prezentul document cuprinde următoarea secvenţă: KCETATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeD-FGPILPPTEVGSNTY-NH2, în care există o punte tioacetalică între cisteine în poziţiile 2 şi 7 şi în care lizina din poziţia 1 este ataşată la po fracţiune de linker a unui acid gras conform formulei: (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H (NR. ID. SECV.:6). O variantă de realizare alternativă aici constă din următoarea secvenţă: KCETATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeD-FGPILPPTEVGSNTY-NH2, în care există o punte tioacetalică între cisteine în poziţiile 2 şi 7 şi în care lizina din poziţia 1 este ataşată la po fracţiune de linker a unui acid gras conform formulei: (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H (NR. ID. SECV.:6). Mai jos prezentăm o reprezentare a Compusului VI folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia lizinei în poziţia 1, cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, Orn în poziţia 11, αMeF în poziţia 15, NMeD în poziţia 22 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0038]

[0039] În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin de la aproximativ 90 % la aproximativ 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:6. În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin aproximativ 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % sau 99 % similaritate de secvenţă cu Compusul VI (NR. ID. SECV.:6).

[0040] Unul dintre exemplele de realizare din prezentul document cuprinde următoarea secvenţă: KCETATCATG-Orn-αMeL-AEFLVRSSHNFGPILPPTEVGSNTY-NH2 (NR. ID. SECV.:7). O variantă de realizare alternativă aici constă din următoarea secvenţă: KCETATCATG-Orn-αMeL-AEFLVRSSHNFGPILPPTEVGSNTY-NH2 (NR. ID. SECV.:7). Mai jos prezentăm o reprezentare a Compusului VII, cu excepţia cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, Orn în poziţia 11, αMeL în poziţia 12 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0041]

[0042] În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin de la aproximativ 90 % la aproximativ 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:7. În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin aproximativ 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % sau 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:7.

[0043] În unele exemple de realizare ale compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.: 7, lizina din poziţia 1 este ataşată la o fracţiune de linker a unui acid gras. Într-un exemplu de realizare preferat al compuşilor care cuprind NR. ID. SECV.: 7, lizina din poziţia 1 este ataşată la un acid gras printr-un linker conform formulei: (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H.

[0044] Unul dintre exemplele de realizare din prezentul document cuprinde următoarea secvenţă: KCETATCATG-Orn-αMeL-AEFLVRSSHNFGPILPPTEVGSNTY-NH2, în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7 şi în care lizina din poziţia 1 este ataşată la un acid gras printr-un linker conform formulei: (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H (NR. ID. SECV.:8). O variantă de realizare alternativă aici constă din următoarea secvenţă: KCETATCATG-Orn-αMeL-AEFLVRSSHNFGPILPPTEVGSNTY-NH2, în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7 şi în care lizina din poziţia 1 este ataşată la un acid gras printr-un linker conform formulei: (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H (NR. ID. SECV.:8). Mai jos prezentăm o reprezentare a Compusului VIII folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia lizinei în poziţia 1, cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, Orn în poziţia 11, αMeL în poziţia 12 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0045]

[0046] În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin de la aproximativ 90 % la aproximativ 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:8. În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin aproximativ 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % sau 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:8.

[0047] Unul dintre exemplele de realizare din prezentul document cuprinde următoarea secvenţă: γE-CNTATCATGKLAEFLVRSSNNFGPKLPPTEVGSNTY-NH2, în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7 şi în care lizina din poziţia 26 este ataşată la un acid gras printr-un linker conform formulei: AEEA2-γE-CO-(CH2)18-CO2H (NR. ID. SECV.:9). Un exemplu de realizare alternativ din prezentul document constă din următoarea secvenţă: γE-CNTATCATGKLAEFLVRSSNNFGPKLPPTEVGSNTY-NH2, în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7 şi în care lizina din poziţia 26 este ataşată la un acid gras printr-un linker conform formulei: AEEA2-γE-CO-(CH2)18-CO2H (NR. ID. SECV.:9) Mai jos prezentăm o reprezentare a Compusului IX folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia acidului glutamic (γE) în poziţia 1 (unde legătura peptidică este formată folosind grupul său al acidului carboxilic cu catenă laterală în poziţia gamma şi nu în poziţia alfa tipică), cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, lizinei în poziţia 26 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0048]

[0049] În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin de la aproximativ 90 % la aproximativ 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:9. În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin aproximativ 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % sau 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:9.

[0050] Unul dintre exemplele de realizare din prezentul document cuprinde următoarea secvenţă: γE-CNTATCATGKLAEFLVRSSNNFGPKLPPTEVGSNTY-NH2, în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7 şi în care lizina din poziţia 26 este ataşată la un acid gras printr-un linker conform formulei: γE-AEEA2-CO-(CH2)18-CO2H (NR. ID. SECV.:10). Un exemplu de realizare alternativ din prezentul document constă din următoarea secvenţă: γE-CNTATCATGKLAEFLVRSSNNFGPKLPPTEVGSNTY-NH2, în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7 şi în care lizina din poziţia 26 este ataşată la un acid gras printr-un linker conform formulei: γE-AEEA2-CO-(CH2)18-CO2H (NR. ID. SECV.:10). Mai jos prezentăm o reprezentare a Compusului X folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia acidului glutamic (γE) în poziţia 1 (unde legătura peptidică este formată folosind grupul său al acidului carboxilic cu catenă laterală în poziţia gamma şi nu în poziţia alfa tipică), cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, lizinei în poziţia 26 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0051]

[0052] În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin de la aproximativ 90 % la aproximativ 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:10. În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin aproximativ 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % sau 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:10.

[0053] Unul dintre exemplele de realizare din prezentul document cuprinde următoarea secvenţă: γE-CNTATCATGKLAEFLVRSSNNFGPKLPPTEVGSNTY-NH2, în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7 şi în care lizina din poziţia 26 este ataşată la o fracţiune de linker a unui acid gras conform formulei: (γE)2-AEEA-CO-(CH2)18-CO2H (NR. ID. SECV.:11). Un exemplu de realizare alternativ din prezentul document constă din următoarea secvenţă: γE-CNTATCATGKLAEFLVRSSNNFGPKLPPTEVGSNTY-NH2, în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7 şi în care lizina din poziţia 26 este ataşată la o fracţiune de linker a unui acid gras conform formulei: (γE)2-AEEA-CO-(CH2)18-CO2H (NR. ID. SECV.:11). Mai jos prezentăm o reprezentare a Compusului XI folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia acidului glutamic (γE) în poziţia 1 (unde legătura peptidică este formată folosind grupul său al acidului carboxilic cu catenă laterală în poziţia gamma şi nu în poziţia alfa tipică), cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, lizinei în poziţia 26 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0054]

[0055] În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin de la aproximativ 90 % la aproximativ 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:11. În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin aproximativ 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % sau 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:11.

[0056] Unul dintre exemplele de realizare din prezentul document cuprinde următoarea secvenţă: γE-CNTATCATQ-Orn-LAEFLVRSSNNFGPKLPPTEVGSNTY-NH2, în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7 şi în care lizina din poziţia 26 este ataşată la un acid gras printr-un linker conform formulei: AEEA2-γE-CO-(CH2)18-CO2H (NR. ID. SECV.:12). Un exemplu de realizare alternativ constă din următoarea secvenţă: γE-CNTATCATQ-Orn-LAEFLVRSSNNFGPKLPPTEVGSNTY-NH2, în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7 şi în care lizina din poziţia 26 este ataşată la un acid gras printr-un linker conform formulei: AEEA2-γE-CO-(CH2)18-CO2H (NR. ID. SECV.:12). Mai jos prezentăm o reprezentare a Compusului XII folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia acidului glutamic (γE) în poziţia 1 (unde legătura peptidică este formată folosind grupul său al acidului carboxilic cu catenă laterală în poziţia gamma şi nu în poziţia alfa tipică), cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, ornitinei în poziţia 11, lizinei în poziţia 26 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0057]

[0058] În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin de la aproximativ 90 % la aproximativ 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:12. În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin aproximativ 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % sau 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:12.

[0059] Unul dintre exemplele de realizare din prezentul document cuprinde următoarea secvenţă: γE-CGTATCATG-Orn-LAEFLVRSSNNFGPKLPPTEVGSNTY-NH2, în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7 şi în care lizina din poziţia 26 este ataşată la o fracţiune de linker a unui acid gras conform formulei: γE2-CO-(CH2)18-CO2H (NR. ID. SECV.:13). Un exemplu de realizare alternativ din prezentul document constă din următoarea secvenţă: γE-CGTATCATG-Orn-LAEFLVRSSNNFGPKLPPTEVGSNTY-NH2, în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7 şi în care lizina din poziţia 26 este ataşată la o fracţiune de linker a unui acid gras conform formulei: γE2-CO-(CH2)18-CO2H (NR. ID. SECV.:13). Mai jos prezentăm o reprezentare a Compusului XIII folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia acidului glutamic (γE) în poziţia 1 (unde legătura peptidică este formată folosind grupul său al acidului carboxilic cu catenă laterală în poziţia gamma şi nu în poziţia alfa tipică), cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, ornitinei în poziţia 11, lizinei în poziţia 26 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0060]

[0061] În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin de la aproximativ 90 % la aproximativ 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:13. În mod alternativ, compusul poate avea cel puţin aproximativ 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % sau 99 % similaritate de secvenţă cu NR. ID. SECV.:13.

[0062] Prezenta dezvăluire dezvăluie un compus care constă din NR. ID. SECV.:1, un compus care constă din NR. ID. SECV.:2, un compus care constă din NR. ID. SECV.:3, un compus care constă din NR. ID. SECV.:4, un compus care constă din NR. ID. SECV.:5, un compus care constă din NR. ID. SECV.:6, un compus care constă din NR. ID. SECV.:7, un compus care constă din NR. ID. SECV.:8, un compus care constă din NR. ID. SECV.:9, un compus care constă din NR. ID. SECV.:10, un compus care constă din NR. ID. SECV.:11, un compus care constă din NR. ID. SECV.:12 şi/sau un compus care constă din NR. ID. SECV.:13 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic. Prezenta dezvăluire dezvăluie, de asemenea, o compoziţie farmaceutică ce cuprinde un compus care cuprinde NR. ID. SECV.:1, NR. ID. SECV.:2, NR. ID. SECV.:3, NR. ID. SECV.:4, NR. ID. SECV.:5, NR. ID. SECV.:6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12, NR. ID. SECV.:13 sau NR. ID. SECV.:14, sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic şi unul sau mai mulţi purtători, diluanţi sau excipienţi acceptabili din punct de vedere farmaceutic. Prezenta dezvăluire dezvăluie, de asemenea, o compoziţie farmaceutică ce constă dintr-un compus care cuprinde NR. ID. SECV.:1, NR. ID. SECV.:2, NR. ID. SECV.:3, NR. ID. SECV.:4, NR. ID. SECV.:5, NR. ID. SECV.:6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12, NR. ID. SECV.:13 sau NR. ID. SECV.:14, sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic şi unul sau mai mulţi purtători, diluanţi sau excipienţi acceptabili din punct de vedere farmaceutic.

[0063] Prezenta dezvăluire dezvăluie, de asemenea, compuşi care cuprind NR. ID. SECV.: 22, NR. ID. SECV.: 23, NR. ID. SECV.: 24, NR. ID. SECV.: 25 sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic. Într-un alt exemplu de realizare, prezenta dezvăluire dezvăluie compuşi care constau din NR. ID. SECV.:22, NR. ID. SECV.:23, NR. ID. SECV.:24, NR. ID. SECV.:25 sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic. Preferabil, compuşii din NR. ID. SECV.:22, NR. ID. SECV.:23, NR. ID. SECV.:24, NR. ID. SECV.:25 cuprind o punte de disulfură sau tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7. Mai preferabil, compuşii care cuprind NR. ID. SECV.:22, NR. ID. SECV.:23, NR. ID. SECV.:24, NR. ID. SECV.:25 au o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7 şi ataşată la o fracţiune de linker a unui acid gras. Preferabil, fragmentul de acid gras este ataşat la o lizină.

[0064] Prezenta dezvăluire prezintă o metodă de tratare a diabetului, obezităţii, dislipidemiei şi/sau NASH, la un pacient care cuprinde administrarea la un pacient care are nevoie de aceasta a unei cantităţi eficace de compuşi care cuprind NR. ID. SECV.: 1, NR. ID. SECV.: 2, NR. ID. SECV.: 3, NR. ID. SECV.: 4, NR. ID. SECV.: 5, NR. ID. SECV.: 6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12, NR. ID. SECV.:13 sau NR. ID. SECV.:14, sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic sau compoziţii farmaceutice care le conţin. Prezenta dezvăluire descrie, de asemenea, o metodă de scădere a aportului alimentar, de scădere a greutăţii corporale, de scădere a glicemiei, de scădere a HbA1c şi/sau de scădere a trigliceridelor, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de aceasta a unei cantităţi eficace de compuşi care cuprind NR. ID. SECV.:1, NR. ID. SECV.:2, NR. ID. SECV.:3, NR. ID. SECV.:4, NR. ID. SECV.:5, NR. ID. SECV.:6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12, NR. ID. SECV.:13 sau NR. ID. SECV.:14, sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic sau compoziţii farmaceutice care le conţin. Preferabil, prezenta dezvăluire descrie o metodă de tratare a diabetului, obezităţii, dislipidemiei şi/sau NASH la un pacient care cuprinde administrarea la un pacient care are nevoie de aceasta a unei cantităţi eficace de compuşi cuprinzând NR. ID. SECV.: 2 sau compoziţii farmaceutice care îl conţine. Mai preferabil, prezenta dezvăluire descrie o metodă de tratare a diabetului la un pacient, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de acesta a unei cantităţi eficace de compuşi care cuprinde NR. ID. SECV.: 2 sau compoziţii farmaceutice care îl conţin. În mod alternativ, prezenta dezvăluire descrie o metodă de tratare a obezităţii la un pacient, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de aceasta a unei cantităţi eficace de compuşi care cuprinde NR. ID. SECV.: 2 sau compoziţii farmaceutice care îl conţin.

[0065] Prezenta cerere furnizează compuşii care cuprind NR. ID. SECV.:1, NR. ID. SECV.:2, NR. ID. SECV.:3, NR. ID. SECV.:4, NR. ID. SECV.:5, NR. ID. SECV.:6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12, NR. ID. SECV.:13 sau NR. ID. SECV.:14 sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic sau compoziţii farmaceutice care le conţin pentru a fi utilizate în terapie. Prezenta cerere descrie în plus compuşii care cuprind NR. ID. SECV.:1, NR. ID. SECV.:2, NR. ID. SECV.:3, NR. ID. SECV.:4, NR. ID. SECV.:5, NR. ID. SECV.:6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12, NR. ID. SECV.:13, sau NR. ID. SECV.:14 sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic sau compoziţii farmaceutice care le conţin pentru a fi utilizate în tratarea diabetului, obezităţii, dislipidemiei şi/sau NASH. Prezenta cerere descrie, de asemenea, compusul care cuprinde NR. ID. SECV.:2 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic sau compoziţii farmaceutice care îl conţin pentru a fi utilizate în terapie, tratarea diabetului, obezităţii, dislipidemiei şi/sau NASH. Mai preferabil, prezenta cerere descrie compusul care cuprinde NR. ID. SECV.:2 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic sau compoziţii farmaceutice care îl conţin pentru a fi utilizate în tratarea diabetului. În mod alternativ, prezenta cerere descrie compusul care cuprinde NR. ID. SECV.:2 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic sau compoziţii farmaceutice care îl conţin pentru a fi utilizate în tratarea obezităţii. În mod alternativ, prezenta cerere descrie compusul care cuprinde NR. ID. SECV.:2 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic sau compoziţii farmaceutice care îl conţin, pentru a fi utilizate în tratarea dislipidemiei. În mod alternativ, prezenta cerere descrie compusul care cuprinde NR. ID. SECV.:2 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic sau compoziţii farmaceutice care îl conţin pentru a fi utilizate în tratarea NASH.

[0066] Prezenta cerere descrie compuşii care cuprind NR. ID. SECV.:1, NR. ID. SECV.:2, NR. ID. SECV.:3, NR. ID. SECV.:4, NR. ID. SECV.:5, NR. ID. SECV.:6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12, NR. ID. SECV.:13 sau NR. ID. SECV.:14 sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic sau compoziţii care le conţin, pentru a fi utilizate în scăderea aportului alimentar, scăderea greutăţii corporale, scăderea glicemiei, scăderea HbA1c şi/sau scăderea trigliceridelor. Mai preferabil, prezenta cerere descrie compuşii care cuprind NR. ID. SECV.:2 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic sau compoziţii care îl conţin, pentru a fi utilizate în scăderea aportului alimentar, scăderea greutăţii corporale, scăderea glicemiei, scăderea HbA1c şi/sau scăderea trigliceridelor.

[0067] Prezenta dezvăluire descrie, de asemenea, utilizarea unui compus care cuprinde NR. ID. SECV.:1, NR. ID. SECV.:2, NR. ID. SECV.:3, NR. ID. SECV.:4, NR. ID. SECV.:5, NR. ID. SECV.:6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12, NR. ID. SECV.:13, sau NR. ID. SECV.:14 sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, la fabricarea unui medicament pentru tratarea diabetului, obezităţii, dislipidemiei şi/sau NASH. Preferabil, prezenta dezvăluire descrie în plus utilizarea unui compus care cuprinde NR. ID. SECV.: 2 în fabricarea unui medicament pentru tratarea diabetului, obezităţii, dislipidemiei şi/sau NASH.

[0068] Prezenta dezvăluire prevede, de asemenea, utilizarea unui compus care cuprinde NR. ID. SECV.:1, NR. ID. SECV.:2, NR. ID. SECV.:3, NR. ID. SECV.:4, NR. ID. SECV.:5, NR. ID. SECV.:6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12, NR. ID. SECV.:13 sau NR. ID. SECV.:14 sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în fabricarea unui medicament pentru scăderea aportului alimentar, scăderea greutăţii corporale, scăderea glicemiei, scăderea HbA1c şi/sau scăderea trigliceridelor. Preferabil, prezenta dezvăluire prevede în plus utilizarea unui compus care cuprinde NR. ID. SECV.:2 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în fabricarea unui medicament care scade aportul alimentar, scade greutatea corporală, scade glicemia, scade HbA1c şi/sau scade trigliceridele.

[0069] Cu excepţia cazului în care se defineşte altfel, toţi termenii tehnici şi ştiinţifici utilizaţi în prezentul document au aceeaşi semnificaţie pe care o înţelege de regulă o persoană de specialitate din domeniul căruia îi aparţine această dezvăluire. Deşi orice metode şi materiale similare sau echivalente cu cele descrise în prezentul document pot fi utilizate în practica sau testarea peptidelor, compoziţiilor farmaceutice şi metodelor agonistului amilinei, metodele şi materialele preferate sunt descrise în prezentul document.

[0070] În plus, referirea la un element prin articolul nehotărât „o» sau „un» nu exclude posibilitatea existenţei mai multor elemente, cu excepţia cazului în care contextul impune în mod clar existenţa unui singur element. Articolul nehotărât „o» sau „un» înseamnă de obicei „cel puţin un/o».

[0071] Aşa cum se utilizează în prezentul document, „aproximativ» înseamnă, într-un interval semnificativ din punct de vedere statistic, o valoare sau valori cum ar fi, de exemplu, o concentraţie declarată, lungime, greutate moleculară, pH, similitudine de secvenţă, interval de timp, temperatură, volum etc. O astfel de valoare sau interval poate fi cuprins într-un ordin de mărime, de obicei în limita a 20 %, mai tipic în intervalul 10 % şi chiar mai tipic în intervalul 5 % dintr-o valoare sau un interval dat. Variaţia admisibilă cuprinsă de termenul „aproximativ» va depinde de sistemul specific studiat şi poate fi apreciată uşor de către o persoană de specialitate din domeniu.

[0072] Aşa cum se utilizează în prezentul document şi cu referire la unul sau mai mulţi receptori, „activitate», „activează», „activând» şi altele asemenea înseamnă capacitatea unui compus, cum ar fi o peptidă din prezentul document, de a se lega şi de a induce un răspuns la receptor(i), măsurat prin folosirea unor teste cunoscute în domeniu, cum ar fi testele in vitro descrise mai jos.

[0073] După cum se utilizează în prezentul document, termenul „aminoacid» înseamnă atât aminoacizi naturali, cât şi aminoacizi necodificaţi. După cum se cunoaşte în stadiul tehnicii, un aminoacid este o moleculă care, din punct de vedere chimic, este caracterizată prin prezenţa uneia sau mai multor grupe de amine şi a uneia sau mai multor grupe de acid carboxilic şi poate conţine alte grupe funcţionale. În plus, aminoacizii sunt descrişi de regulă folosind coduri standard de o literă (de exemplu, L = leucină), precum şi reziduuri substituite cu alfa-metil ale aminoacizilor naturali (de exemplu, α-metil leucină, sau αMeL şi α-metil fenilalanină, sau αMeF) şi anumiţi alţi aminoacizi necodificaţi, cum ar fi „γE», „NMeN», „NMeD», „Orn» şi alţii similari. Structurile aminoacizilor necodificaţi din prezenta dezvăluire apar mai jos:

[0074]

[0075] Aşa cum se utilizează în prezentul document, „γE» înseamnă acid gama-glutamic (unde legătura peptidică este formată folosind grupul de acid carboxilic cu catenă laterală în poziţia gama, mai degrabă decât în poziţia alfa tipică). După cum se utilizează în prezentul document, „Orn» înseamnă ornitină. După cum se utilizează în prezentul document, „αMeL» înseamnă alfa-metil-L-leucină. După cum se utilizează în prezentul document, „αMeF» înseamnă alfa-metil-L-fenilalanină. După cum se utilizează în prezentul document, „NMeN» înseamnă N-metil-asparagină şi „NMeD» înseamnă acid N-metil-aspartic.

[0076] După cum se utilizează în prezentul document, „AEEA» înseamnă acid 2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]acetic. Structura apare mai jos:

[0077]

[0078] După cum se utilizează în prezentul document, „peptidă a agonistului de amilină» înseamnă un compus, cum ar fi o peptidă sintetică sau o polipeptidă, care activează un receptor ţintă şi care provoacă cel puţin un efect in vivo sau in vitro prin intermediul unui agonist nativ pentru acel receptor.

[0079] După cum se utilizează în prezentul document, „gestionarea greutăţii cronice» înseamnă o metodă prin care se menţine pierderea în greutate ca adjuvant la dieta cu conţinut redus de calorii şi creşterea activităţii fizice la persoanele care sunt sau au fost caracterizate anterior drept obeze.

[0080] Termenul „diabet» se referă la o boală în care este afectată capacitatea organismului de a produce sau de a răspunde la hormonul insulină, ducând la metabolismul anormal al carbohidraţilor şi la niveluri ridicate de glucoză în sânge şi urină. După cum se utilizează în prezentul document, termenul diabet se poate referi la o afecţiune cronică ce afectează modul în care organismul procesează zahărul din sânge sau glucoza, de exemplu diabetul zaharat de tip 2 (T2DM); o afecţiune cronică în care pancreasul produce puţină insulină sau nu produce deloc insulină, de exemplu diabetul zaharat de tip 1 (T1DM); o afecţiune în care glicemia este mare, dar nu suficient de mare pentru a fi diabet de tip 2, de exemplu prediabet; o formă de glicemie crescută care afectează femeile gravide, de exemplu diabetul gestaţional.

[0081] Termenul „dislipidemie» se referă la o tulburare a metabolismului lipoproteinelor, incluzând supraproducţia sau deficitul de lipoproteine. Dislipidemiile se pot manifesta prin creşterea concentraţiilor de colesterol total, lipoproteine cu densitate scăzută (LDL), colesterol şi trigliceride şi/sau o scădere a concentraţiei de lipoproteine cu densitate mare (HDL) din sânge. Dislipidemia se poate dezvolta sau nu în legătură cu diabetul zaharat.

[0082] Aşa cum se utilizează în prezentul document, termenul „acid gras» constă dintr-o catenă dreaptă cu un număr par de atomi de carbon, cu atomi de hidrogen de-a lungul catenei şi la un capăt (monoacid) sau la ambele capete (diacid) ale catenei unei grupe de carboxil (-COOH). Într-un exemplu de realizare preferat, fracţiunea „acid gras» este un diacid C20.

[0083]

[0084] După cum se utilizează în prezentul document, „puntea tioacetalică» se referă la o sinteză organică a unei grupe tioacetalice pentru a re-lega funcţional disulfura în cadrul structurilor peptidice. O punte tioacetalică (-S-CH2-S-) este prezentată mai jos, cu o grupare metilen inserată între doi atomi de sulf.

[0085]

[0086] Termenul „tratament» sau „tratare», după cum se utilizează în prezentul document, se referă la gestionarea şi îngrijirea unui pacient care are o afecţiune pentru care administrarea unui agonist peptidic al receptorului de amilină este indicată în scopul combaterii sau ameliorării simptomelor şi complicaţiilor afecţiunii. Tratarea include administrarea unui compus sau a unei compoziţii farmaceutice care conţine un compus dintre compuşii dezvăluiţi în prezentul document la un pacient care are nevoie de acesta pentru a preveni apariţia simptomelor sau a complicaţiilor, ameliorarea simptomelor sau a complicaţiilor sau eliminarea bolii, afecţiunii sau tulburării. Preferabil, tratarea include administrarea unui compus sau a unei compoziţii farmaceutice care conţine un compus din prezenta dezvăluire la un pacient care are nevoie de aceasta pentru a duce la o pierdere netă de greutate corporală, o reducere a aportului alimentar, o reducere a nivelului de glucoză din sânge, o reducere a HbA1c şi/sau o reducere a nivelului trigliceridelor. Pacientul care urmează să fie tratat este un mamifer şi, de preferinţă, o fiinţă umană.

[0087] După cum se utilizează în prezentul document, termenul „cantitate eficace» înseamnă o cantitate sau doză din unul sau mai mulţi compuşi din prezentul document, la administrarea unei singure doze sau a mai multor doze la o persoană care are nevoie de aceasta, care oferă un efect dorit la o astfel de persoană aflată sub diagnostic sau tratament (respectiv, poate produce o diferenţă măsurabilă clinic într-o afecţiune a persoanei, cum ar fi, de exemplu, o pierdere netă a greutăţii corporale, o reducere a aportului alimentar, o reducere a nivelului de glucoză din sânge, o reducere a HbA1c şi/sau o reducere a nivelului trigliceridelor). O cantitate eficace poate fi demonstrată cu uşurinţă de către o persoană de specialitate din domeniu prin utilizarea tehnicilor cunoscute şi prin observarea rezultatelor obţinute în circumstanţe analoage. La determinarea cantităţii eficace pentru o persoană, sunt luaţi în considerare o serie de factori, inclusiv, fără limitare, specia mamiferului, mărimea, vârsta şi starea generală de sănătate, boala sau tulburarea specifică implicată, gradul de implicare sau gravitatea bolii sau tulburării, răspunsul, compusul specific administrat, modul de administrare, caracteristicile de biodisponibilitate ale preparatului administrat, regimentul de doză selectat, utilizarea medicamentelor concomitente şi alte circumstanţe relevante. Preferabil, o cantitate eficace dintr-un compus sau compoziţie farmaceutică care conţine un compus din prezenta dezvăluire, administrată unui pacient care are nevoie de aceasta, ar duce la o pierdere netă a greutăţii corporale, o reducere a aportului alimentar, o reducere a nivelului de glucoză din sânge, o reducere a HbA1c şi/sau o reducere a nivelului trigliceridelor. O doză poate include o doză iniţială de încărcare mai mare, urmată de o doză mai mică. O doză eficace din compuşii descrişi în prezentul document poate fi între 0,05 μg/kg şi 5000 μg/kg sau între 0,01 nmol/kg şi 1000 nmol/kg.

[0088] După cum se utilizează în prezentul document, „timp de înjumătăţire» sau „t1/2» înseamnă un timp necesar pentru ca jumătate dintr-o cantitate a unui compus, cum ar fi peptida din prezentul document, să fie îndepărtată dintr-un lichid sau alt spaţiu fiziologic, cum ar fi serul sau plasma unei persoane, prin procese biologice. În mod alternativ, t1/2 poate însemna şi timpul necesar pentru ca o cantitate dintr-o astfel de peptidă să-şi piardă jumătate din activitatea farmacologică, fiziologică sau radiologică.

[0089] După cum se utilizează în prezentul document, „concentraţie iniţială maximă eficace» sau „EC50» înseamnă o concentraţie de compus care are ca rezultat activarea/stimularea în proporţie de 50 % a unui punct final al testului, cum ar fi curba doză-răspuns.

[0090] După cum se utilizează în prezentul document, „cu acţiune îndelungată» înseamnă că afinitatea de legare şi activitatea unei compoziţii din prezentul document continuă pentru o perioadă de timp mai mare decât peptida sau proteina nativă, permiţând dozarea cel puţin la fel de rar ca o dată pe zi sau chiar de trei ori pe săptămână, de două ori pe săptămână, o dată pe săptămână sau lunar. Profilul de acţiune în timp al compuşilor din prezentul document poate fi măsurat utilizând metode de testare farmacocinetică cunoscute, precum cele descrise în exemplele de mai jos.

[0091] Termenul „NASH» se referă la steatohepatita nealcoolică, cunoscută şi sub numele de boală hepatică grasă. „NASH» se referă, de asemenea, la inflamaţia ficatului şi la leziunile cauzate de acumularea de grăsime în ficat. „NASH» se referă, de asemenea, la un subtip de boală hepatică grasă nealcoolică („NAFLD»). În unele exemple de realizare, „NASH» poate fi sinonim cu „NAFLD».

[0092] Termenul „obezitate», după cum se utilizează în prezentul document, se referă la o tulburare care implică excesul de grăsime corporală care creşte riscul de probleme de sănătate. Termenul „obezitate» se referă, de asemenea, la greutatea care este mai mare decât ceea ce este considerat o greutate sănătoasă pentru o anumită înălţime. Termenul „obezitate» se referă, de asemenea, la un indice al masei corporale mai mare de 30,0 sau un indice al masei corporale de 27,0 sau mai mare (supraponderal) cu cel puţin o afecţiune comorbidă legată de greutate (de exemplu, hipertensiune arterială, diabet zaharat de tip 2 sau dislipidemie).

[0093] După cum se utilizează în prezentul document, indicele de masă corporală se referă la greutatea unei persoane în kilograme împărţită la pătratul înălţimii în metri.

[0094] După cum se utilizează în prezentul document, termenii „pacient» şi „persoană» sunt folosiţi în mod interschimbabil şi înseamnă un mamifer şi, preferabil, un om. În anumite situaţii concrete, pacientul, preferabil un om, este caracterizat în continuare de o boală, tulburare sau afecţiune care ar beneficia de administrarea unui compus care agonizează atât receptorii de amilină, cât şi pe cei de calcitonină.

[0095] În unele exemple de realizare, compoziţiile farmaceutice care cuprind un compus dezvăluit în prezent pot fi administrate oral pacienţilor care au nevoie de un astfel de tratament. Compoziţiile farmaceutice cuprinzând un compus dezvăluit în prezent pot fi administrate parenteral pacienţilor care au nevoie de un astfel de tratament. Administrarea parenterală poate fi efectuată prin injecţie subcutanată, intramusculară sau intravenoasă cu ajutorul unei seringi, opţional a unei seringi tip stilou sau a unui injector acţionat mecanic. Alternativ, administrarea parenterală poate fi efectuată cu ajutorul unei pompe de perfuzie. Exemplele de realizare ale compuşilor dezvăluiţi în prezent asigură compoziţii farmaceutice adecvate pentru administrare la un pacient, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de aceasta a unei cantităţi eficace din punct de vedere terapeutic dintr-un compus dezvăluit în prezent şi unul sau mai mulţi excipienţi acceptabili din punct de vedere farmaceutic. Astfel de compoziţii farmaceutice pot fi preparate prin oricare dintre o varietate de tehnici care utilizează excipienţi convenţionali pentru produse farmaceutice care sunt bine cunoscute în domeniu. (Remington's Pharmaceutical Sciences, ediţia 21, University of the Sciences in Philadelphia, Philadelphia, PA, SUA (2006)).

[0096] După cum se utilizează în prezentul document, „similitudinea secvenţei» înseamnă o proprietate cantitativă a două sau mai multe secvenţe de acid nucleic sau secvenţe de aminoacizi ale compuşilor biologici, cum ar fi, de exemplu, o corespondenţă pe o lungime întreagă sau o fereastră de comparaţie a două sau mai multe secvenţe. Similitudinea secvenţei poate fi măsurată prin (1) identitate procentuală sau (2) similaritate procentuală. Identitatea procentuală măsoară un procent de reziduuri identice între doi compuşi biologici împărţiţi la lungimea celei mai scurte secvenţe, iar similitudinea procentuală măsoară identităţile şi, în plus, include lacunele de secvenţă şi similitudinea reziduurilor în evaluare. Metodele şi algoritmii pentru determinarea similitudinii secvenţei sunt bine-cunoscute în domeniu şi, prin urmare, nu este necesar să fie descrise exhaustiv în prezentul document. Un procent specificat de poziţii identice de nucleotide sau aminoacizi este de cel puţin aproximativ 75 %, 80 %, 85 %, 86, 76, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % sau mai mare.

[0097] Compuşii prezentaţi în prezentul document pot fi utilizaţi în combinaţie simultană, separată sau secvenţială cu unul sau mai mulţi agenţi terapeutici suplimentari utili pentru inducerea pierderii în greutate, tratarea diabetului, a afecţiunilor legate de diabet, obezitate şi/sau gestionarea greutăţii cronice, dislipidemie şi/sau NASH. Exemple nelimitative de agenţi terapeutici suplimentari care pot fi combinaţi cu compuşii revendicaţi includ: insulină sau analogi de insulină; biguanide; sulfoniluree; tiazolidindione; inhibitori ai dipeptidil peptidazei-4 („DPP-4»); inhibitori ai transportatorilor de glucoză dependenţi de sodiu (SGLT2); compuşi ai incretinei, cum ar fi peptida similară glucagonului 1 (GLP-1) sau analogi GLP-1, polipeptidă inhibitoare gastrică (GIP) sau analogi GIP, analogi de oxintomodulină sau oxantomodulină; compuşi agonişti ai factorului de diferenţiere a creşterii 15 (GDF15); analogi de peptide YY (PYY); agonişti duali GIP/GLP-1; triagonişti Gcg/GIP/GLP-1 (triagonişti ai glucagonului, GIP şi GLP-1); sau combinaţii ale oricăruia dintre agenţii de mai sus. Compuşii revendicaţi şi agentul sau agenţii terapeutici suplimentari pot fi co-administraţi prin aceeaşi cale de livrare şi dispozitiv, cum ar fi o singură pastilă, capsulă, tabletă sau formulă injectabilă; administrate fie separat, fie în acelaşi timp, în dispozitive sau căi de administrare separate; sau administrat în mod secvenţial.

[0098] Un alt exemplu de realizare al prezentei dezvăluiri este o metodă de tratare a unei afecţiuni la un pacient care are nevoie de aceasta, selectate din grupul format din: diabet, obezitate, NASH şi/sau dislipidemie, care cuprinde administrarea la pacient a unei cantităţi eficace dintr-un compus care cuprinde NR. ID. SECV.:1, NR. ID. SECV.:2, NR. ID. SECV.:3, NR. ID. SECV.:4, NR. ID. SECV.:5, NR. ID. SECV.:6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12, NR. ID. SECV.:13 sau NR. ID. SECV.:14 sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în combinaţie cu o cantitate eficace de incretină sau analog de incretină. Preferabil, un exemplu de realizare a prezentei dezvăluiri este o metodă de tratare a unei afecţiuni la un pacient care are nevoie de aceasta, selectat din grupul format din: diabet, obezitate, NASH şi/sau dislipidemie, care constă în administrarea la pacient a unei cantităţi eficace dintr-un compus care cuprinde NR. ID. SECV.:2 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în combinaţie cu o cantitate eficace de analog de incretină sau incretină.

[0099] Într-un exemplu de realizare specific, prezenta dezvăluire este o metodă de tratare a unei afecţiuni la pacientul care are nevoie de aceasta, selectată dintr-un grup format din: diabet, obezitate, NASH şi/sau dislipidemie, care cuprinde administrarea unui pacient care are nevoie de un astfel de tratament a unei cantităţi eficace dintr-un compus care cuprinde NR. ID. SECV.: 1, NR. ID. SECV.: 2, NR. ID. SECV.:3, NR. ID. SECV.:4, NR. ID. SECV.:5, NR. ID. SECV.:6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12, NR. ID. SECV.:13 sau NR. ID. SECV.:14 sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în combinaţie cu un agonist GLP-1. Într-un exemplu de realizare specific al prezentei dezvăluiri este descrisă o metodă de tratare a unui pacient cu diabet, obezitate, NASH şi/sau dislipidemie, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de un astfel de tratament a unei cantităţi eficace dintr-un compus care cuprinde NR. ID. SECV.: 1 sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în combinaţie cu un agonist GLP-1 care cuprinde compusul XVII (NR. ID. SECV.: 18). Într-un alt exemplu de realizare specific al prezentei dezvăluiri este descrisă o metodă de tratare a unui pacient cu diabet, obezitate, NASH şi/sau dislipidemie, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de un astfel de tratament a unei cantităţi eficace dintr-un compus care cuprinde NR. ID. SECV.: 2 sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în combinaţie cu un agonist GLP-1 care cuprinde compusul XVII (NR. ID. SECV.: 18).

[0100] Într-un exemplu de realizare specific al prezentei dezvăluiri este descrisă o metodă de tratare a unui pacient cu diabet, obezitate, NASH şi/sau dislipidemie, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de un astfel de tratament a unei cantităţi eficace dintr-un compus care cuprinde NR. ID. SECV.: 1, NR. ID. SECV.: 2, NR. ID. SECV.: 3, NR. ID. SECV.: 4, NR. ID. SECV.: 5, NR. ID. SECV.:6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12, NR. ID. SECV.:13, sau NR. ID. SECV.:14 sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în combinaţie cu un analog al oxintomodulinei. Într-un exemplu de realizare specific al prezentei dezvăluiri este descrisă o metodă de tratare a unui pacient cu diabet, obezitate, NASH şi/sau dislipidemie, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de un astfel de tratament a unei cantităţi eficace dintr-un compus care cuprinde NR. ID. SECV.: 1, NR. ID. SECV.: 2, NR. ID. SECV.: 3, NR. ID. SECV.: 4, NR. ID. SECV.: 5, NR. ID. SECV.:6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12, NR. ID. SECV.:13, sau NR. ID. SECV.:14 sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în combinaţie cu un analog de oxintomodulină cuprinzând compusul XVIII (NR. ID. SECV.:19). Într-un alt exemplu de realizare specific al prezentei dezvăluiri este descrisă o metodă de tratare a unui pacient cu diabet, obezitate, NASH şi/sau dislipidemie, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de un astfel de tratament a unei cantităţi eficace dintr-un compus care cuprinde NR. ID. SECV.: 2 sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în combinaţie cu un analog al oxintomodulinei cuprinzând compusul XVIII (NR. ID. SECV.: 19).

[0101] Într-un exemplu de realizare specific al prezentei dezvăluiri este descrisă o metodă de tratare a unui pacient cu diabet, obezitate, NASH şi/sau dislipidemie, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de un astfel de tratament a unei cantităţi eficace dintr-un compus care cuprinde NR. ID. SECV.: 1, NR. ID. SECV.: 2, NR. ID. SECV.: 3, NR. ID. SECV.: 4, NR. ID. SECV.: 5, NR. ID. SECV.:6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12, NR. ID. SECV.:13, sau NR. ID. SECV.:14 sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în combinaţie cu un triagonist de glucagon, GIP şi GLP-1. Într-un exemplu de realizare specific al prezentei dezvăluiri este descrisă o metodă de tratare a unui pacient cu diabet, obezitate, NASH şi/sau dislipidemie, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de un astfel de tratament a unei cantităţi eficace dintr-un compus care cuprinde NR. ID. SECV.: 1, NR. ID. SECV.: 2, NR. ID. SECV.: 3, NR. ID. SECV.: 4, NR. ID. SECV.: 5, NR. ID. SECV.:6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12, NR. ID. SECV.:13, sau NR. ID. SECV.:14 sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în combinaţie cu un triagonist de glucagon, GIP şi GLP-1 cuprinzând Compusul XIX (NR. ID. SECV.:20). Într-un alt exemplu de realizare specific al prezentei dezvăluiri este descrisă o metodă de tratare a unui pacient cu diabet, obezitate, NASH şi/sau dislipidemie, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de un astfel de tratament a unei cantităţi eficace dintr-un compus cuprinzând NR. ID. SECV.: 2 sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în combinaţie cu un triagonist de glucagon, GIP şi GLP-1 cuprinzând compusul XIX (NR. ID. SECV.:20).

[0102] Într-un exemplu de realizare specific al prezentei dezvăluiri este descrisă o metodă de tratare a unui pacient cu diabet, obezitate, NASH şi/sau dislipidemie, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de un astfel de tratament a unei cantităţi eficace dintr-un compus care cuprinde NR. ID. SECV.: 1, NR. ID. SECV.: 2, NR. ID. SECV.: 3, NR. ID. SECV.: 4, NR. ID. SECV.: 5, NR. ID. SECV.:6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12, NR. ID. SECV.:13, sau NR. ID. SECV.:14 sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în combinaţie cu un agonist dual GIP/GLP-1. Într-un exemplu de realizare specific al prezentei dezvăluiri este descrisă o metodă de tratare a unui pacient cu diabet, obezitate, NASH şi/sau dislipidemie, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de un astfel de tratament a unei cantităţi eficace dintr-un compus care cuprinde NR. ID. SECV.: 1, NR. ID. SECV.: 2, NR. ID. SECV.: 3, NR. ID. SECV.: 4, NR. ID. SECV.: 5, NR. ID. SECV.:6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12, NR. ID. SECV.:13, sau NR. ID. SECV.:14 sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în combinaţie cu un agonist dual GIP/GLP-1 cuprinzând NR. ID. SECV.:21. Într-un alt exemplu de realizare specific al prezentei dezvăluiri este descrisă o metodă de tratare a unui pacient cu diabet, obezitate, NASH şi/sau dislipidemie, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de un astfel de tratament a unei cantităţi eficace dintr-un compus cuprinzând NR. ID. SECV.: 2 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în combinaţie cu un agonist dual GIP/GLP-1 cuprinzând NR. ID. SECV.: 21.

[0103] Un alt exemplu de realizare al prezentei dezvăluiri este compusul care cuprinde NR. ID. SECV.:1, NR. ID. SECV.:2, NR. ID. SECV.:3, NR. ID. SECV.:4, NR. ID. SECV.:5, NR. ID. SECV.:6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12, NR. ID. SECV.:13 sau NR. ID. SECV.:14 sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, pentru utilizare într-o combinaţie separată, simultană sau secvenţială cu un analog de incretină sau incretină pentru tratarea diabetului, obezităţii, NASH şi/sau dislipidemiei. Preferabil, un exemplu de realizare al prezentei dezvăluiri este compusul care cuprinde NR. ID. SECV.:2, sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, pentru utilizare într-o combinaţie separată, simultană sau secvenţială cu un analog de incretină sau incretină pentru tratarea diabetului, obezităţii, NASH şi/sau dislipidemiei. Mai preferabil, incretina sau analogul incretinei este un agonist dual GIP/GLP-1 cuprinzând NR. ID. SECV.:21.

[0104] Anumite abrevieri utilizate în prezentul document sunt definite după cum urmează: „ACN» se referă la acetonitril; „AMY1R» se referă la receptorul de amilină 1; „cAMP» se referă la monofosfat ciclic de adenozină; „CT» se referă la calcitonină; „DCM» se referă la diclorometan; „DIEA» se referă la diizopropiletilamină; „DMF» se referă la N,N-dimetilformamidă; „DMSO» se referă la dimetilsulfoxid; „DODT» se referă la 2,2'-(etilendioxi)dietanetiol; „FBS» se referă la ser fetal bovin; „Fmoc» se referă la fluorenilmetiloxicarbonil; „GDF15» se referă la factorul de diferenţiere a creşterii 15; „GPCR» se referă la receptorul (receptorii) cuplat(i) cu proteina G; „HEPES» se referă la acidul 4-(2-hidroxietil)-1-piperazin-etansulfonic; „HTRF» înseamnă fluorescenţă omogenă, rezolvată în timp. „IBMX» se referă la 1-metil-3-izobutilxantină; „MEM» se referă la suportul esenţial minim; „Mtt» se referă la 4-metiltritil; „NASH» se referă la boala hepatică grasă nealcoolică; „NEAA» se referă la aminoacizii neesenţiali; „PyAOP» se referă la hexafluorofosfatul de (7-azabenzotriazol-1-iloxi)tripirolidinofosfoniu; „RP-HPLC» se referă la cromatografia lichidă de înaltă presiune în fază inversă; „TCEP» se referă la tris(2-carboxietil)fosfinclorhidrat"; „TFA» se referă la acidul trifluoroacetic; iar „TRIS» se referă la tris(hidroximetil)aminometan.

[0105] Exemplul 1: Prepararea şi purificarea compuşilor I şi II

[0106] Compusul I şi Compusul II sunt obţinuţi conform următoarelor etape. În primul rând, Compusul I (NR. ID. SECV.:1) este sintetizat folosind chimia fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc)/terţ-butil (t-Bu) pe un sintetizator peptidic multiplex cu 12 canale Symphony (Protein Technologies, Inc. Tucson, AZ).

[0107] Polistiren Rink Amide MBHA răşină LL (Novabiochem, sub: 0,35 meq/g, 100-200 mesh, nr. cat. 855045) este utilizat pentru sinteza la scară de 0,13 mmol. Sunt utilizate grupuri standard de protecţie a catenei laterale. Boc-Glu-OtBu este utilizat pentru poziţia 1. Fmoc-Lys(Mtt)-OH este utilizat pentru lizina din poziţia 26. Grupele Fmoc sunt îndepărtate înainte de fiecare etapă de cuplare (2 × 7 minute) folosind piperidină 20 % în DMF. Toate cuplările de aminoacizi sunt efectuate timp de 30 de minute la 60 °C folosind un raport molar egal de aminoacid Fmoc (0,3M), diizopropilcarbodiimidă (0,9 M) şi Oxyma (0,9 M), la un exces molar de 7,7 ori faţă de încărcarea peptidică teoretică. Cuplările de aminoacizi urmând αMeF în poziţia 15 şi NMeN în poziţia 22 sunt efectuate timp de 3 ore şi respectiv 6 ore la 60 °C. Pentru Compusul I (NR. ID. SECV.:1), răşina este tratată cu un cocktail de scindare în acest moment (condiţii descrise după procedurile de adăugare a fragmentului de legătură de acid gras pentru a genera compusul II). Mai jos este prezentată o schemă a Compusului I (NR. ID. SECV.:1) care utilizează codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia acidului glutamic (γE) în poziţia 1 (unde legătura peptidică este formată folosind grupul său de acid carboxilic cu catenă laterală în poziţia gama, mai degrabă decât poziţia alfa tipică), cisteinele din poziţiile 2 şi 7, Orn în poziţia 11, αMeF în poziţia 15, NMeN în poziţia 22 şi tirozină în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0108]

[0109] Apoi, răşina este spălată bine cu DCM de 6 ori pentru a îndepărta DMF rezidual. Grupa de protecţie Mtt de pe lizină în poziţia 26 este îndepărtată selectiv din răşina peptidică folosind două tratamente cu hexafluoroizopropanol 30 % (Oakwood Chemicals) în DCM (tratament de 2 × 40 de minute). Ataşarea ulterioară a fracţiunii de linker a acidului gras se realizează prin cuplarea acidului Fmoc-glutamic α-t-butil ester (Fmoc-Glu-OtBu, Ark Pharm, Inc.), acid mono-OtBu-eicosanoic (WuXi AppTec, Shanghai, China). Excesul de 3 ori al reactivilor (AA: PyAOP: DIEA=1: 1:1 mol/mol) sunt utilizate pentru fiecare cuplare care durează 1 oră.

[0110] După ce sinteza este completă, răşina peptidică este spălată cu DCM şi apoi uscată bine cu aer. Răşina uscată este tratată cu 10 ml de cocktail de scindare (TFA: DODT: TIS: H2O = 89:3:3:5 v/v) timp de 2 ore la temperatura camerei. Răşina este filtrată, spălată de două ori fiecare cu 2 ml de TFA pur şi materialele filtrate combinate sunt tratate cu un volum de 4 ori de dietil eter rece (-20 °C) pentru a precipita peptida brută. Suspensia peptidă/eter este apoi centrifugată la 3500 rpm timp de 2 minute pentru a forma o peletă solidă, supernatantul este decantat, iar granula solidă este triturată cu eter de încă două ori. Pentru a realiza puntea tioacetalică, granula, după uscarea la aer, se dizolvă în 5 ml de soluţie tampon de fosfat de potasiu 20 mM şi 3 ml de ACN. Odată dizolvat complet, după ce se agită bine, se adaugă TCEP în H2O (30 μM, 5 echiv.), diiodometan (8 echiv.) şi trietilamină (10 echiv.) şi se lasă la agitat timp de 5-30 min. LCMS este utilizat pentru a monitoriza reacţia, care se finalizează de obicei în 5 minute. După ce se finalizează reacţia, la amestec se adaugă 1 ml de H2O g/ 0,1 % TFA, precum şi 6 ml de acid acetic. Se adaugă mai mult ACN, după cum este necesar, dacă soluţia este tulbure.

[0111] Peptida brută este purificată prin RP-HPLC pe o coloană Phenomenex PhenylHexyl (5 μm, 100A, 250x21,2 mm, cod piesă: 00G-4257-P0-AX) cu un gradient liniar utilizând un sistem 100 % acetonitril şi 0,1 % TFA/apă. Puritatea peptidei este evaluată utilizând RP-HPLC analitic utilizând o coloană Waters Symmetry Shield RP18 (3,5 um, 6x100 mm, Partea 186000179), iar criteriile de grupare sunt de >95 %. Puritatea grupului principal al Compusului II (NR. ID. SECV.:2) s-a dovedit a fi mai mare de 98,4 %. Liofilizarea ulterioară a grupei principale de produse finale a generat sarea TFA a peptidei liofilizate. Masa moleculară a compusului I (NR. ID. SECV.:1) este determinată de LC/MS (Găsit: [M+3H]3+=1315,2; Calc. [M+3H]3+=1315,5; MW găsit (medie) = 3942,6; Calc. MW (medie) = 3943,4). Masa moleculară a compusului II (NR. ID. SECV.: 2) este determinată de LC/MS (Găsit: [M+3H]3+=1509,5; Calc. [M+3H]3+=1509,7; MW găsit (medie) = 4525,5; Calc. MW (medie) = 4526,1). Mai jos prezentăm o schemă a compusului I (NR. ID. SECV.:2) folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia acidului glutamic (γE) în poziţia 1 (unde legătura peptidică este formată folosind acidul său carboxilic cu catenă laterală în poziţia gamma şi nu în poziţia alfa tipică), cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, Orn în poziţia 11, αMeF în poziţia 15, NMeN în poziţia 22, lizinei în poziţia 26 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0112]

[0113] Procese similare cu cele descrise mai sus şi cunoscute persoanelor de specialitate din domeniu pot fi utilizate pentru a sintetiza catena principală peptidică, pentru a conjuga radicalul de legătură cu acidul gras, pentru a examina puritatea şi pentru a confirma masa moleculară a compuşilor invenţiei descrişi în prezentul document.

[0114] Exemplul 2: Prepararea şi purificarea compuşilor III şi IV

[0115] Compuşii III şi IV sunt obţinuţi conform proceselor descrise în Exemplul 1.

[0116] Mai jos este prezentată o schemă a Compusului I (NR. ID. SECV.:3) care utilizează codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia acidului glutamic (γE) în poziţia 1 (în care legătura peptidică este formată folosind grupul său de acid carboxilic cu catenă laterală în poziţia gama, mai degrabă decât poziţia alfa tipică), cisteinele din poziţiile 2 şi 7, Orn în poziţia 11, αMeF în poziţia 15, NMeD în poziţia 22 şi tirozină în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0117]

[0118] Masa moleculară a Compusului III (NR. ID. SECV.:3) este determinată de LC/MS (Găsit: [M+3H]3+=1314,9; Calc. [M+3H]3+=1315,8; MW găsit (medie)=3941,7; Calc. MW (medie)=3944,4).

[0119] Mai jos prezentăm o schemă a compusului IV (NR. ID. SECV.:4) folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia acidului glutamic (γE) în poziţia 1 (unde legătura peptidică este formată folosind grupul său al acidului carboxilic cu catenă laterală în poziţia gamma şi nu în poziţia alfa tipică), cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, Orn în poziţia 11, αMeF în poziţia 15, NMeD în poziţia 22, lizinei în poziţia 26 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0120]

[0121] Masa moleculară este determinată prin LC/MS (Găsit: [M+3H]3+=1509,7; Calc. [M+3H]3+=1510,0; MW găsit (medie) = 4526,1; Calc. MW (medie) = 4527,1).

[0122] Exemplul 3: Prepararea şi purificarea Compuşilor V şi VI

[0123] Compuşii V şi VI sunt obţinuţi conform proceselor prezentate în Exemplul 1.

[0124] Mai jos prezentăm o schemă a compusului V (NR. ID. SECV.:5) folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, Orn în poziţia 11, αMeF în poziţia 15, NMeD în poziţia 22 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0125]

[0126] Masa moleculară a compusului V (NR. ID. SECV.:5) este determinată de LC/MS (Găsit: [M+3H]3+=1314,9; Calc. [M+3H]3+=1315,5; MW găsit (medie)=3941,7; Calc. MW (medie) = 3943,4).

[0127] Mai jos prezentăm o schemă a Compusului VI (NR. ID. SECV.:6) folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia lizinei în poziţia 1, cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, Orn în poziţia 11, αMeF în poziţia 15, NMeD în poziţia 22 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0128]

[0129] Masa moleculară este determinată prin LC/MS (Găsit: [M+3H]3+=1509,4; Calc. [M+3H]3+=1509,7; MW găsit (medie) = 4525,2; Calc. MW (medie) = 4526,1).

[0130] Exemplul 4: Prepararea şi purificarea Compusului VII şi VIII

[0131] Compuşii VII şi VIII sunt obţinuţi conform proceselor prezentate în Exemplul 1.

[0132] Mai jos prezentăm o schemă a compusului VII (NR. ID. SECV.:7) folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, Orn în poziţia 11, αMeL în poziţia 12 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0133]

[0134] Masa moleculară a Compusului VII (NR. ID. SECV.:7) este determinată de LC/MS (Găsit: [M+3H]3+=1317,9; Calc. [M+3H]3+=1318,1; MW găsit (medie) = 3950,7; Calc. MW (medie) = 3951,4).

[0135] Mai jos prezentăm o schemă a Compusului VIII (NR. ID. SECV.:8) folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia lizinei în poziţia 1, cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, Orn în poziţia 11, αMeL în poziţia 12 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0136]

[0137] Masa moleculară este determinată prin LC/MS (Găsit: [M+3H]3+=1512,2; Calc. [M+3H]3+=1512,4; MW găsit (medie) = 4533,6; Calc. MW (medie) = 4534,2).

[0138] Exemplul 5: Prepararea şi purificarea Compusului IX

[0139] Compusul IX este obţinut conform proceselor descrise în Exemplul 1.

[0140] Mai jos prezentăm o schemă a Compusului IX (NR. ID. SECV.:9) folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia acidului glutamic (γE) în poziţia 1 (unde legătura peptidică este formată folosind grupul său al acidului carboxilic cu catenă laterală în poziţia gamma şi nu în poziţia alfa tipică), cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, lizinei în poziţia 26 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0141]

[0142] Masa moleculară este determinată prin LC/MS (Găsit: [M+3H]3+=1558,3; Calc. [M+3H]3+=1558,8; MW găsit (medie) = 4671,9; Calc. MW (medie) = 4673,3).

[0143] Exemplul 6: Prepararea şi purificarea Compusului X

[0144] Compusul X este obţinut conform proceselor prezentate în Exemplul 1.

[0145] Mai jos prezentăm o schemă a Compusului X (NR. ID. SECV.:10) folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia acidului glutamic (γE) în poziţia 1 (unde legătura peptidică este formată folosind grupul său al acidului carboxilic cu catenă laterală în poziţia gamma şi nu în poziţia alfa tipică), cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, lizinei în poziţia 26 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0146]

[0147] Masa moleculară este determinată prin LC/MS (Găsit: [M+3H]3+=1558,5; Calc. [M+3H]3+=1558,8; MW găsit (medie) = 4672,5; Calc. MW (medie) = 4673,3).

[0148] Exemplul 7: Prepararea şi purificarea Compusului XI

[0149] Compusul XI este obţinut conform proceselor descrise în Exemplul 1.

[0150] Mai jos prezentăm o schemă a Compusului XI (NR. ID. SECV.:11) folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia acidului glutamic (γE) în poziţia 1 (unde legătura peptidică este formată folosind grupul său al acidului carboxilic cu catenă laterală în poziţia gamma şi nu în poziţia alfa tipică), cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, lizinei în poziţia 26 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0151]

[0152] Masa moleculară este determinată prin LC/MS (Găsit: [M+3H]3+=1553,2; Calc. [M+3H]3+=1553,4; MW găsit (medie) = 4656,6; Calc. MW (medie) = 4657,2).

[0153] Exemplul 8: Prepararea şi purificarea Compusului XII

[0154] Compusul XII este obţinut conform proceselor prezentate în Exemplul 1.

[0155] Mai jos prezentăm o schemă a Compusului XII (NR. ID. SECV.:12) folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia acidului glutamic (γE) în poziţia 1 (unde legătura peptidică este formată folosind grupul său al acidului carboxilic cu catenă laterală în poziţia gamma şi nu în poziţia alfa tipică), cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, Orn în poziţia 11, lizinei în poziţia 26 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0156]

[0157] Masa moleculară este determinată prin LC/MS (Găsit: [M+3H]3+=1577,4; Calc. [M+3H]3+=1577,8; MW găsit (medie) = 4729,2; Calc. MW (medie) = 4730,3).

[0158] Exemplul 9: Prepararea şi purificarea Compusului XIII

[0159] Compusul XIII este obţinut conform proceselor prezentate în Exemplul 1.

[0160] Mai jos prezentăm o schemă a Compusului XIII (NR. ID. SECV.:13) folosind codurile standard de aminoacizi cu o singură literă, cu excepţia acidului glutamic (γE) în poziţia 1 (unde legătura peptidică este formată folosind grupul său al acidului carboxilic cu catenă laterală în poziţia gamma şi nu în poziţia alfa tipică), cisteinelor în poziţiile 2 şi 7, Orn în poziţia 11, lizinei în poziţia 26 şi tirozinei în poziţia 37, unde structurile acestor reziduuri de aminoacizi au fost extinse:

[0161]

[0162] Masa moleculară este determinată prin LC/MS (Găsit: [M+3H]3+=1481,2; Calc. [M+3H]3+=1481,3; MW găsit (medie) = 1440,6; Calc. MW (medie) = 4441,0).

[0163] Pregătirea punţii de legătură de disulfură

[0164] Pentru a realiza legătura de disulfură, soluţia de oxidare se prepară prin adăugarea a 10 picături de soluţie de iod (2 % iod în AcOH) la 40 ml de 20 % MeCN/20 % AcOH/60 % apă într-un balon. Separat, se realizează o soluţie peptidică prin dizolvarea granulei peptidice după uscarea în aer în 5 ml de AcOH. Sub agitare, soluţia peptidică este adăugată prin picurare la soluţia de oxidare. Se adaugă o soluţie suplimentară de iod (2 % iod în AcOH), după cum este necesar, pentru a menţine o soluţie de culoare galben deschis în balon. Culoarea maro deschis/galben este menţinută timp de 5 minute după adăugarea întregii soluţii peptidice. Iodul suplimentar este neutralizat prin adăugarea unei picături de acid ascorbic saturat la soluţia de oxidare. Soluţia este filtrată cu un filtru de 0,45 μm şi peptida este gata pentru purificare.

[0165] Exemplul 10: Activitatea funcţională in vitro a peptidelor agonist al amilinei

[0166] Receptorii AMY1 şi CT sunt GPCR care sunt cuplaţi funcţional la proteinele Gαs. Stimularea acestor receptori duce la o producţie crescută de cAMP intracelular, care poate fi detectată folosind tehnologii standard in vitro. Activitatea in vitro a peptidelor este măsurată prin cantitatea de cAMP formată în celulele supraexprimate AMY1R uman şi CTR.

[0167] Receptorii CT umani sunt exprimaţi stabil în celulele vezicii urinare umane (UM-UC-3 sau UMUC3) sub controlul unui vector de expresie pcDNA. Linia celulară UMUC3 este cultivată în MEM 1X (Meditech Inc., 17-305-CV) suplimentat cu 10 % FBS, 1 % soluţie antibiotică/antimicotică, 1 mM piruvat de sodiu, 1X MEM NEAA, 1X GlutaMAX-I. Plasmida umană CTa-pcDNA3. 1Hygro(+)(T2616) DNA este transfectată în celule UMUC3 folosind reactivul de transfectare LipofectAMINE 2000 (Invitrogen, 11668-019). După 20 de zile de selecţie, se măsoară nivelurile de ARNm de la diferite clone pentru a confirma expresia hCTR. Pentru a determina funcţia celulelor hCTR supraexprimate, nivelurile intracelulare de cAMP ca răspuns la calcitonina de somon sunt măsurate şi comparate cu expresia mRNA hCTR în fiecare clonă.

[0168] Liniile celulare stabile AMY1R uman sunt generate prin transfectarea suplimentară a RAMP1-pCMVpuroPB uman (T14213) în celule clonă hCTR UMUC3. După selecţie, nivelurile de ARNm RAMP1 uman de la diferite clone sunt măsurate pentru a confirma expresia AMY1R uman.

[0169] Celulele hAMY1R sunt cultivate în MEM 1X (Corning) suplimentat cu 10 % FBS, 1 % soluţie antibiotică/antimicotică, 1 mM piruvat de sodiu, 1X MEM NEAA, 1X GlutaMAX-1, 200 μg/ml higromicină B şi 0,4 μg/ml puromicină. Celulele hCTR sunt cultivate în acelaşi mediu lipsit de puromicină. Celulele cultivate sunt cultivate până la 70 % confluenţă şi apoi incubate peste noapte cu mediu proaspăt.

[0170] În ziua testului, 10 μl de soluţie tampon de analiză (MEM fără fenol roşu (Corning, nr. cat. 17-305-CV), 0,1 % cazeină, 0,5 mM IBMX, 5 mM HEPES, pH 7,4) sunt distribuiţi în fiecare godeu al plăcilor cu 384 de godeuri acoperite cu poli-D-lizină albă (nr. cat. Corning 354661). Se adaugă peptide diluate în DMSO (200 nL/godeu) într-o serie de diluţie 1:3 folosind dispozitivul acustic de manipulare a lichidului ECHO (Beckman). Celulele cultivate sunt detaşate cu TrypLE Express (Gibco), resuspendate în soluţie tampon de testare şi se distribuie în fiecare godeu 10 μl care conţine 1200 celule/godeu (hCTR) sau 1500 celule/godeu (hAMY1R). Plăcile au fost incubate la temperatura camerei timp de 1 oră.

[0171] Cantitatea de cAMP intracelular este cuantificată cu ajutorul tehnologiei HTRF (Omogenous Time Resolved Fluorescence; Cisbio) conform instrucţiunilor furnizorului. Pe scurt, 10 μl de conjugat cAMP-d2 şi 10 μl de conjugat anti-cAMP-cryptat în soluţie tampon de liză sunt incubate cu celulele tratate la temperatura camerei timp de 60 de minute. Semnalul HTRF este detectat imediat folosind un cititor de plăci Envision (Perkin-Elmer) pentru a calcula raportul de fluorescenţă la 665 la 620 nm. Datele brute sunt convertite în cantitate de AMPc (pmol/sondă) folosind o curbă standard cAMP generată pentru fiecare experiment. Valorile relative EC50 sunt calculate din intervalul de sus-jos al curbei concentraţie-răspuns definită utilizând 1 nM CT somon (Bachem) ca maxim şi soluţie tampon în mod individual ca minim cu un program de potrivire a curbei logistice cu patru parametri (Genedata Screener® v12.0.4). Compuşii din prezenta cerere prezintă activitate selectivă la receptorul de amilină faţă de receptorul de calcitonină, aşa cum se arată în Tabelul 1.

[0172] Tabelul 1. Compararea datelor de activitate funcţională la receptorii de amilină şi calcitonină

Număr compus

hAMY1R cAMP EC50 (pM, ±SE)

hCTR cAMP EC50 (pM, ±SE)

I

133 ± 12

18000 ± 1080

II

75 ± 12

2340 ± 272

III

156 ± 27

16300 ± 3030

IV

107 ± 16

6140 ± 764

V

139 ± 17

17000 ± 2440

VI

107 ± 15

13200 ± 2230

VII

173 ± 34

11900 ± 1530

VIII

107 ± 20

9690 ± 2010

IX

132 ± 20

18900 ± 3830

X

80 ± 13

14000 ± 3320

XI

38 ± 7.8

10500 ± 2200

XII

113 ± 34

25900 ± 7620

XIII

78 ± 14

9490 ± 1540

XV

43 ± 4.4

2400 ± 402

XVI

393 ± 51

103 ± 20

[0174] Exemplul 11: Afinitatea de legare a peptidelor agoniştilor de amilină la receptorii hAMY1 şi hCT in vitro

[0175] Membranele din celulele supraexprimate AMY1R şi CTR umane (descrise în Exemplul 10) au fost izolate printr-o metodă standard şi utilizate pentru testele de legare. Constantele de disociere la echilibru (Kd) pentru diferitele interacţiuni receptor/radioligand sunt determinate din analiza de legare a saturaţiei utilizând aceiaşi reactivi şi soluţii tampon ca acelea descrise mai jos pentru testarea compuşilor. Valorile Kd determinate pentru preparatele de receptori utilizate în acest studiu sunt după cum urmează: hAMY1R, 0,067 nM; receptor de calcitonină umană (hCTR), 0,046 nM.

[0176] Protocol de legare hAMY1R

[0177] Afinitatea de legare la receptor (Ki) a peptidelor agoniştilor rAMY, hCT şi agoniştilor hAMY este determinată printr-un test competitiv de filtrare a legării la radioligand. Soluţia tampon de analiză constă din (în mM) 50 HEPES, pH 7,1, 5 MgCl2, 5 KCl, 0,2 % (g/v) bacitracină, 0,003 % (g/v) saponină şi este utilizat pentru diluarea radioligandului şi a preparatului pe membrană. Reacţiile de legare se efectuează în 0,1 ml volum total de reacţie într-un bloc de testare cu polistiren 96 în godeuri adânci. Amilină de şobolan iodată (sinteză personalizată ViTrax; 2200 Ci/mmol; 125I-rAMY) este diluată iniţial la aproximativ 50 pM în soluţia tampon de testare. Compuşii de testare şi legarea nespecifică (NSB - definită ca 300 nM rAMY) sunt adăugate la alicote de tampon de radioactivitate. Pe scurt, compuşii de testare sunt diluaţi la concentraţia iniţială de 200 nM, diluaţi în serie în trepte de 4 ori în 125I-rAMY, apoi 0,05 ml de compus de testat diluat, NSB sau legare totală (definită ca 125I-rAMY pură) sunt transferate în blocul de testare a polistirenului cu 96 de godeuri. Reacţia de legare este iniţiată prin adăugarea a 0,05 ml de 200 μg/ml hAMY1R diluat în tampon de testare la radioactivitate. Blocurile de testare sunt turbionate uşor, sigilate cu parafilm şi incubate la RT timp de aproximativ 20 de ore. Cu treizeci de minute înainte ca incubarea să fie completă, straturile de filtrare (straturi de filtrare imprimate Perkin Elmer Cat # 1450-421) sunt înmuiate într-o soluţie constând din soluţia tampon de testare minus saponină, dar suplimentată cu 0,1 % (g/v) albumină serică bovină fără acid gras (FAF-BSA) şi 0,5 % (v/v) polietilenimină (PEI). La sfârşitul incubaţiei, ligandul legat este separat de liber prin adăugarea unui tampon de stingere la rece cu gheaţă constând din 100 mM NaCl, 50 mM TRIS-HCl pH 7,1 şi colectat imediat peste stratul de filtrare prin filtrare în vid cu o maşină de recoltat cu filtru TomTec cu 96 de godeuri, utilizând următorul protocol de filtrare (timp uscat, 7; ciclul 3 repetare, 0; timp de spălare, 1; timp de înmuiere, 1; primul timp de aspirare, 4; timp de spălare/aspirare, 7; al 2-lea aspirat, 4; presiunea aerului 2 PSI). Intervalul final de concentraţie al testului pentru peptidele testate în curbele de răspuns este 100 nM - 0,00038 nM.

[0178] Protocol de legare hCTR

[0179] Afinitatea de legare la receptor (Ki) a peptidelor agoniste rAMY, hCT şi hAMY pe membranele hCTR este determinată printr-un test competitiv de filtrare a legării la radioligand. Procedurile de testare sunt similare cu cele ale testului de legare hAMY1R, cu excepţia faptului că 125I-hCT (sinteza personalizată ViTrax; 2200 Ci/mmol) este folosit ca ligand fierbinte. Reacţiile de legare sunt efectuate în 0,2 ml volum total de reacţie cu 14 pM 125I-hCT şi 20 μg/ml membrană hCTR şi incubate timp de 20 de ore. Intervalul final de concentraţie al testului pentru peptidele testate în curbele de răspuns este 2500 nM - 0,00128 nM. Compuşii din prezenta cerere prezintă activitate selectivă la receptorul de amilină faţă de receptorul de calcitonină, aşa cum se arată în Tabelul 2.

[0180] Tabelul 2. Legarea in vitro (Ki) la receptorii umani de amilină şi calcitonină

Număr compus

hAMY1R, Ki (nM ± SE)

hCTR, Ki (nM ± SE)

II

0.017 ± 0,006

202 ± 45

IV

0,0296 ± 0,0099

665 ± 113

VI

0,0445 ± 0,0082

235 ± 45

VIII

0,0435 ± 0,0072

927 ± 120

XV

0,0196 ± 0,0020

0,256 ± 0,087

XVI

0,701 ± 0,148

0,104 ± 0,043

[0182] Exemplul 12: Efecte in vivo asupra aportului alimentar şi greutăţii corporale la şobolani normali

[0183] Şobolanii masculi Sprague Dawley din Envigo RMS (Indianapolis, IN) sunt menţinuţi pe o dietă chow (2014; Teklad Global, Envigo RMS, Indianapolis, IN) şi adăpostiţi individual într-o instalaţie cu temperatură controlată (72,0 °F; 22,2 °C) cu un ciclu de lumină inversat de 12:12 ore (lumini stinse la 10 AM) şi acces liber la alimente şi apă. La vârsta de 10 săptămâni, se înregistrează greutăţile corporale fără post şi greutăţile iniţiale ale alimentelor, iar animalelor li se administrează o singură injecţie subcutanată (SC) de vehicul sau peptidă acilată (1 ml/kg), urmată de măsurători zilnice ale greutăţii corporale şi ale aportului alimentar timp de 4 zile după doză. Zona de sub analiza curbei (AUC) este calculată atât pentru greutatea corporală, cât şi pentru aportul alimentar faţă de vehicul.

[0184] Tabelul 3: Modificări ale greutăţii corporale şi ale aportului alimentar timp de 4 zile la şobolani Sprague Dawley după administrarea unei singure doze de peptidă a agonistului amilinei cu acţiune îndelungată

Număr compus

Doză (nmol/kg, SC)

Δ Greutate corporală (%)*

Inhibarea cumulativă a aportului alimentar (%)**

II

0,1

1,8

-4,1

0,3

2,4

-3,7

1

0,5

-18,6

3

-3,3

-37,9

10

-7,4

-57,3

30

-10,1

-69,8

100

-12,9

-77,9

300

-14,9

-84,5

1000

-17,2

-87,1

IV

0,1

1,4

-1,1

0,3

1,8

-2,0

1

0,8

-5,6

3

-2,0

-20,5

10

-5,2

-46,8

30

-9,2

-59,2

100

-11,9

-68,1

VI

300

-14,2

-79,2

1000

-16,4

-82,9

0,1

2,2

2,3

0,3

1,2

-0,4

1

1,2

-0,4

3

-0,9

-23,8

10

-3,6

-36,4

30

-8,3

-58,9

100

-12,7

-73,4

300

-14,1

-76,9

1000

-16,2

-84,6

VIII

0,1

2,0

1,3

0,3

1,6

3,2

1

-1,0

-17,5

3

-3,9

-37,7

10

-7,2

-58,5

30

-10,8

-67,0

100

-13,8

-75,2

300

-13,6

-74,9

1000

-18,9

-84,7

* Modificarea greutăţii corporale medii la 96 de ore după doză, comparativ cu greutatea iniţială a animalelor naive. ** Aportul alimentar cumulat al animalelor tratate cu peptide la 96 de ore după doză faţă de animalele tratate cu vehicul la 96 de ore după doză.

[0186] Exemplul 13: Efectele in vivo indus de dietă asupra aportului alimentar şi greutăţii corporale la şobolanii obezi

[0187] Şobolanii masculi Long Evan din Envigo RMS (Indianapolis, IN) la vârsta de 14 săptămâni sunt supuşi unei diete bogate în grăsimi (40 % din kcal din grăsimi, TD.95217; Envigo RMS, Indianapolis, IN) până la vârsta de 35-45 de săptămâni. Animalele sunt adăpostite individual într-o instalaţie cu temperatură controlată (75,0 °F; 23,9 °C) cu un ciclu invers de lumină/întuneric de 12 ore (luminile se sting la ora 10 AM) şi acces liber la alimente şi apă. Greutăţile corporale sunt înregistrate şi compoziţia corporală (masa grasă) este determinată utilizând Analiza cantitativă prin rezonanţă magnetică nucleară (RMN ECHO, 3-1 Composition Analyzer; Echo Medical Systems, Houston, TX), urmată de randomizare în grupuri experimentale (n=5). Şobolanilor li se administrează injecţii subcutanate de vehicul sau peptidă (1 ml/kg) la fiecare trei zile (zilele 1, 4, 7, 10 şi 13). Greutăţile corporale zilnice sunt înregistrate şi modificările la sfârşitul tratamentului (ziua 14) sunt calculate ca procente în raport cu greutăţile anterioare tratamentului (ziua 1). Compoziţia corporală este determinată în ziua 14, iar modificările masei de grăsime şi ale masei fără grăsimi (greutatea corporală - masa grasă) sunt calculate din valorile pre-tratament ca modificări în grame.

[0188] Tabelul 4: Modificări ale greutăţii corporale induse de dietă într-un studiu de 2 săptămâni la şobolani obezi cu peptide agoniste de amilină

Număr compus

Doză (nmol/kg, SC)

Δ Greutate corporală (%)*

Δ Masa de grăsime (g)*

Δ Masa fără grăsimi (g)*

II

1

-7,1

-43,8

-7,5

10

-9,0

-59,6

-5,6

100

-10,7

-61,0

-15,4

IV

1

-4,5

-31,0

-0,2

10

-8,5

-53,5

-6,4

100

-8,9

-52,9

-8,6

VI

1

-3,2

-25,5

1,9

10

-8,8

-51,9

-9,1

100

-9,8

-54,7

-15,2

VIII

1

-6,0

-36,6

-4,7

10

-9,0

-54,3

-7,2

100

-11,5

-56,4

-26,9

* Modificarea greutăţii corporale medii sau a masei de grăsime sau a masei fără grăsime la 2 săptămâni, comparativ cu greutatea iniţială a animalelor naive.

[0190] Exemplul 14: Farmacocinetica la şobolanii masculi Sprague Dawley

[0191] Farmacocinetica Compusului II (NR. ID. SECV.:2), Compusului IV (NR. ID. SECV.:4), Compusului VI (NR. ID. SECV.:6) şi Compusului VIII (NR. ID. SECV.:8) este evaluată după o singură administrare subcutanată a 30 nmol/kg la şobolani Sprague Dawley masculi. Probele de sânge sunt colectate la 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96 de ore după doza SC. Concentraţiile plasmatice individuale rezultate sunt utilizate pentru a calcula parametrii farmacocinetici. Concentraţiile de plasmă peptidică (K3EDTA) sunt determinate folosind o metodă calificată LC/MS care măsoară masa intactă a peptidelor. Fiecare peptidă şi un analog ca standard intern sunt extrase din plasmă. Pentru detectarea LC/MS se utilizează un Thermo Q-Exactive de înaltă rezoluţie. Parametrii farmacocinetici medii sunt prezentaţi în Tabelul 5.

[0192] Tabelul 5. Parametrii farmacocinetici medii ai peptidelor după o singură administrare subcutanată de 30 nmol/kg la şobolani Sprague Dawley masculi.

Număr compus

T1/2 (ore)

Tmax (ore)

Cmax/D (kg*nmol/L/nmol)

AUCINF/D (hr*kg*nmol/L/nmol)

Cl/F (ml/oră/kg)

II

52,8±6,6

24,0±0,0

4,9±0,9

473±63,8

2,1±0,3

IV

66,9±27,6

20,0±6,9

5,5±2,1

551±27,1

1,8±0,1

VI

54,0±8,4

24,0±0,0

5,4±0,5

506±26,6

2,0±0,1

VIII

36,4±2,93

16,0±6,9

3,8±0,4

270±22,4

3,7±0,3

Abrevieri: T1/2 = timp de înjumătăţire, Tmax = timp până la concentraţia maximă, Cmax/D = concentraţia plasmatică maximă împărţită la doză, AUCINF/D = AUCinf împărţit la doză, CL/F = clearance/biodisponibilitate. Note: Datele sunt media, unde n=3/grup.

[0194] Exemplul 15: Farmacocinetica la masculii maimuţelor Cynomolgus

[0195] Farmacocinetica compusului II (NR. ID. SECV.:2), a compusului IV (NR. ID. SECV.:4), a compusului VI (NR. ID. SECV.:6) şi a compusului VIII (NR. ID. SECV.:8) este evaluată după o singură administrare subcutanată a 20 nmol/kg la masculii maimuţelor Cynomolgus. Probele de sânge sunt colectate la 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 120, 168, 240, 336, 408, 504 ore după doza SC. Concentraţiile plasmatice individuale rezultate sunt utilizate pentru a calcula parametrii farmacocinetici. Concentraţiile de plasmă peptidică (K3EDTA) sunt determinate folosind o metodă calificată LC/MS care măsoară masa intactă a peptidelor. Fiecare peptidă şi un analog ca standard intern sunt extrase din plasmă. Pentru detectarea LC/MS se utilizează un Thermo Q-Exactive de înaltă rezoluţie. Parametrii farmacocinetici medii sunt prezentaţi în Tabelul 6.

[0196] Tabelul 6. Parametrii farmacocinetici medii ai peptidelor după o singură administrare subcutanată de 20 nmol/kg la maimuţele Cynomolgus.

Număr compus

T1/2 (ore)

Tmax (ore)

Cmax/D (kg*nmol/L/nmol)

AUCINF/D (hr*kg*nmol/L/nmol)

Cl/F (ml/oră/kg)

II

159±7,7

54,0±13,9

6,7±1,0

1752±313

0,58±0,1

IV

177±13,5

48,0±24,0

6,2±1,0

1607±104

0,62±0,04

VI

85,0±5,8

40,0±13,9

4,9±0,7

794±27

1,26±0,04

VIII

62,0±4,7

28,0±18,3

7,2±0,3

942±67

1,07±0,1

Abrevieri: T1/2 = timp de înjumătăţire, Tmax = timpul până la concentraţia maximă, Cmax/D = concentraţia plasmatică maximă împărţită la doză, AUCINF/D = AUCinf împărţit la doză, CL/F = clearance/biodisponibilitate. Note: Datele sunt media, unde n=3/grup.

[0198] Exemplul 16: Evaluarea riscului de imunogenitate

[0199] Testul de internalizare a celulelor dendritice (DC)

[0200] Acest test evaluează capacitatea DC umane de a internaliza anticorpii testaţi. Celulele CD14+ sunt cultivate şi diferenţiate în DC imature cu IL-4 şi GM-CSF. Anticorpii testaţi, controlul izotipului sau un control pozitiv sunt preincubaţi cu agentul de detecţie (Fab-QSY7-TAMRA) într-un raport 1:1 pentru a forma un complex şi apoi adăugaţi la culturi. Celulele sunt incubate timp de o zi. După internalizare şi scindare, un semnal TAMRA pozitiv este detectat prin citometrie în flux şi se calculează un indice de internalizare normalizat utilizând controlul izotipului IgG1-EN şi anticorpul anti-CXCR.

[0201] Testul MAPPS (proteomică peptidică asociată MHC)

[0202] MAPPS profilează MHC-II a prezentat peptide pe celule dendritice umane tratate cu molecule testate. Celulele CD14+, izolate din PBMC ale donatorilor umani normali, sunt cultivate şi diferenţiate în DC imature prin incubare cu IL-4 şi GM-CSF. În ziua 4, mediile de cultură sunt înlocuite cu medii proaspete care conţin molecule testate. În ziua 5, se adaugă LPS pentru a transforma celulele în DC mature. În ziua 6, celulele sunt lizate în tampon RIPA cu inhibitori de protează. Imunoprecipitarea complexelor MHC-II se realizează utilizând anticorp anti-MHC-II biotinilat cuplat la bile de streptavidină. Complexul legat este eluat şi filtrat. Peptidele MHC-II izolate sunt analizate printr-un spectrometru de masă. Identificările peptidice sunt generate de o conductă internă de proteomică utilizând algoritmi de căutare fără enzimă şi o bază de date bovină/umană cu secvenţe de testare anexate la baza de date. Un flux de lucru KNIME este utilizat pentru a procesa fişierele de identificare din probe. Peptidele identificate din articolele testate sunt aliniate cu secvenţa părinte a moleculei de testare. Rezultatul este utilizat pentru a determina procentul de donatori care prezintă peptide MHC-II din regiunile moleculei testate. Compusul II, Compusul IV, Compusul VI, Compusul VIII, un compus reprezentativ pentru US 9,023789 (denumit în continuare „Compusul '789») şi pramlintida sunt testate în testul MAPP. Compusul II, Compusul IV, Compusul VI, Compusul VIII nu prezintă peptide prezentate pe complexele MHC-II în test. Compusul '789 afişează un cluster peptidic care se întinde pe reziduurile 8-23 pe complexele MHC-II. Pramlintida prezintă două clustere peptidice care în total acoperă reziduurile 1-34 care sunt afişate pe complexele MHC-II.

[0203] Analiza TCEM in silico (motiv expus celulelor T)

[0204] Această analiză evaluează probabilitatea ca anumite clustere peptidice, identificate prin MAPPS, să activeze celulele T CD4+. Secvenţele peptidice identificate MAPPS care conţin reziduuri non-germinale sunt introduse într-o pagină de predicţie a legării MHCII pentru analiza bazei de date a imunoepitopilor (IEDB). Este selectată metoda de predicţie recomandată de IEDB. Predicţia consideră că cele mai frecvente 27 de alele HLA-DR, -DP şi -DQ acoperă o fracţiune semnificativă a populaţiei umane. Fiecare secvenţă de intrare, cu o lungime egală sau mai mare de 15 reziduuri, este împărţită în suprapunere de 15 metri offset 1 aminoacid pentru a acoperi întreaga secvenţă. Pentru fiecare peptidă, se generează un rang procentual prin compararea scorului peptidei cu scorurile a cinci milioane de 15 mers aleatoriu selectaţi din baza de date SWISSPROT. Aminoacizii localizaţi în poziţiile putative P-1, P2, P3, P5, P7 şi P8 ale registrului generează TCEM, iar riscul este definit pe baza prezenţei reziduurilor non-germinale în aceste poziţii. Reziduurile non-germinale şi probabilitatea legării miezului la alele multiple sunt raportate într-o redare grafică şi luate în considerare pentru evaluarea riscului de imunogenitate.

[0205] Legarea serică a MS

[0206] Acest test evaluează legarea în afara ţintei a unui candidat de test la proteinele serice umane. Anticorpii testaţi sunt acoperiţi pe o microplacă Immulon 4 HBX. După blocare, se adaugă ser uman şi se incubează peste noapte. Placa este spălată şi proteinele legate sunt eluate, reduse, alchilate şi digerate. Peptidele sunt analizate printr-un spectrometru de masă. Identificările peptidice sunt generate de o cale internă de proteomică utilizând algoritmi de căutare cu specificitatea enzimei triptice şi o bază de date umană cu secvenţele moleculelor de testare anexate. Ionii sunt cuantificaţi cu instrumente interne de proteomică (Chrom-Alignment, Metaconsense şi Quant) şi analizaţi în JMP folosind analiza Oneway/Each Pair, platforma de testare Student's t. Analiza log2auc pentru ioni folosind JMP: Potrivire Y cu X pentru fiecare ion/Comparare mijloace/Toate perechile, Tukey HSD.

[0207] Testul de proliferare a celulelor T

[0208] Acest test evaluează capacitatea anticorpilor testaţi sau a peptidelor MAPPS testate de a activa celulele T CD4 + prin inducerea proliferării celulare. PBMC epuizate ale celulelor T CD8+ sunt preparate şi etichetate cu CFSE. Fiecare probă este testată cu proba de control a mediului, hemocianină din Megathura Cheii (KLH; Proba de control de referinţă clinică pozitivă), anticorpi testaţi sau peptide MAPPS testate. Culturile sunt incubate timp de 7 zile. În ziua 7, probele sunt analizate prin citometrie de flux.

[0209] Reactivitate preexistentă (ACE AssayFormat)

[0210] Acest test evaluează prezenţa anticorpilor preexistenţi (ADA) împotriva moleculelor testate în serul uman normal (NHS) naiv la tratament. NHS diluat este incubat peste noapte pe o placă de streptavidină Pierce acoperită cu molecule testate biotinilate. În ziua următoare, proteinele de legare capturate sunt eluate cu acid, acoperite dur pe o placă mezoscalară (MSD) şi detectate cu o combinaţie de moleculă marcată cu biotină şi streptavidină marcată cu ruteniu. Dacă sunt prezenţi anticorpi anti-medicament, aceştia vor lega medicamentul marcat, iar semnalul rezultat este denumit semnal de nivel 1 (exprimat ca electrochemiluminescenţă). Acest semnal este confirmat la nivelul 2 prin adăugarea excesului de moleculă testată nemarcată în etapa de detecţie, ceea ce duce la suprimarea semnalului de nivel 1. Prezenţa anticorpilor anti-medicament preexistenţi este exprimată ca magnitudinea celei de-a 90-a percentile a inhibării de nivel 2. Ceade-a 90-a percentilă a inhibării de nivel 2 este un instrument statistic pentru a evalua amploarea specificităţii reactivităţii de nivel 1. Această a 90-a percentilă este utilizată pentru a clasifica moleculele în funcţie de riscul ADA.

[0211] Tabelul 7. Rezumatul evaluării riscului de imunogenitate

Test

Pramlintidă

Compusul '789

Compusul II

Compusul IV

Compusul VI

Compusul VIII

Test MAPPS 10 donatori cu diverse MHC

10/10 donatori cu risc ridicat au prezentat peptide

5/10 donatori cu risc ridicat au prezentat peptide

Risc scăzut, fără peptide prezentate

Risc scăzut, fără peptide prezentate

Risc scăzut, fără peptide prezentate

Risc scăzut, fără peptide prezentate

Testul de proliferare a celulelor T: proteine

Risc ridicat (7/7 donatori pozitivi)

Risc scăzut (1/7

Risc scăzut (0/9

Risc scăzut (0/9

Risc scăzut

Risc scăzut

7-10 donatori cu diverse MHC

donatori pozitivi)

donatori pozitivi)

donatori pozitivi)

(1/9 donatori pozitivi)

(1/9 donatori pozitivi)

Reactivitate preexistentă Inhibarea T2 a celei de-a 90-a percentile > 50 donatori

N/A

58,0 %

48,8 %

33,2 %

43,9 %

51,4 %

Abrevieri: ACE = eluare prin captare acidă; ADA = anticorpi antidrog; CDR = regiunea determinantă de complementaritate; DC = celulă dendritică; H1 = VH CDR1; H2 = VH CDR2; H3 = VH CDR3; L1 = VL CDR1; L2 = VL CDR2; MAPP = proteomica peptidică asociată MHC; MHC = complex major de histocompatibilitate; MS = spectrometrie de masă T2 = Nivelul 2; TCEM = motiv expus celulelor T; VH = greu variabil; VL = lumină variabilă; VHFR3 = cadru greu variabil 3

[0213] Exemplul 17: Eficacitatea in vivo la şobolanii obezi cu inducere prin dietă (DIO) a Compusului II în combinaţie cu alţi compuşi incretinici

[0214] Acest studiu este realizat pentru a investiga efectul Compusului II asupra afecţiunilor de diabet şi/sau obezitate la şobolanii DIO atunci când este administrat în combinaţie cu alţi compuşi de incretină, inclusiv un agonist GLP-1 (compusul XVII), analogul oxintomodulinei (compusul XVIII) şi un triagonist al glucagonului, GLP-1 şi GIP (compusul XIX). Şobolani masculi cu obezitate indusă prin dietă (DIO), Long Evans (Envigo), menţinuţi pe o dietă bogată în calorii de la sosirea la Lilly (TD95217; Teklad, Madison, WI), sunt utilizaţi în următoarele studii. Animalele sunt adăpostite individual într-o instalaţie cu temperatură controlată (24 °C), cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore (lumini aprinse la ora 22:00) şi acces liber la alimente (TD95217) şi apă.

[0215] Şobolanii sunt randomizaţi în funcţie de greutatea corporală, astfel încât fiecare grup experimental de animale să aibă o greutate corporală similară. Greutăţile corporale variază între 529 şi 823 grame.

[0216] Fiecare grup conţine cinci şobolani. Vehiculul şi Compusul II (1 nmol/kg) sunt dizolvate în vehicul (20 mM Tris-HCl pH8 + 0,02 % PS80) şi sunt administrate prin injecţie subcutanată (SC) (1 ml/kg) şobolanilor DIO hrăniţi ad libitum cu de la 30 la 90 de minute înainte de începutul ciclului de întuneric, la fiecare 3 zile timp de 14 zile. Injecţiile SC se fac în zilele 1, 4, 7, 10 şi 13. Greutatea corporală şi aportul alimentar sunt măsurate zilnic pe tot parcursul studiului. Modificările absolute ale greutăţii corporale sunt calculate prin scăderea greutăţii corporale a aceluiaşi animal înainte de prima injecţie de moleculă.

[0217] La sfârşitul studiului, sângele este colectat pentru a măsura glicemia şi insulina plasmatică. Glicemia este măsurată cu glucometre AccuChek (Roche, Indianapolis, IN). Insulina este măsurată prin ELISA (MSD, Rockville, MD).

[0218] Toate datele sunt prezentate ca medie ± SEM de 5 animale pe grup. Analiza statistică este efectuată utilizând ANOVA unidirecţional, urmată de testul de comparaţie multiplă Tukey pentru a compara grupurile de tratament cu grupul de vehicule sau între ele. Diferenţe semnificative sunt identificate la p<0,05.

[0219] Tabelul 8: Efectul compusului II cu şi fără combinaţii cu compusul XVII, compusul XVIII sau compusul XIX asupra greutăţii corporale şi a ingestiei cumulative de alimente.

Tratament*

Modificarea greutăţii corporale (g)*

Aportul alimentar cumulat (g)***

Vehicul (10 ml/kg)

-3,42±6,10

212,08±16,84

Compusul II (1 nmol/kg)

-35,90±3,95*

149,94±10,88*

Compusul XVII (10 nmol/kg)

-54,20±6,52*

150,04±5,71*

Compusul XVIII (10 nmol/kg)

-50,24±6,36*

165,86±7,45*

Compus XIX (3 nmol/kg)

-43,28±2,54*

157,50±10,63*

Compusul II + compusul XVII

-80,68±6,44*+

98,60±16,46*

Compusul II + compusul XVIII

-59,96±6,87*#

137,78±14,66*

Compusul II + Compusul XIX

-63,22±10,11*#

118,84±11,99*

*Tratamentele au fost administrate subcutanat la fiecare trei zile în Ziua 1, 4, 7, 10 şi 13. **Măsurătorile greutăţii corporale au fost efectuate zilnic. Modificarea greutăţii corporale este diferenţa de la Ziua 1 la Ziua 14 reprezentată în grame. Aportul alimentar cumulat a fost totalul alimentelor consumate pe parcursul perioadei de tratament de 14 zile. Analiza statistică a fost făcută prin ANOVA unidirecţional, urmat de Tukey. *p<0,05 comparativ cu grupul de vehicule; #p<0,05 în comparaţie cu oricare dintre Compusul XVII, Compusul XVIII sau Compusul XIX; +p<0,05 comparativ cu Compusul II.

[0221] Există o pierdere în greutate mai mare pentru combinaţia compusului II cu compusul XVII, compusul XVIII sau compusul XIX decât cu compusul II singur.

[0222] NR. ID. SECV.:1: Compusul I

[0223] γE-CNTATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeN-FGPKLPPTEVGSNTY-NH2 în care există o punte tioacetalică între cisteine în poziţiile 2 şi 7

[0224] NR. ID. SECV.:2: Compusul II

[0225] γE-CNTATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeN-FGPKLPPTEVGSNTY-NH2

[0226] în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7

[0227] în care lizina în poziţia 26 este ataşată la o fracţiune de linker de acid gras conform formulei (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H

[0228] NR. ID. SECV.:3: Compusul III

[0229] γE-CNTATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeD-FGPKLPPTEVGSNTY-NH2 în care există o punte tioacetalică între cisteine în poziţiile 2 şi 7

[0230] NR. ID. SECV.:4: Compusul IV

[0231] γE-CNTATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeD-FGPKLPPTEVGSNTY-NH2

[0232] în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7

[0233] în care lizina în poziţia 26 este ataşată la o fracţiune de linker de acid gras conform formulei (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H

[0234] NR. ID. SECV.:5: Compusul V

[0235] KCETATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeD-FGPILPPTEVGSNTY-NH2 unde există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7

[0236] NR. ID. SECV.:6 Compusul VI

[0237] KCETATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeD-FGPILPPTEVGSNTY-NH2

[0238] în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7

[0239] în care lizina în poziţia 1 este ataşată la o fracţiune de linker de acid gras conform formulei (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H

[0240] NR. ID. SECV.:7 Compusul VII

[0241] KCETATCATG-Orn-αMeL-AEFLVRSSHNFGPILPPTEVGSNTY-NH2 în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7

[0242] NR. ID. SECV.:8 Compusul VIII

[0243] KCETATCATG-Orn-αMeL-AEFLVRSSHNFGPILPPTEVGSNTY-NH2

[0244] în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7

[0245] în care lizina în poziţia 1 este ataşată la o fracţiune de linker de acid gras conform formulei (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H

[0246] NR. ID. SECV.: 9 Compusul IX

[0247] γE-CNTATCATGKLAEFLVRSSNNFGPKLPPTEVGSNTY-NH2

[0248] în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7

[0249] în care lizina în poziţia 26 este ataşată la o fracţiune de linker de acid gras conform formulei AEEA2-γE-CO-(CH2)18-CO2H

[0250] NR. ID. SECV.: 10 Compusul X

[0251] γE-CNTATCATGKLAEFLVRSSNNFGPKLPPTEVGSNTY-NH2

[0252] în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7

[0253] în care lizina în poziţia 26 este ataşată la o fracţiune de linker de acid gras conform formulei γE- AEEA2-CO-(CH2)18-CO2H

[0254] NR. ID. SECV.: 11 Compusul XI

γE-CNTATCATGKLAEFLVRSSNNFGPKLPPTEVGSNTY-NH2

[0256] în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7

[0257] în care lizina în poziţia 26 este ataşată la o fracţiune de linker de acid gras conform formulei (γE)2-AEEA-CO-(CH2)18-CO2H

[0258] NR. ID. SECV.: 12 Compusul XII

[0259] γE-CNTATCATQ-Orn-LAEFLVRSSNNFGPKLPPTEVGSNTY-NH2

[0260] în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7

[0261] în care lizina în poziţia 26 este ataşată la o fracţiune de linker de acid gras conform formulei AEEA2-γE-CO-(CH2)18-CO2H

[0262] NR. ID. SECV.: 13 Compusul XIII

[0263] γE-CGTATCATG-Orn-LAEFLVRSSNNFGPKLPPTEVGSNTY-NH2

[0264] în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţiile 2 şi 7

[0265] în care lizina în poziţia 26 este ataşată la o fracţiune de linker de acid gras conform formulei γE2-CO-(CH2)18-CO2H

[0266] NR. ID. SECV.: 14 Compusul XIV

[0267] Xaa1-C-Xaa3-TATCAT- Xaa10- Xaa11-Xaa12-AE-Xaa15-LVRSS-Xaa21-Xaa22-

[0268] FGP-Xaa26-LPPTEVGSNTY-NH2.

[0269] în care

[0270] Xaa1 este K sau γE

[0271] Xaa3 este E, N sau G

[0272] Xaa10 este G sau Q;

[0273] Xaa11 este Orn sau K;

[0274] Xaa12 este L sau αMeL

[0275] Xaa15 este αMeF sau F

[0276] Xaa21 este N sau H

[0277] Xaa22 este NMeD, NMeN sau N

[0278] Xaa26 este I sau K

[0279] NR. ID. SECV.: 15 Compusul XV; Pramlintidă

[0280] KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2

[0281] în care există o punte de disulfură între cisteinele din poziţiile 2 şi 7

[0282] NR. ID. SECV.: 16 Compuşi XVI; hCT

[0283] CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP-NH2

[0284] în care există o punte de disulfură între cisteinele din poziţiile 1 şi 7

[0285] NR. ID. SECV.:17 hAMY

[0286] KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY-NH2

[0287] în care există o punte de disulfură între cisteinele din poziţiile 2 şi 7

[0288] NR. ID. SECV.:18 Compusul XVII

[0289] H-Aib-EGTFTSDVSSYLEGQAAK((2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-acetil)2-(γGlu)- CO-(CH2)16-CO2H)EFIAWLVRGRG

[0290] NR. ID. SECV.:19 Compusul XVIII

[0291] H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKKAK((2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-acetil)2-(γGlu)- CO-(CH2) 18-CO2H)EF VEWLLEGGPSSG-NH2

[0292] NR. ID. SECV.:20 Compusul XIX

[0293] Y-Aib-QGTFTSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-acetil)-(γGlu)- CO-(CH2)18-CO2H)AQ-Aib-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2

[0294] NR. ID. SECV.:21

[0295] YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS

[0296] în care X1 este Aib; X2 este Aib; K din poziţia 20 este modificat chimic prin conjugare cu gruparea epsilon-amino a catenei laterale K cu (2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-acetil)2-(γGlu)1-CO-(CH2)18-CO2H; iar aminoacidul C-terminal este amidat ca o amidă primară cu terminaţie C.

[0297] NR. ID. SECV.:22 Coloana vertebrală a Compusului I

[0298] γE-CNTATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeN-FGPKLPPTEVGSNTY-NH2

[0299] NR. ID. SECV.:23 Schelet al Compusului III

[0300] γE-CNTATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeD-FGPKLPPTEVGSNTY-NH2

[0301] NR. ID. SECV.:24 Coloana principală a compusului V

[0302] KCETATCATG-Orn-LAE-αMeF-LVRSSN-NMeD-FGPILPPTEVGSNTY-NH2

[0303] NR. ID. SECV.:25 Componenta principală a Compusului VII

[0304] KCETATCATG-Orn-αMeL-AEFLVRSSHNFGPILPPTEVGSNTY-NH2

Claims (20)

1. Un compus care conţine:

Xaa1-C-Xaa3--TATCAT- Xaa10- Xaa11-Xaa12-AE-Xaa15-LVRSS-Xaa21-Xaa22-FGP-Xaa26--LPPTEVGSNTY (NR. ID. SECV.: 14),

în care

Xaa1 este K sau γE;

Xaa3 este E, N sau G;

Xaa10 este G sau Q;

Xaa11 este Orn sau K;

Xaa12 este L sau αMeL;

Xaa15 este αMeF sau F;

Xaa21 este N sau H;

Xaa22 este NMeD, NMeN sau N; şi Xaa26 este I sau K,

sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic.

2. Compusul din revendicarea 1, în care

Xaa1 este γE;

Xaa3 este N;

Xaa10 este G;

Xaa11 este Orn;

Xaa12 este L;

Xaa15 este αMeF;

Xaa21 este N;

Xaa22 este NMeN; şi

Xaa26 este K (SEQ ID NO:22),

sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic.

3. Compusul din revendicarea 1, în care

Xaa1 este γE;

Xaa3 este N;

Xaa10 este G;

Xaa11 este Orn;

Xaa12 este L;

Xaa15 este αMeF;

Xaa21 este N;

Xaa22 este NMeD; şi

Xaa26 este K (SEQ ID NO:23),

sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic.

4. Compusul din revendicarea 2 sau 3, în care lizina la Xaa26 este ataşată la o fracţiune de linker a unui acid gras în conformitate cu formula: (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H.

5. Compusul din revendicarea 1, în care

Xaa1 este K;

Xaa3 este E;

Xaa10 este G;

Xaa11 este Orn;

Xaa12 este L;

Xaa15 este αMeF;

Xaa21 este N;

Xaa22 este NMeD; şi

Xaa26 este I (SEQ ID NO:24),

sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic.

6. Compusul din revendicarea 1, în care

Xaa1 este K;

Xaa3 este E;

Xaa10 este G;

Xaa11 este Orn;

Xaa12 este αMeL;

Xaa15 este F;

Xaa21 este H;

Xaa22 este N; şi

Xaa26 este I (SEQ ID NO:25),

sau o sare a acestora acceptabilă din punct de vedere farmaceutic.

7. Compusul din revendicarea 5 sau 6, în care lizina la Xaa1 este ataşată la o fracţiune de linker a unui acid gras în conformitate cu formula: (γE)2-CO-(CH2)18-CO2H.

8. Compusul din oricare dintre revendicările anterioare, în care există o punte tioacetalică între cisteinele din poziţia 2 şi 7.

9. Compusul din revendicarea 1, în care compusul este selectat din grupul format din NR. ID. SECV.:1, NR. ID. SECV.:2, NR. ID. SECV.:3, NR. ID. SECV.:4, NR. ID. SECV.:5, NR. ID. SECV.:6, NR. ID. SECV.:7, NR. ID. SECV.:8, NR. ID. SECV.:9, NR. ID. SECV.:10, NR. ID. SECV.:11, NR. ID. SECV.:12 şi NR. ID. SECV.:13 sau o sare farmaceutică a acestora.

10. Un compus care constă din NR. ID. SECV.:2 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic.

11. Un compus care constă din NR. ID. SECV.:4 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic.

12. Un compus care constă din NR. ID. SECV.:6 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic.

13. Un compus care constă din NR. ID. SECV.:8 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic.

14. Un compus care cuprinde NR. ID. SECV.:2, sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic.

15. Un compus care cuprinde NR. ID. SECV.:4 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic.

16. Un compus care cuprinde NR. ID. SECV.:6, sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic.

17. Un compus care cuprinde NR. ID. SECV.:8 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic.

18. O compoziţie farmaceutică ce cuprinde un compus în conformitate cu oricare dintre revendicările de la 1 la 17 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic şi unul sau mai mulţi purtători, diluanţi sau excipienţi acceptabili din punct de vedere farmaceutic.

19. Compusul din oricare dintre revendicările de la 1 la 17 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, pentru utilizare în terapie.

20. Compusul din oricare dintre revendicările de la 1 la 17, sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, pentru utilizare în tratarea unei afecţiuni selectate din grupul care constă din diabet zaharat de tip 2, obezitate, dislipidemie şi NASH.