MD4121007T2 - Formulări de anticorp anti-protofibrilă peptidă beta amiloidă cu concentrație ridicată și metode de utilizare a acestora - Google Patents

Abstract

Sunt furnizate în prezenta invenţie formulări farmaceutice apoase care cuprind concentraţii mari dintr-un anticorp izolat anti-protofibrilă Aß sau un fragment al acestuia care se leagă de protofibrilele Aß umane, cum ar fi BAN2401, arginină, polisorbat 80 şi un tampon acceptabil farmaceutic.

Description

Prezenta cerere revendică beneficiul priorităţii pentru cererea provizorie de brevet U.S. nr. 62/992.746 depusă la 20 martie 2020 şi cererea provizorie de brevet american nr. 63/027.263 depusă la 19 mai 2020.

Boala Alzheimer (AD) este o afecţiune neurodegenerativă progresivă, de etiologie necunoscută şi cea mai frecventă formă de demenţă în rândul persoanelor în vârstă. În 2006, au existat 26,6 milioane de cazuri de AD în lume (interval: 11,4-59,4 milioane) (Brookmeyer, R., ş.a., Forecasting the global burden of Alzheimer's Disease. Alzheimer Dement. 2007; 3:186-91), în timp ce în Statele Unite s-a raportat că peste 5 milioane de persoane trăiesc cu AD (2010 Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimer Dement. 2010;6:158-94). Până în anul 2050, se preconizează că prevalenţa AD la nivel mondial va creşte la 106,8 milioane (interval: 47,2 - 221,2 milioane), în timp ce numai în Statele Unite prevalenţa este estimată la 11 până la 16 milioane. (Brookmeyer, supra, şi 2010 Alzheimer's disease facts and figures, supra).

Boala implică, în general, un declin global al funcţiei cognitive care progresează lent şi lasă subiecţii aflaţi în stadiu terminal imobilizaţi la pat. Subiecţii cu AD supravieţuiesc de obicei doar 3 până la 10 ani de la debutul simptomelor, deşi sunt cunoscute extreme de 2 şi 20 de ani. (Hebert, L.E., ş.a., Alzheimer disease in the U.S. population: prevalence estimates using the 2000 census. Arch Neurol. 2003; 60:1119-1122.) AD este a şaptea cauză principală a tuturor deceselor din Statele Unite şi a cincea cauză principală de deces la americanii cu vârsta peste 65 de ani, în ciuda faptului că mortalitatea cauzată de AD este mult subestimată, deoarece certificatele de deces rareori atribuie cauza decesului AD. (2010 Alzheimer's disease facts and figures, supra.)

Histologic, boala este caracterizată prin plăci neuritice, găsite în principal în cortexul asociativ, sistemul limbic şi ganglionii bazali. Constituentul principal al acestor plăci este peptida beta amiloidă (Aβ). Aβ există în diverse stări conformaţionale - monomeri, oligomeri, protofibrile şi fibrile insolubile. Detaliile relaţiei mecanicistice dintre debutul bolii Alzheimer şi producerea de Aβ sunt necunoscute. Cu toate acestea, unii anticorpi anti-Aβ sunt în prezent în curs de studiu clinic ca potenţiali agenţi terapeutici pentru boala Alzheimer.

Anticorpii anti-Aβ şi alte proteine pot fi administraţi subiecţilor pe cale intravenoasă, subcutanată, intramusculară şi prin alte mijloace. Dozajul şi/sau forma farmaceutică a unui anticorp pot prezenta numeroase provocări în dezvoltarea unei formulări farmaceutice adecvate. De exemplu, la concentraţii mari de anticorpi, stabilitatea anticorpului poate fi problematică din cauza formării de agregate proteină-proteină, sau a fragmentării. În general, agregarea creşte odată cu creşterea concentraţiilor de anticorpi. Mai mult, formulările de anticorpi cu concentraţie mare necesită concentraţii mari de stabilizatori şi alţi excipienţi pentru a obţine stabilitatea proteinelor pe termen lung şi durata de valabilitate. Formulările de anticorpi cu concentraţie mare sunt, de asemenea, adesea vâscoase, ceea ce poate complica fabricarea şi administrarea formulării farmaceutice.

Sunt prezentate aici formulări farmaceutice care cuprind 80-300 mg/ml dintr-un anticorp anti-protofibrilă Aβ izolat, sau un fragment al acestuia care se leagă de protofibrila Aβ, în care anticorpul este BAN2401 (cunoscut, de asemenea ca lecanemab). Formulările farmaceutice prezentate aici s-au dovedit a fi avantajoase. De exemplu, în ciuda concentraţiilor mari de anticorp anti-protofibrilă Aβ (de ex., 100 mg/ml sau 200 mg/ml), rata de agregare proteină-proteină este neaşteptat de scăzută şi comparabilă cu ratele de agregare observate de obicei la concentraţii mult mai mici de anticorpi (de ex., 10 mg/ml). În unele exemple de realizare, formulările farmaceutice dezvăluite în prezent prezintă o rată iniţială de agregate mai mică decât formulările care au concentraţii semnificativ mai mici de anticorpi anti-protofibrilă Aβ (de ex., ~0,3% nivel iniţial de agregate pentru 100 mg/ml anticorpi anti-protofibrilă Aβ faţă de ~0,8% nivel iniţial de agregate pentru 10 mg/ml anticorpi anti-protofibril Aβ). În unele exemple de realizare, formulările farmaceutice dezvăluite în prezent prezintă o rată de generare a particulelor sub-vizibile mai mică decât formulările care au concentraţii semnificativ mai mici de anticorpi anti-protofibrilă Aβ (de ex., 10,6 particule/ml pentru 100 mg/ml anticorpi anti-protofibrilă Aβ faţă de 12,6 particule/ml pentru 10 mg/ml anticorpi anti-protofibrilă Aβ). În unele exemple de realizare, formulările farmaceutice dezvăluite în prezent prezintă o rată de agregare scăzută, un nivel iniţial de agregare scăzut, o rată de fragmentare a proteinelor scăzută şi/sau o scădere a formării particulelor sub-vizibile în comparaţie cu formulările care au concentraţii semnificativ mai mici de anticorp anti-protofibrilă Aβ. Rata scăzută de agregare, nivelul iniţial de agregare, rata de fragmentare a proteinelor şi/sau generarea de particule sub-vizibile pot permite o stabilitate crescută şi/sau o durată de valabilitate mai lungă a produsului. Mai mult, excipienţii din formulările farmaceutice dezvăluite în prezent pot fi prezenţi în cantităţi mai mici decât în produsele intravenoase comercializate în prezent. În unele exemple de realizare, pH-ul şi osmolalitatea formulărilor farmaceutice dezvăluite în prezent sunt acceptabile pentru administrare intravenoasă după diluare în fluide intravenoase.

Atribuirea aminoacizilor fiecărui domeniu este, în general, conform definiţiilor din SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST (Kabat ş.a., ed a 5-a, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91- 3242. 1991, denumit în continuare "Raport Kabat").

Anticorpul anti-protofibrilă Aβ conform invenţiei este BAN2401, cunoscut, de asemenea, ca lecanemab. BAN2401 este o versiune monoclonală IgG1 umanizată a mAb158, care este un anticorp monoclonal murin produs împotriva protofibrilelor şi descris în WO 2007/108756 şi Journal of Alzheimer's Disease 43: 575-588 (2015). BAN2401 este un anticorp anti-protofibrilă Aβ, care demonstrează o afinitate scăzută pentru monomerul Aβ, în timp ce se leagă cu selectivitate ridicată la speciile de agregate Aβ solubile. De exemplu, s-a raportat că BAN2401 demonstrează o selectivitate de aproximativ 1000 de ori şi, respectiv, de 5 până la 10 ori mai mare pentru protofibrilele Aβ solubile decât pentru monomerii Aβ, sau fibrilele Aβ insolubile.

BAN2401 cuprinde (i) un domeniu variabil al lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR:1 şi (ii) un domeniu variabil al lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR:2. Secvenţele complete ale lanţului greu şi ale lanţului uşor ale BAN2401 sunt prezentate în SECV ID NR: 11 şi 12 şi sunt descrise în WO 2007/108756 şi în Journal of Alzheimer's Disease 43:575-588 (2015).

Alte exemple nelimitative de anticorpi pentru utilizare ca cel puţin un anticorp anti-protofibrilă Aβ în prezenta dezvăluire îi includ pe cei descrişi în WO 2002/003911, WO 2005/123775, WO 2007/108756, WO 2011/001366, WO 2011/104696 şi WO 2016/005466.

WO 2020/023530 se referă la metodele de tratament şi prevenire a bolii Alzheimer.

În unele exemple de realizare, anticorpul anti-protofibrilă Aβ izolat este prezent într-o concentraţie care variază de la 85 mg/ml până la 275 mg/ml. În unele exemple de realizare, anticorpul anti-protofibrilă Aβ izolat este prezent într-o concentraţie care variază de la 90 mg/ml până la 250 mg/ml. În unele exemple de realizare, anticorpul anti-protofibrilă Aβ izolat este prezent într-o concentraţie care variază de la 95 mg/ml până la 225 mg/ml. În unele exemple de realizare, anticorpul anti-protofibrilă Aβ izolat este prezent într-o concentraţie care variază de la 100 mg/ml până la 200 mg/ml. În unele exemple de realizare, anticorpul izolat este prezent într-o concentraţie de 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 110 mg/ml, 120 mg/ml, 130 mg/ml, 140 mg/ml, 150 mg/ml, 160 mg/ml, 170 mg/ml, 180 mg/ml, 190 mg/ml, 200 mg/ml, 210 mg/ml, 220 mg/ml, 230 mg/ml, 240 mg/ml, 250 mg/ml, 260 mg/ml, 270 mg/ml, 280 mg/ml, 290 mg/ml, sau 300 mg/ml. În unele exemple de realizare, anticorpul izolat este prezent într-o concentraţie de 100 mg/ml. În unele exemple de realizare, anticorpul izolat este prezent într-o concentraţie de 200 mg/ml. În unele exemple de realizare, anticorpul izolat este prezent într-o concentraţie de 250 mg/ml. În unele exemple de realizare, anticorpul izolat este prezent într-o concentraţie de 300 mg/ml. Formularea farmaceutică a invenţiei cuprinde un tampon acceptabil farmaceutic. În unele exemple de realizare, tamponul este un tampon citrat. În unele exemple de realizare, tamponul este un tampon histidină. În unele exemple de realizare, cel puţin o componentă suplimentară din formularea farmaceutică este aleasă dintre emulgatori. În unele exemple de realizare, cel puţin o componentă suplimentară din formularea farmaceutică este aleasă dintre acid citric (sau acid citric monohidrat), clorură de sodiu şi histidină (şi/sau histidină clorhidrat).

Concentraţia de arginină (şi/sau arginină clorhidrat) în formularea farmaceutică variază de la aproximativ 100 mM până la aproximativ 400 mM. În unele exemple de realizare, concentraţia de arginină (şi/sau arginină clorhidrat) în formularea farmaceutică variază de la aproximativ 110 mM până la aproximativ 380 mM. În unele exemple de realizare, concentraţia de arginină (şi/sau arginină clorhidrat) în formularea farmaceutică variază de la aproximativ 120 mM până la aproximativ 360 mM. În unele exemple de realizare, concentraţia de arginină (şi/sau arginină clorhidrat) în formularea farmaceutică variază de la aproximativ 125 mM până la aproximativ 350 mM. În unele exemple de realizare, concentraţia de arginină (şi/sau arginină clorhidrat) în formularea farmaceutică este de 125 mM. În unele exemple de realizare, concentraţia de arginină (şi/sau arginină clorhidrat) în formularea farmaceutică este de 200 mM. În unele exemple de realizare, concentraţia de arginină (şi/sau arginină clorhidrat) în formularea farmaceutică este de 350 mM.

În unele exemple de realizare, formularea farmaceutică cuprinde histidină. În unele exemple de realizare, concentraţia de histidină în formularea farmaceutică variază de la aproximativ 10 mM până la aproximativ 100 mM. În unele exemple de realizare, concentraţia de histidină în formularea farmaceutică variază de la 10 mM până la 100 mM, 12 mM până la 80 mM, 14 mM până la 60 mM, 15 mM până la 55 mM, 15 mM până la 35 mM, sau 15 mM până la 25 mM. În unele exemple de realizare, concentraţia de histidină este de 25 mM. În unele exemple de realizare, concentraţia de histidină este de 50 mM.

Concentraţia de polisorbat 80 în formularea farmaceutică variază de la aproximativ 0,01 până la 0, 1% g/v, 0,01 până la 0,08% g/v, 0,02 până la 0,08% g/v, 0,03 până la 0,07% g/v, sau 0,04 până la 0,06% g/v. În unele exemple de realizare, polisorbatul 80 este prezent în formularea farmaceutică într-o concentraţie de 0,01% g/v, 0,02% g/v, 0,03% g/v, 0,04% g/v, 0,05% g/v, 0,06% g/v, 0,07% g/v, sau 0,08% g/v. În unele exemple de realizare, polisorbatul 80 este prezent în formularea farmaceutică într-o concentraţie de 0,02% g/v. În unele exemple de realizare, polisorbatul 80 este prezent în formularea farmaceutică într-o concentraţie de 0,05% g/v.

În unele exemple de realizare, formularea farmaceutică cuprinde acid citric monohidrat. În unele exemple de realizare, concentraţia de acid citric monohidrat în formularea farmaceutică variază de la aproximativ 10 mM până la 100 mM. În unele exemple de realizare, concentraţia de acid citric monohidrat în formularea farmaceutică variază de la 10 mM până la 100 mM, 10 mM până la 90 mM, 15 mM până la 85 mM, 20 mM până la 80 mM, 25 mM până la 75 mM, 30 mM până la 70 mM, 30 mM până la 60 mM, sau 30 mM până la 50 mM. În unele exemple de realizare, concentraţia de acid citric monohidrat în formularea farmaceutică este de 50 mM.

Dezvăluirea oferă o formulare farmaceutică care are un pH în intervalul de 4,5 până la 5,5. În unele exemple de realizare, pH-ul este 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, sau 5,5. În unele exemple de realizare, pH-ul este 5,0.

În unele exemple de realizare, formulările farmaceutice descrise în acest document pot fi sub formă de soluţie şi/sau orice altă formulare lichidă adecvată considerată corespunzătoare de către o persoană de specialitate în domeniu. Calea de administrare a compoziţiilor prezentei dezvăluiri poate fi intravenoasă, sau subcutanată. În unele exemple de realizare, formularea farmaceutică este formulată ca un lichid steril, nepirogen, pentru administrare intravenoasă. În unele exemple de realizare, formularea farmaceutică este formulată ca un lichid steril, nepirogen, pentru administrare subcutanată. În unele exemple de realizare, compoziţia farmaceutică este o soluţie salină.

În unele exemple de realizare, formularea farmaceutică cuprinde 100 mg/ml de BAN2401, 50 mM acid citric monohidrat, 110 mM arginină, 240 mM arginină clorhidrat şi 0,05% (g/v) polisorbat 80 şi are un pH de 5,0 ± 0,4.

În unele exemple de realizare, formularea farmaceutică cuprinde 100 mg/ml, sau 200 mg/ml de BAN2401, 25 mM de histidină şi histidină clorhidrat, 200 mM arginină clorhidrat şi 0,05% (g/v) polisorbat 80 şi are un pH de 5,0 ± 0,4.

În unele exemple de realizare, formularea farmaceutică cuprinde 200 mg/ml de BAN2401, 50 mM histidină şi histidină clorhidrat, 125 mM arginină clorhidrat şi 0,02% (g/v) polisorbat 80 şi are un pH de 5,0 ± 0,4.

În unele exemple de realizare, formularea farmaceutică cuprinde 200 mg/ml de BAN2401, 50 mM acid citric (şi/sau acid citric monohidrat), 125 mM arginină (şi/sau arginină clorhidrat) şi 0,02% (g/v) polisorbat 80 şi are un pH de 5,0 ± 0,4.

BAN2401 şi metodele care includ utilizare a BAN2401 sunt descrise în cererea de brevet provizorie U.S. nr. 62/749.614 şi cererea internaţională PCT nr. PCT/US2019/043067.

Scurtă descriere a figurilor

FIG. 1 prezintă procentul de agregare în formulările de BAN2401 la 10 mg/ml, 100 mg/ml şi 200 mg/ml la momentele de timp 0, 1, 2 şi 3 luni la 5°C.

FIG. 2 prezintă procentul de fragmentare în formulările de BAN2401 la 10 mg/ml, 100 mg/ml şi 200 mg/ml la momentele de timp 0, 1, 2 şi 3 luni la 5 °C.

FIG. 3 prezintă procentul de monomeri în formulările de BAN2401at 10 mg/ml, 100 mg/ml şi 200 mg/ml la momentele de timp 0, 1, 2 şi 3 luni la 5 °C.

FIG. 4 prezintă procentul de agregare în formulările de BAN2401 la 10 mg/ml, 100 mg/ml şi 200 mg/ml la momentele de timp 0, 1, 2 şi 3 luni la 25 °C.

FIG. 5 prezintă procentul de fragmentare în formulările de BAN2401at 10 mg/ml, 100 mg/ml şi 200 mg/ml la momentele de timp 0, 1, 2 şi 3 luni la 25 °C.

FIG. 6 prezintă procentul de monomeri din formulările de BAN2401 la 10 mg/ml, 100 mg/ml şi 200 mg/ml la momentele de timp 0, 1, 2 şi 3 luni la 25 °C.

FIG. 7 prezintă procentul de agregare în formulările de BAN2401 la valori ale pH-ului de 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 şi 6,5 la momentele de timp 0, 1, 2 şi 3 luni la 5 °C.

FIG. 8 prezintă procentul de fragmentare în formulările de BAN2401 la valori ale pH-ului de 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 şi 6,5 la momentele de timp 0, 1, 2 şi 3 luni la 5 °C.

FIG. 9 prezintă procentul de monomeri din formulările de BAN2401 la valori ale pH-ului de 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 şi 6,5 la momentele de timp 0, 1, 2 şi 3 luni la 5 °C.

FIG. 10 prezintă procentul de agregare în formulările de BAN240I la valori ale pH-ului de 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 şi 6,5 la momentele de timp 0, 1, 2 şi 3 luni la 25 °C.

FIG. 11 prezintă procentul de fragmentare în formulările de BAN2401at valori ale pH-ului de 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 şi 6,5 la momentele de timp 0, 1, 2 şi 3 luni la 25 °C.

FIG. 12 prezintă procentul de monomeri din formulările de BAN2401 la valori ale pH-ului de 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 şi 6,5 la momentele de timp 0, 1, 2 şi 3 luni la 25 °C.

FIG. 13 prezintă procentul de agregare în formulările de BAN2401at 10 mg/ml, 100 mg/ml şi 200 mg/ml la momentele de timp 0, 1 şi 2 luni la 25 °C.

FIG. 14 prezintă procentul de fragmentare în formulările de BAN2401 la 10 mg/ml, 100 mg/ml şi 200 mg/ml la momentele de timp 0, 1 şi 2 luni la 25 °C.

FIG. 15 prezintă procentul de monomeri din formulările de BAN2401 la 10 mg/ml, 100 mg/ml şi 200 mg/ml la momentele de timp 0, 1 şi 2 luni la 25 °C.

FIG. 16 prezintă procentul de agregare a monomerilor în formulările de BAN2401 în funcţie de concentraţia de arginină.

FIG. 17 prezintă o schemă logică pentru procesul de fabricare a unei injecţii BAN2401 de 10 mg/ml.

FIG. 18 prezintă o schemă logică pentru procesul de fabricare a unei injecţii BAN2401 de 100 mg/ml.

FIG. 19 prezintă valorile de pH ale formulărilor de BAN2401 la valorile de pH la momentele de timp 0 şi 12 luni la 5 °C.

FIG. 20 prezintă valorile de pH ale formulărilor de BAN2401 la valorile de pH la momentele de timp 0, 1 şi 3 luni la 25 °C.

FIG. 21 prezintă valorile de pH ale formulărilor de BAN2401 la valorile de pH după o lună la 5 °C şi cu agitare la 25 °C.

FIG. 22 prezintă absorbanţa la 405 nm a formulărilor de BAN2401 la momentele de timp 0, 1, 3, 6, 9 şi 12 luni la 5 °C.

FIG. 23 prezintă absorbanţa la 405 nm a formulărilor de BAN2401 la momentele de timp 0, 1 şi 3 luni la 25 °C.

FIG. 24 prezintă absorbanţa la 405 nm a formulărilor de BAN2401 la o lună la 5 °C şi cu agitare la 25 °C.

FIG. 25 prezintă procentul de agregare în formulările de BAN2401at momentele de timp 0, 1, 3, 6, 9 şi 12 luni la 5 °C.

FIG. 26 prezintă procentul de fragmentare în formulările de BAN2401 la momentele de timp 0, 1, 3, 6, 9 şi 12 luni la 5 °C.

FIG. 27 prezintă procentul de monomeri din formulările de BAN2401 la momentele de timp 0, 1, 3, 6, 9 şi 12 luni la 5 °C.

FIG. 28 prezintă procentul de agregare în formulările de BAN2401 la momentele de timp 0, 1 şi 3 luni la 25 °C.

FIG. 29 prezintă procentul de fragmentare în formulările de BAN2401 la momentele de timp 0, 1 şi 3 luni la 25 °C.

FIG. 30 prezintă procentul de monomeri din formulările de BAN2401 la momentele de timp 0, 1 şi 3 luni la 25 °C.

FIG. 31 prezintă procentul de agregare în formulările de BAN2401 la o lună la 5 °C şi cu agitare la 25 °C.

FIG. 32 prezintă procentul de fragmentare în formulările de BAN2401 la o lună la 5 °C şi cu agitare la 25 °C.

FIG. 33 prezintă procentul de monomeri din formulările de BAN2401at o lună la 5 °C şi cu agitare la 25 °C.

Definiţii

Următoarele sunt definiţiile termenilor utilizaţi în prezenta cerere de brevet.

Aşa cum sunt utilizaţi aici, termenii la singular "un", "o" şi "forma articulată" includ şi referinţa la plural, cu excepţia cazului în care contextul indică în mod clar altfel.

Expresia "şi/sau", aşa cum este utilizată aici, înseamnă "oricare sau ambele" elemente astfel unite, adică elemente care sunt prezente împreună în unele cazuri şi prezente separat în alte cazuri. Astfel, ca exemplu nelimitativ, "A şi/sau B", atunci când este utilizat împreună cu un limbaj deschis, cum ar fi "care cuprinde", se poate referi, în unele exemple de realizare, doar la A (incluzând, opţional, elemente altele decât B); în alte exemple de realizare, doar la B (incluzând, opţional, elemente altele decât A); în alte exemple de realizare, atât la A, cât şi la B (incluzând, opţional, alte elemente); etc.

Aşa cum este utilizat aici, "cel puţin unul" înseamnă unul, sau mai multe dintre elementele din lista de elemente, dar nu include neapărat cel puţin unul din fiecare element enumerat în mod specific în lista de elemente şi nu exclude nicio combinaţie de elemente din lista de elemente. Această definiţie permite, de asemenea, ca elementele să poată fi prezente opţional, altele decât elementele identificate în mod specific în lista de elemente la care se referă sintagma "cel puţin unul", indiferent dacă sunt sau nu înrudite cu acele elemente identificate în mod specific. Astfel, ca exemplu nelimitativ, "cel puţin unul dintre A şi B" (sau, în mod echivalent, "cel puţin unul dintre A sau B" sau, în mod echivalent, "cel puţin unul dintre A şi/sau B") se poate referi, într-un exemplu de realizare, la cel puţin unul, incluzând, opţional, mai mult de unul, A, fără B prezent (şi incluzând, opţional, alte elemente decât B); într-un alt exemplu de realizare, la cel puţin unul, incluzând, opţional, mai mult de unul, B, fără A prezent (şi incluzând, opţional, alte elemente decât A); într-un alt exemplu de realizare, la cel puţin unul, incluzând, opţional, mai mult de un element A, şi cel puţin unul, incluzând, opţional, mai mult de un element B (şi incluzând, opţional, alte elemente); etc.

Când se recită un număr, fie singur, fie ca parte a unui interval numeric, trebuie înţeles că valoarea numerică poate varia peste şi sub valoarea indicată cu o variaţie rezonabilă pentru valoarea descrisă, aşa cum este recunoscută de o persoană de specialitate în domeniu.

Aşa cum este utilizat aici, un "fragment" al unui anticorp cuprinde o porţiune a anticorpului, de exemplu, care cuprinde o regiune de legare a antigenului, sau o regiune variabilă a acestuia. Exemplele nelimitative de fragmente includ fragmente Fab, fragmente Fab', fragmente F(ab')2, fragmente Fv, diacorpi, anticorpi liniari şi molecule de anticorpi cu lanţ unic.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "fragmentare", sau "formare de fragmente" se referă la degradarea unui anticorp, sau a unui fragment al acestuia atunci când se află într-o formulare, sau este adăugat la aceasta. Un fragment generat prin fragmentarea, sau formarea fragmentelor poate fi, sau nu, capabil să se lege de antigenul de care se leagă anticorpul, sau fragmentul acestuia.

Aşa cum se utilizează aici, "tampon histidină" poate cuprinde histidină, histidină clorhidrat, sau o combinaţie a acestora, în care histidina clorhidrat poate fi histidină clorhidrat monohidrat.

Aşa cum se utilizează aici, "tampon citrat" poate cuprinde acid citric, sărurile acestuia, sau o combinaţie a acestora, în care acidul citric poate fi acid citric monohidrat, sau acid citric anhidru.

Exemple de realizare nelimitative ale dezvăluirii:

Anumite exemple de realizare ale prezentei dezvăluiri se referă la formulări farmaceutice apoase.

Concentraţia anticorpilor

Pentru oricare dintre formulările farmaceutice apoase descrise aici, anticorpul poate fi prezent în următoarele concentraţii.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, anticorpul anti-protofibrilă Aβ izolat este prezent într-o concentraţie de 100 mg/ml.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, anticorpul anti-protofibrilă Aβ izolat este prezent într-o concentraţie de 200 mg/ml.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, anticorpul anti-protofibrilă Aβ izolat este prezent într-o concentraţie care variază de la 80 mg/ml până la 300 mg/ml. În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, anticorpul anti-protofibrilă Aβ izolat este prezent într-o concentraţie care variază de la 80 mg/ml până la 240 mg/ml.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, anticorpul anti-protofibrilă Aβ izolat este prezent într-o concentraţie care variază de la 100 mg/ml până la 200 mg/ml.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, anticorpul anti-protofibrilă Aβ izolat este prezent într-o concentraţie care variază de la 80 mg/ml până la 300 mg/ml, 85 mg/ml până la 275 mg/ml, 90 mg/ml până la 250 mg/ml, 95 mg/ml până la 225 mg/ml, 100 până la 200 mg/ml. În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, anticorpul anti-protofibrilă Aβ izolat este prezent într-o concentraţie care variază de la 90 mg/ml până la 220 mg/ml, 100 mg/ml până la 210 mg/ml, sau 110 mg/ml până la 200 mg/ml.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, anticorpul izolat anti-protofibrilă Aβ este prezent într-o concentraţie de 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 110 mg/ml, 120 mg/ml, 180 mg/ml, 190 mg/ml, 200 mg/ml, 210 mg/ml, 220 mg/ml, 230 mg/ml, 240 mg/ml, 250 mg/ml, 260 mg/ml, 270 mg/ml, 280 mg/ml, 290 mg/ml, sau 300 mg/ml.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, anticorpul anti-protofibrilă Aβ izolat este prezent într-o concentraţie de 100 mg/ml.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, anticorpul anti-protofibrilă Aβ izolat este prezent într-o concentraţie de 200 mg/ml.

Arginina

Pentru oricare dintre formulările farmaceutice apoase descrise aici, formularea cuprinde arginină. Arginina este arginină, arginină clorhidrat, sau o combinaţie a acestora.

Concentraţia de arginină variază de la aproximativ 100 mM până la aproximativ 400 mM.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, concentraţia de arginină variază de la 110 mM până la 380 mM, 120 mM până la 360 mM, 125 mM până la 350 mM, 100 mM până la 200 mM, 125 mM până la 200 mM, sau 150 mM până la 200 mM. În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, concentraţia de arginină variază de la 150 mM până la 250 mM, 160 mM până la 240 mM, 170 mM până la 230 mM, 180 mM până la 220 mM, 190 mM până la 210 mM arginină, arginină clorhidrat, sau o combinaţie a acestora.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, concentraţia de arginină este de 125 mM.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, concentraţia de arginină este de 200 mM.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, concentraţia de arginină variază de la 200 mM până la 400 mM, 210 mM până la 390 mM, 220 mM până la 380 mM, 230 mM până la 370 mM, 240 mM până la 360 mM, 240 mM până la 350 mM, sau 250 mM până la 350 mM.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, concentraţia de arginină este de 350 mM.

Polisorbat 80 (PS80)

Pentru oricare dintre formulările farmaceutice apoase descrise aici, formularea cuprinde polisorbat 80 0,01% g/v până la 0,1% g/v.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, concentraţia de polisorbat 80 variază de la aproximativ 0,01% g/v până la 0,08% g/v, 0,02% g/v până la 0,08% g/v, 0,03% g/v până la 0,07% g/v, sau 0,04% g/v până la 0,06% g/v.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, polisorbatul 80 este prezent într-o concentraţie de 0,01% g/v, 0,02% g/v, 0,03% g/v, 0,04% g/v, 0,05% g/v, 0,06% g/v, 0,07% g/v, sau 0,08% g/v.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, polisorbatul 80 este prezent într-o concentraţie de 0,02% g/v.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, polisorbatul 80 este prezent într-o concentraţie de 0,05% g/v.

Tampon

Pentru oricare dintre formulările farmaceutice apoase descrise aici, formularea cuprinde o soluţie tampon acceptabilă farmaceutic, după cum urmează.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, tamponul acceptabil farmaceutic este tamponul citrat.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, tamponul citrat este prezent într-o concentraţie de la aproximativ 10 mM până la aproximativ 100 mM.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, concentraţia tamponului citrat variază de la 10 mM până la 100 mM, 10 mM până la 90 mM, 15 mM până la 85 mM, 20 mM până la 80 mM, 25 mM până la 75 mM, 30 mM până la 70 mM, 30 mM până la 60 mM, sau 30 mM până la 50 mM.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, tamponul citrat este prezent într-o concentraţie de 50 mM.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, tamponul acceptabil farmaceutic este un tampon histidină.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, tamponul histidină este prezent într-o concentraţie de la aproximativ 10 mM până la aproximativ 100 mM.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, concentraţia tamponului histidină variază de la 10 mM până la 100 mM, 12 mM până la 80 mM, 14 mM până la 60 mM, sau 15 mM până la 55 mM, 15 mM până la 35 mM, sau 15 mM până la 25 mM.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, tamponul histidină este prezent într-o concentraţie de 25 mM.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, tamponul histidină este prezent într-o concentraţie de 50 mM.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, tamponul histidină cuprinde histidină şi histidină clorhidrat monohidrat. În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, tamponul histidină cuprinde histidină şi histidină clorhidrat monohidrat, în care histidina are o concentraţie de la aproximativ 0,1 până la 0,3 mg/ml şi histidina clorhidrat monohidrat are o concentraţie de la aproximativ 4 până la 6 mg/ml. În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, tamponul histidină cuprinde histidină şi histidină clorhidrat monohidrat, în care histidina are o concentraţie de aproximativ 0,26 mg/ml şi histidina clorhidrat monohidrat are o concentraţie de aproximativ 4,89 mg/ml. În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, tamponul de histidină cuprinde histidină şi histidină clorhidrat monohidrat, în care histidina cuprinde 0,2-0,3 mg/ml histidină şi 4,4 până la 4,9 mg/ml histidină clorhidrat, opţional histidina clorhidrat fiind monohidrat.

pH

Pentru oricare dintre formulările farmaceutice apoase descrise aici, formularea are un pH care variază de la 4,5 până la 5,5.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, pH-ul este 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, sau 5,5.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, pH-ul este 5,0.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, formularea farmaceutică este adecvată pentru injectare intravenoasă.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice, formularea farmaceutică este adecvată pentru injectare subcutanată.

În unele exemple de realizare ale formulării farmaceutice apoase, formularea farmaceutică cuprinde metionină.

În unele exemple de realizare, este descrisă o formulare farmaceutică apoasă care cuprinde:

(a) 80 mg/ml până la 240 mg/ml BAN2401,

(b) 140 mM până la 260 mM arginină clorhidrat,

(c) 0,01% g/v până la 0,1% g/v polisorbat 80 şi

(d) 15 mM până la 35 mM tampon histidină,

în care formularea farmaceutică are un pH care variază de la 4,5 până la 5,5.

În unele exemple de realizare, este descrisă aici o formulare farmaceutică apoasă care cuprinde:

(a) 80 mg/ml până 120 mg/ml BAN2401,

(b) 240 mM până la 360 mM arginină,

(c) 0,03% g/v până la 0,08% g/v polisorbat 80 şi

(d) 30 mM până la 70 mM tampon citrat,

în care formularea farmaceutică are un pH care variază de la 4,5 până la 5,5 şi în care arginina este arginină, arginină clorhidrat, sau o combinaţie a acestora.

În unele exemple de realizare, este descrisă aici o formulare farmaceutică apoasă care cuprinde:

(a) 100 mg/ml BAN2401,

(b) 200 mM arginină clorhidrat,

(c) 0.05% g/v polisorbat 80 şi

(d) 25 mM tampon histidină,

în care formularea farmaceutică are un pH care variază de la 4,5 până la 5,5.

În unele exemple de realizare, este descrisă aici o formulare farmaceutică apoasă care cuprinde:

(a) 200 mg/ml BAN2401,

(b) 200 mM arginină clorhidrat,

(c) 0.05% g/v polisorbat 80 şi

(d) 25 mM tampon histidină,

în care formularea farmaceutică are un pH care variază de la 4,5 până la 5,5.

În unele exemple de realizare, este descrisă aici o formulare farmaceutică apoasă care cuprinde:

(a) 100 mg/ml BAN2401,

(b) 350 mM arginină,

(c) 0.05% g/v polisorbat 80 şi

(d) 50 mM tampon citrat,

în care formularea farmaceutică are un pH care variază de la 4,5 până la 5,5 şi în care arginina este arginină, arginină clorhidrat, sau o combinaţie a acestora,

În unele exemple de realizare, este descrisă aici o formulare farmaceutică apoasă care cuprinde:

(a) 150 mg/ml până la 250 mg/ml BAN2401,

(b) 100 mM până la 150 mM arginină clorhidrat,

(c) 0,01% g/v până la 0,05% g/v polisorbat 80 şi

(d) 35 mM până la 65 mM tampon histidină,

în care formularea farmaceutică are un pH care variază de la 4,5 până la 5,5.

În unele exemple de realizare, formularea farmaceutică apoasă are un pH de 5,0.

EXEMPLE

Exemplul 1: Studiu privind concentraţia de proteină

În studiul concentraţiei au fost preparate şi examinate probe cu trei concentraţii de proteine (10, 100, 200 mg/ml). Materialul de 10 mg/ml a fost substanţa medicamentoasă purificată (PDS) BAN2401 şi materialele de 100 şi 200 mg/ml au fost produse din PDS BAN2401 utilizând filtre de centrifugare Amicon Ultra-15. Probele au fost toate în acelaşi tampon de formulare (25 mM citrat de sodiu, 125 mM clorură de sodiu, pH 5,7), cu excepţia faptului că fiecare a avut un nivel diferit de PS80. Procentele de PS80 ale probelor de 10, 100, 200 mg/ml au fost 0,02%, 0,16% şi respectiv 0,32%. Toate probele au fost filtrate cu 0,2 gm şi împărţite în tuburi sterile de polipropilenă (PP) pentru testarea stabilităţii. (Notă: Procesul de îndepărtare a PS80 nu a fost disponibil la momentul efectuării studiului concentraţiei.)

Stabilitatea probei a fost evaluată la două temperaturi (5 şi 25 °C) timp de 3 luni utilizând HPLC-SEC nativ, pH şi DLS. Pe probele T = 0 au fost efectuate teste suplimentare de caracterizare, cum ar fi, verificarea PS80. Detaliile testării probelor sunt prezentate în Tabelul 1.

pH-ul a fost măsurat folosind un pH-metru cu microprobă. Înainte de măsurători, s-a efectuat o calibrare folosind standarde de pH 4,0 şi 7,0.

Agregarea şi degradarea fizică a BAN2401 concentrat au fost evaluate prin efectuarea HPLC-SEC nativă pe probe de stabilitate depozitate la 5 şi 25 °C.

Analiza HPLC-SEC (nativă) a fost efectuată utilizând o coloană TSK G3000 SWXL cu fosfat de sodiu 0,2 M, fază mobilă cu pH 7,0, la un debit de 1,0 ml/min. Volumele de injecţie ale probei au fost de 15, 1,5 sau 0,8 pi, pentru concentraţii de proteine de 10, 100, sau respectiv 200 mg/ml. Acest lucru asigură injectarea a aproximativ 150 pg de proteină în coloană pe parcursul studiului. Rezultatele ariilor relative ale picurilor (%) pentru monomer, agregat şi fragment sunt prezentate în Figurile 1-6.

La ambele temperaturi (5 şi 25 °C), s-au observat procente de agregare şi rate de agregare mai mari odată cu creşterea concentraţiilor de proteine. Pentru probele de 100 şi 200 mg/ml, procentele iniţiale de agregare au fost de aproape două ori mai mari decât cele ale probei de 10 mg/ml. Acest fapt a indicat că procesul de concentrare în sine a cauzat agregarea proteinelor. O agregare suplimentară a avut loc în timpul depozitării la 5 şi 25 °C. Rata medie de agregare pe parcursul a 3 luni la 5 °C a fost de 0,17% pe lună pentru 100 mg/ml şi de 0,20% pe lună pentru 200 mg/ml. Pentru comparaţie, proba de 10 mg/ml a prezentat o rată de agregare de doar 0,07% pe lună în aceleaşi condiţii. În concluzie, s-a constatat că BAN2401 la 100 mg/ml, sau mai mare nu a fost stabil fizic în formulare.

Concentraţia de proteine a fost evaluată prin UV prin măsurarea absorbanţei la 280 şi 320 mu pe un spectrofotometru Beckman DU-800. Probele au fost diluate de 500 de ori şi au fost preparate în duplicat. Concentraţia de proteine a fost calculată folosind un coeficient de extincţie, ε, de 1,32, folosind următoarea formulă:

Concentraţia de proteine a fost măsurată folosind un spectrofotometru UV-Vis. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 2. Per total, concentraţiile au rămas neschimbate pe parcursul celor 3 luni la ambele temperaturi.

Exemplul 2: Studiu de screening al pH-ul

Stabilitatea BAN2401 la 200 mg/ml a fost evaluată la cinci valori diferite ale pH-ului. Pentru a prepara probele,PS80 s-a îbdepărtat BAN2401 PDS a fost concentrat şi diafiltrat într-o soluţie tampon care conţine 50 mM citrat de sodiu, 100 mM clorură de sodiu, pH 4,5. Ajustarea finală a concentraţiei a fost efectuată printr-o diluţie pentru a obţine o concentraţie de 200 mg/ml proteină şi 0,02% PS80. Materialul rezultat a fost împărţit în 5 părţi alicote; patru dintre părţile alicote au fost titrate cu hidroxid de sodiu 10 N pentru a produce probe la pH diferit (adică, pH 5,0, 5,5, 6,0 şi 6,5). Probele rezultate au fost filtrate cu o grosime de 0,2 µm şi sub-împărţite în tuburi sterile de polipropilenă (PP) pentru evaluarea stabilităţii.

Stabilitatea probelor a fost evaluată la două temperaturi (5 şi 25 °C) utilizând HPLC-SEC nativ, pH şi DLS pe o perioadă de 3 luni. În plus, a fost efectuat un studiu de agitare la momentul I lună, în care un subset de probe la 5 °C a fost agitat orizontal la 250 RPM timp de 3 zile într-un incubator la 25 °C. Detaliile testării probelor sunt prezentate în Tabelul 3.

Analiza SEC-HPLC a fost efectuată utilizând o coloană TSK G3000 SWXL cu fosfat de sodiu 0,2 M, fază mobilă cu pH 7,0, la un debit de 1,0 ml/min. Volumele de injecţie ale probei au fost de 15, 1,5, sau 0,8 µl pentru concentraţii de proteine de 10, 100, sau respectiv 200 mg/ml. Acest lucru asigură injectarea a aproximativ 150 µg de proteină în coloană pe parcursul studiului. Au fost raportate rezultatele ariilor relative ale picurilor (%) pentru monomer, agregat şi fragment.

Agregarea şi degradarea fizică a BAN2401 concentrat au fost evaluate prin efectuarea HPLC-SEC nativă pe probe de stabilitate depozitate la 5 şi 25 °C. Rezultatele sunt prezentate în Figurile 7-12. BAN2401 a părut a fi mai stabil la pH mai scăzut la ambele temperaturi (5 şi 25 °C). Formulările cu pH 4,5 şi 5,0 au început cu procente scăzute de agregate şi au prezentat o creştere mai lentă a formării agregatelor, cu o rată de -0,07% pe lună la 5 °C. Pe lângă agregare, a fost analizată şi fragmentarea proteinei. Rezultatele au sugerat că fragmentarea BAN2401 a fost mai pronunţată în formulările de BAN2401 la pH mai scăzut. Pe baza acestor consideraţii, formulările de BAN2401 la pH 5,0 au fost considerate cele mai stabile (adică, a prezentat o agregare şi/sau o degradare fizică mai redusă a BAN2401 în comparaţie cu alte formulări la diferite valori ale pH-ului).

Exemplul 3: Studiu de Screening al excipientului

În acest studiu au fost analizaţi doisprezece excipienţi. Pentru a prepara probele cu BAN2401 la 200 mg/ml, s-a îndepărtat PS80 BAN2401 a fost concentrat printr-o etapă TFF, urmată de o etapă de diafiltrare cu tamponul de bază (50 mM citrat, 0,02% PS80, pH 6,0). Materialul concentrat a fost împărţit în douăzeci şi patru de fracţii. Fiecare fracţie a fost îmbogăţită cu o soluţie stoc care conţine un excipient specific. Pentru majoritatea excipienţilor, au fost examinate două concentraţii, cu excepţia clorurii de sodiu şi a acidului ascorbic, pentru care au fost preparate probe cu trei, respectiv un nivel de concentraţie. O listă a excipienţilor utilizaţi şi concentraţiile acestora este prezentată în Tabelul 4.

Toate probele, inclusiv probele martor (adică, proba în tamponul de bază fără excipient), au fost filtrate cu o concentraţie de 0,2-gm şi apoi umplute aseptic în seringi BD folosind un instrument manual de etanşare. Probele martor au fost, de asemenea, umplute în flacoane de sticlă. Flacoanele şi seringile BD au fost plasate la 5 şi 25 °C. Stabilitatea probei a fost evaluată timp de 2 luni utilizând HPLC-SEC nativă şi pH-ul.

Probele din studiul de screening al excipienţilor au fost preparate într-o soluţie tampon sub-optimală (50 mM citrat, 0,02% PS80, pH 6,0) pentru a amplifica efectele pozitive ale excipienţilor în prevenirea formării agregatelor. Profilul de stabilitate (agregare) al fiecărei formulări pe o perioadă de 2 luni la 25 °C a fost evaluat prin efectuarea HPLC-SEC nativă.

După cum se arată în Figurile 13-15, formularea care conţine 160 mM arginină (F14) a produs cea mai mică rată de agregare dintre formulări. Prin comparaţie, formularea cu 160 mM arginină a prezentat doar 1,4% agregate la 25 °C după 2 luni, în timp ce martorul (adică, formularea în tamponul de bază fără excipient - F0) a prezentat 2,4% agregate în acelaşi timp şi în aceleaşi condiţii.

În plus, formulările cu arginină au avut cele mai mici procente iniţiale de agregate, ceea ce indică faptul că arginina a fost capabilă să suprime formarea agregatelor în timpul etapei de concentrare a proteinelor. Fragmentarea a fost puţin mai mare în cazul formulării cu arginină (F14) în comparaţie cu martorul (F0). Cu toate acestea, diferenţa ar fi putut fi în variabilitatea testului.

Al doilea cel mai bun excipient din acest studiu a fost formularea cu 400 mM prolină (F10), deşi efectul său în controlul agregării nu a fost la fel de eficient ca formularea cu arginină (F14).

Formulările cu clorură de sodiu (F16-F18) nu au prezentat niciun efect asupra stabilităţii în comparaţie cu proba martor. Aceeaşi observaţie a fost făcută şi pentru formulările cu PS80 (F19 şi F20): nu s-a observat niciun efect de stabilitate prin variaţia conţinutului de PS80. Formularea cu acid ascorbic (F15) a prezentat un efect dramatic,de creştere a procentelor de agregate şi fragmente de la începutul studiului.

pH-ul celor două formulări de arginină (F13 & F14) a fost măsurat pentru a verifica dacă prezenţa argininei în formulări nu a cauzat o deviere a pH-ului în timp. După cum se arată în Tabelul 4, nu s-a observat nicio modificare a pH-ului. De asemenea, a fost măsurată osmolalitatea celor două formulări. Probele au fost depozitate la -20 °C înainte de a fi decongelate în acelaşi timp pentru măsurători.

Exemplul 4: Studiu privind concentraţia de arginină

Relaţia dintre concentraţia de arginină şi agregate din formulare a fost studiată prin Design Expert® 7.0. Factorii aleşi pentru studiu şi nivelurile explorate pentru fiecare factor sunt prezentate în Tabelul 6 de mai jos.

O randomizare a probei a fost generată prin design D-optimal în Design Expert® 7.0. Setul de probe obţinut conţinea 25 de puncte de date, inclusiv 4 reproduceri, aşa cum se arată în Tabelul 7. Fiecare formulare a fost preparată şi evaluată.

Relaţia dintre concentraţia de arginină şi nivelurile de agregate în formulările de BAN2401 de 100 mg/ml la pH 5,0 care conţin 0,02% polisorbat 80 a fost estimată prin Design Expert® 7.0. Rezultatul estimării a fost prezentat în Figura 16.

Exemplul 5: Studiu PS80

Pentru a evalua modificările calităţii produsului medicamentos în condiţii de stres, s-au efectuat studii de agitare şi congelare-decongelare utilizând o soluţie tampon de formulare (pH 5,0, 350 mM arginină, 50 mM acid citric). În acest experiment, au fost investigate formulări cu concentraţii variabile de polisorbat 80 pentru a confirma efectul polisorbatului 80 asupra generării de particule sub-vizibile în astfel de condiţii de stres. Formulările investigate şi condiţiile de stres aplicate sunt prezentate în Tabelul 8.

Probele au fost preparate în acelaşi mod ca cel descris în Exemplul 4. S-a adăugat o soluţie de PS80 10% pentru a atinge concentraţia ţintă de PS80 în formulări şi ajustarea finală a concentraţiei de proteine a fost efectuată prin diluare cu soluţia tampon de formulare. Formulările au fost trecute prin filtre de 0,2 gm şi umplute în flacoane de 2 ml cu un volum de umplere de 1,3 ml. Probele au fost plasate pe un agitator orbital în orientare orizontală (flaconul aşezat pe o parte), care a fost apoi plasat într-un frigider, sau pe masa de laborator. Probele au fost agitate la 250 rpm timp de 3 zile. Alte probe au fost congelate prin plasarea într-o cameră la -20°C timp de 2 ore, apoi scoase şi lăsate la temperatura camerei timp de 2 ore pentru a se dezgheţa. Ciclul de congelare-dezgheţare a fost repetat de trei ori. Probele din studiile de agitare şi congelare-dezgheţare au fost evaluate pentru aspectul vizual, nivelurile de agregate şi fragmente prin SEC-HPLC şi particulele sub-vizibile prin Micro Flow Imaging (MFI).

Rezultatele studiilor de agitare şi congelare-decongelare asupra formulărilor BAN2401 cu niveluri variabile de PS80 sunt rezumate mai jos.

Analiza SEC-HPLC

Analiza SEC-HPLC a fost efectuată utilizând o coloană TSK G3000 SWXL cu fosfat de sodiu 0,2 M, fază mobilă cu pH 7,0, la un debit de 1,0 ml/min. Volumele de injectare ale probei au fost de 5,0 µl sau 2,5 µl pentru concentraţii de proteine de 50, sau, respectiv, 100 mg/ml. Acest lucru asigură injectarea a aproximativ 250 µg de proteină în coloană pe parcursul studiului. Au fost raportate rezultatele ariilor relative ale picurilor (%) pentru monomer, agregat şi fragment.

În ceea ce priveşte nivelul agregatelor din formulările cu pH 5 depozitate la 25 °C timp de 3 luni cu concentraţii variabile de polisorbat 80, nu a existat nicio diferenţă semnificativă în ceea ce priveşte nivelurile de agregate atunci când concentraţia de PS80 a fost crescută de la 0% la 0,06%, la un pH al formulării de 5,0. Se concluzionează că PS80 nu afectează formarea agregatelor, adică a dimerului şi trimerului, măsurată prin SEC-HPLC, în timpul depozitării formulărilor BAN2401 la 25 °C.

În ceea ce priveşte efectul concentraţiei de polisorbat 80 asupra nivelurilor de fragmente din formulările la pH 5, concentraţia de polisorbat 80 nu afectează nivelurile de fragmente din BAN2401.

În ceea ce priveşte aspectul formulărilor după agitare la 250 rpm timp de 3 zile la temperatura ambiantă, proba fără PS80 a fost tulbure, cu proteine precipitate, în timp ce celelalte probe (0,02%, 0,05% şi 0,1% polisorbat 80) au fost vizibil clare, soluţii fără particule. Toate probele care au fost agitate la 250 rpm timp de 3 zile la 5 °C au fost clare şi fără precipitat. Toate probele supuse ciclurilor de congelare/decongelare au fost, de asemenea, clare şi fără precipitat.

Nivelurile de agregate şi fragmente din formulările BAN2401 supuse agitării şi congelarii-decongelării sunt prezentate în Tabelul 9. Condiţia de stres care a cauzat cea mai mare instabilitate a fost agitarea în condiţii ambientale. În aceste condiţii, proba fără PS80 a prezentat cea mai mare formare de specii cu greutate moleculară mare şi cea mai mare pierdere de monomer. Acest efect a fost anulat pe măsură ce concentraţia de PS80 a crescut.

Analiza particulelor sub-vizibile

Analiza particulelor sub-vizibile a fost efectuată utilizând un Micro Flow Imaging (Microscop de flux DPA4100 şi celulă de flux BP-4100-FC-400-UN). Volumul total al probei a fost de 0,9 ml şi rezultatele au fost raportate pentru intervalele 2,25-100 µm, 5-100 µm, 10-100 µm şi 25-100 µm.

O creştere a particulelor sub-vizibile (2 până la 10 pm) a fost observată în probele fără PS80 care au fost supuse agitării şi congelarii-decongelare. Generarea de particule sub-vizibile a fost suprimată din ce în ce mai mult pe măsură ce concentraţia de PS80 din formulare a crescut. Acest efect a fost observat în toate intervalele de dimensiuni studiate. Nu a existat nicio modificare semnificativă a particulelor sub-vizibile în formulările care conţin 0,05% şi 0,1% polisorbat 80. Prin urmare, o concentraţie de PS80 de 0,05% a fost aleasă ca fiind optimă pentru formulare.

Datele sugerează că PS80 nu are niciun efect asupra formării agregatelor (dimeri şi trimeri) şi fragmentelor de BAN2401, măsurate prin SEC-HPLC. Prin urmare, concentraţia de PS80 a fost selectată pe baza rezultatelor studiilor de agitare şi congelare-decongelare. O concentraţie de PS80 de 0,05% a fost aleasă pentru a preveni potenţialele precipitări în timpul transportului şi pentru a minimiza formarea particulelor sub-vizibile.

Exemplul 6: Prepararea formulărilor intravenoase (IV) ale BAN2401

A. Formularea BAN2401 de 10 mg/ml

O formulare BAN2401 10 mg/ml pentru injecţie intravenoasă ("Injecţie 10 mg/ml") a fost fabricată printr-un proces aseptic convenţional cGMP pentru prepararea unei formulări apoase sterile. Injecţia BAN2401 de 10 mg/ml a fost produsă din formularea substanţelor medicamentoase BAN2401 corespunzătoare de mai jos, fără adăugarea de excipienţi şi diluare. O formulare IV exemplificativă care conţine 10 mg/ml BAN2401 este prezentată în Tabelul 10.

Soluţia filtrată de substanţă medicamentoasă BAN2401 a fost introdusă aseptic în flacoane, aşa cum este ilustrat în Figura 17 (denumită în Figura 17 "Formularea A"). Substanţa medicamentoasă reunită a fost supusă unei etape de filtrare pentru reducerea încărcăturii biologice printr-un filtru de 0,2 pm. Filtrarea sterilă finală a fost efectuată prin două filtre de 0,2 pm în serie şi s-au efectuat teste de integritate a filtrului pre- şi post-filtrare. Produsul medicamentos steril vrac a fost introdus aseptic în flacoane. În timpul operaţiunii de umplere, precizia umplerii a fost confirmată prin măsurarea greutăţii de umplere a flaconului. Flacoanele umplute au fost închise cu dopuri şi apoi etanşate cu un sigiliu de aluminiu. După închiderea cu capac, produsul a fost depozitat la 5± 3 °C.

Flacoanele au fost analizate utilizând Metoda 1 (Întunecare uşoară) conform USP 788. Rezultatele sunt prezentate în Tabelele 11 şi 12.

Exemplul 7: Prepararea Formulărilor Intravenoase (IV) şi Subcutanate (SC) ale BAN2401

A. Formulări BAN2401 de 100 mg/ml

O formulare BAN2401 100 mg/ml ("Injecţie 100 mg/ml") a fost fabricată printr-un proces aseptic convenţional cGMP pentru prepararea unei formulări apoase sterile. BAN2401 100 mg/ml a fost produs din substanţele medicamentoase BAN2401 corespunzătoare fără adăugarea de excipienţi şi diluare (Tabelul 13).

Soluţia filtrată de substanţă medicamentoasă BAN2401 (injecţie 100 mg/ml) a fost introdusă aseptic în flacoane, aşa cum este ilustrat în Figura 18 (denumită în Figura 18 "Formularea B"). Substanţa medicamentoasă a fost supusă unei etape de filtrare pentru reducerea încărcăturii microbiene printr-un filtru de 0,2 pm. Filtrarea sterilă finală a fost efectuată prin două filtre de 0,2 pm în serie şi s-au efectuat teste de integritate a filtrului pre- şi post-filtrare. Produsul medicamentos steril vrac a fost introdus aseptic în flacoane. În timpul operaţiunii de umplere, precizia umplerii a fost confirmată prin măsurarea greutăţii de umplere a flaconului. Flacoanele umplute au fost închise cu dopuri şi apoi etanşate cu un sigiliu de aluminiu. După închiderea cu capac, produsul a fost depozitat la 5± 3 °C.

Flacoanele au fost analizate utilizând Metoda 1 (Întunecare uşoară) conform USP 788. Rezultatele sunt prezentate în Tabelele 14 şi 15.

A fost fabricată o altă injecţie BAN2401 de 100 mg/ml. Următoarele materiale pot fi utilizate într-o a doua formulare exemplificativă care conţine 100 mg/ml BAN2401, aşa cum se prezintă în Tabelul 16.

B. Formulare BAN2401 de 200 mg/ml

Următoarele materiale pot fi utilizate într-o formulare SC exemplificativă care conţine 200 mg/ml BAN2401, aşa cum se prezintă în Tabelul 17. Stabilitatea BAN2401 în aceste formulări (FSC1, FSC2 şi FSC3) a fost evaluată împreună cu o evaluare a stabilităţii materialului în trei închideri de recipiente:

i) Seringă preumplută (PFS) din sticlă Becton-Dickenson Hypak Biotech şi dop

ii) PFS din material plastic West Crystal Zenith şi dop

iii) Flacon de sticlă West de 5 ml şi dop

BAN2401, la o concentraţie ţintă de proteine de 200 mg/ml, a fost preparat prin TFF, aşa cum este rezumat mai jos. A fost efectuată o operaţiune TFF separată pentru a prepara materialul BAN2401 în fiecare tampon de formulare, cu excepţia FSC1a şi FSC1b. Pentru două dintre formulări, a fost efectuată o operaţiune TFF şi materialul concentrat rezultat a fost împărţit în două jumătăţi de loturi. O cantitate mică de material filtrat steril din fiecare tampon de formulare finală nu a fost introdusă la momentul zero, ci a fost depozitată congelată la -20°C pentru a fi introdusă în inchiderile recipientelor corespunzătoare pentru testarea seringilor.

(a) Prepararea BAN2401

Procesul de concentrare/diafiltrare a proteinelor prin TFF poate fi împărţit în 3 etape:

1. Concentrarea materialului la 100-150 mg/ml

2. Diafiltrare (5X) împotriva tamponului de formulare

3. Concentrare până la >200 mg/ml

Etapa de concentrare/diafiltrare a fost realizată utilizând un sistem Pall Centramate LV instalat cu un filtru de 0,02 m2 din suprafaţa membranei. Materialul BAN2401 (extras din lotul GMP de fabricaţie înainte de adăugarea PS80) a fost încărcat în sistemul TFF şi s-a obţinut o concentraţie de 10-15 ori (etapa 1). Materialul a fost apoi diafiltrat cu până la 5 diavolume de tampon de formulare (etapa 2), efectuându-se verificări ale pH-ului şi conductivităţii permeatului pentru a monitoriza diafiltrarea. După diafiltrare, materialul a fost concentrat în continuare până la concentraţia ţintă de proteine de 210 până la 250 mg/ml (etapa 3). Retentatul a fost colectat şi s-au prelevat probe pentru determinarea concentraţiei de proteine.

La prepararea acestei formulări, concentraţia ţintă de proteine de 210 până la 250 mg/ml nu a fost atinsă din cauza presiunii ridicate din sistemul TFF. Prin urmare, concentraţia ţintă de proteine a fost atinsă utilizând unităţi de filtrare Millipore centrifi.Igal (30.000 MWCO). Pentru a efectua această etapă de concentrare, unităţile de filtrare au fost echilibrate cu soluţia tampon de formulare a BAN2401, urmată de centrifugarea materialului BAN2401 la 3600 RPM (~3000 x g) la intervale de 30 de minute la 20 °C, până când concentraţia proteinei în retentat se aşteaptă a fi mai mare de 200 mg/ml. Retentatul a fost recuperat din unităţile de filtrare şi reunit. După amestecare temeinică, retentatul reunit a fost prelevat pentru măsurători ale concentraţiei de proteine.

După concentrarea proteinei, s-a prelevat o probă din amestec şi s-a diluat de 500 de ori cu soluţia tampon adecvată pentru formulare. Absorbanţa probei diluate la 280 nm şi 320 nm a fost măsurată în raport cu soluţia tampon blank. Ajustarea finală a concentraţiei de proteine a fost efectuată prin diluare cu soluţia tampon adecvată pentru formulare. În cele din urmă, s-a adăugat o soluţie de PS80 10% la BAN2401 pentru a obţine 0,02% PS80 în soluţia finală şi soluţia de proteine a fost amestecată complet prin rotaţie end-over-end.

Materialul final formulat cu BAN2401 a fost filtrat folosind filtre de seringă de 0,2 µm şi ulterior introdus în flacoane, sau PFS. Această etapă a fost efectuată aseptic într-o hotă de biosecuritate. Flacoanele, sau PFS rezultate au fost plasate într-un congelator la -20°C. Flacoanele au fost depozitate inversate şi PFS au fost depozitate orizontal pentru a simula cele mai defavorabile condiţii.

C. Experimente de stabilitate pe formulări SC exemplificative de 200 mg/ml care cuprind BAN2401.

Stabilitatea probei a fost evaluată la 5°C (3M, 6M, 9M, 12M) şi 25°C (1M, 3M) utilizând teste pentru pH (Figurile 19-21), absorbanţă la 405 nm (Figurile 22-24) (pentru a detecta creşteri ale îngălbenirii), cromatografie de excluziune dimensională (SEC) (Figurile 25-33) şi ulterior la 5°C. A se vedea Tabelul 17 pentru formulările exemplificative FSC1-FSC4; de notat că în Figurile 19-33, "F1a" se referă la FSC1a, "F1b" se referă la FSC1b, "F2" se referă la FSC2 şi "F3" se referă la FSC3. Teste suplimentare de caracterizare, inclusiv concentraţia de proteine, calorimetrie diferenţială de scanare (DSC), PS80 şi osmolalitate, au fost efectuate pe probe la t=0. Testarea particulelor sub-vizibile a fost efectuată pe probe la t=0 şi t=6 luni. Un studiu de agitare de 3 zile a fost efectuat pe probe depozitate timp de 1 lună la 5°C. Probele pentru studiul de agitare au fost transferate de la depozitarea la 5°C după 1 lună la 25°C cu agitare timp de 3 zile la 250 rpm.

Rezultatele testelor au arătat că 200 mg/ml BAN2401 în toate formulările FSC1a-FSC3 a prezentat niveluri similare de agregate şi fragmente după depozitare la 2-8°C timp de 12 luni. A fost evaluată stabilitatea BAN2401 la 200 mg/ml, în cele trei formulări FSC1a-FSC3. Per total, stabilitatea BAN2401 în fiecare formulare testată a părut similară şi s-a menţinut la peste 98,2% monomer după depozitare la 5°C timp de 12 luni, indiferent de închiderea recipientului testat. În plus, după depozitarea la 5°C timp de 12 luni, pH-ul a rămas stabil, neexistând o creştere apreciabilă a îngălbenirii prin A405.

(a) Concentraţia de proteine (probe la T=0)

Concentraţia de proteine a fost măsurată folosind un spectrofotometru UV-Vis. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 18.

Concentraţia de proteine a fost evaluată prin măsurarea absorbanţei la 280 şi 320 nm pe un spectrofotometru Beckman DU-800 utilizând o cuvetă de cuarţ de 1cm. Probele au fost diluate de 500 de ori şi au fost preparate ca triplicat. Concentraţia de proteine a fost calculată folosind un coeficient de extincţie, ε. de 1,32, folosind următoarea formulă:

(b) Polisorbat 80 (probă la T=0)

Conţinutul de PS80 din probe a fost măsurat prin cuantificarea acidului oleic. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 19.

Măsurarea a fost efectuată prin cuantificarea acidului oleic, un produs de hidroliză al PS80. Folosind hidroliza bazică, PS80 eliberează acid oleic într-un raport molar de 1:1. Acidul oleic poate fi apoi separat de alte produse de hidroliză şi matrici ale PS80 folosind HPLC cu fază inversă. Acidul oleic a fost monitorizat fără derivatizare folosind absorbanţa la 195 nm. [J. Chromatography B, 878 (2010) 1865-1870]. Experimental, probele au fost amestecate cu hidroxid de sodiu pentru a elibera acid oleic, care a fost ulterior extras cu acetonitril. Extractul a fost diluat cu o soluţie de fosfat de potasiu şi un volum de probă de 100 µl a fost injectat într-o coloană Waters Symmetry C18. Separarea s-a făcut folosind o eluţie izocratică care conţine 80% fază organică A (acetonitril) şi 20% fază apoasă B (20 mM fosfat de potasiu monobasic, pH 2,8). Concentraţia de PS80 din probă a fost calculată din aria picului folosind o curbă standard.

(c) Osmolalitate (probe la T=0)

Osmolalitatea probelor a fost determinată utilizând un osmometru cu punct de congelare. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 20.

Osmolalitatea a fost măsurată utilizând un osmometru cu punct de congelare Precision Systems Osmette III. Probele au fost diluate de 3 ori cu WFI şi volumele de probă diluate de 10 µl au fost prelevate şi încărcate în instrument folosind pipeta osmometrului. Măsurătorile de osmolalitate rezultate au fost corectate pentru diluţia probei.

(d) Particule sub-vizibile

Analiza particulelor sub-vizibile a fost efectuată utilizând un instrument Fluid Technologies FlowCarn. Rezultatele la T=O sunt prezentate în Tabelul 21. Se pare că există o creştere a concentraţiei totale de particule şi a numărului de particule mai mare de 10 µm în timp, atunci când materialul este depozitat la 5°C. Gradul de modificare crescută a fost mic, în următoarea ordine: FSC I a < FSC1b < FSC2 < FSC3.

Analiza particulelor sub-vizibile a fost efectuată utilizând o cameră Fluid Imaging Technologies FlowCam cu un obiectiv 20X şi o celulă de flux de 50 um. Înainte de a rula probe BAN2401, celula de flux a fost spălată cu dI H2O şi s-a efectuat o măsurare pe dI H2O pentru a se asigura că celula de flux a fost curată. Dacă numărul total de panicule numărate per 0,2 ml de di H2O a fost ≦ 2, celula de flux a fost considerată gata de utilizare. Probele au fost echilibrate la temperatura camerei, apoi diluate de 20 de ori cu apă deionizată. Probele diluate în duplicat au fost analizate utilizând un volum de probă de 0,2 ml şi un debit de probă de 0,02 ml/min. Rata de autoimaginare a fost de 14, rezultând o eficienţă de 19,6% şi un timp de rulare de 10 min. Concentraţiile de particule rezultate au fost corectate pentru diluţia probei.

(e) pH

pH-ul fiecărei formulări a fost monitorizat pe parcursul testării stabilităţii. După cum se arată în Figurile 19-21, nu s-a observat nicio modificare aparentă a probelor în niciuna dintre condiţiile de depozitare testate.

(f) HPLC-SEC

Analiza prin cromatografie de excluziune dimensională prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC-SEC) a fost efectuată utilizând o coloană TSK 03000 SWXL cu fosfat de sodiu 0,2 M, fază mobilă pH 7,0, la un debit de 1,0 ml/min. Volumul de injecţie al probei a fost de 0,8 µl pentru o concentraţie de proteină de 200 mg/ml. Acest lucru asigură injectarea a aproximativ 150 µg de proteină în coloană pe parcursul studiului. Rezultatele ariilor relative ale picurilor (%) pentru monomer, agregat şi fragment au fost raportate, aşa cum se arată în Figurile 25-33.

Degradarea fizică a BAN2401 a fost evaluată prin efectuarea HPLC-SEC pe probele de stabilitate depozitate la 5 şi 25 °C. După depozitarea la 5°C timp de 12 luni, procentul de agregat a fost similar pentru cele 3 formulări, de aproximativ 1,1%. Procentul de fragment generat pentru toate formulările testate a fost în intervalul 0,4-0,5%. Conţinutul de monomer după 12 luni de depozitare la 5°C a fost în intervalul de 98,4-98,6% pentru toate formulările testate şi închiderile recipientelor. La ratele actuale de degradare, este posibil ca BAN2401 din toate formulările testate să aibă mai mult de 97% monomer după o depozitare de până la 24 de luni la 5°C.

După depozitare la 25°C timp de până la 3 luni, generarea de fragmente după 3 luni a fost cuprinsă în intervalul de 0,4-0,8%. Conţinutul de monomer a fost puţin mai mare de 98% pentru toate formulările, cu excepţia FSC3, care a avut puţin sub 98% monomer după 3 luni la 25°C.

Exemplul 8: Selecţia concentraţiilor de proteină, arginină şi polisorbat 80

A. Prepararea probelor

Fiecare formulare candidată (F1-F12) a fost preparată după cum urmează. Intermediarul de proces al substanţei medicamentoase (DS) a fost concentrat şi echilibrat cu soluţiile tampon corespunzătoare pentru formulare (Tabelul 22) prin intermediul unităţilor de filtrare centrifugală. După concentrare şi echilibrare, s-a adăugat PS80 dizolvat în soluţia tampon pentru formulare pentru a obţine concentraţii predeterminate şi concentraţiile de proteine au fost ajustate la concentraţia finală. Fiecare formulare candidată a fost umplută în flacoane cu un volum de umplere de 0,5 ml. Formulările candidate (F1-F12) sunt prezentate în Tabelul 22. Formularea F0 a fost evaluată ca martor.

B. Protocol de stabilitate

Protocoalele de stabilitate sunt prezentate în Tabelul 23, Tabelul 24 şi Tabelul 25. După scoaterea de la depozitare, flacoanele au fost depozitate la 5 °C până la testare. Condiţiile de depozitare au fost următoarele:

• Condiţii pe termen lung: păstrare la 5 °C±3°C în poziţie verticală • Stare accelerată: Depozitat la 25 °C±2 °C, 60%RH±5%RH, în poziţie verticală • Condiţii stresante (congelare-decongelare): Congelat la -30°C şi decongelat la temperatura camerei, în poziţie verticală • Condiţii de stres (agitare): 5 °C, întins, orizontal, la 250 rpm pe un agitator cu mişcare alternativă, cu o amplitudine de agitare de 50 mm

Deoarece se ştie că vâscozitatea soluţiei creşte exponenţial la soluţii proteice foarte concentrate, concentraţia de proteine a fiecărei formulări candidate (F1-F5) a fost ajustată la 200 ± 10 mg/ml cu un tampon de formulare care conţine 0,05 (g/v)% de PS80 pentru analiză. Celelalte formulări nu au fost diluate înainte de măsurare.

C. Rezultate şi discuţii

(a) Selectarea concentraţiei de arginină

Pentru a selecta concentraţia ţintă de arginină în formulare, au fost evaluate proprietăţile fizice şi s-au efectuat studii de stabilitate prin congelare-decongelare, pe termen lung şi accelerată pentru formulările candidate cu diferite concentraţii de arginină (150 până la 350 mmol/l, F1 până la F5) şi comparate cu formularea F0 (a se vedea Tabelul 22). Proprietăţile fizice şi rezultatele studiului de congelare-decongelare au fost prezentate în Tabelul 26. Rezultatele studiului de stabilitate pe termen lung şi accelerată au fost prezentate în Tabelul 27 şi Tabelul 28.

(b) Proprietăţi fizice

După cum se arată în Tabelul 26, valorile osmolalităţii au crescut odată cu creşterea concentraţiei de arginină. F1, F2 şi F3 au prezentat valori ale osmolalităţii mai mici în comparaţie cu F4 şi F5. Prin urmare, concentraţia de arginină a fost limitată la 250 mmol/l, sau mai mică. Valorile viscozităţii F1-F5 s-au situat într-un interval îngust (7,3-8,1 cP) şi nu au fost corelate cu concentraţia de arginină între 150 până la 350 mmol/l. Rezultatele privind aspectul, pH-ul şi concentraţia de PS80 şi de proteine au fost aproape de valoarea ţintă.

(c) Studiu de stabilitate la congelare-decongelare

Nu s-au observat modificări semnificative la niciun element testat după trei cicluri de testare prin congelare-decongelare, aşa cum se prezintă în Tabelul 26.

(d) Studiu de stabilitate pe termen lung

După cum se prezintă în Tabelul 27, nu s-au observat modificări semnificative la toate elementele testate, cu excepţia HPLC cu excludere dimensională (SEC) după depozitare timp de trei luni. Cantităţile de agregate şi fragmente obţinute prin SEC au crescut uşor în formulările candidate F1-F5. Fiecare rată de creştere a fost similară cu cea a formulării F0.

(e) Studiu de stabilitate accelerată

După cum se prezintă în Tabelul 28, nu s-au observat modificări semnificative la toate elementele testate, cu excepţia SEC şi HPLC cu excluziune ionică (IEX). Deşi cantitatea de agregat obţinută prin SEC a crescut la toţi candidaţii (F1-F5, BAN2401 200 mg/ml) şi rata a fost mai rapidă decât cea a formulării F0, aşa cum era de aşteptat, toţi candidaţii au fost consideraţi fezabili, având în vedere rezultatele în condiţii de lungă durată şi stabilitatea F0 cu o durată lungă de valabilitate. Concentraţia mai mare de arginină a dus la o formare uşor mai lentă a agregatelor, în concordanţă cu rezultatele descrise în Exemplul 4. Cantitatea de fragment obţinută prin SEC a crescut, de asemenea, la toţi candidaţii, dar viteza a fost similară cu cea din formularea F0. În ceea ce priveşte IEX, cantitatea de vârf acid a crescut la toţi candidaţii, dar viteza a fost similară cu cea din F0.

(f) Concentraţia de arginină

După cum se prezintă în Tabelul 26, F4 şi F5 (la concentraţii de arginină de 300 şi 350 mmol/l) nu au fost considerate fezabile din punct de vedere al osmolalităţii. Printre candidaţii fezabili F1, F2 şi F3 (la concentraţii de arginină de 150, 200 şi 250 mmol/l), F1 este cel mai apropiat de izotonic. După cum se prezintă în Tabelul 28, formulările cu concentraţii mai mari de arginină au prezentat o rată de formare a agregatelor mai mică în studiile de stabilitate accelerată, dar diferenţa de rată nu a fost semnificativă în intervalul de concentraţie de arginină evaluat. Luând în considerare atât izotonicitatea, cât şi rata de formare a agregatelor, 200 mmol/l a fost selectată ca concentraţie ţintă de arginină pe baza formulării F2.

(g) Selectarea concentraţiei de proteine

Pentru a selecta concentraţia ţintă de proteine în formulare, au fost evaluate proprietăţile fizice şi au fost efectuate studii de stabilitate prin congelare-decongelare, pe termen lung şi accelerată pentru formulări candidate cu diferite concentraţii de proteine (200 până la 300 mg/ml, F2, F6, F7) şi formulare F0. Proprietăţile fizice şi rezultatele studiului de congelare-decongelare sunt prezentate în Tabelul 29. Rezultatele studiilor de stabilitate pe termen lung şi accelerată au fost prezentate în Tabelul 27 şi Tabelul 28.

(h) Proprietăţi fizice

După cum se prezintă în Tabelul 29, F2 şi F6 au prezentat valori ale osmolalităţii mai mici în comparaţie cu F7. Valorile viscozităţii în F2, F6 şi F7 au fost de 7,8, 21 şi respectiv 48 cP. O viscozitate ridicată, peste 20 cP, ar cauza dificultăţi în fabricarea DS prin creşterea contrapresiunii pompei şi scăderea fluxului transmembranar în timpul etapelor de ultrafiltrare şi diafiltrare. În plus, o soluţie cu concentraţie mai mare îngreunează procesul de umplere cu DP prin înfundarea acelor de umplere, ceea ce duce la variaţia greutăţii de umplere. Deoarece viscozitatea dorită este raportată a nu fi mai mare de 20 cP3, F2 a fost fezabilă. Rezultatele privind aspectul, pH-ul şi concentraţia de PS80 şi de proteine au fost aproape conforme cu ţinta.

(i) Studiu de congelare-decongelare

Nu s-au observat modificări semnificative la toate elementele testate după trei cicluri de testare prin congelare-decongelare, aşa cum se prezintă în Tabelul 29.

(j) Studiu de stabilitate pe termen lung

După cum se prezintă în Tabelul 27, nu s-au observat modificări semnificative, în afară de HPLC cu excluziune dimensională (SEC) după depozitare timp de trei luni. Cantitatea de agregat obţinută prin SEC a crescut uşor în formulările candidate F2, F6 şi F7, dar rata de creştere a fost similară cu cea din F0.

(k) Studiu accelerat de stabilitate

După cum se prezintă în Tabelul 28, nu s-au observat modificări semnificative în afară de SEC şi HPLC cu excluziune ionică (IEX). Cantitatea de agregat obţinută prin SEC a crescut la toţi candidaţii (F2, F6 şi F7) în rate similare la intervalul de trei luni (creştere de 0,7-0,8%). Prin urmare, toţi candidaţii au fost consideraţi fezabili. Cantitatea de fragment obţinută prin SEC a crescut, de asemenea, la toţi candidaţii, dar rata a fost similară cu cea din F0. În ceea ce priveşte IEX, cantitatea de vârf acid obţinută prin IEX a crescut la toţi candidaţii, dar rata a fost similară cu cea din F0.

(I) Concentraţia de proteine

Având în vedere rezultatele osmolalităţii şi viscozităţii prezentate în Tabelul 29 şi rezultatele stabilităţii generale prezentate în Tabelul 27 şi Tabelul 28, a fost selectată o concentraţie de proteine de 200 mg/ml.

(m) Selectarea concentraţiei de PS80

Pentru a selecta concentraţia ţintă de PS80 în formulare, au fost efectuate studii de congelare-decongelare şi agitare pentru formulări candidate cu concentraţii diferite de PS80 [0 până la 0,10 (g/v)%, F8-F12] şi formularea F0. Rezultatele studiului de congelare-decongelare şi agitare sunt prezentate în Tabelul 30 şi, respectiv, Tabelul 31.

(n) Studiu de cogelare-decongelare

După cum se prezintă în Tabelul 30, nu s-au observat modificări semnificative la toate elementele testate după trei cicluri de testare prin congelare-decongelare. Numărul de particule obţinut prin MFI a fost relativ ridicat în F8 (fără PS80).

(o) Studiu de agitare

După cum se prezintă în Tabelul 31, formulările care conţin 0,02 (g/v)% până la 0,10 (g/v)% de PS80 (F9 până la F12) au fost stabile după agitare. Au fost observate modificări la F8 (fără PS80) în ceea ce priveşte aspectul, concentraţia de proteine şi cantitatea de agregat prin SEC după agitare. Aspectul s-a schimbat de la un lichid limpede, uşor gălbui, la un lichid alb opalescent. Concentraţia de proteine a scăzut uşor de la 206 până la 195 mg/ml. Cantitatea de agregat a crescut de la 1,1% până la 3,8%. Prin urmare, F8 (fără PS80) nu a fost considerat fezabil.

(p) Concentraţia PS80

Pe baza rezultatelor prezentate în Tabelul 30 (studiu de congelare-decongelare) şi Tabelul 31 (studiu de agitare), formulările care conţin 0,02 (g/v)% până la 0,10 (g/v)% de PS80 au fost stabile după trei cicluri de congelare-decongelare şi agitare, timp de până la trei zile. Prin urmare, s-a selectat ca ţintă o concentraţie de PS80 de 0,05 (g/v)%.

(q) Concluzie

În concluzie, următoarea formulare a fost selectată pentru formularea BAN2401 pentru studiile ulterioare.

Exemplul 9: Studiu de stabilitate pentru formulări BAN2401 de 200 mg/ml cu pH diferit

A fost efectuat un studiu de stabilitate pentru a testa stabilitatea formulărilor BAN2401 la 200 mg/ml cu pH diferit. În plus, a fost testat impactul adăugării de metionină asupra stabilităţii produsului medicamentos (DP).

A. Prepararea probelor

Fiecare formulare candidată (Tabelul 33) a fost preparată după cum urmează. Formulările au fost echilibrate cu soluţia tampon corespunzătoare prin intermediul unităţilor de filtrare centrifugală. Numai pentru prepararea F20, s-a utilizat soluţie tampon la un pH de 3,5 până când pH-ul soluţiei filtrate a atins 4,0, deoarece protonii sunt respinşi de proteinele încărcate concentrate în apropierea membranei semipermeabile, fenomen cunoscut sub numele de efect Donnan. După concentrare şi echilibrare, s-a adăugat PS80 dizolvat în soluţia tampon pentru a obţine o concentraţie predeterminată şi apoi concentraţia proteinei a fost ajustată la concentraţia finală. Fiecare formulare candidată a fost umplută în flacoane cu un volum de umplere de 0,5 ml. Formularea F0 (vezi Tabelul 33) a fost evaluată ca un martor.

B. Protocol de depozitare

Protocoalele de depozitare sunt prezentate în Tabelul 34, Tabelul 35 şi Tabelul 36. După scoaterea din depozit, flacoanele au fost depozitate la 5 °C până la începerea testării. Condiţiile de depozitare sunt următoarele:

• Condiţie pe termen lung: depozitat la 5 °C±3°C în poziţie verticală • Stare accelerată: Depozitat la 25 °C±2 °C, 60%RH±5%RH, în poziţie verticală • Condiţii stresante (congelare-decongelare): Congelat la -30°C şi decongelat la temperatura camerei, în poziţie verticală

1000 lx: 25 °C±2 °C, 60%RH±5%RH, culcat cu o expunere la lumină de 1000 lx

Întuneric: 25 °C ± 2 °C, 60%RH±5%RH, culcat fără expunere la lumină, acoperind cu folie de aluminiu

Pentru a confirma nivelul agregatului după o depozitare de trei luni, sau mai mult, s-a evaluat, suplimentar, prin HPLC cu excluziune dimensională, probele ca fiind depozitate pe termen lung, timp de nouă luni şi timp de trei luni pentru studiul accelerat al stabilităţii. Ultimele probe au fost testate după ce au fost depozitate la frigider timp de şase luni.

C. Rezultate şi discuţii

Proprietăţile fizice au fost evaluate şi s-au efectuat studii pe termen lung şi accelerate pentru formulările candidate, inclusiv variaţia pH-ului (pH 4,0 până la pH 6,0) şi adăugarea de metionină. De asemenea, au fost efectuate studii de congelare-decongelare şi fotostabilitate pentru a evalua eficienţa adăugării de metionină.

D. Variaţia pH-ului

După cum se arată în Tabelul 37, Tabelul 38A şi 38B, Tabelul 39 şi Tabelul 40, nu s-au observat diferenţe semnificative între formulările candidate (F13, F15, F17 şi F20 până la F22) pentru niciun element de testare, cu excepţia HPLC cu excluziune dimensională (SEC). Formularea F20 (adică, o formulare cu pH mai mic de 4,0), a prezentat o cantitate mai mică de agregate prin SEC la momentul iniţial. În plus, într-un studiu de stabilitate accelerată s-au observat o rată uşor mai mică de formare a agregatelor şi o rată mai mare de formare a fragmentelor. Rezultatele formulărilor cu pH între 4,5 şi 5,5 s-au confirmat a fi comparabile.

E. Adăugarea de metionină

Aşa cum se arată în Tabelele 41A şi 41B şi în Tabelele 42 până la 46, nu s-a observat nicio diferenţă semnificativă între formulările cu, sau fără metionină (F18 şi F15). Formularea cu metionină (F18) a prezentat o rată uşor mai mică de formare a agregatelor într-un studiu extins de stabilitate pe termen lung, un studiu accelerat de stabilitate şi un studiu de fotostabilitate. F18 a prezentat, de asemenea, o oxidare uşor mai mică a reziduului de metionină (de ex., la poziţia 259 în lanţurile grele) la expunerea la lumină cu 1000 lux până la şapte zile. Studiul de congelare-decongelare nu a arătat nicio diferenţă. Efectul a 10 mmol/l de metionină ca stabilizator a fost limitat.

F. Concluzie

Atributele de calitate au fost comparabile între formulările de BAN2401, cu variaţii ale pH-ului de la 4,5 până la 5,5. Depozitările la pH 4,0 au arătat o rată mai mică de formare a agregatelor şi, dimpotrivă, o rată mai rapidă de formare a fragmentelor în timpul depozitării. Nu s-a observat nicio diferenţă semnificativă între formulările cu şi fără metionină la o concentraţie de 10 mmol/l, pe baza evaluărilor calităţii şi a studiilor de stabilitate, inclusiv pe termen lung, accelerate, prin congelare-decongelare şi fotosensibilitate. Deşi s-a observat o rată uşor mai lentă de formare a agregatelor şi o suprimare minoră a oxidării reziduurilor de aminoacizi, diferenţele nu au fost semnificative. În concluzie, F15 şi F21, care au fost compuse din 200 mg/ml de BAN2401, 25 mmol/l de L-histidină/histidină clorhidrat, 200 mmol/l de L-arginină, 0,05 (g/v)% de polisorbat 80 la un pH de 5,0 ± 0,5, au fost considerate substanţe medicamentoase bune pentru dezvoltare ulterioară.

Exemplul 10: Investigarea efectului concentraţiei de arginină asupra stabilităţii formulării de BAN2401

A fost evaluat efectul concentraţiei de arginină (0, 50, 100 şi 200 mmol/l) asupra stabilităţii BAN2401 la 200 mg/ml. Probele pentru fiecare nivel de concentraţie de arginină au fost depozitate în condiţii accelerate (25 °C/60%RH) şi testate la 0, 1 şi 2 luni.

A. Prepararea probelor

Probele (F1-F4) au fost preparate prin schimb de soluţii tampon cu intermediarul de procesare al substanţei medicamentoase BAN2401 concentrate prin ultrafiltrare. După filtrarea aseptică, fiecare probă de 0,4 ml a fost introdusă într-un flacon. Informaţiile despre probă sunt prezentate în Tabelul 47.

B. Rezultate

Rezultatele acestui studiu de stabilitate pentru probele F1 până la F4 sunt prezentate în Tabelele 48 până la 51. Nu a existat nicio diferenţă în ceea ce priveşte pH-ul şi concentraţia de proteine între probe şi nivelul concentraţiei de arginină a fost în concordanţă cu ţinta stabilită pentru probele iniţiale.

Procentul de agregate pentru probele care conţin arginină (F2 până la F4) a fost mai mic decât cel al probei fără arginină (F1).

C. Discuţii şi concluzii

Rezultatele acestui studiu au indicat faptul că concentraţiile de arginină de 50 până la 200 mmol/l previn creşterea agregatelor proteice în formularea BAN2401 de 200 mg/ml. Variaţia concentraţiei de arginină între loturi poate duce la variaţii ale % de agregate între loturi. În plus, concentraţia de arginină poate afecta tendinţa de creştere a % de agregate în studiul de stabilitate.

Formularea care cuprinde tampon histidină pare să prezinte efect asupra reducerii fragmentării BAN2401, comparativ cu procentul de fragmentare din proba F1 cu procentul de fragmentare prezentat în Figura 11 din Exemplul 2, în care s-au utilizat probele care cuprindeau 200 mg/ml BAN2401, 50 mM citrat de sodiu şi 100 mM clorură de sodiu.

LISTA DE SECVENŢE

Lanţ greu (SECV. ID NR.: 11):

Lanţ uşor (SECV. ID NR.: 12):

Remarci: Documentul complet, inclusiv tabelul(ele) de referinţă şi lista(ele) de secvenţe, poate fi descărcat de pe site-ul EPO.

Claims (17)

1. Formulare farmaceutică apoasă care cuprinde:

(a) un anticorp izolat anti-protofibrilă Aβ care se leagă de protofibrilele Aβ umane, la o concentraţie de 80 mg/ml până la 300 mg/ml,

(b) 100 mM până la 400 mM arginină,

(c) 0,01% g/v până la 0,1% g/v polisorbat 80 şi

(d) o soluţie tampon acceptabilă farmaceutic,

în care formularea farmaceutică are un pH care variază de la 4,5 până la 5,5,

în care anticorpul izolat anti-protofibrilă Aβ este lecanemab şi

în care arginina este arginină, arginină clorhidrat, sau o combinaţie a acestora.

2. Formulare farmaceutică conform revendicării 1, în care anticorpul anti-protofibrilă Aβ izolat este prezent într-o concentraţie de 100 mg/ml până la 200 mg/ml.

3. Formulare farmaceutică conform revendicării 1, în care anticorpul anti-protofibrilă Aβ izolat este prezent într-o concentraţie de 100 mg/ml.

4. Formulare farmaceutică conform revendicării 1, în care anticorpul anti-protofibrilă Aβ izolat este prezent într-o concentraţie de 200 mg/ml.

5. Formulare farmaceutică conform oricăreia dintre revendicările 1-4, care cuprinde, în plus, metionină.

6. Formulare farmaceutică conform oricăreia dintre revendicările 1-5, în care tamponul acceptabil farmaceutic este tamponul citrat, sau tamponul histidină.

7. Formulare farmaceutică conform oricăreia dintre revendicările 1-6, care cuprinde 10 până la 100 mM tampon citrat, sau 10 până la 100 mM tampon histidină.

8. Formulare farmaceutică conform oricăreia dintre revendicările 1-7, care cuprinde 125 până la 350 mM arginină.

9. Formulare farmaceutică conform oricăreia dintre revendicările 1-8, care cuprinde 200 mM arginină, în care arginina este arginină clorhidrat.

10. Formulare farmaceutică conform oricăreia dintre revendicările 1-9, care cuprinde 200 mM arginină, în care arginina este arginină clorhidrat şi 25 mM tampon histidină.

11. Formulare farmaceutică apoasă conform revendicării 1, care cuprinde:

(a) 80 mg/ml până la 240 mg/ml de anticorp izolat anti-protofibrilă Aβ,

(b) 140 mM până la 260 mM arginină clorhidrat,

(c) 0,02% g/v până la 0,08% g/v polisorbat 80 şi

(d) 15 mM până la 35 mM tampon histidină,

în care formularea farmaceutică are un pH care variază de la 4,5 până la 5,5.

12. Formulare farmaceutică apoasă conform revendicării 1, care cuprinde:

(a) 80 mg/ml până la 120 mg/ml de anticorp izolat anti-protofibrilă Aβ,

(b) 240 mM până la 360 mM arginină,

(c) 0,02% g/v până la 0,08% g/v polisorbat 80 şi

(d) 30 mM până la 50 mM tampon citrat,

în care formularea farmaceutică are un pH care variază de la 4,5 până la 5,5,

şi în care arginina este arginină, arginină clorhidrat, sau o combinaţie a acestora.

13. Formulare farmaceutică apoasă conform revendicării 1, care cuprinde:

(a) 100 mg/ml sau 200 mg/ml din anticorp izolat anti-protofibrilă Aβ,

(b) 190 mM până la 210 mM de arginină, arginină clorhidrat, sau o combinaţie a acestora,

(c) 0,04% g/v până la 0,06% g/v polisorbat 80 şi

(d) 15 mM până la 35 mM tampon histidină.

14. Formulare farmaceutică apoasă conform revendicării 1, care cuprinde:

(a) 100 mg/ml de anticorp izolat anti-protofibrilă Aβ,

(b) 200 mM arginină clorhidrat,

(c) 0.05% g/v polisorbat 80 şi

(d) 25 mM tampon histidină.

15. Formulare farmaceutică apoasă conform revendicării 1, care cuprinde:

(a) 200 mg/ml de anticorp izolat anti-protofibrilă Aβ,

(b) 200 mM arginină clorhidrat,

(c) 0.05% g/v polisorbat 80 şi

(d) 25 mM tampon histidină.

16. Formulare farmaceutică apoasă conform oricăreia dintre revendicările 13-15, în care tamponul de histidină este o combinaţie de histidină şi histidină clorhidrat monohidrat.

17. Formulare farmaceutică apoasă conform oricăreia dintre revendicările 13-16, în care formularea farmaceutică are un pH de 5,0.