MD1390Z - Metodă de identificare a markerului anti-Toxocara IgG în serul sangvin - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la medicină, şi anume la o metodă de identificare a markerului anti-Toxocara IgG în serul sangvin şi poate fi folosită pentru diagnosticul toxocarozei umane.Esenţa invenţiei constă în examinarea serului sangvin în testul imunoenzimatic cu utilizarea microplăcii adsorbite cu Ag toxocara canis şi determinarea valorilor densităţii optice a probelor prin metoda fotometrică la lungimea de undă 450 nm, apoi se determină raportul dintre valoarea medie a densităţii optice a serului pacientului x 10 şi valoarea medie a densităţilor optice ale probelor de control negativ, şi dacă raportul este de până la 9 NTU, se consideră că rezultatul este negativ, dacă este mai mare de 11 NTU, rezultatul este pozitiv, iar probele cu rezultatul de 9...11 NTU se prelucrează cu suspensie de caolin de 25%, apoi se repetă testul imunoenzimatic cu determinarea ulterioară a raportului menţionat pentru determinarea rezultatului negativ în cazul când raportul este de până la 9 NTU şi pozitiv dacă este mai mare de 11 NTU.

Description

Invenţia se referă la medicină, şi anume la o metodă de identificare a markerului anti-Toxocara IgG în serul sangvin şi poate fi folosită pentru diagnosticul toxocarozei umane.

Toxocaroza umană constituie o problemă medico-socială de importanţă majoră cu răspândire globală, dar totodată rămâne a fi una dintre cele mai neînţeleasă invazie parazitară la om cu complexe şi diferite probleme ce ţin de diagnostic, tratament şi profilaxie. Este o infecţie produsă de un parazit din genul Toxocara, familia Ascarididae, contactată prin ingestia de sol contaminat cu ouă embrionate, provenite din fecalele animalului gazdă. Contaminarea mediului ambiant cu ouă de toxocara şi igiena defectuoasă a alimentaţiei asigură răspândirea infecţiei. În cazul copiilor, o sursă importantă de infecţie o reprezintă locurile de joacă în care au acces animalele. În ultima perioadă de timp se constată o extindere continuă a infecţiei, inclusiv în ţările în curs de dezvoltare economică, astfel constituind o problemă prioritară şi pentru Republica Moldova (Plăcintă Gheorghe. Monografie: Toxocaroza - problemă actuală a serviciului medical şi sanitar public, Chişinău, 2017, 240 p.)

Tratamentul toxocarozei umane rămâne o chestiune controversă şi nu este în general un consens cu privire la tratamentul specific, în această ordine de idei, actualmente nu există o metodă definitivă de a diagnostica infecţia parazitară cu toxocaroză. Criteriile de vindecare cer a fi stabilite în forme clare clinice, indicatori de imagistică şi de laborator. Strategia optimală de management necesită elaborarea algoritmului de diagnostic, tratament al toxocarozei aplicat în funcţie de activitatea procesului pato-invaziv (Van Den Broucke S., Kanobana K., Polman K., et al. Toxocariasis diagnosed in international travelers at the Institute of Tropical Medicine, Antwerp, Belgium, from 2000 to 2013, in: PLoS Negl.Trop. Dis., 2015; nr. 9).

Medicina clinică contemporană devine vădită prin utilizarea extensivă a tehnologiilor diagnosticului de laborator de înaltă performanţă, care sunt vertiginos implementate în practica medicală (Roldan W.H., Elefant G.R., Ferreira A.W. Deglycosylation of Toxocara excretory-secretory antigens improves the specificity of the serodiagnosis for human toxocariasis. The Journal Parasite Immunology, November 2015, vol. 37, Issue 11, p. 557-567).

Investigaţiile privind nivelul de anticorpi anti-Toxocara IgG una din componentele de bază ale diagnosticului clinic şi realizarea prin metoda de analiză imunoenzimatică pe suport solid, utilizând kiturile de reactivi ai companiei NovaTec (Germania). Complexul imun format din conjugatul legat se vizualizează la adăugarea de tetrametilbenzidină (TMB), substrat care dă un produs de reacţie albastru. Intensitatea produsului obţinut este proporţională cu cantitatea de anticorpi specifici anti-Toxocara canis IgG în specimen. Pentru stoparea reacţiei enzimatice se utilizează stop-reagentul (mai frecvent acidul sulfuric). Detecţia se efectuează fotometric la lungimea de undă 450 sau 620 nm.

Tehnologia testului imunoenzimatic exprimată prin identificarea markerului anti-Toxocara IgG include următoarele etape:

1. Formarea complexului imunologic, urmare a reacţiei imunologice prin suplimentarea cu reagenţi, unde unul conţine markerul enzimatic.

2. Stoparea fazei solide pentru îndepărtarea componentelor nespecifice.

3. Suplimentarea reacţiei enzimatice prin adăugarea soluţiei cromogen/substrat şi stoparea reacţiei cu stop-reagent.

4. Analiza rezultatelor.

5. Evaluarea cu interpretarea rezultatelor obţinute [1].

Dezavantajele soluţiei cunoscute constau în aceea, că actualmente nu există o metodă definitivă de a diagnostica infecţiile cu toxocara, iar sensibilitatea şi specificitatea reală a testelor serologice nu poate fi determinată cu acurateţe. Diagnosticul de laborator este şi mai mult complicat de variabilitatea răspunsului imunologic umoral, care depinde de încărcătură şi localizarea infecţiei. Numeroase studii au demonstrat că testele imunoenzimatice care folosesc un antigen excretor, purificat din stratul larval au o sensibilitate şi specificitate sporită comparativ cu alte teste care utilizează antigenul brut. În contextul celor expuse, totuşi unele probe de ser examinate la prezenţa markerului anti-Toxocara IgG în testul imunoenzimatic (ELISA) demonstrează rezultate echivoce (invalide), urmare a prezenţei în seruri a diferitor factori inhibitori nespecifici care influenţează rezultatele finale ale reacţiei, manifestată prin reducerea specificităţii metodei.

Problema pe care o rezolvă invenţia constă în elaborarea unei noi metode de investigare a serurilor umane la prezenţa markerului anti-Toxocara IgG, pentru sporirea specificităţii şi sensibilităţii testului imunoenzimatic, se efectuează în timp redus de 3,5 ore şi reduce maximal riscul de infectare cu toxocaroză. Aşadar, serurile umane recoltate de la pacienţi cu diagnosticul clinic prezumptiv de toxocaroză, care în testul ELISA au demonstrat rezultate incerte (invalide) se prelucrează cu suspensie de caolin de 25%, pentru înlăturarea inhibitorilor nespecifici, apoi repetat sunt examinate în ELISA.

Esenţa invenţiei constă în examinarea serului sangvin în testul imunoenzimatic cu utilizarea microplăcii adsorbite cu Ag toxocara canis şi determinarea valorilor densităţii optice a probelor prin metoda fotometrică la lungimea de undă 450 nm, apoi se determină raportul dintre valoarea medie a densităţii optice a serului pacientului x 10 şi valoarea medie a densităţilor optice ale probelor de control negativ, şi dacă raportul este de până la 9 NTU, se consideră că rezultatul este negativ, dacă este mai mare de 11 NTU, rezultatul este pozitiv, iar probele cu rezultatul de 9...11 NTU se prelucrează cu suspensie de caolin de 25%, apoi se repetă testul imunoenzimatic cu determinarea ulterioară a raportului menţionat pentru determinarea rezultatului negativ în cazul când raportul este de până la 9 NTU şi pozitiv dacă este mai mare de 11 NTU.

Rezultatul invenţiei constă în sporirea specificităţii şi sensibilităţii testării imunoenzimatice, se efectuează în timp redus de 3,5 ore şi reducerea maximală a riscului de infectare cu toxocaroză.

Metoda propusă include 3 (trei) etape:

1. Investigarea primară a serurilor sanguine umane întru identificarea markerului anti-Toxocara IgG prin testul imunoenzimatic ELISA.

2. Identificarea probelor de ser sanguin care au demonstrat rezultatele incerte cu prelucrarea lor cu soluţie de caolin de 25%

3. Investigarea repetată a probelor de ser prelucrate cu soluţie de caolin de 25% în testul ELISA cu evaluarea şi interpretarea finală a rezultatelor obţinute. În continuare detaliat se prezintă tehnologiile de realizare, caracteristice pentru fiecare etapă.

I etapă

Procedeu manual.

Iniţial se montează numărul necesar de stripuri cu godeuri care sunt absorbite cu Ag toxocara canis în microplaca din trusa destinată pentru realizarea ELISA conform instrucţiunii anexate NovaTec, Immundiagnostica GmbH, NovaLisa Toxocara canis IgG, Product Number TOCG0450 (96 Determinations). Ulterior în godeurile stripurilor montate se picură reagenţii şi probele investigate cu excepţia blancului (A1), în alte 3 godeuri (B1) se picură 100 µl ser uman (control negativ) care nu conţine anti-Toxocara IgG; C1- 100 µl, ser uman slab pozitiv la anti-Toxocara (cut-off); D1 - 100 µl care conţine ser uman cu anti-Toxocara IgG cu titru mai mare de 1000,0 UI/mL (control pozitiv). Proba investigată în volum de 10 µl se diluează în 1000 µl diluant de probă, care conţine fosfat bufer 10 mM, pH 7,2±0,2. Apoi probele diluate în volum de 100 µl se repartizează în stripuri începând cu E1. Striurile pregătite se sigilează cu peliculă şi se incubează timp de o oră la temperatura de +37ºC, apoi se spală în regim automat de 5 ori cu livrarea şi aspirarea a 300 µl per godeu cu soluţie diluată de fosfat, pregătită anterior (1:20), urmează pipetarea a 100 µl de enzimă conjugată, care conţine globulina conjugată cu peroxidază proteina A în fiecare godeu cu excepţia A1, apoi se incubează timp de 30 min la temperatura de 20…25ºC. Ulterior urmează spălarea stripurilor în regim automat de 5 ori cu livrarea şi aspirarea a 300 µl per godeu cu soluţie diluată de fosfat, pregătită anterior (1:20). În continuare se adaugă câte 100 µl Cromogen substrat, care conţine 3,3; 5,5- tetrametilbenzidin TMB în fiecare godeu şi se incubează la temperatura de 20…25°C, timp de 15 min. Reacţia se stopează prin adăugarea a câte 100 µl de acid sulfuric 0,2 mol/L, apoi se determină valorile densităţii optice la lungimea de undă 450 nm, apoi se determină raportul dintre valoarea medie a densităţii optice a serului pacientului x 10 şi valoarea medie a densităţilor optice ale probelor de control negativ şi, în cazul, în care raportul este de până la 9 NTU, se consideră că rezultatul este negativ, dacă este mai mare de 11 NTU rezultatul este pozitiv, iar probele cu rezultatul de 9...11 NTU sunt cu rezultat incert.

Etapa II

Include următoarele proceduri tehnologice.

Absorbţia inhibitorilor nespecifici din probele umane incerte şi anume cu rezultatul de 9...11 NTU, se prelucrează cu suspensie de caolin de 25%. Prelucrarea include următoarea procedură: soluţia de caolin în concentraţie de 25,0% se diluează cu soluţie fiziologică (1:5), apoi urmează prelucrarea a 100 µl ser cu 400 µl de soluţie fiziologică. Ulterior volume identice (1:1) de suspensie de caolin şi ser diluat se toarnă într-o eprubetă, care se incubează la temperatura de 18…25ºC, timp de 30 min, fiind amestecate periodic. Urmează centrifugarea (20 min, 2500 rot/min), după care serul se aspiră şi se păstrează la temperatura de 4 ºC.

Etapa III

După inactivare şi prelucrare cu suspensie de caolin de 25% a probelor de ser incerte (echivoce) pentru evitarea influenţei inhibitorilor nespecifici, probele procesate se analizează repetat în testul ELISA cu produsele trusei de diagnostic de laborator pentru infecţii parazitare cu toxocara a companiei NovaTec, Immunodiagnostica GmbH, NovaLisa, Toxocara canis IgG, Product Number : TOCG0450 (96 Determination).

Pentru argumentarea celor expuse prezentăm datele obţinute (Tabel) privind investigarea a 955 seruri sangvine, recoltate de la pacienţii în vârstă de la 2 până la 75 ani din diferite teritorii administrative ale Republicii Moldova cu diagnosticul clinic prezumptiv de toxocaroză, în baza acordului informat, prin metoda cunoscută şi metoda revendicată pentru identificarea markerului anti-Toxacara IgG. Rezultatele obţinute demonstrează că prin metoda cunoscută markerul anti-Toxacara IgG, utilizând testului ELISA, a fost identificat în 469 (49,1%) de probe recoltate de la pacienţii investigaţi. Pentru bărbaţi acest indicator a constituit 208 (48,6%), iar pentru femei 261 (49,5%). Rezultatele negative au demonstrat absenţa markerului anti-Toxacara IgG în 439 (42,4%) din 955 probe investigate, pentru bărbaţi acest indicator a constituit 197 (46,0%), iar pentru femei 242 (45,9%). Este important de menţionat, că din totalul de probe de 955 examinate cu testul ELISA au fost identificate 47 (4,9%) rezultate incerte: 23 (5,4%) cazuri pentru bărbaţi şi 24 (4,6%) la femei. Evaluarea comporativă a rezultatelor obţinute, demonstrează că nu există o diferenţă semnificativă în indicatorii de incidenţă a markerului anti-Toxacara IgG la bărbaţi şi femei, urmare a realizării metodei cunoscute (p˂0,05).

Utilizarea metodei revendicate pentru probele incerte esenţial modifică rezultatele finale privind identificarea repetată a markerului anti-Toxocara IgG prin testul imunoenzimatic. Urmare a utilizării metodei propuse, ponderea probelor pozitive a rămas nemodificată, rezultatele incerte au dispărut, iar incidenţa probelor negative pentru bărbaţi şi femei a constituit respectiv 51,4% şi 50,5%. Este important de menţionat existenţa unei diferenţe semnificative privind incidenţa probelor negative la markerul anti-Toxocara IgG investigate prin metoda cunoscută - 42,4 % şi cea revendicată - 50,9% (p< 0,01) (Tabel). În ansamblu datele obţinute demonstrează că metoda revendicată elimină rezultatele incerte, astfel semnificativ sporind specificitatea şi sensibilitatea testului.

Tabel

Rezultatele identificării şi evaluării prin ELISA a marcherului anti-Toxocara IgG în serurile sanguine ale pacienţilor cu diagnosticul clinic prezumptiv de toxocaroză, obţinute prin metoda cunoscută şi cea revendicată

Pacienţii în dependenţă de sex Nr. de probe investigate (pacienţi) Identificarea marcherului anti-Toxocara IgG Metoda cunoscută Metoda revendicată Pozitiv Incert Negativ Pozitiv Incert Negativ abs % abs % abs % abs % abs abs % Bărbaţi 428 208 48,6 ± 2,4 23 5,4 ±1,1 197 46,0± 2,4 208 48,6± 2,4 0 220 51,4± 2,4 Femei 527 261 49,5± 2,2 24 4,6 ±0,9 242 45,9± 2,2 261 49,5± 2,2 0 266 50,5± 2,2 Total 955 469 49,1± 1,6 47 4,9 ±0,6 439 42,4± 1,5 469 49,1± 1,6 0 486 50,9 ±1,6

Remarcă: Pacienţii examinaţi din toate teritoriile administrative ale Republicii Moldova au cuprins diapazonul de vârstă de la 2 până la 75 ani.

1. Instrucţiunea de utilizare a testului: NovaTec, Immundiagnostica GmbH, NovaLisa, Toxocara canis IgG. Product Number: TOCG60450 (96 Determination), Waldstrabe 23A6 - 63128, Dietzenbach, Germany, 25 sept. 2017, Găsit: <http://www.elisakits.co.uk/toxocara-canis-igg-elisa-kit>

Claims (1)

1. Metodă de identificare a markerului anti-Toxocara IgG în serul sanguin, care include examinarea serului sangvin în testul imunoenzimatic cu utilizarea microplăcii adsorbite cu Ag toxocara canis şi determinarea valorilor densităţii optice a probelor prin metoda fotometrică la lungimea de undă 450 nm, apoi se determină raportul dintre valoarea medie a densităţii optice a serului pacientului x 10 şi valoarea medie a densităţilor optice ale probelor de control negativ, şi dacă raportul este de până la 9 NTU, se consideră că rezultatul este negativ, dacă este mai mare de 11 NTU, rezultatul este pozitiv, iar probele cu rezultatul de 9...11 NTU se prelucrează cu suspensie de caolin de 25%, apoi se repetă testul imunoenzimatic cu determinarea ulterioară a raportului menţionat pentru determinarea rezultatului negativ în cazul când raportul este de până la 9 NTU şi pozitiv dacă este mai mare de 11 NTU.