KR950005920B1 - 항생물질 tan-749의 제조방법 - Google Patents

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항생물질 TAN-749의 제조방법

제1도∼제3도는 각각 TAN-749A 디히드로클로라이드의 UV 스펙트럼, IR 스펙트럼 및¹³C NMR 스펙트럼을 나타내고, 제4도∼제6도는 각각 TAN-749B 디히드로클로라이드의 UV 스펙트럼, IR 스펙트럼 및¹³C NMR 스펙트럼을 나타내고,

제7도 및 제8도는 각각 TAN-749C 디히드로클로라이드의 UV 스펙트럼 및 IR 스펙트럼을 나타대고,

제9도 및 제10도는 각각 TAN-749D 디히드로클로라이드의 UV 및 IR 스펙트럼을 나타낸다.

본 발명은 세균 감염의 치료약제로서 유리하게 사용할 수 있는 신규의 항생물질 TAN-749(이후에는 때때로 TAN-749로 약칭한다)의 제조방법에 관한 것이다.

TAN-749A 및 C 그리고 TAN-749B 및 D는 각각 일반식, C₁₅H₂₇N₅O₃및 C₁₆H₂₉N₅O₃으로 나타내진다. 비슷한 분자식을 갖는 항생제로는 스트렙토미세스 속에 속하는 미생물에 의해 생산된 류실네가마이신(분자식 : C₁₅H₃₁N₅O₅)이 포함된다[TheJournal of Antibiotics, 24, 732(1971)].

항생제를 이용한 치료학이 개발되었기 때문에, 대부분의 세균성 질병이 극복되고 있다; 그러나, 아직까지도 감염성 질병의 의약 분야에서는 몇가지 중요한 문제점이 있다. 예를 들어, 공지의 항생제를 장기간 또는 많은 양을 사용하게 되면 병원성 세균의 균상이 변화되거나(세균의 대치) 또는 약제-내성 박테리아가 생김으로써(약-내성 취득) 질병이 증가되기도 한다; 자기 면역이 결핍된 사람을 위한 치료가 더욱 요구되고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 새로운 구조 및 새로운 생물학적 활성을 갖는 항생제 또는 그의 합성에 이용되는 중간물질이 요구되고 있다.

본 발명자들은 새로운 항생제를 찾기 위하여 토양으로부터 수많은 세균을 분리해내어 이들을 종류별로 나누고 이들에 의해 생산되는 항생제를 연구한 결과 새로운 항생제를 생산해 내는 몇몇 미생물을 발견하게 되었다. 약제-내성을 갖는 것을 포함하여 그램-양성 및 그램-음성균 모두에 대하여 항균 활성을 갖는 항생제를 생산할 수 있는, 슈도모나스 속에 속하는 이들 미생물은 배지 내에서 이들 미생물을 배양함으로써 배지내에 축적할 수 있다. 본 발명자들은 이 항생제의 물성, 화학적 성질 및 생물학적 특성에 의거하여 이를 분리하여 새로운 항생제임을 증명하였다; 이것은 항생물질 TAN-749로 명명되었다. TAN-749는 4개의 성분으로 이루어져 있다, 이들은 각각 TAN-749A, B, C 및 D로 명명되었다.

본 명세서에서, 항생물질 TAN-749A, B, C 및 D 또는 이들 각각은 일반적으로 항생물질 TAN-749 또는 간단하게 TAN-749로 불리운다.

본 발명자들은 이러한 발견에 기초를 두고 더 연구를 하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 (1) 항생물질 TAN-749A, B, C 및 D 또는 그의 염 및 (2) 하나 또는 그 이상의 항생물질 TAN-749A, B, C 및 D를 생산할 수 있는 슈도모나스 속에 속하는 미생물을 배지에서 배양하여 하나 또는그 이상의 TAN-749A, B, C 및 D를 생산하고 배양 브로쓰에 이들을 축적시킨 후 이들을 수집함을 특징으로 하는 항생물질 TAN-749A, B, C 및 D 또는 그의 염의 제조방법 및 (3) 유효량의 하나 또는 그 이상의 항생물질 TAN-749A, B, C 및 D 및 담체를 함유하는 세균 감염 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용할 수 있는, 항생물질 TAN-749를 생산하는 세균으로는 항생물질 TAN-749를 생산할 수 있는 슈도모나스 속에 속하는 미생물, 예를 들어 슈도모나스 플루오르센스 등이 포함된다. 보다 상세히 설명하면, 일본 나가노현의 시로우마산에서 수집한 식물로부터 분리한 슈도모나스 플루오르센스 YK-437(이후에는 때때로 "균주 YK-437"로 약칭한다)이 포함된다.

균주 YK-437은 다음과 같은 세균학적 특성을 갖는다 :

(a) 형태

24℃에서 5일간 영양 한천 사면 배지 위에서 배양한 후 형태학적 특성을 관찰한다.

세포형태 및 크기 : 간상균, 0 5∼1.0μm×1.5∼4μm

운동성 : 유(편모운동)

포자형성 : 무

그램-염색 : 음성

내산성 : 비내산성

(b) 각종 배지위에서의 성장 상태

24℃에서 1∼14일간 각종 배지 위에서의 성장 상태를 관찰한다

① 영양 한천 판 배양 :

세균의 집락은 무색 투명하며 원형이다.

집락의 표면은 볼록한 구와 비슷하다. 집락의 가장 자리는 구불구불하다. 확산성의 색소는 생산되지 않는다.

② 영양 한천 사면 배양 :

집락은 옷감과 같고, 매우 광택이 나며 불투명하고 무색이다.

③ 영양 브로쓰 배양 :

혼탁한 현탁액 내에서 성장한다. 얇은 껍질을 형성한다. 침전이 형성되지 않는다.

④ 영양 겔라틴 천자 배양 :

주로 상층에서 잘 성장한다. 높은 액화 활성으로 액화한다.

⑤ 리트무스 우유 :

리트무스-환원 활성은 관찰되지 않는다. 펩톤화 활성은 관찰되지만 응집은 관찰되지 않는다.

(c) 생리학적 특성

① 질산염 환원 : -

② 탈질소 작용 : -

③ MR(메틸레드)시험 : -

④ VP(보게스-포르스카우어)시험 : -

⑤ 인돌 생산 : -

⑥ 황화 수소 생산(납 아세테이트 페이퍼) : -

⑦ 녹말 가수분해 ; -

⑧ 시트르산 이용(코젤 시트레이트 배지, 크리스텐젠 시트레이트 배지, 시몬 시트레이트 배지) : +

⑨ 무기 질소원 이용 :

I) 질산칼륨 : +

II) 황산 암모늄 : +

⑩ 색소 생산(킹 A 배지, 킹 B 배지, 만니톨 이스트 추출물 한천 배지) : 킹 B 배지에서 레몬색의 세포내 색소의 생산 및 레몬색의 수용성 색소의 생산 모두가 관찰된다.

킹 A 배지 : 글리세롤 10g, 펩톤 20g, 염화 마그네슘 1.4g, 황산 암모늄 10g, 한천 15g, 증류수 1000ml, pH 7.2

킹 B 배지 : 글리세롤 10g, 펩톤 20g, 인산 수소 칼륨 1.5g, 황산 마그네슘 1.5g, 한천 15g, pH 7.2

⑪ 우레아제 : +

⑫ 옥시다제 : +

⑬ 카탈라제 : +

⑭ 성장 조건 :

I) pH : 4.1∼8.5의 pH에서 성장.

최적 pH는 6.3∼8.2

II) 온도 : 8∼36℃에서 성장.

최적 온도는 11∼24℃.

⑮산소 요구성 : 호기성

O-F(산화-발효)시험[휴.레이프손 법] : 산화성

당으로부터의 산 및 기체 생산 및 그의 이용 :

+ : 이용, ± : 유사이용, - : 이용하지 않음

DNA의 G-C(구아닌-시토신)함량 : 66.4±1.5몰(Tm법)

염화나트륨 내성 : 0∼5%

카르복시메틸 셀룰로스 또는 콜로이달 키딘에 대한 분해활성 : -

한천 또는 아르기네이트에 대한 분해활성 : -

트윈 80에 대한 분해활성 : +

균주 YK-437을 각종 문헌[Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed , International Journal of Systematic Bacteriology, 30, 225∼420(1980)]에 설명되어 있는 세균 종 및 저널에 나타나 있는 일련의 유효 검사와 비교 대조하였다: 다음과 같은 사실, 즉 편모에 의한 운동성을 갖는 호기성 그램-음성 간상균이고, 카탈라제 및 옥시다제 작용을 모두 가지며, DNA의 G+C 함량이 66.4±1.0몰%인 사실에 비추어 볼때 상기 균주가 슈도모나스 속에 속하는 것이라고 생각된다.

상기 문헌, 즉 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology에 따르면 슈도모나스 속은 그 성장인자의 요구성, 폴리-β-히드록시부티레이트의 세포내 축적, DL-아르기닌의 이용성 및 40℃에서의 성장과 같은 특성에 따라 4종류, 즉 I, II, 및 IV로 나뉘어진다.

표 1은 실험에 의해 얻어진 균주 YK-437의 특성을 나타낸다.

[표 1]

[균주 YK-437의 특성]

* +: 양성, - : 음성

* * 스테니어 배지(Journal of General Microbiology 43, 159∼271(1966)사용

*** 소듐 프로피오네이트

**** 소듐 부티레이트

I에 속하는 균주 YK-437이 영양 요구 변이성이 아니며 세포내 탄소 저장원으로서 폴리-β-히드록시부티레이트를 축적하지 않는다는 점에서 적절하다.

10종이 I에 속한다. 균주 YK-437이 플루오로크롬을 생산해 내고 아르기닌-디히드롤라제를 갖고 있기 때문에, 균주 YK-437이 슈도모나스 아에루기노사, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 플루오르센스, 슈도모나스 클로로라피스 및 슈도모나스 아우레오파시엔스 중 어느 하나에 속하리라고 생각된다.

균주 YK-437은 탈질소작용 및 트레할로스 및 게라니올의 이용이라는 점에서 슈도모나스 아에루기노사와 다르고, 겔라틴의 가수분해 및 트레할로스의 이용이라는 점에서 슈도모나스 푸티다와 다르다. 균주 YK-437은 탈질소작용, 리파제-활성 및 탄소원의 이용이라는 점에서 슈도모나스 클로라피스와 다르며, 소르비톨 및 아도니톨의 이용이라는 점에서 슈도모나스 아우레오파시엔스와 다르다.

균주 YK-437의 상술한 특성은 슈도모나스 플루오르센스의 그것과 잘 일치한다. 따라서, 균주 YK-437은 슈도모나스 플루오르센스인 것으로 확인되었으며 슈도모나스 플루오르센스 YK-437로 명명되었다.

슈도모나스 플루오르센스 YK-437은 1985년 6월 7일 이래로 일본국 재단법인 발효 연구소(IFO)에 IFO 14446의 수탁 번호로 기탁되어 있다. 또한 1985년 6월 15일에 일본국 통상 산업성 공업 기술원 미생물 공업기술 연구소(FRI)에 FERM P-8312로 수탁된 상기 미생물은 부다페스트 조약하의 기탁으로 전환되어 FERM BP-1005의 수탁번호로 FRI에 보관되어 있다. 슈도모나스 플루오르센스 YK-437은 1986년 5윌 19일에 KFCC-10203의 수탁번호로 한국 종균 협회(KFCC)에 기탁되었다.

본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 슈도모나스 속에 속하는 세균은 변이 유발소에 대해 매우 민감하여 예를 들면 자외선, X-선 니트로소구아니딘 및 에틸 메탄설포네이트 등의 화학 물질을 이용한 인공 변이에 의해 쉽게 변이될 수 있다; 그러나, 본 발명에 사용할 수 있는 균주로는 TAN-749를 생산할 수 있는 모든 변이종이 포함된다.

TAN-749-생산 세균의 배양에서, 세균에 의해 동화되는 물질을 적절한 탄소원으로 사용할 수 있다 : 글루코스, 말토스, 락토스, 블랙스트랩 당밀, 오일 및 지방(콩기름, 을리브유 등) 및 유기산(시트르산, 숙신산, 글루콘산), 질소원으로는 각종 유기 또는 무기 화합물을 사용할 수 있다 : 콩가루, 면실 분말, 옥수수 침지액, 건조 이스트, 이스트 추출액, 육즙, 펩톤, 우레아, 황산 암모늄, 질산 암모눔, 염화 암모늄 및 인산 암모늄, 보통의 세균 배양에 필수적인 염화나트륨, 염화칼륨, 탄산칼슘, 황산마그네슘, 제일 인산 칼륨 및 제이 인산 칼륨 같은 무기 염을 단독으로 또는 배합하여 적절하게 사용할 수 있다.

황산 제일철 및 황산 제이구리 등의 중금속염 및 비타민 B₁및 비오틴 같은 비타민을 필요에 따라 첨가한다. 실리콘 오일 및 폴리알킬렌 글리콜 에테르 등의 발포 방지제 및 계면 활성제도 가할 수 있다. 세균성장을 도와 결국 TAN-749의 생산을 촉진하는 다른 무기 또는 유기 물질로 첨가할 수 있다.

배양 방법으로는 보통의 항생제 생산 방법을 적용할 수 있다; 고체 및 액체 배양 모두 이용할 수 있다. 액체 배양의 경우, 정상 배양, 진탕 배양, 심부 배양, 호기 배양 중 아무것이나 실시할 수 있다 : 호기성 심부 배양이 특히 바람직하다. 배양 온도는 약 10∼30℃에서 선택할 수 있으며, 약 17∼24℃가 바람직하다. 배지 pH는 약 4∼8에서 선택할 수 있으며 6∼7이 바람직하다. 배양은 약 8∼168시간, 바람직하게는 24∼144시간 동안 실시해야 한다.

배양물로부터 목적 생성물인 TAN-749를 수집하기 위해서는 배양물로부터 미생물에 의해 생성된 대사물질을 수집하기 위해 통상적으로 적용되는 분리방법을 적절하게 이용할 수 있다. 수용성 알칼리 물질처럼 행동하여 주로 배양 여액에 포함되어 있는 TAN-749는 예를 들면 다음과 같은 방법으로 수집할 수 있다. 즉, 필터 에이드를 가한후 배양액을 여과하거나 원심 분리하여 세균 세포를 제거한다. 생성된 여액을 적절한 담체와 접촉시켜 여액내의 생활성 성분이 흡착되도록 한 후, 적절한 용매를 이용하여 유효 성분이 떨어지도록 하여 목적 생성물을 수득한다. 유용한 크로마토그래피성 담체로는 활성탄, 분말 셀룰로스 및 흡착성 수지처럼 흡착력에 차이가 있는 화합물, 양이온 교환 수지, 양이온 교환 셀룰로스 및 양이온 교환 덱스트란 겔처럼 작용기가 다른 화합물 및 덱스트란 겔처럼 분자량에 차이가 있는 화합물 등이 포함된다. 이들 담체로부터 목적 화합물을 용출시키기 위하여 적절하게 병용할 수 있는 용리액으로는 수화 아세톤 및 수화 알코올 같은 수용성 유기 용매의 수화 용액 및 산, 알칼리, 완충액, 유기염 또는 무기염을 함유하는 수용액이 포함되는데, 이때의 배합은 담체의 종류 및 품질에 따라 다양하게 결정된다.

경우에 따라서, 상기 크로마토그래피법에 의해 수득한 항생제-함유 조생성물을 정제된 생성물을 얻기 위해 HPLC하여 분리할 수 있다.

TAN-749를 회수하는 방법은 하기에 더욱 상세히 설명되어 있다. 여액에 함유되어 있는 항균물질은 앰버라이트 IRC-50 및 CG-50(Rohm ＆ Hass Co., 미합중국) 같은 양이온 교환 수지를 이용하여 흡착시킨후 염 또는 산을 함유하는 수용액 또는 완충액을 이용하여 용출시킬 수 있다. 항생제는 또한 CM-세파덱스(Pharmacia Fine Chemicals, Sweden) 같은 양이온 교환 덱스트란 겔에 흡착시킨 후 염 또는 산을 함유하는 수용액 또는 완충액을 이용하여 용출시킬 수 있다. 생성된 용출액으로부터 염 및 유색물질 등을 제거하기 위하여 크로마토그래피용 활성탄(Takeda Chemical Industries Co., Ltd. 일본) 또는 디아이온 HP-20 및 SP-207(Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd. 일본) 및 앰버라이트 XAD-II(Rohm ＆ Hass Co., 미합중국) 등의 흡착성 수지를 사용하는 것이 바람직하다. 용출된 분획은 농축 및 동결 건조를 포함하는 공정을 통하여 분말로 만들어진다. 생성된 분말의 순도가 낮은 경우에는 더 정제하기 위하여 HPLC하는 것이 바람직하다.

HPLC에 사용 가능한 담체에는 TSK 겔(Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. 일본) 및 YMC 겔(Yamamura Chemical Laboratories, 일본)이 포함된다. 이동상으로는 메탄올, 아세토니트릴 등의 혼합용매 및 무기염을 함유하는 수용액 또는 완충액을 사용할 수 있다. TAN-749는 염산, 황산 및 인산 등의 무기산 또는 포름산, 아세트산 및 옥살산 등의 유기산의 염의 형태로 분리된다.

상기 공정 중에 분리된 TAN-749 염은 공지의 방법을 이용하여 유리 TAN-749 화합물로 전환시킬 수 있으며, 상기 유리 화합물은 공지의 방법을 이용하여 상기와 동일한 염으로 전환시킬 수 있다.

후술한 실시예 1에서 수득한 TAN-749A, B, C 및 D의 디히드로클로라이드는 다음의 물리적 및 화학적 성질을 갖는다 :

[1] TAN-749 디히드로클로라이드

(1) 외관 : 무색 고체

(2) 비선광도 :

[α]_D ²⁵= -11°±5°(c=1.06, H₂O)

(3) pKa'값 : 8.0

(4) 분자량 : 326(M+H)⁺, 348(M+Na)⁺(SI-MS법, M은 유리 화합물의 분자량을 나타낸다)

(5) 분자식 : C₁₅H₂₇N₅O₃·2HCl

(6) 원소분석 :

시료를 40℃에서 감압하에 6시간 동안 오산화인에서 건조시킨 후 분석한다(시료에 1몰의 물이 포함되어 있다는 조건하에 계산).

실측치 계산치

C : 43.6±2.0 C : 43.27

H : 7.4±1.0 H : 7.50

N : 17.0±1.5 N : 16.82

O : O : 15.37

Cl : 16.4±15 Cl : 17.03(%)

(7) UV 흡수 스펙트럼(물) :

제1도 참조

λ_max266±3nm(

: 658±100)

(8) IR 흡수 스펙트럼(KBr 법) :

제2도 참조.

주 흡수 파장은 다음과 같다 :

3400, 3100, 1700, 1670, 1550, 1440, 1380, 1340, 1280, 1220, 1150, 1100, 1000, 960, 870, 680(cm^-1)

(9)¹³C NMR 스펙트럼 :

다음 시그날은 D₂O내에서 100MHz에서 측정한 것이다. 제3도 참조

174.7(s), 172.3(s), 171.7(s), 139.3(d), 139.3(d), 129.6(d), 125.3(d), 69.2(d), 49.2(d), 47.8(t), 39.8(t), 39.1(t), 38.1(t), 35.2(t), 16.0(q)ppm.

(s : 단일선, d : 이중선, t : 삼중선, q : 사중선)

(10) 고수율 액체 크로마토그래피(HPLC) :

머무름시간 : R_t=4.4분

컬럼 : YMC-PAK A 312(YamamuraChemical Laboratories)

이동상 : 12% 메탄올/0.01M 인산용액(pH 3)

용출속도 : 2ml/분

(11) 발색반응 :

양성 : 에를리히 반응, 디메틸벤즈알데히드, 과망간칼륨

음성 : 닌히드린, 그레이그-리벡, 사까구찌, 드라겐도르프 반응

(12) 용해도 :

가용성 : 물, 디메틸 설폭시드, 메탄올

난용성 : 아세톤, 에틸 아세테이트, 디에틸 에테르

(13) 산성 또는 염기성 :

중성(유리 화합물은 염기성)

[12] TAN-749B 디히드로클로라이드

(1) 외관 : 무색고체

(2) 비선광도 :

[α]_D ²⁵=-56°±20°(c=1.0, H₂O)

(3) pKa'값 : 8.05

(4) 분자량 : 340(M+H)⁺, 362(M+Na)⁺(SI-MS법)

(5) 분자식 : C₁₆H₂₉N₅O_3ㆍ2HCl

(6) 원소분석 :

TAN-749A 디히드로클로라이드에서와 동일한 조건하에 분석한다(시료안에 1.5몰의 물이 있다는 조건하에 계산)

실측치 계산치

C : 43.62 C : 43.94

H : 7.53 H : 7.37

N : 16.06 : 16.01

O : O : 16.46

Cl : 16.31 Cl : 16.21(%)

(7) UV 스펙트럼(물) :

제4도 참조

λ_max264±3nm(

: 660±100)

제5도 참조

3300, 3100, 1700, 1660, 1610, 1550, 1450, 1420, 1380, 1350, 1280, 1220, 1150, 1070, 1000, 960, 930, 870, 690(cm^-1).

(9)¹³C NMR 스펙트럼 :

100MHz, D₂O에서 측정한다. 제6도 참조

174.7(s), 171.6(s), 139.3(d), 139.2(d), 129.6(d), 125.5(d), 72.6(d), 52.3(d), 49.3(d), 39.9(t), 39.1(t), 37.5(t), 35.2(t), 18.8(q), 16.0(q)(ppm)

(10) HPLC :

머무름시간 : R_t=7.2분

(TAN-749A와 동일한 조건)

(11) 발색 반응 :

TAN-749A 디히드로클로라이드와 동일

(12) 용해도 :

TAN-749A 디히드로클로라이드와 동일

(13) 산성 또는 염기성 :

중성(유기 화합물은 염기성)

3] TAN-749C 디히드로클로라이드

(1) 외관 : 무색고체

(2) 비선광도 :

[α]_D ²³=-11°±5°(c=0.68, H₂O)

(3) 분자량 : 326(M+H)⁺, 348(M+Na)⁺(SI-MS법)

(4) 분자식 : C₁₅H₂₇N₅O₃·2HCl

(5) 원소분석 :

(시료에 0.5몰의 물이 함유되어 있다는 조건하에 계산)

실측치 계산치

C : 44.35 C : 44.23

H : 7.83 H : 7.42

N : 17.28 H : 17.19

O : O : 13.75

Cl : 17.59 Cl : 17.41(%)

(6) UV 스펙트럼(물) :

제7도 참조

λ_max262±3nm(

: 680±100)

(7) IR 스펙트럼(KBr법) :

제8도 참조

3250, 3070, 1660, 1630, 1540, 1430, 1340, 1260, 1200, 1150, 1085, 995, 860, 650(cm^-1)

(8)¹³C NMR 스펙트럼 :

D₂O내 100MHz에서 측정

174.7(s), 172.3(s), 171.6(s), 145.1(d), 1430.(d), 132.0(d), 123.1(d), 69.2(d), 49.2(d), 47.7(t), 39.7(t), 39.1(t), 38.0(t), 35.2(t), 20.6(q)ppm.

(9) 발색반응 :

TAN-749A 디히드로클로라이드와 동일

(10) HPLC :

머무름시간 : R_t=5.7(분)[A : R_t=5.3(분)]

컬럼 : YMC-PAK A312

이동상 : 30% 아세토니트릴/0.01M 옥탄 설포네이트/0.02M 인산 용액(pH 3.0)

유출속도 : 2ml/분

(11) 용해도 :

TAN-749A 디히드로클로라이드와 동일

(12) 산성 또는 염기성 :

중성(유리 화합물은 염기성)

[4] TAN-749D 디히드로클로라이드

(1) 외관 : 무색고체

(2) 비선광도 :

[α]_D ²⁴=+30°±10°(c=0.5, H₂O)

(3) 분자량 : 340(M+H)⁺, 362(M+Na)⁺(SI-MS법)

(4) 분자식 : C₁₆H₂₉N₅O₃·2HCl

(5) 원소분석 :

(시료내에 0.5몰의 물이 함유되어 있다는 조건하에 계산)

실측치 계산치

C : 45.15 C : 45.61

H : 7.98 H : 7.65

N : 16.44 H : 16.62

O : O : 13.29

Cl : 16.59 Cl : 16.83(%)

(6) UV 스펙트럼(물) :

제9도 참조

λ_max262±3nm(

: 655±100)

(7) IR 스펙트럼(KBr법) :

제10도 참조

3250, 3050, 1660, 1635, 1530, 1435, 1345, 1260, 1200, 1150, 995, 860, 650(cm^-1)

(8)¹³C NMR 스펙트럼 :

D₂O내 100MHz에서 측정

174.7(s), 171.7(s), 171.6(s), 145.3(d), 143.0(d), 132.0(d), 123.2(d), 72.5(d), 52.2(d), 49.3(t), 39.9(t), 39.2(t), 37.5(t), 35.3(t), 20.7(q), 18.8(q)ppm.

(9) 발색반응 :

TAN-749A 디히드로클로라이드와 동일

(10) HPLC :

머무름시간 : R_t=6.2(분)[B : R_t=5.8(분)]

(TAN-749C 디히드로클로라이드와 동일한 조건)

(11) 용해도 :

TAN-749A 디히드로클로라이드와 동일

(12) 산성 또는 염기성 :

중성(유리 화합물은 염기성)

상술한 물성 및 화학적 성질로부터, TAN-749A 및 C, 그리고 TAN-749B 및 D가 각각 서로의 입체 이성질체임을 알 수 있다.

TAN-749의 생물학적 특성은 하기에 기술되어 있다.

표 2 및 3은 각종 미생물에 대한 TAN-749A, B, C 및 D(디히드로클로라이드)의 항균 스펙트럼을 나타낸다.

[표 2]

(주1) 배지 조성물

박토-항생제 배지 3(Difco, USA) : 17.5g

박토-이스트 추출액(Difco, USA) : 5.0g

박토-한천(Difco, USA) : 20g

증류수(pH 미조정) : 1,000ml

접종크기 : 약 10⁶CFU/ml의 고리가득.

[표 3]

(주1) 한천 희석법으로 결정

접종크기는 10⁸CFU/ml의 고리 가득한 크기이다.

(주2) TSA(트립티카제 소이 한천; Baltimore Biological Laboratories, USA), B-TSA : 10% 말 혈청/TSA

표 4는 임상학적으로 분리된 스타필로코커스 아우레우스 균주에 대한 TAN-749A 디히드로클로라이드의 항균 활성을 나타낸다.

[표 4]

(주1) 한천 희석법으로 결정

배지 : 뮤엘러 힌톤 배지(Difco, USA)

접종크기 : 10⁶CFU/ml의 고리가득

표 5는 생쥐에서의 감염 질병에 대한 TAN-749A, B, C 및 D(디히드로클로라이드)의 치료 효과를 나타낸다.

[표 5]

표 6은 생쥐에서의 TAN-749A 및 B(디히드로클로라이드)의 예비 급성 독성을 나타낸다.

[표 6]

상기 데이타로부터 TAN-749 및 그 염이 그램-양성균 및 그램-음성균 모두에 대하여 항균 활성을 가지며 포유동물에서의 급성 독성이 낮음을 알 수 있다. 나아가, 여러 종류의 약제-내성균에 대하여 효과적이며 교차 내성을 나타내지 않는다. 따라서, TAN-749 및 그 염은 포유동물(생쥐, 쥐, 토끼, 개, 인간등)내에서의 세균 감염을 치료하기 위하여 사용할 수 있다.

TAN-749 또는 그 염은 다음과 같은 방법으로 치료제로서 사용할 수 있다; TAN-749 또는 그 염을 약학적으로 허용되는 담체와 혼합한다. 예를 들어, 경구제제를 생산하는 경우에는 적절한 양의 결합제(예, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 마크로졸 등), 붕해제(예, 녹말, 카르복시메틸 셀룰로스 칼슘 등), 부형제(예, 락토스, 녹말 등), 윤활제(예, 마그네슘 스테아레이트, 활석 등)등을 사용할수있다.

비경구용 제제, 예를 들어 주사용 제제의 생산에 있어서는 등장제(예, 글루코스, D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등), 방부제(예, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 p-히드록시벤조에이트, 프로필 p-히드록시벤조에이트 등), 완충액(예, 인산 완충액, 소듐 아세테이트 완충액)등을 사용할 수 있다. 이들을 약 1∼50mg/kg/1일, 바람직하게는 약 5∼20mg/kg/1일의 복량으로 피하 또는 근육내 주사하여 상기 포유동물에 비경구 투여할 수 있다. TAN-749 또는 그 염을 경구 투여하는 경우에 약 1∼100mg/kg/1일, 바람직하게는 5∼50mg/kg/1일의 복량의 TAN-749를 캡슐의 형태로 투여할 수 있다.

TAN-749 또는 그 염은 살균제로도 사용가능하다. 예를 들어, TAN-749 또는 그 염을 약 0.01∼0.1w/v%의 농도로 용해시켜 제조한 액체 또는 1g당 약 0.2∼20mg, 바람직하게는 약 1∼10mg의 TAN-749를 함유하는 연고를 손, 발, 얼굴, 귀 등에 도포함으로써 멸균 및 소독할 수 있다.

본 발명의 생성물인 TAN-749A, B, C 및 D는 세균에 의해 생산된 신규의 항생제로서 약제-내성인 것을 포함하여 그램-양성 및 그램-음성균에 대해여 효과적이므로, 임상학적 약제, 예를 들어 세균 감염의 치료제로서 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에서 보다 상세히 설명된다. 배지의 성분 함량은 다른 언급이 없는한 w/v%로 표시된다.

[실시예 1]

강화된 한천 사면 배지위에서 키운 슈도모나스 플루오르센스 YK-437(IFO 14446, FERM BP-1005, KFCC-10203)을 2% 글루코스, 3% 가용성 녹말, 1% 콩가루, 0.3% 옥수수 침지액, 0.5% 폴리펩톤(Daigo Nutritive Chemicals, 일본) 및 0. 3% 염화나트륨을 함유하는 수용액(pH 7.0)에서 0.5% 침전 탄산칼슘을 가하여 제조한 배지 500ml를 함유하는 2ℓ들이 사까구찌 플라스크에 접종시키고, 24℃에서 48시간동안 상호 진탕 배양한다. 생성된 배양 브로쓰 전체를 상기 배지에 0.05% 악트콜(Actcol, Takeda Chemical Ind., 일본), 발포 방지제를 가하여 제조한 30ℓ의 배지를 함유하는 50ℓ들이 발효기에 접종시키고, 24℃의 온도, 30ℓ/분의 공기 공급율 및 200rpm/분에서 48시간동안 배양한다. 생성된 배양 브로쓰 6ℓ를 3% 글리세롤, 0.1% 글루코스, 0.5% 폴리펩톤, 0.5% 육즙(Wako Pure Chemical Ind., 일본), 0.5% 염화나트륨, 0.05% 티오황산 나트륨, 2ppm 염화코발트 및 0.05% 악토콜을 함유하는 배지 120ℓ를 함유하는 200ℓ들이 발효기에 접종시키고 120ℓ/분의 공기 공급율 및 170rpm의 교반하에 24℃에서 66시간 동안 배양한다.

2N 염산을 이용하여 pH 6.5로 조절한 후에, 생성된 배양 브로쓰(105ℓ)를 히플로 수퍼 셀(Johns Manville Product, USA)에 가하고, 여과하여 물로 세척함으로써 여액(102ℓ)을 수득한다. pH 6.5로 조절한 후에 생성된 여액을 IRC-50(Na⁺형, 2ℓ)을 채운 컬럼에 통과시킨다. 컬럼을 물로 세척한 후에 2M 염용액(500ℓ)으로 용출시킨다. 생성된 용출액을 활성탄(2ℓ)으로 채운 컬럼에 통과시키고, 물로 세척한 후에 용리액 8% 이소부탄올-물 용액(15ℓ)으로 용출시킨다. 용출액의 pH를 6.2로 조절한 후에 2ℓ가 되도록 농축시키고, CM-세파덱스 C-25(Na⁺형, 0.5ℓ)를 채운 컬럼에 통과시킨다. 0.1M 염용액(20ℓ)을 이용하여 유효분획을 용출시킨다.

TAN-749B 분획은 크로마토그램의 첫 부분에 나타나며, TAN-749A 분획은 뒷 부분에 나타난다.

각각의 생성된 분획을 활성탄(1.0ℓ 또는 4.0ℓ)을 이용한 크로마토그래피하고, 탈염시킨 후에 농축 및 동결건조함으로써 TAN-749B 조생성물(4.0g) 또는 TAN-749A 조생성물(8.9g)을 수득한다.

조생성물 B(4.0g)를 역상 HPLC하여 분리함으로써[담체 : YMC-PAK S-30(Yamamura Chemical Laboratories, 일본); 이동상 : 8% 메탄올/0.02M 인산용액(pH 3)] 유효분획을 수득한다. 생성된 유효분획을 CM-세파덱스 C-25(Na⁺형, 0.25ℓ)를 이용한 컬럼 크로마토그래피한 후 활성탄(0.3ℓ)을 이용한 컬럼 크로마토그래피함으로써 정제된 분획을 수득한다. 생성된 분획을 농축 및 동결 건조시킴으로써 흰 분말 형태의 TAN-749B 디히드로클로라이드(0.66g)를 수득한다. 조생성물 A(8.9g)를 동일한 방법으로 처리하여 흰 분말 형태의 TAN-749A 디히드로클로라이드(4.7g)를 수득한다.

[실시예 2]

강화된 한천 사면 배지에서 키운 슈도모나스 플루오르센스 YK-437(IFO 14446, FERM BP-1005, KFCC-10203)을 2% 글루코스, 3% 가용성 녹말, 1% 콩가루, 0.3% 옥수수 침지액, 0.5% 폴리펩톤 및 0.3% 염화나트륨을 함유하는 수용액(pH 7.0)에 0.5% 침전 탄산칼슘을 가하여 제조한 배지 500ml를 함유하는 2ℓ들이 사까구찌 플라스크에 접종시키고, 24℃에서 48시간 동안 상호 진탕 배양시킨다. 생성된 배양브로쓰 전체를 상기 배지에 0.05% 악트콜을 가하여 제조한 배지 120ℓ를 함유하는 200ℓ들이 발효기에 접종시키고, 120ℓ/분의 공기 공급율 및 180rpm/분의 조건하에 24℃에서 48시간 동안 배양한다. 생성된 배양 브로쓰 50ℓ를 3% 글리세롤, 0.1% 글루코스, 0.5% 폴리펩톤(Daigo Nutritive Chemicals), 0.5% 육즙(Wako Pure Chemicals 일본), 0.5% 염화나트륨, 0.05% 티오황산나트륨, 2ppm 염화 코발트 및 0 .05% 악트콜을 함유하는 배지 1,200ℓ를 함유하는 2,000ℓ들이 발효기에 접종시키고 1,200ℓ/분의 공기 공급율 및 150rpm의 교반하에 24℃에서 66시간 동안 배양한다.

수득한 배양 브로쓰(1,150ℓ)를 pH 6으로 조절한 후 히플로 수퍼 셀(Johns Manville Product, USA)에 가하고, 여과하여 물로 세척함으로써 여액(1,220ℓ)을 얻는다. 생성된 여액을 pH 6.2로 조절하고 IRC-50(Na⁺형, 20ℓ)으로 채운 컬럼에 통과시킨다. 컬럼을 물로 세척한 후, 0.5N 염산 용액(200ℓ)으로 용출시킨다. 생성된 용출액을 pH 5.6으로 조절한 후, 디아이온 SP-207(20ℓ)로 채운 컬럼에 통과시키고 물(120ℓ)로 용출시킨다. 생성된 용출액을 2ℓ로 농축시키고, 농축액을 CG-50(NH₄ ⁺형,3ℓ)으로 채운 컬럼에 통과시킨다. 0.4∼0.6M 염용액(40ℓ)을 이용하여 유효분획을 용출시킨다.

TAN-749A ,B, C 및 D는 크로마토그램의 첫번째 부분에 나타나고 TAN-749A 분획은 뒷 부분에 나타난다.

생성된 각각의 분획을 활성탄(1.2ℓ 또는 2.0ℓ)을 이용한 크로마토그래피하고, 8% 이소부탄올-물 용액(4ℓ 또는 10ℓ)으로 용출시킨다. TAN-749A만을 함유하는 분획을 농축 및 동결 건조시킴으로써 TAN-749A(47.5g)를 수득한다.

TAN-749A, B, C 및 D를 함유하는 분획으로는, 상기와 같은 방법으로 수득한 분획 3로트(최초의 배양 브로쓰 3,450ℓ에 해당한다)를 농축시킨다. 생성된 농축물(2ℓ)을 CG-50(NH₄ ⁺형, 3ℓ)을 이용한 컬럼크로마토그래피한다. 컬럼을 0.2M 염용액으로 세척한 후, 0.5∼0.8M 염용액으로 용출시킨다.

TAN-749B 및 D를 함유하는 분획은 크로마토그램의 첫째 부분에 나타나며, TAN-749A 및 C를 함유하는 분획은 뒷 부분에 나타난다. TAN-749A 및 C를 함유하는 분획을 활성탄을 이용한 크로마토그래피한다. 생성된 용출액을 농축시키고 동결건조시킴으로써 소량의 TAN-749C를 함유하는 TAN-749A 분말(20g)을 수득한다.

TAN-749B 및 D를 함유하는 분획을 활성탄을 이용한 크로마토그래피하고 탈염시킨다. 생성된 용출액을 CM-세파덱스 C-25(Na¹형, 1ℓ)를 이용한 컬럼 크로마토그래피하고 0.2M 염용액으로 용출시킨다. 생성된 용출액을 농축시킨다. 생성된 농축물을 역상 HPLC[담체 : ODS, YMC-PAK S-30, 이동상 : 5% 메탄올/0.02M 인산용액(pH 3.0)]하여 두 분획, 즉 TAN-749B만을 함유하는 분획 및 TAN-749B 및 D를 함유하는 분획으로 나눈다. TAN-749B만을 함유하는 분획을 CM-세파덱스를 이용한 크로마토그래피하고 다음에 활성탄을 이용한 크로마토그래피함으로써 TAN-749B(3 .05g)를 수득한다. TAN-749B 및 D를 함유하는 분획을 농축시킨 후 다시 HPLC한다.

TAN-749D만을 함유하는 생성된 분획을 농축시킨다. 생성된 농축물을 IRA-402(C1^-형, 10ml)로 채운 컬럼에 통과시키고, 컬럼을 물로 세척한다. 용출액을 활성탄을 이용한 크로마토그래피하여 탈염시킴으로써 TAN-749D(15.5mg)를 수득한다.

상기에서 수득한, 소량의 TAN-749C를 함유하는 TAN-749A 분말(3g)를 차례로 CM-세파덱스, CG-50 및 활성탄을 이용한 크로마토그래피함으로써 TAN-749C 함량비를 증가시킨다. 높은 함량의 TAN-749C를 함유하는 생성된 분말을 상기와 같은 조건하에서 두번 HPLC하여 정제함으로써 TAN-749C(20.2mg)를 수득한다.

[실시예 3]

캡슐

(1) TAN-749A 300mg

(2) 락토스 28mg

(3) 옥수수 녹말 58mg

(4) 히드록시 프그필 셀룰로스 12mg

(5) 마그네슘 스테아레이트 2mg

400mg/ 캡슐

상기 성분(1), (2), (3) 및 (4)를 혼합하고 공지의 방법으로 과립화한다. 과립에 성분(5)를 가한다. 혼합물을 겔라틴 캡슐 1(Pharmacopoeia of Japan, 10th ed. 참조)에 팩킹한다.

[실시예 4]

20g의 TAN-749B를 1ℓ의 증류수에 용해시킨다. 50g의 만니톨을 넣고 용해시킨 후에, 여과하여 멸균시키고 2ml씩의 용액을 앰플에 쏟아 붓는다. 이를 동결건조하고, 밀봉하여 앰플을 만든다. 사용시에는 상기 앰플을 개봉하여 2ml의 생리 식염수에 용해시킴으로써 피하 또는 근육내 주사제를 제조한다.

Claims (3)

1. 하나 이상의 항생물질 TAN-749A, B, C 및 D를 생산할 수 있는 슈도모나스 속에 속하는 미생물을 배지 내에서 배양하여 배양 브로쓰 내에 하나 이상의 항생제 TAN-749A, B, C 및 D를 생산 및 축적시킨후에 이를 회수함을 특징으로 하는 항생물질 TAN-749A, B, C 및 D 또는 이들 염의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 미생물이 슈도모나스 플루오르센스임을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 미생물이 슈도모나스 플루오르센스 YK-437(FERM BP-1005, KFCC-10203)임을 특징으로 하는 방법.

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