HU197768B

HU197768B - Process for producing antibiotics tan-749 and pharmaceutical compositions comprising such compounds as active ingredient

Info

Publication number: HU197768B
Application number: HU862550A
Authority: HU
Inventors: Setsuo Harada; Hideo Ono
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1985-06-18
Filing date: 1986-06-17
Publication date: 1989-05-29
Also published as: ATE81870T1; KR950005920B1; EP0206068A2; HUT44079A; CA1282722C; DK283186A; DE3687016T2; CN86104019A; DK283186D0; DE3687016D1; EP0206068B1; JPS62258394A; ES8707708A1; KR870000420A; JPH0639479B2; ES556136A0; EP0206068A3

Description

A találmány tárgya eljárás az új, TAN-749 jelölésű antibiotikumok (a továbbiakban rövidítve TAN-749) és hatóanyagként a fenti vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására. A TAN-749 baktériumellenes hatása következtében gyógyszerkészítmények hatóanyagaként baktériális fertőzések kezelésére használható.

A TAN-749A és C és TAN-749B és D a C₁₅H₂₇N₅O₃, illetve C₁₆H₂₉N₅O₃ összegképlettel jellemezhető. Hasonló összegképletű antibiotikum a leucilnegamicin (C|₅H₃₁ N₅O₅), amelyet a Streptomyces nemzetségbe tartozó mikroorganizmus termel [The Journal of Antiblotics, 24, 732 (1971)].

Az antibiotikumokat alkalmazó terápia fejlődésének eredményeként a legtöbb bakteriális eredetű betegség gyógyítható, mégis vannak jelentős problémák a fertőző betegségek gyógyításának területén. így a hagyományos antibiotikumokkal végzett, túl hosszú időn át tartó, vagy túl nagy dózisokat alkalmazó gyógykezelés megváltoztatja a kórokozó baktérium-flórát (baktériumok kicserélődése), vagy gyógyszer-rezisztens baktériumok megjelenéséhez vezet (gyógyszer-rezisztencia megjelenése) aminek következtében a betegségek száma növekszik, és az autoimmunitással nem rendelkező betegek számára új terápeutikumok szükségesek. Az új szerkezettel és ezáltal új biológiai aktivitással rendelkező antibiotikumok, vagy az ezek előállításához felhasználható új köztitermékek kutatása szükséges e probléma megoldásához.

Üj antibiotikumok feltalálására irányuló kutatásaink során a talajból számos baktériumtörzset izoláltunk, majd ezeket szétválasztottuk és antibiotikum-terpielés szempontjából megvizsgáltuk. Azt tapasztaltuk, hogy néhány mikroorganizmus új antibiotikumot termel. Ezek a mikroorganizmusok a Pseudomonas nemzetségbe tartoznak, és képesek Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok — beleértve a gyógyszer-rezisztens törzseket is — elleni hatással rendelkező antibiotikumot termelni és azt a tenyésztés során a tenyészetben felhalmozni. A fenti antibiotikumot elválasztottuk és fizikai, kémiai és biológiai tulajdonságai alapján megállapítottuk, hogy az új antibiotikum; TAN-749-nek neveztük el. A TAN-749 négy komponensből áll, ezeket TAN749A, B, C, illetve D-nek nevezzük.

A leírásban TAN-749 alatt a TAN-749A, B, C vagy D antibiotikumot, vagy ezek elegyeit értjük.

A fenti eredmények alapján további vizsgálatokat végeztünk a találmány tökéletesítése céljából.

A találmány tárgya tehát eljárás a TAN749A, B, C és D antibiotikumok, és ezek savaddíciós sói előállítására, oly módon, hogy a Pseudomonsas nemzetségbe tartozó, TAN749 A, B, C vagy D antibiotikumok, vagy ezek elegyei termelésére képes mikroorganizmuso2 kát tápközegben tenyésztünk, majd a tápközegben felhalmozódott TAN-749A, B, C vagy D antibiotikumot, vagy ezek elegyét a tápközegből kinyerjük.

A találmány tárgya továbbá eljárás bakteriális fertőzések kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására, oly módon, hogy a TAN-749A, B, C vagy D antibiotikum, vagy azok elegyeinek gyógyászatilag hatásos mennyiségét a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverjük és gyógyászati készítménnyé formáljuk.

A találmány szerinti eljárásban TAN-749 antibiotikumot termelő mikroorganizmusként a Pseudomonas nemzetségbe tartozó, TAN749 termelésre képes mikroorganizmust használhatjuk, vagyis Pseudomonas fluorescenst, közelebbről, a Pseudomonas fluorescens YK437 törzset (melyet a továbbiakban YK-437nek nevezünk röviden), amelyet a Shirouma hegységben (Nagano Prefecture, Japán) gyűjtött növényből izoláltunk.

Az YK-437 törzs az alábbi bakteriológiai tulajdonságokkal rendelkezik.

(a) Morfológia

A morfológiai tulajdonságokat ferde tápagaron, 24°C-on 5 napon át végzett inkubálás után vizsgáljuk.

A sejt formája és mérete: pálcika, 0,5—

1,0 pmXl,5—4 μιη

Mozgékonyság: megfigyelhető (ostoros)

Spóraképzés: nincs

Gram-festés: negatív

Savállóság: nem saválló (b) Szaporodás különféle tápközegekben

A szaporodást különféle tápközegekben

24°C-on 1 —14 napon át figyeljük.

1) Tápagar lemez tenyészet:

a telepek színtelenek, áttetszők és köralakúak;

a telepek felülete fejszerü — domború gömb;

a telep határa hullámos;

nincs diffundálható pigment-képződés.

2) Tápagar ferde tenyészet:

a telepek szövetszerűek, erősen fényiének, nem átlátszóak és színtelenek.

3) Folyékony tápközeg: .

zavaros szuszpenzióban szaporodik; vékony hártyát képez; nem észlelhető kicsapódás.

4) Tápzselatinos szúrt tenyészet:

jó növekedés, főleg a felső részen; a táptalajt nagy aktivitással elfolyósítja.

5) Lakmusz-tej:

nem észlelhető lakmusz-redukáló aktivitás; peptonizáló aktivitás megfigyelhető, de koaguláció nem.

(c) Fiziológiai jellemzők

1) Nitrát-redukció: negatív

2) Denitrifikálás: negatív

3) Metil-vörös próba: negatív

4) Voges-Proskauer próba: negatív

5) Indol-képződés: negatív

-2197768

6) Hidrogén-szulíid-képződés (ólom-acetátos papír): negatív

7) Keményítő-hidrolízis: negatív

8) Citromsav-hasznosítás (Kosel-féle citrátos tápközeg, Christensen-féle citrátos tápközeg, Simmons-féle citrátos tápközeg): pozitív

9) Szervetlen nitrogén-forrás hasznosítás:

I) Kálium-nitrát: pozitív

II) Ammónium-szulfát: pozitív

10) Pigment-képződés (King-féle A-tápközeg, King-féle B-tápközeg, mannit-élesztőkivonat-agar tápközeg): citromsárga intracelluláris pigment-képződés és citromsárga vízoldható pigment-képződés figyelhető meg King-féle B-tápközegben.

King-féle A-tápközeg: 10 g glicerin, 20 g pepton, 1,4 g magnézium -klorid, 10 g ammónium-szulfát, 15 g agar, 1000 ml-re desztillált vízzel, pH 7,2

King-féle B-tápközeg: 10 g glicerin, 20 g pepton, 1,5 g kálium-monohidrogén-íoszfát, 1,5 g magnézium-szulfát, 15 g agar, PH ⁷·2

11) Ureáz: pozitív

12) Oxidáz: pozitív

13) Kataláz: pozitív

14) Szaporodási feltételek:

I) pH : 4,1—8,5 pH-tartományban szaporodik; optimális pH-tartomány: 6,3—8,2;

II) hőmérséklet; 8—36°C hőmérsékle15 ten szaporodik;

optimális hőmérséklet-tartomány; 11—24°C.

15) Oxigén-igény: aerob

16) Oxidációs fermentációs teszt (Hugh20 -Leifson módszer): oxidatív

17) Sav- és gázképződés cukrokból, és azok hasznosítása:

Sav Gáz Hasznosítás (pepton-víz) (pepton-víz) (Davis-tápközeg)

L-arabinoz + - +

D-xiloz + - +

D-glükoz + - +

D-mannoz + - +

D-fruktoz - - +

D-galaktoz + - +

Maltoz - - +

Szacharóz + - +

Laktoz - - +

Trehaloz - - +

D-szorbit - - +

D-mannit +

Lnozit - - +

Glicerin - - +

Keményít# + (+: pozitív: + gyengén pozitív:

negatív)

18) DNS guanin -j- citozin tartalma: 66,4± ±l,5mól% (T_f„-módszer)

19) Nátrium-klorid tűrés: 0—5%

20) Karboxi-metil-cellulóz vagy kolloidális kitin lebontó aktivitás: negatív

21) Agar vagy arginát lebontó aktivitás: negatív

22) Tween 80 lebontó aktivitás: pozitív

Az YK-437 törzset a Bergey’s Manual oí Determinative Bacteriology (8. kiadás) vagy az International Journal of Systematic Bacteriology [30, 225—420 (1980)] irodalmi helyeken ismertetett baktérium fajokkal, és az utóbbi folyóiratban közölt azonosító táblázatokkal összevetve azt találtuk, hogy a törzs a Pseudomonas nemzetségbe tartozik, a fenti megállapítást az alábbi jellemzőkre alapoztuk: aerob, Gram-negatív pálcika, amely ostorosán mozog, és mind kataláz, mind oxidáz aktivitással rendelkezik, továbbá guanin -j- eitozin tartalma a DNS-ben 66,4±l,0 mól%.

A Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology szerint a Pseudomonas nemzetség négy csoportra osztható (I., II., III, és IV. csoport) növekedési faktor igénye, a poli-βθθ -hidroxi-butirát sejten belüli felhalmozódása, a DL-arginin hasznosítása és a 40°C-on való szaporodás alapján.

Az YK-437 törzs jellemzőit a fenti szempontból vizsgálva az 1. táblázatban foglal65 juk össze.

1977()8

Vizsgálat fajtája	Eredmény*
Ροΐί-β-hidroxi-butirát
felhalmozódás	—
Argin in-dihid roláz	+
Pigment-képződés
King-féle A-tápközeg	—
King-t’éle B-tápközeg	+
Denitrifikálás	—
Lipáz (Tween 80) aktivitás	—
Zselatin hidrolízis	+
Ροΐί-β-hidroxi-butirát
hidrolízis	—
Szén-források hasznosítása**
trehalóz	4
szacharóz	4~
L-arabinóz	+
propionát***	—
butirát****	—
szorbit	+
adonit	+
propi léngli kol	—
etanol	—

**: Stainer-féle tápközeget használva [Jour nal of General Microbiology 43, 159— 271 (1966] ***: nátrium-propionát ****: nátrium-butirát

A fenti eredmények alapján megállapítottuk, hogy az YK-437 törzs az I. csoportba tartozik, mivel a törzs nem mutat auxotrófiát és nem halmozza fel a poli-β-hidroxi-butirátot intracelIuIáris szén-tartalékként.

Az I. csoportba tíz faj tartozik. Mivel az YK-437 törzs íluorokrómot termel és arginin-hidroláz aktivitással rendelkezik, úgy véltük, hogy a törzs a Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis vagy Pseudomonas aureofaciens fajok egyikébe tartozik.

Az YK-437 a Pseudomonas aeruginosától a denitrifiká 1 ás és a trehalóz és gerániol hasznosítása tekintetében, a Pseudomonas putidától a zselatin hidrolízise és a trehalóz hasznosítása szempontjából különbözik. Az YK437 törzs a Pseudomonas chlororaphistol a denitrifikálás, a lipáz aktivitás és a szén-források hasznosítása szempontjából, míg a Pseudomonas aureofacienstől a szorbit és az adonit hasznosítása szempontjából különbözik.

Az YK-437 fent ismertetett jellemzői jó egyezést mutatnak a Pseudomonas fluorescens jellemzőivel. Ennek alapján az YK-437 törzset mint Pseudomonas fluorescenst azonosítottuk, és Pseudomonas fluorescens YK437-nek neveztük el.

A Pseudomonas fluorescens ΥΚ-437-et az Institute fór Fermentation-nél (IFO, Osaka, Japán) helyeztük letétbe 1985. junius 7-én, IFO 14446 szám alatt.

A fenti mikroorganizmust 1985. június 15-én a Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, 4

Ministry of International Trade and Industrynál (Japán) is letétbe helyeztük, FERMP-8312 szám alatt, majd a letétbe helyezett törzset a Budapesti Szerződésben előírt letétté alakítottuk, és az FRI-nél FERM BP-1005 szám alatt tartjuk fenn.

A Pseudomonas nemzetségbe tartozó baktériumok, amelyeket a találmány szerinti eljárásban is használunk, általában igen érzékeny mutagénekre, így például mesterségesen, ultraibolya fénnyel, röntgensugárzással, kémiai vegyületekkel — például nitrozo-guanidinnel vagy etil-metán-szulfonáttal, stb. — kezelve könnyen előállíthatjuk különféle variánsait, ezért a találmány szerinti eljárás minden TAN-749 termelésre képes variáns alkalmazását magában foglalja.

A ΤΑΝ-749-et termelő baktériumok tenyésztésére a baktériumok által hasznosítható szénforrásként például glükózt, maltózt, laktózt, melaszokat, olajat és zsírokat — például szójaolajat, .olívaolajat, stb. — és szerves savakat — például citromsavat, borostyánkősavat, glükonsavat, stb. — használhatunk. Nitrogénforrásként különféle szerves vagy szervetlen nitrogénvegyületeket használhatunk, például szójabab-lisztet, gyapotmag-port, kukoricalekvárt, szárított élesztőt, élesztőkivonatot, húskivonatot, peptont, karbamidot, ammónium-szulfátot, ammónium-nitrátot, ammónium-kloridot, és ammónium-foszfátot. Szervetlen sókat, például nátrium-kloridot, kálium-kloridot, kalcium-karbonátot, magnézium-szulfátot, kálium-dihidrogén-foszfátot, dikálium-hidrogén-foszfátot — amelyek a baktérium-tenyészetekben általában szükségesek — szintén használhatunk, külön-külön, vagy egymással kombinálva.

A táptalajhoz kívánt esetben nehézfémsókat, például vas(II)-szulfátot vagy réz-szulfátot, és vitaminokat, például B, vitamint és biotint is adhatunk. A táptalajhoz kívánt esetben habzásgátló anyagként például szilikonoiajat vagy polialkilénglikol-étert, és felületaktív szereket is adhatunk. Más szerves vagy szervetlen anyagokat is alkalmazhatunk, amelyekkel a baktérium szaporodását és így a TAN-749-termelést elősegíthetjük.

A tenyésztést az antibiotikumok előállítására szokásosan alkalmazott eljárásokkal végezhetjük; szilárd és folyékony tenyészeteket egyaránt alkalmazhatunk. Folyékony tenyészetek esetén nyugvó tenyészetet, rázott tenyészetet, merített tenyészetet, levegőztetett tenyészetet, stb. alkalmazhatunk, legelőnyösebb a levegőztetett, merített tenyészet. A tenyésztési hőmérséklet 10 és 30°C között változhat, az inkubálást előnyösen 17 és 24°C közötti hőmérsékleten végezzük. A tápközeg pH-értéke 4 és 8 között változhat, előnyösen közel 6 és 8 közötti pH-értéken dolgozunk. A tenyésztést közel 8—168 órán át, előnyösen közel 24—144 órán át végezzük.

-4197768

A TAN-749 antibiotikumot a tenyészetből a mikrobák által termelt metabolitok elválasztására szokásosan alkalmazott eljárásokkal nyerhetjük ki. A ΤΑΝ-749-et például — amely vízoldható, bázikus anyag, és így főleg a tenyészet szürletében található — az alábbi eljárással nyerhetjük ki a tenyészetből.

A folyékony tenyészethez szűrési segédanyagot adunk, majd a tenyészetből szűréssel vagy centrifugálással eltávolítjuk a baktérium-sejteket. Az így kapott szürlethez megfelelő hordozóanyagot adunk, a biológiailag aktív komponensek adszorbeálása céljából, majd az aktív komponenseket megfelelő oldószerrel eluálva a terméket elválasztjuk és visszanyerjük.

Előnyösen alkalmazható kromatográfiás hordozóanyagként olyan anyagokat említhetünk, amelyek alkalmazásakor az anyagok elválasztását azok eltérő adszorbeálódó képességét — például aktívszén, cellulózpor vagy adszorpciós gyanták — vagy a funkciós csoportokban mutatkozó eltéréseket — például kationcserélő gyanták, kationcserélő cellulóz vagy kationcserélő dextrán-gél — vagy az eltérő molekulatömegeket — például dextrán-gél — hasznosítva érjük el.

A kívánt vegyületeket a hordozóanyagról megfelelő kombinációban alkalmazott eluensekkel eluálhatjuk. Eluensként például vízoldékony szerves oldószerek hidratált oldatait — így hidratált acetont vagy hidratált alkoholokat —, savakat, bázisokat, puffereket, szerves vagy szervetlen sókat tartalmazó vizes oldatokat használhatunk, az eluens öszszetétele a hordozóanyag típusától és anyagi minőségétől függ.

Bizonyos esetekben a kromatográfiás eljárással kapott antibiotikum-tartalmú nyersterméket további tisztítás céljából nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárásnak vethetjük alá.

A TAN-749 kinyerésére szolgáló eljárásokat részletesebben alább ismertetjük. A szőriéiben lévő antibakteriális hatású anyagokat kationcserélő gyantákon — például Amberlite IRC-50 vagy CG-50 (Rohm and Haas Co., USA) — adszorbeálhatjuk majd sókat vagy savakat tartalmazó vizes oldatokkal vagy pufferoldatokkal eluálhatjuk. Az antibiotikumokat kationcserélő dextrán-gélen — például CS-Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals, Svédország) is adszorbeálhatjuk, majd sókat vagy savakat tartalmazó vizes vagy pufferoldatokkal eluálhatjuk. A kapott eluátumból a sókat és a színezőanyagokat előnyösen aktívszénnel (Takeda Chemical Industries Co., Ltd., Japán) kromatografálva, vagy adszorpciós gyantákkal — például Diaion HP-20 vagy SP-207 (Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd., Japán) vagy Amberlite XAD-Π (Roam and Herth Co., USA) — távolíthatjuk el. Az eluált frakciókat liofilizálással vagy koncentrálással porrá alakítjuk. Ha a kapott por kis tisztaságú, további tisztítás8 ra előnyösen nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárást használunk. A nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárásban hordozóanyagként például TSK-gélt (Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd., Japán) vagy YMC-gélt (Yamamura Chemical Laboratories, Japán) használunk. Mozgó fázisként például metanol, acetonitril, stb. és szervetlen sókat tartalmazó vizes vagy pufferoldatok elegyeit használhatjuk. A ΤΑΝ-749-et ásványi savval — például hidrogén-kloriddal, kénsavval vagy foszforsavval —, vagy szervetlen savval — például hangyasavval, ecetsavval vagy oxálsavval — alkotott sója formájában választjuk el.

A fenti eljárás termékeként kapott TAN-749-sókat szokásos módon szabad TAN-749 antibiotikummá alakíthatjuk, és a szabad formában lévő ΤΑΝ-749-et szintén hagyományos módon újra sóvá alakíthatjuk.

Az 1. és 2. példa szerint előállított TAN-749A, B, C és D di(hidrogén-klorid)-sóinak fizikai és kémiai tulajdonságait az alábbiakban foglaljuk össze.

(I) TAN-749A-di(hidrogén-klorid) (1) Megjelenés: színtelen, szilárd anyag (2) Fajlagos forgatóképesség:

[a]p⁵=—11 ±5° (c=l,06, vízben) (3) pKsat, érték: 8,0 (4) Móltömeg: 326 (M+H)+, 348 (M+Na) + (Sl-MS módszer, M a szabad vegyület móltömegét jelenti) (5) összegképlet: C_I5H₂₇N₃O₃.2HC1 (6) Elemanalízis:

az analízist megelőzően a mintákat foszfor-pentoxid felett 40°C-on, csökkentett nyomáson 6 órán át szárítjuk (a számításnál feltételezzük, hogy a mintában 1 mól víz van) talált: számított:

C=43,6±2,0% C=43,27%

H=7,4±l,0% H=7,50%

N=17,0±l,5% N=16,82%

0= — 0-15,37%

0=16,4± 1,5% Cl=17,03% (7) Ultraibolya (UV) abszorpciós spektrum (vízben): 1. ábrán látható;

k_max: 266±3 nm (E)7_m=658± 100) (8) Infravörös (IR) abszorpciós spektrum (KBr-módszer): 2. ábrán látható;

a fő abszorpciós huliámszámok az alábbiak:

3400, 3100, 1700, 1670, 1550, 1440, 1380, 1340, 1280, 1220, 1150, 1100, 1000, 960, 870, 680 (cm¹) (9) ¹³C-Magmágneses rezonancia (NMR) spektrum:

az alábbi jeleket D₂O-ban mérjük, 100 MHz-en; a spektrum a 3. ábrán látható; 174,7(s), 172,3(s), 171,7(s), 139,3(d), 139,3(d), 129,6(d), 125,3(d), 69,2(d), 49,2(d), 47,8 (t), 39,8 (t), 39,1 (t), 38,1 (t) 35,2(t), 16,0(q) (ppm) (rövidítések: s:szingulett, d:dublett, t: :triplett, q, kvadruplett)

-5197768 (10) Nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) vizsgálat;

retenciós idő: R₍=4,4 (perc) oszlop: YMC-PAKA312 (Yamamura Chemical Laboratories) mozgó fázis: 12% metanol/0,01 mól/1 foszforsavoldat (pH 3) átfolyási sebesség: 2 ml/perc (11) Színreakció:

pozitív: Ehrlich-reakció, dimetil-benzaldehid, kálium-permanganát negatívminhidrin, Greig-Leaback-, Sakaguchi-, Dragendorff-reakció (12) Oldhatóság:

oldódik: vízben, dimetil-szulfoxidban, metanolban kissé oldódik: acetonban, etil-acetátban, dietil-éterben (13) Savas vagy bázikus jelleg:

neutrális (szabad formában bázikus) (II) TAN-749B-di(hidrogén-klorid) (1) Megjelenés: színtelen, szilárd anyag (2) Fajlagos forgatóképesség:

[a]p =+56±20° (c=l,0, vízben) (3) pKsov érték: 8,05 (4) Móltömeg: 340 (M+H)+, 362 (M+ -)-Na) ⁺ (SI-MS módszer) (5) összegképlet: C|₆H₂₉N₅O₃.2HC1 (6) Elemanalízis:

az elemzést a TAN-749A-di (tiidrogéri-klorid)-éval azonos körülmények között végezzük (a számításnál feltételezzük, hogy a minta 1,5 mól vizet tartalmaz) talált: számított:

C =43,62% C =43,94%

H =7,53% H =7,37%

N =16,06% N =16,01%

O = — 0=16,46%

Cl=16,31% 0=16,21% (7) UV-spektrum (vízben):

4. ábrán látható;

λ_Μαν: 264 ±3 nm (E, „7=660 ± 100) (8) IR-spektrum (KBr-módszer):

5. ábrán látható;

3300, 3100,1700, 1660, 1610, 1550, 1450, 1420, 1380, 1350, 1280, 1220, 1150, 1070, 1000, 960, 930, 870, 690 (cm^-1) (9) ^l3C-NMR-spektrum (D₂O, 100 MHz):

6. ábrán látható;

174,7(s) 171,6(s), 139,3(d), 139,2(d), 129,6(d), 125,5(d), 72,6(d), 52,3(d), 49,3(d), 39,9(t), 39,1 (t), 37,5(t), 35,2(t) 18,8(q), 16,0(q) (PPm) (10) HPLC:

retenciós idő: R₍=7,2 (perc) (vizsgálati körülmények azonosak a TAN-749A-éval) (11) Színreakció:

azonos a TAN-749A-di(hidrogén-klorid)éval (12) Oldhatóság:

azonos a TAN-749A-di(hidrogén-klorid)éval (13) Savas vagy bázikus jelleg:

semleges (szabad formában lévő vegyűlet bázikus) (III) TAN-749C-di(hidrogén-klorid) (1) Megjelenés: színtelen, szilárd anyag (2) Fajlagos íorgatóképesség:

[a]p³=—11 ±5° (c=0,68, vízben) (3) Móltömeg: 326 (M+H)+, 348 (M+ -(-Na)⁺ (SI-MS módszer) (4) összegképlet: Ci₅H₂₇N₅O₃.2HCl (5) Elemanalízis:

(a számításnál feltételezzük, hogy a mintában 0,5 mól víz van) talált: számított:

C =44,35% C =44,23%

H =7,83% H =7,42%

N =17,28% N =17,19%

O= — 0=13,75%

0=17,59% 0=17,41% (6) UV-spektrum (vízben):

7. ábrán látható;

\rnax'· 262±3 nm (E^=680± 100) (7) IR-spektrum (KBr-módszer): 8. ábrán látható;

3250, 3070, 1660, 1630, 1540, 1430, 1340, 1260, 1200, 1150, 1085, 995, 860, 650 (cm^-1) ,8) ^{8 9 10 11 12 l3}C-NMR-spektrum (D₂O, 100 MHz): 174,7 (s), 172,3(s), 171,6(s), 145,1 (d), 143,0(d), 132,0(d), 123,1 (d), 69,2(d), 49,2 (d), 47,7 (t), 39,7 (t), 39,1 (t), 38,0(t) 35,2(t), 20,6 (q) (ppm) (9) Színreakció:

azonos a TAN-749A-di(hidrogén-klorid)-éval (10) HPLC:

retenciós idő: Rz=5,7 (perc) [A:R,=5,3 (perc)] oszlop: YMC-PAK A312 mozgó fázis: 30% acetonitril/0,01 mól/!

oktán-szulfonát/0,02 mól/1 foszforsavoldat (pH 3,0) átfolyási sebesség: 2 ml/perc (11) Oldhatóság:

azonos a TAN-749A-di (hidrogén-klortd) éval (12) Savas vagy bázikus jelleg: semleges (szabad formában lévő vegyület bázikus) (IV) TAN-749D-di(hidrogén-kIorid) (1) Megjelenés: színtelen, szilárd anyag (2) Fajlagos forgatóképesség:

[a]p=+30± 10° (c=0,5, vízben) (3) Móltömeg: 340 (M+H)⁺, 362 (M+

4-Na)ss (SI-MS módszer) (4) összegképlet: C₁₆H₂₉N₅O₃.2HC1 (5) Elemanalízis:

(a számításnál feltételezzük, hogy a minta 0,5. mól vizet tartalmaz) talált: számított:

C =45,15% C =45,61%

H =7,98% H = 7,65%

N =16,44% N =16,62%

0= — 0=13,29%

0=16,59% 0=16,83%

-6197768 (6) UV-spektrum (vízben): a 9. ábrán látható;

262±3 nm (Ε^=655± 100) (7) IR-spektrum (KBr-módszer): a 10. ábrán látható;

3250,3050, 1660, 1635, 1530, 1435, 1345, 1260, 1200, 1150, 9995, 860, 650 (cm'¹) (8) ^l3C-NMR-spektrum (D₂O, 100 MHz): 174,7(s), 171,7(s), 171,6(s), 145,3(d), 143,0(d), 132,0(d), 123,2(d), 72,5(d), 52,2 (d), 49,3(t), 39,9(t), 39,2(t), 37,5(t) 35,3(t), 20,7(q), 18,8(q) (ppm) (9) Színreakció:

azonos a TAN-749A-di(hidrogén-klorid)-éval (10) HPLC:

retenciós idő: R,=6,2(perc) [B:R/=5,8 (perc)] (a körülmények azonosak a TAN-749C-di(hidrogén-klorid)-éval) (11) Oldhatóság:

azonos a TAN-749A-di (hidrogén-klorid)éval (12) Savas vagy bázikus jelleg:

semleges (szabad formában lévő vegyület bázikus).

A fent ismertetett fizikai és kémiai tulajdonságok alapján nyilvánvaló, hogy a TANIG 749 A és C, és a TAN-749B és D egymás szte^reoizomerjei.

A TAN-749 biológiai tulajdonságait az alábbiakban ismertetjük.

A 2. és 3. táblázat a TAN-749A, B, C és D [di- (hidrogén-klorid) -ok] antibakteriáIis spektrumát tartalmazza, különféle mikroorganizmusok ellen.

2. táblázat

Mikroorganizmus	Minimális gátló koncentráció (jug/ml)*
A	B	c	D
Staphylococcus aureus FDA	209 P	50	12,	5 >100	50
Escherichia coli NIHJ JC2		>100	>100	>100	>100
Citrobacter freundii		>100	>100	>100	>100
IFO 12681
Klebsiella pneumoniae IF0	3317	>100	100	7 100	>100
Proteus vulgáris IFO 3988		100	25	100	100
Proteus morganii TFO 3168		>100	>100	>100	>100
Pseudomonas aeruginosa		25	50	50	100
IFO 3080
Alcaligenes faecalís IFO	131 1.1	3,13	6,	25 12,5	6,25
Acinetobacter calcoaceticus	25	50	>100 ^;	>100
IFO 13006

Táptalaj összetétele:

Bacto-Antibiotic Médium 3: 17,5 g (Difco Laboratories, USA)

Bacto-elesztokivonat: 5,0 g (Difco Laboratories, USA)

Bacto-agar: 20 g (Difco Laboratories, USA)

Desztillált víz -(pH nincs állítva) 1000 ml

Inokulum nagysága: 10 telepképzo egység/ml tömény ségíí tenyészetből 1 kacsnyi

3, táblázat

Mikroorganizmus Tápközeg** Minimális gátló koncentráció* ( pg/ml)

AB C D

Staphylococcus TSA 12,5 3,13 >100 25 aureus 308A-1

-7197768

3. táblázat /folytatás/

Mikroorganizmus Tápközeg** Minimális gátló koncentráció* ( jug/ml)

	A	B	C	D
Escherichia	TSA	50	12,5	>100	50
coli T7
Staphylococcus	B-TSA	12,5	3, 13	> 100	25
aureus FDA209P
Streptococcus	B-TSA	3,13	6,25	100	25
pyogenes E—14
Pseudomonas	B-TSA	100	50	100	100

aeruginosa P9 x: agar-hígításos módszerrel meghatározva:

inokulum mennyisége: 10 telepképző egység/ml töménységű tenyészetből 1 kacsnyi xx: TSA: Tripticase Soy Agár: Baltimore Biological Laboratories, USA:

B-TSA: 10% lószérum/TSA

A TAN-749A-di(hidrogén-klorid) antibakteriális hatását klinikai izolált Staphylococcus aureus törzsek ellen a 4. táblázatban ismertetjük.

A TAN-749A, B, C és D di (hidrogén-klorid)-jainak terápiás hatását kísérletesen fertőzött egéren az 5. táblázatban mutatjuk be.

ATAN-749Aés B di(hidrogén-klorid)-sóinak akut toxicitási értékeit egéren vizsgáljuk, az eredményeket a 6. táblázatban közöljük.

4, táblázat

Staphylococcus aureus törzs	Rezisztencia' típusa	Minimális gátló koncentráció* ( JJg/ml)
1840 S	nincs	12,5
1840-2	G-penicillin	12,5
TN 2613	meticillin	6,25
TN 2648	meticillin	3,13
TN 2687	makróiid	6,25
TN 2684	makróiíd	6,25
TN 2688	makróiid	6,25

x: agar-hígítdsos módszerrel meghatározva: tápközeg: Mueller-Hinton táptalaj (Difco, USA): inokulum mennyisége: 10 telepképző egység/ml töménységű tenyészetből 1 kacsnyi

-8197768 táblázat

Mikroorganizmus (i.p. fertőzés)	Kezelés módja		ED5 0	(mg/kg)
A	B	C D
Escherichia	s.c.	67,2	27,3	50
coli 0-111
Escherichia	S * C <	50,8
coli T7
Pseudomonas	s.c.	31,9	61,4
aeryginosa P-9
Staphylococcus	s.c.	1,31	0,351 12,5 <6,25
aureus 308A-1
Staphylococcus	p.o.	17,7	16,2
aureus 308A-1

6. táblázat
Adagolás	LD₅₀ (mg/kg)
módja	A B
szubkután	^500 400-800
órái is	2000-4000

. 30

Amint azt a fenti eredmények bizonyítják, a TAN-749 és sói antibakteriális hatással rendelkeznek mind Gram-pozitív, piind Gram-negatív baktériumok ellen, és toxicitásuk emlős szervezetek ellen alacsony. Ezenkívül, különféle gyógyszer-rezisztens baktériumok ellen is hatásosak, és nem mutatnak kereszt-rezisztenciát. Ezért a TAN-749 és sói emlősökben bakteriális fertőzések kezelésére használhatók (emlősök alatt például egeret, patkányt, nyulat, kutyát, stb., illetve embert értünk) .

A TAN-749 és sói gyógyszerkészítmények hatóanyagaként használhatók. A gyógyszerkészítményeket úgy állítjuk elő, hogy a TAN-749-et vagy annak sóit gyógyászatilag elfogadható hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverjük és gyógyszerkészítménnyé formáljuk. Orálisan adagolható gyógyszerkészítmények előállítására például megfelelő mennyiségű kötőanyagot — így hidroxi-propil-cellulózt, hidroxi-propil-metil-cellulózt, makrogolt, stb. —, dezintegrálószert — így keményítőt, karboxi-metil-cellulózt, kalciumot, stb. —, hordozóanyagot — így laktózt, keményítőt, stb. —, sikosítóanyagot — például magnézium-sztearátot, talkumot, stb. — használhatunk.

A parenterálisan adagolható gyógyszerkészítmények vagy terápeutikumok, például injekciók előállítására például izotonizáló szereket — így glükózt, D-szorbitot, D-marmitot, nátrium-kloridot, stb. —, konzerválószereket — így benzil-alkoholt, klór-butanolt, metil-p-hidroxi-ben zoátot, propil-p-hidroxi-benzoátot, stb. —, pufferanyagokat — így foszfát-puffért, nátrium-acetát-puffer, stb. — használhatunk. A parenterális készítményeket szubkután vagy intramuszkuláris injekció formájában adagolhatjuk a kezelendő emlősnek, közel 1—50 mg/kg/nap, előnyösen közel 5—20 mg/kg/nap dózisban. Ha a TAN-749-et vagy sóit orálisan adagoljuk, a dózisforma például kapszula lehet, és a hatóanyag dózisa közel 1 —100 mg/kg/nap, előnyösen

5—50 mg/kg/nap lehet.

A ΤΑΝ-749-et és sóit baktericid szerként is használhatjuk, például kéz, láb, arc, fül, stb. sterilezésére vagy fertőtlenítésére, oly módon, hogy a fenti testrészeket cseppfolyós készítménnyel — például a ΤΑΝ-749-et vagy annak sóját közel 0,01—0,1 vegyes% koncentrációban tartalmazó, steril vízzel készült oldattal — vagy kenőccsel — például 0,2—20mg/g előnyösen 1 —10 mg/g hatóanyagot tartalmazó kenőccsel — kezeljük.

A találmány szerinti eljárással előállított TAN-749A, B, C és D új, baktériumok által termelt antibiotikumok, amelyek mind Grampozitív, mind Gram-negatív baktériumok ellen hatásosak, beleértve a gyógyszer-rezisztens törzseket is; fenti tulajdonságaik következtében előnyösen alkalmazható a klinikai gyakorlatban, például bakteriális fertőzések kezelésére.

A találmányt közelebbről — a korlátozás szándéka nélkül — az alábbi példák segítségével kívánjuk ismertetni. A példákban a tápközegek összetételét mindenütt vegyes%-ban adjuk meg, hacsak azt másként nem jelezzük.

1. példa

Komplett ferde agaron tenyésztett Pseudomonas fluorescens YK-437 (IFO 14446/ FERM BP-1005) törzset 2 l-es Sakaguchi-lomb kban lévő 500 ml tápközegbe oltunk — melyet úgy állítunk elő, hogy 2% glükózt, 3% oldható keményítőt, 1% szójalisztett, 0,3% kukoricalekvárt, 0,5% polipeptont (Daigo

-9197768

Nutritive Chemicals, Japán) és 0,3% nátrium-kloridot tartalmazó vizes oldathoz (pH 7,0) 0,5% kalcium-karbonátot adunk —, és a tenyészetet 24°C-on 48 órán át lengő rázógépen rázatjuk. A kapott tenyészet teljes mennyiségét 50 l-es fermentorba visszük át, amely 30 l tápkőzeget tartalmaz, a tápkőzeget úgy állítjuk elő, hogy a fenti táptalajhoz 0,5% Actcol (Takeda Chemical Industries, Japán) habzásgátlószert adunk. A tenyésztést 24°C-on 30 l/perc levegőztetés és 200 fordulat/perc mellett 48 órán át folytatjuk. A kapott tenyészet 6 l-ét 200 l-es fermentorba oltjuk át, amely 120 1 3% glicerint, 0,1% glükózt, 0,5% polipeptont, 0,5% húskívonatot (Wako Pure Chemical Industries, Japán), 0,5% nátrium-kloridot, 0,05% nátrium-tioszulfátot, 2 pg/ml kobalt-kloridot és 0,05% Actolt tartalmaz, majd a tenyésztést 24°C-on 66 órán át folytatjuk, 120 l/perc levegőztetés és 170 fordulat/perc keverés mellett.

A kapott 105 I tenyészet pH-ját 2 n sósavoldattal 6,5-re állítjuk, majd Hyflo Super Cél (Johns Manville Product, USA) szűrési segédanyaghoz adjuk és szűrjük, a mosást vízzel végezzük. A kapott 102 liter szürlet pH-ját, 6,5-re állítjuk, és 2 1 IRC-50-nel (Na⁺-típus) töltött oszlopon folytatjuk át. Az oszlopot vízzel mossuk, majd 500 1 2 mól/1 koncentrációjú sóoldattal eluáljuk. A kapott eluátumot 2 1 aktívszénnel töltött oszlopon folytatjuk keresztül, az oszlopot vízzel mossuk, majd 15 I 8% butanolt tartalmazó vízzel eluáljuk. A kapott eluátum pH-ját 6,2-re állítjuk, térfogatát 2 1-re koncentráljuk és 0,5 1 CM-Sephadex C-25-teI (Na⁺-típus) töltött oszlopon folytatjuk át. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat 20 1 0,1 mól/1 koncentrációjú sóoldattal eluáljuk (1—41. frakció).

A TAN-749B-t tartalmazó frakció eluálódik hamarabb, (10—12. frakció), míg a TAN-749A-t tartalmazó frakció később eluálódik (13—18. frakció).

A kapott frakciókat 1,0 1, illetve 4,0 1 aktivált csontszénen kromatografáljuk, és az eluátumot sómentesítjük, majd koncentráljuk és liofilizáljuk. 4,0 g TAN-749B, illetve 8,9 g TAN-749A nyersterméket kapunk.

A 4,0 g TAN-749B nyersterméket ezután fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással tisztítjuk, hordozóként YMK-PAK S-30-at (Yamamura Chemical Laboratories,, Japán), mozgó fázisként 8% metanolt tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszforsavoldatot (pH 3) használunk. A kapott, kívánt terméket tartalmazó frakciókat 0,25 1 CM-Sephadex C-25-tel (Na⁺-típus) töltött oszlopon kromatografáljuk, majd 0,3 1 aktívszénnel töltött oszlopon tisztítjuk. A kapott tiszta frakciót koncentráljuk és liofilizáljuk. 0,66 g TAN-749B-di(hidrogén-klorid)ot kapunk, fehér por formájában, amelynek fizikai állandói azonosak a leírás első részében közöltekkel.

A 8,9 g TAN-749A nyersterméket a fentiek szerint tisztítva 4,7 g tiszta TAN-749A-di(hid10 rogén-klorid)-ot kapunk, fehér por formájában, amelynek fizikai állandói azonosak a leírás első részében közöltekkel.

2. példa

Komplett ferde agaron tenyésztett Pseudomonas fluorescens YK-437 (1FO 14446, FERM BP-1005) törzset 2 literes Sakaguchi-lombikban lévő 500 ml tápközegbe oltunk — amelyet úgy állítunk elő, hogy 2% glükózt 3% oldható keményítőt, 1% szójalisztet, 0,3% kukoricalekvárt, 0,5% polipeptont, és 0,3% nátrium-kloridot tartalmazó vizes oldathoz (pH 7,0) 0,5% kalcium-karbonátot adunk —, és a tenyészetet 24°C-on 48 órán át lengő rázógépen rázatjuk. A kapott tenyészet teljes menynyiségét 200 literes fermentorba visszük át, amely 120 liter tápközeget tartalmaz, amelyet úgy állítunk elő, hogy a fenti táptalajhoz 0,05% Actcolt adunk. A tenyészetet 24°Con 120 l/perc levegőztetés és 180 fordulat/perc keverési sebesség mellett 48 órán át inkubáljuk. A kapott tenyészet 50 literét 20000 literes, 1200 liter táptalajt tartalmazó fermentorba oltjuk át, a tápközeg 3% glicerint, 0,1% glükózt, 0,5% polipeptont (Daigo Nutritive Chemicals, Japán), 0,5% húskivonatot (Wako Pure Chemicals, Japán), 0,5% nátrium-kloridot, 0,05% nátrium-tioszulfátot, 2pg/ml kobalt-kloridot és 0,05% Actcolt tartalmaz. A Tenyésztést 24°C-on 66 órán át folytatjuk, 1200 l/perc levegőztetés és 150 fordulat/perc keverési sebesség alkalmazása mellett.

A kapott 1150 liter tenyészet pH-ját 6,5-re állítjuk, majd Hyflo Super Cel-hez (Johns Manville Product, USA) adjuk, szűrjük, vízzel mossuk, és a kapott 1220 liter szűrlet pH-ját 6,2-re állítjuk, majd 20 liter IRC-50nel (Na⁺-típus) töltött oszlopon folytatjuk át. Az oszlopot vízzel mossuk, majd 200 liter, 0,5 n hidrogén-klorid-oldattal eluáljuk. A kapott eluátum pH-ját 5,6-ra állítjuk, majd 20 liter Diaion SP-207-tel töltött oszlopon folytatjuk keresztül, és 120 liter vízzel eluáljuk. A kapott eluátumot 2 literre koncentráljuk, és a koncentrátumot 3 liter CG-50-nel (NH₄ ⁺-ripus) töltött oszlopon folyatjuk keresztül. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat 40 1 0,4—0,6 mól/1 koncentrációjú fóoldattal eluáljuk (1 —15. frakció).

A TAN-749A, B, C és D tartalmú frakció e'uálódik hamarabb (4—9. frakció), és egy TAN-749A tartalmú frakció eluálódik később (10—14. frakció).

Minden egyes kapott frakciót kromatográfiás tisztításnak vetünk alá, az oszlopot 1,2 liter, vagy 2,0 liter aktívszénnel töltjük meg, és az eluálást 8% izobutanolt tartalmazó vizes oldat 4, illetve 10 literével végezzük. A csak TAN-749A-t tartalmazó frakciókat koncentrálva és liofilizálva 47,5 g TAN-749A-t kapunk, di(hidrogén-klorid)-só formájában, amelynek fizikai állandói azonosak a leírás első részében közöltekkel.

-10197768

Ami a TAN-749A, B, C és D tartalmú frakciót illeti, három, azonos módon, összesen 3450 liter kiindulási tenyészetből nyert frakciót koncentrálunk. A kapott 2 liter koncentrátumot 3 liter CG-50-nel (NH₄ ⁺-típus) töltött oszlopon kromatografáljuk, az oszlopot 0,2 mól/l koncentrációjú sóoldattal mossuk, majd 0,5-0,8 mól/l koncentrációjú sóoldat 40 literével eluáljuk (1 —15. frakció). A TAN-749B-t és D-t tartalmazó frakció eluálódik hamarabb (6—8. frakció), és a TAN-749A-Í és C-t tartalmazó frakció jelenik meg később (10—13. frakció). A TAN-749A-t és C-t tartalmazó frakciót aktívszénnel töltött oszlopon kromatografáljuk és sómentesítjük. A kapott eluátumot koncentráljuk és liofilizá 1 juk. 20 g TAN-749A-t tartalmazó port kapunk, amely kis mennyiségű TAN-749C-t tartalmaz.

A TAN-749B-Í és D-t tartalmazó frakciót aktívszénne! töltött oszlopon kromatografáljuk és sómentesítjük. A kapott eluátumot 1 liter CM-Sephadex C-25-tel töltött oszlopon (Na⁺-típus) kromatografáljuk, az eluálást 0,2 mól/l koncentrációjú sóoldattal végezzük. A kapott eluátumot koncentráljuk; és a kapott koncentrátumot fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással tisztítjuk, hordozóként ODS, YMC-PAK S-30-at; mozgó fázisként 5% metanolt tartalmazó 0,02 mól/l koncentrációjú 5 1 foszforsavoldatot (pH 3,0) használunk (1—50. frakció). Két frakciót kapunk,, az egyik csak TAN-749B-Í tartalmaz (15—35. frakció), a másik TAN-749B-t és D-t tartalmaz együtt (38—48. frakció). A csak TAN-749B-Í tartalmazó frakciót CM-Sephadex töltetű oszlopon, majd aktívszénnel töltött oszlopon kromatografáljuk. 3,05 g TAN-749B-di (hidrogén-klorid)-ot kapunk, amelynek fizikai állandói azonosak a leírás első részében közöltekkel.

A TAN-749B-Í és D-t tartalmazó frakciót koncentráljuk és nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással újra tisztítjuk. A kapott, csak TAN-749D-t tartalmazó frakciót koncentráljuk. A koncentrátumot 10 ml IRA-402-vel (Cl^--típus) töltött oszlopon folyatjuk át és az oszlopot vízzel mossuk. Az átfolyt anyagot aktívszénnel kromatografálva sómentesítjük. 15,5 mg ΤΑΝ-749-di (hidrogén-klorid)-ot kapunk, amelynek fizikai állandói azonosak a leírás első részében közöltekkel.

A 3 g, kevés TAN-749C-t tartalmazó TAN-749A port — amelyet a fentiek szerint állítottunk elő — CM-Sephadex CG-50, majd aktívszén töltetű oszlopon kromatografáljuk, a TAN-749C arányának növelése céljából. A kapott, magas TAN-749C tartalmú port nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással tisztítjuk, majd az eljárást megismételjük, a fent ismertetett körülmények között. 20,2 mg TAN-749C-di (hidrogén-klorid) -ot kapunk, amelynek fizikai állandói azonosak a leírás első részében közöltekkel.

3. példa

Kapszula előállítása * (DTAN-749A ’ j. 300 mg (2) Laktóz ' 28 mg (3) Kukoricakeményítő 58 mg (4) Hidroxi-propil-cellulóz 12 mg (5) Magnézium-sztearát 2 mg

A fenti (1). (2), (3) és (4) összetevőket összekeverjük és a szokásos módon granuláljuk. A granulátumhoz hozzáadjuk az (5) komponenst. Az elegyet 1-es számú zselatin kapszulába töltjük (a Japán Gyógyszerkönyv

10. kiadásának megfelelően).

4. példa g TAN-749B-t egy liter desztillált vízben oldunk. Az oldathoz 50 g mannitot adunk, és a kapott oldatot sterilre szűrjük, majd 2 mlenként ampullákba töltjük. Az ampullák tartalmát liofilizáljuk, majd leíorrasztjuk. Az ampullás készítmény használatakor az ampullát felnyitjuk és a benne lévő anyagot 2 ml fiziológiás sóoldatban oldjuk. A kapott oldatot intramuszkulárisan vagy szubkután módon adagolhatjuk.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás a TAN-749A — amely di (hidrogén-klorid)-sója formájában az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik:

(i) megjelenése: színtelen, szilárd anyag (ii) fajlagos forgatóképessége:

(a)y==—11±5° (c=I,06, vízben) (iii) pK_saw értéke: 8,0 (iv) móltömege: 326 (M-j-H)⁺, 348 (M+ + Na) ⁺ (SI-MS módszer, M a szabad vegyüld móltömegét jelenti) ív) összegképlete: C_I5H₂₇N₅O₃.2HC1 (vi) elemanalízise:

az analízist megelőzően a mintákat foszfor-pentoxid felett 40°C-on, csökkentett nyomáson 6 órán át szárítjuk (a számításnál feltételezzük, hogy a mintában 1 mól víz van) talált: számított:

C=43,6±2,0% C =43,27% H=7,4±l,0% H = 7,50% N=17,0±l,5% N =16,82%

0= — 0=15,37%

Cl=16,4±l,5% 0=17,03% (vii) ultraibolya (UV) abszorpciós spektruma (vízben): ,

Á_max: 266±3 nm (Ε,Λ,=658± 100) (viii) infravörös (IR) abszorpciós spektruma (KBr-módszer) a fő abszorpciós hullámszámok:

3400,3100, 1700, 1670, 1550, 1440, 1380, 1340, 1280, 1220, 1150, 1100, 1000, 960, 870, 680 (cm-') (:x) ¹³C-Magmágneses rezonancia (NMR) spektruma D₂O-ban mérve, 100 MHz-en 174,7(s), 172,3(s), 171,7(s), 139,3(d), 139,3(d), 129,6(d), 125,3(d), 69,2(d), 49,2(d), 47,8 (t), 39,8(t), 39,1 (t), 38,1 (t 35,2(t), 16,0(q) (ppm)

-11197768 (x) nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) vizsgálattal retenciós ideje: Rz=4,4 (perc), oszlop: YMC-PAK A312 (Yamamura Chemical Laboratories) mozgó fázis: 12% metanol/0,01 mól/1 foszforsavoldat (pH 3) átfolyási sebesség: 2 ml/perc (xi) szinreakció:

pozitív: Ehrlich-reakció, dimetil-benzaldehid, kálium-permanganát negatív: ninhidrin, Greig-Leaback-, Sakaguchi-, Dragendorff-reakció (xii) oldhatósága:

oldódik: vízben, dimetil-szulfoxidban, metanolban, kissé oldódik: acetonban, etil-acetátban, dietil-éterben (xiii) savas vagy bázikus jellege:

neutrális (szabad formában bázikus) —,

TAN-749B — ameiy di(hidrogén-klorid)-sója formájában az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik:

(i) megjelenése: színtelen, szilárd anyag (ii) fajlagos forgatóképessége: (a)o⁵=+56±20° (c=l,0, vízben) (iii) pKss? értéke: 8,05 (iv) móltömege: 340 (M+H)⁺, 362 (M+ +Na) + (SI-MS módszer) (v) összegképlete: C,₆H₂₉N₅O₃.2HC1 (vi) elemanalízise:

az analízist megelőzően a mintákat foszfor-pentoxid felett 40°C-on, csökkentett nyomáson 6 órán át szárítjuk (a számításnál feltételezzük, hogy a minta 1,5 mól vizet tartalmaz) talált: számított:

C =43,62% C =43,94%

H = 7,53% H = 7,37%

N =16,06% N =16,01%'

0= - 0=16,46%

0=16,31% 0 = 16,21% (vii) UV-spektruma (vízben) k_max: 264 + 3 nm (E,^,=660 + 100) (viii) IR-spektruma (KBr-módszer):

3300, 3100, 1700, 1660, 1610, 1550, 1450, 1420, 1380, 1350, 1280, 1220, 1150, 1070, 1000, 960, 930, 870, 690, (cm^-1) (íx) ^I3C-NMR-spektruma (D₂O, 100 MHz): 174,7(s), 171,6(s), 139,3 (d), 139,2(d), 129,6(d), 125,5(d), 75,6(d), 52,3(d), 49,3(d), 39,9(t), 39,1 (t), 37,5(t),

35,2(t), 18,8(q), 16,0(q) (ppm) (x) HPLC:

retenciós idő: Rz=7,2 (perc), oszlop: YMC-PAK A312 (Yamamura Chemical Laboratories) mozgó fázis: 12% metanol/0,01 mól/1 foszforsavoldat (pH 3) átfolyási sebesség: 2 ml/perc (xi) színreakciói:

pozitív: Ehrlich-reakció, dimetil-benzaldehid, kálium-permanganát negatív: ninhidrin, Greig-Leaback-, Sakaguchi-, Dragendorff-reakció (xii) oldhatósága:

oldódik: vízben, dimetil-szulfoxidban, metanolban, kissé oldódik: acetonban, etil-acetátban, dietil-éterben (xiii) savas vagy bázikus jellege:

neutrális (szabad formában bázikus)—,

TAN-749C — amely di(hidrogén-klorid)-sója formájában az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik:

(i) megjelenése: színtelen, szilárd anyag (ii) fajlagos forgatóképessége:

(a)o³=—11 ±5° (c=0,68, vízben) (iii) móltömege: 326 (M%H)⁺, 348 (M+ + Na)⁺ (SI-MS módszer) (iv) összegképlete: C₁₅H₂₇N₅O₃.2HC1 (v) elemanalízise:

(a számításnál feltételezzük, hogy a mintában 0,5 mól víz van) talált: számított:

C =44,35% C =44,23%

H = 7,83% H = 7,42%

N =17,28% N =17,19%

O= - 0=13,75%

0 = 17,59% 0=17,41% (vi) UV-spektruma (vízben):

kmax'. 262±3 nm (E,¹Cm=680± 100) (vii) IR-spektruma (KBr-módszer):

3250,3070, 1660,1630, 1540, 1430,1340, 1260,1200,1150,1085, 995, 860, 650 (cm ') (viii) ^I3C-NMR-spektruma (D₂O, 100 MHz): 174,7(s), 172,3(s), 171,6(s), 145,1 (d), 143,0(d), 132,0(d), 123,1 (d), 69,2(d), 49,2 (d), 47,7 (t), 39,7 (t), 39,1 (t),

38,0(t), 35,2(t), 20,6(q), (ppm) (ix) színreakciói:

pozitív: Ehrlich-reakció, dimetil-benzaldehid, kálium-permanganát negatív: ninhidrin, Greig-Leaback-, Sakaguchi-, Dragendorff-reakció (x) HPLC:

retenciós idő: R/=5,7 (perc) (A:R/=5,3 (perc)) oszlop: YMC-PAK A 312 mozgó fázis: 30% acetonitril/0,01 mól/ /1 oktán-szulfonát/0,02 mól/1 foszforsavoldat (pH 3,0) átfolyási sebesség: 2 ml/perc (xi) oldhatósága:

oldódik: vízben, dimetil-szulfoxidban, metanolban, kissé oldódik: acetonban, etil-acetátban, dietil-éterben (xii) savas vagy bázikus jellege: neutrális (szabadformában bázikus)—,

TAN-749D — amely di(hidrogén-klorid)-sója formájában az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik:

-12197768 talált:

C =45,15% H = 7,98% N =16,44% 0= 0 = 16.599 (i) megjelenése: színtelen, szilárd anyag (ii) fajlagos forgatóképessége:

(α)ο⁴=-)-30+10° (c=0,5, vízben) (iii) móltömege: 340 (M-j-H)⁺, 362 (M+ +Na)⁺ (SI-MS módszer) (iv) összegképlete: C₁₆H₂₉N₅O₃.2HC1 (v) elemanalízise:

(a számításnál feltételezzük, hogy a minta 0,5 mól vizet tartalmaz) számított:

C =45,61%

H = 7,65%

N =16,62%

0=13,29%

Cl=16,83% (vi) UV-spektruma (vízben):

ληαχ- 262±3 nm (Ε^=655± 100) (vii) IR-spektruma (KBr-módszer):

3250, 3050, 1660, 1635, 1530, 1435, 1345,

1260, 1200, 1150, 995, 860, 650, (cm¹) (viii) ^l3C-NMR-spektruma (D₂O, 100 MHz):

174,7(s), 171,7(s), 171,6(s), 145,3(d),

143,0(d), 132,0(d), 123,2(d), 72,5(d),

52,2(d), 49,3(t), 39,9(t), 39,2(t),

37,5(t), 35,3 (t), 20,7(q), 18,8(q), (ppm) (ix) színreakciói:

pozitív: Ehrlich-reakció, dimetil-benzaldehid, kálium-permanganát negatív: ninhidrin, Greig-Leaback-, Sakaguchi-, Dragendorff-reakció (x) HPLC:

retenciós idő: R/=6,2 (perc) (B:R₍=5,8 (perc)) oszlop: YMC-PAK A312 (Yamamura Chemical Laboratories) mozgófázis: 30% acetonitril/0,01 mól/l oktán-szulfonát/0,02 mól/l foszforsavoldat (pH 3,0) átfolyási sebesség: 2 ml/perc (xi) oldhatósága:

oldódik: vízben, dimetil-szulfoxidban, metanolban, kissé oldódik: acetonban, etil-acetátban, dietil-éterben (xii) · savas vagy bázikus jellege:

neutrális (szabad formában bázikus) — antibiotikumok és savaddíciós sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy a Pseudomonas fluorescens YK-437 (FERM BP-1005) törzset vagy annak a TAN-749A, B, C és D antibiotikumok bármelyikének termelésére képes mutánsát vagy variánsát tápközegben tenyésztjük, majd az antibiotikumokat a tenyészetből kinyerjük. .

(Elsőbbsége: 1985. 12. 23.)
2. Eljárás baktériumellenes hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított TAN-749A, B, C vagy D antibiotikumot, vagy azok egy gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóját a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk.

(Elsőbbsége: 1985. 12. 23.)
3. Eljárás a TAN-749A — amely di(hidrogén-klorid) -sója formájában az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik: ....

() (ü) (iü) (iv) (v) (vi) (vü) (viii) ,H₂₇N₅O₃.2HC1 megjelenése: színtelen, szilárd anyag fajlagos forgatóképessége:

(a)p⁵=—11 ±5° (c=l,06, vízben) pKsat, értéke: 8,0 móltömege: 326 (M-)-H)⁺, 348 (M+ + Na) ⁺ (SI-MS módszer, M a szabad vegyület móltömegét jelenti) összegképlete: C₁₅í elemanalízise: az analízist megelőzően a mintákat foszfor-pentoxid felett 40°C-on, csökkentett nyomáson 6 órán át szárítjuk (a számításnál feltételezzük, hogy a víz van)

C =43,27%

H = 7,50%

N =16,82%

O =15,37% 0=17,03% adszorpciós spektru45 mintában 1 mól C =43,6 + 2,0%

H = 7,4± 1,0%

N =17,0± 1,5%

O = —

0=16,4+1,5% ultraibolya (UV) ma (vízben): _t l_max 266±3 nm (E₁Vm=658± 100) infravörös (IR) abszorpciós spektrumában (KBr-módszer) a fő adszorpciós hullámszámok:

3400,3100, 1700, 1670, 1550, 1440, 1380, 1340,1280, 1220,1150, 1100, 1000, 960, 870, 680 (cm^-1) (ix) ^l3C-Magmágneses rezonancia (NMR) spektruma D₂O-ban mérve, 10 MHz-en: 174,7(s), 172,3(s), 171,7(s), 139,3(d), 139,3(d), 129,6(d), 125,3(d), '69,2(d), 49,2(d), 47,8(t), 39,8(t), 39,1 (t),

38,1 (t), 35,2(t), 16,0(q) (ppm) (x) nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) vizsgálattal retenciós ideje: R/=4,4 (perc), oszlop: YMK-PAK A312 (Yamamura Chemical Laboratories) mozgó fázis: 12% metanol/0,01 mól/l foszforsavoldat (pH 3) átfolyási sebesség: 2 ml/perc (xi) színreakciói:

pozitív: Ehrlich-reakció, dimetíl-benzal dehid, kálium-permanganát negatív: ninhidrin, Greig-Leaback-, Sakaguchi-, Dragendorff-reakció (xii) oldhatósága:

oldódik: vízben, dimetil-szulfoxidban, metanolban, kissé oldódik: acetonban, etil-acetátban, dietil-éterben (xiií) savas vagy bázikus jellege:

neutrális (szabad formában bázikus) — és

TAN-749B — amely di(hidrogén-klorid)-sója formájában az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik:

(i) megjelenése: színtelen, szilárd anyag (ii) fajlagos forgatóképessége:

(a)p⁵=-)-56±20° (c=l,0, vízben)

-13197768 (iü) (ív) (V) (vi)

PK értéke: 8,05 móltömege: 340 (M+H)⁺, 362 (M + + Na)⁺'(SI-MS módszer) összegképlete: Ci₆H₂₉N₅O₃.2HC1 elemanalízise:

az analízist megelőzően a mintákat foszfor-pentoxid felett 40°C-on, csökkentett nyomáson 6 órán át szárítjuk (a számításnál feltételezzük, hogy a minta 1,5 mól vizet tartalmaz) talált: számított:

(vii) (viii)

C =43,62% C =43,94%

H = 7,53% H = 7,37%

N =16,06% N =16,01%

0= — 0=16,46%

0=16,31% 0=16,21%

UV-spektrum (vízben):

264±3 nm (Ej?_m=660± 100) (ÍX) (X)

IR-spektruma (KBr-módszer): 3300,3100, 1700, 1660, 1610, 1550, 1450, 1420,1380,1350,1280, 1220, 1150,1070, 1000, 960, 930, 870, 690, (cm^-1) ^l3C-NMR-spektruma (D₂O, 100 MHz): 174,7(s), 171,6(s), 139,3(d), 139,2(d), 129,6(d), 125,5(d), 75,6(d), 52,3(d), 49,3(d), 39,9(t), 39,1 (t), 37,5(t),

35,2(t), 18,8(q), 16,0(q) (ppm)

HPLC:

retenciós idő oszlop:

mozgó fázis:

Rí—7,2 (perc), YMC-PAK A312 (Yamamura Chemical Laboratories) 12% metanol/0,01 mól/l foszforsavoldat (pH 3) átfolyási sebesség: 2 ml/perc (xi) színreakciói:

5 pozitív: Ehrlich-reakció, dimetil-benzaldehid, kálium-permanganát negatív: ninhidrin, Greig-Leaback-,

Sakaguchi-, Dragendorff-reakció

10 (xii) oldhatósága:

oldódik: vízben, dimetil-szulfoxidban, metanolban, kissé oldódik: acetonban, etil-acetátban, dietil-éterben

15 (xiii) savas vagy bázikus jellege:

neutrális (szabad formában bázikus) — antibiotikumok, és savaddíciós sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy a Pseudomonas fluorescens YK-437 (FERM BP-1005) törzset

20 vagy annak a TAN-749A, B, C és D antibiotikumok bármelyikének termelésére képes mutánsát vagy variánsát tápközegben tenyésztjük, majd az antibiotikumokat a tenyészetből kinyerjük.

25 (Elsőbbsége: 1985. 06. 18.)
4. Eljárás baktériumellenes hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a 3. igénypont szerinti eljárással előállított TAN-749A vagy B antibiotiku30 mot, vagy azok egy gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóját a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk.