KR950004010B1

KR950004010B1 - 미생물을 이용한 세팔로스포린 c의 제조방법

Info

Publication number: KR950004010B1
Application number: KR1019920002264A
Authority: KR
Inventors: 양호석; 곽효성; 이광무; 정구헌; 박장우; 민경복
Original assignee: 주식회사종근당; 손영동
Priority date: 1992-02-15
Filing date: 1992-02-15
Publication date: 1995-04-22
Also published as: KR930018023A

Abstract

내용없음

Description

미생물을 이용한 세팔로스포린 C의 제조방법

제1도는 본 발명의 친균주 CKD 7302의 맥아즙 한천 배지에서의 집락형태 사진.

제2도는 본 발명의 변이주 CKD 7601의 맥아즙 한천 배지에서의 집락형태 사진.

제3도는 본 발명의 변이주 CKD 7601의 분생자 및 분생자병의 사진.

제4도는 본 발명의 변이주 CKD 7601의 본 배양 120시간에서의 형태 사진.

제5도는 고속액체 크로마토그라피에 의한 세팔로스포린 C와 데아세틸 세팔로스포린 C의 크로마토그램.

본 발명은 미생물 변이주를 이용하여 세팔로스포린 C(Cephalosporin C)를 제조하는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로는 본 발명은 전분, 이의 가부분해물 및 콘스팁리카(Corn Steep Liquor)등의 유기태 질소원을 주원료로한 영양배지에 세팔로스포리움속의 변이주를 배양하여 배양액중의 부산물인 데아세틸 세팔로스포린 C[Deacetyl cephalosporin C, 일반식(1)의 R=OH인 화합물]의 축적을 최소로 하면서 목적산물인 세팔로스포린 C[Cephalosporin C, 일반식(1)의 R=OCOCH₃인 화합물]를 고농도로 축적시켜 발효액으로부터 세팔로스포린 C의 회수를 손쉽게 할 뿐 아니라 7-아미노 세팔로스포린산 (7-ACA)으로의 전환을 용이하게 함을 특징으로 한다.

(R : OH 또는 OCOCH₃) (1)

본 발명의 목적물인 세팔로스포린 C는 반합성 세팔로스포린계 항생물질들의 전구물질로 유용하게 사용되므로 산업적으로 매우 중요한 물질이다.

세팔로스포린 C를 산업적으로 생산하는 방법에 대하여는 수 많은 연구가 진행되고 있음에도 아직도 만족스러운 상태는 아니다. 특히 배양액중에 총 세팔로스포린류의 약 15-20%를 차지하고 목적산물인 세팔로스포린 C와 물리, 화학적 성질이 유사하여 정제 및 합성에 악영향을 미치는 부산물의 일종인 데아세틸 세팔로스포린 C[Deacetyl cephalosporin C, 일반식(1)의 R=OH인 화합물]가 함께 생성되는 것은 해결해야 할 큰 과제중의 하나이다.

데아세틸 세팔로스포린 C는 아브라함 등이 처음으로 발견하였다 [바이오 팩 저널(Biochem.J.),81, 591, 1961]. 세팔로스포리움속 미생물에는 세팔로스포린 C로부터 데아세틸 세팔로스포린 C로 전환시키는 에스터레이즈(esterase)가 흔하게 발견되며[디벨로프, 인드, 마이크로바이올(Develop.Ind. Microbiol.), 8, 417, 1967], 후지사와 등은 세팔로스포리움 아크레모니움의 배양액에서 상기의 에스터레이즈를 부분정제하였다.[어그리. 바이올. 팩(Agr. Biol. Chem.),3(6), 1303, 1975].

이 효소는 디이소프로필플루오로포스페이트(diisopropylfluorophosphate)에 의해 저해를 받음이 밝혀져 데아세틸 세팔로스포린 C의 생성이 효소에 의한다는 사실을 입증하고 있다. 그러나 후버등은 발효도중 세팔로스포린 C의 비효소적 가수분해에 의해서도 데아세틸 세팔로스포린 C가 생성될 수 있다는 증거를 제시하고 있어[어플. 마이크로바이을(AppI.Microbio1.),16(7), 1011, 1968]배양중 데아세틸 세팔로스포린 C의생성은 효소 및 비효소적 작용에 의한다고 알려져 있다.

효소작용에 의해 데아세틸 세팔로스포린 C가 생성되는 것을 제어할 목적으로 데이비드.에이.로우등은 세팔로스포리움속 미생물의 배양액중에 디이소프로필포스파이트(diisopropylphosphite)와 같은 아린산화합물을 첨가하는 방법을 제안하였다. (U. K. Pat. 2,136,000). 한편 목적산물인 세팔로스포린 C 그 자체를 배양액중에 고농도로 축적시키기 위한 균주개발의 방법이나 획득한 변이주를 효과적으로 이용하는 측면에서는 많은 연구 발표가 있다(U. K. Pat. 1,503,851, U. K. Pat. 1,109,362, U. K. Pat. 1,400,433, U. K. Pat. 1,488,821, U. K. Pat. 1,389,714, U. K. Pat. 938,755, JP 46-1828, JP 50-58,289, 특허공보 76-230, 특허공보 78-12, 특허공보 80-1588, 특허공보 82-908, 특허공보 91-4371등 참조). 그러나 부산물의 일종인 데아세틸 세팔로스포린 C의 생성을 근본적으로 억제시킨 균주의 개발에 대한 보고는 없는 실정이다.

한편, 발효에 의한 항생제의 생산에 있어서 무기인의 농도가 일정수준 이상일 경우 미생물의 포도당섭취를 증진시켜 증식속도를 증가시키나 세포내 에너지 수준을 높은 수준으로 유지하게 하여 항생물질 생산에는 악 영향을 미치는 것으로 알려져 있다[아크. 마이크로바이올(Arch. Microbio1.),128, 78, 1980]. 무기인의 함량이 높은 콘스팁리카는 많은 무기물, 유기산, 아미노산이 포함된 값싸고 좋은 유기태 질소원이지만 콘스팁리카를 과량 사용하면 배지중의 무기인의 함량도 필연적으로 높아져 발효에 오히려 좋지 않은 결과를 초래한다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 방안으로 무기인을 포접하여 서서히 방출시키는 물질을 첨가하거나 무기인의 조절기작이 해제되어 고농도의 무기인에 의해 세팔로스포린 C의 생합성이 저해되지 않는 변이주를 획득할 수 있다.

또한, 세팔로스포린 C의 발효에서는 탄소원, 질소원, 및 무기물이외에 세팔로스포린 C의 전구체로서 또는 세팔로스포린 C 생합성시의 조절인자로서 메치오닌(methionine)을 필요로 하게되며 메치오닌은 특히 분절포자의 형성을 촉진시키고 세팔로스포린 C 생합성 효소군의 합성을 증진시켜 세팔로스포린 C 생산에 기여하는 것으로 알려져 있어(한국 산업미생물 학회지2, 251, 1987), 대부분의 세팔로스포린 C의 산업적 발효생산 방법에서는 디/엘-메치오닌(D,L-methionine)을 중요한 원료로 사용하고 있다.(특허공보 91-4371). 그러나 메치오닌을 발효원료로 사용할 경우 메치오닌 가격이 비쌀 뿐 아니라 발효중에 악취가 발생하며 발효기간이 연장되는 등의 결점이 있어 메치오닌을 발효원료로 사용치 않고 세팔로스포린 C를 생산하고자 하는 시도가 꾸준히 제시되고 있다(U. S. Pat. 3,539,649, JP 62-236,500)

본 발명자들은 세팔로스포린 C의 산업적 생산시 문제가 되고 있는 상기의 세가지 문제점, 즉 이를 다시 요약하면, 1) 배양액중에 일종의 부산물인 데아세틸 세팔로스포린 C가 함께 축적된다는 점, 2) 특정 농도이상의 무기인에 의해 목적산물인 세팔로스포린 C 생합성이 저해 받기 쉽다는 점, 그리고 3) 세팔로스포린C를 생산하는 미생물이 고가이면서 발효도중 악취를 발생시키는 메치오닌 의존성이 크다는 점을 해결하기 위하여, 세팔로스포리움속의 미생물에 자외선등의 돌연변이원을 처리하여 1) 배지중에 특정화합물을 첨가하지 않아도 발효도중에 부산물인 데아세틸 세팔로스포린 C의 함량이 비교적 낮고 선택적으로 목적산물인 세팔로스포린 C를 다량 축적하며, 2) D,L-메치오닌에 의해 생산성이 크게 좌우되지 않고, 3) 무기인에 의한 조절기작이 해제되어 고농도의 무기인에 의해 세팔로스포린 C의 생합성이 저해되지 않아 유기태 질소원으로서 가격이 저렴한 콘스팁리카를 고농도로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 4) 상기의 특성을 획득하고 생산성이 증가되었으며 보존중이나 발효기간중 복귀 변이가 일어나지 않고 안정적인 돌연변이주를 획득하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 변이주 분리방법은, 원주인 세팔로스포룸 스페시스 ATTC 14553(후에Acremonium chrysogenumATCC 14553으로 개명, U. S. Pat. 3,082,155참조)의 포자현탁액에 자외선, 이임에스(EMS, Ethyl methane sulfonate)등의 돌연변이원을 공지의 방법으로 처리하여 변이주인 아크레모니움 크리소게넘CKD 7302 균주를 획득한다. 획득한 변이주인 아크레모니움 크리소게넘 CKD 7302의 포자현탁액(10⁶∼10⁷포자/ml)을 2% 가성소다 용액으로 pH를 8.5로 조절하고 엠엔엔지(MNNG, N-Methy1-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine)를 100 내지 400마이크로그람/밀리리터(μg/ml)의 농도가 되도록 첨가하여 37℃에서 20분간 진탕 교반한후 이 포자현탁액에 100 대지 200주울/평방미터(J/m²) 세기의 자외선을 조사하여 gg.9%∼99.99%의 사멸율을 나타나게 한다. 이 포자현탁액을 완전 배지에 도말하여 28℃에서 7-9일간 배양하여 콜로니의 크기가 1밀리미터(mm)내외에 도말하면 알칼리제네스 폐칼리스 IFO 13111의 배양액을 첨가한 한천배지를 완전 배지상에 부어 굳힌다. 이것을 37℃에서 하루 더 배양하여 억제환의 크기가 대조구보다 큰 변이주를 완전 배지상에 순수 분리한다. 순수분리된 콜로니를 14일간 배양하여 각 클로니들을 완전배지에서 일정한 크기로 절취하여 알칼리제네스 페칼리스 IFO 13111의 배양액을 넣어 굳힌 배지상에 올려 놓는다. 이것을 37℃에서 하루 더 배양하여 억제환의 크기가 대조구보다 큰 변이주를 획득한 뒤 이 균주를 메치오닌이 제외되고 무기인의 농도가 높게 제조한 발효배지에서 소량(2m1 발효배지/5m1 바이알) 배양한다. 배양후생물학적 역가 검정법으로 우량주를 선발하고 최종적으로 삼각플라스크에서 배양하여 고속액체 크로마토그래피로서 변이주인 아크레모니움 크리소게넘 CKD 7601을 선발한다.

(주1) 완전배지 조성

맥아엑기스 2%, 맥아당 4%, 단백성 펩톤 1%, 한천 2.5%

(주2) 발효배지 조성

콘스팁리카 11%, 옥수수전분 5%, 탄산칼슘 1.2%, 제 l 인산칼륨 1.5%, 황산암모늄 1.2%, 요소 0.2%,황산칼슘 1%, 황산마그네슘 0.35%, 휘시 익스트렉트(Fish extract) 1%, 대두분 1.5%, 동·식물유(대두유,미강유,돈지) 5%, 소포제 0.02%, 미량원소 적당량.

이렇게 선별된 변이주들의 균학적 특성및 생산성은 다음의 표 1,2,3에 나타내었으며 방법 및 역가 측정방법은 실시예에 나타내었다.

돌연변이체인 아크레모니움 크리소게넘(Acremonium chrysogenum) CKD 7601(한국과학기술원, KCTC 8512P, 1992, 2. 11)의 균학적 성질을 하기 표1에 기재하였다.

[표1] 친균주(CKD 7302)와 돌연변이주(CKD 7601)의 차이점

1. 한천 배지상에서의 성질

1) 형태적 성질

① 맥아즙 한천배지

생육이 양호하며 그물모양으로 기질 균사가 펴져 나간다. 집락은 둥글고 불규칙한 주름을 형성하며 분화구 모양은 없다.

② 오트밀 한천 배지

발육이 양호하며 기균사의 형성은 거의 보이지 않는다. 집락은 주위가 불규칙한 원형이며 표면은 불규칙한 주름을 형성한다. 집락 색깔은 연황색을 띄며 가용성 색소는 생성치 않는다.

2) 현미경적 성질

맥아즙 한천배지에서 증식중인 균사는 무색으로 폭은 2-4μ로 분지되어 있으며 분생자병(conidiophore)은 기균사 또는 기질 균사로부터 돌출되어 길이 30-70μ, 굵기 1.5-2.0μ로서 선단에 분생자(conidia)를 형성한다(제3도 참조). 분생자는 원형 대지 타원형인 단세포로서 무색이며 크기는 3-4μ×5-7μ이다.

2. 액체 영양 배지에서의 형태적 성질

액체 영양 배지에서 호기적으로 배양시 초기에는 격막이 드문드문 있는 균사로 증식하고 연이어 두껍고 짧으며 격막이 많은 형태로 변한후 분절포자(arthrospore)를 생성한다. 배양이 진행됨에 따라 분생자(conidia)도 가끔 보이며 발아된 형태(germlings)를 나타내는 포자도 있다.(제4도참조)

3. 배양 특성

1) 무기인과 D,L-메치오닌의 영향

친균주인 아크레모니움 크리소게넘 CKD 7302와 돌연변이 균주인 아크레모니움 크리소게넘 CKD 7601를 탄소원으로 전분, 질소원으로 콘스팁리카를 주로 사용한 영양배지에 각각 배양 하면서 무기태인(inorganicphosphate) 농도와, D,L-메치오닌의 농도를 달리한 경우 생육과 세팔로스포린 C의 생산성을 표 2에 나타내었다. 즉, 하기 표 2에서 보여주는 바와같이 돌연변이주는 친주와는 달리 무기태인인 제1인산칼륨 농도를1.5%까지 증가시켜준 경우와 D,L-메치오닌을 첨가하지 않은 경우에서도 증식 및 생산성이 큰 차이를 보이고 있지 않아 산업용 균주로는 유용한 성질을 지닌 변이주임을 확인할 수 있었다.

[표2] 무기태인과 D,L-메치오닌이 생육과 세팔로스포린 C의 생산에 미치는 영향

* 기본 배지 조성 :

콘스팁리카 11%, 옥수수전분 5%, 탄산칼슘 1.2%, 황산암모늄 1.2%, 요소 0.2%, 황산칼슘 1%, 황산마그네슘 0.35%, 휘시 익스트렉트 1%, 대두분 1.5%, 대두유 5%, 소포제 0.02%, 미량원소 적당량.

2) 생성물의 구성성분에 관한 특성

친균주(CKD 7302)와 돌연변이주(CKD 7601)를 상기의 기본 배지조성에 무기인을 1.2% 첨가한 배지에 각각 접종하여 실시예 1에 명기한 방법에 의해 배양하여 생성된 세팔로스포린류를 제4도에 기재한바 있는 조건으로 고속액체 크로마토그라피법에 의해 정량 해본 결과, 하기표 3에서 알 수 있는 바와같이 친균주에 비해 돌연변이 균주는 목적산물인 세팔로스포린 C의 생산량이 현저히 증가함과 동시에 일종의 부산물인 데아세틸 세팔로스포린 C의 함량이 크게 감소 했음을 보여주고 있다.

[표3] 균주에 따른 세팔로스포린 C와 데아세틸 세팔로스포린 C의 생산성 비교

앞에서 보여주는 바와같이, 본 발명의 변이주들은 유전적인 돌연변이가 일어나 비교적 고농도의 인산을 함유하면서 메치오닌을 첨가하지 않은 발효배지에서 배양할 경우에도 높은 세팔로스포린 C 생산량을 나타내었다.

선발된 변이주는 상기의 특성 이외에도 유기태 질소원으로서 전분제조의 부산물인 콘스팁리카를 기존의 미생물에 비해 과량, 좀더 상세하게는 5-11%, 이용할 뿐 아니라 대두분 1-3%, 보다 바람직하게는 15∼2.5% 범위내이고, 휘시 익스트렉트(fish extract) 1-3%, 보다 바람직하게는 1-2% 범위내이며, 땅콩분, 면실분 또는 건조효모 등의 이용성도 좋은 편이며, 탄소원 및 에너지원으로서 긴 사슬구조를 지니는 당인 전분 또는 덱스트린, 물엿 등 그 가수분해 물 또는 설탕을 효과적으로 이용한다. 이외에도 대두유, 미강유, 돈지 등의 동식물성 천연유와 메칠올레이트, 프리오루브 1435(PRIOLUBE 1435, 제조사 : Unchema International)등의 반합성유를 탄소원 및 에너지원으로 사용할 경우에도 비슷한 수준의 세팔로스포린 생산량을 나타내어 공업적인 생산시에 경제적인 측면과 원료의 수급면에서 유리한 특성을 지닌다.

배양조건은 호기적인 조건하에서 배양온도는 25-30℃, 배양중의 pH는 5.5이하로 떨어지지 않도록 암모니아수등의 알카리 용액으로 조정하면서 영양원으로서는 상기 대두분, 땅콩분, 면실분, 건조효모, 황산암모늄 중 1종이상의 질소원과 대두유, 미강유 , 메칠올레이트, 댁스트린중 1종이상의 탄소원을 적절히 추가하면서 배양한다. 세팔로스포린 C는 대부분이 배양여액 중에 존재하기 때문에 배양액을 원심분리 또는 여과하여 균체를 제거한 여액으로부터 공지의 방법에 의해 분별 채취한다. 즉, 양이온 및 음이온 교환수지(예 ; 암바라이드 IRA-900), 활성탄, 셀룰로즈, 실리카겔, 세파엑스-XAD(제조사 롬앤 핫스사)등을 이용하여 크로마토그라피 또는 겔 여과법을 조합하여 분별 채취후 역삼투등의 방법으로 농축하고 수산화나트륨등으로 중화하여 건조과정을 거쳐 세팔로스포린 C염을 얻는다.

본 발명을 실시예에 구체적으로 설명함에 있어서 그것에 의해 본 발명의 내용이 제한되어지는 것은 아니다.

(실시예 1)

사용균주 : 아크레모니움 크리소게넘 CKD 7302(친균주), 아크레모니움 크리소게넘 CKD 7601(변이주)종배양 1단 배지 : 맥아즙 2%, 단백성 펩톤 1%, 효모 엑기스 2.7%, 탄산칼슘 0.5%, pH 7.1

종배양 2단 배지 : 콘스팁리카 2.1%, 탄산칼슘 0.5%, D, L-메치오닌 0.05%, 설탕 2.5%, 포도당 1%, 초산암모늄 0.55%, 대두유 0.9%, 돈지 0.1%, 휘시익스트렉트 1%, pH 6.5

발효배지 : 콘스팁리카 11%, 옥수수 전분 5%, 대두분, 1.5%, 황산암모늄 1.2%, 요소 0.2%, 제1인산칼륨1.2%, 황산칼슘 1%, 황산마그네슘 0.35%, 탄산칼슘 1.2%, 휘시익스트렉트 1%, 대두유(또는 미강유) 5%, 미량원소 적당량, pH 6.2

배양방법 :

종균배양 1단 배지 40m1을 500ml 심각 플라스크에 넣어 121℃에서 20분간 가압살균한 다음, 균주들을 접종하여 28℃, 240rpm의 조건으로 3일간 진탕 배양한다. 종균배양 2단배지를 1단 배지와 동일한 용기에서 동일한 조건으로 살균한 뒤 1단 종균배양액 10%를 접종하여 28℃에서 2일간 배양한다. 발효배지를 종균배양 배지와 동일한 용기에서 동일한 조건으로 살균한 뒤 2단 종균 배양액 10%를 접종하여 25℃에서 240rpm의 조건으로 7일간 진탕배양 하였고 그 결과는 하기 표 4와 같다.

[표 4]

(실시예 2)

본 실시예의 사용균주, 배지조성등은 실시예 1과 동일하며 종배양 1단배지 800m1을 7L 둥근 플라스크에 넣어 121℃에서 40분간 가압살균한 다음 균주들을 접종하여 28℃에서 3일간 진탕 배양한다. 이종배양액을4.5L의 발효배지로 채운 7L 발효배지조에 14% 접종하고 25℃-28℃ 300-1000rpm, 0.5-1vvm(통기속도)의 조건에서 7일간 배양할때 배양 40-50시간후에 pH가 5.6이하로 하락할 경우 더 이상의 하락을 방지하기 위하여 배양 말기까지 암모니아수로 pH를 조절한다. 또한 대두유와 황산암모늄의 경우에는 배양중에 지속적으로 공급하여야 하는데 대두유는 배양중에 약 1-2%의 농도로 유지하여 배양말기까지 대략 13%의 대두유를 소모하며 황산암모늄은 배양중에 50mg%를 유지하여 배양말기까지 총 0.9∼1.5%의 황산암모늄을 소모하였다. 본 실시예의 결과는 하기 표 5와 같다.

[표 5]

(실시예 3)

본 실시예의 사용균주, 배지조성은 실시예 1과 동일한다. 실시예 2에서와 같은 방법으로 배양한 1단 종배양액을 90L의 종배양 2단 배지를 함유한 200L 종모 발효조에 0.13% 접종하여 3일간 배양한 2단 종배양액을 140L의 발효배지로 채운 250L 발효조에 14% 접종하고 7일간 배양하며 온도, 교반속도, 통기속도와 배양중의 pH 조절 방법 및 대우유 공급방법, 황산암모늄 공급방법은 실시예 2와 동일하게 수행한다. 본 실시예의 결과는 하기 표6과 같다.

[표 6]

Claims

맥아즙 한천배지에서 연황색의 집락을 형성하고 배양액중에 데아제틸 세팔로스포린 C를 거의 축적하지 않으며 목적산물인 세팔로스포린 C를 선택적으로 다량 축적하는 아크레모니움 크리소게넘(Acremonium chrysogenum) 변이주 CKD 7601(KCTC 8512P).
맥아즙 한천배지에서 연황색의 집락을 형성하고 배양액중에 데아세틸 세팔로스포린 C를 거의 축적하지 않으며 목적산물인 세팔로스포린 C를 선택적으로 다량 축적하는 아크레모니움 크리소게넘(Acremomium chrysogenum) 변이주 CKD 7601(KCTC 8512P)를 탄소원, 에너지원 및 질소원을 함유하는 배지에서 배양하여 세팔로스포린 C를 생성, 축적, 분별채취함을 특징으로 하는 세팔로스포린 C의 제조방법.
제2항에 있어서, 전분과 이의 가수분해물 또는 설탕을 탄소원으로 사용하며, 동식물성 천연유 및 반합성유를 탄소원 및 에너지원으로 사용함을 특징으로 하는 세팔로스포린 C의 제조방법.
제2항에 있어서, 인산함량이 높은 과량의 콘스팁리카(Corn steep liquor) 및 휘시익스트렉트(fishextract)등을 유기태 질소원으로 사용하며 대두분, 땅콩분, 면실분, 건조효모, 대두유, 황산암모늄 중 1종이상 등을 추가로 사용함을 특징으로 하는 세팔로스포린 C의 제조방법.
제4항에 있어서, 콘스팁리카는5-11%, 휘시익스트렉트는1-2%, 대두분은1.5-2.5% 사용함을특징으로 하는 제조방법.