KR900008745B1 - 전분 및 전분가수분해물로 부터 말토스를 생성하는 연속효소법 - Google Patents

전분 및 전분가수분해물로 부터 말토스를 생성하는 연속효소법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

전분 및 전분가수분해물로 부터 말토스를 생성하는 연속효소법
본 발명은 고정된 베타 아밀라제 효소(immobilised beta-amylase enzyme) 및 말토스함량이 높은 시럽을 제조하는 공정에 이것을 사용하는데 관한 것이다.
말토스 및 고농도 말토스 시럽은 적당한 전분 기질을 베타-아밀라제 단독으로 또는 플루라나제 첨가하에 미국특허 번호 3,565,765에 공지된 바와 같이 당화(糖化)함으로써 전분으로부터 제조하는 것이 보통이다.
근년에 들어, 효소를 고정시키는 기술이 개발되어 아주 효율적이고 경제적인 효소사용을 용이하게 해주며 고정된 효소를 베드나 칼럼에 넣음으로써 연속 효소 처리가 가능하게 되었다. 이어 베드나 컬럼을 통해 기질을 연속적으로 통과시키거나 상출시켜 효소 반응을 수행한다.
고정된 베타 아밀라제를 사용하여 말토스를 생성하는 연속법을 개발하는데 있어 문제점에 부딪치게 되었다. 예를 들어 미국특허 번호 3,868,304에 공지되고 특허된 방법을 적용하여(글루코스이소머라제를 다공성 알루미나 담체 물질에 흡착시켜 고정시킨 후 이 고정된 효소를 사용하여 포도당을 과당으로 이성화시키는 것이 포함되어 있음) 같은 유형의 담체 물질상에 흡착된 베타-아밀라제로 말토스를 생성하는 연속칼럼법을 수행하는 경우 베타-아밀라제 활성이 급속히 상실된다. 따라서 이 방법은 비고정-아밀라제를 사용하는 연속배치법 보다 훨씬 덜 경제적이다.
안정성 문제를 해결하는 한 방법은 베타아밀라제를 담체에 화학적으로 커플링 시키는 것이다. 예컨데 베타-아밀라제는 수용성 카보디이미드를 사용하여 아크릴아미드-아크릴산의 가교결합 공중합체에 화학적으로 결합시킬 수 있다. 이 방법과 기타 다른 화학적 커플링법이 하기 문헌에 소개되어 있다. "전분을 말토스로 전환시키는데 사용되는 아크릴성공중합체에 고정된 두 개의 효소 시스템 즉 베타아밀라제-플루라나제를 제조하는 방법, I. 고정된 베타-아밀라제의 제법과 안정성"[Biotechnology and Bioengineering, vol XVI, P 567-577(1974), "II. 효소들의 코커플링 및 충전된 베트컬럼에서의 사용"(Ibid P 579-591) "III. 연속반응체에 대한 프로세스 카이네틱 연구"(Ibid P 1567-1587, per Vretblad 및 Rolf Axen 고정된 보리 베타-아밀라제의 제법과 성질"(Biotechnology and Bioengineering, Vol XV, P 783-794(1973)]
비록 화학적커플링이 베타-아밀라제의 활성수명을 보호하는데 효과적이어서 따라서 말토스를 연속컬럼당화법으로 생성할 수 있게 해주나 화학적 고정법은 많은 비용이 들기 때문에 공업적 규모에 이어 불리한점을 가지고 있다. 이것은 고가의 화학물질과 복잡한 화학반응을 포함한다. 더욱이 이것은 효소활성이 다소모된 후 재생시켜 담체 물질을 회수하는 것이 힘들고, 비용이 많이 들며 때론 불가능하다.
공업적으로는 효소를 미국 특허 번호 3,868,304에 설명된 바와 같이 다공성 흡착담체상에 고정시키는 것이 일반적으로 바람직하다. 효소를 이와같은 담체상에 고정시키거나 적재하는 것은 극히 간단하며 단지 컬럼이나 다른 반응용기를 담체로 충전시킨후 효소용액을 이곳을 통해 통과시키는 것이 포함된다. 재생은, 열분해나 또는 화학물질을 담체물질을 거의 또는 전혀 파괴함이 없이 컬럼을 통해 통과시키는 것과 같은 간단한 방법이 포함된다. 불행하게도 베타-아밀라제에 있어 이 방법은 컬럼수명이 매우 짧다는 불리한 점을 가지고 있다.
앞서 지적한 바와같은 베타-아밀라제는 아주 민감한 효소로서 특히 화학반응액에서 그 활성을 빨리 상실한다. 그러나 혈청알부민 시스테인 및 글루타치온과 같은 티올을 함유하는 화합물은 효소 희박용액의 효과적인 보호제인 것으로 밝혀졌다.
영국 특허 명세서 1,543,094에 베타-아닐라제를 다공성담체 물질상에 흡착시켜 고정시키는 한 방법이 나와있으며 여기서는 보호 티올기를 함유하는 유기물질 존재하에 당화를 수행했다. 유기물질은 티올함유 아미노산, 티올함유 천연폴리펩티드, 티올함유 수불용성 합성중합체 및 그 혼합물로부터 선택된다. 수용성 티올함유 물질이 이 방법에서 사용되는 경우 이들이 최종 말토스시럽내에 남아 있게 되어 일반적으로 제거해야 한다. 따라서 1,543,094 특허에서는 티올기를 함유하는 수불용성 합성 중합체의 사용을 권장하고 있다.
효소를 담체상에 물리적으로 결합 시킴으로써 거대 다공성 또는 거대망상담체상에 효소를 고정시키는 연속시스템이 벨기에 특허번호 862,765에 공지되어 있다. 이 방법은 양이온과 음이온 수지 또는 이온성이 없는 거대 다공성 중합체 수지를 모두 이용한다. 문헌에 따르면 베타-아밀라제는 다이아몬드 샴록사 제품인(dlamond Shamroch) 두올라이트 ES-762수지(이온교환 활성이 없으나 효소흡착제로서 높은 용적을 가진 거대 다공성 중합체)상에 고정시킬 수 있다. 수지를 메탄올로 세정한 후 CH3COONa/CH3COOH 1% 용액으로 pH 5.4로 완충시킨다. 베타-아밀라제 효소를 담체상에 고정시킨 후 효소를 보호하기 위해 시스테인퍼어라이트를 첨가한다.
영국 특허 번호 1,557,944의 실시예 24에는 용성전분 용액을 디에틸아미노에틸아민으로 변경시킨 페놀성 수지상에 지지되어 있는 베타-아밀라제와 접촉시켜 말토스시럽을 생성시키는 것이 설명되어 있다. 이 방법으로 생성된 말토스양은 고정된 효소 컬럼으로부터 나온 유출물 ㎖당 12㎖인 것으로 보고되었다.
본 발명의 방법에 따라, 두올라이트 ES-568(다이아몬드 샴록사 제품) 같은 일정한 다공도를 가진 페놀성 교환수지를 베타-아밀라제를 고정시키는 담체로서 사용할 수 있음이 밝혀졌다. 고정된 베타-아밀라제는 유효 수명이 길어 고농도 말토스 시럽 즉 30-55% 말토스 시럽을 생성하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 전분가수 분해물로부터 말토스를 생성하는데 사용되는 고정된 베타-아밀라제 시스템은 다공성 페놀 수지상에 고정된 베타-아밀라제 효소로 구성되어 있으며 상기 수지는 총 표면적이 약 40-200㎡/g이며, 소공의 크기가 약 30Å 이상이며 그중 적어도 30%는 30-250Å의 반경을 가짐을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 특징은 전분가수분해물은 고정된 베타-아밀라제 시스템으로 연속접촉 시킴을 목적으로 하는 전문가수 분해물을 말토스시럽으로 전환시키는 연속법이다.
바람직한 다공성 페놀수지는 음이온교환 수지이다. 바람직한 수지는 소공의 반경이 약 30-250Å으로서 그 중 적어도 50%가 50-150Å의 반경을 가지며/거나 적어도 20%가 약 60-90Å의 반경을 가지며/거나, 적어도 20%가 약 70-80Å의 반경을 가진 그런 것이다. 수지는 10용량% 이하의 수준팽창 용적을 가진 것이 편리하다.
유럽특허 출원 81102183, 1(공고번호 0036662)에 첨부된 도면은 본 발명의 시스템에서 사용된 담체를 포함한 몇몇 담체들의 소공반경 분포 미분 곡석이다. 좀더 상세히 청구범위에 정의된 다공성 페놀수지담체는 도면중 곡선 1과 유사한 다공성프로필을 가지고 있다. 이 곡선은 수은 포로시메트리(porosimetry)로 소공의 크기와 용량을 측정하여 소공내 압축된 용량과 반경과의 관계를 나타내는 적분곡석을 도면에 그린 후 반경의 증가차에 따른 소공용적의 증가를 나타내는 좀더 상세한 미분분포 곡선을 얻기위해 적분곡선을 미분하여 얻은 것이다. 이런 측정에 대한 상세한 설명이 표면적의 측정에 관한 설명과 함께 하기 문헌에 나와 있다. (Adsorption On solidss, V. ponec, etal, Butter worths, 1974, P 38-39, 540-545 및 552-555).
여기서 정의된 표면적과 다공도를 가진 어던 페놀성수지도 본 발명에 사용할 수 있으나 음이온 능력을 가진 수지는 사용하는 것이 바람직하다. 특출한 것으로 밝혀진 특수수지는 두올라이트 ES-568이다. 이것은 다이아몬트 샴록사로부터 이용이 가능한 페놀-포름알데히드 수지이다.
본 발명에 따라 제조된 시럽의 건조고체 함량의 적어도 약 30중량-55중량% 이상에 해당하는 말토스 함량을 함유하고 있다. (여기서 언급된 모든 퍼센트는 따로 언급이 없는 한 중량퍼센트이다)이들은 청량음료, 과자, 빵반죽, 맥주와 유아식 및 병약자 음식을 포함한 식품들의 향미성분 및 첨가제로 많이 사용되고 있다. 이들은 또한 인쇄조성물 및 기타 공업용으로도 사용된다.
본 발명의 연속법은 컬럼내에서 수행되는 것이 바람직하다. 수지를 우선 컬럼내 넣은후 베타-아밀라제를 수지상에 고정시킨다. 이어 전분가수 분해물을 컬럼을 통해 보내 고농도 말토스 시럽을 얻는다.
수지는 이것을 컬럼에 넣은 후 포함된 기포를 제거하기 위해 탈염수로 세척하여 본 발명에 사용하기 적합하도록 제조한다. 이어 이것을 수산화 암모늄 같은 알칼리로 세척한다. 이어 과량의 알칼리를 pH가 약 4.5-8.0, 바람직하게는 5.5-7.0이 될 때까지 탈염수로 세척한다.
본 발명을 실시하는데 사용되는 베타-아밀라제효소는 식물성 또는 세균성 베타-아밀라제일 수 있다. 특히 적합한 베타-아밀라제는 맥아추출물로부터 얻는 것이다.
베타-아밀라제는 이것을 용액 상태로 컬럼을 통해 순환시켜 수지상에 고정시킨다. 그후 수지를 탈염수물로 세척하고 결합효소를 측정하기 위해 유출물을 수거한다.
이어 전분가수 분해물을 컬럼내 도입시킨다. 특히 적합한 전분가수 분해물은 덱스트로스 당량(이후 "DE")이 약 12-20이며 건조함량이 (이후 "% ds")가 약 30-55인 효소 희석된 옥수수 말토덱스트린이다.
pH는 수산화나트륨, 탄산나트륨 또는 수산화암모늄과 같은 적당량 알칼리를 기질 공급물질에 첨거하여 약 5.5-7.8로 조절한다.
본 발명의 생성물은 말토스 함량이 높다. 건조고체 함량의 약 30-55%에 해당하는 말토스 농도는 하기 실험결과로 입증된 바와 같이 쉽게 얻을 수 있다. 또한 보통 컬럼수명도 1500시간 이상이었다.
[실시예 1]
크기가 2.5×30㎝인 컬럼 3개에 두올라이트 ES-568 수지 100㎖를 충전시켰다. 이어 수지를 60℃에서 탈염수로 역류 세척하여 삽입된 기포를 제거했다. 이어 충전된 25℃에서 2% 수산화암모늄으로 1시간 동안 4베드용량/시간의 속도(이후 "BVH")로 하류세척했다. 이어 과량의 알칼리를 유출물의 pH가 6.8이 될 때까지 탈염수로 세척했다. 이어 베타-아밀라제 용액을 담체 ㎖당 34단위의 양으로 공급한후 24시간 동안 4BVH포 유속하에 재순환시켜 효소를 수지상에 고정시켰다. 이후 수지를 1시간동안 4BVH포의 속도로 탈염수로 세척하고 유출물을 모아 결합요소를 측정했다. 결합효소양은 하기식을 사용하여 계산했다.
Figure kpo00001
(% 결합효소=100-비결합효소, 비결합효소는 최종 물 세척액으로 수거된 4베드 용량의 유출물의 활성으로부터 측정했다. 이 활성은 유출물 ㎖당 단위수로 측정했다. 이 경우 100㎖ 컬럼을 통과된 4베드 용량은 400㎖이며 따라서 유출물중 총 활성은 400×단위수/유출물 ㎖이다. 이것을 공급된 효소 전체 단위수로 나누었다. 이어 여기에 100을 공해 비결정효소 %를 얻었다).
베타아밀라제 1단위가 pH 4.5 및 45℃에서 1분에 용성 전분으로부터 1m몰의 말토스를 생성하는데 필요한 효소 활성의 양이라 가정할 때 여러 컬럼의 평균치로 98.4%이 결합이 측정되었다. 이것은 공급된 효소 총 3400 단위를 기준으로 한 것으로 유출물중에는 0.14단위/㎖가 측정되었다.
이어 컬럼에 12 DE의 효소-희석 옥수수말토덱스트린 각기, 30,40 및 50% 용액을 공급했다. 말토덱스트린 공급물은 맑았으나 무기질이 제거된 것은 아니다. 이들에 약 1500ppm의 SO2를 함유시킨 후 수산화나트륨으로 pH 6.0으로 맞추었다. 컬럼 3개를 실온에서 1시간동안 그들 개개의 공급물로 감미를 주었다. 이어 컬럼온도를 50℃로 올리고 유속을 조절하여 55% 말토스시럽(건조성분 기준)을 얻었다.
각종 기질 건조 성분에서 얻어진 초기 BVH 속도도 다음과 같다.
Figure kpo00002
이런 조건하에서 개개 건조 성분에 대해 설탕함량을 측정했다. 생성된 시럽은 하기 조성을 가졌다.
덱스트로스 건조성분의 1.5%
말토스 건조성분의 54.4-55.5%
D.P.3 건조성분의 15.2-15.5%
D.P.4+건조성분의 27.5-28.8%
[실시예 2]
본 발명의 방법 및 시스템을 더 연장된 기간동안 사용할 수 있음을 입증하기 위해 고정된 효소제제의 장기 생산성을 결정하기 위한 조작을 수행했다.
컬럼을 실시예 1의 일반적인 과정에 따라 베타-아밀라제로 충전시켰다.
베타 아밀라제 용액은 통상적으로 이용이 가능한 농축 맥아 추출물 A. B. M 화학사 제품인 제품인 하이 디아스타제 1500으로부터 제조되었다.
공급용액은 40% d.s의 20 DE 탈 무기질 옥수수기제 말토덱스트린으로 여기에 염화칼슘을 Ca++150ppm 농도로 첨가했다. 이 공급용액에 안정화제로서 150ppm SO2를 함유시켰으며 수산화나트륨으로 pH를 6.0으로 완충시켰다. 컬럼을 50℃에서 작동시켰으며 과정중 유속을 조절하여 건조고체를 기준으로 할 때 50% 말토스 전환이 일어나도록 했다.
이 조작에서의 조건은 다음과 같다.
초기 BVH(50% 말토스) 5.3
1차 반감기(일) 44.6
2차 반감기(일) 18.3
총 수명(일) 72(a)
총 베드용량 4987
생산성, kg d.s/담체 ℓ 2339
(a) 총 수명은 0.5BVH가 될 때까지의 총 조작시간을 의미한다. 나타난 바와 같이 , 본 방법은 2달이상 연속해서 수행할 수 있으며, 1ℓ의 담체-효소 포함체로부터 건조 성분이 40%이며 말토스 함량이 50%인 고말토스 함유 시럽 고체 2.3톤 이상을 생산했다.
[실시예 3]
이 방법이 건조성분 함량이 높은데서도 사용될 수 있음을 입증하기 위해 실시예 1과 2의 일반법을 따라 실시하되 단지 컬럼을 50% d.s의 DE 말토덱스트린 및 Ca++ 200ppm의 염화칼슘으로 충전시켰다. 2000ppm SO2약간을 공급 재료에 첨가했다. 그 결과는 다음과 같다 :
초기 BVH 50% 말토스 3.0
1차 반감기(일) 23
2차 반감기(일) 45
총 수명(일) 86(a)
총 베드 용량 2624
생산성, Kg d.s./담체 1 1611
(a) 총 수명은 0.5BVH가 될 때까지의 총 작동 기간을 의미한다. 비록 50% d.s.에서는 40% d.s.(실시예 2)때보다 생산성이 낮았으나 50% d.s.에서 컬럼조작한 결과 다음과 같은 이점을 나타낸다.
1) 50% d.s.로 생성된 전분가수 분해물을 공급물로서 사용했을 때 증발비용이 절감되며, 2) 50% d.s.에서 조작시 미생물에 의해 변질된 위험이 적으며, 3) 50% d.s.에서 조작시 메타-아밀라제의 총수명(일)이 더 길다.
[실시예 4]
본 실시예에서는 본 발명에 따른 시스템에서 사용된 담체를 실시예 1 및 2의 일반법에 따라 사용된 담체들과 비교했다. 컬럼을 용해된 고체가 40% 또는 50%인 20 DE 말로덱스트린으로 충전시키고 여기에 각기 150ppm의 염화칼슘과 이산화황을 첨가했다. 그 결과는 하기표와 같다.
Figure kpo00003
(a) 총 수명은 0.5BVH가 될 때까지의 총 조작시간을 의미한다.
(b) 총 수명 예상치

Claims (9)

  1. 다공성 페놀수지상에 고정된 베타-아밀라제 효소로 구성되어 있으며 여기서 상기 수지가 약 40-200㎡/g의 총 표면적을 가지며, 상기 소공의 반겨이 약 30Å 이상이며 그의 적어도 30% 이상은 반경이 약 30-250Å임을 특징으로 하는 전분가수 분해물로부터 말토스 제조하는데 사용되는 고정된 베타-아밀라제 시스템.
  2. 제1항에 있어서 상기 다공성페놀 수지가 음이온 교환 형태의 수지임을 특징으로 하는 시스템.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서 반경이 약 30-250Å인 소공의 적어도 약 50%가 약 50-150Å의 반경을 가짐을 특징으로 하는 시스템.
  4. 제1항 내지 3항중 어느하나에서 반경이 약 30-250Å인 소공의 적어도 약 20%가 약 60-90Å의 반경을 가짐을 특징으로 하는 시스템.
  5. 제1항 내지 4항중 어느하나에서 반경이 약 30-250Å인 소공의 적어도 약 20%가 약 70-80Å의 반경을 가짐을 특징으로 하는 시스템.
  6. 전분가수분해물을 제1항 내지 6항중 어느하나의 고정된 베타-아밀라제 시스템과 연속접촉시킴을 특징으로 하는 전분가수분해물을 말토스시럽으로 전환시키는 연속법.
  7. 제6항에 있어서 상기한 전분가수분해물이 약 12-20의 DE 및 약 30-55의 d.s%를 가지며 생성된 시럽이 적어도 30%의 말토스로 구성된 용해된 고체를 함유함을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항 또는 7항에 있어서 상기 전분가수분해물을 수산화나트륨, 탄산나트륨 및 수산화암모늄으로 구성된 군으로부터 선택된 알칼리를 사용하여 pH를 약 5.5-7.0으로 유지시킴을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항, 7항 또는 8항중 어느하나에서 고정된 베타-아밀라제 효소가 약 4.5-8.0의 pH범위를 가짐을 특징으로 하는 방법.
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