BE862765A - Systeme continu ameliore pour fixer ou immobiliser des enzymes sur des supports d'un type special - Google Patents

Systeme continu ameliore pour fixer ou immobiliser des enzymes sur des supports d'un type special

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BE862765A
BE862765A BE2056582A BE2056582A BE862765A BE 862765 A BE862765 A BE 862765A BE 2056582 A BE2056582 A BE 2056582A BE 2056582 A BE2056582 A BE 2056582A BE 862765 A BE862765 A BE 862765A
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emi
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enzymes
macroporous
enzyme
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E Berghmans
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Cpc International Inc
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Description


   <EMI ID=1.1>  La présente invention concerne un système continu Amélioré pour fixer ou immobiliser des enzymes sur un support

  
 <EMI ID=2.1> 

  
luire dans le présent mémoire. Spécifiquement, on a constaté que, conformément à l'invention, la fixation, la liaison ou l'immobilisation des enzymes ne doit pas être attribuée à un type quelconque d'adsorbant ou de support d'une nature ionique, mais simplement à une liaison "physique" des enzymes avec le support.

  
En particulier, on a observé que la fixation des enzymes peut se faire avec des résines tant cationiques qu'anioniques dont la nature ionique a été détruite, aussi bien qu'avec des résines polymères macroporeuses n'ayant aucun comportement ionique, quel qu'il soit.

  
Bien entendu, on sait que les enzymes peuvent être fixées sur tous les types de supports semblables à des résines d'une nature ionique, ou sur des corps d'alumine dont les dimensions des pores sont déterminées selon une gamme spécifiée.

  
 <EMI ID=3.1> 

  
ponsable de l'immobilisation des enzymes. Dans le second cas, les enzymes sont en quelque sorte "piégées" dans les pores du corps d'alumine (dont les dimensions ont une ouverture maximale

  
o

  
 <EMI ID=4.1> 

  
Il n'est pas évident qu'un adsorbant macroporeux ou

  
 <EMI ID=5.1> 

  
rablement plus grandes, c'est-à-dire de 1000 à 90.000 A et dont la nature n'est pas ionique, adsorbe des enzymes.

  
On a constaté également que ces résines macroporeuses ou macroréticulaires maintiennent l'activité enzymatique beaucoup plus longtemps que d'autres supports, ce qui permet le passage de plus de volumes de lit de substrat et, par conséquent, de plus de produit. Finalement, on a encore observé que la consommation totale des enzymes est nettement plus basse.

  
La présente invention peut être mise en oeuvre avec une large gamme de systèmes macroporeux et plusieurs carbohydrases telles que la 8-amylase, l'a-amylase, la glucoamylase, l'amylase fongique, l'isoamylase et l'isomérase de glucose.

  
Seules l'isomérase de glucose, la glucoamylase et la 8-amylase sont utilisées. On notera bien entendu que l'invention peut aussi être mise en oeuvre avec d'autres enzymes du type carbohydrase et sur des substrats comprenant d'autres constituants du sucre, afin d'obtenir des produits finals dotés de caractéristiques différentes.

  
Exemple 1 : Essai avec une isomérase liée

  
Une colonne, dont le rapport du diamètre à la hauteur est de 1,8 à 1, est remplie de 250 cm3 d'une résine échangeuse d'anions faiblement basique du type du groupe fonctionnel des amines tertiaires, et ce selon un cycle dit de chlorure

  
 <EMI ID=6.1> 

  
Après remplissage de la colonne, on la lave au méthanol et on la balaie avec un tampon au pH 7. La colonne est en-

  
 <EMI ID=7.1> 

  
 <EMI ID=8.1> 

  
pH 7,5 et désaérée avec de l'azote. 1,1 g d'isomérase de glucose liquide provenant du streptomyces olivochromogènes et se caractérisant par 2500 unités d'activité par ml, passe dans la colonne à une vitesse de 0,25 volume de lit par heure. Ensuite, la solution de dextrose passe immédiatement après le dépôt de l'enzyme dans la colonne.

  
 <EMI ID=9.1> 

  
lit par heure et à une température constante de 66[deg.]C. Le substrat a une concentration de 53%, 
 <EMI ID=10.1> 
 <EMI ID=11.1> 

  
 <EMI ID=12.1> 

  
 <EMI ID=13.1> 

  
 <EMI ID=14.1> 

  
 <EMI ID=15.1> 

  
54%,  
 <EMI ID=16.1> 
 Cet essai démontre que l'on peut s'attendre à un bon rendement et à une bonne efficacité.

  
Exemple 3: Essai avec une glucoamylase

  
La résine utilisée est celle dénommée IRA 983 de Rohm & Haas également. La colonne est préparée de la même façon qu'aux exemples 1 et 2 , mais tamponnée au pH 4,2, au lieu de 7.

  
Le substrat est un hydrolysat d'amidon enzyme-enzyme d'un équivalent en dextrose de 18. La température de la colonne

  
 <EMI ID=17.1> 

  
volume de lit par heure, On utilise 2 g de glucoamylase se caractérisant par 180 unités d'activité par gramme. La substance sèche du substrat est de 30%. On utilise 50 cm3 de support.

  

 <EMI ID=18.1> 
 

  
On travaille à un débit constant de 0,5 volume de lit par heure et à une température constante de 60[deg.]C. La consommation d'enzyme est de 0,05% (procédé classique = ) Exemple 4: Immobilisation d'une isomérase montrant la nature

  
non ionique de la fixation

  
On utilise la résine ES 762 qui est une résine expérimentale fournie par Diaprosim, Il s'agit d'un polymère macroporeux qui n'exerce aucune activité d'échange d'ions, mais qui absorbe largement l'enzyme.

  
 <EMI ID=19.1> 

  
des monomères, puis une colonne de 50 cm3 est construite.

  
On tamponne la résine au pH 8,3 en utilisant une

  
 <EMI ID=20.1> 

  
circuler au débit de 0,5 volume de lit par heure.

  
L'enzyme utilisée est une isomérase de glucose dérivée du Streptomyces olivochromogenes et se caractérisant par
1000 unités d'activité par gramme, et ce au niveau de 1 g par

  
 <EMI ID=21.1> 

  
de 0,2 volume de lit par heure pendant 24 heures. Une solution de dextrose à 50% contenant 10 &#65533;<2> mole de magnésium et 10 <3> mole de cobalt passe à travers la colonne au débit de 0,4 volume de lit par heure initialement.

  

 <EMI ID=22.1> 
 

  
L'enzyme isomérase est retenue par la résine.

  
Exemple 5 : Immobilisation d'une glucoamylase montrant la nature

  
non ionique Ce la fixation

  
Même support que celui de l'exemple 4.

  
On tamponne au pH 4,2 en utilisant une solution à 1% de CH3COO Na-CH3COOH, en la faisant recirculer au débit de 0,5 volume de lit par heure.

  
L'enzyme est la glucoamylase liquide G990 se caractérisant par 180 unités d'activité par 4 gr, de 6990 pour 50 cm3 de support par remise en circulation de l'enzyme au débit de 0,2 volume de lit par heure pendant 24 heures. On introduit dans la colonne une maltodextrine dont l'équivalent en dextrose est
15 et dont la teneur en substance sèche est de 30%.

  
On travaille à 55[deg.]C.

  

 <EMI ID=23.1> 


  
L'enzyme glucoamylase est retenue par la résine.

  
 <EMI ID=24.1> 

  
non-ionique de la fixation

  
Même support que ceux des exemples 4 et 5 et même tampon que celui de l'exemple 5. 0,1 g par litre de cystéine

  
 <EMI ID=25.1> 

  
L'enzyme est la 6-amylase XP 206 en poudre de Nagase, qui est tout d'abord extraite avec de l'eau pendant 30 minutes,'puis

  
 <EMI ID=26.1> 

  
 <EMI ID=27.1> 

  
 <EMI ID=28.1> 

  
 <EMI ID=29.1> 

  
 <EMI ID=30.1>  

  
Le substrat est chelaté, avant son introduction dans la colonne, pour éliminer les ions métalliques.

  

 <EMI ID=31.1> 


  
Exemple 7 : Immobilisation d'une isomérase sur une résine

  
cationique.

  
La résine utilisée est la C264 de Diaprosim. Il s'agit d'un copolymère de styrène avec un groupe sulfonique. La résine n'a aucune nature anionique.

  
On construit une colonne de 250 cm3 et on la lave

  
 <EMI ID=32.1> 

  
On tamponne de la même façon qu'à l'exemple 4. Le dépôt de l'enzyme se fait en utilisant l'isomérase liquide C992 à raison de 2 g par 250 cm3 de support au débit de 0,2

  
 <EMI ID=33.1> 

  
On utilise une solution de dextrose à 60[deg.]C et on règle au pH 8,3 avec 10 &#65533;2 mole de magnésim et 10 &#65533;3 mole de cobalt.

  
La concentration du substrat correspond aux 53% d'un équivalent en dextrose enzyme-enzyme de 96. 

  

 <EMI ID=34.1> 


  
Bien que le débit en volume de lit par heure et les rendements en lévulose soient plutôt bas, ces chiffres montrent que l'isomérase est retenue par le support.

  
Dans l'exemple suivant, on utilise la résine Amberlite XN 1009 (=XAD 12) fabriquée par Rohm & Haas; il s'agit d'un adsorbant macroréticulaire comprenant des groupes azote très polaires.

  
Exemple 8 : Fixation de la glucoamylase

  
L'adsorbant XN 1009 (500 cm3) est (1) lavé avec trois volumes de NaOH pour le débarrasser de la protéine et des colorants, (2) lavé de nouveau et (3) neutralisé entièrement par 2 volumes de HCl.

  
Après élimination par lavage de l'excès d'acide,

  
la résine est tamponnée avec un tampon à l'acétate au pH 4,2.

  
Après tamponnage, la température est portée à 60[deg.]C et l'enzyme est ajoutée comme suit :

  
1. Adoucissement pour équilibrer la pression osmotique en envoyant du dextrose 17,5 Bé sur la résine;

  
2. Dépôt d'enzyme : 900 unités de glucoamylase (G990) sont déposés en deux heures (1 volume de lit par heure).

  
L'enzyme est dissoute dans la solution de dextrose semblable à celle utilisée pour l'adoucissement.

  
3. Un hydrolysat enzyme-enzyme dont la teneur en substance sèche est 30,6% et l'équivalent en dextrose 18, est préparé. La solution à bas équivalent en dextrose et dont le pH est 4,2, est introduite dans la colonne.

  
Le débit est porté à 0,2 volume de lit par heure.

  
Les données moyennes suivantes sont enregistrées:

  

 <EMI ID=35.1> 


  
lit par heure 200 heures.

  
Le débit est ensuite réduit à 0,1 volume de lit par heure pour maintenir l'équivalent en dextrose à 96-97. Durée du débit de 0,1 volume de lit par

  
heure 250 heures Durée totale 450 heures

  
L'équivalent en dextrose ne tombe ensuite qu'à 64 et la'colonne est arrêtée.

  
Enzyme utilisée (total)

  

 <EMI ID=36.1> 


  
Consommation moyenne de l'essai discontinu: 150 unités par kg. Commentaire

  
 <EMI ID=37.1> 

  
XN 1009 neutralisé. 

REVENDICATIONS

  
1.- Procédé pour conduire une réaction enzymatique consistant à mettre le substrat en contact avec une enzyme afin de le faire réagir avec ladite enzyme qui a été adsorbée par un système macroporeux, caractérisé en ce que la dimension des pores du systèmes macroporeux est suffisamment grande pour adsorber l'enzyme.

Claims (1)

  1. 2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le système macroporeux est non ionique.
    3.- Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le système libre non ionique est un composé choisi dans le groupe comprenant une matière d'échange d'anions neutralisée par des anions et une matière d'échange de cations neutralisée par des cations.
    4.- Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que les anions sont choisis dans le groupe comprenant <EMI ID=38.1>
    amines et leurs combinaisons.
    5.- Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que les cations sont choisis dans le groupe comprenant du magnésium, du cobalt, du vanadium et leurs combinaisons.
    6.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à conduire la réaction enzymatique en utilisant au moins deux enzymes différentes, adsorbées par le système macroporeux.
    7.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat est un composé choisi dans le groupe comprenant un hydrolysat d'amidon, un amidon liquéfié, une solution de dextrose, une solution contenant du dextrose et du lévulose, une maltodextrine d'une teneur en dextrose de moins de 5% et un hydrolysat d'amidon contenant du maltose et dont la teneur en dextrose est inférieure à 5%. 8.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat se compose d'une matière ayant subi une réaction enzymatique partielle et contient des enzymes actives lorsqu'il est mis en contact avec le système macroporeux, de façon que les enzymes actives contenues dans le substrat soient adsorbées par le système macroporeux et agissent de façon à remplacer les enzymes adsorbées au préalable par le
    <EMI ID=39.1>
    rieure.
    9.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat a des propriétés ioniques telles qu'il ne modifie pas les propriétés ioniques du système macroporeux.
    10,- Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce que le substrat est déminéralisé.
    <EMI ID=40.1>
    en ce que l'enzyme adsorbante est choisie dans le groupe comprenant 1-la-amylase, la glucoamylase, la 6-amylase, 1\amylase fongique, l'isoamylase, l'isomérase de glucose et leurs combinaisons,
    12.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le système macroporeux, où l'enzyme est adsorbée, est déposé dans une colonne.
    13,- Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que la colonne a au moins 1 mètre de haut et un rapport du diamètre à la hauteur d'au moins là 3.
    <EMI ID=41.1>
    en ce qu'il consiste à régénérer le Système macroporeux en;
    <EMI ID=42.1> 15.- Système continu amélioré pour fixer ou immoliliser des enzymes sur des supports d'un type spécial, substantiellement tel que décrit précédemment.
BE2056582A 1977-01-10 1978-01-10 Systeme continu ameliore pour fixer ou immobiliser des enzymes sur des supports d'un type special BE862765A (fr)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0112147A3 (fr) * 1982-12-14 1986-11-20 Cpc International Inc. Procédé enzymatique continu pour la production de maltose à partir d'amidon et d'hydrolysats d'amidon
EP0234415A3 (en) * 1986-02-24 1988-05-11 Miles Laboratories, Inc. Method for the preparation of an enzyme-containing cell immobilized conjugate and the immobilized conjugate produced thereby

Cited By (2)

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EP0112147A3 (fr) * 1982-12-14 1986-11-20 Cpc International Inc. Procédé enzymatique continu pour la production de maltose à partir d'amidon et d'hydrolysats d'amidon
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