KR20240094190A - 나문재 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
나문재 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 나문재 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 나문재 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 나문재 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 나문재 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
탈모는 두피에서 머리카락이 빠지는 현상을 의미하며, 일반적으로 두피의 성모(굵고 검은 머리털)가 빠지는 것을 의미한다. 성모는 색깔이 없고 굵기가 가는 연모와는 달리, 빠질 경우 미용상 문제를 일으킬 수 있다. 한국 사람의 경우 5-7 만개의 머리카락이 있으며, 하루에 약 50-70 개의 머리카락이 빠지는 것은 정상적인 현상이다. 하지만, 100 개 이상의 머리카락이 빠지면 탈모가 진행 중일 가능성이 있다.
종래에는 탈모가 중년 이후의 남성에게만 일어나는 일로, 젊은 남성 및 여성과는 상관없는 문제로 여겨졌지만, 최근에는 연령 또는 성별에 상관 없이 누구에게나 일어나는 경향이 있으며, 탈모가 진행되면 미용 및 외관상의 문제로 큰 스트레스를 유발할 수 있다.
이러한 탈모에 대한 종래의 치료방법으로는 대표적으로 미녹시딜 계열의 약물 치료법이 사용되고 있지만, 이는 사람에 따라 효과가 크지 않고 약물을 중단할 경우 다시 탈모가 진행된다고 알려져 있다. 또한, 미녹시딜은 각질, 피부발진, 홍조, 두통, 어지러움 및 안구자극 등의 부작용을 유발하기도 하며, 혈관 확장을 유발하기 때문에 심혈관계 질환자, 18세 이하인 사람 및 임산부는 사용하지 못하는 한계가 있다.
나문재(Suaeda glauca Bunge)는 국내 해안가를 중심으로 서식하는 자생식물로 갯솔나무라고도 불리우며, 명아주과(Chenopodiacaea)에 속한 1년생 초본이다. 나문재는 종래에는 고혈압과 간질환 치료를 위한 약물로 처방되었으며, 최근에는 항산화, 항염증 및 변비 치료 효과가 보고된 바 있지만, 탈모증 예방 또는 치료 효과에 대해서는 어떠한 개시도 되어 있지 않다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 나문재 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 나문재 추출물 및 분획물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 나문재 분획물로부터 분리한 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있다.
본 발명은 나문재 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물은 하기의 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
본 발명은 상기 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 경피투여형 제제를 제공한다.
본 발명은 상기 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 나문재를 건조하는 단계; 상기 나문재 건조물을 50% 에탄올과 혼합하는 단계; 상기 혼합물을 가온 추출하는 단계; 및 상기 가온 추출물을 여과 및 감압농축하는 단계;를 포함하는 제조방법으로 제조된 나문재 추출물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 나문재를 메탄올로 추출하여 조추출물을 얻는 단계; 상기 조추출물을 물과 노말헥산으로 분배하여 노말헥산 분획물을 얻는 단계; 상기 노말헥산 분획을 실시하고 남은 증류수 현탁액에 동량의 클로로포름으로 분배하여 클로로포름 분획물을 얻는 단계; 및 상기 클로로포름 분획을 실시하고 남은 증류수 현탁액에 동량의 에틸아세테이트로 분배하여 에틸아세테이트 분획물을 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 나문재 분획물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 나문재 분획물의 제조방법은 상기 에틸아세테이트 분획을 실시하고 남은 증류수 현탁액에 동량의 노말부탄올로 분배하여 노말부탄올 분획물을 얻는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 에틸아세테이트 분획물을 제조하는 단계; 및 상기 제조 단계에서 얻은 에틸아세테이트 분획물을 크로마토그래피로 분획하여 화합물을 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는 하기의 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
본 발명의 나문재 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 탈모 치료시 부작용이 없고, 발모 효과가 우수하여 의약품, 의약외품, 화장품 및 건강기능식품에도 유용하게 활용될 수 있다.
또한, 본 발명의 나문재 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 종래의 대표적인 탈모 치료제인 미녹시딜에 비해 발모 효과가 우수하다.
본 발명의 효과들은 이상에서 언급한 효과들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 청구범위의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 나문재 추출물의 세포 독성 평가 결과에 대한 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 나문재 추출물을 농도별로 인간모유두세포(HFDPC)에 처리했을 때 VEGF, β-catenin, IGF-1 및 P-GSK 단백질의 발현을 나타낸 western blot 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 나문재 추출물을 농도별로 각질형성세포(HaCaT)에 처리했을 때 β-catenin 및 P-GSK 단백질의 발현을 나타낸 western blot 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 나문재 추출물을 농도별로 인간제대정맥세포(HUVEC)에 처리했을 때 VEGF, β-catenin, IGF-1 및 P-GSK 단백질의 발현을 나타낸 western blot 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 나문재 분획물로부터 화합물을 분리 및 정제하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 6은 본 발명에 따른 나문재 분획물로부터 분리한 화합물을 인간모유두세포(HFDPC)에 처리했을 때, VEGF, β-catenin, IGF-1 및 P-GSK 단백질의 발현을 나타낸 western blot 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 나문재 분획물로부터 분리한 화합물을 각질형성세포(HaCaT)에 처리했을 때 IGF-1 및 P-GSK 단백질의 발현을 나타낸 western blot 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 본 발명에 따른 나문재 분획물로부터 분리한 화합물을 인간제대정맥세포(HUVEC)에 처리했을 때 β-catenin, IGF-1 및 P-GSK 단백질의 발현을 나타낸 western blot 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 나문재 추출물을 농도별로 인간모유두세포(HFDPC)에 처리했을 때 VEGF, β-catenin, IGF-1 및 P-GSK 단백질의 발현을 나타낸 western blot 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 나문재 추출물을 농도별로 각질형성세포(HaCaT)에 처리했을 때 β-catenin 및 P-GSK 단백질의 발현을 나타낸 western blot 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 나문재 추출물을 농도별로 인간제대정맥세포(HUVEC)에 처리했을 때 VEGF, β-catenin, IGF-1 및 P-GSK 단백질의 발현을 나타낸 western blot 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 나문재 분획물로부터 화합물을 분리 및 정제하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 6은 본 발명에 따른 나문재 분획물로부터 분리한 화합물을 인간모유두세포(HFDPC)에 처리했을 때, VEGF, β-catenin, IGF-1 및 P-GSK 단백질의 발현을 나타낸 western blot 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 나문재 분획물로부터 분리한 화합물을 각질형성세포(HaCaT)에 처리했을 때 IGF-1 및 P-GSK 단백질의 발현을 나타낸 western blot 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 본 발명에 따른 나문재 분획물로부터 분리한 화합물을 인간제대정맥세포(HUVEC)에 처리했을 때 β-catenin, IGF-1 및 P-GSK 단백질의 발현을 나타낸 western blot 결과이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명에서“추출물”은 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온, 저온 또는 가온 상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다.
상기 추출물을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 용매 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서“분획물”은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법 또는 이의 조합 등이 될 수 있다.
본 발명에서 상기 분획물의 제조에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획에 사용되는 용매로는 이에 제한되지는 않으나, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 분획물로부터 화합물 분리 및 정제에 사용되는 방법의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 상기 화합물 분리 및 정제에 사용되는 방법으로는 이에 제한되지는 않으나, 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼크로마토그래피(column chromatography), 중압액체크로마토그래피 (medium pressure liquid chromatography: MPLC), 박막크로마토그래피(thin layer chromatography: TLC), HPLC 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰 산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산 등을 포함할 수 있다. 또한 상기 무기산은 이에 제한 되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 “경피투여형 제제”는 피부를 통해 약물을 투여하여 효과를 나타내는 제형을 의미한다. 본 발명에서 경피투여형 제제는 이에 제한되지는 않으나, 연고제, 크림제, 겔제, 로션제, 액제, 유제, 현탁제, 스틱제, 파스타제, 리니멘트제, 파프제, 테이프제, 에어로졸제 또는 외용산제 등이 될 수 있다.
본 발명에서 화장료 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 또는 헤어스프레이 등이 될 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 상세히 기술하나, 하기 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 아니함은 자명하다.
실시예 1. 나문재 에탄올 추출물의 제조
1-1. 나문재 준비
야생의 나문재 지상부를 대한민국 신안군 해변에서 채취하여, 경상국립대학교 생약학 실험실에 채집표본(GNTEX-263)으로 기탁하였다. 상기 기탁한 채집표본과 동일한 나문재의 지상부를 동결건조기로 건조하여 나문재 건조물 2.5 kg을 얻은 후 파쇄하여 준비하였다.
1-2. 나문재 에탄올 추출물의 제조
상기 실시예 1-1에서 준비한 나문재 건조물의 부피와 동량인 50% 에탄올을 준비한 뒤, 상기 나문재 건조물과 상기 50% 에탄올을 혼합하였다. 상기 혼합물을 70℃ 항온수조에서 4시간 동안 가온 추출하여 여과한 뒤, 감압 농축하여 나문재 에탄올 추출물을 얻었다.
실험예 1. 나문재 추출물의 세포독성 평가
인간모유두세포(Human follicle dermal papilla cell; HFDPC)는 Promocell사(Sickingenstr, Heidelberg, Germany)에서 분양받아 사용하였다. 상기 인간모유두세포는 supplementMix(Promocell, Sickingenstr, Heidelberg, Germany)와 1% penicillin-streptomycin이 함유된 Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium(Promocell, Sickingenstr, Heidelberg, Germany) 배지를 이용하여 37℃ 및 5% CO2 환경에서 배양하였다.
각질형성세포(keratinocyte; HaCat)는 한국 KB 코스메틱에서 제공받아 사용하였다. 상기 HaCat 세포는 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% penicillin-streptomycin이 함유된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 이용하여 37℃ 및 5% CO2 환경에서 배양하였다.
인간제대정맥내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells; HUVEC)는 Thermo Fisher scientific사(USA)에서 분양받아 사용하였다. 상기 인간제대정맥내피세포는 EGM™-2 SingleQuots® supplement(Lonza, Walkersville, USA)이 함유된 Endothelial Cell Basal Medium-2(EBM-2, Lonza, Walkersville, USA)배지를 사용하여 37℃ 및 5% CO2 환경에서 배양하였다.
상기 인간모유두세포, 각질형성세포 및 인간제대정맥내피세포에서 나문재 추출물에 대한 세포독성은 Cell Counting Kit-8 키트(CCK-8, Dojindo Molecular Biology, Japan)를 통해 측정하였다. 상기 3가지 세포 모두 96-well plate에 1×105 cells/mL을 100 μL씩 분주한 뒤, 안정화를 위해 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 24시간 동안 배양하였다.
상기 배양한 세포에 상기 실시예 1-2에서 얻은 나문재 추출물을 0, 6.25, 12.5 및 25 mg/ml의 농도별로 처리한 다음 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양한 후, 상기 CCK-8 키트 시약을 10 μL씩 넣고 2시간 동안 반응시킨 후 마이크로플레이트 흡광도 리더 (Infinite M200 PRO, TECAN, Switzerland)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조구의 상기 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.
본 실험 결과, 도 1에 기재한 바와 같이 인간모유두세포, 각질형성세포 및 인간제대정맥내피세포에서 상기 나문재 추출물의 농도별 처리군에 대한 세포독성이 나타나지 않았다.
실험예 2. 인간모유두세포(HFDPC)에서 나문재 추출물에 의한 탈모 관련 단백질 발현
인간모유두세포를 6-Well Plate에 3×105 cells/well이 되도록 분주하여 안정화를 위해 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양한 세포에 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 얻은 나문재 추출물을 0, 6.25, 12.5 및 25 mg/ml 농도별로 처리한 뒤, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였고, 양성대조군으로 미녹시딜(MNX)을 10 uM을 처리하였다.
상기 미녹시딜과 농도별 나문재 추출물을 처리한 각 Well의 세포 배양액을 제거한 다음 PBS로 세척한 후 M-per Buffer를 사용하여 cell lysate를 준비하였고, 4℃의 조건에서 14,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 얻은 상등액을 총 단백질 추출액으로 사용하였다. 상기 단백질의 농도는 Bradford Assay로 정량한 후, 10% Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis(SDS-PAGE)에 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 단백질을 PVDF membrane으로 Transfer 한 후, 5% Non-Fat Dry Milk를 함유한 TBST에 담구어 상온에서 1시간 동안 배양하여 비특이적 단백질에 대한 Blocking을 실시하고 TBST로 세척하였다. 상기 Blocking한 membrane에 1차 항체를 처리하여 4℃에서 15시간 동안 반응시킨 뒤, TBST로 세척하고 처리된 상기 1차 항체에 맞는 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 다시 TBST로 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) kit로 반응시킨 후 Chemidoc image 분석기(Vilber Fusion FX5, Germany)를 이용하여 VEGF, β-catenin, IGF-1 및 P-GSK 단백질의 발현 양을 확인하였다.
본 실험 결과, 도 2 및 표 1에 기재한 바와 같이 나문재 추출물의 농도별 처리군 중에서 가장 낮은 농도인 6.25 mg/ml 처리군에서 VEGF, β-catenin, IGF-1 및 P-GSK의 모든 단백질의 발현이 미녹시딜 처리군 대비 증가하였으며, 상기 나문재 추출물을 12.5 mg/ml 농도로 처리한 군에서 발현이 가장 높게 나타났다.
실험예 3. 각질형성세포(HaCaT)에서 나문재 추출물에 의한 탈모 관련 단백질 발현
각질형성세포를 6-Well Plate에 3×105 cells/well이 되도록 분주하여 안정화를 위해 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양한 세포에 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 얻은 나문재 추출물을 0, 6.25, 12.5 및 25 mg/ml 농도별로 처리한 뒤, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였고, 양성대조군으로 미녹시딜(MNX)을 10 uM을 처리하였다.
상기 미녹시딜과 농도별 나문재 추출물을 처리한 각 Well의 세포 배양액을 제거한 다음 PBS로 세척한 후 M-per Buffer를 사용하여 cell lysate를 준비하였고, 4℃의 조건에서 14,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 얻은 상등액을 총단백질 추출액으로 사용하였다. 상기 단백질의 농도는 Bradford Assay로 정량한 후, 10% Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis(SDS-PAGE)에 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 단백질을 PVDF membrane으로 Transfer 한 후, 5% Non-Fat Dry Milk를 함유한 TBST에 담구어 상온에서 1시간 동안 배양하여 비특이적 단백질에 대한 Blocking을 실시하고 TBST로 세척하였다. 상기 Blocking한 membrane에 1차 항체를 처리하여 4℃에서 15시간 동안 반응시킨 뒤, TBST로 세척하고 처리된 1차 항체에 맞는 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 다시 TBST로 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) kit로 반응시킨 후 Chemidoc image 분석기(Vilber Fusion FX5, Germany)를 이용하여 β-catenin 및 P-GSK 단백질의 발현 양을 확인하였다.
본 실험 결과, 도 3 및 표 2에 기재한 바와 같이 β-catenin 단백질의 발현에서 무처리군 대비 미녹시딜 처리군은 9% 증가하였으며, 나문재 추출물 처리군에서 미녹시딜 처리군 대비 증가하였다. 특히 나문재 추출물을 6.25 mg/ml 농도로 처리한 군에서 미녹시딜 처리군 대비 β-catenin 단백질의 발현량이 88% 증가하여, 미녹시딜에 비해 나문재 추출물이 탈모 치료에서 우수함을 나타내었다. 또한, p-GSK 단백질 발현에서 무처리군 대비 미녹시딜 처리군은 6% 감소함을 보였으며, 나문재 추출물을 25mg/ml 농도로 처리한 군에서 미녹시딜 처리군 대비 P-GSK 단백질의 발현량이 11% 증가하였다.
실험예 4. 인간제대정맥세포(HUVEC)에서 나문재 추출물에 의한 탈모 관련 단백질 발현
인간제대정맥세포를 6-Well Plate에 3×105 cells/well이 되도록 분주하여 안정화를 위해 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양한 세포에 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 얻은 나문재 추출물을 0, 6.25, 12.5 및 25 mg/ml 농도별로 처리한 뒤, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였고, 양성대조군으로 미녹시딜(MNX)을 10 μM을 처리하였다.
상기 미녹시딜을 처리한 각 Well의 세포 배양액을 제거한 다음 PBS로 세척한 후 M-per Buffer를 사용하여 cell lysate를 준비하였고, 4℃의 조건에서 14,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 얻은 상등액을 총 단백질 추출액으로 사용하였다. 상기 단백질의 농도는 Bradford Assay로 정량한 후, 10% Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis(SDS-PAGE)에 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 단백질을 PVDF membrane으로 Transfer 한 후, 5% Non-Fat Dry Milk를 함유한 TBST에 담구어 상온에서 1시간 동안 배양하여 비특이적 단백질에 대한 Blocking을 실시하고 TBST로 세척하였다. 상기 Blocking한 membrane에 1차 항체를 처리하여 4℃에서 15시간 동안 반응시킨 뒤, TBST로 세척하고 처리된 상기 1차 항체에 맞는 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 다시 TBST로 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) kit로 반응시킨 후 Chemidoc image 분석기(Vilber Fusion FX5, Germany)를 이용하여 VEGF, β-catenin, IGF-1 및 P-GSK 단백질의 발현 양을 확인하였다.
본 실험 결과, 도 4 및 표 3에 기재한 바와 같이 나문재 추출물 처리군은 모든 농도에서 VEGF, β-catenin, IGF-1 및 P-GSK의 모든 단백질의 발현이 미녹시딜 처리군 대비 증가하였으며, 상기 나문재 추출물을 6.25 mg/ml 농도로 처리한 군에서 β-catenin 및 IGF-1 단백질의 발현이 무처리군 대비 각각 34% 및 45% 증가하였다. 또한, 상기 나문재 추출물 6.25 mg/ml 처리군에서 미녹시딜 처리군 대비 β-catenin 및 IGF-1 단백질의 발현이 각각 32% 및 39% 증가하여, 미녹시딜에 비해 나문재 추출물이 탈모 치료에서 우수함을 나타내었다. 상기 나문재 추출물을 25mg/ml 농도로 처리한 군에서 VEGF 및 P-GSK 단백질의 발현이 무처리군 대비 각각 57% 및 11% 증가하였으며, 미녹시딜 처리군 대비 각각 58% 및 17% 증가하여, 미녹시딜에 비해 나문재 추출물이 탈모 치료에서 우수함을 나타내었다.
실시예 2. 나문재 분획물의 제조
2-1. 나문재 메탄올 조추출물의 제조
상기 실시예 1-1에서 준비한 나문재 건조물의 부피와 동량 이상의 80% 메탄올을 준비한 뒤, 상기 나문재 건조물과 상기 80% 메탄올을 혼합하였다. 상기 혼합물을 상온에서 3시간 동안 초음파 추출하여 1차 추출액을 얻었으며, 상기 1차 추출액을 얻은 방법과 동일한 방법으로 2회 추가 추출하여 2 내지 3차 추출액을 얻었다. 상기 1 내지 3차 추출액을 모두 혼합하여 여과한 후 감압 농축하여 나문재 메탄올 조추출물 497.3 g을 얻었다.
2-2. 나문재 노말헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트 분획물의 제조
나문재 노말헥산 분획물의 제조
상기 실시예 2-1에서 추출한 나문재 메탄올 조추출물을 증류수에 현탁한 후 동량의 노말헥산을 가하고 45분 동안 분획깔때기에서 반응시켰다. 상기 노말헥산 반응물의 층이 완전히 나뉘면 노말헥산층만을 분리하여 1차 노말헥산 분획물을 얻었다. 상기 1차 노말헥산 분획물을 얻은 방법과 동일한 방법으로 2회 추가 분획하여 2 내지 3차 노말헥산 분획물을 얻었다. 상기 1 내지 3차 분획물을 모두 혼합하여 나문재 노말헥산 분획물을 얻었다.
나문재 클로로포름 분획물의 제조
상기 노말헥산 분획을 실시하고 남은 증류수 현탁액에 동량의 클로로포름을 가하고 45분 동안 분획깔때기에서 반응시켰다. 상기 클로로포름 반응물의 층이 완전히 나뉘면 클로로포름층만을 분리하여 1차 클로로포름 분획물을 얻었다. 상기 1차 클로로포름 분획물을 얻은 방법과 동일한 방법으로 2회 추가 분획하여 2 내지 3차 클로로포름 분획물을 얻었다. 상기 1 내지 3차 클로로포름 분획물을 모두 혼합하여 나문재 클로로포름 분획물을 얻었다.
나문재 에틸아세테이트 분획물의 제조
상기 클로로포름 분획을 실시하고 남은 증류수 현탁액에 동량의 에틸아세테이트를 가하고 45분 동안 분획깔때기에서 반응시켰다. 상기 에틸아세테이트 반응물의 층이 완전히 나뉘면 에틸아세테이트층만을 분리하여 1차 에틸아세테이트 분획물을 얻었다. 상기 1차 에틸아세테이트 분획물을 얻은 방법과 동일한 방법으로 2회 추가 분획하여 2 내지 3차 에틸아세테이트 분획물을 얻었다. 상기 1 내지 3차 에틸아세테이트 분획물을 모두 혼합하여 나문재 에틸아세테이트 분획물을 얻었다.
2-3. 나문재 노말부탄올 분획물의 제조
상기 에틸아세테이트 분획을 실시하고 남은 증류수 현탁액에 동량의 노말부탄올을 가하고 45분 동안 분획깔때기에서 반응시켰다. 상기 노말부탄올 반응물의 층이 완전히 나뉘면 노말부탄올층만을 분리하여 1차 노말부탄올 분획물을 얻었다. 상기 1차 노말부탄올 분획물을 얻은 방법과 동일한 방법으로 2회 추가 분획하여 2 내지 3차 노말부탄올 분획물을 얻었다. 상기 1 내지 3차 에틸아세테이트 분획물을 모두 혼합하여 나문재 노말부탄올 분획물을 얻었다.
실시예 3. 나문재 분획물로부터 화합물의 분리 및 구조 동정
3-1. 나문재 분획물로부터 화합물의 분리
실시예 2-1 및 2-2와 동일한 방법으로, 나문재 에틸아세테이트 분획물을 준비하였다. 상기 에틸아세테이트 분획물을 CHCl3, MeOH과 H2O 혼합용매로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 23개의 소분획으로 나누었다. 상기 23개의 소분획을 E-1 내지 E-23으로 명명하였다. 상기 소분획 E-7에 대하여 다시 CHCl3와 MeOH의 혼합용매로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 17개의 소분획으로 나누었으며, 상기 17개의 소분획을 E-7-1 내지 E-7-17으로 명명하였다(도 5 참조).
상기 소분획 E-7-9에 대하여 H2O와 MeOH의 혼합용매로 중압액체 크로마토그래피(MPLC)를 수행하여 14개의 소분획으로 나누었으며, 상기 14개의 소분획을 E-7-9-1 내지 E-7-9-14로 명명하였다. 상기 소분획 E-7-9-1으로부터 화합물 7 내지 8을, 상기 E-7-9-2으로부터 화합물 3을, 상기 E-7-9-4으로부터 화합물 2를, 상기 E-7-9-6으로부터 화합물 1을 분리하였다(도 5 참조).
상기 소분획 E-7-7에 대하여 H2O와 MeOH의 혼합용매로 ODS 겔 크로마토그래피를 수행하여 5개의 소분획으로 나누었으며, 상기 5개의 소분획을 E-7-7-1 내지 E-7-7-5으로 명명하였다. 상기 소분획 E-7-7-5로부터 고속액체 크로마토그래피(HPLC) 정제를 통해 화합물 4를 분리하였다(도 5 참조).
또한, 상기 소분획 E-20에 대하여 H2O와 MeOH의 혼합용매로 중압액체 크로마토그래피(MPLC)를 수행하여 18개의 소분획으로 나누었으며, 상기 18개의 소분획을 E-20-1 내지 E-20-18로 명명하였다. 상기 소분획 E-20-8로부터 고속액체 크로마토그래피(HPLC) 정제를 통해 화합물 5 내지 6을 분리하였다(도 5 참조).
3-2. 나문재 분획물로부터 분리한 화합물의 구조 동정
상기 실시예 3-1에서 나문재 분획물로부터 분리한 총 8개의 화합물을 1H-핵자기공명 스펙트럼(1H-NMR spectrum) 및 13C-핵자기공명 스펙트럼(13C-NMR spectrum)을 측정하여 구조를 동정한 결과, 화합물 1은 하기 화학식 1로 표시되는 N-트랜스-페룰로일티라민(N-trans-feruloyltyramine)으로, 화합물 2는 하기 화학식 2로 표시되는 N-페룰로일 노르메타네프린(N-feruloyl normetanephrine)으로, 화합물 3은 하기 화학식 3으로 표시되는 트롤린(Trolline)으로, 화합물 4는 하기 화학식 4로 표시되는 캠페롤(Kaempferol)으로, 화합물 5는 하기 화학식 5로 표시되는 캠페롤-3-O-β-D-글루코시드(Kaempferol-3-O-β-D-glucoside)으로, 화합물 6은 하기 화학식 6으로 표시되는 케르세틴-3-O-β-D-글루코시드(Quercetin-3-O-β-D-glucoside)으로, 화합물 7은 하기 화학식 7으로 표시되는 티로솔(Tyrosol)으로, 화합물 8은 하기 화학식 8로 표시되는 하이드록시티로솔(Hydroxy tyrosol)으로 동정되었다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
실험예 5. 나문재 분획물로부터 분리한 화합물의 세포독성평가
인간모유두세포, 각질형성세포 및 인간제대정맥내피세포에서 나문재 분획물로부터 분리한 화합물에 대한 세포독성은 CCK-8 키트를 통해 측정하였다. 상기 3가지 세포 모두 96-well plate에 1×105 cells/mL을 100 μL씩 분주한 뒤, 안정화를 위해 37℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 동안 배양하였다.
상기 배양한 세포에 실시예 3에서 얻은 8종의 화합물을 10 μM로 처리한 다음 37℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 동안 배양한 후, 상기 CCK-8 시약을 10 μL씩 넣고 2시간 동안 반응시킨 후 마이크로플레이트 흡광도 리더(Infinite M200 PRO, TECAN, Switzerland)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
본 실험 결과, 상기 나문재 분획물로부터 분리한 화합물 8종은 상기 인간모유두세포, 각질형성세포 및 인간제대정맥내피세포에 대한 세포독성이 나타나지 않았다.
실험예 6. 인간모유두세포(HFDPC)에서 나문재 분획물로부터 분리한 화합물에 의한 탈모 관련 단백질 발현
인간모유두세포를 6-Well Plate에 3×10*?* cells/well이 되도록 분주하여 안정화를 위해 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양한 세포에 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 얻은 나문재 분획물로부터 분리한 화합물 1 내지 8을 각각 10 μM 농도로 처리한 뒤, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였고, 양성대조군으로 미녹시딜(MNX) 10 μM을 처리하였다.
상기 미녹시딜과 나문재 화합물 1 내지 8을 처리한 인간모유두세포에서 단백질을 추출하여 western blot 실험을 통해 β-catenin, p-GSK, IGF-1및 VEGF 단백질의 발현을 확인하는 과정은 상기 실험예 3과 동일하게 진행하였다.
본 실험 결과, 도 6 및 표 4에 기재한 바와 같이 상기 화합물 1 내지 8 처리군에서 VEGF 및 IGF-1 단백질의 발현이 무처리군 및 미녹시딜 처리군 대비 모두 증가하였으며, 특히 화합물 4 처리군에서 4가지 단백질의 발현량이 가장 높게 증가하였으며, 무처리군 대비 β-catenin, p-GSK, IGF-1, VEGF에서 각각 33%, 53%, 46%, 186% 증가하였다.
실험예 7. 각질형성세포(HaCaT)에서 나문재 분획물로부터 분리한 화합물에 의한 탈모 관련 단백질 발현
각질형성세포를 6-Well Plate에 3×10*?* cells/well이 되도록 분주하여 안정화를 위해 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양한 세포에 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 얻은 나문재 분획물로부터 분리한 화합물 1 내지 8을 각각 10 μM 농도로 처리한 뒤, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였고, 양성대조군으로 미녹시딜(MNX) 10 μM을 처리하였다.
상기 미녹시딜과 나문재 화합물 1 내지 8을 처리한 각질형성세포에서 단백질을 추출하여 western blot 실험을 통해 IGF-1 및 P-GSK 단백질의 발현을 확인하는 과정은 상기 실험예 3과 동일하게 진행하였다.
본 실험 결과, 도 7 및 표 5에 기재한 바와 같이 상기 화합물 1 내지 8 처리군에서 P-GSK 단백질의 발현이 무처리군 및 미녹시딜 처리군 대비 모두 증가하였으며, 특히 상기 화합물 8 처리군에서 P-GSK 단백질의 발현량이 미녹시딜 처리군 대비 142% 증가하였다. 또한, 상기 화합물 7 처리군에서 IGF-1 단백질의 발현이 미녹시딜 처리군 대비 23% 증가하였다.
실험예 7. 인간제대정맥세포(HUVEC)에서 나문재 분획물로부터 분리한 화합물에 의한 탈모 관련 단백질 발현
인간제대정맥세포를 6-Well Plate에 3×10*?* cells/well이 되도록 분주하여 안정화를 위해 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양한 인간제대정맥세포에 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 얻은 나문재 분획물로부터 분리한 화합물 1 내지 8을 각각 10 μM 농도로 처리한 뒤, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였고, 양성대조군으로 미녹시딜(MNX) 10 μM을 처리하였다.
상기 미녹시딜과 나문재 화합물 1 내지 8을 처리한 인간제대정맥세포에서 단백질을 추출하여 western blot 실험을 통해 β-catenin, IGF-1 및 P-GSK 단백질의 발현을 확인하는 과정은 상기 실험예 4와 동일하게 진행하였다.
본 실험 결과, 도 8 및 표 6에 기재한 바와 같이 상기 화합물 1 내지 8 처리군에서 β-catenin 단백질의 발현이 무처리군 대비 모두 증가하였으며, 상기 화합물 1 내지 7 처리군의 경우 β-catenin 단백질의 발현이 미녹시딜 처리군 대비 모두 증가하였다. 특히, 상기 화합물 3 내지 7 처리군은 β-catenin 단백질의 발현이 무처리군 대비 각각 108%, 119%, 122%, 108% 또는 96% 증가하였다. 또한, 상기 P-GSK 단백질의 발현은 상기 화합물 4 내지 6 처리군에서 무처리군 대비 증가하였으며, 상기 IGF-1 단백질의 발현은 상기 화합물 1 내지 8 처리군에서 무처리군 및 미녹시딜 처리군 대비 모두 증가하였다.
이상 설명으로부터, 본 발명에 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다.
Claims (11)
- 나문재 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 화합물은
하기의 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
- 제1항 또는 제2항에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 경피투여형 제제.
- 제1항 또는 제2항에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 의약외품 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 화장료 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 화장료 조성물은
헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 화장료 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 건강기능식품 조성물.
- 나문재를 건조하는 단계;
상기 나문재 건조물을 50% 에탄올과 혼합하는 단계;
상기 혼합물을 가온 추출하는 단계; 및
상기 가온 추출물을 여과 및 감압농축하는 단계;를 포함하는 제조방법으로 제조된 나문재 추출물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진, 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
- 나문재를 메탄올로 추출하여 조추출물을 얻는 단계;
상기 조추출물을 물과 노말헥산으로 분배하여 노말헥산 분획물을 얻는 단계;
상기 노말헥산 분획을 실시하고 남은 증류수 현탁액에 동량의 클로로포름으로 분배하여 클로로포름 분획물을 얻는 단계; 및
상기 클로로포름 분획을 실시하고 남은 증류수 현탁액에 동량의 에틸아세테이트로 분배하여 에틸아세테이트 분획물을 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 나문재 분획물의 제조방법.
- 제9항에 있어서,
상기 에틸아세테이트 분획을 실시하고 남은 증류수 현탁액에 동량의 노말부탄올로 분배하여 노말부탄올 분획물을 얻는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나문재 분획물의 제조방법.
- 제9항의 방법으로 에틸아세테이트 분획물을 제조하는 단계; 및
상기 제조 단계에서 얻은 에틸아세테이트 분획물을 크로마토그래피로 분획하여 화합물을 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는 하기의 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물의 제조방법.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
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| KR101757775B1 (ko) | 2016-06-24 | 2017-07-17 | 연세대학교 원주산학협력단 | 참외 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물 |
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