KR20240081502A - 신규 메탄 생산 균주 및 이를 이용한 메탄 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규 메탄 생산 균주 및 이를 이용한 메탄 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 이산화탄소 및 수소 기질로부터 메탄을 생산하는 능력을 갖는 기탁번호 KCTC 15130BP로 기탁된 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주 및 이를 이용하여 메탄을 생산하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신규 메탄 생산 균주 및 이를 이용한 메탄 생산 방법에 관한 것이다.
미생물을 이용한 메탄 생산 기법은 혐기적으로 처리된 배지에 이산화탄소(CO2)와 수소(H2)를 공급하여 독립영양 호열성 고세균으로 Autotrophic hydrogenotrophic thermophilic Methanogen 등과 같은 미생물을 배양하면, 배양된 미생물이 다음의 반응식과 같은 화학기작을 통해 메탄을 생산한다.
[반응식 1]
CO2 + 4H2 →CH4 + 2H2O
종래 메탄생산 공정에 필요한 균주를 상업적으로 이용하기 위해서는 기존에 연구개발을 통해 개발된 미생물의 국가 또는 보유기관을 통하여 수급하여야 하며, 이 경우 유전자원 관련 국제 의정서인 '나고야 의정서(Nagoya Protocol)'에 의거하여 반드시 해당 균주 사용으로 인해 발생되는 상업적 이익에 대하여 해당 균주를 보유 중인 국가 또는 보유기관과의 사전협의 및 계약을 통하여 공유하여야 하는 경제적 문제점이 발생한다.
또한 종래의 기술은 공정효율 향상 등을 위해서는 해당 균주의 유전자 조작, 배양방법 변경, 및 공정개선 등의 실시가 필요한 경우, 해당 균주의 특허권을 소유하고 있는 국가 및 보유기관으로부터의 제약이 수반되는 여러 가지 문제점들이 따른다.
전술한 바와 같이, 기존 미생물을 활용하여 메탄 생산 공정에 적용하기 위해서는 여러 가지 법적, 경제적 제약이 존재하는바, 이를 해결하기 위한 방안으로 최근에는 국내에서 자체 개발한 메탄 생산 균주가 보고되고 있으나, 메탄 생산 능력이 다소 미흡하다는 단점이 존재한다.
본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 우수한 메탄 생산성을 갖는 신규 메탄 생산 균주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 메탄 생산 균주를 배양하여 메탄을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,
기탁번호 KCTC 15130BP로 기탁되고, 메탄 생산능을 갖는 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주를 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 균주는 이산화탄소 및 수소 기질로부터 메탄을 생성하는 것일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 균주의 16S rRNA 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 균주는 담배 폐기물을 포함하는 혐기소화조에서 분리된 것일 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 완충용액, 영양소, 및 미량원소 용액을 포함하는 배양 배지를 준비하는 단계; (b) 상기 배양 배지에 기탁번호 KCTC 15130BP로 기탁되고, 메탄 생산능을 갖는 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주를 접종하는 단계; (c) 이산화탄소와 수소가 혼합된 혼합가스 조건하에서, 상기 균주를 배양하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계를 통해 발생한 메탄을 수득하는 단계;를 포함하는 메탄 생산방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 균주의 16S rRNA 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 완충용액은, 제1인산칼륨(KH2PO4) 및 제2인산칼륨(K2HPO4) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 영양소는, 염화암모늄(NH4Cl), 염화칼륨(KCl), 황화나트륨 9수화물(Na2S·9H2O), 아세트산나트륨(sodium acetate), 효모추출물(yeast extract), 트립카아제 펩톤(Trypticase peptone), 염화나트륨(NaCl), 염화마그네슘 6수화물(MgCl2·6H2O), 황산마그네슘 7수화물(MgSO4·7H2O), 염화칼슘 2수화물(CaCl2·2H2O), 황산 제1철암모늄(Fe(NH4)2(SO4)2-6H2O), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 시스테인-HCl(cystein-HCl) 및 인산암모늄((NH4)HPO4) 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 미량 원소 용액은, 나이트릴로트리아세트산(nitrilotriacetic acid), 황산마그네슘(MgSO4), 염화마그네슘 6수화물(MgCl2·6H2O), 황산망간 1수화물(MnSO4·H2O), 염화나트륨(NaCl), 황산철 7수화물(FeSO4·7H2O), 염화칼슘 2수화물(CaCl2·2H2O), 염화코발트 6수화물(CoCl2·6H2O), 염화아연(ZnCl2), 황산구리 5수화물(CuSO4·5H2O), 황산칼륨알루미늄 12수화물(AlK(SO4)2-12H2O), 붕산(H3BO3), 몰리브덴산나트륨(Na2MoO4), 염화니켈 6수화물(NiCl2·6H2O), Na2WO4·2H2O, 황산마그네슘 7수화물(MgSO4·7H2O), 황산코발트 7수화물(CoSO4·7H2O), 황산아연 7수화물(ZnSO4·7H2O), 몰리브덴산나트륨 2수화물(Na2MoO4·2H2O), 아셀렌산나트륨 5수화물(Na2SeO3·5H2O), 사염화철 4수화물(FeCl4·4H2O), 염화제2구리 2수화물(CuCl2·2H2O), 염화망간 4수화물(MnCl2·4H2O), 몰데브덴산 암모늄((NH4)6Mo7O24·4H2O), 염화알루미늄(AlCl3), 에틸렌디아민사아세트산(ethylenediamine-N, N, N', N'-tetraacetic acid), 염화마그네슘 6수화물(MgCl2·6H2O), 염화칼륨(KCl), 염화철 2수화물(FeCl2·2H2O), 염화철 4수화물(FeCl2·4H2O), 셀렌산나트륨(Na2SeO4), 아셀렌산나트륨(Na2SeO3), Na2WO4, 및 염화알루미늄 6수화물(AlCl3·6H2O) 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 (c) 단계의 배양 온도는 50 내지 70℃일 수 있다.
본 발명에 따르면, 우수한 메탄 생산성을 갖는 메탄 생산 균주인 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주를 제공할 수 있다. 또한, 상기 균주를 이용한 메탄 생산 기술은 메탄 생산에 필요한 원료로 대표적인 지구온난화 물질인 이산화탄소(CO2)와 물의 전기분해에서 얻어지는 수소(H2)를 활용할 수 있다는 점에서 이산화탄소 활용을 통한 온실가스 감축효과는 물론 재생에너지 보급 확대에 따른 풍력과 태양광 등의 변동성 전원의 장기 및 대용량 에너지 저장기술로 활용이 가능한 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주의 생장 곡선을 나타낸 것이다.
도 2는 종래 메탄 생산 균주 Methanothermobacter sp. KEPCO2와, 본 발명에 따른 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주의 메탄 생산 능력을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 16S rRNA 서열 분석을 통해 작성한 본 발명에 따른 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주의 계통도이다.
도 4는 본 발명에 따른 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주의 16S rRNA 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 종래 메탄 생산 균주 Methanothermobacter sp. KEPCO2와, 본 발명에 따른 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주의 메탄 생산 능력을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 16S rRNA 서열 분석을 통해 작성한 본 발명에 따른 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주의 계통도이다.
도 4는 본 발명에 따른 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주의 16S rRNA 서열을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 용어 "균주(strain)"는 단일 개체나 순수 분리 배양된 생명체의 개체군(population)을 지칭한다. 보다 구체적으로, 미생물이나 세포 등을 분리해서 특정한 배지를 사용하여 순수 배양하고, 계속 심어서 계대배양할 때, 그 계통을 균주라 지칭할 수 있다. 상기 균주는 같은 종에 있는 최종계의 단계의 구분단위일 수 있다.
본 발명의 용어 "균주 동정(strain identification)"은 상기 균주를 계통 분류상의 체제에 따라 검색하여 종명을 밝히는것을 지칭한다. 상기 균주 동정은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 16S rRNA 유사성에 의한 균주 동정, DNA-DNA 혼성화 정도(DDH)에 의한 균주 동정 등이 있으나, 이로 제한되는 것이 아니다.
본 명세서에 개시된 일 실시예에 의하면, 16S rRNA 유사성에 의한 균주 동정을 위하여 고세균 특이적 16S rRNA 프라이머가 사용될 수 있다. 상기 고세균 특이적 16S rRNA 프라이머는 제1 프라이머(GAT TAA GCC ATG CAA GTC GAA CGA; 서열 번호 2)가 포워드 프라이머로 이용되고, 제2 프라이머(CTC CTC AAA GAA CCC AGA TTC GAC; 서열 번호 3)가 리버스 프라이머로 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 “배양(cultivation)은 미생물 및 발생 중인 동식물의 배 등의 생물체나 기관·조직·세포 등의 생물체 일부를 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 상기 배양 시 배양하는 생물체의 종류에 따라 각종 영양물질이나 삼투압·pH·온도 등 이 결정될 수 있다.
본 발명의 용어 “계대 배양(subculture)"은 세포 증식을 위해 새로운 배양 접시에 옮겨 세포의 대(代)를 계속 이어서 배양하는 것을 의미한다. 상기 배양 또는 계대 배양은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
이러한 용어들에 더하여, 필요한 경우 기타 용어들이 명세서 내의 다른 곳에서 정의된다. 본원에서 달리 명확하게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 업계 용어들은 업계에서 인식하는 의미를 가질 것이다.
본 발명에서는 메탄 생산능을 갖는 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주를 제공한다.
본 발명에 따른 균주는 담배 폐기물(니코틴을 포함한 담배 잎, cellulose acetate filter, 담배잎과 필터를 감싸고 있는 종이로 구성)을 기질로 하는 혐기 발효조의 샘플에서 분리하였다. 구체적으로, 상기 샘플을 하기 표 1의 배지에서 배양하고 메탄 생성을 분석함으로써 메탄생성능이 있는 균주만을 선별하였다. 이어서 동일한 배지를 계대 배양하여 균주를 분리하였으며, 선별된 균주를 동정함으로써 선별된 균주가 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) 균주임을 확인하였다. 이후, 상기 균주를 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP로 명명하였고, 미생물 기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2022년 10월 12일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 15130BP를 부여받았다.
본 발명에 따른 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주의 16S-rRNA 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 균주는 이산화탄소 및 수소 기질로부터 메탄 및 물을 생성할 수 있다.
상기 메탄 및 물의 생성비는 1:1.5 내지 1:2.5일 수 있다. 바람직하게는, 상기 메탄 및 물의 생성비는 1:2일 수 있다.
상기 이산화탄소 및 수소 기질의 반응비는 1:3.5 내지 1:4.5일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이산화탄소 및 수소 기질의 반응비는 1:4일 수 있다.
상기 반응을 요약하면, 다음과 같은 반응 공식이 될 수 있다.
CO2 + 4H2 → CH4 +2H2O
본 발명에 따른 균주는 바이오에너지 생산 미생물일 수 있다.
상기 바이오에너지는 바이오메탄일 수 있다. 상기 바이오메탄은 바이오 가스 에너지로 활용될 수 있다. 상기 바이오메탄은 전기 생산 또는 열 생산에 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 균주는 호열성 균일 수 있다.
본 발명에 따른 균주는 독립영양생물(autotroph)일 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 완충용액, 영양소, 및 미량원소 용액을 포함하는 배양 배지를 준비하는 단계; (b) 상기 배양 배지에 기탁번호 KCTC 15130BP로 기탁되고, 메탄 생산능을 갖는 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주를 접종하는 단계; (c) 이산화탄소와 수소가 혼합된 혼합가스 조건하에서, 상기 균주를 배양하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계를 통해 발생한 메탄을 수득하는 단계;를 포함하는 메탄 생산방법을 제공한다.
본 발명의 메탄 생산 방법에서 (a) 단계는, 본 발명의 메탄 생산 균주인 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주를 배양하여 메탄을 생산하는 배양 배지를 준비하는 단계로 아래와 같은 조성 물질이 포함될 수 있다.
상기 배양 배지에 포함되는 상기 완충용액은, 제1인산칼륨(KH2PO4) 및 제2인산칼륨(K2HPO4) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 배양 배지에 포함되는 상기 영양소는 염화암모늄(NH4Cl), 염화칼륨(KCl), 황화나트륨 9수화물(Na2S·9H2O), 아세트산나트륨(sodium acetate), 효모추출물(yeast extract), 트립카아제 펩톤(Trypticase peptone), 염화나트륨(NaCl), 염화마그네슘 6수화물(MgCl2·6H2O), 황산마그네슘 7수화물(MgSO4·7H2O), 염화칼슘 2수화물(CaCl2·2H2O), 황산 제1철암모늄(Fe(NH4)2(SO4)2-6H2O), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 시스테인-HCl(cystein-HCl) 및 인산암모늄((NH4)HPO4) 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 배양 배지에 포함되는 상기 미량 원소 용액은, 나이트릴로트리아세트산(nitrilotriacetic acid), 황산마그네슘(MgSO4), 염화마그네슘 6수화물(MgCl2·6H2O), 황산망간 1수화물(MnSO4·H2O), 염화나트륨(NaCl), 황산철 7수화물(FeSO4·7H2O), 염화칼슘 2수화물(CaCl2·2H2O), 염화코발트 6수화물(CoCl2·6H2O), 염화아연(ZnCl2), 황산구리 5수화물(CuSO4·5H2O), 황산칼륨알루미늄 12수화물(AlK(SO4)2-12H2O), 붕산(H3BO3), 몰리브덴산나트륨(Na2MoO4), 염화니켈 6수화물(NiCl2·6H2O), Na2WO4·2H2O, 황산마그네슘 7수화물(MgSO4·7H2O), 황산코발트 7수화물(CoSO4·7H2O), 황산아연 7수화물(ZnSO4·7H2O), 몰리브덴산나트륨 2수화물(Na2MoO4·2H2O), 아셀렌산나트륨 5수화물(Na2SeO3·5H2O), 사염화철 4수화물(FeCl4·4H2O), 염화제2구리 2수화물(CuCl2·2H2O), 염화망간 4수화물(MnCl2·4H2O), 몰데브덴산 암모늄((NH4)6Mo7O24·4H2O), 염화알루미늄(AlCl3), 에틸렌디아민사아세트산(ethylenediamine-N, N, N', N'-tetraacetic acid), 염화마그네슘 6수화물(MgCl2·6H2O), 염화칼륨(KCl), 염화철 2수화물(FeCl2·2H2O), 염화철 4수화물(FeCl2·4H2O), 셀렌산나트륨(Na2SeO4), 아셀렌산나트륨(Na2SeO3), Na2WO4, 및 염화알루미늄 6수화물(AlCl3·6H2O) 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 메탄 생산 방법에서 상기 (b) 단계는 상기 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주를 배양 배지에 접종하는 단계로, 구체적으로는 전체 배양 배지 100 부피%에 대하여, 5 내지 15 부피%의 양으로 상기 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주를 접종할 수 있으며, 보다 바람직하게는 전체 배양 배지 100 부피%에 대하여 10 부피%를 접종할 수 있다.
만약 상기 균주의 접종량이 제시된 범위를 벗어나 5 부피% 미만이면, 메탄 생산 균주인 상기 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주의 성장 및 메탄 생산 효과가 미미할 수 있고, 배양 시간도 길어지므로 경제성이 떨어진다. 반대로 메탄 생산 균주의 접종량이 전체 배양 배지 100 부피%에 대해 15 부피%를 초과하면, 배양 배지 대비 많은 양의 균주로 인해 오히려 메탄 생산 균주의 성장성이 저하되는 문제가 발생하므로, 상기 제시된 범위의 접종량으로 균주를 접종하는 것이 바람직하다.
본 발명의 메탄 생산 방법에서 상기 (c) 단계는, 이산화탄소와 수소가 혼합된 혼합가스 조건하에서, 상기 균주를 배양하는 단계이다. 이때, 상기 배양은 배양 배지가 담겨있는 배양 용기를 아르곤과 같은 불활성화 기체를 이용하여 혐기성 조건으로 만든 후, 이산화탄소와 수소의 혼합가스가 상기 배양 용기에 주입된 상태에서 수행될 수 있다.
상기 이산화탄소와 수소의 혼합 가스의 부피비는 1:3.5 내지 1:4.5일 수 있고, 바람직하게는 1:4일 수 있다.
또한, 상기 균주는 40℃ 내지 75℃ 온도에서 배양될 수 있으며, 바람직하게는 50℃ 내지 70℃ 온도에서 배양될 수 있다.
상기 제시된 배양조건을 벗어나면, 본 발명의 메탄 생산 균주인 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주의 성장이 제대로 이루어지지 못할 수 있으므로, 상기 제시된 배양 조건을 만족하는 것이 바람직하다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
균주의 분리
(1) 담배를 기질로 하는 혐기소화조로부터 1 mL의 inoculum을 하기 표 1의 배지 19 mL에 접종하였다. 이때, 160 mL의 serum bottle을 사용하였고, working volume 20 mL이며 초기 serum bottle 내의 압력은 1.8 bar였다. 60 ℃, 150 rpm shaking incubator에서 배양하였으며, 이때 liquid는 담배를 기질로 하는 혐기소화조와 같은 짙은 갈색이었다. 다음으로, GC-TCD를 통해 상기 bottle에서 압력이 감소하고, CO2와 H2의 생산이 줄어듦과 동시에 CH4 생산이 확인되면 fresh 한 medium에 다시 1 mL을 접종하여 계대배양을 진행하였다.
(2) 다음으로, 계대배양한 bottle에서 압력이 감소하고, CO2와 H2의 소모와 CH4이 생산이 확인되면 이를 원액, 10배, 102배, 103배로 희석하여 고체 배지에 spreading하였다. 고체 배지는 하기 표 1의 배지와 같은 조성에 11 g/L의 gelite를 포함하고 있으며 50 mL의 serum bottle 내에서 굳힌 것을 사용하였다. 이때, 계대배양한 bottle 내의 액체는 하얀색에 가까운 상태이다.
(3) 다음으로, 상기 고체 배양을 통해 얻어진 single colony를 15 mL hungate tube에 옮겨, CO2와 H2의 소모와 CH4 생산 여부를 확인하였다. CH4 생산이 확인된 colony들을 160 mL serum bottle에 옮겨 CH4이 생산 속도를 비교하고, 가장 빠르게 CH4이 생산을 보이는 bottle의 배양액을 희석하여 상기 (2)와 같은 방법으로 single colony를 얻었으며, 상기 (2)와 (3)을 수차례 반복하여 균주를 분리하였다.
| Buffer (g/L) | K2HPO4 | 2.04 g |
| KH2PO4 | 1 g | |
| Nutrient (g/L) | NH4Cl | 1 g |
| NaCl | 1 g | |
| MgCl2·6H2O | 0.1 g | |
| CaCl2·2H2O | 0.06 g | |
| NaHCO3 | 4 g | |
| Cysteine-HCl | 0.5 g | |
| Na2S·9H2O | 0.5 g | |
| 1000X Trace solution (g/L) Stock solution | Nitriloacetic acid | 12.8 g |
| FeCl2·4H2O | 1.35 g | |
| MnCl2·4H2O | 0.1 g | |
| CaCl2·2H2O | 0.1 g | |
| ZnCl2 | 0.1 g | |
| H3BO3 | 0.01 g | |
| NaCl | 1 g | |
| NiCl2·6H2O | 0.15 g | |
| AlCl3·6H2O | 0.05 g | |
| CoCl2·6H2O | 0.024 g | |
| CuCl2·2H2O | 0.025 g | |
| Na2MoO4 | 0.024 g | |
| Na2SeO4 | 0.026 g | |
| Na2WO4·2H2O | 0.25 g |
- Medium pH: pH 7.3
- Head space 조성: CO2 : H2 = 1 : 4
다음으로, 메탄 생성균 specific 프라이머 (서열 번호 2 및 3)를 사용해서 PCR을 진행하고, 전기 영동을 통해 상기 분리된 균주가 단일 균주인지 여부를 확인하였다.
균주 동정
상기 분리된 균주가 단일 균주로 확인이 되어, Methanobacterium sp. DP로 명명하고, 고세균 전용 Specific 프라이머를 이용하여 16S rRNA 서열 분석을 진행하였다(표 2)
| No. | 종류 | 5'-3' sequence | 서열번호 |
| 1 | Forward 프라이머 | GAT TAA GCC ATG CAA GTC GAA CGA | 2 |
| 2 | Reverse 프라이머 | CTC CTC AAA GAA CCC AGA TTC GAC | 3 |
그 결과, 16S rRNA 서열 (서열 번호 1)을 확보하였다.
상기 획득한 서열 번호 1의 16S rRNA 서열을 NCBI database를 통해 BLAST 한 결과, 가장 비슷한 종래 메탄생성균(Methanobacterium thermaggregans strain DSM 3266)과 Methanobacterium sp. DP의 16S rRNA sequence는 16개가 다른 것을 확인하고, Methanobacterium 속 신종 균주로 동정하였다(도 3).
상기 동정된 균주를 부다페스트조약에 따른 미생물 기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2022년 10월 12일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 15130BP를 부여받았다.
균주의
균학적
성질
(1) 반응물 및 생성물
Methanobacterium sp. DP 균주는 이산화탄소 및 수소를 기질로 사용하여 메탄 및 물을 생성하는 것을 확인하였다.
4H2 + CO2 → CH4 +2H2O
(2)
생장능
측정
본 발명에 따른 Methanobacterium sp. DP 균주를 상기 표 1에 따른 조성의 배지, head space 조성 및 60 ℃의 온도에서 배양하여, 상기 균주의 생장을 측정하고 그 결과를 하기 도 1에 나타내었다. 균주의 생장은 600 nm 파장에서 흡광도의 변화 측정을 통해 확인하였다. 채취한 미생물은 증류수에 10배 희석하여 측정하였다.
하기 도 1의 결과를 통해, Methanobacterium sp. DP의 생장 패턴을 확인할 수 있었다. 구체적으로, Methanobacterium sp. DP는 140시간까지 꾸준히 성장하여 3.5까지 바이오매스의 증가를 보였으며, 140시간 이후부터는 흡광도가 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 본 발명의 Methanobacterium sp. DP 균주는 메탄 생성을 위해 장시간 동안 꾸준한 성장성을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
균주의 메탄
생성능
측정
종래 알려진 메탄 생성균 중 메탄 생산성이 가장 우수한 것으로 알려진 Methanothermobacter sp. KEPCO2와 본 발명에 따른 Methanobacterium sp. DP 균주를 상기 표 1에 따른 조성의 배지, head space 조성 및 60 ℃의 온도에서 배양한 후, 이들의 메탄 생산 능력을 비교하고 그 결과를 하기 도 2에 나타내었다.
메탄의 측정은 Methanobacterium sp. DP 를 배양하는 바틀에서 가스를 채취하여 GC-TCD를 통해 이루어졌다. 구체적으로, 미생물이 배양되는 바틀의 압력변화와 GC-TCD를 통해 얻어진 가스 조성을 이용하여, 감소한 이산화탄소, 수소의 양과 함께 생산된 메탄의 양을 확인하였다.
하기 도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 Methanobacterium sp. DP 균주는 48시간 동안 130 mL 이상의 메탄을 생산하는 것으로 나타났고, 이를 통해, 본 발명의 Methanobacterium sp. DP 균주는 종래 Methanothermobacter sp. KEPCO2 대비, 현저하게 향상된 속도로 우수한 메탄 생산 능력을 가짐을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시형태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (10)
- 기탁번호 KCTC 15130BP로 기탁되고, 메탄 생산능을 갖는 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 이산화탄소 및 수소 기질로부터 메탄을 생성하는 것을 특징으로 하는 균주. - 제1항에 있어서,
상기 균주의 16S rRNA 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 균주. - 제1항에 있어서,
상기 균주는 담배 폐기물을 포함하는 혐기소화조에서 분리된 것을 특징으로 하는 균주. - (a) 완충용액, 영양소, 및 미량원소 용액을 포함하는 배양 배지를 준비하는 단계;
(b) 상기 배양 배지에 기탁번호 KCTC 15130BP로 기탁되고, 메탄 생산능을 갖는 메타노박테리움 속(Methanobacterium. sp) DP 균주를 접종하는 단계;
(c) 이산화탄소와 수소가 혼합된 혼합가스 조건하에서, 상기 균주를 배양하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계를 통해 발생한 메탄을 수득하는 단계;를 포함하는 메탄 생산방법. - 제5항에 있어서,
상기 균주의 16S rRNA 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 메탄 생산방법. - 제5항에 있어서,
상기 완충용액은, 제1인산칼륨(KH2PO4) 및 제2인산칼륨(K2HPO4) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 메탄 생산방법. - 제5항에 있어서,
상기 영양소는, 염화암모늄(NH4Cl), 염화칼륨(KCl), 황화나트륨 9수화물(Na2S·9H2O), 아세트산나트륨(sodium acetate), 효모추출물(yeast extract), 트립카아제 펩톤(Trypticase peptone), 염화나트륨(NaCl), 염화마그네슘 6수화물(MgCl2·6H2O), 황산마그네슘 7수화물(MgSO4·7H2O), 염화칼슘 2수화물(CaCl2·2H2O), 황산 제1철암모늄(Fe(NH4)2(SO4)2-6H2O), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 시스테인-HCl(cystein-HCl) 및 인산암모늄((NH4)HPO4) 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 메탄 생산방법. - 제5항에 있어서,
상기 미량 원소 용액은, 나이트릴로트리아세트산(nitrilotriacetic acid), 황산마그네슘(MgSO4), 염화마그네슘 6수화물(MgCl2·6H2O), 황산망간 1수화물(MnSO4·H2O), 염화나트륨(NaCl), 황산철 7수화물(FeSO4·7H2O), 염화칼슘 2수화물(CaCl2·2H2O), 염화코발트 6수화물(CoCl2·6H2O), 염화아연(ZnCl2), 황산구리 5수화물(CuSO4·5H2O), 황산칼륨알루미늄 12수화물(AlK(SO4)2-12H2O), 붕산(H3BO3), 몰리브덴산나트륨(Na2MoO4), 염화니켈 6수화물(NiCl2·6H2O), Na2WO4·2H2O, 황산마그네슘 7수화물(MgSO4·7H2O), 황산코발트 7수화물(CoSO4·7H2O), 황산아연 7수화물(ZnSO4·7H2O), 몰리브덴산나트륨 2수화물(Na2MoO4·2H2O), 아셀렌산나트륨 5수화물(Na2SeO3·5H2O), 사염화철 4수화물(FeCl4·4H2O), 염화제2구리 2수화물(CuCl2·2H2O), 염화망간 4수화물(MnCl2·4H2O), 몰데브덴산 암모늄((NH4)6Mo7O24·4H2O), 염화알루미늄(AlCl3), 에틸렌디아민사아세트산(ethylenediamine-N, N, N', N'-tetraacetic acid), 염화마그네슘 6수화물(MgCl2·6H2O), 염화칼륨(KCl), 염화철 2수화물(FeCl2·2H2O), 염화철 4수화물(FeCl2·4H2O), 셀렌산나트륨(Na2SeO4), 아셀렌산나트륨(Na2SeO3), Na2WO4, 및 염화알루미늄 6수화물(AlCl3·6H2O) 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 메탄 생산방법. - 제5항에 있어서,
상기 (c) 단계의 배양 온도는 50 내지 70℃인 것을 특징으로 하는 메탄 생산방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220153232A KR20240081502A (ko) | 2022-11-16 | 2022-11-16 | 신규 메탄 생산 균주 및 이를 이용한 메탄 생산 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220153232A KR20240081502A (ko) | 2022-11-16 | 2022-11-16 | 신규 메탄 생산 균주 및 이를 이용한 메탄 생산 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR20240081502A true KR20240081502A (ko) | 2024-06-10 |
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| KR1020220153232A KR20240081502A (ko) | 2022-11-16 | 2022-11-16 | 신규 메탄 생산 균주 및 이를 이용한 메탄 생산 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20240081502A (ko) |
-
2022
- 2022-11-16 KR KR1020220153232A patent/KR20240081502A/ko unknown
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