KR102108642B1

KR102108642B1 - 신규 호열성 메탄 생성 미생물

Info

Publication number: KR102108642B1
Application number: KR1020180127075A
Authority: KR
Inventors: 상병인; 주고운; 전병승; 최옥경
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2018-10-23
Filing date: 2018-10-23
Publication date: 2020-05-07
Also published as: KR20200045930A

Abstract

본 명세서는 신규 호열성 메탄 생성 미생물에 관한 것이다. 본 명세서에 의해 개시되는 내용에 따른 신규 호열성 메탄 생성 미생물은 메타노터모박터(Methanothermobacter) KCTC 13661BP이다.

Description

신규 호열성 메탄 생성 미생물 {New Methanothermobacter}

본 명세서에 의해 개시되는 내용은 신규 호열성 메탄 생성 미생물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 메타노터모박터(Methanothermobacter) KCTC 13661BP에 관한 것이다.

메탄균(Methanogen)과는 혐기성 조건으로 메탄을 합성하는 세균의 총칭이다. 메탄균은 지극히 광범위한 환경에 생육하는 것으로 알려져 있다. 메탄균은 동물의 소화기관이나 늪 지대, 해저 퇴적물, 지각 내에 넓게 존재하며, 지구상에서 방출되는 메탄의 대부분을 합성하고 있다. 특히, 소의 장내(루멘)나, 사람의 결장 등에도 존재해, 비교적 친밀한 장소에 생식 하는 생물로서 인지되고 있다. 또, 진흙이나 수질 정화에 있어서의 응용 등도 시도되고 있다.

일반적으로, 메탄균의 생육 기질은 이산화탄소인 것으로 알려져 있다. 그러나, 이 그 밖에도 다양한 탄소원을 메탄으로 변환할 수 있는 메탄균도 존재한다. 예를 들면, Methanosarcinacea strain의 메탄균은, 일산화탄소, 초산, 메탄올, 메탄티올, 메틸아민 등을 이용할 수 있고, 유정으로부터 분리된 Methanolobus siciliae 등은 디메틸술피드를 자화 할 수 있다. 또, Methanogenium organophilum은 제1급 알코올인 에탄올이나 1-프로파놀을 이용할 수 있다. 또 제2급 알코올(ISO 프로파놀, 시크로펜타노르, 2-부탄올등)을 전자 공여체로서 이용하는 것도 있다.

본 출원에 의해 개시되는 내용은 신규 호열성 메탄 생성 미생물, 예를 들어, 메타노터모박터(Methanothermobacter) KCTC 13661BP을 제공한다.

본 출원에 의해 개시되는 기술의 양태에 따르면, 신규 호열성 메탄 생성 미생물, 예를 들어, 메타노터모박터(Methanothermobacter) KCTC 13661BP 균주가 제공된다. 상기 균주는 이산화탄소 및 수소 기질로부터 메탄 및 물을 생성하는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에 의해 개시되는 기술에 따르면, 다음과 같은 효과가 발생한다.

신규 호열성 메탄 생성 미생물, 예를 들어 메타노터모박터(Methanothermobacter) KCTC 13661BP을 제공할 수 있다. 나아가, 메탄 생성 효율이 더욱 증대된 신규 호열성 메탄 생성 미생물을 제공할 수 있다.

도 1은 일 실시예에 개시된 16S rRNA 서열의 전기 영동을 통하여 단일 균주 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 일 실시예에 개시된 16S rRNA 서열 분석을 통한 균주 동정 결과를 나타내는 계통수이다.
도 3 및 도 4는 Methanothermobacter thermautotrophicus (DSM 3590) 및 메타노터모박터(Methanothermobacter) KCTC 13661BP의 염분 농도에 따른 생장능을 비교하기 위하여 Optical density 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 Methanothermobacter thermautotrophicus (DSM 3590) 및 메타노터모박터(Methanothermobacter) KCTC 13661BP의 염분 농도에 따른 메탄 생성능을 비교하기 위하여 VVD(volumes of gas per volume of reactor per day) 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 일 실시예에 개시된 염분 농도에 따른 생장능을 측정하기 위한 Optical density 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 일 실시예에 개시된 염분 농도에 따른 메탄 생성능을 측정하기 위한 VVD 측정 결과를 나타낸다.
도 8은 일 실시예에 개시된 온도에 따른 생장능을 측정하기 위한 Optical density 측정 결과를 나타낸다.
도 9는 일 실시예에 개시된 온도에 따른 메탄 생성능을 측정하기 위한 VVD 측정 결과를 나타낸다.
도 10은 일 실시예에 개시된 배지에 따른 생장능 및 메탄생성능을 측정하기 위하여, Buffered nutrient medium 배지에서 Optical density 및 VVD 측정 결과를 나타낸다.
도 11은 일 실시예에 개시된 배지에 따른 생장능 및 메탄생성능을 측정하기 위하여, DSMZ 141 medium 배지에서 Optical density 및 VVD 측정 결과를 나타낸다.
도 12는 일 실시예에 개시된 배지에 따른 생장능 및 메탄생성능을 측정하기 위하여, Basic anaerobic medium 배지에서 Optical density 및 VVD 측정 결과를 나타낸다.
도 13은 일 실시예에 개시된 배지에 따른 생장능 및 메탄생성능을 측정하기 위하여, European patent medium 배지에서 Optical density 및 VVD 측정 결과를 나타낸다.
도 14는 일 실시예에 개시된 배지에 따른 생장능 및 메탄생성능을 측정하기 위하여, ATCC medium 배지에서 Optical density 및 VVD 측정 결과를 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 대표적인 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

용어 "균주(strain)"는 단일 개체나 순수 분리 배양된 생명체의 개체군(population)을 지칭한다. 보다 구체적으로, 미생물이나 세포 등을 분리해서 특정한 배지를 사용하여 순수 배양하고, 계속 심어서 계대배양할 때, 그 계통을 균주라 지칭할 수 있다. 상기 균주는 같은 종에 있는 최종계의 단계의 구분단위일 수 있다.

용어 "균주 동정(strain identification)"은 상기 균주를 계통 분류상의 체제에 따라 검색하여 종명을 밝히는 것을 지칭한다. 상기 균주 동정은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 16S rRNA 유사성에 의한 균주 동정, DNA-DNA 혼성화 정도(DDH)에 의한 균주 동정 등이 있으나, 이로 제한되는 것이 아니다.

본 명세서에 개시된 일 실시예에 의하면, 16S rRNA 유사성에 의한 균주 동정을 위하여 고세균 특이적 16S rRNA 프라이머가 사용될 수 있다. 상기 고세균 특이적 16S rRNA 프라이머는 제1 프라이머(GAT TAA GCC ATG CAA GTC GAA CGA; 서열 번호 2)가 포워드 프라이머로 이용되고, 제2 프라이머(CTC CTC AAA GAA CCC AGA TTC GAC; 서열 번호 3)가 리버스 프라이머로 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 “배양(cultivation)은 미생물 및 발생 중인 동식물의 배 등의 생물체나 기관·조직·세포 등의 생물체 일부를 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육 시키는 것을 의미한다. 상기 배양 시 배양하는 생물체의 종류에 따라 각종 영양물질이나 삼투압·pH·온도 등 이 결정될 수 있다.

용어 “계대 배양(subculture)"은 세포 증식을 위해 새로운 배양 접시에 옮겨 세포의 대(代)를 계속 이어서 배양하는 것을 의미한다. 상기 배양 또는 계대 배양은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다.

용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

이러한 용어들에 더하여, 필요한 경우 기타 용어들이 명세서 내의 다른 곳에서 정의된다. 본원에서 달리 명확하게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 업계 용어들은 업계에서 인식하는 의미를 가질 것이다.

이하, 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 상세히 설명한다.

본 명세서에 의해 개시되는 일 양태에 따르면, 신규 메탄 생성 균주가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 균주는 중랑하수처리장 혐기소화조의 샘플에서 분리하였다. 구체적으로, 상기 샘플을 Basic anaerobic medium에 배양하고 메탄 생성을 분석함으로써 메탄생성능이 있는 균주만을 선별하였다. 이어서 동일한 배지를 계대 배양하여 균주를 분리하였으며, 선별된 균주를 동정함으로써 선별된 균주가 메타노터모박터(Methanothermobacter) 균주임을 확인하였다. 미생물 기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2018년 10월 16일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 13661BP를 부여받았다.

상기 신규 메탄 생성 균주는 이산화탄소 및 수소 기질로부터 메탄 및 물을 생성할 수 있다.

상기 메탄 및 물의 생성비는 1:1.5 내지 1:2.5 일 수 있다. 바람직하게는, 상기 메탄 및 물의 생성비는 1:2 일 수 있다.

상기 이산화탄소 및 수소 기질의 반응비는 1:3.5 내지 1:4.5 일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이산화탄소 및 수소 기질의 반응비는 1:4 일 수 있다.

상기 반응을 요약하면, 다음과 같은 반응 공식이 될 수 있다.

CO₂ + 4H₂ → CH₄ +2H₂O

상기 신규 메탄 생성 균주는 바이오에너지 생산 미생물일 수 있다.

상기 바이오에너지는 바이오메탄일 수 있다. 상기 바이오메탄은 바이오 가스 에너지로 활용될 수 있다. 상기 바이오메탄은 전기 생산 또는 열 생산에 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에 의해 개시되는 신규 메탄 생성 균주는 다양한 환경에서 생장할 수 있다. 또한, 본 명세서에 의해 개시되는 신규 메탄 생성 균주는 다양한 환경에서 메탄 생성능을 보유할 수 있다.

상기 다양한 환경은 다양한 염 종류일 수 있다. 예를 들어, 상기 염은 Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, NH₄ ⁺, Cl^-, SO₄ ^2-, NO₃ ^2-, CO₃ ^2- 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구현예에 의하면, 본 명세서에 의해 개시되는 신규 메탄 생성 균주는 다양한 염 종류에서 생장할 수 있다. 예를 들어, NaCl 배지에서 생장할 수 있다. 상기 신규 메탄 생성 균주는 염분저항성을 보유하는 균일 수 있다.

다른 구현예에 의하면, 본 명세서에 의해 개시되는 신규 메탄 생성 균주는 다양한 염 종류에서 메탄 생성능을 보유할 수 있다. 예를 들어, NaCl 배지에서 메탄 생성능을 보유할 수 있다.

상기 다양한 환경은 다양한 염분농도 범위일 수 있다. 예를 들어, 상기 염분농도 범위 0mM 내지 50mM, 50mM 내지 100mM, 100mM 내지 200mM, 200mM 내지 300mM, 300mM 내지 400mM 또는 400mM 내지 500mM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구현예에 의하면, 본 명세서에 의해 개시되는 신규 메탄 생성 균주는 다양한 염분 농도 범위에서 생장할 수 있다. 예를 들어, Na⁺ 이온 농도 50mM 내지 450mM 에서 생장할 수 있다. 상기 신규 메탄 생성 균주는 고농도의 염분에 저항성을 보유하는 균일 수 있다.

다른 구현예에 의하면, 본 명세서에 의해 개시되는 신규 메탄 생성 균주는 다양한 염분 농도 범위에서 메탄 생성능을 보유할 수 있다. 예를 들어, Na⁺ 이온 농도 50mM 내지 450mM 에서 메탄 생성능을 보유할 수 있다.

상기 다양한 환경은 다양한 온도 범위일 수 있다.

일 구현예에 의하면, 본 명세서에 의해 개시되는 신규 메탄 생성 균주는 다양한 온도 범위에서 생장할 수 있다. 예를 들어, 30℃ 내지 85℃ 온도에서 생장할 수 있다. 바람직하게는, 45℃ 내지 65℃ 온도에서 생장할 수 있다. 상기 신규 메탄 생성 균주는 호열성 균일 수 있다.

다른 구현예에 의하면, 본 명세서에 의해 개시되는 신규 메탄 생성 균주는 다양한 온도 범위에서 메탄 생성능을 보유할 수 있다. 예를 들어, 30℃ 내지 85℃ 온도에서 메탄 생성능을 보유할 수 있다. 바람직하게는, 50℃ 내지 60℃ 온도에서 메탄 생성능을 보유할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 명세서을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

[실시예 1] 단일 균주 분리 방법

중랑하수처리장 혐기소화조 샘플을 액체 배지에 접종(Basic anaerobic medium 이용)한다. 계대배양을 통해 미생물 활성화(계대배양을 하면서 NaHCO₃, Na₂S의 농도를 기존 대비 3배 증가시킴)시킨다. 이후, 메탄 생산이 확인되면 고체 배지에 spreading하고, 콜로니가 형성되면 다시 액체 배지에 배양한다.

Basic anaerobic medium 조성

pH	7.0
Buffer(g/L)	K₂HPO₄3H₂O 0.4 g
Nutrient (g/L)	NH₄Cl 1 g NaCl 0.1 g MgCl-6H₂O 0.1 g CaCl₂-2H₂O 0.05 g Na₂S-9H₂O 0.5 g NaHCO₃ 4 g
Vitamin solution (mg/L)	Biotin 2.0 mg Folic acid 2.0 mg Pyridoxine HCl 10.0 mg Riboflavin 5.0 mg thiamin 5.0 mg nicotinic acid 5.0 mg pantothenic acid 5.0 mg B-12 0.1 mg P-aminobenzoic acid 5.0 mg Thioctic acid 5.0 mg
Trace solution (g/L)	FeCl₂4H₂O 2 g H₃BO₃0.05 g ZnCl₂0.05 g CuCl₂ 2H₂O 0.038 g MnCl₂ 4H₂O 0.05 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄ 4H₂O 0.05 g AlCl₃ 0.05 g CoCl₂ 6H₂O 0.05 g NiCl₂ 6H₂O 0.092 g EDTA 0.5 g Na₂SeO₃ 5H₂O 0.1 g

메탄 생성균 specific 프라이머 (서열 번호 2 및 3)를 사용해서 PCR을 진행하고, 전기 영동을 통해 단일 균주 여부를 확인하였다(도 1).

[실시예 2] 균주 동정

분리한 균주가 단일 균주로 확인이 되어, Methanothermobacter sp. BS-12으로 명명하고, 고세균 전용 Specific프라이머를 이용하여 16S rRNA 서열 분석을 진행하였다(표 2).

고세균 전용 Specific프라이머

No.	종류	5'-3' sequence	서열 번호
1	Forward 프라이머	GAT TAA GCC ATG CAA GTC GAA CGA	2
2	Reverse 프라이머	CTC CTC AAA GAA CCC AGA TTC GAC	3

그 결과, 16S rRNA 서열 (서열 번호 1)을 확보하였다.

상기 획득한 서열 번호 1의 16S rRNA 서열을 NCBI database를 통해 BLAST 한 결과, 가장 비슷한 종래 메탄생성균(Methanothermobacter wolfeii)과 Methanothermobacter sp. BS-12의 16S rRNA sequence는 2개가 다른 것을 확인하고, Methanothermobacter 속 신종 균주로 동정하였다(도 2).

[실시예 3] 균주의 균학적 성질

실시예 3-1: 반응물 및 생성물

Methanothermobacter sp. BS-12 균주는 이산화탄소 및 수소를 기질로 사용하여 메탄 및 물을 생성하는 것을 확인하였다.

4H₂ + CO₂ → CH₄ +2H₂O

실시예 3-2: 생장능 비교

종래 메탄생성균으로 알려진 Methanothermobacter thermautotrophicus(DSM 3590) 및 본 실시예를 통해 획득한 Methanothermobacter sp. BS-12 균주의 대조군 조건 및 NaCl 고농도 조건에서 배양하여, 생장능을 비교하였다. 상기 대조군 조건은 전술한 표 1의 Basic anaerobic medium 을 의미하고, 상기 NaCl 고농도 조건은 NaCl 53.5mM, 100mM, 200mM, 300mM, 400 mM 농도 조건을 의미한다. 상기 배양은 pH 7.0, 60 ℃, 150 rpm에서 수행되었다.

먼저, 양 균을 Basic anaerobic medium 에서 24시간 배양 후, 생장능 비교 결과, 본 실시예를 통해 획득한 Methanothermobacter sp. BS-12 균주가 대조군 조건 및 NaCl 고농도 조건에서 생장이 약 1.5 내지 3 배 우수한 것을 확인하였다 (도 3).

또한, 양 균을 Basic anaerobic medium 에서 48시간 배양 후, 생장능 비교 결과, 본 실시예를 통해 획득한 Methanothermobacter sp. BS-12 균주가 대조군 조건 및 NaCl 고농도 조건에서 생장이 약 1.5 내지 4 배 우수한 것을 확인하였다 (도 4).

실시예 3-3: 메탄 생성능 비교

종래 메탄생성균으로 알려진 Methanothermobacter thermautotrophicus(DSM 3590) 및 본 실시예를 통해 획득한 Methanothermobacter sp. BS-12 균주를 대조군 조건 및 NaCl 고농도 조건에서 배양하여, 메탄 생성능을 비교하였다. 상기 대조군 조건은 Basic anaerobic medium 을 의미하고, 상기 NaCl 고농도 조건은 NaCl 53.5mM, 100mM, 200mM, 300mM, 400 mM 농도 조건을 의미한다. 상기 배양은 pH 7.0, 60 ℃, 150 rpm에서 수행되었다.

양 균을 Basic anaerobic medium 에서 48시간 배양 후, 메탄 생성능 비교 결과, 본 실시예를 통해 획득한 Methanothermobacter sp. BS-12 균주가 대조군 조건(Basic anaerobic medium) 및 NaCl 고농도 조건에서 메탄 생성능이 약 1.3 내지 4 배 우수한 것을 확인하였다 (도 5).

[실시예 4] 배양 조건에 따른 균주 생장능 및 메탄 생성능

본 실시예를 통해 획득한 Methanothermobacter sp. BS-12 균주의 배양조건을 탐색하기 위하여, 다양한 조건 및 다양한 배지에서 균주를 배양하였다.

실시예 4-1: NaCl Tolerence 탐색

전술한 표 1의 Basic anaerobic medium을 이용하여 Na⁺이온의 농도 53.5mM, 100mM, 200mM, 300mM, 400 mM 에서 Methanothermobacter sp. BS-12를 배양하여 NaCl tolerence를 확인하였다. 상기 배양은 pH 7.0, 60 ℃, 150 rpm에서 수행되었다.

기존 배지의 Na⁺이온의 농도는 53.5 mM이며, 이를 대조군 조건으로 설정하고, 해수의 Na⁺이온 농도(25 g/L

428 mM) 범위까지 생장 조건을 설정하였다.

균주의 기질인 이산화탄소+수소 (1+4)의 혼합가스를 주입하고 배양하였다.

Basic anaerobic medium 에서 염분 농도에 따른 균주의 생장능을 확인하기 위하여, 각 염분 농도 조건에서 Optical density을 측정하였다(도 6).

Basic anaerobic medium 에서 염분 농도에 따른 균주의 메탄생성능을 확인하기 위하여, 각 염분 농도 조건에서 VVD(volumes of gas per volume of reactor per day)를 측정하였다(도 7).

그 결과, NaCl 농도는 본 실시예를 통해 획득한 Methanothermobacter sp. BS-12 균주의 생장 및 메탄 생성에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 따라서 해수 등 고염분 농도 조건에서도 생장 및 메탄 생성이 가능할 것을 확인하였다.

실시예 4-2: 온도 조건 탐색

전술한 표 1의 Basic anaerobic medium 을 이용하여 온도 40℃, 50℃, 60℃, 70℃ 에서 Methanothermobacter sp. BS-12를 배양하여 배양 최적 온도를 확인하였다. 상기 배양은 pH 7.0, 150 rpm에서 수행되었다.

Basic anaerobic medium 에서 온도에 따른 균주의 생장능을 확인하기 위하여, 각 온도 조건에서 Optical density을 측정하였다(도 8).

Basic anaerobic medium 에서 온도에 따른 균주의 메탄생성능을 확인하기 위하여, 각 온도 조건에서 VVD를 측정하였다(도 9).

그 결과, 본 실시예를 통해 획득한 Methanothermobacter sp. BS-12 균주는 60℃에서 최적 생장 나타내고, 50℃에서도 잘 자라는 것을 확인하였으며, 40℃에서도 생장 가능한 것을 확인하였다. 또한, 본 실시예를 통해 획득한 Methanothermobacter sp. BS-12 균주는 60℃에서 최적 메탄 생성능을 나타내고, 50℃에서도 높은 메탄 생성능을 보유하며, 40℃에서도 메탄 생성이 가능한 것을 확인하였다.

실시예 4-3: 배지 조건 탐색

다양한 배지에서 Methanothermobacter sp. BS-12를 배양하여 배양 배지를 탐색하였다. 상기 배양은 pH 7.0, 60℃, 150 rpm에서 수행되었다.

(1) Buffered nutrient medium

Buffered nutrient medium 조성

pH	7.0
Buffer(g/L)	NaH₂PO₄H₂O 9.94 g Na₂HPO₄H₂O 5.5 g
Nutrient (g/L)	NH₄Cl 0.31 g KCl 0.13 g Na₂S 9H₂O 0.5 g
Vitamin solution (mg/L)	Biotin 2.0 mg Folic acid 2.0 mg Pyridoxine HCl 10.0 mg Riboflavin 5.0 mg thiamin 5.0 mg nicotinic acid 5.0 mg pantothenic acid 5.0 mg B-12 0.1 mg P-aminobenzoic acid 5.0 mg Thioctic acid 5.0 mg
Trace solution (g/L)	NTA 1.5 g MgSO₄3.0 g MnSO₄H₂O 0.5 g NaCl 1.0 g FeSO₄7H₂O 0.1 g CaCl₂2H₂O 0.1 g CoCl₂6H₂O 0.1 g ZnCl₂0.13 g CuSO₄5H₂O 0.01 g AlK(SO₄)₂12H₂O 0.01 g H₃BO₃0.01 g Na₂MoO₄0.025 g NiCl₂6H₂O 0.024 g Na₂WO₄2H₂O 0.025 g

상기 표 3에 개시된 Buffered nutrient medium 에서 Methanothermobacter sp. BS-12 균주의 생장능 및 메탄생성능을 확인하였다 (도 10).

(2) DSMZ 141 medium

DSMZ 141 medium 조성

pH	7.0
Buffer(g/L)	K₂HPO₄0.14 g
Nutrient (g/L)	KCl 0.34 g Na-acetate 1 g Yeast extract 2 g Trypticase peptone 2 g NaCl 18 g MgCl₂ 6H₂O 4 g MgSO₄ 7H₂O 3.45 g NH₄Cl 0.25 g CaCl₂ 2H₂O 0.14 g FeNH₄)₂(SO₄)₂6H₂O 0.002 g Na₂S 9H₂O 0.5 g NaHCO₃ 4 g
Vitamin solution (mg/L)	Biotin 2.0 mg Folic acid 2.0 mg Pyridoxine HCl 10.0 mg Riboflavin 5.0 mg thiamin 5.0 mg nicotinic acid 5.0 mg pantothenic acid 5.0 mg B-12 0.1 mg P-aminobenzoic acid 5.0 mg Thioctic acid 5.0 mg
Trace solution (g/L or mg/L)	NTA 1.5 g MgSO4 7H₂O 3.0 g MnSO4 H₂O 0.5 g NaCl 1 g FeSO4 7H₂O 0.1 g CoSO₄ 7H₂O 0.18 g CaCl2 2H₂O 0.1 g ZnSO₄ 7H₂O 0.18 g CuSO4 5H₂O 0.01 g KAl(SO4)2 12H₂O 0.02 g H3BO3 0.01 g Na2MoO4 2H₂O 0.01 g NiCl2 6H₂O 0.03 g Na₂SeO₃ 5H₂O 0.3 mg Na₂WO₄ 2H₂O 0.4 mg

상기 표 4에 개시된 DSMZ 141 medium 에서 Methanothermobacter sp. BS-12 균주의 생장능 및 메탄생성능을 확인하였다 (도 11).

(3) Basic anaerobic medium

전술한 표 1에 개시된 Basic anaerobic medium 에서 Methanothermobacter sp. BS-12 균주의 생장능 및 메탄생성능을 확인하였다 (도 12).

(4) European patent medium

European patent medium 조성

pH	6.8 ~ 7.3
Buffer(g/L)	KH₂PO₄ 1.4 g
Nutrient (g/L)	NH₄Cl 6.4 g NaCl 0.6 g MgCl₂6H₂O 0.2 g Na₂S 9H₂O 0.5 g
Trace solution (mg/L)	FeCl₂ 4H₂O 0.04 g NiCl₂ 6H₂O 1.188 mg CoCl₂ 6H₂O 0.595 mg Na₂MoO₄ 2H₂O 0.605 mg Na₂SeO₃0.173 mg Na₂WO₄2.938 mg

상기 표 5에 개시된 European patent medium 에서 Methanothermobacter sp. BS-12 균주의 생장능 및 메탄생성능을 확인하였다 (도 13).

(5) ATCC medium

ATCC medium 조성

pH	7.2 ~ 7.4
Buffer(g/L)	KH₂PO₄ 0.3 g
Nutrient (g/L)	NH₄Cl 1 g NaCl 0.6 g MgCl 6H₂O 0.1 g CaCl₂2H₂O 0.06 g Na₂S 9H₂O 0.5 g NaHCO₃ 4 g
Trace solution (g/L)	NTA 12.8 g FeCl₃ 6H₂O 1.35 g MnCl₃ 4H₂O 0.1 g ZnCl₂0.1 g H₃BO₃0.01 g NiCl₂ 6H₂O 0.15 g AlCl₃ 6H₂O 0.05 g CoCl₂ 6H₂O 0.024 g CuCl₂ 2H₂O 0.025 g Na₂MoO₄ 2H₂O 0.024 g Na₂SeO₄ 6H₂O 0.026 g

상기 표 6에 개시된 European patent medium 에서 Methanothermobacter sp. BS-12 균주의 생장능 및 메탄생성능을 확인하였다 (도 14).

이들 실시예는 오로지 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로서, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC13661BP

20181016

<110> INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION HANYANG UNIVERSITY <120> New Methanothermobacter <130> CP18-170 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1478 <212> DNA <213> Methanobacterium sp. <400> 1 tccgtttgat cctggcggag gctactgcta ttggggttcg attaagccat gcaagtcgaa 60 cgagcacctc ggtgctcgtg gcgaacggct cagtaacacg tggataacct gcccttggga 120 ccgggataac cccgggaaac tggggataaa cccggatagg tgaagatgcc tggaatggtg 180 cttcacccaa acacctccgg gtgcccaagg atgggtctgc ggccgattag gtagttggta 240 gggtaacggc ctaccaagcc catcatcggt acgggttgtg agagcaagag cccggagatg 300 gaacctgaga caaggttcca ggccctacgg ggcgcagcag gcgcgaaacc tccgcaatgc 360 acgcaagtgc gacgggggaa ccccaagtgc cactcttaac ggggtggctt ttcagaagtg 420 taaaaagctt ctggaataag ggctgggcaa gaccggtgcc agccgccgcg gtaacaccgg 480 cagctcaagt ggtagccgct tttattgggc ctaaagcgtc cgtagccggt ctgataagtc 540 tctggtgaaa tcccacagct taactgtggg aattgctgga gatactatca tgactcgagg 600 tcgggagagg ctggaggtac tcccagggta ggggtgaaat cctgtaatcc tgggaggacc 660 acctgtggcg aaggcgtcca gctggaacga acctgacggt gagggacgaa agccaggggc 720 gcgaaccgga ttagataccc gggtagtcct ggccgtaaac gatgtggact tggtgttgag 780 atggcttcga gctgccccag tgccgaaggg aagctgttaa gtccaccgcc tgggaagtac 840 ggccgcaagg ctgaaactta aaggaattgg cgggggagca ccacaacgcg tggagcctgt 900 ggtttaattg gattcaacgc cggacatctc accaggggcg acagcagtat gatggccagg 960 ttgatgacct tgcttgacaa gctgagagga ggtgcatggc cgccgtcagc tcgtaccgtg 1020 aggcgtcctg ttaagtcagg caacgagcga gacccacgcc cttagttacc agcggaaccc 1080 ttatgggttg ccgggcacac taaggggacc gccagtgata aactggagga aggagtggac 1140 gacggtaggt ccgtatgccc cgaatcccct gggcaacacg cgggctacaa tggcctggac 1200 aatgggttcc gacactgaaa ggtggaggta atcccctaaa ccaggtcgta gttcggatcg 1260 agggctgtaa ctcgccctcg tgaagctgga atgcgtagta atcgcgtgtc attatcgcgc 1320 ggtgaatacg tccctgctcc ttgcacacac cgcccgtcac gccacccaaa aagggcttgg 1380 atgaggccac agcaccttgt tgtggtcgaa tctgggttct ttgaggaggg cgaagtcgta 1440 acaaggtagc cgtaggggaa cctgcggctg gatcacct 1478 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 gattaagcca tgcaagtcga acga 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ctcctcaaag aacccagatt cgac 24

Claims

메탄 생성능을 갖는 균주인
메타노터모박터(Methanothermobacter) KCTC 13661BP.
제1항에 있어서,
상기 균주는 이산화탄소 및 수소 기질로부터 메탄 및 물을 생성하는 것을 특징으로 하는
메타노터모박터(Methanothermobacter) KCTC 13661BP.
제2항에 있어서,
상기 메탄 및 물의 생성비는 1:1.5 내지 1:2.5 인 것을 특징으로 하는
메타노터모박터(Methanothermobacter) KCTC 13661BP.
제2항에 있어서,
상기 이산화탄소 및 수소 기질의 반응비는 1:3.5 내지 1:4.5 인 것을 특징으로 하는
메타노터모박터(Methanothermobacter) KCTC 13661BP.
제1항에 있어서,
상기 균주는 50mM 내지 400mM의 NaCl 농도에서 생장(Cell growth) 하는 것을 특징으로 하는
메타노터모박터(Methanothermobacter) KCTC 13661BP.
제1항에 있어서,
상기 균주는 50mM 내지 400mM의 NaCl 농도에서 메탄 생성(Methanation) 하는 것을 특징으로 하는
메타노터모박터(Methanothermobacter) KCTC 13661BP.
제1항에 있어서,
상기 균주의 생장 배지는 하기 표 1의 조성을 갖는 ATCC medium, 하기 표 2의 조성을 갖는 Buffered nutrient medium, 하기 표 3의 조성을 갖는 DSMZ 141 medium, 하기 표 4의 조성을 갖는 Basic anaerobic medium 및 하기 표 5의 조성을 갖는 European patent medium 중 어느 하나 이상인
메타노터모박터(Methanothermobacter) KCTC 13661BP:

.
제1항에 있어서,
상기 균주의 메탄 생성 배지는 하기 표 1의 조성을 갖는 ATCC medium, 하기 표 2의 조성을 갖는 Buffered nutrient medium, 하기 표 3의 조성을 갖는 DSMZ 141 medium, 하기 표 4의 조성을 갖는 Basic anaerobic medium 및 하기 표 5의 조성을 갖는 European patent medium 중 어느 하나 이상인
메타노터모박터(Methanothermobacter) KCTC 13661BP:

.
제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 서열을 가지는 것을 특징으로 하는
메타노터모박터(Methanothermobacter) KCTC 13661BP.