KR20240072344A - 사과 과피색 판별용 snp 마커 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사과 과피색 판별용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 사과 과피색과 연관된 SNP 마커는 적색 과피를 가지는 품종을 정확하게 판별할 수 있다. 또한, 본 발명의 SNP 마커는 사과의 과실 없이 유엽만으로도 사과의 과피색을 판별할 수 있어 새로운 사과 품종을 개발하는데 있어서 시간, 면적 및 노동력을 절감시킬 수 있어 육종 효율을 개선할 수 있다.

Description

사과 과피색 판별용 SNP 마커 및 이의 용도 {SNP markers for identifying of skin color in apple and use thereof}
본 발명은 사과 과피색 판별용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
사과나무(Malus domestica Borkh)는 장미과(Rosaceae) 배나무아과(Maloideae) 사과나무속(Malus)에 속하는 목본성 영년생 원예작물로 온대 지역에서 주로 재배하고 있으며, 일년생 작물에 비해 과실의 형질을 확인하기까지의 유년기간이 길고, 수형이 커서 육종을 위해서는 많은 포장 면적과 경비가 소요되어 육종 효율이 낮은 작물이다. 또한 사과나무속은 자가불화합성이 존재하고 유전조성이 이형접합(heterozygote) 상태이기 때문에 품종육성에 넓은 포장 면적과 오랜 시간이 소요되어 고비용·저효율의 유전연구 특성을 갖는다.
한·EU, 한·미, 한·중 FTA의 발효로 개방화 시대의 사과의 산업경쟁력이 요구되는 시점에 국내 사과 재배 농가도 고품질의 안전성 높은 기능성 과실을 생산하는 것이 시급하다.동일한 품종으로 수입산과 국내산의 사과·배가 국내에서 경쟁할 경우 국내산 사과가 생산비 혹은 소비자가 측면에서 불리할 수 있다. 하지만 품질이 다른 품종으로 국내 소비자에게 국내산과 수입산의 차별성을 각인시키고 품질의 우수성을 인식시켜 앞으로 다가올 사과 산업의 국제경쟁력을 제고시킬 수 있다. 따라서 앞으로는 차별화된 국내 사과·배 품종의 육성이 필요하다. 또한, 자국 육성 품종에 대한 보호권 강화에 따라 국내 품종육성 및 고유의 육종 기술이 개발되어야 하며, 신품종 육성을 위해서는 고전육종, 분자육종, 유전체 해독 및 정보를 통합한 고효율의 정밀 육종 체계가 필요하다.
따라서, 본 발명자들은 사과 핵심집단 및 reference set에 대해 조사된 과실특성과 reference genome에 따른 GBS-SNP set, array-SNP set의 genotype 정보를 이용하여 GWAS 분석을 수행해 각 형질관 연관된 유의한 SNP를 탐색하였다. 그 중, 사과 과피 착색과 연관성이 높은 SNP를 HRM 분석에 이용하여 일정 수준 이상의 과피 색상을 구분할 수 있는 분자표지를 개발하였다.
대한민국 등록특허 제10-2108750호
본 발명의 목적은 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 201번째 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 5개 이상의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적색 과피의 사과 품종 판별용 SNP 마커 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 또는 2의 201번째 뉴클레오티드 위치의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 적색 과피의 사과 품종 판별용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 적색 과피의 사과 품종 판별을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 201번째 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 5개 이상의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적색 과피의 사과 품종 판별용 SNP 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 201번째 뉴클레오티드 위치의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 적색 과피의 사과 품종 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 사과로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 또는 2의 201번째 뉴클레오티드 위치의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제을 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및 (c) 중합효소연쇄반응 산물을 분석하여 사과 과피색을 판별하는 단계;를 포함하는 적색 과피의 사과 품종 판별을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 사과 과피색과 연관된 SNP 마커는 적색 과피를 가지는 품종을 정확하게 판별할 수 있다. 또한, 본 발명의 SNP 마커는 사과의 과실 없이 유엽만으로도 사과의 과피색을 판별할 수 있어 새로운 사과 품종을 개발하는데 있어서 시간, 면적 및 노동력을 절감시킬 수 있어 육종 효율을 개선할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 사과 유전자원을 대상으로 과피색(Chroma, Hue angle)에 대한 GWAS 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 사과 과피색과 연관성 있는 SNP의 위치를 manhattan plot으로 시각화된 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, GWAS 분석을 수행한 과피색에 대하여 linkage disequilibrium (LD, 연관불균형)을 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 사과 육종용 교배집단 F1 89개체를 대상으로 교배집단의 과피 바탕색, 과피착색 색조를 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명에서 개발된 과피 착색 연관 분자표지를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 HRM (High Resolution Melting)을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 사과 핵심집단과 유전분석용 교배집단 F1 89개체를 대상으로 본 발명에서 개발된 2개의 과피 착색 연관 분자표지의 적용성 검정 결과를 나타낸 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(Terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.
본 발명은 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 201번째 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 5개 이상의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적색 과피의 사과 품종 판별용 SNP 마커 조성물 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "다형성 (polymorphism)"이란 하나의 유전자 좌위 (locus)에 두 가지 이상의 대립 유전자 (allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생 빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립 유전자를 가진다. 따라서, 다형성 마커에 대한 유전적 연관 (genetic association)은 특정한 다형성 마커의 하나 이상의 특정한 대립형질에 대해 연관이 있다는 것을 의미한다. 마커는 단일 염기 다형성 (SNP), 마이크로새틀라이트 (microsatellite), 삽입, 결실, 중복 및 전위 (translocation)를 포함한, 게놈에서 발견되는 임의의 변이 형태의 대립형질을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "단일염기다형성 (SNP)"은 게놈에서 단일염기 (A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체 (individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 단일염기는 폴리뉴클레오티드 서열에 변화 (대체), 제거 (결실) 또는 첨가 (삽입)될 수 있다. SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다. 단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역 (intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성 (degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열상에 변화를 일으키지는 않는다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적 (synonymous)이라 하고 (침묵 돌연변이라고도 불리움), 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP의 경우 비-동의적 (non-synonymous)이라고 한다. 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시키는 반면에 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성한다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.
또한, 상기 사과 품종은 시나노 스위트(Shinano sweet), 홍옥(Jonathan), 후지(Fuji), 홍로(Hongro), 갈라(Gala), 피크닉(Picnic), 롬 뷰티(Rome beauty), 감홍(Gamhong), 핑크 우드(Pink wood), 레드 딜리셔스(Red delicious), 카메오(Cameo), 트레코 레드 갈라(Treco red gala), 크림슨 킹(Crimson king), 양광(Yoko), 스퍼어리브레이즈(Spur earliblaze), 산사(Sansa)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 201번째 위치하는 SNP는 사과 9번 염색체(NC_024247.1)의 29298755 번째 위치에 존재하는 것일 수 있다.
또한, 상기 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 201번째 위치하는 SNP는 사과 9번 염색체(NC_024247.1)의 29693636 번째 위치에 존재하는 것일 수 있다.
이어서, 서열번호 1 또는 2의 201번째 뉴클레오티드 위치의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 적색 과피의 사과 품종 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 상기 제제는 SNP 마커를 포함하는, 10 내지 100 개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드들을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머 (primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산서열로 상보적인 주형 (template)와 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도 (complexity)뿐만 아니라, 온도 및 이온 강도와 같은 이용 조건에 의존할 것이다. 구체적 예로, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 구아닌 및 시토신의 함량 (GC contents), GC배열, 어닐링 (annealing) 온도 및 이온 강도 등 여러 조건을 고려하여 결정해야 한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (dNTPs)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
또한, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드의 크기로 사용될 수 있다. 상기 프라이머 서열은 상기 삽입-결실 (Insertion-Deletion, INDEL) 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이면 사용가능하다. 또한, 당업계에 공지된 합성 기술이면 제한되지 않고 얻을 수 있다.
또한, 상기 프라이머는 변형시킬 수 있으며, 예를 들어 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예를 들면 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예를 들면 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로 의 변형이 있을 수 있다.
또한, 상기 제제는 SNP를 각각 포함하는, 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드들과 특이적으로 혼성화 하는 프로브를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프로브"는 다양한 길이의 DNA 또는 RNA 염기서열로 5' 또는 3' 말단에 방사성 표지 또는 형광 표지 등을 추가로 부착할 수 있으며, 단일가닥의 염기서열로 구성되어 상보적인 서열을 가진 단일가닥 DNA 또는 RNA에 특이적으로 결합하여 혼성화하는 것이 특징이며, 혼성화한 프로브의 표지 신호를 탐지하는 방식을 통해 타겟을 검출할 수 있다. 본 발명에서는 상기 삽입-결실 마커의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 서열을 포함할 수 있고, DNA, RNA 또는 DNA-RNA 잡종 (hybrid) 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 또는 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트;일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 조성물은 HRM(High Resolution Melting) 분석을 위한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "HRM(High Resolution Melting) 분석"은 염기서열의 차이를 분별해주는 기술 중 하나로, 염기서열을 일일이 분석하지 않고도 유전 변이를 신속히 탐색해주는 기술이며, PCR 멜팅(또는 dissociation) 커브 테크닉에 근거한 방법이다. HRM은 DNA 이중나선에 특이적으로 결합하는 형광 염색을 이용함. 중합효소연쇄반응(PCR) 후, 증폭된 DNA 산물은 온도가 상승함에 따라 이중가닥에서 단일가닥 형태로 분해됨. 이 과정에서 이중가닥에 결합하고 있던 형광 염색 물질이 방출되고 그 감소한 양을 곡선 모양의 그래프로 나타낸다. 상기 곡선은 ‘녹는 곡선(melting curve)’이라 하며 DNA의 길이, G와C의 함량, 염기서열의 차이 등에 따라 다른 모양을 나타내고, 이를 실시간으로 분석하여 DNA 염기서열의 차이를 구분한다.
또한, 상기 HRM(High Resolution Melting) 분석은 double-stranded DNA(ds DNA) 결합 염료(dye), PCR, 분석 소프트웨어 등을 활용하여 실시할 수 있다. HRM 분석은 dsDNA 결합 염료(double-stranded DNA-bindimg dye) 존재 하에서 PCR 증폭을 수행함으로써 시작할 수 있다. 결합 염료는 dsDNA 결합시 높은 형광을 나타내고, 비결합 상태에서 낮은 형광을 나타낸다. 증폭 이후, 온도 변화에 따라 형광 데이타를 수집할 수 있는 장치를 이용하여 HRM을 진행할 수 있다. dsDNA가 분리(또는 용융)되어 단일 스트랜드가 되었을 때, 염료는 유출되고 형광에 변화가 일어난다. 그 결과, 앰플리콘에 특이적인 멜트 커브 프로파일을 나타낸다. 본 발명에서는 이와 같은 멜트커브의 패턴을 분석하여, 사과 과피색을 판단할 수 있다. 증폭을 위해, 리얼타임 PCR을 이용하는 것이 바람직하다. real-time PCR에 의할 경우, 증폭, 용융(melt), 데이타 분석을 동일 장치에서 실시할 수도 있기 때문이다. 또한, 표준 PCR 써머 싸이클러에서 PCR 실시 후, HRM 분석을 위해 real-time PCR을 실시할 수도 있다. double-stranded DNA(ds DNA) 결합 염료는 상용의 것으로, 예를 들어, SYTO(R) 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain, EvaGreen(R) Dye, SYBR(R) Green I, SYBR(R) GreenER TM Dyes 등일 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 적색 과피의 사과 품종 판별용 조성물을 포함하는, HRM(High Resolution Melting) 분석용 PCR 키트를 제공한다.
예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 상기 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.
더불어, 본 발명은 (a) 사과로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 또는 2의 201번째 뉴클레오티드 위치의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및 (c) 중합효소연쇄반응 산물을 분석하여 사과 과피색을 판별하는 단계;를 포함하는, 적색 과피의 사과 품종 판별을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 핵산 시료는 사과의 유엽(young leaves)으로부터 수득된 것일 수 있으나, 사과의 어느 부위에서 DNA를 추출하는지 특별히 제한되지 않는다.
또한, 상기 핵산 시료는 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법 (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 추출될 수 있다.
또한, 상기 방법으로 추출된 DNA(또는 핵산 시료)를 PCR로 증폭하는 것 또한 검사 표본을 늘이기 위한 것으로, 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 적당한 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 중합효소연쇄반응 (PCR) 이외에 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 다른 증폭 방법(예를 들어, 리가아제 연쇄반응 (ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭 (nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템 (transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭 (strand displacement amplification) 및 Qβ 복제효소 (replicase)를 통한 증폭, 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA) 등) 또한 본 발명의 범주에 속한다는 것은 명백하다.
또한, 상기 서열번호 1 또는 2의 201번째 뉴클레오티드 위치의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 또는 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트;일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.
<실시예 1> 다양한 사과 유전자원에 대한 유전자형 데이터 및 표현형 데이터 수집
1-1. 사과 유전자원에 대한 유전자형 데이터 수집
GWAS 분석을 위한 사과 유전자원으로 308종을 선별하였으며(표 1 참조), 사과의 유엽을 이용하여 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Germany)으로 genomic DNA를 추출하였고, Genotyping-by-sequencing (GBS) 분석을 수행하였다. Golden Delicious (Velasco et al. 2010) 또는 Golden Delicious double haploid (Daccord et al. 2017)을 reference genome으로 이용하였고, GBS 분석에 의해 선별된 SNP들을 SNP loci of biallelic, missing rate ＜ 20%, minor allele frequency ＞ 5% 조건하에 filtering 수행을 통해 최종적으로 유의한 SNP 51,434개를 선발하였다.
1 Adam's Crab 155 Red well
2 Akane 156 Reinette du Canada
3 Akita 157 Reinette Grise
4 Akita Tare 158 Rescue
5 Alome Mills 159 Rev.w Wilks
6 Alps Otome 160 Ribston
7 Amere 161 Rome beauty
8 Amur Naliv 162 Rossoshanskoje Polosatoje
9 Anna 163 Roter Boskoop
10 Antonovka 164 Royal jonathan
11 Antonovka karmen 165 Royale d'Angleterre
12 Antonovka Shafran 166 Russian
13 Aori No.13 167 Sakada Tsugaru
14 Arlet 168 Samar Candskoe rannee
15 Arthur Turner 169 Scarlet Sentinel M.11 apple
16 Asiro3 170 Sekaiichi
17 Beautiful Arcade 171 Sensacion
18 Belle De Boskoop 172 Senshu
19 Beninomai 173 SH-6
20 Bhrens 174 Shaphran Letnij
21 Blairmont 175 Shengli
22 Brettacher 176 Smokehouse
23 Britegold 177 Smootee golden
24 Calvoic Sansover 178 Somerset Red Streak
25 Carroll 179 Spartan
26 Champion 180 Spigold
27 Chiver's Delight 181 Spur Earliblaze
28 Columbia 182 Spur Golden Delicious
29 Crimson King 183 Spur Starking
30 Dab 325 184 Spy
31 Dayton 185 Stafford
32 Demir 186 Succary
33 Diana 187 Summer Rambo
34 DIR 68T 492 188 Sun Gold
35 Dolgo 189 Sun rise
36 Dorothea 190 Sundale Sturdee Spur
37 Dorsett Golden 191 Sunlight
38 Double Red Delicious 192 Suntan
39 Dunkerton late 193 Surpasse Frequin
40 E559-13 194 Sweet Coppin
41 Eikou 195 Sweet Delicious
42 Eley purple crab 196 Sweet Jonathan
43 Empire 197 Tale Sweet
44 Empress spur G.D 198 Tallmans Sweet
45 Falla Water 199 Telamon
46 Fireside 200 Totem
47 Frequin 201 Transcendent
48 Friandise 202 Treco Red Gala
49 Frostproof 203 Trent
50 Galaxy Gala 204 Virginia Crab K-6
51 George Cave 205 Virginia Gold
52 Golden Delicious 206 Wakapingguo
53 Golden Delicious Klon.Bis 207 White winter pearmain
54 Gravenstein 208 Wickson
55 Hanyae Hanakaidou 209 Wiliams Favourite
56 Heyer #12 210 Winesap
57 Hillwell Red Braeburn 211 Xanthocarpa
58 Hokuto 212 Yantaishaguo
59 Holstein 213 Yellow Bell flower
60 Hordapfel 214 Yellow Delicious
61 Huidobro 215 Yellow spur golden delicious
62 Hunter Melba (4*) 216 Yellow Transparent
63 Hunter Spartan (4*) 217 Yoko
64 Idared I 218 Young America
65 Ikorocavka Alaja 219 Zuboff
66 Indian Magic Crab 220 Kunmamyeongwol
67 Indian Summer Crab 221 Kumhong
68 Ingrid Marie 222 Kiou
69 Iwakami 223 Ryoka
70 Jacquin 224 Manbok
71 Jadernicka 225 Biko Tugaru
72 James Grieve-2 226 Bingwa
73 Jiguan 227 Sandongbingwa
74 Jonafree 228 Seokwang
75 Jonared 229 Seohong
76 Jumbo 230 Sunhong
77 Kamsolmolez 231 SeopsaTsugaru
78 Kile 232 Sinano-red
79 Kingstone Black 233 Sinano-gold
80 Kinrei 234 Tsugaru
81 Lady williams 235 Arisoo
82 Landsberger Reinette 236 Aikahyang
83 Law Red Delicious 237 Anhaeng Tare
84 Laxton's Superb 238 Yeohong
85 Local 10(907583) 239 Yongdonghaedang
86 Local 11(907584) 240 Chicheng
87 Lura Red 241 Zaohuang
88 M.Darth Manta 242 Zhongqiu
89 M.prunifolia Sikora 243 Ginger-gold
90 M.transitoria 244 champion fuji
91 M.Brevipes SI-22-40 245 Chukwang
92 M.floribunda Sieb 246 Shuka Tsugaru
93 M.John Downie 247 Cameo
94 M.mandshurica 248 Vance
95 M.robusta var electa 88075 249 Honggeum
96 M.sikkimensis 250 Hongso
97 M.Taurensii 251 Hwangtaepyeong
98 M3 252 Fukutami
99 M7 253 Himekami
100 Macfree 254 Asiro8
101 Magnolia Gold 255 Ben Davis
102 Manshu 256 Chouyou
103 Marin Onfroy 257 Cox's orange pippin
104 Marshall McIntosh 258 Geneva Black
105 Maypole 259 Geneva Early
106 Mayqueen 260 Harcourt
107 McIntosh 261 Hibernal
108 McIntosh spur 262 Humboldt
109 Melrose 263 Idajon
110 Merton Pearmain 264 Jon Grimes
111 Mislimka 265 Jonagold Daliguy
112 Misuzu Tsugaru 266 King
113 Mobb's royal 267 Lodi
114 Namangan Skoe Krasnoe 268 M.arnoldiana Sarg
115 Nico 269 Merton Ace
116 Nishtani Jonathan 270 Michelin
117 Noiphing 271 Mollie's Delicious
118 Norda 272 Newtwon pippin
119 Norfolk Royal 273 Odin
120 Novosibirsk sweet 274 Parkland
121 Nugget 275 Pilot
122 Obilnoye 276 Roberts Crab
123 Oswego 277 Rome
124 Ottawa 278 Webster
125 Ottawa 8 228 279 Winter Banana
126 Ottawa546 280 Xingiangtianguo
127 Parkian Crab 81090HT 281 Kwansang1
128 Pearmain de clark 282 Noya
129 Pederstrup 283 Summer Dream
130 Pethyre 284 Suhongsaekbingwa
131 Peypring Cerueuko 285 Shinano Sweet
132 Piervomaiskoie 286 Picnic
133 Pink pearl 287 Green Boll
134 Pink Wood 288 Jonathan
135 Pixie 289 Granny Smith
136 Pomme Cloche 290 Fuji
137 Pomme Royale 291 Gamhong
138 Prairie Spy 292 Ralls Janet
139 PRI 17-1 293 Sansa
140 67PRI 1279-9(27-55) 294 Hwahong
141 Priscilla 295 Gala
142 Prof.Grebnicka Renete (Berzi) 296 Hongan
143 Pumpkin Sweet 297 Hongro
144 Puritan 298 Indo
145 Purple wave 299 Hwangok
146 Quinte 300 Summer King
147 Radiant 301 Delicious
148 Radoux 302 Vance Delicious
149 Red Apple 303 Orin
150 Red Bow 304 Red gold
151 Red cox's poruona 305 Toki
152 Red Delicious 306 Nero Rome
153 Red Dougherty 307 Starking
154 Red King 308 Beverly Hills
1-2. 사과 유전자원에 대한 표현형 데이터 수집
표현형 조사를 위해 사과 육종용 교배집단의 적화 및 적과작업, 병해충 방제 작업 등 지속적인 수체 관리를 수행하였으며, 사과 유전자원, 분자표지 활용 교배집단 및 유전분석용 교배집단에 해당하는 F1 89개체에 대한 과피 착색을 과실 착색기 및 성숙기에 맞춰서 조사하였다.
사과 과피 착색 조사는 환경 변화에 따른 오류를 최소화하기 위해 5년간(2015, 2016, 2017, 2018, 2019년) 반복 수행하였다. 과피 착색이 가장 많이 진행된 양광면 세 지점을 택하여 color difference meter(CR-400/410, Minolta Co., Tokyo, Japan) 색차를 측정하였고, L*, a*, b* 값을 이용하여 Chroma와 Hue 값을 계산하였다.
Chroma = (a*2 + b*2)1/2
Hue = tan-1(b*/a*)
<실시예 2> 사과 유전자원의 GWAS 분석을 통한 SNP 마커 발굴
효율적인 GWAS 분석을 위해 유전자형 데이터는 reference genome으로 Malus × domestica v1.0 (Velasco et al. 2010)을 기반으로 한 GBS 분석을 통해 얻은 51,434 SNPs와 Whole genome sequence를 double haploid 버전인 M. × domestica Genome (GDDH13 v1.1) (Daccord et al. 2017)에 re-alignment하여 얻은 43,169 SNPs를 이용하였다. 표현형 데이터는 5년간(2015년∼2019년)의 연차 반복을 수행하였으며, 과피색(chroma, hue angle 값) 형질을 분석하였다. GWAS 분석은 R 환경에 기반한 GAPIT (Genomic Association and Prediction Integrated Tool)과 PLINK 프로그램을 이용하였다(Lipka et al. 2012; Purcell et al. 2007).
사과 유전자원을 대상으로 과피색(Chroma, Hue angle)에 대한 GWAS 분석 결과는 도 1에 나타내었다. GWAS의 결과를 시각화하는 Q-Q plot에서는 SNP과 각 형질사이에 연관성이 없다는 귀무가설이 옳다면 모든 p-value값은 일양분포를 따르지만 연관성이 있다고 판단되면 이 분포를 벗어나므로 연관성이 있는 SNP들이 있음을 확인하였다.
이어서, 연관성 있는 SNP의 위치를 manhattan plot으로 시각화된 결과를 확인하였다(도 2). 가로축은 염색체 번호와 물리적 위치를 의미하며 세로축은 -log10(P)값으로 이 값은 SNP과 형질 사이에 연관성이 없다는 귀무가설 하에 F-검정하여 구해진 p-value에 대해서 -log10(P)로 바꾼 값을 의미한다. 즉, 이 값이 클수록 SNP과 형질사이에 연관성이 있을 확률이 높다고 판단한다. 이러한 연관성의 유무를 판단하는 유의수준(significance level)은 GWAS가 다중 검정이기 때문에 단일 검정의 유의수준을 이용하게 되면 전체에 대해서 1종 오류를 범할 확률이 높아져 귀무가설이 참임에도 불구하고 기각할 수 있다. 따라서 FWER (Family-wise error rate)방법 또는 FDR (False discovery rate)방법으로 다중 검정에 맞는 유의수준을 정하게 되고 이는 샘플 개수와 SNP 개수 등에 따라 기준이 달라진다.
이에 따라 과피색과 연관성이 높은 SNP는 chroma의 경우 chromosome 9에서 -log10(P) 값이 12에 가까운 유의수준이 높은 SNP이 확인되었고, hue angle의 경우 chromosome 2, 3, 12에서 significant line을 넘는 SNP가 나타났다.
연차 반복된 4년간의 표현형 데이터를 이용하여 수행한 GWAS 분석을 통해 과실 형질별로 가장 유의성이 높은 SNP를 선발하였다. 과피색 chroma는 4년간 모두 -log10(P) > 10의 고도로 연관하는 SNP가 chromosome 9에서 나타났으며, 과피색 hue angle은 choromosome 2, 3, 4, 12, 17번에서 유의수준 -log10(P) > 11을 넘는 SNP를 확인하였으며, 사과 과피색에 대한 연관성이 높은 SNP는 표 2에 기재하였다.
Trait Chr. Position SNP Alleles P-value Gene
Skin color
(chroma)		 9 29585162 A/G 3.73×10-12 LOC103444207
9 30309556 A/T 4.07×10-11 LOC103444238
9 29298755 A/G 8.83×10-11 LOC103444196
9 29692945 A/C 1.02×10-10 LOC103444361
9 29693636 A/C 4.48×10-10 LOC103444361
Skin color
(hue angle)		 4 18771093 C/T 5.10×10-12 LOC103433310
12 18919840 A/G 7.06×10-12 -
2 14190 A/G 1.96×10-11 -
17 20252645 A/G 2.01×10-11 -
3 4177256 A/C 3.12×10-11 LOC108171273
GWAS 분석을 수행한 과피색에 대하여 linkage disequilibrium (LD, 연관불균형)을 확인하였다(도 3). Linkage disequilibrium이란 유전자간의 거리가 가까워 독립적인 recombination의 형태를 보이지 않는 경우, 유전자가 기대치 이상으로 연관되어 나타나는 현상이다. LD는 특정 형질에 관여하는 유전자와 함께 움직이는 분자표지(SNP)를 사용하여 recombination되는 수치를 계산한 후, 연관된 정도를 파악하고 SNP 간 상대적인 거리를 예측하여 분석한다.
<실시예 3> GWAS 이용 사과 과피 착색 연관 분자표지 개발
3-1. 사과 과피 착색 연관 분자표지 표현형 검정
사과 과피 착색 연관 분자표지인 SNP 마커(서열번호 1 및 2)의 활용성 검토를 위해, 분자표지 활용 교배집단 및 유전분석용 교배집단에 해당하는 사과 육종용 교배집단 F1 89개체(‘화홍’ × ‘레드필드’, ‘후지’ × ‘쓰가루’, ‘왕림’ × ‘핑크레이디’, ‘후지’ × ‘왕림’, ‘핑크레이디’ × ‘쓰가루’ 등)를 대상으로 하여 교배집단의 과피 바탕색, 과피착색 색조를 조사하였고, 그 결과는 표 3 및 도 4에 나타내었다.
GBS를 이용한 GWAS 분석 결과, 과피 착색 연관 분자표지로서 사과 과피색과 연관성이 높은 SNP를 선발하고, 고도로 유의한 서열번호 1 및 서열번호 2의 201번째 염기에 해당하는 SNP 마커를 바탕으로 Primer 3.0을 이용하여 primer 제작 후 Roter-Gene 6000 (Qiagen)을 이용하여 HRM (High Resolution Melting)을 수행하였다. HRM 분석 결과는 도 5에 나타내었으며, Red line은 적색, Green line은 황색 또는 녹색 품종을 나타낸다. 과피색 primer에 이용한 사과 유전자원의 품종과 판별기준은 표 4에 나타내었다.
그 결과, 사과 과피색 관련 프라이머 세트를 적용하여 정확도가 높은 2개의 candidate marker를 선발하였다. 과피 착색 연관 30개의 프라이머를 사과 핵심집단을 대상으로 적용하여 4개(C9S45, C9S55, C9S25, C9S49)의 candidate marker를 선발하였고(도 5), 이들을 사과 유전자원에 적용한 결과 C9S45와 C9S55 프라이머 세트에서 80% 이상 표현형과 일치함을 확인하였다(결과 미제시).
표 2에 기재된 SNP 중 201번 염색체 29298755번째 위치하는 SNP(서열번호 1의 201번째 서열에 해당)를 검출하는 프라이머 세트(C9S45, 서열번호 3 및 4) 및 201번 염색체 29692945 번째 위치하는 SNP(서열번호 2의 201번째 서열에 해당)를 검출하는 프라이머 세트(C9S55, 서열번호 5 및 6)가 사과 과피색과 높은 유의성을 나타내는 것을 확인하였다. 상기 프라이머 세트의 염기서열은 표 5에 나타내었다.
과피색 품종
적색 Shinano sweet, Jonathan, Fuji, Hongro, Gala, Picnic, Rome beauty, Gamhong, Pink wood, Red delicious, Cameo, Treco red gala, Crimson king, Yoko, Spur earliblaze, Sansa 등
황색, 녹색 Granny smith, Orin, Lodi, Spur golden delicious, Indo, Yellow transparent, Mutsu, Toki, Ginger gold, Hwangok, Golden delicious, Doud golden delicious, Virginia gold 등
No. primer_name 염기서열 서열번호
1 C9S45_F TAG ACA ACC ACT AGA GCC CAA A 3
2 C9S45_R TGT AGG TTT GTC TGC ATT TCC C 4
3 C9S55_F CCC TGA ACC TGT TCT TAT GAA CT 5
4 C9S55_R TGC GAC AAT CGT CCC AAA ATC 6
3-3. 사과 과피 착색 연관 후보 마커의 적용성 검정
상시 실시예 3-2에서 선발된 가장 정확도가 높은 2개 과피 착색 연관 분자표지를 사과 핵심집단과 유전분석용 교배집단 F1 89개체를 대상으로 하여 적용성을 검정하였다. 2종의 사과 과피색 판별용 프라이머 세트(C9S45와 C9S55)는 과피색의 적색과 적색이 아닌 품종(황색, 녹색)을 기준으로 판별 가능성을 확인하였으며, red line은 적색, yellow line은 황색, green line은 녹색 계통 및 품종을 나타내었다(도 6).
이어서, 사과 핵심집단 및 육종용 교배집단에 사과 과피색 판별용 프라이머 세트(C9S45, C9S55)를 적용하여 얻어진 HRM 분석 결과와 표현형 결과와의 일치도를 확인하였으며, 분자표지의 정확도는 각 교배조합 내 정확도 계산 후 평균값으로 나타내었다.
그 결과, C9S45는 75.7%의 정확도를 나타내었으며 F1 89개체 중 68개체를 선발 가능하였고, C9S55는 83.7%의 정확도를 가지며 F1 89개체 중 79개체의 선발이 가능하였다(표 6).
이와 같이, 서열번호 1 또는 2의 201번째 서열에 해당하는 사과 과피색 판별용 SNP 마커를 검출하는 프라이머 세트를 이용한 HRM (High Resolution Melting) 분석을 통해 사과 유전자원을 대상으로 검정 및 확인하여 표현형 데이터와 일치하는 것을 확인하였다.
<실시예 4> 사과 과피 착색 연관 분자표지에 대한 PCR-HRM 조건 최적화
개발된 사과 과피 착색 연관 분자표지의 정확도가 가장 높은 HRM 분석 조건(DNA 및 primer 농도, PCR 단계별 온도 및 시간) 설정 실험을 수행하였다. 다음과 같은 조건에서 melting curve의 구분이 가장 명확하게 나타났다.
Components Volume (μL)
2x qPCRBIO HRM Mix 10
10μM primer 0.8
Distilled water 7.4
50ng/μL-1 DNA 1
total 20
또한, 최종 결정된 PCR-HRM 반응조건은 표 8에 기재하였다.
Step Temperature (℃) Time Cycle
Hold stage 95 2 분 1
PCR stage Denaturation 95 5 초 40
Annealing 60 20 초
Extension 72 30 분
Melt curve stage 72-95 0.1℃씩 증가
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

  1. 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 201번째 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 5개 이상의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적색 과피의 사과 품종 판별용 SNP 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 사과 품종은 시나노 스위트(Shinano sweet), 홍옥(Jonathan), 후지(Fuji), 홍로(Hongro), 갈라(Gala), 피크닉(Picnic), 롬 뷰티(Rome beauty), 감홍(Gamhong), 핑크 우드(Pink wood), 레드 딜리셔스(Red delicious), 카메오(Cameo), 트레코 레드 갈라(Treco red gala), 크림슨 킹(Crimson king), 양광(Yoko), 스퍼어리브레이즈(Spur earliblaze), 산사(Sansa)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 적색 과피의 사과 품종 판별용 SNP 마커 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 201번째 위치하는 SNP는 사과 9번 염색체(NC_024247.1)의 29298755 번째 위치에 존재하는 것인, 적색 과피의 사과 품종 판별용 SNP 마커 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 201번째 위치하는 SNP는 사과 9번 염색체(NC_024247.1)의 29693636 번째 위치에 존재하는 것인, 적색 과피의 사과 품종 판별용 SNP 마커 조성물.
  5. 서열번호 1 또는 2의 201번째 뉴클레오티드 위치의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 적색 과피의 사과 품종 판별용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제제는 SNP 마커를 포함하는, 10 내지 100 개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드들을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 것인, 적색 과피의 사과 품종 판별용 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 제제는 SNP를 각각 포함하는, 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드들과 특이적으로 혼성화 하는 프로브를 포함하는 것인, 적색 과피의 사과 품종 판별용 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 또는 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트;인 것을 특징으로 하는, 적색 과피의 사과 품종 판별용 조성물.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 조성물은 HRM(High Resolution Melting) 분석을 위한 것인, 적색 과피의 사과 품종 판별용 조성물.
  10. 제5항의 조성물을 포함하는, HRM(High Resolution Melting) 분석용 PCR 키트.
  11. (a) 사과로부터 핵산 시료를 수득하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 또는 2의 201번째 뉴클레오티드 위치의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및
    (c) 중합효소연쇄반응 산물을 분석하여 사과 과피색을 판별하는 단계;를 포함하는, 적색 과피의 사과 품종 판별을 위한 정보를 제공하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 핵산 시료는 사과의 유엽(young leaves)으로부터 수득되는 것인, 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 서열번호 1 또는 2의 201번째 뉴클레오티드 위치의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 또는 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트;인 것을 특징으로 하는, 방법.
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