KR20240070556A - 피분석물을 검출하는 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

수성 조성물, 예를 들어 용해 완충제로서 사용하기 위한 조성물은 산화지르코늄 입자, 0.005% (질량/부피) 이상의 농도의 계면활성제, 제2철에 대해 104.2 이상의 제 1 친화도 상수 및 마그네슘에 대해 103.8 미만의 제 2 친화도 상수를 갖는 유기 철-킬레이트제 (pH 8.45 의 20℃ 탈이온수에서 결정됨), 및 완충제를 포함한다. 수성 조성물은 20℃ 에서 측정될 때 모든 경우에 7.7 이상 및 8.45 미만, 더 특히 7.8 내지 8.3 의 pH 를 갖는다. 조성물을 사용하는 방법 및 수성 조성물의 구성요소들을 포함하는 키트들.

Description

피분석물을 검출하는 방법 및 조성물
US10604787 은 등온 핵산 증폭 반응에서 샘플 억제를 제거하기 위한 수성 용해 완충제 조성물 (즉, 세포와 접촉하여 세포를 용해시키고 그들의 핵산을 방출하는 조성물) 을 설명한다. 조성물은 유기 철-킬레이트제 (iron-chelating reagent), 제2철 (ferric iron), 0.005% (질량 부피) 이상의 농도의 비이온성 계면활성제, 및 2-하이드록시프로판-1,2,3-트리카복실레이트를 포함하며, 2-하이드록시프로판-1,2,3-트리카복실레이트 및 유기 철-킬레이트제는 별개의 분자이다. 수성 조성물은 약 8.45 - 8.85 의 pH 를 갖는다.
US2019/0112637 은 용해 완충제의 사용을 포함하는 핵산 증폭 방법을 개시한다. 용해 완충제는 제2철 이온을 포함할 수 있고, 나노입자 분산 안정화제, 약 11 내지 약 16 의 친수성-친유성 균형을 갖는 비이온성 계면활성제, 폴리비닐피롤리돈, 황산마그네슘 헵타하이드레이트, 플루오로계면활성제, 지시 염료, 및 상기 시약들 중 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 용해 완충제는 25℃에서 약 9.8 내지 10.5 의 pH 를 갖는 것으로 보고된다.
US10619189 는 복수의 산화지르코늄 입자, 0.005% (질량/부피) 이상의 농도의 비이온성 계면활성제, 유기 철-킬레이트제, 및 나노입자 분산 안정제, 폴리비닐피롤리돈, 또는 이들 둘 다를 포함하는 핵산 증폭 반응에서 샘플 억제를 제거하기 위한 수성 조성물을 개시한다. 상기 조성물은 약 8.45 - 8.85 의 pH 를 갖는다.
US5693517 은 전통적인 및 비전통적인 뉴클레오시드 트리포스페이트를 혼합함으로써 생성된 이전의 역전사/증폭 반응으로부터 생성된 핵산으로 오염된 역전사 반응을 살균하는 시약 및 방법을 개시한다. 살균 후, 증폭될 핵산은 Tris-HCl (pH 8.3), KCl, 및 EDTA, Tris-HCl, (pH 8.3), KCl, DTT, 및 MnCl2, 및 바이신 KOAc, 및 Mn(OAc)2 (pH 7.97) 를 포함하는 액체에서 인큐베이션될 수 있다. 그러나, 이 액체는 용해 완충제가 아니며, 본 개시는 매트릭스 화합물에 의한 샘플 억제를 감소시키는 것에 관련되지 않는다.
본 개시의 상기 개요는 본 개시의 모든 구현 또는 각각의 개시된 실시예를 설명하도록 의도되지 않는다. 다음의 설명은 예시적인 실시형태들을 보다 구체적으로 예시한다. 본원 전반에 걸친 몇몇 장소에서, 예시들의 리스트를 통해 안내가 제공되며, 이들은 예시가 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 각각의 경우에, 인용된 리스트는 대표 그룹으로서만 기능하며, 배타적인 리스트로서 해석되어서는 안된다.
본 출원에서, 용어, 예컨대 "a", "an" 및 "the" 는 오직 단수형 실체를 지칭하려는 것이 아니라, 예시를 위해 특정 예가 사용될 수 있는 일반적인 계열을 포함한다. 용어 "a", "an" 및 "the" 는 "적어도 하나" 및 "하나 이상"이라는 문구와 상호교환적으로 사용된다. 리스트가 뒤따르는 어구들 "적어도 하나" 및 "적어도 하나를 포함한다" 는 리스트 내의 아이템들 중 임의의 하나 및 리스트 내의 둘 이상의 아이템들의 임의의 조합을 지칭한다.
"공통적인", "공통으로", "자주", "빈번한" 및 "빈번하게" 와 같은 용어들은 본 발명에서 전형적으로 이용되는 특징들을 지칭하기 위해 사용되지만, 달리 지시되지 않는 한, 그렇게 설명된 특징들이 본 개시 전에 공지되거나 공통적임을 암시하는 것으로 의도되지 않는다.
달리 언급되지 않는 한, 본 개시 및 첨부된 청구항에서의 모든 pH 값들은 20℃ 에서 측정된 pH 값을 지칭한다.
미생물이나 바이러스, 특히 식품 시료에서 발견되는 것은 분자 방법으로 검출할 수 있다. 이러한 방법, 예를 들어 3M 분자 검출 시스템 (3M Company, St. Paul, MN, USA) 과 함께 사용되는 방법은 옵션적으로 인큐베이션 후에, 샘플을 수성 완충제와 접촉시키는 것을 포함한다. 완충제는 세포를 용해시켜 세포로부터 핵산을 방출하는 용해 완충제이다. 용해 완충제와 접촉한 후, 핵산의 증폭이 수행될 수 있다.
US10604787, US10619189, 및 US2019/0112637 은, 핵산의 증폭 또는 검출을 방해할 수 있는 시료 중에 존재하는 식품 매트릭스, 즉 식품 시료로부터의 화학적 화합물의 효과를 감소시키거나 제거하기 위해 z 이리코늄 산화물 입자를 용해 완충제에 첨가할 수 있다는 것을 개시한다. 아민을 갖는 양이온성 완충제인 트리스 (tris) 는 본 개시내용에서 바람직한 완충 제재이며, 이는 완충제가 tris 완충제의 완충 영역인 8.45 내지 8.85 의 pH 를 가져야 함을 나타낸다.
본 개시는 종래 기술의 용해 완충제의 여러 문제점을 인식한다. 첫째, 일부 시료는 전술한 참고문헌에 개시된 8.45-8.85 pH 범위에서 적절한 안정성을 갖지 않을 수 있지만, 더 낮은 pH 범위, 즉, 중성에 더 가까운 범위에서 더 안정적일 수 있다. 둘째, 공기 중의 이산화탄소는 (수성 액체와 접촉하거나 또는 수성 액체에 용해될 때 탄산이 됨으로써) 산으로서 작용할 수 있으며, 따라서 종래 기술의 완충제의 비교적 높은 pH 를 중화시킨다. 이러한 효과는 더 낮은 pH 에서 다소 낮을 수 있다. 셋째, 수성 액체에 사용될 수 있는 트리스 완충제와 같은 음이온성 또는 양이온성 완충제의 양은 핵산 증폭 또는 검출 과정을 방해할 수 있기 때문에 다소 제한적이다. 따라서, 종래 기술의 완충제들의 완충 용량은 낮다. 낮은 완충 용량은 테스트될 수 있는 식품 매트릭스의 유형을 제한하는데, 이는 일부 식품 매트릭스가 매우 산성 또는 염기성이어서 종래 기술의 완충제가 이들을 증폭을 위해 허용가능한 pH 로 변환할 수 없기 때문이다. 넷째, pH 에 관계없이 더 빠른 결과 도출 시간을 가지는 것이 유리할 것이다.
요약하면, 이러한 및 다른 문제점에 대한 해결책은 다음을 포함하는 수성 조성물에 있다: 산화지르코늄 입자, 0.005% (질량/부피) 이상의 이온 농도의 계면활성제, 제2철에 대해 104.2 이상의 제 1 친화성 상수 및 마그네슘에 대해 103.8 미만의 제 2 친화성 상수를 갖는 유기 철-킬레이트제 (여기서, 제 1 친화성 상수 및 제 2 친화성 상수는 pH 8.45 의 20℃ 탈이온수에서 결정됨), 및 선택적으로 40 mM 이상의 농도를 가지고, 더 선택적으로 40 mM 내지 약 200 mM의 농도를 가지고, 및 더욱 더 선택적으로 40 mM 내지 150 mM 의 농도를 갖는 완충제. 수성 조성물은 20℃ 에서 측정될 때 모든 경우에 7.7 이상 및 8.45 미만, 더 특히 7.8 내지 8.3 의 pH 를 갖는다.
해결책은 또한, a) 혼합물을 형성하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 수성 조성물을 미생물 또는 바이러스를 포함하는 조성물과 접촉하는 단계; b) 용해된 혼합물을 형성하기 위해 혼합물 중의 미생물 또는 바이러스를 용해하는 단계; 및 c) 용해된 혼합물의 적어도 일부를 핵산 증폭 공정에 적용하는 단계를 포함하는, 핵산을 증폭하는 방법에 있다.
해결책은 또한, 복수의 산화지르코늄 입자들; 비이온성 계면활성제; 제2철에 대해 104.2 이상의 제 1 친화성 상수 및 마그네슘에 대해 103.8 미만의 제 2 친화성 상수를 갖는 유기 철-킬레이트제 (여기서, 제 1 친화성 상수 및 제 2 친화성 상수는 pH 8.45 의 20℃ 탈이온수에서 결정됨); 7.8 이하의 pH 로부터 8.2 이상의 pH 까지 연장되는 20℃ 에서의 완충 영역을 갖는 완충제를 포함하는 키트에 있다. 키트 내의 성분은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 수성 조성물을 형성하기 위해, 사용자에 의해 물에 용해되는 건조 성분으로서 제공될 수 있다. 대안적으로, 키트의 성분들 중 하나 이상은 키트에서 물에 용해될 수 있고, 건조 성분은, 임의의 경우, 나중에 첨가된다.
수성 조성물
수성 조성물은 용액 또는 분산액일 수 있다. 분산액일 때, 산화지르코늄 입자는 전형적으로 조성물에 분산된다. 일부 실시형태들에서, 산화지르코늄 입자는 나노입자이다. 특정 실시형태에서, 산화지르코늄 입자는 본원에 추가로 기재된 바와 같이 광자 상관 분광법에 의해 측정될 때 각각의 경우에, 500 nm 이하, 보다 특히 250 nm 이하, 보다 더 특히 100 nm 이하의 평균 입자 크기를 갖는다. 산화지르코늄 입자는 선택적으로 10 이상, 예컨대 10-600, 특히 25-600, 보다 특히 50-600, 보다 더 특히 100-600, 보다 더 특히 200-600, 보다 더 특히 300-600, 및 가장 특히 400-600 의 표면적 (m2/L 단위) 을 갖는다.
각각의 경우에, 입자 크기는 US864710 의 "Test Methods" 섹션 하에 기재된 방법에 따라 광자 상관 분광법 (PCS) 에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 적색 레이저 (633 nm 파장) 를 구비할 수 있는 Zeta Sizer-Nano Series, Model ZEN 3600 과 같은 PCS 기기가 사용될 수 있다. 샘플을 10-14 mm 와 같은 적절한 액체 깊이로, 1 cm 정사각형 큐벳에 넣었다. 액체 깊이는 사용되는 기기의 치수에 의존할 것이다. 이어서, 큐벳을 기기 내에 넣고 25℃ 에서 평형화시킨다. 기기 파라미터를 다음과 같이 설정할 수 있다: 분산제 굴절률: 1.3330, 분산제 점도: 0.8872 mPa-sec, 재료 굴절률: 2.10, 및 재료 흡수값 0.10 단위. 기기 크기 측정 절차는 기기의 사용 설명서에 따라서 실행될 수 있다. 대부분의 PCS 기기는 입자 크기의 최상의 측정을 얻기 위해 레이저 빔 위치 및 감쇠기 설정을 자동으로 조정할 것이지만, 이들이 사용되는 기기에 의해 자동으로 조정되지 않으면, 입자 크기의 최상의 측정 (예를 들어, 가장 반복가능한 측정, 최상의 신호 대 잡음비 등) 을 얻기 위해 기기의 명령 매뉴얼에 따라 또는 표준 기기 최적화 기술에 따라 최적화될 수 있다. 많은 경우에, 입자 크기를 측정할 필요가 없는데, 이는 표지된 입자 크기 (예를 들어, 제조업체에 의해 측정됨) 를 갖는 상업적으로 입수가능한 산화지르코늄 입자가 이용가능하고, 일반적으로 제조업체의 입자 크기 표현 (예를 들어, 제품 라벨 상) 을 신뢰할 수 있기 때문이다.
임의의 전술된 산화 지르코늄 산화물 입자를 안정화시키기 위해 안정화제가 선택적으로 첨가될 수 있다. 가장 일반적으로, 안정화제는 시트르산 또는 이의 염, 예컨대 시트르산칼륨, 시트르산 철 암모늄 등이다. 핵산의 증폭 또는 검출을 방해하지 않는 한, 다른 안정화제가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 일부 산화지르코늄 입자는 안정화제 없이도 필요한 pH 값에서 안정한 분산액을 형성할 수 있기 때문에 안정화제가 필요하지 않다.
임의의 전술된 경우에, pH (20℃에서 측정될 때) 는 7.7 초과 및 8.45 미만일 수 있다. 특히, pH (20℃에서 측정될 때) 는 7.7 초과, 7.8 초과, 7.9 초과, 또는 8.0 초과일 수 있다. 특히, pH (20℃에서 측정될 때)는 8.45 미만, 8.4 미만, 8.3 미만, 또는 8.2 미만일 수 있다. 가장 통상적으로, 가장 특히, pH는 7.8 내지 8.3 이다.
완충제는 특히 적어도 하나의 쌍성 이온 (zwitterionic) 화합물을 포함하며, 이는 화합물이 조성물의 pH 에서 쌍성 이온 형태로 존재함을 의미한다. 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 양이온, 음이온, 또는 비이온 완충제가 핵산 가닥과 결합할 수 있고, 따라서 샘플 내의 미생물의 증폭 또는 검출을 방해할 수 있다는 가설을 세웠다. 특히 유용한 쌍성 이온 화합물은 바이신 (bicine) 이다. 따라서, 완충제는 가장 특히 바이신이다.
완충제, 특히 쌍성 이온 완충제, 및 가장 특히 바이신은 임의의 적합한 농도를 가질 수 있지만, 일반적으로 40 mM 이상, 보다 특히 40 mM 내지 200 mM, 보다 더 특히 40 mM 내지 150 mM, 보다 더 특히 50 mM 내지 150 mM 의 농도를 갖는다. 이러한 농도의 완충제는 트리스와 같은 양이온 또는 음이온 완충제로 수득될 수 있는 것보다 더 높은 완충 능력을 제공하며, 이는 높은 농도에서의 핵산 증폭 또는 검출 공정을 방해할 것이다.
철-킬레이트제는 제2철에 대한 제 1 친화성 상수가 104.2 이상이고, 마그네슘에 대한 제 2 친화성 상수가 103.8 미만이다. 제 1 친화성 상수 및 제 2 친화성 상수는 pH 8.45 의 20℃ 탈이온수에서 결정된다. 따라서, 철-킬레이트제는 마그네슘보다 제2철에 대해 더 큰 친화도를 갖는다. 철-킬레이트제는 전형적으로 유기 철-킬레이트제이며, 이는 철-킬레이트제가 유기 화합물이라는 것을 의미하고; 이는 유기 철-킬레이트 화합물이 오직 유기 철 화합물만을 킬레이트화한다는 것을 의미하는 것으로 의도되지 않는다.
임의의 적합한 유기, 철-킬레이트제가 사용될 수 있다. 가장 전형적으로, 유기, 철-킬레이트제는 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), N,N',N',N'-테트라키스(2-피리디닐메틸)에탄-1,2-디아민, 1,2-비스(O-아미노페녹시)에탄-N,N,N,N'-테트라아세트산, N-(2-하이드록시에틸) 에틸렌디아민-N,N',N'-트리아세트산, 전술한 것들 중 임의의 것의 염, 또는 전술한 것들 중 임의의 것의 수화물을 포함한다. 가장 일반적으로, 유기, 철-킬레이트제의 염, 예컨대 나트륨 또는 칼륨 염, 또는 혼합된 나트륨/칼륨 염, 및 특히 칼륨 염이 사용된다. EGTA 는 가장 일반적으로 사용되며, 가장 특히 EGTA 의 칼륨 염이다.
선택적으로, 본원에 언급된 임의의 실시형태에서, 조성물은 제2철을 필요로 할 수 있다. 포함되는 경우, 제2철은 전형적으로 50-385 마이크로몰, 예컨대 적어도 110 마이크로몰, 적어도 165 마이크로몰, 적어도 220 마이크로몰, 적어도 275 마이크로몰, 또는 적어도 330 마이크로몰의 농도를 가지며; 각각의 경우, 최대 농도는 385 마이크로몰일 수 있다. 제2철이 포함될 때, 제2철 내의 제2철 이온 대 유기 철-킬레이트제의 몰비는 전형적으로 0.04 내지 0.28, 보다 특히 0.14 내지 0.18 이다.
적어도 하나의 비이온성 계면활성제는, 예를 들어, 조성물이 제조된 후 상업적으로 허용가능한 양의 시간 동안 용액 중에 있도록 의도된 성분을 침전시키지 않거나, 현탁되도록 의도된 성분을 현탁시키는 안정한 제형을 제공하는 임의의 적합한 비이온성 계면활성제일 수 있다. 특히 유용한 비이온성 계면활성제는 11 내지 16 의 친수성-친유성 균형 (HLB) 을 갖는 것들을 포함한다. 이러한 HLB 범위는 핵산 증폭에 사용되는 DNA 중합효소, 예컨대 PCR 및 LAMP 의 활성을 촉진한다. 사용될 수 있는 특정 비이온성 계면활성제의 비제한적인 예는 TRITON X-100, TRITON X-114, TRITON X-405, TRITON X-101 등과 같은 TRITON 상표명으로 입수가능한 것, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 (예컨대 TWEEN 상표명으로 입수가능한 것), 폴리옥시에틸렌 알킬 에스테르 (예컨대 BRIJ 상표명으로 입수가능한 것), 노닐페놀, 라우릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 폴리옥시에틸렌 알킬 아민, 폴리옥시에틸렌 지방산 비스페일 에테르, 및 플루오로계면활성제 (예컨대 3M Company St. Paul MN USA 로부터 NOVEC 상표명으로 입수가능한 것) 를 포함한다.
비이온성 계면활성제는 임의의 적합한 농도, 예를 들어, 상기 언급된 기준 또는 특정 최종 용도에 의해 요구되는 바와 같은 다른 기준 중 하나 이상을 충족시키는 농도로 존재할 수 있다. 전형적으로, 0.005% (w/v) 내지 0.3% (w/v), 예컨대 0.01% 내지 0.3% (w/v) 의 농도가 사용된다.
마그네슘 이온, 칼륨 이온, 또는 둘 모두가 또한 조성물에 사용될 수 있다. 이들은 예를 들어 qPCR, LAMP 등과 같은 PCR 에 의한 시료의 하류 핵산 증폭을 용이하게 할 수 있다. 사용되는 경우, 마그네슘 이온의 양은 전형적으로 1 mM 내지 15 mM 이다. 사용되는 경우, 칼륨 이온의 양은 전형적으로 5 mM 내지 500 mM, 예컨대 20 mM 내지 60 mM 이다. 특히 마그네슘 이온은 마그네슘 염, 예컨대 황산마그네슘 또는 이의 수화물, 보다 특히 황산마그네슘 헵타하이드레이트의 성분으로서 포함된다.
선택적으로, 조성물은 하나 이상의 추가 성분들을 추가로 포함할 수 있다. 사용되는 경우, 이들은 가장 일반적으로 지시 염료, 보존제, LAMP 반응의 인핸서, qPCR 반응의 인핸서, 또는 플루오로계면활성제 중 하나 이상이다.
지시 염료가 사용되는 경우, 이는 의도한 용도에 적합한, 예컨대 관심 미생물 또는 미생물들의 검출에 적합한 임의의 염료일 수 있다. 많은 지시 염료가 당업계에 공지되어 있으며, 원칙적으로 이들 중 임의의 것을 사용할 수 있다. 하나의 특히 일반적인 염료는 크레졸 레드이다. 지시 염료는 항상 요구되는 것은 아니며; 일부 검출 시스템은 지시 염료에 의존하지 않으며, 일부 경우에 원하는 염료가 하류 처리 단계 동안 첨가될 수 있다.
생물학적 시스템과 함께 사용하기에 적합한 다양한 보존제가 공지되어 있고, 이것이 사용되는 경우, 원하는 최종 용도에 따라 당업자에 의해 선택될 수 있다. 하나의 특히 유용한 보존제는 메틸이소티아졸리논이다.
LAMP 또는 qPCR 반응을 용이하게 하기 위한 인핸서가 또한 당업계에 공지되어 있으며, 사용될 핵산 증폭의 유형과 같은 원하는 최종 용도에 따라 선택될 수 있다. 그 예로는 황산마그네슘 및 황산암모늄 등의 황산염, 또는 이들의 수화물, 또는 염화칼륨이 포함된다.
키트
상기 기재된 바와 같은 조성물은 최종 사용자를 위해 미리 제조될 수 있거나, 또는 키트가 최종 사용자에게 제공될 수 있고, 최종 사용자는 이어서 키트의 성분들, 및 선택적으로 사용자에 의해 제공되는 물로부터 조성물을 제조할 수 있다. 따라서, 키트는 복수의 산화지르코늄 입자를 포함할 수 있으며, 이는 조성물을 참조하여 기재된 바와 같은 임의의 전술된 입자일 수 있다. 산화지르코늄 입자는 탈이온수와 같은 물에 분산되는 고체로서 제공될 수 있거나, 또는 물에 분산물로서 제공될 수 있다.
키트는 제2철에 대해 104.2 이상의 제 1 친화성 상수 및 마그네슘에 대해 103.8 미만의 제 2 친화성 상수를 갖는 유기 철-킬레이트제를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 제 1 친화성 상수 및 제 2 친화성 상수는 pH 8.45 의 20℃ 탈이온수에서 결정된다. 상기 조성물을 참조하여 기재된 바와 같은 임의의 유기, 철-킬레이트제가 사용될 수 있다. EGTA 가 가장 일반적이다. 유기, 철-킬레이트제는 탈이온수와 같은 물에 분산되거나, 또는 물에 제공될 수 있다.
키트는 완충제를 더 포함할 수 있다. 완충제는 가장 일반적으로 7.7 이하의 pH 로부터 8.2 이상의 pH 로 연장되는 20℃ 에서의 완충 영역을 갖는다. 따라서, 완충제는 전형적으로 조성물의 pH 범위에서 완충 능력을 제공할 수 있으며, 이 범위는 위에서 상세히 논의된다. 위에서 상세하게 논의된 바와 같이, 완충제는 전형적으로 쌍성 이온성 및 가장 특히 바이신이다. 완충제는 탈이온수와 같은 물에 재구성되는 고체로서 제공될 수 있거나, 또는 물에 용해될 수 있다.
유사하게, 키트는 나노입자 분산 안정화제, 지시 염료, 보존제, LAMP 반응의 인핸서, qPCR 반응의 인핸서, 또는 플루오로계면활성제, 및/또는 제2철염 중 적어도 하나를 제공할 수 있다. 이들 중 임의의 것이 물에 분산될 수 있거나 또는 이들은 나중에 물에 분산될 고체로서 제공될 수 있다.
가장 일반적으로, 복수의 산화지르코늄 입자, 비이온성 계면활성제, 및 유기 철-킬레이트제 중 적어도 하나는 pH (20℃에서 측정될 때) 가 7.7 초과 및 8.45 미만인 수성 액체 중에 배치된다. 특정 경우에, pH (20℃에서 측정될 때) 는 7.7 초과, 7.8 초과, 7.9 초과, 또는 8.0 초과일 수 있다. 특히, pH (20℃에서 측정될 때)는 8.45 미만, 8.4 미만, 8.3 미만, 또는 8.2 미만일 수 있다. 가장 통상적으로, 가장 특히, pH는 7.8 내지 8.3 이다. 임의의 나머지 성분은 가장 일반적으로 나중에 수성 액체에 첨가되는 고체로서 제공된다.
이용 방법
본원에 개시된 바와 같은 조성물 및 키트는 핵산을 증폭하는 방법에서 가장 일반적으로 사용된다. 키트는 먼저 키트의 성분을 서로 및/또는 물, 특히 탈이온수 또는 역삼투 정제수와 조합하여 본원에 개시된 바와 같은 조성물을 형성함으로써 사용될 수 있다. 이어서, 조성물은 당업계에 공지된 일반적인 방법, 예컨대 US10619189 에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있다.
간략하게, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 미생물 또는 바이러스를 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 샘플과 접촉하여 혼합물을 형성할 수 있다. 샘플은, 특히 미생물 또는 바이러스의 수를 증가시키기 위해 필요할 경우, 이 접촉 단계 전에 선택적으로 배양될 수 있다. 이어서, 미생물 또는 바이러스를 용해시켜 용해된 혼합물을 형성할 수 있다. 이어서, 용해된 혼합물을 핵산 증폭 과정에 적용하여, 미생물 또는 바이러스에 존재하는 하나 이상의 핵산을 증폭시킬 수 있다.
용해 단계는 전형적으로 열 용해이며, 이는 혼합물을 5-30 분 동안 80-115℃로 가열함으로써 가장 흔히 달성된다.
핵산 증폭 방법은 임의의 공지된 방법일 수 있으나, 가장 일반적으로 PCR, 예컨대 qPCR, 또는 LAMP 이다. qPCR 증폭은 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 "Real-time PCR in the microbiology laboratory" by Mackay, I. in European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 2004(190) 에 기재되어 있다. LAMP 증폭은 예를 들어, US9090168 에 기재되어 있다. LAMP 증폭과 같은 증폭의 결과는 공지의 방법, 예컨대 문헌 "Novel bioluminescent quantitative detection of nucleic acid amplification in real-time" by Gandelman, O. et al PLoS One, Nov 30;5(11) 에 기재된 것에 의해 검출될 수 있다.
실시예들
산화지르코늄 나노입자 분산액 (물 중 5 중량%, ≤100 nm 평균 입자 크기 (BET), 부품 번호 643122) 을 Sigma Aldrich Company, St. Louis, MO 로부터 입수하였다.
시트르산 (부품 번호 C1909), 폴리비닐피롤리돈 (부품 번호 P5288), TRITON X-100 계면활성제 (부품 번호 T8787), 바이신 (부품 번호 B8660), 아세트산 칼륨 (P1190), 수산화 칼륨 (부품 번호 60370), EGTA (부품 번호 03777), 마그네슘 헵타하이드레이트 (부품 번호 63138), 및 PROCLIN 950 (부품 번호 46878-U) 은 모두 Sigma Aldrich Company 로부터 입수하였다.
조성물의 pH 를 20℃ 에서 ACCUMET 겔-충전된 중합체 본체 pH/ATC 이중-접합 조합 전극 (무수) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 로부터 입수함) 을 갖는 ACCUMET AE150 벤치탑 pH 미터를 사용하여 측정하였다. 측정은 샘플 제조 24시간 이내에 수행하였다.
실시예 1.
표 1 에 기재된 각 성분을 탈이온수에 명시된 순서로 첨가하고 혼합하여 현탁액 조성물을 제조하였다. 조성물은 8.1 의 pH 를 가졌다.
표 1.
비교예 A.
시트르산, 산화 지르코늄 분산액, EGTA, 황산 마그네슘 헵타하이드레이트 성분을 조성물에 포함하지 않는 것을 제외하고는 실시예 1 에 기재된 바와 같이 조성물을 제조하였다. 조성물은 8.3 의 pH 를 가졌다.
실시예 2.
각 성분을 탈이온수에 표 2 에 기재된 순서로 첨가하여 조성물을 제조하였다. 조성물은 8.3 의 pH 를 가졌다. 실시예 1 (표 1) 의 조성물과 비교하여, 이 조성물 (표 2) 은 증가된 완충 능력을 제공하기 위해 더 높은 농도의 바이신 및 수산화칼륨, 및 더 낮은 농도의 아세트산칼륨을 가졌다.
표 2.
비교예 B.
시트르산, 산화지르코늄 분산액, EGTA, 황산 마그네슘 헵타하이드레이트 성분을 조성물에 포함하지 않는 것을 제외하고는 실시예 2 에 기재된 바와 같이 조성물을 제조하였다. 조성물은 8.3 의 pH 를 가졌다.
비교예 C.
미국 특허 제10619189호의 실시예 2 에 기재된 바와 같이 조성물을 제조하였다. 조성물은 8.7 의 pH 를 가졌다.
실시예 3. 루프 매개 등온 증폭 (LAMP) - 실시예 1-2 및 비교예 A-C 의 조성물을 이용한 생체 발광 검출 분석.
생 닭고기 (32 g) 및 완충된 펩톤 물 농축 배지 (BPW-ISO, 41.5℃ 로 예열된 162 mL, 3M Company, St. Paul, MN 로부터 입수됨) 를 Nasco WHIRL-PAK 균질화기 필터 백 (부품 번호 01318, Thermo Fisher Scientific 로부터 입수됨) 에서 조합하고 2분 동안 230 rpm (분당 회전수) 로 혼합하였다. 샘플을 6 시간 동안 41.5℃ 에서 인큐베이션하였다. 실시예 1-2 및 비교예 A-C 의 조성물로부터 선택된 분취량 (580 마이크로리터) 을 별도의 1.1 mL AXYGEN 미니-튜브 (부품 번호 MTS-11-12-C-R, Corning Inc., Corning, NY 로부터 입수됨) 에 개별적으로 첨가하였다 (즉, 튜브 당 단일 조성물이 첨가됨). 다음으로, 균질화기 백으로부터 20 마이크로리터의 농축된 샘플을 각각의 튜브에 첨가하였다.
핵산 증폭 및 생체 발광 검출을 위해, 각각의 튜브를 100℃ 열 블록에서 15분 동안 가열하고, 약 40℃ 로 냉각시킨 후, 혼합물의 20 마이크로리터 분취액을 일반 매트릭스 대조군 펠릿 (부품 번호 MDMC96NA, 3M Company 로부터 입수됨) 을 함유하는 반응 튜브에 첨가하였다. 각 조성물에 대해 3 개의 반응 튜브 (n=3) 를 준비하였다. 펠릿을 용해시킨 후, 각각의 반응 튜브를 제조업체의 지시에 따라 생체 발광 신호를 기록하면서 3M 분자 검출 기기 (부품 번호 MDS 100; 3M Company 로부터 입수됨) 를 사용하여 분석하였다. 최대 생체 발광 신호 (RLU (relative light units)) 및 최대 생체 발광 신호가 발생한 반응 시간을 기록하였다. 그 결과를 표 3 내지 5 에 3 회 시험 평균으로서 보고하였다.
표 3.
표 4.
표 5.
실시예 4. LAMP - 상이한 pH 값들을 갖는 조성물을 사용한 생체 발광 검출 검정
실시예 1 의 절차 (표 1)에 따라 제조된 조성물의 pH 를 다양한 양의 빙초산으로 조절하여 pH 가 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 또는 8.2 인 5개의 개별 조성물을 제공하였다. 최대 생체 발광 신호가 발생하는 반응 시간을 실시예 3 의 절차에 따라 결정하였다. 그 결과를 표 6 에 3회 시험 평균으로 보고하였다.
표 6.

Claims (20)

  1. 수성 조성물로서,
    산화지르코늄 입자;
    0.005% (질량/부피) 이상의 농도의 계면활성제;
    제2철에 대해 104.2 이상의 제 1 친화성 상수 및 마그네슘에 대해 103.8 미만의 제 2 친화성 상수를 갖는 유기, 철-킬레이트제로서, 상기 제 1 친화성 상수 및 상기 제 2 친화성 상수는 pH 8.45 의 20℃ 탈이온수에서 결정되는, 상기 유기, 철-킬레이트제; 및
    선택적으로 40 mM 이상의 농도, 더 선택적으로 40 mM 내지 약 200 mM의 농도, 및 더욱 더 선택적으로 40 mM 내지 150 mM 의 농도를 갖는 완충제를 포함하며,
    상기 조성물은 20℃ 에서 측정시 7.7 초과 및 8.45 미만, 선택적으로 7.8 내지 8.3 의 pH 를 갖는, 수성 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 완충제는 적어도 하나의 쌍성 이온 화합물을 포함하는, 수성 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 쌍성 이온 화합물은 바이신을 포함하는, 수성 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    시트르산 또는 그의 염을 더 포함하는, 수성 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    마그네슘 염을 더 포함하고, 선택적으로 상기 마그네슘 염은 황산마그네슘 또는 이의 수화물, 및 더 선택적으로 황산마그네슘 헵타하이드레이트 (heptahydrate) 인, 수성 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유기, 철-킬레이트제는 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산, N,N',N',N'-테트라키스(2-피리디닐메틸)에탄-1,2-디아민, 1,2-비스(O-아미노페녹시)에탄-N,N,N,N'-테트라아세트산, N-(2-하이드록시에틸) 에틸렌디아민-N,N',N'-트리아세트산, 전술한 것들 중 임의의 것의 염, 또는 전술한 것들 중 임의의 것의 수화물을 포함하는, 수성 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2철 이온을 더 포함하는, 수성 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 산화지르코늄 입자는 본원에 기재된 바와 같은 광자 상관 분광법에 의해 측정될 때 각각의 경우에, 500 nm 이하, 선택적으로 250 nm 이하, 선택적으로 이하의 평균 입자 크기를 갖는, 수성 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    지시 염료, 보존제, LAMP 반응의 인핸서, qPCR 반응의 인핸서, 또는 플루오로계면활성제 중 하나 이상을 더 포함하는, 수성 조성물.
  10. 핵산을 증폭하는 방법으로서,
    a) 혼합물을 형성하기 위해 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 미생물 또는 바이러스를 포함하는 샘플과 접촉하는 단계;
    b) 용해된 혼합물을 형성하기 위해 상기 혼합물 중 상기 미생물 또는 상기 바이러스를 용해하는 단계; 및
    c) 상기 용해된 혼합물의 적어도 일부를 핵산 증폭 공정에 적용하는 단계를 포함하는, 핵산을 증폭하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    단계 a) 이전에, 미생물 또는 바이러스를 포함하는 상기 조성물을 성장 배지에서 배양하는 단계를 더 포함하는, 핵산을 증폭하는 방법.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    상기 핵산 증폭 공정은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 루프 매개 등온 증폭 (LAMP) 을 포함하는, 핵산을 증폭하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 PCR 은 qPCR 인, 핵산을 증폭하는 방법.
  14. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용해하는 단계는 열 용해를 포함하고, 상기 열 용해는 선택적으로 상기 혼합물을 5 내지 30분 동안 80 내지 115℃ 로 가열하는 것을 포함하는, 핵산을 증폭하는 방법.
  15. 복수의 산화지르코늄 입자들;
    비이온성 계면활성제;
    제2철에 대해 104.2 이상의 제 1 친화성 상수 및 마그네슘에 대해 103.8 미만의 제 2 친화성 상수를 갖는 유기, 철-킬레이트제로서, 상기 제 1 친화성 상수 및 상기 제 2 친화성 상수는 pH 8.45 의 20℃ 탈이온수에서 결정되는, 상기 유기, 철-킬레이트제; 및
    7.8 이하의 pH 로부터 8.2 이상의 pH 로 연장되는 20℃ 에서의 완충 영역을 갖는 완충제를 포함하는, 키트.
  16. 제 14 항에 있어서,
    나노입자 분산 안정제를 더 포함하는, 키트.
  17. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    비이온성 계면활성제는 약 11 내지 약 16 의 친수성-친유성 균형을 갖는, 키트.
  18. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 산화지르코늄 입자들, 상기 비이온성 계면활성제, 및 상기 유기, 철-킬레이트제 중 적어도 하나는 20℃ 에서 측정시 7.7 초과 및 8.45 미만, 선택적으로 7.8 내지 8.3 의 pH 를 갖는 수성 액체 중에 배치되는, 키트.
  19. 제 15 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    지시 염료, 보존제, LAMP 반응의 인핸서, qPCR 반응의 인핸서, 또는 플루오로계면활성제 중 적어도 하나를 더 포함하는, 키트.
  20. 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키트는 제2철 염을 더 포함하는, 키트.
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