KR20240067928A - 세포외 소포체를 처리 및 분석하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포외 소포체가 형광 염색 염료 또는 항체와 접촉시키기 전에 정제되지 않은 세포외 소포체를 처리하는 방법을 제공한다. 원심분리 필터를 사용하면 세포외 소포체의 한 가지 이상의 특성을 분석하기 전에 과잉 염색 염료나 항체를 쉽게 제거할 수 있다. 본 방법은 세포외 소포체의 높은 농도를 유지하면서 신속하고 간단한 처리 및 분석을 제공한다.
Description
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2021년 9월 29일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/249,705의 이익을 주장하며, 이의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 세포외 소포체가 형광 염색 염료 또는 항체와 접촉하기 전에 정제되지 않은 세포외 소포체를 처리하는 방법을 제공한다. 원심분리 필터를 활용하면 세포외 소포체의 한 가지 이상의 특성을 분석하기 전에 과도한 염색 염료나 항체를 쉽게 제거할 수 있다. 이 방법은 세포외 소포체의 높은 농도를 유지하면서 신속하고 간단한 처리 및 분석을 제공한다.
다양한 암 및 기타 질환에 대한 엑소좀 또는 세포외 소포체를 이용한 응용 및 치료에 대한 연구가 계속해서 발전하고 있다. 이러한 50 내지 150nm 세포 유래 소포체는 단백질, 지질 및 핵산(siRNA 및 안티센스 핵산 포함)을 포함하는 다양한 약리물질(cargo)을 전달할 수 있어서 다양한 다른 세포 유형으로 전달을 위해 이를 활용하는 데 대한 관심이 커졌다.
생성되는 세포 집단 및 관련 파편으로부터 세포외 소포체를 단리하고 분석하기 위해 다양한 방법이 개발되었다. 그러나 이러한 기존 접근법은 종종 세포외 소포체의 손실을 초래하거나 샘플을 상당히 희석시켜 분석의 일관성이 떨어지거나 분석이 저해될 수 있다.
원치 않는 희석 없이 세포외 소포체 분리 및 분석을 제공하는 간단하고 신속한 방법이 필요하다. 본 발명은 그러한 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 생물학적 유체에서 세포외 소포체를 농축하는 단계; 세포외 소포체의 농도를 측정하는 단계; 세포외 소포체를 형광 염색 염료 또는 세포외 소포체 표면 표지자를 위한 항체와 접촉시키는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 200 내지 750kD 분자량 컷오프 폴리에테르술폰 필터 매체를 포함하는 원심분리 필터에 통과시켜 표지된 세포외 소포체 집단을 과잉 형광 염색 염료 또는 과잉 항체로부터 분리하는 단계; 및 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계를 포함하는 세포외 소포체를 처리하는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 세포외 소포체는 접촉 전에 정제되지 않는다.
추가 실시양태에서, 접선 유동 필터를 사용하여 적응용 배지에서 세포외 소포체를 농축하는 단계; 세포외 소포체의 농도를 결정하는 단계; 세포외 소포체를 형광 염색 염료 또는 세포외 소포체 표면 표지자를 위한 항체와 접촉시키는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 300kD 분자량 컷오프 폴리에테르설폰 필터 배지를 포함하는 원심분리 필터에 통과시켜 표지된 세포외 소포체 집단을 과잉 형광 염색 염료 또는 과잉 항체로부터 분리하는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계; 및 회수된 표지된 세포외 소포체 집단을 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 분석하는 단계를 포함하는 세포외 소포체를 분석하는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 세포외 소포체는 접촉 전에 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제되지 않는다.
추가 실시양태에서, 생물학적 유체에서 세포외 소포체를 농축하는 단계; 세포외 소포체의 농도를 적어도 세포외 소포체 5x1010개/mL로 결정하는 단계; 세포외 소포체를 세포외 소포체 표면 표지자를 위한 항체와 접촉시키는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 적어도 1:300 비율로 희석시키는 단계; 및 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계를 포함하는 세포외 소포체를 처리하는 방법이 본원에서 제공되고, 여기서 세포외 소포체는 접촉 전에 정제되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 접선 유동 필터를 이용하여 조정배지에서 세포외 소포체를 농축하는 단계; 세포외 소포체의 농도를 적어도 세포외 소포체 5x1010개/mL로 결정하는 단계; 세포외 소포체를 세포외 소포체 표면 표지자를 위한 항체와 접촉시키는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 적어도 1:300 비율로 희석시키는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계; 및 회수, 표지된 세포외 소포체 집단을 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 분석하는 단계를 포함하는 세포외 소포체를 분석하는 방법이 본원에서 제공되고, 여기서 세포외 소포체는 접촉 전에 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제되지 않는다.
추가 실시양태에서, 생물학적 유체에서 세포외 소포체를 농축하는 단계; 세포외 소포체의 농도를 적어도 세포외 소포체 5x1010개/mL로 결정하는 단계; 세포외 소포체를 RNA-특이적 염료와 접촉시키는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 적어도 1:300 비율로 희석시키는 단계; 및 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계를 포함하는 세포외 소포체를 처리하는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 세포외 소포체는 접촉 전에 정제되지 않는다.
추가 실시양태에서, 접선 유동 필터를 이용하여 조정배지에서 세포외 소포체를 농축하는 단계; 세포외 소포체의 농도를 적어도 세포외 소포체 5x1010개/mL로 결정하는 단계; 세포외 소포체를 녹색 형광 RNA 염색 또는 적색 형광 RNA 염색과 접촉시키는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 적어도 1:300 비율로 희석시키는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계; 및 회수, 표지된 세포외 소포체 집단을 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 분석하는 단계를 포함하는 세포외 소포체를 분석하는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 세포외 소포체는 접촉 전에 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제되지 않는다.
도 1a 내지 1h는 크기 배제 크로마토그래피 및 여과 후 EV로부터 염료의 제거를 보여준다.
도 2는 형광 염료 제거를 위한 다양한 분자량 컷오프 필터의 비교를 보여준다.
도3a 내지 3b는 NanoSep 300K 여과가 EV 크기 분포에 미치는 영향을 보여준다.
도 4a는 여과 및 크기 배제 크로마토그래피를 통한 과잉 항체 EV 제거와 함께 항-테트라스파닌 항체(CD9, CD63 및 CD81)에 의한 정제된 EV 염색을 보여준다.
도 4b 내지 4c는 여과를 통한 과잉 항체 제거와 함께 항-테트라스파닌 항체(CD9, CD63 및 CD81)에 의한 조정된 배지 및 공정 중 샘플의 염색을 보여준다.
도 5a 내지 5f는 EV의 항체 표지화를 입증하는 입자 크기 분포를 보여준다.
도 6a 내지 6b는 항체 표지화 확인에 미치는 희석의 영향을 보여준다.
도 7a는 항체 표지화 및 EV 크기에 미치는 희석 방법의 영향을 보여준다.
도 7b 내지 7c는 MSC- 및 HEK-293293-유래 배양물의 적응용 배지를 사용한 항체 표지화에서 희석 방법의 영향을 보여준다.
도 8a 내지 8c는 RNA 염색 및 희석 결과를 보여준다.
도 2는 형광 염료 제거를 위한 다양한 분자량 컷오프 필터의 비교를 보여준다.
도3a 내지 3b는 NanoSep 300K 여과가 EV 크기 분포에 미치는 영향을 보여준다.
도 4a는 여과 및 크기 배제 크로마토그래피를 통한 과잉 항체 EV 제거와 함께 항-테트라스파닌 항체(CD9, CD63 및 CD81)에 의한 정제된 EV 염색을 보여준다.
도 4b 내지 4c는 여과를 통한 과잉 항체 제거와 함께 항-테트라스파닌 항체(CD9, CD63 및 CD81)에 의한 조정된 배지 및 공정 중 샘플의 염색을 보여준다.
도 5a 내지 5f는 EV의 항체 표지화를 입증하는 입자 크기 분포를 보여준다.
도 6a 내지 6b는 항체 표지화 확인에 미치는 희석의 영향을 보여준다.
도 7a는 항체 표지화 및 EV 크기에 미치는 희석 방법의 영향을 보여준다.
도 7b 내지 7c는 MSC- 및 HEK-293293-유래 배양물의 적응용 배지를 사용한 항체 표지화에서 희석 방법의 영향을 보여준다.
도 8a 내지 8c는 RNA 염색 및 희석 결과를 보여준다.
청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는(comprising)"이라는 용어와 함께 사용될 때 단수형(단어 "a" 또는 "an")의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상”, "적어도 하나”', 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와도 일치한다.
본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 값을 결정하기 위해 사용되는 방법/장치에 대한 고유한 오차 변동을 내포한다는 것을 나타내는 데 사용된다. 전형적으로, 이 용어는 대략 상황에 따른 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20% 미만의 변동성을 포괄하는 의미이다.
청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 대안(들)만을 지칭하도록 명시적으로 지정되거나 대안(들)이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 데 사용되지만, 본 개시내용은 대안만 및 "및/또는”을 지칭하는 정의를 지원한다.
본 명세서 및 청구항(들)에 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는(comprising)"(및 "포함한다(comprise 및 comprises)"와 같은 포함하는의 임의의 형태), "갖는"(및 "갖다(have 및 has)"와 같은 갖는의 임의의 형태), "포함하는(including)"(및 "포함한다(include 및 includes)"와 같은 포함하는의 임의의 형태) 또는 "함유하는(containing)"(및 "함유한다(contains 및 contain"와 같은 함유하는의 임의의 형태)은 포괄적이거나 개방적이며, 인용되지 않은 추가적 요소 또는 방법 단계를 제외하지 않는다.
실시양태에서, 세포외 소포체를 처리하는 방법이 본원에 제공된다. 용어 "세포외 소포체"(EV) 및 "엑소좀"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 세포 활성화 또는 스트레스 하에서 세포로부터 생성되는 마이크론 이하 크기 또는 나노미터 크기의 막 소포체를 지칭한다. EV는 모세포의 핵산, 단백질 및 지질을 운반하며, 안티센스 RNA, 마이크로RNA(miRNA) 또는 siRNA를 비롯한 원하는 핵산을 운반하도록 가공될 수 있다. EV의 크기는 약 30nm 내지 약 200nm 정도인 것이 적합하다.
본원에 기술된 처리 방법은 하나 이상의 세포 유형을 통한 생산 후 생물학적 유체로부터 EV를 분리하는 데 사용된다. 본원에 사용된 "생물학적 유체"는 EV 생산에 사용되는 세포, 세포 파편, 완충액, 세포 성장 배지 등을 적절하게 포함하는 용액을 지칭한다.
실시양태에서, EV를 처리하는 방법은 생물학적 유체에서 세포외 소포체를 농축하는 것, 즉 생물학적 유체에 존재하는 EV를 농축하는 것을 포함한다. EV를 농축하는 방법에는 예를 들어 EV를 하나 이상의 접선 유동 필터에 통과시켜 EV를 농축하는 것(즉, 샘플 내 EV 수를 유지하면서 유체 부피를 줄이는 것)이 포함된다. 하나 이상의 접선 유동 필터를 통해 EV를 농축하기 전에, EV는 약 10분 동안 300xg, 후속으로 약 20분 동안 1200xg, 후속으로 약 30분 동안 10,000xg와 같은 하나 이상의 원심분리 단계를 통해 처리될 수 있다. 추가 원심분리 단계를 사용할 수도 있다. 또한, 원심분리 속도 및 기간은 예를 들어 약 5 내지 20분 동안 약 200xg 내지 500xg, 이어서 약 10 내지 30분 동안 약 800xg 내지 1500xg, 이어서 약 20 내지 40분 동안 7,000xg 내지 15,000xg로 수정될 수 있다.
본원에 설명된 바와 같이, EV의 농축은 하나 이상의 접선 유동 필터를 사용하여 적절하게 수행된다. 직교류(crossflow) 여과라고도 알려진 접선 유동 여과는 공급물, 입구 또는 입력 유체 흐름이 한 부분이 통과하여 막 밖으로(투과물 흐름으로) 나올 때 막 면과 평행하게 통과하는 반면 나머지(잔류물 흐름)는 막 내부를 통과하여 입력으로 다시 재순환될 수 있으며, 농축되고 궁극적으로 저장소로 전달되거나 추가 처리를 위해 전달될 수 있는 여과 시스템 또는 공정이다. 접선 유동 필터는 용액이 공급되는 일련의 중공 섬유 막(단일 섬유도 사용될 수 있음)으로 적절하게 구성된다. 잔류물 흐름은 중공 섬유 내부를 통과하여 섬유 막 내부의 용액 내에 EV를 유지하는 반면, 초과 부피는 섬유 막을 통과하여 투과물 흐름으로 빠져나간다. 이로 인해 총 샘플의 부피가 줄어들어 EV 샘플의 농축을 유발한다(부피당 EV 수가 증가함). 접선 유동 필터에 사용하기 위한 예시적인 재료에는 폴리(에테르 술폰), 폴리(아크릴로니트릴) 및 폴리(비닐리덴 디플루오라이드), 셀룰로스 에스테르 및 폴리(술폰)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 중합체가 포함된다. 예시적인 접선 유동 필터에는 MICROKROS® 및 MIDIKROS® 필터와 이들의 변형을 포함하여 SPECTRUM LABS® 또는 REPLIGEN®에서 입수 가능한 필터가 포함된다. 실시양태에서, 접선 유동 필터의 재료는 약 100kD(100킬로달톤) 내지 약 750kD의 분자량 컷오프, 더욱 적합하게는 약 100kD 내지 약 500kD의 분자량 컷오프, 약 200kD 내지 약 400kD의 분자량 컷오프, 또는 100kD, 200kD, 300kD, 400kD 또는 500kD의 분자량 컷오프를 갖는 변형된 폴리(에테르 설폰)(MPES) 필터이다.
처리 방법은 세포외 소포체의 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 세포외 소포체의 농도를 측정하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 동적 광 산란, 나노입자 분석을 위한 유세포 분석법(나노규모 유세포 분석법)(예를 들어, NanoFCM(Nottingham, UK)), 및 나노입자 추적 분석(Nanosight Instruments, Malvern Instruments; ViewSizer, Horiba)을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 적절하게는 세포외 소포체의 농도는 처리 방법을 계속하기 전에 적어도 약 세포외 소포체 0.5x1010개/mL로 결정된다. 보다 적절하게는, 세포외 소포체의 농도는 처리 방법을 계속하기 전에 적어도 세포외 소포체 1x1010개/mL로 결정되며, 더욱 적절하게는 적어도 0.8x1010개, 적어도 0.9x1010개, 적어도 1.1x1010개, 적어도 1.2x1010개, 적어도 1.2x1010개, 적어도 1.3x1010개, 적어도 1.4x1010개, 또는 적어도 1.5x1010개가 되도록 결정된다. 본원에 설명된 바와 같이, 약 1x1010개 이상의 EV 농도를 달성함으로써 표지화 공정의 나머지 청소/분리/세척 요소 및 EV의 궁극적인 분석이 재현 가능하게 수행될 수 있고 전체 폐기물이 감소되는 것으로 확인되었다.
본원에 기술된 바와 같이, 방법은 세포외 소포체를 형광 염색 염료 또는 세포외 소포체 표면 표지자를 위한 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 그런 다음 접촉된 EV를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성한다. 적합한 실시양태에서, EV는 EV의 막을 투과하고 하나 이상의 EV 내부 분자를 염색하는 형광 염색 염료와 접촉된다. 예를 들어, 형광 염색 염료는 숙신이미딜 기를 통해 내부 EV 분자에, 특히 세포내 리신 잔기 및 기타 아민 공급원에 결합하는 염료인 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(6-카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르; 5(6)-CFDA-SE)(CFSE)일 수 있다. EV를 표지화하는 데 사용할 수 있는 형광 염색 염료를 비롯한 추가 염료에는 예를 들어 ExoBrite™ EV 막 염색(Biotium, Fremont, CA), ExoGlow™ EV 염색(System Biosciences, Palo Alto, CA)뿐만 아니라 막 염료로서 예컨대 PKH67(Sigma Aldrich)이 포함된다. RNA를 염색하는 염료도 활용될 수 있다. SYTO™ RNASelect™ 및 Quant-iT™ RiboGreen™과 같은 RNA 염색 염료를 예로 들 수 있다. 추가적인 염료도 해당 분야에 알려져 있으며 설명된 방법에서도 사용될 수 있다.
적합하게는, 세포외 소포체는 형광 염색 염료와 접촉되고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 1시간 동안 배양된다. 예를 들어, EV는 약 30분 내지 약 2시간, 또는 약 30분 내지 약 1.5시간, 또는 약 45분 내지 약 1.5시간, 또는 약 1시간 내지 약 1.5시간, 또는 약 1.5시간 동안 약 35℃ 내지 40℃, 또는 약 37℃의 온도에서 형광 염색 염료와 접촉될 수 있다.
EV가 항체로 표지되는 방법에서, 특정 세포외 소포체 표면 표지자를 위해 하나 이상의 항체가 선택될 수 있다. 즉, EV 표면에 있을 것으로 예상되거나 원하는 물질(예를 들어, 단백질 등)이 함유된 EV 표면에 있기를 원하는 표면 표지자이다. 예시적인 실시양태에서, 항체는 항-테트라스파닌 항체, 즉 EV 표면의 테트라스파닌 당단백질에 결합하는 항체이다. 테트라스파닌은 작은 막 단백질(200 내지 350개 아미노산)로, 여러 파트너 단백질과 측면에서 상호작용하고 서로 상호작용하여 소위 TEM(테트라스파닌이 풍부한 마이크로도메인)을 형성한다. 예시적인 항체에는 항-CD9 항체, 항-CD63 항체, 항-CD81 항체, 및 항-IgG1 항체가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 추가 항체에는 항-CD151 항체, 항-CD82 항체, 항-CD53 항체, 항-CD37 항체 등이 포함될 수 있다. 적합하게는 EV는 항-CD9 항체, 항-CD63 항체, 항-CD81 항체 및 항-IgG1 항체의 조합과 같은 항체의 조합으로 표지된다. 예를 들어, (CD9+CD63; CD9+CD81; CD81+CD63) 및 삼중(CD9+CD81+CD63) 조합을 사용할 수 있다.
적합하게는, 세포외 소포체는 항체(들)와 접촉되고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 30분 동안 배양된다. 예를 들어, EV는 약 30분 내지 약 2시간, 또는 약 30분 내지 약 1.5시간, 또는 약 45분 내지 약 1.5시간, 또는 약 1시간 내지 약 1.5시간, 또는 약 1시간 동안 약 35℃ 내지 40℃, 또는 약 37℃의 온도에서 항체와 접촉될 수 있다.
표지화 후, 세포외 소포체(표지된 EV와 표지되지 않은 EV 모두 포함)는 200 내지 750kD 분자량 컷오프 폴리에테르설폰 필터 매체를 포함하는 원심분리 필터를 통과하여 표지된 세포외 소포체 집단을 과잉 형광 염색 염료 또는 과잉 항체로부터 분리한다. 그런 다음 표지된 세포외 소포체 집단이 회수된다.
본원에 기술된 바와 같이, 표지된 세포외 소포체 집단을 약 200 내지 750kD 분자량의 컷오프를 갖는 폴리에테르술폰 필터를 통해 통과시킴으로써 표지된 EV가 EV의 상당한 손실 없이 그리고 EV의 상당한 희석 없이 매우 높은 수로 회수된다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 적합한 실시양태에서, 접촉된 세포외 소포체(염료 또는 항체로 표지됨)는 적어도 10,000xg의 원심력에서 적어도 10분 동안 원심분리 필터를 통과한다. 적절하게는, 폴리에테르술폰 필터의 분자량 컷오프는 약 200 내지 500kD, 약 200 내지 400kD, 또는 200kD, 300kD, 400kD 또는 500kD이다. 예시적인 300kD 분자량 컷오프 필터는 PALL® Corporation(Port Washington, NY)의 OMEGA™ 300K 폴리에테르술폰 막을 포함하는 NANOSEP® 원심분리 필터이다.
본원에 기술된 바와 같이, 놀랍게도 EV를 표지하기 위해 형광 염료 또는 항체와 접촉시키기 전에 세포외 소포체를 정제할 필요가 없다는 것이 밝혀졌다. 기존에, EV는 표지화 전에 세포 성장 배지 용액에서 정제되어야 했다. 그러나 본원에 설명된 바와 같이 정제 없이 단순히 EV를 농축하면(예를 들어, 원심분리 또는 접선 유동 필터링 또는 이들의 조합을 통해), 표지된 다음 나중에 정제, 회수, 및 분석할 수 있는 EV 샘플이 생성되고, 분석을 통해 분석용 EV를 고농도화하고 EV 특성에 대한 재현 가능한 분석 결과를 제공하는 것으로 확인되었다. 본원에서 사용된 바와 같이, "세포외 소포체를 정제한다"는 용어는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼이나 기타 여과 매체를 이용하여 적응용 배지에 존재하는 세포 성분, 파편 등을 EV로부터 분리하여 정제된 EV를 갖게 되는 것을 의미한다. 본원에 기술된 바와 같이, 이러한 단계 및 컬럼은 본 방법이 정제된 EV의 사용을 요구하지 않고 실시양태에서 구체적으로 배제하기 때문에 본원에 기술된 처리 및 분석 방법에서 특별히 제외된다.
당업계에 공지된 바와 같이, 다양한 세포를 사용하여 세포외 소포체를 생성할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, EV는 인간 배아 신장(HEK-293) 세포(HEK-293 세포 포함), 인간 백인 결장 선암종 HT-29 세포, 또는 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 생산된다. EV를 제조하는 데 사용될 수 있는 추가 세포에는 배아 줄기 세포 유래 심혈관 전구 세포, 내피 전구 세포, 미성숙 수지상 세포(DC) 등이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 추가 실싱양태에서, EV는 다양한 암 세포주를 포함한 질병 세포주로부터 생산될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 암세포와 같은 다양한 세포 유형으로부터 배설된 EV에 존재하는 질병 특징을 분석하는 데 유용하다.
예시적인 실시양태에서, EV를 함유하는 생물학적 유체는 적응용 배지이다. 본원에 사용된 바와 같이 "적응용 배지(단수형 또는 복수형)”는 하나 이상의 성장 인자로 조정된 세포 성장 배지를 지칭하며, 그 안으로 성분이 세포에 의해 분비되고, 이는 세포 파편(예를 들어, 지질, 단백질 및 단백질 응집체, 핵산 등)을 포함할 수는 있으나 손상되지 않은 전체 세포는 포함되지 않는다. 예시적 실시양태에서, 적응용 배지는 HEK-293, HT-29 또는 MSC 세포 성장 배지를 포함하지만 적합하게는 무혈청이다.
적합하게는, 세포 및 그의 생성물 EV는 본원에 기술된 처리 방법에 사용하기 전에 생물반응기에서 생산된다. 세포는 교반 탱크, 에어리프트, 섬유, 마이크로섬유, 중공 섬유, 세라믹 매트릭스, 유동층, 고정층 및/또는 분출층 생물반응기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 생물반응기(본원에서는 반응기로도 지칭됨)에서 제조될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "생물반응기"는 발효기 또는 발효 유닛, 또는 임의의 다른 반응 용기를 포함할 수 있으며, 용어 "생물반응기" 및 "반응기"는 "발효기"와 상호교환적으로 사용된다. 발효기 또는 발효라는 용어는 미생물 및 포유류 배양물을 모두 지칭한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 예시적인 생물반응기 유닛은 영양분 및/또는 탄소원 공급, 적합한 가스(예를 들어, 산소) 주입, 세포 배양 배지 또는 발효의 입구 및 출구 흐름, 기체상과 액체상의 분리, 온도 유지, 산소 및 CO2 수준 유지, pH 수준 유지, 휘저음(예를 들어, 교반) 및/또는 세척/멸균 중 하나 이상 또는 모두를 수행할 수 있다. 발효 유닛과 같은 예시적인 반응기 유닛은 유닛 내에 다수의 반응기를 함유할 수 있으며, 예를 들어 유닛은 각 유닛에 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 이상의 생물반응기를 가질 수 있고/있거나 시설은 시설 내에 단일 또는 다중 반응기를 갖는 다중 유닛을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 생물반응기는 회분식, 반유가식, 유가식, 관류 및/또는 연속 발효 공정에 적합할 수 있다. 임의의 적합한 반응기 직경이 사용될 수 있다. 실시양태에서, 생물반응기는 약 100mL 내지 약 50,000L 사이의 부피를 가질 수 있다. 비제한적인 예로는 100mL, 250mL, 500mL, 750mL, 1리터, 2리터, 3리터, 4리터, 5리터, 6리터, 7리터, 8리터, 9리터, 10리터, 15리터, 20리터, 25리터, 30리터, 40리터, 50리터, 60리터, 70리터, 80리터, 90리터, 100리터, 150리터, 200리터, 250리터, 300리터, 350리터, 400리터 , 450리터, 500리터, 550리터, 600리터, 650리터, 700리터, 750리터, 800리터, 850리터, 900리터, 950리터, 1000리터, 1500리터, 2000리터, 2500리터, 3000리터, 3500 리터, 4000리터, 4500리터, 5000리터, 6000리터, 7000리터, 8000리터, 9000리터, 10,000리터, 15,000리터, 20,000리터 및/또는 50,000리터의 부피를 포함한다. 추가로, 적합한 반응기는 다용도, 일회용(single-use 및 disposable), 또는 비일회용일 수 있고 스테인레스강(예를 들어, 316L 또는 임의의 다른 적합한 스테인레스강) 및 인코넬과 같은 금속 합금, 플라스틱, 및/또는 유리를 포함하는 임의의 적합한 재료로 형성될 수 있다.
추가 실시양태에서, 세포외 소포체를 분석하는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 실시양태에서, 이러한 방법은 접선 유동 필터를 사용하여 적응용 배지에서 세포외 소포체를 농축하는 단계; 세포외 소포체의 농도를 결정하는 단계; 세포외 소포체를 형광 염색 염료 또는 세포외 소포체 표면 표지자를 위한 항체와 접촉시키는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 300kD 분자량 컷오프 폴리에테르술폰 필터 매체를 포함하는 원심분리 필터에 통과시켜 표지된 세포외 소포체 집단을 과잉 형광 염색 염료 또는 과잉 항체로부터 분리하는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계; 및 회수된 표지된 세포외 소포체 집단을 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 분석하는 단계를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, 세포외 소포체는 염료 또는 항체와 접촉시키기 전에 크기 배제 크로마토그래피를 통해 적절하게 정제되지 않는다.
본원에 기술된 분석 방법은 표지화 효율, 세포외 소포체 수, 세포외 소포체 농도, 및 세포외 소포체 크기 중 하나 이상의 결정을 허용한다. 예를 들어, 다양한 형광 현미경 기법, 액체 크로마토그래피 기법, 질량 분석법, NMR 분광법, 미세유체 저항 펄스 감지(MRPS) 등을 비롯한 유세포 분석기의 사용 이외의 다른 분석 기법도 사용될 수 있다. 본원에 기술된 분석 방법은 생산 중 EV의 품질 관리 확인을 위한 제조 공정의 일부로 적절하게 사용될 수 있다. 이러한 방법을 사용하면 해당 방법이 원하는 EV를 생산하는지 빠르고 쉽게 결정할 수 있으므로 추가 제조를 계속하거나 필요에 따라 변형하거나 원하지 않는 EV 또는 EV 특성으로 인해 중단할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 예시적인 실시양태에서, 세포외 소포체는 형광 염색 염료인 6-카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)와 접촉되고, 적합하게는 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 1시간 동안 배양된다.
EV가 항체와 접촉되는 실시양태에서, 적합하게는 항-CD9 항체, 항-CD63 항체, 항-CD81 항체 및/또는 항-IgG1 항체 중 하나 이상이 활용된다. 적합하게는, 세포외 소포체를 항체와 접촉시키고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 30분 동안 배양한다.
EV를 제조하기 위해 다양한 세포 집단이 활용될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 적합하게는 EV는 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 인간 백인 결장 선암종 HT-29 세포, 또는 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 생산된다. 이러한 실시양태에서, 적응용 배지는 HEK-293, HT-29 또는 MSC 세포 성장 배지를 각각 포함한다.
적합하게는, 적응용 배지 내 세포외 소포체의 농도는 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 결정되며, 적합하게는 형광 염료 또는 항체로 표지하기 전에 적어도 세포외 소포체 1x1010 개/mL이다. 예시적인 실시양태에서, 세포외 소포체는 EV의 농도를 결정하기 전에 300kD 분자량 컷오프 접선 유동 필터를 사용하여 농축된다.
본원에 기술된 바와 같이, 놀랍게도 접촉된 세포외 소포체는 적어도 10분 동안 적어도 10,000xg의 원심력에서 원심분리 필터(300kD 분자량 컷오프 폴리에테르설폰 필터 매체 포함)를 통해 통과되어 EV를 분리할 수 있는 동시에, 분석을 위해 높은 농도의 EV를 유지하고, 여과 과정 동안 상당한 수의 EV를 잃지 않는다는 것이 발견되었다.
추가의 실시양태에서, 생물학적 유체에서 세포외 소포체를 농축하는 단계, 세포외 소포체의 농도를 적어도 세포외 소포체 5x1010개/mL로 결정하는 단계, 세포외 소포체를 세포외 소포체 표면 표지자를 위한 항체와 접촉시키는 단계, 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계, 표지된 세포외 소포체 집단을 적어도 1:300 비율로 희석하는 단계, 및 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계를 포함하는 세포외 소포체를 처리하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 기술된 바와 같이, 세포외 소포체는 접촉 전에 정제되지 않는다.
이러한 실시양태에서, 세포외 소포체의 농도를 적어도 5x1010개로 설정한 다음, EV를 적어도 1:300 비율로 희석하면 EV의 항체 표지화 이후에 분석용으로 표지된 EV를 회수하기 위해 여과가 필요하지 않다는 것으로 확인되었다.
본원에 기술된 바와 같이, 이러한 방법은 생물학적 유체에서 세포외 소포체를 농축하는 것을 포함한다. EV를 농축하는 방법이 본원에 설명되어 있으며, 예를 들어 EV를 원심 분리하는 것뿐만 아니라 EV를 하나 이상의 접선 유동 필터로 통과시켜 EV를 농축하는 것도 포함한다. 적절하게는, EV는 약 100kD(100킬로달톤) 내지 약 400kD 사이의 분자량 컷오프를 갖는, 더 적절하게는 약 300kD의 분자량 컷오프를 갖는 변형된 폴리(에테르 설폰)(MPES) 필터인 접선 유동 필터를 통과시킨다.
세포외 소포체의 농도를 결정하는 방법이 본원에 기술되어 있으며, 적절한 실시양태에서 EV 농도는 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 결정된다. EV 농도는 적합하게는 적어도 약 1x1010개 EV/mL, 더 적합하게는 적어도 약 2x1010개 EV/mL, 적어도 약 3x1010개 EV/mL, 적어도 약 4x1010개 EV/mL, 적어도 약 5x1010개 EV/mL, 적어도 약 6x1010개 EV/mL, 적어도 약 7x1010개 EV/mL, 적어도 약 8x1010개 EV/mL, 적어도 약 9x1010개 EV/mL, 또는 적어도 약 10x1010개 EV/mL이다.
적어도 약 5x1010개 EV/mL의 EV 농도가 달성되면, EV는 EV 세포 표면 표지자를 위한 항체와 접촉될 수 있다. 전체적으로 기술된 바와 같이, 항체는 적합하게는 항-테트라스파닌 항체이고, 예시적인 항체에는 항-CD9 항체, 항-CD63 항체, 항-CD81 항체, 및 항-IgG1 항체가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
항체에 의해 접촉되는 EV의 수는 적합하게는 약 1x107 내지 1x1010개 EV, 보다 적합하게는 약 1x108 내지 1x109개 EV이거나, 다른 실시양태에서는 약 1x108개, 약 2x108개, 약 3x108개, 약 4x108개, 약 5x108개, 약 6x108개, 약 7x108개, 약 8x108개, 약 9x108개, 또는 약 1x109개 EV가 항체와 접촉된다. 항체를 EV에 접촉시키는 조건은 당업계에 공지되어 있고, 적합한 것은 항체와 EV를 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 30분 동안, 적합하게는 적어도 40분, 적어도 50분, 적어도 1시간, 적어도 1.5시간 또는 적어도 2시간 동안, 그리고 약 35℃ 내지 42℃ 또는 약 37℃의 온도에서 배양하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 배양은 예를 들어 약 1,200 내지 1,500rpm, 또는 약 1,400rpm의 회전 속도로 교반되는 인큐베이터에서 발생한다.
항체를 사용하여 EV를 표지하기 위한 배양 후, EV는 본원에 설명된 바와 같이 EV의 회수 및 잠재적 분석 이전에 인산염 완충 식염수(PBS)와 같은 적합한 완충액을 사용하여 적어도 약 1:200(부피:부피)으로 적합하게 희석된다. 추가 실시양태에서, EV의 추가 분석 전에 EV는 적어도 약 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550; 1:600; 1:650; 1:700; 1:750; 1:800; 1:850; 1:900; 1:950; 또는 적어도 약 1:1000(부피:부피)으로 희석된다.
전체 개시내용에 기술된 바와 같이, 다양한 세포 유형이 EV를 생산하는 데 활용될 수 있으며, 적합한 실시양태에서 세포외 소포체는 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 인간 백인 결장 선암종 HT-29 세포, 또는 중간엽 줄기세포(MSC)로부터 생산된다. 이러한 실시양태에서, 생물학적 유체는 적합하게는 HEK-293 또는 MSC 세포 성장 배지를 포함하는 적응용 배지이다.
또 다른 실시양태에서, 접선 유동 필터를 사용하여 적응용 배지에서 세포외 소포체를 농축하는 단계, 세포외 소포체의 농도가 적어도 세포외 소포체 5x1010개/mL가 되도록 결정하는 단계, 세포외 소포체를 세포외 소포체 표면 표지자를 위한 항체와 접촉시키는 단계, 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계, 표지된 세포외 소포체 집단을 적어도 1:300 비율로 희석시키는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계; 및 회수된, 표지된 세포외 소포체 집단을 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 분석하는 단계를 포함하는 세포외 소포체를 분석하는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 세포외 소포체는 접촉 전에 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제되지 않는다.
항-CD9 항체, 항-CD63 항체, 항-CD81 항체, 및/또는 항-IgG1 항체를 포함하여 EV를 표지하는 데 사용하기 위한 예시적인 항체가 전체 개시내용에 기술되어 있다. 적합하게는, 세포외 소포체는 1x108 내지 1x109개 항체 입자와 접촉되고, 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 30분 동안 배양된다.
실시양태에서, 세포외 소포체는 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 인간 백인 결장 선암종 HT-29 세포, 또는 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 생산되고, 적합하게는 적응용 배지는 HEK-293 또는 MSC 세포 성장 배지를 포함하며, 세포외 소포체는 300kD 분자량 컷오프 접선 유동 필터를 사용하여 농축된다. 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기의 사용을 포함하여 세포외 소포체의 농도를 결정하는 방법이 본원에 설명되어 있다.
표지화 효율, 세포외 소포체 수, 세포외 소포체 농도 및 세포외 소포체 크기 중 하나 이상을 결정하기 위한 분석을 포함하여 회수된 EV를 분석하는 다양한 방법이 본원에 설명되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 생물학적 유체에서 세포외 소포체를 농축하는 단계; 세포외 소포체의 농도를 적어도 세포외 소포체 5x1010개/mL 로 결정하는 단계; 세포외 소포체를 RNA-특이적 염료와 접촉시키는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 적어도 1:300 비율로로 희석시키는 단계; 및 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계를 포함하는 세포외 소포체를 처리하는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 세포외 소포체는 c에서 접촉시키기 전에 정제되지 않는다.
실시양태에서, 세포외 소포체는 녹색 형광 RNA 염색 또는 적색 형광 RNA 염색과 접촉된다. 적합하게는 RNA 염색은 예를 들어 SYTO™ RNASelect™ 및 Quant-iT™ RiboGreen™(ThermoFisher, Waltham, MA)를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 세포외 소포체는 RNA-특이적 염료와 접촉되고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 20분 동안 배양된다.
본원에 기술된 바와 같이, 적합하게는 세포외 소포체는 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 인간 백인 결장 선암종 HT-29 세포, 또는 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 생산된다. 실시양태에서, 세포외 소포체의 농도는 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 결정된다. 본원에 기술된 바와 같이, 적합하게는 생물학적 유체는 HEK-293, HT-29 또는 MSC 세포 성장 배지를 포함하는 적응용 배지이고, 농축은 생물학적 유체를 접선 유동 필터를 통해 통과시키는 것을 포함한다.
추가 실시양태에서, 접선 유동 필터를 사용하여 적응용 배지에서 세포외 소포체를 농축하는 단계; 세포외 소포체의 농도를 적어도 세포외 소포체 5x1010개/mL로 결정하는 단계; 세포외 소포체를 녹색 형광 RNA 염색 또는 적색 형광 RNA 염색과 접촉시키는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 적어도 1:300 비율로 희석시키는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계; 및 회수된, 표지된 세포외 소포체 집단을 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 분석하는 단계를 포함하는 세포외 소포체를 분석하는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 세포외 소포체는 c에서 접촉시키기 전에 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제되지 않는다.
적합하게는, 세포외 소포체는 녹색 형광 RNA 염료 또는 적색 형광 RNA 염료(본원에 기술된 예시적인 염료)와 접촉되고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 20분 동안 배양된다. 적합하게는, 세포외 소포체는 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 인간 백인 결장 선암종 HT-29 세포, 또는 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 생산된다. 실시양태에서, 세포외 소포체의 농도는 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 결정된다. 적합하게는, 적응용 배지는 HEK-293, HT-29, 또는 MSC 세포 성장 배지를 포함하고, 세포외 소포체는 b에서 300kD 분자량 컷오프 접선 유동 필터를 사용하여 농축된다.
본원에 기술된 바와 같이, 예를 들어 제조 공정의 품질 관리 단계의 일부로서 표지화 효율, 세포외 소포체 수, 세포외 소포체 농도 및 세포외 소포체 크기 중 하나 이상을 결정하기 위해 회수된, 표지된 세포외 소포체 집단이 적합하게 분석된다.
실시예
실시예 1: NanoSep 여과를 이용한 분석을 위한 형광 및 항체 표지화 및 세포외 소포체 처리
재료 및 방법
CFSE 염색용:
항체 표지화용
이 절차는 NanoFCM의 NanoAnalyzerNanoAnalyzer에 의한 추가 다운스트림 분석을 위해, CFSE를 사용한 입자의 정량화 및 염색, 또는 항테트라스파닌 항체를 사용한 표지화, 이어서 여과를 설명한다.
MSC 및 HEK-293 세포로부터 생산된 세포외 소포체를 함유하는 적응용 배지는 5x1010개(적절하게는 1x1011개 입자/mL) 초과에 도달하기 위해 MicroKros 300K 접선 유동 필터를 사용하여 농축되었다. EV의 농도는 NanoFCM의 NanoAnalyzer를 사용하여 결정되었다.
비교를 위해, 제조업체의 지침에 따라 Izon(Izon SEC qEV10 35nm, Cat n°qEV10/35nm) 컬럼을 사용함으로써 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 MSC 및 HEK-293 세포로부터 EV를 정제했다.
형광 염색 절차
샘플 475μl* + CFSE 200μM(최대 10μl)
염색 반응물을 와류시키고, 어둠 속에서 진탕 조건 하에 37℃의 써모믹서에서 1시간 동안 배양한다.
배양 후, 제조업체의 지시에 따라 300kD 분자량 컷오프 폴리에테르설폰 필터 매체(NANOSEP® 300k)를 포함하는 원심분리 필터를 통해 여과하여 과잉 CFSE를 제거하고 NanoAnalyzer(NanoFCM)로 풀링된 분획을 측정한다. 비교를 위해 크기 제외 컬럼을 통해 두 번째 샘플을 여과했다. 결과에 표시된 대로 추가 분리 필터도 검사하여 최상의 여과 매체를 결정했다.
항체 표지화 절차
NanoAnalyzer로 샘플을 측정하여 입자 농도가 > 4E+9인지 확인한다. 염색 전 예시적 희석.
MSC의 EV: 1 내지 300
HEK-293의 EV: 1 내지 500
다음과 같이 반응 튜브를 제조한다:
단일 염색 Ab: 샘플 9μl + Ab* 1μl
비염색 대조군:샘플 9μl + PBS 1X 1μl
Ab MIX: 1μl의 각 Ab* + 7 내지 9μl의 샘플(최대 10μl)
* 필요한 경우 중간 희석액, 즉, 이소형 Ab를 제조한다.
염색 반응물을 와류시키고, 어둠 속에서 진탕 조건 하에 37℃의 써모믹서에서 배양한다.
배양 시간이 끝나면 샘플을 적어도 1:300으로 희석하고(또는 필요한 경우 더 높은 희석을 적용) NanoAnalyzer로 측정한다.
결과 및 논의
도 1a 내지 1h는 크기 배제 크로마토그래피(도 1a 내지 1d) 및 NanoSep 여과(도 1e 내지 1h)를 사용한 염료 제거 결과를 보여준다. 표시된 바와 같이 두 방법 모두 비교할 만한 염색 효율과 과잉 형광 염료 제거를 제공했지만, 여과 기반 방법은 SEC 기반 방법에 비해 분리 시간을 크게 줄이고 EV 농도의 전반적인 증가를 제공했다.
도 2는 표지된 EV에서 CFSE 염료를 제거할 때 다양한 분자량 컷오프(300K, 100K 및 50K) 필터를 비교한 결과를 보여준다. 도 2는 또한 정제된 EV(표지화 전에 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 통해 필터링됨)에 비해 정제되지 않은 농축 EV(농축 상층액)를 사용한 여과 결과를 비교했다. 표시된 대로 300kD 분자량 컷오프인 폴리에테르술폰 필터 매체(NANOSEP® 300k)는 적응용 배지(농축 상층액)와 정제된 EV 모두에서 과잉 CFSE를 제거하는 데 있어 최상의 결과를 보여주었다. NanoSep 100K 필터는 정제된 EV에서 형광 염료를 효과적으로 제거했지만 적응용 배지에서는 제거하지 못했다.
NanoSep 300K 필터로 EV의 크기 분포가 수정되지 않는다는 것을 확인하기 위한 실험도 수행되었다. SEC 정제된 EV의 크기를 측정하고(도 3a), 그런 다음 NANOSEP® 300K 필터를 통과시키고 다시 측정했다(도 3b). 나타낸 바와 같이, EV의 중앙값과 평균 크기는 크게 다르지 않았다.
도 4a는 전통적인 SEC 방법과 비교하여 NANOSEP® 300K 필터를 사용하여 EV에서 과잉 항체를 효과적으로 제거하는 것을 보여준다. 언급한 바와 같이, 세 가지 항체 모두에 대해 EV의 표지화 %는 두 여과 방법을 모두 사용하여 비교할 수 있었으며, 이는 NanoSep 300K 여과가 EV의 높은 농도를 유지하면서 과잉 항체를 제거하는 효과적인 방법임을 입증했다. 도 4b 내지 4c는 적응용 배지 및 HEK-293 세포(도 4b) 및 MSC(도 4c) 세포 배양의 공정 중 샘플로부터 과잉 표지된 항체의 효과적인 제거와 함께 항-테트라스파닌 항체(CD9, CD63 및 CD81)를 사용한 EV 염색을 보여준다. 특히, 이 방법은 DNAse 후 처리(DNased), 후 정화(CLAR), 0.2μm 컷오프 필터를 사용한 바이오버든 후 여과(BB0.2), 사전 접선 유동 여과 1(TFF1-입력), 사후 부피 감소(TFF1-부피 감소), 사후 고염도 세척(TFF1-고염도), 정용여과 후 세척(TFF1-DFC) , 정용여과된 세척의 0.45μm 컷오프를 사용한 사후 여과(TFF1-DFC F45), 사전 음이온 교환 크로마토그래피(CHR 입력), 음이온 교환 크로마토그래피 유동 통과(CHR-FT), 음이온 교환 크로마토그래피 세척(CHR-W), 음이온 교환 크로마토그래피 분획(CHR-FX 및 피크), 음이온 교환 크로마토그래피 고염도 세척(CHR-고염도), 사전 접선 유동 여과 2(TFF2-입력), 탈염 후 세척(TFF2-탈염) 및 0.2μm 컷오프 필터로의 사후 최종 멸균 여과를 포함하여 EV 정제 과정의 모든 단계에서 원시 적응용 배지(CM) 및 샘플에 적용 가능했다. 도 5a 내지 5f는 효과적이고 편견 없는 항체 결합을 결정하기 위한 수단으로 입자 크기 분포를 사용할 경우의 유사한 결과를 보여준다.
실시예 2: 여과 없는 분석을 위한 세포외 소포체 항체 표지화 및 처리
EV를 포함하는 MSC 및 HEK-293 세포로부터의 적응용 배지를 접선 유동 여과(300kD 접선 유동 필터)를 사용하여 농축하였다. 나노입자 농도는 항체 표지화 과정을 시작하기 전에 NanoFCM을 사용하여 5x1010개 EV/mL 초과로 결정되었다.
항-CD9, 항-CD63 및 항-CD81 항체를 약 2x108 내지 1x109개 항체 입자 사이에 첨가하고 약 1400rpm으로 교반하면서 37℃에서 1시간 동안 배양했다.
샘플을 적절한 완충액으로 1:300 초과로 희석한 후 항체 표지화를 위해 NanoFCM으로 분석했다. 도 6a 내지 6b는 1:300 초과의 희석 비율을 사용하면 항체 표지화를 측정할 때 허용되는 형광 역치가 여전히 허용된다는 것을 보여준다.
분석 전에 여과를 사용하지 않았으므로 여과 중에 EV를 제거하는 것에 대한 우려가 사라졌다.
도 7a는 전통적인 SEC 여과 방법에 대해 본원에 기술된 바와 같은 항체 염색 및 분석을 위한 희석 방법의 비교를 보여준다. 표시된 바와 같이, 분석 전에 1:1000으로 희석하면 SEC 여과를 통해 달성한 것과 비교할 만한 표지화 효율을 유발하였다.
도 7b는 MSC 배양물로부터 농축된(150x) 적응용 배지를 활용하여 본원에 기술된 항체 염색 및 분석을 위한 희석 방법의 결과를 보여준다. 분석 전 1:1000으로 희석하면 허용되는 역치값(<200) 및 이벤트 수(>2000)를 갖는 염색 %, 중간값 및 평균 크기(nm)로 효율적인 표지화가 가능해졌다. 도 7c는 HEK-293 세포 배양물로부터의 농축된(30x) 적응용 배지로부터의 결과를 보여준다. 분석 전 1:1000으로 희석하면 허용되는 역치값(<200) 및 이벤트 수(>2000)를 갖는 염색 %, 중간값 및 평균 크기(nm)로 효율적인 표지화가 가능해졌다.
실시예 3: 여과 없는 분석을 위한 RNA 염색 및 세포외 소포체 처리
EV를 포함하는 MSC 및 HEK-293 세포로부터의 적응용 배지를 접선 유동 여과(300kD 접선 유동 필터)를 사용하여 농축하였다. 나노입자 농도는 RNA 염색 절차를 시작하기 전에 NanoAnalyzer(NanoFCM)를 사용하여 5x1010개 EV/mL 초과인 것으로 결정되었다.
SYTO™ RNASelect™(Syto; 써모 피셔 사이언티픽) 및 Quant-iT™ RiboGreen®(RiboGreen; 써모 피셔 사이언티픽)을 각각 25μM로 첨가하고 1:50으로 희석했다. Syto와 RiboGreen의 경우 샘플을 둘 다 빛으로부터 보호하면서 흔들면서 37℃에서 각각 20분과 30분 동안 배양했다. 샘플을 적절한 완충액으로 1:300 초과로 희석한 후 항체 표지화를 위해 NanoFCM으로 분석했다. 두 번째 샘플을 NanoSep 300K 필터를 통해 통과시켜 염료의 여과 대 희석을 비교했다.
도 8a는 RiboGreen과 Syto 둘 다 엑소좀 참조 샘플(ExoRef)을 효과적으로 표지한다는 것을 보여준다. 모든 그래프(8a 내지 8c)에서 QuantT-iT miRNA는 RNA 표지화를 위한 대조군으로 표시된다.
도 8b는 HEK-293 세포로부터 제조된 EV가 RiboGreen 및 Syto 둘 다로 효과적으로 표지되고, 희석을 사용하면 Nanosep 여과와 비교할 때 대략 동일하게 확인된 표지화 효율이 발생함을 보여준다.
도 8c는 MSC 세포로부터 제조된 EV가 RiboGreen 및 Syto 둘 다로 효과적으로 표지되고, 희석을 사용하면 Nanosep 여과와 비교할 때 대략 동일하게 확인된 표지화 효율이 발생함을 보여준다.
이러한 결과는 희석이 RNA 염료로 표지된 EV를 특성화하는 데 효과적으로 사용될 수 있으며 분석 전에 결합되지 않은 형광 RNA 염료를 분리하기 위해 여과가 필요하지 않음을 입증한다. 이는 놀랍고 예상치 못한 결과이며, 전반적으로 설명된 바와 같이 분석을 위해 EV를 제조하는 빠르고 간단한 방법을 제공한다.
EV가 정제되지 않은 적응용 배지의 EV에 대해 본원에 제공된 실험 데이터에 기초하여 유사한 결과가 예상될 수 있다. 이러한 방법에는 과잉 RNA 염료를 여과하기 위한 접선 유동 여과(300kD 접선 유동 필터) 사용과 과잉 염료를 제거하기 위한 희석 방법이 포함된다. 두 방법 모두 적응용 배지의 EV로 번역될 때 정제된 EV에 제공되는 것과 유사한 결과를 얻을 것으로 예상된다.
예시적 실시양태
실시양태 1은 생물학적 유체에서 세포외 소포체를 농축시키는 단계; 세포외 소포체의 농도를 결정하는 단계; 세포외 소포체를 형광 염색 염료 또는 세포외 소포체 표면 표지자를 위한 항체와 접촉시키는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 200 내지 750kD 분자량 컷오프 폴리에테르술폰 필터 매체를 포함하는 원심분리 필터에 통과시켜 표지된 세포외 소포체 집단을 과잉 형광 염색 염료 또는 과잉 항체로부터 분리하는 단계; 및 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계를 포함하는 세포외 소포체를 처리하는 방법이며, 여기서 세포외 소포체는 접촉 전에 정제되지 않는다.
실시양태 2는 실시양태 1의 방법을 포함하고, 여기서 농축 단계는 접선 유동 필터를 통해 생물학적 유체를 통과시키는 단계를 포함한다.
실시양태 3은 실시양태 2의 방법을 포함하고, 여기서 접선 유동 필터는 약 100kD 내지 약 500kD의 분자량 컷오프를 갖는다.
실시양태 4는 실시양태 1의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 형광 염색 염료 6-카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)와 접촉된다.
실시양태 5는 실시양태 1의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 항-CD9 항체, 항-CD63 항체, 항-CD81 항체, 및/또는 항-IgG1 항체와 접촉된다.
실시양태 6은 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 형광 염색 염료와 접촉되고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 1시간 동안 배양된다.
실시양태 7은 방법 실시양태 1 내지 3 또는 실시양태 5를 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 항체와 접촉되고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 30분 동안 배양된다.
실시양태 8은 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 인간 백인 결장 선암종 HT-29 세포, 또는 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 생산된다.
실시양태 9는 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 생물학적 유체 내 세포외 소포체의 농도는 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 결정된다.
실시양태 10은 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체의 농도는 접촉 전에 적어도 세포외 소포체 1x1010개/mL인 것으로 결정된다.
실시양태 11은 실시양태 1 내지 10 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 생물학적 유체는 HEK-293, HT-29 또는 MSC 세포 성장 배지를 포함하는 적응용 배지이다.
실시양태 12는 실시양태 1 내지 11 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 접촉된 세포외 소포체는 적어도 10,000xg의 원심력에서 적어도 10분 동안 원심분리 필터를 통과한다.
실시양태 13은 세포외 소포체를 분석하는 방법으로서, 접선 유동 필터를 사용하여 적응용 배지에서 세포외 소포체를 농축하는 단계; 세포외 소포체의 농도를 결정하는 단계; 세포외 소포체를 형광 염색 염료 또는 세포외 소포체 표면 표지자를 위한 항체와 접촉시키는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 300kD 분자량 컷오프 폴리에테르설폰 필터 매체를 포함하는 원심분리 필터에 통과시켜 표지된 세포외 소포체 집단을 과잉 형광 염색 염료 또는 과잉 항체로부터 분리하는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계; 및 회수된 표지된 세포외 소포체 집단을 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 분석하는 단계를 포함하며, 여기서 세포외 소포체는 접촉 전에 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제되지 않는다.
실시양태 14는 실시양태 13의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 형광 염색 염료 6-카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)와 접촉된다.
실시양태 15는 실시양태 13의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 항-CD9 항체, 항-CD63 항체, 항-CD81 항체, 및/또는 항-IgG1 항체와 접촉된다.
실시양태 16은 실시양태 13 또는 실시양태 14의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 형광 염색 염료와 접촉되고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 1시간 동안 배양된다.
실시양태 17은 실시양태 13 또는 실시양태 15의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 항체와 접촉되고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 30분 동안 배양된다.
실시양태 18은 실시양태 13 내지 17 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 인간 백인 결장 선암종 HT-29 세포, 또는 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 생산된다.
실시양태 19는 실시양태 13 내지 18 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 적응용 배지 내 세포외 소포체의 농도는 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 결정된다.
실시양태 20은 실시양태 13 내지 19 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 세포외 소포체의 농도는 c에서 접촉시키기 전에 적어도 세포외 소포체 1x1010개/mL인 것으로 결정된다.
실시양태 21은 실시양태 13 내지 20 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 적응용 배지는 HEK-293, HT-29 또는 MSC 세포 성장 배지를 포함하고, 세포외 소포체는 b에서 300kD 분자량 컷오프 접선 유동 필터를 사용하여 농축된다.
실시양태 22는 실시양태 13 내지 21 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 접촉된 세포외 소포체는 적어도 10,000xg의 원심력에서 적어도 10분 동안 원심분리 필터를 통과한다.
실시양태 23은 실시양태 13 내지 22 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 회수되고 표지된 세포외 소포체 집단은 표지화 효율, 세포외 소포체 수, 세포외 소포체 농도, 및 세포외 소포체 크기 중 하나 이상을 결정하기 위해 분석된다.
실시양태 24는 세포외 소포체를 처리하는 방법으로서, 생물학적 유체에서 세포외 소포체를 농축하는 단계; 세포외 소포체의 농도를 적어도 세포외 소포체 5x1010개/mL로 결정하는 단계; 세포외 소포체를 세포외 소포체 표면 표지자를 위한 항체와 접촉시키는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 적어도 1:300 비율로 희석시키는 단계; 및 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계를 포함하며, 여기서 세포외 소포체는 접촉 전에 정제되지 않는다.
실시양태 25는 실시양태 24의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 항-CD9 항체, 항-CD63 항체, 항-CD81 항체, 및/또는 항-IgG1 항체와 접촉된다.
실시양태 26은 실시양태 24 또는 실시양태 25의 방법을 포함하고, 여기서 1x108 내지 1x109개 세포외 소포체는 항체 입자와 접촉된다.
실시양태 27은 실시양태 24 내지 26 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 항체와 접촉되고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 30분 동안 배양된다.
실시양태 28은 실시양태 24 내지 27 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 인간 백인 결장 선암종 HT-29 세포, 또는 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 생산된다.
실시양태 29는 실시양태 24 내지 28 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체의 농도는 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 결정된다.
실시양태 30은 실시양태 24 내지 29 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 생물학적 유체는 HEK-293, HT-29 또는 MSC 세포 성장 배지를 포함하는 적응용 배지이고, 농축 단계는 생물학적 유체를 접선 유동 필터로 통과시키는 것을 포함한다.
실시양태 31은 세포외 소포체를 분석하는 방법으로서, 접선 유동 필터를 사용하여 적응용 배지에서 세포외 소포체를 농축하는 단계; 세포외 소포체의 농도를 적어도 세포외 소포체 5x1010개/mL로 결정하는 단계; 세포외 소포체를 세포외 소포체 표면 표지자를 위한 항체와 접촉시키는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 적어도 1:300 비율로 희석시키는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계; 및 회수된 표지된 세포외 소포체 집단을 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 분석하는 단계를 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 접촉 전에 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제되지 않는다.
실시양태 32는 실시양태 31의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 항-CD9 항체, 항-CD63 항체, 항-CD81 항체, 및/또는 항-IgG1 항체와 접촉된다.
실시양태 33은 실시양태 31 또는 실시양태 32의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 1x108 내지 1x109개 항체 입자와 접촉된다.
실시양태 34는 실시양태 31 내지 33 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 항체와 접촉되고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 30분 동안 배양된다.
실시양태 35는 실시양태 31 내지 34 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 인간 백인 결장 선암종 HT-29 세포, 또는 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 생산된다.
실시양태 36은 실시양태 31 내지 35 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체의 농도는 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 결정된다.
실시양태 37은 실시양태 31 내지 36 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 적응용 배지는 HEK-293, HT-29, 또는 MSC 세포 성장 배지를 포함하고, 세포외 소포체는 b에서 300kD 분자량 컷오프 접선 유동 필터를 사용하여 농축된다.
실시양태 38은 실시양태 31 내지 37 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 회수되고 표지된 세포외 소포체 집단은 표지화 효율, 세포외 소포체 수, 세포외 소포체 농도, 및 세포외 소포체 크기 중 하나 이상을 결정하기 위해 분석된다.
실시양태 39는 세포외 소포체를 처리하는 방법으로서, 생물학적 유체에서 세포외 소포체를 농축하는 단계; 세포외 소포체의 농도를 적어도 세포외 소포체 5x1010개/mL로 결정하는 단계; 세포외 소포체를 RNA 특이적 염료와 접촉시키는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 적어도 1:300 비율로 희석시키는 단계; 및 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계를 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 접촉 전에 정제되지 않는다.
실시양태 40은 실시양태 39의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 녹색 형광 RNA 염료 또는 적색 형광 RNA 염료와 접촉된다.
실시양태 41은 실시양태 39 내지 40 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 RNA-특이적 염료와 접촉되고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 20분 동안 배양된다.
실시양태 42는 실시양태 39 내지 41 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 인간 백인 결장 선암종 HT-29 세포, 또는 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 생산된다.
실시양태 43은 실시양태 39 내지 42 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체의 농도는 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 결정된다.
실시양태 44는 실시양태 39 내지 43 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 생물학적 유체는 HEK-293, HT-29 또는 MSC 세포 성장 배지를 포함하는 적응용 배지이고, 농축 단계는 생물학적 유체를 접선 유동 필터로 통과시키는 단계를 포함한다.
실시양태 45는 세포외 소포체를 분석하는 방법으로서, 접선 유동 필터를 사용하여 적응용 배지에서 세포외 소포체를 농축하는 단계; 세포외 소포체의 농도를 적어도 세포외 소포체 5x1010개/mL로 결정하는 단계; 세포외 소포체를 녹색 형광 RNA 염료 또는 적색 형광 RNA 염료와 접촉시키는 단계; 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 적어도 1:300 비율로 희석시키는 단계; 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계; 및 회수된 표지된 세포외 소포체 집단을 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 분석하는 단계를 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 접촉 전에 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제되지 않는다.
실시양태 46은 실시양태 45의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 녹색 형광 RNA 염색 또는 적색 형광 RNA 염색과 접촉되고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 20분 동안 배양된다.
실시양태 47은 실시양태 45 내지 46 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체는 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 인간 백인 결장 선암종 HT-29 세포, 또는 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 생산된다.
실시양태 48은 실시양태 45 내지 47 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 세포외 소포체의 농도는 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 결정된다.
실시양태 49는 실시양태 45 내지 48 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 적응용 배지는 HEK-293, HT-29, 또는 MSC 세포 성장 배지를 포함하고, 세포외 소포체는 b에서 300kD 분자량 컷오프 접선 유동 필터를 사용하여 농축된다.
실시양태 50은 실시양태 45 내지 49 중 어느 하나의 방법을 포함하고, 여기서 회수되고 표지된 세포외 소포체 집단은 표지화 효율, 세포외 소포체 수, 세포외 소포체 농도, 및 세포외 소포체 크기 중 하나 이상을 결정하기 위해 분석된다.
특정 실시양태가 본원에 도시되고 설명되었지만, 청구범위는 설명되고 도시된 부분의 특정 형태 또는 배열로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에는 예시적인 실시양태가 개시되어 있으며, 특정 용어가 사용되더라도 이는 일반적이고 설명적인 의미로만 사용되며 제한의 목적으로 사용되지는 않는다. 위의 교시에 비추어 실시양의 수정 및 변형이 가능하다. 그러므로 실시양태는 구체적으로 설명된 것과 다르게 실시될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로 여기에 포함된다.
Claims (50)
- 세포외 소포체를 처리하는 방법으로서,
a. 생물학적 유체에서 세포외 소포체를 농축하는 단계;
b. 세포외 소포체의 농도를 결정하는 단계;
c. 세포외 소포체를 형광 염색 염료 또는 세포외 소포체 표면 표지자를 위한 항체와 접촉시키는 단계;
d. 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계;
e. 접촉된 세포외 소포체를 200 내지 750kD 분자량 컷오프 폴리에테르술폰 필터 매체를 포함하는 원심분리 필터에 통과시켜 표지된 세포외 소포체 집단을 과잉 형광 염색 염료 또는 과잉 항체로부터 분리하는 단계; 및
f. 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계
를 포함하고,
여기서 세포외 소포체는 c에서 접촉 전에 정제되지 않는 것인 방법. - 제1항에 있어서, 농축 단계가 생물학적 유체를 접선 유동 필터에 통과시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제2항에 있어서, 접선 유동 필터가 약 100kD 내지 약 500kD의 분자량 컷오프를 갖는 방법.
- 제1항에 있어서, 세포외 소포체가 형광 염색 염료 6-카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)와 접촉되는 방법.
- 제1항에 있어서, 세포외 소포체가 항-CD9 항체, 항-CD63 항체, 항-CD81 항체, 및/또는 항-IgG1 항체와 접촉되는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포체가 형광 염색 염료와 접촉되고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 1시간 동안 배양되는 방법.
- 제1항 내지 제3항 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포체가 항체와 접촉되고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 30분 동안 배양되는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포체가 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 인간 백인 결장 선암종 HT-29 세포, 또는 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 생산되는 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 유체 내 세포외 소포체의 농도가 나노입자 분석용 유세포 분석기를 사용하여 결정되는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, c에서 접촉시키기 전에 세포외 소포체의 농도가 적어도 세포외 소포체 1x1010개/mL로 결정되는 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 유체가 HEK-293, HT-29 또는 MSC 세포 성장 배지를 포함하는 적응용 배지인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉된 세포외 소포체를 원심분리 필터에 적어도 10,000xg의 원심력으로 적어도 10분 동안 통과시키는 방법.
- 세포외 소포체를 분석하는 방법으로서,
a. 접선 유동 필터를 사용하여 적응용 배지에서 세포외 소포체를 농축하는 단계;
b. 세포외 소포체의 농도를 결정하는 단계;
c. 세포외 소포체를 형광 염색 염료 또는 세포외 소포체 표면 표지자를 위한 항체와 접촉시키는 단계;
d. 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계;
e. 접촉된 세포외 소포체를 300kD 분자량 컷오프 폴리에테르술폰 필터 매체를 포함하는 원심분리 필터에 통과시켜 표지된 세포외 소포체 집단을 과잉 형광 염색 염료 또는 과잉 항체로부터 분리하는 단계;
f. 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계; 및
g. 나노입자 분석을 위해 유세포 분석기를 사용하여 회수되고 표지된 세포외 소포체 집단을 분석하는 단계
를 포함하고,
여기서 세포외 소포체는 c에서 접촉시키기 전에 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제되지 않는 것인 방법. - 제13항에 있어서, 세포외 소포체가 형광 염색 염료 6-카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)와 접촉되는 방법.
- 제13항에 있어서, 세포외 소포체가 항-CD9 항체, 항-CD63 항체, 항-CD81 항체, 및/또는 항-IgG1 항체와 접촉되는 방법.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 세포외 소포체를 형광 염색 염료와 접촉시키고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 1시간 배양하는 방법.
- 제13항 또는 제15항에 있어서, 세포외 소포체를 항체와 접촉시키고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 30분 동안 배양하는 방법.
- 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포체가 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 인간 백인 결장 선암종 HT-29 세포, 또는 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 생산되는 방법.
- 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 적응용 배지 내 세포외 소포체의 농도가 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 결정되는 방법.
- 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, c에서 접촉시키기 전에 세포외 소포체의 농도가 적어도 세포외 소포체 1x1010개/mL로 결정되는 방법.
- 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 적응용 배지는 HEK-293, HT-29, 또는 MSC 세포 성장 배지를 포함하고, 세포외 소포체는 b에서 300kD 분자량 컷오프 접선 유동 필터를 사용하여 농축되는 방법.
- 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉된 세포외 소포체는 적어도 10,000xg의 원심력에서 적어도 10분 동안 원심분리 필터를 통과하는 방법.
- 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 회수되고 표지된 세포외 소포체 집단을 분석하여 표지화 효율, 세포외 소포체 수, 세포외 소포체 농도 및 세포외 소포체 크기 중 하나 이상을 결정하는 방법.
- 세포외 소포체를 처리하는 방법으로서,
a. 생물학적 유체에서 세포외 소포체를 농축하는 단계;
b. 세포외 소포체의 농도를 적어도 세포외 소포체 5x1010개/mL로 결정하는 단계;
c. 세포외 소포체를 세포외 소포체 표면 표지자를 위한 항체와 접촉시키는 단계;
d. 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계;
e. 표지된 세포외 소포체 집단을 적어도 1:300 비율로 희석시키는 단계; 및
f. 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계
를 포함하고,
여기서 세포외 소포체는 c에서 접촉시키기 전에 정제되지 않는 것인 방법. - 제24항에 있어서, 세포외 소포체가 항-CD9 항체, 항-CD63 항체, 항-CD81 항체, 및/또는 항-IgG1 항체와 접촉되는 방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 세포외 소포체가 1x108 내지 1x109개 항체 입자와 접촉되는 방법.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포체가 항체와 접촉되고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 30분 동안 배양되는 방법.
- 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포체가 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 인간 백인 결장 선암종 HT-29 세포, 또는 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 생산되는 방법.
- 24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포체의 농도가 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 결정되는 방법.
- 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 유체가 HEK-293, HT-29 또는 MSC 세포 성장 배지를 포함하는 적응용 배지이고, 농축 단계가 접선 유동 필터를 통해 생물학적 유체를 통과시키는 것을 포함하는 방법.
- 세포외 소포체를 분석하는 방법으로서,
a. 접선 유동 필터를 사용하여 적응용 배지에서 세포외 소포체를 농축하는 단계;
b. 세포외 소포체의 농도를 적어도 세포외 소포체 5x1010개/mL로 결정하는 단계;
c. 세포외 소포체를 세포외 소포체 표면 표지자를 위한 항체와 접촉시키는 단계;
d. 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계;
e. 표지된 세포외 소포체 집단을 적어도 1:300 비율로 희석시키는 단계;
f. 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계; 및
g. 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 회수된 표지된 세포외 소포체 집단을 분석하는 단계
를 포함하고,
여기서 세포외 소포체는 c에서 접촉시키기 전에 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제되지 않는 것인 방법. - 제31항에 있어서, 세포외 소포체가 항-CD9 항체, 항-CD63 항체, 항-CD81 항체, 및/또는 항-IgG1 항체와 접촉되는 방법.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 세포외 소포체가 1x108 내지 1x109개 항체 입자와 접촉되는 방법.
- 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포체가 항체와 접촉되고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 30분 동안 배양되는 것인 방법.
- 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포체가 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 인간 백인 결장 선암종 HT-29 세포, 또는 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 생산되는 방법.
- 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포체의 농도는 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 결정되는 방법.
- 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 적응용 배지는 HEK-293, HT-29, 또는 MSC 세포 성장 배지를 포함하고, 세포외 소포체는 b에서 300kD 분자량 컷오프 접선 유동 필터를 사용하여 농축되는 방법.
- 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된, 표지된 세포외 소포체 집단을 분석하여 표지화 효율, 세포외 소포체 수, 세포외 소포체 농도 및 세포외 소포체 크기 중 하나 이상을 결정하는 방법.
- 세포외 소포체 처리 방법으로서,
a. 생물학적 유체에서 세포외 소포체를 농축하는 단계;
b. 세포외 소포체의 농도를 적어도 세포외 소포체 5x1010개/mL 로 결정하는 단계;
c. 세포외 소포체를 RNA-특이적 염료와 접촉시키는 단계;
d. 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계;
e. 표지된 세포외 소포체 집단을 적어도 1:300 비율로 희석시키는 단계; 및
f. 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계
를 포함하고,
여기서 세포외 소포체는 c에서 접촉되기 전에 정제되지 않는 것인 방법. - 제39항에 있어서, 세포외 소포체가 녹색 형광 RNA 염료 또는 적색 형광 RNA 염료와 접촉되는 방법.
- 제39항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포체가 RNA-특이적 염료와 접촉되고 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 20분 동안 배양되는 방법.
- 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포체가 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 인간 백인 결장 선암종 HT-29 세포, 또는 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 생산되는 방법.
- 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포체의 농도는 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 결정되는 방법.
- 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 유체가 HEK-293, HT-29, 또는 MSC 세포 성장 배지를 포함하는 적응용 배지이고, 농축 단계가 생물학적 유체를 접선 유동 필터에 통과시키는 것을 포함하는 방법.
- 세포외 소포체를 분석하는 방법으로서,
a. 접선 유동 필터를 사용하여 적응용 배지에서 세포외 소포체를 농축하는 단계;
b. 세포외 소포체의 농도를 적어도 세포외 소포체 5x1010개/mL 로 결정하는 단계;
c. 세포외 소포체를 녹색 형광 RNA 염료 또는 적색 형광 RNA 염료와 접촉시키는 단계;
d. 접촉된 세포외 소포체를 배양하여 표지된 세포외 소포체 집단을 생성하는 단계;
e. 표지된 세포외 소포체 집단을 적어도 1:300 비율로 희석시키는 단계;
f. 표지된 세포외 소포체 집단을 회수하는 단계; 및
g. 나노입자 분석을 위해 유세포 분석기를 사용하여 회수된, 표지된 세포외 소포체 집단을 분석하는 단계
를 포함하고,
여기서 세포외 소포체는 c에서 접촉시키기 전에 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제되지 않는 것인 방법. - 제45항에 있어서, 세포외 소포체를 녹색 형광 RNA 염료 또는 적색 형광 RNA 염료와 접촉시키고, 약 30℃ 내지 40℃의 온도에서 적어도 20분 동안 배양하는 방법.
- 제45항 또는 제46항에 있어서, 세포외 소포체가 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 인간 백인 결장 선암종 HT-29 세포, 또는 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 생산되는 방법.
- 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포체의 농도가 나노입자 분석을 위한 유세포 분석기를 사용하여 결정되는 방법.
- 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 적응용 배지가 HEK-293, HT-29, 또는 MSC 세포 성장 배지를 포함하고, 세포외 소포체가 b에서 300kD 분자량 컷오프 접선 유동 필터를 사용하여 농축되는 방법.
- 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 표지된 세포외 소포체 집단을 분석하여 표지화 효율, 세포외 소포체 수, 세포외 소포체 농도 및 세포외 소포체 크기 중 하나 이상을 결정하는 방법.
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