CN118043665A - 用于处理和分析细胞外囊泡的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于处理细胞外囊泡的方法，其中在与荧光染色染料或抗体接触之前，所述细胞外囊泡未被纯化。通过利用离心过滤器，在分析所述细胞外囊泡的一种或多种特性之前，可以容易地去除过量染色染料或抗体。所述方法提供了快速且简单的处理和分析，同时维持细胞外囊泡的高浓度。

Description

用于处理和分析细胞外囊泡的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年9月29日提交的美国临时专利申请第63/249,705号的权益，所述美国临时专利申请的公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开提供了用于处理细胞外囊泡的方法，其中在与荧光染色染料或抗体接触之前，所述细胞外囊泡未被纯化。通过利用离心过滤器，在分析所述细胞外囊泡的一种或多种特性之前，可以容易地去除过量染色染料或抗体。所述方法提供了快速且简单的处理和分析，同时维持细胞外囊泡的高浓度。
背景技术
使用外泌体或细胞外囊泡用于各种癌症和其它病状的应用和治疗的研究在继续发展。这些50-150nm细胞源性囊泡递送包含蛋白质、脂质和核酸(包含siRNA和反义核酸)的各种货物的能力引起了对利用其递送至各种不同细胞类型的关注。
为了从正在生成的细胞群体和相关联碎片中分离并分析细胞外囊泡，已经开发了各种方法。然而，这些传统方法通常会导致细胞外囊泡的损失或显著稀释样品，从而导致分析不一致或受到影响。
需要简单、快速的方法来提供细胞外囊泡分离和分析，而不需要不想要的稀释。本发明提供了此类方法。
发明内容
在一些实施例中，本文提供了一种用于处理细胞外囊泡的方法，所述方法包括：浓缩生物流体中的细胞外囊泡；确定所述细胞外囊泡的浓度；使所述细胞外囊泡与荧光染色染料或细胞外囊泡表面标志物的抗体接触；温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；使所述所接触的细胞外囊泡穿过离心过滤器，所述离心过滤器包括分子量截止值为200-750kD的聚醚砜过滤介质，以从过量荧光染色染料或过量抗体中分离所述经标记的细胞外囊泡群体；以及回收所述经标记的细胞外囊泡群体，其中在所述接触之前，所述细胞外囊泡未被纯化。
在另外的实施例中，本文提供了一种用于分析细胞外囊泡的方法，所述方法包括：用切向流过滤器浓缩条件培养基中的细胞外囊泡；确定所述细胞外囊泡的浓度；使所述细胞外囊泡与荧光染色染料或细胞外囊泡表面标志物的抗体接触；温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；使所述所接触的细胞外囊泡穿过离心过滤器，所述离心过滤器包括分子量截止值为300kD的聚醚砜过滤介质，以从过量荧光染色染料或过量抗体中分离所述经标记的细胞外囊泡群体；回收所述经标记的细胞外囊泡群体；以及使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪分析所回收的、经标记的细胞外囊泡群体，其中在所述接触之前，所述细胞外囊泡未通过尺寸排阻色谱法纯化。
在另外的实施例中，本文提供了一种用于处理细胞外囊泡的方法，所述方法包括：浓缩生物流体中的细胞外囊泡；确定所述细胞外囊泡的浓度为至少5×1010个细胞外囊泡/mL；使所述细胞外囊泡与细胞外囊泡表面标志物的抗体接触；温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；将所述经标记的细胞外囊泡群体稀释至少1:300倍；以及回收所述经标记的细胞外囊泡群体，其中在所述接触之前，所述细胞外囊泡未被纯化。
在仍另外的实施例中，本文提供了一种用于分析细胞外囊泡的方法，所述方法包括：用切向流过滤器浓缩条件培养基中的细胞外囊泡；确定所述细胞外囊泡的浓度为至少5×1010个细胞外囊泡/mL；使所述细胞外囊泡与细胞外囊泡表面标志物的抗体接触；温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；将所述经标记的细胞外囊泡群体稀释至少1:300倍；回收所述经标记的细胞外囊泡群体；以及使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪分析所回收的、经标记的细胞外囊泡群体，其中在所述接触之前，所述细胞外囊泡未通过尺寸排阻色谱法纯化。
在另外的实施例中，本文提供了一种用于处理细胞外囊泡的方法，所述方法包括：浓缩生物流体中的细胞外囊泡；确定所述细胞外囊泡的浓度为至少5×1010个细胞外囊泡/mL；使所述细胞外囊泡与RNA特异性染料接触；温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；将所述经标记的细胞外囊泡群体稀释至少1:300倍；以及回收所述经标记的细胞外囊泡群体，其中在所述接触之前，所述细胞外囊泡未被纯化。
在另外的实施例中，本文提供了一种用于分析细胞外囊泡的方法，所述方法包括：用切向流过滤器浓缩条件培养基中的细胞外囊泡；确定所述细胞外囊泡的浓度为至少5×1010个细胞外囊泡/mL；使所述细胞外囊泡与绿色荧光RNA染色剂或红色荧光RNA染色剂接触；温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；将所述经标记的细胞外囊泡群体稀释至少1:300倍；回收所述经标记的细胞外囊泡群体；以及使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪分析所回收的、经标记的细胞外囊泡群体，其中在所述接触之前，所述细胞外囊泡未通过尺寸排阻色谱法纯化。
附图说明
图1A-1H示出了在尺寸排阻色谱法和过滤之后从EV中去除染料。
图2示出了用于荧光染料去除的不同分子量截止值过滤器的比较。
图3A-3B出了NanoSep300K过滤对EV大小分布的影响。
图4A示出了用抗四跨膜蛋白抗体(CD9、CD63和CD81)对经纯化的EV进行染色，并通过过滤和尺寸排阻色谱法去除过量抗体EV。
图4B-4C示出了用抗四跨膜蛋白抗体(CD9、CD63和CD81)对条件培养基和处理中的样品进行染色，并通过过滤去除过量抗体。
图5A-5F示出了粒径分布，证明了EV的抗体标记。
图6A-6B示出了稀释对抗体标记的确认的影响。
图7A示出了稀释方法对抗体标记和EV大小的影响。
图7B-C示出了稀释方法在用来自MSC和HEK-293293源性培养物的条件培养基进行抗体标记中的效果。
图8A-8C示出了RNA染色和稀释的结果。
具体实施方式
在权利要求和/或说明书中，当结合术语“包括(comprising)”使用时，词语“一个(a)”或“一种(an)”的使用可以意指“一个/一种(one)”，但是还与“一个或多个/一种或多种(one or more)”、“至少一个/至少一种(at least one)”以及“一个或多于一个/一种或多于一种(one or more than one)”一致。
贯穿本申请，术语“约”用于指示值包含用于测定值的方法/装置的固有的误差变化。通常，根据情况，所述术语意在涵盖约或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％可变性。
权利要求中对术语“或”的使用用于意指“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或替代方案相互排斥，尽管本公开支持仅指代替代方案以及指代“和/或”的定义。
如本说明书和权利要求所使用的，词语“包括”(以及包括的任何形式，如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”)、“具有(having)”(以及具有的任何形式，如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包含(including)”(以及包含的任何形式，如“包含(includes)”和“包含(include)”)或“含有(containing)”(以及含有的任何形式，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包容性的或开放性的并且不排除另外的未列举的元素或方法步骤。
在实施例中，本文提供了一种用于处理细胞外囊泡的方法。术语“细胞外囊泡”(EV)和“外泌体”在本文中可互换使用，并且是指亚微米大小或纳米大小的膜囊泡，在细胞激活或应激下从细胞中产生。EV携带来自其亲本细胞的核酸、蛋白质和脂质，并且可以被工程化为携带期望的核酸，包含反义RNA、微小RNA(miRNA)或siRNA。EV的大小合适地在约30nm至约200nm的数量级。
在通过一个或多个细胞类型产生EV之后，本文所描述的处理方法用于从生物流体中分离EV。如本文所使用的，“生物流体”是指用于产生EV的合适地包括细胞、细胞碎片、缓冲液、细胞生长培养基等的溶液。
在实施例中，用于处理EV的方法包含浓缩生物流体中的细胞外囊泡，即浓缩生物流体中存在的EV。浓缩EV的方法包含，例如，使EV穿过一个或多个切向流过滤器以浓缩EV(即，在维持样品中的EV的数量的同时减少流体体积)。在通过一个或多个切向流过滤器浓缩EV之前，可以通过一个或多个离心步骤处理EV，如通过300xg持续约10分钟，然后通过1200xg持续约20分钟，然后通过10,000xg持续约30分钟。也可以使用另外的离心步骤。另外，离心的速度和持续时间可以改变，例如介于约200xg至500xg之间持续约5-20分钟，然后介于约800xg至1500xg之间持续约10-30分钟，然后介于约7,000xg至15,000xg之间持续约20-40分钟。
如本文所描述的，使用一个或多个切向流过滤器合适地进行EV的浓缩。切向流过滤，也被称为横流过滤，是过滤系统或过程，其中进料、入口或输入流体流在一部分穿过时平行于膜面穿过，并离开膜(渗透流)，而剩余部分(滞留流)穿过膜内并可再循环回输入，变得浓缩，可以最终被送至储存或用于进一步处理。切向流过滤器合适地由一系列中空纤维膜组成(尽管也可以使用单一纤维)，将溶液进料到所述中空纤维膜中。滞留流在中空纤维内穿过，将EV保留在纤维膜内的溶液内，而过量体积穿过纤维膜并进入到渗透流中。这减小总样品的体积，导致EV样品的浓缩(每体积的EV的数量增加)。用于切向流过滤器的示例性材料包含聚合物，包括但不限于聚(醚砜)、聚(丙烯腈)和聚(偏二氟乙烯)、纤维素酯和聚(砜)。示例性切向流过滤器包含可从SPECTRUM或/>获得的过滤器，包含和/>过滤器和其变型。在实施例中，切向流过滤器的材料是改性聚(醚砜)(MPES)过滤器，其分子量截止值介于约100kD(100千道尔顿)至约750kD之间，更合适地分子量截止值为约100kD至约500kD，分子量截止值为约200kD至约400kD，或分子量截止值为100kD、200kD、300kD、400kD或500kD。
处理方法进一步包括确定细胞外囊泡的浓度。本领域已知多种方法用于确定细胞外囊泡的浓度，并且包含例如动态光散射、用于纳米颗粒分析的流式细胞术(纳米级流式细胞术)(例如NanoFCM(英国诺丁汉(Nottingham,UK)))和纳米颗粒追踪分析(Nanosight仪器、Malvern仪器；ViewSizer、Horiba)等。
如本文所描述的，在继续处理方法之前，细胞外囊泡的浓度合适地被确定为至少约0.5×1010个细胞外囊泡/mL。更合适地，在继续处理方法之前，细胞外囊泡的浓度被确定为至少1×1010，更合适地为至少0.8×1010、至少0.9×1010、至少1.1×1010、至少1.2×1010、至少1.3×1010、至少1.4×1010或至少1.5×1010个细胞外囊泡/mL。如本文所描述的，已经确定的是，通过实现约至少1×1010的EV的浓度，可以可再现地进行过程的标记、清洁/分离/洗涤元素的剩余部分以及EV的最终分析，并减少总体浪费。
如本文所描述的，所述方法进一步包括使细胞外囊泡与荧光染色染料或细胞外囊泡表面标志物的抗体接触。然后温育将所接触的EV以产生经标记的细胞外囊泡群体。在合适的实施例中，EV与荧光染色染料接触，所述荧光染色染料渗透EV的膜并对一个或多个EV内分子进行染色。例如，荧光染色染料可以是羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；5(6)-CFDA-SE)(CFSE)，通过其琥珀酰亚胺基基团与EV内分子，特别是与细胞内赖氨酸残基和其它胺源偶联的染料。可以用于标记EV的包含荧光染色染料的另外的染料包含例如ExoBriteTMEV膜染色剂(加利福尼亚州弗里蒙特的Biotium公司(Biotium,Fremont,CA))、ExoGlowTMEV染色剂(加利福尼亚州帕洛阿尔托的系统生物科学公司(SystemBiosciences,Palo Alto,CA))以及如PKH67(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))等膜染料。也可以利用对RNA进行染色的染料。例如，如SYTOTMRNASelectTM和Quant-iTTMRiboGreenTM等RNA染色染料。另外的染料在本领域中也是已知的，并且也可以用于所描述的方法中。
合适地，细胞外囊泡与荧光染色染料接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少1小时。例如，EV可以在约35℃-40℃或约37℃的温度下与荧光染色染料接触约30分钟至约2小时、或约30分钟至约1.5小时、或约45分钟至约1.5小时、或约1小时至约1.5小时或约1.5小时。
在用抗体标记EV的方法中，可以针对特定细胞外囊泡表面标志物选择一种或多种抗体。即，预期在EV的表面上，或期望在含有想要的货物(例如，蛋白质等)的EV的表面上的表面标志物。在示例性实施例中，抗体是抗四跨膜蛋白抗体，即与EV的表面上的四跨膜蛋白糖蛋白结合的抗体。四跨膜蛋白是小膜蛋白(200-350个氨基酸)，其与多个配偶体蛋白横向相互作用并互相相互作用以形成所谓的TEM(富含四跨膜蛋白的微结构域)。示例性抗体包含但不限于抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体和抗IgG1抗体。另外的抗体可以包含抗CD151抗体、抗CD82抗体、抗CD53抗体、抗CD37抗体等。合适地，EV用此类抗体的组合，如抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体和抗IgG1抗体的组合进行标记。例如，可以使用(CD9+CD63；CD9+CD81；CD81+CD63)和三联(CD9+CD81+CD63)组合。
合适地，细胞外囊泡与抗体接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少30分钟。例如，EV可以在约35℃-40℃或约37℃的温度下与抗体接触约30分钟至约2小时、或约30分钟至约1.5小时、或约45分钟至约1.5小时、或约1小时至约1.5小时或约1小时。
在标记之后，使细胞外囊泡(包含经标记的和未经标记的EV)穿过离心过滤器，所述离心过滤器包括分子量截止值为200-750kD的聚醚砜过滤介质，以从过量荧光染色染料或过量抗体中分离经标记的细胞外囊泡群体。然后回收经标记的细胞外囊泡群体。
如本文所描述的，令人惊讶地发现，通过使经标记的细胞外囊泡群体穿过分子量截止值为约200-750kD的聚醚砜过滤器，经标记的EV以非常高的数量被回收，而EV没有显著损失，并且EV没有显著稀释。在合适的实施例中，所接触的细胞外囊泡(用染料或抗体标记)在至少10,000xg的离心力下穿过离心过滤器持续至少10分钟。合适地，聚醚砜过滤器的分子量截止值为约200-500kD、约200-400kD或200kD、300kD、400kD或500kD。分子量截止值为300kD的示例性过滤器是来自公司(纽约州华盛顿港(Port Washington,NY))的具有OMEGATM300K聚醚砜膜的/>离心过滤器。
如本文所描述的，令人惊讶地发现，在使细胞外囊泡与荧光染料或抗体接触以标记EV之前，不必纯化所述细胞外囊泡。传统上，在标记之前，EV必须从细胞生长培养基溶液中纯化。然而，如本文所描述的，已经确定的是，简单地浓缩EV(例如，通过离心或切向流过滤或其组合)，而不进行纯化，会产生可以标记的EV样品，然后进行纯化、回收和分析，从而产生高浓度EV进行分析，并提供EV特性的可再现分析结果。如本文所使用的，术语“纯化细胞外囊泡”是指使用尺寸排阻色谱法柱或其它过滤介质，将条件培养基中存在的细胞组分、碎片等与EV分离，从而产生经纯化的EV。如本文所描述的，此类步骤和柱被明确排除在本文所描述的处理和分析方法之外，因为本方法不要求并且在实施例中明确排除使用经纯化的EV。
如本领域已知的，各种细胞可以用于产生细胞外囊泡。在示例性实施例中，EV由人胚胎肾(HEK-293)细胞(包含HEK-293细胞)、人高加索结肠腺癌HT-29细胞或间充质干细胞(MSC)产生。可以用于制备EV的另外的细胞包含但不限于胚胎干细胞源性心血管祖细胞、内皮祖细胞、未成熟树突细胞(DC)等。在另外的实施例中，EV可以由各种疾病细胞系产生，包含各种癌细胞系。在此类实施例中，本文所描述的方法可用于分析如癌细胞等各种细胞类型分泌的EV中存在的疾病特性。
在示例性实施例中，含有EV的生物流体是条件培养基。如本文所使用的“条件培养基(conditioned medium/conditioned media)”是指已经用一种或多种生长因子进行条件培养的细胞生长培养基，组分已经由细胞分泌到所述细胞生长培养基中，并且所述细胞生长培养基可以包含细胞碎片(例如，脂质、蛋白质和蛋白质聚集体、核酸等)，但不包含整个完整的细胞。在示例性实施例中，条件培养基包括HEK-293、HT-29或MSC细胞生长培养基，但合适地不含血清。
合适地，在用于本文所描述的加工方法之前，细胞和其产物EV在生物反应器中产生。细胞可以在任何合适的生物反应器(在本文中也被称为反应器)中制备，包含但不限于搅拌罐、气升、纤维、微纤维、中空纤维、陶瓷基质、流化床、固定床和/或喷动床生物反应器。如本文所使用的，“生物反应器”可以包含发酵罐或发酵单元或任何其它反应容器，并且术语“生物反应器”和“反应器”与“发酵罐”可互换地使用。术语发酵罐或发酵是指微生物培养物和哺乳动物培养物两者。例如，在一些方面，示例生物反应器单元可以执行以下中的一项或多项或全部：营养物质和/或碳源的进料、合适的气体(例如，氧气)的注射、发酵或细胞培养基的入口和出口流动、气相和液相的分离、温度的维持、氧气和CO2水平的维持、pH水平的维持、搅动(例如，搅拌)和/或清洁/灭菌。示例反应器单元，如发酵单元在单元内可以含有多个反应器，例如所述单元在每个单元中可以具有1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个或更多个生物反应器和/或设施可以含有多个单元，所述多个单元在所述设施内具有单个或多个反应器。在各个实施例中，生物反应器可以适于分批、半进料分批、进料分批、灌注和/或连续发酵处理。可以使用任何合适的反应器直径。在各实施例中，生物反应器的体积可以介于约100mL与约50,000L之间。非限制性实例的体积为100mL、250mL、500mL、750mL、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15升、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升、100升、150升、200升、250升、300升、350升、400升、450升、500升、550升、600升、650升、700升、750升、800升、850升、900升、950升、1000升、1500升、2000升、2500升、3000升、3500升、4000升、4500升、5000升、6000升、7000升、8000升、9000升、10,000升、15,000升、20,000升和/或50,000升。另外地，合适的反应器可以是多次使用的、单次使用的、一次性的或非一次性的，并且可以由任何合适的材料形成，包含金属合金，如不锈钢(例如，316L或任何其它合适的不锈钢)和Inconel、塑料和/或玻璃。
在另外的实施例中，本文提供了一种用于分析细胞外囊泡的方法。在示例性实施例中，此类方法包括：用切向流过滤器浓缩条件培养基中的细胞外囊泡；确定所述细胞外囊泡的浓度；使所述细胞外囊泡与荧光染色染料或细胞外囊泡表面标志物的抗体接触；温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；使所述所接触的细胞外囊泡穿过离心过滤器，所述离心过滤器包括分子量截止值为300kD的聚醚砜过滤介质，以从过量荧光染色染料或过量抗体中分离所述经标记的细胞外囊泡群体；回收所述经标记的细胞外囊泡群体；以及使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪分析所回收的、经标记的细胞外囊泡群体。如本文所描述的，在与染料或抗体接触之前，细胞外囊泡合适地未通过尺寸排阻色谱法纯化。
本文所描述的分析方法允许确定标记效率、细胞外囊泡数量、细胞外囊泡浓度和细胞外囊泡大小中的一项或多项。除了使用流式细胞仪之外，还可以使用其它分析技术，包含例如各种荧光显微技术、液相色谱法技术、质谱法、NMR光谱、微流体电阻脉冲传感(MRPS)等。本文所描述的分析方法可以合适地用作制造过程的一部分，用于在产生期间对EV进行质量控制检查。此类方法允许快速且容易地确定所述方法是否正在产生期望的EV，使得由于不期望的EV或EV特性，另外的制造可以继续，或根据需要修改，或停止。
如本文所描述的，在示例性实施例中，细胞外囊泡与荧光染色染料6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)接触，并在约30℃-40℃的温度下合适地温育至少1小时。
在EV与抗体接触的实施例中，合适地利用抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体和/或抗IgG1抗体中的一种或多种。合适地，细胞外囊泡与抗体接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少30分钟。
各种细胞群体可以用于制备EV。如本文所描述的，EV合适地由人胚胎肾(HEK-293)细胞、人高加索结肠腺癌HT-29细胞或间充质干细胞(MSC)产生。在此类实施例中，条件培养基分别包括HEK-293、HT-29或MSC细胞生长培养基。
合适地，在用荧光染料或抗体标记之前，使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪确定条件培养基中的细胞外囊泡的浓度，并且合适地为至少1×1010个细胞外囊泡/mL。在示例性实施例中，在确定EV的浓度之前，细胞外囊泡是使用分子量截止值为300kD的切向流过滤器来浓缩的。
如本文所描述的，令人惊讶地发现，所接触的细胞外囊泡可以在至少10,000xg的离心力下穿过离心过滤器(包括分子量截止值为300kD的聚醚砜过滤介质)至少10分钟，以分离EV，同时仍维持高浓度EV进行分析，并且在过滤过程期间不会损失显著量的EV。
在仍另外的实施例中，本文提供了一种用于处理细胞外囊泡的方法，所述方法包括：浓缩生物流体中的细胞外囊泡；确定所述细胞外囊泡的浓度为至少5×1010个细胞外囊泡/mL；使所述细胞外囊泡与细胞外囊泡表面标志物的抗体接触；温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；将所述经标记的细胞外囊泡群体稀释至少1:300倍；以及回收所述经标记的细胞外囊泡群体。如本文所描述的，在接触之前，细胞外囊泡未被纯化。
在此类实施例中，已经确定通过建立至少5×1010的细胞外囊泡的浓度，并且然后将EV稀释至少1:300倍，在用抗体标记EV之后不需要过滤来回收经标记的EV进行分析。
如本文所描述的，此类方法包含浓缩生物流体中的细胞外囊泡。本文描述了浓缩EV的方法，并且包含例如离心EV以及使EV穿过一个或多个切向流过滤器以浓缩EV。合适地，EV穿过切向流过滤器，所述切向流过滤器是分子量截止值介于约100kD(100千道尔顿)至约400kD之间，更合适地分子量截止值为约300kD的改性聚(醚砜)(MPES)过滤器。
本文描述了用于确定细胞外囊泡的浓度的方法，并且在合适的实施例中，EV浓度是使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪来确定的。EV浓度合适地为至少约1×1010个EV/mL，更合适地为至少约2×1010个EV/mL、至少约3×1010个EV/mL、至少约4×1010个EV/mL、至少约5×1010个EV/mL、至少约6×1010个EV/mL、至少约7×1010个EV/mL、至少约8×1010个EV/mL、至少约9×1010个EV/mL或至少约10×1010个EV/mL。
一旦实现至少约5×1010个EV/mL的EV浓度，EV可以与EV细胞表面标志物的抗体接触。如整个说明书中所描述的，抗体合适地是抗四跨膜蛋白抗体，并且示例性抗体包含但不限于抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体和抗IgG1抗体。
抗体接触的EV的数量合适地介于约1×107至1×1010个EV之间，更合适地介于约1×108至1×109个EV之间，或者在其它实施例中，约1×108、约2×108、约3×108、约4×108、约5×108、约6×108、约7×108、约8×108、约9×108或约1×109个EV与抗体接触。用于使抗体与EV接触的条件是本领域已知的，并且合适的包含将抗体和EV在约30℃-40℃的温度下温育至少30分钟，并且合适地在约35℃-42℃或约37℃的温度下温育至少40分钟、至少50分钟、至少1小时、至少1.5小时或至少2小时。在实施例中，温育在搅拌式温育器中进行，例如转速为约1,200-1,500rpm或约1,400rpm。
在用抗体温育以标记EV之后，在EV的回收和潜在分析之前，使用如磷酸盐缓冲盐水(PBS)等合适的缓冲液将EV合适地稀释到至少约1:200(vol:vol)，如本文所描述的。在另外的实施例中，在进一步分析EV之前，将EV稀释到至少约1:250；1:300；1:350；1:400；1:450；1:500；1:550；1:600；1:650；1:700；1:750；1:800；1:850；1:900；1:950；或稀释到至少约1:1000(vol:vol)。
如整个说明书中所描述的，各种细胞类型可以用于产生EV，并且在合适的实施例中，细胞外囊泡由人胚胎肾(HEK-293)细胞、人高加索结肠腺癌HT-29细胞或间充质干细胞(MSC)产生。在此类实施例中，生物流体合适地是包括HEK-293或MSC细胞生长培养基的条件培养基。
在仍另外的实施例中，本文提供了一种用于分析细胞外囊泡的方法，所述方法包括：用切向流过滤器浓缩条件培养基中的细胞外囊泡；确定所述细胞外囊泡的浓度为至少5×1010个细胞外囊泡/mL；使所述细胞外囊泡与细胞外囊泡表面标志物的抗体接触；温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；将所述经标记的细胞外囊泡群体稀释至少1:300倍；回收所述经标记的细胞外囊泡群体；以及使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪分析所回收的、经标记的细胞外囊泡群体，其中在所述接触之前，所述细胞外囊泡未通过尺寸排阻色谱法纯化。
整个说明书中描述了用于标记EV的示例性抗体，包含抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体和/或抗IgG1抗体。合适地，细胞外囊泡与1×108至1×109个抗体颗粒接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少30分钟。
在实施例中，细胞外囊泡由人胚胎肾(HEK-293)细胞、人高加索结肠腺癌HT-29细胞或间充质干细胞(MSC)产生，并且条件培养基合适地包括HEK-293或MSC细胞生长培养基，并且细胞外囊泡是使用分子量截止值为300kD的切向流过滤器来浓缩的。本文描述了用于确定细胞外囊泡的浓度的方法，所述方法包含使用流式细胞仪进行纳米颗粒分析。
本文描述了分析所回收的EV的各种方法，所述方法包含确定标记效率、细胞外囊泡数量、细胞外囊泡浓度和细胞外囊泡大小中的一项或多项的分析。
在仍另外的实施例中，本文提供了一种用于处理细胞外囊泡的方法，所述方法包括：浓缩生物流体中的细胞外囊泡；确定所述细胞外囊泡的浓度为至少5×1010个细胞外囊泡/mL；使所述细胞外囊泡与RNA特异性染料接触；温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；将所述经标记的细胞外囊泡群体稀释至少1:300倍；以及回收所述经标记的细胞外囊泡群体，其中在c中的所述接触之前，所述细胞外囊泡未被纯化。
在实施例中，细胞外囊泡与绿色荧光RNA染色剂或红色荧光RNA染色剂接触。合适的RNA染色剂包含例如SYTOTMRNASelectTM和Quant-iTTMRiboGreenTM(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔公司(ThermoFisher,Waltham,MA))。在示例性实施例中，细胞外囊泡与RNA特异性染料接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少20分钟。
如本文所描述的，合适地细胞外囊泡由人胚胎肾(HEK-293)细胞、人高加索结肠腺癌HT-29细胞或间充质干细胞(MSC)产生。在实施例中，细胞外囊泡的浓度是使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪来确定的。如本文所描述的，合适地生物流体是包括HEK-293、HT-29或MSC细胞生长培养基的条件培养基，并且浓缩包括使生物流体穿过切向流过滤器。
在另外的实施例中，本文提供了一种用于分析细胞外囊泡的方法，所述方法包括：用切向流过滤器浓缩条件培养基中的细胞外囊泡；确定所述细胞外囊泡的浓度为至少5×1010个细胞外囊泡/mL；使所述细胞外囊泡与绿色荧光RNA染色剂或红色荧光RNA染色剂接触；温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；将所述经标记的细胞外囊泡群体稀释至少1:300倍；回收所述经标记的细胞外囊泡群体；以及使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪分析所回收的、经标记的细胞外囊泡群体，其中在c中的所述接触之前，所述细胞外囊泡未通过尺寸排阻色谱法纯化。
合适地，细胞外囊泡与绿色荧光RNA染色剂或红色荧光RNA染色剂(本文所描述的示例性染色剂)接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少20分钟。合适地，细胞外囊泡由人胚胎肾(HEK-293)细胞、人高加索结肠腺癌HT-29细胞或间充质干细胞(MSC)产生。在实施例中，细胞外囊泡的浓度是使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪来确定的。合适地，条件培养基包括HEK-293、HT-29或MSC细胞生长培养基，并且细胞外囊泡是在b中使用分子量截止值为300kD的切向流过滤器来浓缩的。
如本文所描述的，例如，作为制造过程的质量控制步骤的一部分，合适地对所回收的、经标记的细胞外囊泡群体进行分析以确定标记效率、细胞外囊泡数量、细胞外囊泡浓度和细胞外囊泡大小中的一项或多项。
实例
实例1：荧光和抗体标记以及处理细胞外囊泡，用于使用NanoSep过滤进行分析
材料和方法
对于CFSE染色：
对于抗体标记
该程序描述了用CFSE对颗粒进行定量和染色，或用抗四跨膜蛋白抗体进行标记，然后通过过滤，用于通过来自NanoFCM的纳米检测仪纳米检测仪进行进一步的下游分析。
用MicroKros 300K切向流过滤器浓缩含有由MSC和HEK-293细胞产生的细胞外囊泡的条件培养基，以便达到大于5×1010(合适地为1×1011个颗粒/mL)。EV的浓度是使用来自NanoFCM的纳米检测仪来确定的。
为了进行比较，还使用尺寸排阻色谱法，按照制造商的说明，通过使用Izon公司(Izon)(Izon SEC qEV10 35nm，目录n°qEV10/35nm)柱，从MSC和HEK-293细胞中纯化EV。
荧光染色程序
参数# #
CFSE：最终稀释# 10μM#
最佳颗粒/反应：# 5E+08-2E+09总颗粒#
颗粒体积# 475μl#
CFSE体积200μM# 25μl#
样品的颗粒浓度# >1E+9个颗粒/ml#
反应体积# 500μl#
反应时间：# 1小时30分钟#
反应温度# 37℃，在黑暗中以1400rpm摇动#
使用的稀释剂# PBS#
额外染料去除# SEC/NanoSep#
475μl的样品*+CFSE200μM(至多10μl)
涡旋染色反应，并在黑暗中在摇动条件下在37℃的热混合器中温育1小时。
在温育之后，按照制造商的说明，通过包括分子量截止值为300kD的聚醚砜过滤介质(300k)的离心过滤器过滤将过量的CFSE去除，并使用纳米检测仪(NanoFCM)测量合并的级分。为了进行比较，第二样品通过尺寸排阻柱过滤。如结果所示，还检查了另外的分离过滤器，以确定最佳过滤介质。
抗体标记程序
用纳米检测仪测量样品，以检查颗粒浓度>4E+9。在染色之前的示例性稀释。
来自MSC的EV：1至300
来自HEK-293的EV：1至500
如下制备反应管：
单一染色抗体：9μl的样品+1μl的抗体*
未经染色的对照：9μl的样品+1μl的PBS1X
抗体混合物：1μl的每种抗体*+7-9μl的样品(至多10μl)
*需要时制备中间稀释液，即同种型抗体
涡旋染色反应，并在黑暗中在摇动下在37℃的热混合器中温育1小时。
在温育时间结束时，将样品稀释至少1:300(或在需要时应用更高稀释度)并用纳米检测仪进行测量。
结果和讨论
图1A-1H示出了使用尺寸排阻色谱法(图1A-1D)和NanoSep过滤(图1E-1H)去除染料的结果。如上所述，两种方法均提供了相当的染色效率和过量荧光染料的去除，但与基于SEC的方法相比，基于过滤的方法显著减少了分离时间，并提供了EV浓度的总体增加。
图2示出了比较不同分子量截止值(300K、100K和50K)过滤器在从经标记的EV中去除CFSE染料时的结果。图2还比较了使用未经纯化的浓缩EV(浓缩上清液)相对于经纯化的EV(在标记之前通过尺寸排阻色谱法柱过滤)的过滤结果。如分子量截止值为300kD的聚醚砜过滤介质(300k)所示，显示出用于从条件培养基(浓缩上清液)以及经纯化的EV两者中去除过量CFSE的最佳结果。NanoSep100K过滤器高效地从经纯化的EV中去除荧光染料，但不能从条件培养基中去除。
还进行了实验以确认NanoSep 300K过滤器不会改变EV的大小分布。测量SEC纯化的EV的大小(图3A)，然后穿过300K过滤器并再次测量(图3B)。如图所示，EV的中值和平均大小没有显著变化。
图4A示出了与传统SEC方法相比，使用300K过滤器可有效去除EV中的过量抗体。如上所述，对于所有三种抗体，使用两种过滤方法的EV标记％相当，表明NanoSep300K过滤是去除过量抗体的有效方法，同时仍维持高浓度的EV。图4B-4C示出了用抗四跨膜蛋白抗体(CD9、CD63和CD81)对EV进行染色，有效地从HEK-293细胞(图4B)和MSC(图4C)细胞培养物的条件培养基和处理中的样品中去除过量经标记的抗体。具体地，所述方法适用于原始条件培养基(CM)和来自EV纯化过程的每个步骤的样品，包含DNA酶后处理(DNased)、后澄清(CLAR)、用0.2μm截止过滤器进行生物负荷后过滤(BB0.2)、前切向流过滤1(TFF1-输入)、体积后减小(TFF1-体积减小)、高盐后洗涤(TFF1-高盐)、渗滤后洗涤(TFF1-DFC)、用0.45μm截止渗滤洗涤液进行后过滤(TFF1-DFC F45)、预阴离子交换色谱法(CHR输入)、阴离子交换色谱法流通(CHR-FT)、阴离子交换色谱法洗涤液(CHR-W)、阴离子互换色谱洗级分(CHR-FX和峰)、阴离子交换色谱洗高盐洗涤(CHR-高盐)、预切向流过滤2(TFF2-输入)，脱盐后洗涤(TFF2-脱盐)和用0.2μm截止过滤器的最终无菌后过滤。图5A-5F示出了当使用粒径分布作为手段来确定有效且无偏抗体结合时的类似结果。
实例2：抗体标记和处理细胞外囊泡，用于无需过滤的分析
使用切向流过滤(300kD切向流过滤器)浓缩来自包括EV的MSC和HEK-293细胞的条件培养基。在开始抗体标记过程之前，使用NanoFCM确定纳米颗粒浓度大于5×1010个EV/mL。
抗CD9、抗CD63和抗CD81抗体以约2×108至1×109个抗体颗粒添加，并且在以约1400rpm搅拌的情况下在37℃下温育1小时。
用适当的缓冲液将样品稀释至大于1:300，并且然后用NanoFCM分析抗体标记。图6A-6B表示出了当测量抗体标记时，使用大于1:300的稀释因子仍允许可接受的荧光阈值。
在分析之前没有使用过滤，由此消除了在过滤期间从其中去除EV的任何顾虑。
图7A示出了本文所描述的抗体染色和分析的稀释方法与传统SEC过滤方法的比较。如所指示的，在分析之前以1:1000稀释引起的标记效率与通过SEC过滤实现的标记效率相当。
图7B示出了利用来自MSC培养物的浓缩(150x)条件培养基进行本文所描述的抗体染色和分析的稀释方法的结果。在分析之前的稀释度1:1000引起高效的标记，其中染色％、中值和平均大小(nm)具有可接受的阈值(<200)和事件数(>2000)。图7C示出了来自HEK-293细胞培养物的浓缩(30x)条件培养基的结果。在分析之前的稀释度1:1000引起高效的标记，其中染色％、中值和平均大小(nm)具有可接受的阈值(<200)和事件数(>2000)。
实例3：RNA染色和处理细胞外囊泡，用于无需过滤的分析
使用切向流过滤(300kD切向流过滤器)浓缩来自包括EV的MSC和HEK-293细胞的条件培养基。在开始RNA染色过程之前，使用纳米检测仪(NanoFCM)确定纳米颗粒浓度大于5×1010个EV/mL。
SYTOTMRNASelectTM(Syto；赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))和Quant-iTTM (RiboGreen；赛默飞世尔科技公司)分别以25μM添加并以1:50稀释。对于Syto和RiboGreen，样品分别在摇动下在37℃下避光温育20分钟和30分钟。用适当的缓冲液将样品稀释至大于1:300，并且然后用NanoFCM分析抗体标记。使第二样品穿过NanoSep300K过滤器，以比较染料的过滤与稀释。
图8A示出了RiboGreen和Syto两者高效地标记外泌体参考样品(ExoRef)。对于所有的图(8A-8C)，QuantT-iT miRNA显示为RNA标记的对照。
图8B示出了RiboGreen和Syto两者高效地标记从HEK-293细胞制备的EV，并且当与Nanosep过滤相比时，使用稀释导致大致相同的经确定的标记效率。
图8C示出了RiboGreen和Syto两者高效地标记从MSC细胞制备的EV，并且当与Nanosep过滤相比时，使用稀释导致大致相同的经确定的标记效率。
这些结果表明，稀释可以高效地用于表征用RNA染色剂标记的EV，并且在分析之前不需要过滤来分离未结合的荧光RNA染色剂。这是令人惊讶和不期望的结果，并提供了快速且简单的方法来制备EV进行分析，如整个说明书中所描述的。
基于本文所提供的实验数据，对于条件培养基中的EV，可以期望类似的结果，其中EV未被纯化。这些方法包含使用切向流过滤(300kD切向流过滤器)过滤过量RNA染料，以及使用稀释方法去除过量染料。当在条件培养基中转化为EV时，这两种方法期望产生与经纯化的EV上提供的结果类似的结果。
示例性实施例
实施例1是一种用于处理细胞外囊泡的方法，所述方法包括：浓缩生物流体中的细胞外囊泡；确定所述细胞外囊泡的浓度；使所述细胞外囊泡与荧光染色染料或细胞外囊泡表面标志物的抗体接触；温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；使所述所接触的细胞外囊泡穿过离心过滤器，所述离心过滤器包括分子量截止值为200-750kD的聚醚砜过滤介质，以从过量荧光染色染料或过量抗体中分离所述经标记的细胞外囊泡群体；以及回收所述经标记的细胞外囊泡群体，其中在所述接触之前，所述细胞外囊泡未被纯化。
实施例2包含根据实施例1所述的方法，其中所述浓缩包括使所述生物流体穿过切向流过滤器。
实施例3包含根据实施例2所述的方法，其中所述切向流过滤器的分子量截止值为约100kD至约500kD。
实施例4包含根据实施例1所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述荧光染色染料6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)接触。
实施例5包含根据实施例1所述的方法，其中所述细胞外囊泡与抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体和/或抗IgG1抗体接触。
实施例6包含根据实施例1至4中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述荧光染色染料接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少1小时。
实施例7包含根据实施例1至3或实施例5所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述抗体接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少30分钟。
实施例8包含根据实施例1至7中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡由人胚胎肾(HEK-293)细胞、人高加索结肠腺癌HT-29细胞或间充质干细胞(MSC)产生。
实施例9包含根据实施例1至8中任一项所述的方法，其中所述生物流体中的所述细胞外囊泡的浓度是使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪来确定的。
实施例10包含根据实施例1至9中任一项所述的方法，其中在所述接触之前，所述细胞外囊泡的浓度被确定为至少1×1010个细胞外囊泡/mL。
实施例11包含根据实施例1至10中任一项所述的方法，其中所述生物流体是包括HEK-293、HT-29或MSC细胞生长培养基的条件培养基。
实施例12包含根据实施例1至11中任一项所述的方法，其中所述所接触的细胞外囊泡在至少10,000xg的离心力下穿过所述离心过滤器持续至少10分钟。
实施例13是一种用于分析细胞外囊泡的方法，所述方法包括：用切向流过滤器浓缩条件培养基中的细胞外囊泡；确定所述细胞外囊泡的浓度；使所述细胞外囊泡与荧光染色染料或细胞外囊泡表面标志物的抗体接触；温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；使所述所接触的细胞外囊泡穿过离心过滤器，所述离心过滤器包括分子量截止值为300kD的聚醚砜过滤介质，以从过量荧光染色染料或过量抗体中分离所述经标记的细胞外囊泡群体；回收所述经标记的细胞外囊泡群体；以及使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪分析所回收的、经标记的细胞外囊泡群体，其中在所述接触之前，所述细胞外囊泡未通过尺寸排阻色谱法纯化。
实施例14包含根据实施例13所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述荧光染色染料6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)接触。
实施例15包含根据实施例13所述的方法，其中所述细胞外囊泡与抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体和/或抗IgG1抗体接触。
实施例16包含根据实施例13或实施例14所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述荧光染色染料接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少1小时。
实施例17包含根据实施例13或实施例15所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述抗体接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少30分钟。
实施例18包含根据实施例13至17中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡由人胚胎肾(HEK-293)细胞、人高加索结肠腺癌HT-29细胞或间充质干细胞(MSC)产生。
实施例19包含根据实施例13至18中任一项所述的方法，其中所述条件培养基中的所述细胞外囊泡的浓度是使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪来确定的。
实施例20包含根据实施例13至19中任一项所述的方法，其中在c中的所述接触之前，所述细胞外囊泡的浓度被确定为至少1×1010个细胞外囊泡/mL。
实施例21包含根据实施例13至20中任一项所述的方法，其中所述条件培养基包括HEK-293、HT-29或MSC细胞生长培养基，并且所述细胞外囊泡是在b中使用分子量截止值为300kD的切向流过滤器来浓缩的。
实施例22包含根据实施例13至21中任一项所述的方法，其中所述所接触的细胞外囊泡在至少10,000xg的离心力下穿过所述离心过滤器持续至少10分钟。
实施例23包含根据实施例13至22中任一项所述的方法，其中分析所回收的、经标记的细胞外囊泡群体以确定标记效率、细胞外囊泡数量、细胞外囊泡浓度和细胞外囊泡大小中的一项或多项。
实施例24是一种用于处理细胞外囊泡的方法，所述方法包括：浓缩生物流体中的细胞外囊泡；确定所述细胞外囊泡的浓度为至少5×1010个细胞外囊泡/mL；使所述细胞外囊泡与细胞外囊泡表面标志物的抗体接触；温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；将所述经标记的细胞外囊泡群体稀释至少1:300倍；以及回收所述经标记的细胞外囊泡群体，其中在所述接触之前，所述细胞外囊泡未被纯化。
实施例25包含根据实施例24所述的方法，其中所述细胞外囊泡与抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体和/或抗IgG1抗体接触。
实施例26包含根据实施例24或实施例25所述的方法，其中1×108-1×109个细胞外囊泡与抗体颗粒接触。
实施例27包含根据实施例24至26中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述抗体接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少30分钟。
实施例28包含根据实施例24至27中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡由人胚胎肾(HEK-293)细胞、人高加索结肠腺癌HT-29细胞或间充质干细胞(MSC)产生。
实施例29包含根据实施例24至28中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡的浓度是使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪来确定的。
实施例30包含根据实施例24至29中任一项所述的方法，其中所述生物流体是包括HEK-293、HT-29或MSC细胞生长培养基的条件培养基，并且所述浓缩包括使所述生物流体穿过切向流过滤器。
实施例31是一种用于分析细胞外囊泡的方法，所述方法包括：用切向流过滤器浓缩条件培养基中的细胞外囊泡；确定所述细胞外囊泡的浓度为至少5×1010个细胞外囊泡/mL；使所述细胞外囊泡与细胞外囊泡表面标志物的抗体接触；温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；将所述经标记的细胞外囊泡群体稀释至少1:300倍；回收所述经标记的细胞外囊泡群体；以及使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪分析所回收的、经标记的细胞外囊泡群体，其中在所述接触之前，所述细胞外囊泡未通过尺寸排阻色谱法纯化。
实施例32包含根据实施例31所述的方法，其中所述细胞外囊泡与抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体和/或抗IgG1抗体接触。
实施例33包含根据实施例31或实施例32所述的方法，其中所述细胞外囊泡与1×108至1×109个抗体颗粒接触。
实施例34包含根据实施例31至33中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述抗体接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少30分钟。
实施例35包含根据实施例31至34中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡由人胚胎肾(HEK-293)细胞、人高加索结肠腺癌HT-29细胞或间充质干细胞(MSC)产生。
实施例36包含根据实施例31至35中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡的浓度是使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪来确定的。
实施例37包含根据实施例31至36中任一项所述的方法，其中所述条件培养基包括HEK-293、HT-29或MSC细胞生长培养基，并且所述细胞外囊泡是在b中使用分子量截止值为300kD的切向流过滤器来浓缩的。
实施例38包含根据实施例31至37中任一项所述的方法，其中分析所回收的、经标记的细胞外囊泡群体以确定标记效率、细胞外囊泡数量、细胞外囊泡浓度和细胞外囊泡大小中的一项或多项。
实施例39是一种用于处理细胞外囊泡的方法，所述方法包括：浓缩生物流体中的细胞外囊泡；确定所述细胞外囊泡的浓度为至少5×1010个细胞外囊泡/mL；使所述细胞外囊泡与RNA特异性染料接触；温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；将所述经标记的细胞外囊泡群体稀释至少1:300倍；以及回收所述经标记的细胞外囊泡群体，其中在所述接触之前，所述细胞外囊泡未被纯化。
实施例40包含根据实施例39所述的方法，其中所述细胞外囊泡与绿色荧光RNA染色剂或红色荧光RNA染色剂接触。
实施例41包含根据实施例39至40中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述RNA特异性染料接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少20分钟。
实施例42包含根据实施例39至41中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡由人胚胎肾(HEK-293)细胞、人高加索结肠腺癌HT-29细胞或间充质干细胞(MSC)产生。
实施例43包含根据实施例39至42中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡的浓度是使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪来确定的。
实施例44包含根据实施例39至43中任一项所述的方法，其中所述生物流体是包括HEK-293、HT-29或MSC细胞生长培养基的条件培养基，并且所述浓缩包括使所述生物流体穿过切向流过滤器。
实施例45是一种用于分析细胞外囊泡的方法，所述方法包括：用切向流过滤器浓缩条件培养基中的细胞外囊泡；确定所述细胞外囊泡的浓度为至少5×1010个细胞外囊泡/mL；使所述细胞外囊泡与绿色荧光RNA染色剂或红色荧光RNA染色剂接触；温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；将所述经标记的细胞外囊泡群体稀释至少1:300倍；回收所述经标记的细胞外囊泡群体；以及使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪分析所回收的、经标记的细胞外囊泡群体，其中在所述接触之前，所述细胞外囊泡未通过尺寸排阻色谱法纯化。
实施例46包含根据实施例45所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述绿色荧光RNA染色剂或所述红色荧光RNA染色剂接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少20分钟。
实施例47包含根据实施例45至46中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡由人胚胎肾(HEK-293)细胞、人高加索结肠腺癌HT-29细胞或间充质干细胞(MSC)产生。
实施例48包含根据实施例45至47中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡的浓度是使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪来确定的。
实施例49包含根据实施例45至48中任一项所述的方法，其中所述条件培养基包括HEK-293、HT-29或MSC细胞生长培养基，并且所述细胞外囊泡是在b中使用分子量截止值为300kD的切向流过滤器来浓缩的。
实施例50包含根据实施例45至49中任一项所述的方法，其中分析所回收的、经标记的细胞外囊泡群体以确定标记效率、细胞外囊泡数量、细胞外囊泡浓度和细胞外囊泡大小中的一项或多项。
应当理解的是，虽然本文中已经展示和描述了某些实施例，但是权利要求不限于所描述和所示出的部分的特定形式或布置。在本说明书中已经公开了说明性实施例，并且尽管采用了具体术语，但其仅用于一般性和描述性意义并且不是出于限制的目的。鉴于以上教导，对所述实施例的修改和变化都是可能的。因此，应当理解的是，可以以与具体描述的方式不同的方式实践所述实施例。
本说明书中所提及的所有公开、专利以及专利申请通过引用并入本文中，其程度如同每个单独的公开、专利或专利申请被专门地且单独地指示通过引用并入。

Claims (50)

1.一种用于处理细胞外囊泡的方法，所述方法包括：
a.浓缩生物流体中的细胞外囊泡；
b.确定所述细胞外囊泡的浓度；
c.使所述细胞外囊泡与荧光染色染料或细胞外囊泡表面标志物的抗体接触；
d.温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；
e.使所述所接触的细胞外囊泡穿过离心过滤器，所述离心过滤器包括分子量截止值为200-750kD的聚醚砜过滤介质，以从过量荧光染色染料或过量抗体中分离所述经标记的细胞外囊泡群体；以及
f.回收所述经标记的细胞外囊泡群体，
其中在c中的所述接触之前，所述细胞外囊泡未被纯化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述浓缩包括使所述生物流体穿过切向流过滤器。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述切向流过滤器的分子量截止值为约100kD至约500kD。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述荧光染色染料6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)接触。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞外囊泡与抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体和/或抗IgG1抗体接触。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述荧光染色染料接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少1小时。
7.根据权利要求1至3或权利要求5所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述抗体接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少30分钟。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡由人胚胎肾(HEK-293)细胞、人高加索结肠腺癌HT-29细胞或间充质干细胞(MSC)产生。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述生物流体中的所述细胞外囊泡的浓度是使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪来确定的。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在c中的所述接触之前，所述细胞外囊泡的浓度被确定为至少1×1010个细胞外囊泡/mL。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述生物流体是包括HEK-293、HT-29或MSC细胞生长培养基的条件培养基。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述所接触的细胞外囊泡在至少10,000xg的离心力下穿过所述离心过滤器持续至少10分钟。
13.一种用于分析细胞外囊泡的方法，所述方法包括：
a.用切向流过滤器浓缩条件培养基中的细胞外囊泡；
b.确定所述细胞外囊泡的浓度；
c.使所述细胞外囊泡与荧光染色染料或细胞外囊泡表面标志物的抗体接触；
d.温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；
e.使所述所接触的细胞外囊泡穿过离心过滤器，所述离心过滤器包括分子量截止值为300kD的聚醚砜过滤介质，以从过量荧光染色染料或过量抗体中分离所述经标记的细胞外囊泡群体；
f.回收所述经标记的细胞外囊泡群体；以及
g.使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪分析所回收的、经标记的细胞外囊泡群体，
其中在c中的所述接触之前，所述细胞外囊泡未通过尺寸排阻色谱法纯化。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述荧光染色染料6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)接触。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞外囊泡与抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体和/或抗IgG1抗体接触。
16.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述荧光染色染料接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少1小时。
17.根据权利要求13或权利要求15所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述抗体接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少30分钟。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡由人胚胎肾(HEK-293)细胞、人高加索结肠腺癌HT-29细胞或间充质干细胞(MSC)产生。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述条件培养基中的所述细胞外囊泡的浓度是使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪来确定的。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的方法，其中在c中的所述接触之前，所述细胞外囊泡的浓度被确定为至少1×1010个细胞外囊泡/mL。
21.根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中所述条件培养基包括HEK-293、HT-29或MSC细胞生长培养基，并且所述细胞外囊泡是在b中使用分子量截止值为300kD的切向流过滤器来浓缩的。
22.根据权利要求13至21中任一项所述的方法，其中所述所接触的细胞外囊泡在至少10,000xg的离心力下穿过所述离心过滤器持续至少10分钟。
23.根据权利要求13至22中任一项所述的方法，其中分析所回收的、经标记的细胞外囊泡群体以确定标记效率、细胞外囊泡数量、细胞外囊泡浓度和细胞外囊泡大小中的一项或多项。
24.一种用于处理细胞外囊泡的方法，所述方法包括：
a.浓缩生物流体中的细胞外囊泡；
b.确定所述细胞外囊泡的浓度为至少5×1010个细胞外囊泡/mL；
c.使所述细胞外囊泡与细胞外囊泡表面标志物的抗体接触；
d.温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；
e.将所述经标记的细胞外囊泡群体稀释至少1:300倍；以及
f.回收所述经标记的细胞外囊泡群体，
其中在c中的所述接触之前，所述细胞外囊泡未被纯化。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述细胞外囊泡与抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体和/或抗IgG1抗体接触。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述细胞外囊泡与1×108至1×109个抗体颗粒接触。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述抗体接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少30分钟。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡由人胚胎肾(HEK-293)细胞、人高加索结肠腺癌HT-29细胞或间充质干细胞(MSC)产生。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡的浓度是使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪来确定的。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的方法，其中所述生物流体是包括HEK-293、HT-29或MSC细胞生长培养基的条件培养基，并且所述浓缩包括使所述生物流体穿过切向流过滤器。
31.一种用于分析细胞外囊泡的方法，所述方法包括：
a.用切向流过滤器浓缩条件培养基中的细胞外囊泡；
b.确定所述细胞外囊泡的浓度为至少5×1010个细胞外囊泡/mL；
c.使所述细胞外囊泡与细胞外囊泡表面标志物的抗体接触；
d.温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；
e.将所述经标记的细胞外囊泡群体稀释至少1:300倍；
f.回收所述经标记的细胞外囊泡群体；以及
g.使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪分析所回收的、经标记的细胞外囊泡群体，
其中在c中的所述接触之前，所述细胞外囊泡未通过尺寸排阻色谱法纯化。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞外囊泡与抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体和/或抗IgG1抗体接触。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中所述细胞外囊泡与1×108至1×109个抗体颗粒接触。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述抗体接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少30分钟。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡由人胚胎肾(HEK-293)细胞、人高加索结肠腺癌HT-29细胞或间充质干细胞(MSC)产生。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡的浓度是使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪来确定的。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的方法，其中所述条件培养基包括HEK-293、HT-29或MSC细胞生长培养基，并且所述细胞外囊泡是在b中使用分子量截止值为300kD的切向流过滤器来浓缩的。
38.根据权利要求31至37中任一项所述的方法，其中分析所回收的、经标记的细胞外囊泡群体以确定标记效率、细胞外囊泡数量、细胞外囊泡浓度和细胞外囊泡大小中的一项或多项。
39.一种用于处理细胞外囊泡的方法，所述方法包括：
a.浓缩生物流体中的细胞外囊泡；
b.确定所述细胞外囊泡的浓度为至少5×1010个细胞外囊泡/mL；
c.使所述细胞外囊泡与RNA特异性染料接触；
d.温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；
e.将所述经标记的细胞外囊泡群体稀释至少1:300倍；以及
f.回收所述经标记的细胞外囊泡群体，
其中在c中的所述接触之前，所述细胞外囊泡未被纯化。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述细胞外囊泡与绿色荧光RNA染色剂或红色荧光RNA染色剂接触。
41.根据权利要求39至40中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述RNA特异性染料接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少20分钟。
42.根据权利要求39至41中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡由人胚胎肾(HEK-293)细胞、人高加索结肠腺癌HT-29细胞或间充质干细胞(MSC)产生。
43.根据权利要求39至42中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡的浓度是使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪来确定的。
44.根据权利要求39至43中任一项所述的方法，其中所述生物流体是包括HEK-293、HT-29或MSC细胞生长培养基的条件培养基，并且所述浓缩包括使所述生物流体穿过切向流过滤器。
45.一种用于分析细胞外囊泡的方法，所述方法包括：
a.用切向流过滤器浓缩条件培养基中的细胞外囊泡；
b.确定所述细胞外囊泡的浓度为至少5×1010个细胞外囊泡/mL；
c.使所述细胞外囊泡与绿色荧光RNA染色剂或红色荧光RNA染色剂接触；
d.温育所接触的细胞外囊泡以产生经标记的细胞外囊泡群体；
e.将所述经标记的细胞外囊泡群体稀释至少1:300倍；
f.回收所述经标记的细胞外囊泡群体；以及
g.使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪分析所回收的、经标记的细胞外囊泡群体，
其中在c中的所述接触之前，所述细胞外囊泡未通过尺寸排阻色谱法纯化。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述细胞外囊泡与所述绿色荧光RNA染色剂或所述红色荧光RNA染色剂接触，并在约30℃-40℃的温度下温育至少20分钟。
47.根据权利要求45至46中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡由人胚胎肾(HEK-293)细胞、人高加索结肠腺癌HT-29细胞或间充质干细胞(MSC)产生。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡的浓度是使用用于纳米颗粒分析的流式细胞仪来确定的。
49.根据权利要求45至48中任一项所述的方法，其中所述条件培养基包括HEK-293、HT-29或MSC细胞生长培养基，并且所述细胞外囊泡是在b中使用分子量截止值为300kD的切向流过滤器来浓缩的。
50.根据权利要求45至49中任一项所述的方法，其中分析所回收的、经标记的细胞外囊泡群体以确定标记效率、细胞外囊泡数量、细胞外囊泡浓度和细胞外囊泡大小中的一项或多项。
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