KR20240066125A - 줄기세포 기원 및 발현 마커에 따른 nk 세포 분화 효율 증진 방법 - Google Patents
줄기세포 기원 및 발현 마커에 따른 nk 세포 분화 효율 증진 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 줄기세포 기원 및 발현 마커에 따른 NK 세포 분화 효율 증진 방법에 관한 것으로, 줄기세포의 기원 및/또는 동일한 기원의 세포로부터 리프로그래밍된 줄기세포를 사용하더라도 배양 과정 중 발현하는 특정 마커의 수준에 따라 NK 세포 분화 속도 및 효율이 현저히 상이하게 나타난다는 것이 확인되어, 신속하면서도 다량으로 NK 세포를 수득할 수 있는 방법으로 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 줄기세포 기원 및 발현 마커에 따른 NK 세포 분화 효율 증진 방법에 관한 것이다.
면역체계를 구성하는 세포 중 자연살해세포 (natural killer cell, 이하 "NK 세포")는 바이러스에 감염된 세포 혹은 암세포와 같이 세포막이 비정상적으로 변형된 특징을 인식한다. NK 세포는 활성 세포 독성 T 림프구가 다량 생성되기 전인 바이러스 감염 혹은 종양 형성 초기 단계에서 중요한 역할을 한다. 조직학적으로, NK 세포는 거대과립 림프구이다. 세포내 과립은 이미 형성된 강력한 생물학적 기능을 갖는 분자를 포함하고 있다가 NK 세포가 표적 세포와 접촉했을 때 분비된다. 이들 중 몇몇 분자는 표적 세포의 막에 구멍을 형성하여 세포를 용해시키거나 표적세포에 침입하여 핵 DNA의 분절을 증가시켜 세포 자멸 (Apotosis)또는 세포 예정사 (Programmed cell death)를 야기한다.
NK 세포는 비특이적으로 암을 살상할 수 있는 능력이 있는 세포로 알려져 있다. 이러한 NK 세포의 살해능은 림포카인 활성세포 (lymphokine activated killer cell, LAK) 및 종양침윤림프구 (tumor infiltration lymphocytes, TIL)를 이용하여 고형암 (solid tumor)치료에 이용하거나, 공여자 임파구 주입 (donor lymphocyte infusion)을 통한 면역치료법을 수행함으로써, 골수이식이나 장기 이식 시 발생하는 거부반응을 방지하기 위한 새로운 세포치료 요법으로 응용이 시도되고 있다.
또한, NK 세포의 분화와 활성의 결함은 유방암, 흑색종암, 폐암 등 다양한 암 질환과 관련되어 있음이 보고되어 이러한 질환들을 치료하기 위해 NK 세포 치료법이 대두되고 있다.
NK 세포를 항암 면역세포치료제로 효과적으로 이용하기 위해서는 많은 수의 NK 세포 확보가 필요하다. 그러나 NK 세포는 혈액 내 림프구의 10 내지 15%를 차지하고 있고 암 환자에서는 종종 NK 세포의 수, 분화 및 기능이 저하되어 사실상 충분한 세포수의 확보가 어려운 실정이다. 그러므로 NK 세포치료제로 적용하기 위해서는 NK 세포의 증식이나 분화를 통한 NK 세포의 대량 생산이 요구되고 있다.
본 발명의 하나의 목적은 유도만능줄기세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 유도만능줄기세포는 골수 조혈줄기세포, 섬유아세포, 피부 섬유아세포, 및 제대혈 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 것인, NK 세포 분화 고효율 유도만능줄기세포를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유도만능줄기세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 유도만능줄기세포는 골수 조혈줄기세포, 섬유아세포, 피부 섬유아세포, 및 제대혈 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 것인, 유도만능줄기세포로부터 NK 세포를 고효율로 분화하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유도만능줄기세포의 NK 세포 분화용 조성물, 및 설명서를 포함하는, 유도만능줄기세포로부터 NK 세포를 고효율로 분화하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 유도만능줄기세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 유도만능줄기세포는 골수 조혈줄기세포, 섬유아세포, 피부 섬유아세포, 및 제대혈 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 것인, NK 세포 분화 고효율 유도만능줄기세포를 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포는 골수 조혈줄기세포 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포가 골수 조혈줄기세포 유래인 경우,
상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 조혈전구세포의 CD34 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 조혈전구세포의 CD34 발현 수준이 낮은 경우, 상기 유도만능줄기세포를 NK 세포 분화 고효율 유도만능줄기세포로 선별하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포가 골수 조혈줄기세포 유래인 경우,
상기 유도만능줄기세포로부터 분화중인 NK 세포의 CD56CD45 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화중인 NK 세포의 CD56CD45 발현 수준이 높은 경우, 상기 유도만능줄기세포를 NK 세포 분화 고효율 유도만능줄기세포로 선별하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 유도만능줄기세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 유도만능줄기세포는 골수 조혈줄기세포, 섬유아세포, 피부 섬유아세포, 및 제대혈 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 것인, 유도만능줄기세포로부터 NK 세포를 고효율로 분화하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포가 골수 조혈줄기세포 유래인 경우,
상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 조혈전구세포 중 CD34 발현 수준이 높은 조혈전구세포를 제외하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포가 골수 조혈줄기세포 유래인 경우,
상기 유도만능줄기세포로부터 분화 중인 NK 세포 중 CD56CD45 발현 수준이 낮은 세포를 제외하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 유도만능줄기세포의 NK 세포 분화용 조성물, 및 설명서를 포함하는, 유도만능줄기세포로부터 NK 세포를 고효율로 분화하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 설명서는 상기 방법이 기재될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
줄기세포 기원 및 발현 마커에 따른 NK 세포 분화 효율 증진 방법에 따르면, 줄기세포의 기원 및/또는 동일한 기원의 세포로부터 리프로그래밍된 줄기세포를 사용하더라도 배양 과정 중 발현하는 특정 마커의 수준에 따라 NK 세포 분화 속도 및 효율이 현저히 상이하게 나타난다는 것이 확인되어, 신속하면서도 다량으로 NK 세포를 수득할 수 있는 방법으로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 줄기세포로부터 NK 세포로의 전체 분화 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2a 및 도 2b는 분화 14일 차 6종의 줄기세포의 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2c 및 도 2d는 분화 14일 차 6종의 줄기세포의 FACS 분석 결과를 정량화한 그래프 및 표이다.
도 3a 내지 도 3f는 분화 38일 차 6종의 줄기세포의 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3g 및 도 3h는 분화 38일 차 6종의 줄기세포의 FACS 분석 결과를 정량화한 그래프 및 표이다.
도 4a 내지 도 4f는 분화 50일 차 (분화 종료 후) 6종의 줄기세포의 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4g 및 도 4h는 분화 50일 차 (분화 종료 후) 6종의 줄기세포의 FACS 분석 결과를 정량화한 그래프 및 표이다.
도 4i는 분화 50일 차 (분화 종료 후) 6종의 줄기세포로부터 분화된 NK 세포의 수를 나타낸 그래프이다.
도 2a 및 도 2b는 분화 14일 차 6종의 줄기세포의 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2c 및 도 2d는 분화 14일 차 6종의 줄기세포의 FACS 분석 결과를 정량화한 그래프 및 표이다.
도 3a 내지 도 3f는 분화 38일 차 6종의 줄기세포의 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3g 및 도 3h는 분화 38일 차 6종의 줄기세포의 FACS 분석 결과를 정량화한 그래프 및 표이다.
도 4a 내지 도 4f는 분화 50일 차 (분화 종료 후) 6종의 줄기세포의 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4g 및 도 4h는 분화 50일 차 (분화 종료 후) 6종의 줄기세포의 FACS 분석 결과를 정량화한 그래프 및 표이다.
도 4i는 분화 50일 차 (분화 종료 후) 6종의 줄기세포로부터 분화된 NK 세포의 수를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 유도만능줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, NK 세포 분화 고효율 유도만능줄기세포를 선별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 유도만능줄기세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 유도만능줄기세포는 골수 조혈줄기세포, 섬유아세포, 피부 섬유아세포, 및 제대혈 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 것인, NK 세포 분화 고효율 유도만능줄기세포를 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, “선별”이란 유도만능줄기세포로부터 NK 세포를 고효율로 분화하기 위한 유도만능줄기세포를 선택하는 것을 의미할 수 있다. 이 때, 유도만능줄기세포의 기원을 선택하는 것을 의미할 수 있으며, 동일한 기원, 예를 들어, 본 발명에서는 골수 조혈줄기세포 유래 유도만능줄기세포라고 하더라도 이로부터 배양된 조혈전구세포, 배양중인 NK 세포, 배양된 NK 세포에서 각각 발현하고 있는 특정 마커의 발현 수준의 고저를 통해 선택하는 것을 모두 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, “유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPS cell/iPSC) 또는 역분화 줄기세포”란 다능성이 없는 성인의 피부세포와 같은 체세포에 역분화를 일으키는 4가지 특정 유전자를 도입한 후 발현시키거나 역분화를 일으키는 4가지 유전자가 도입된 세포에서 만들어진 역분화 유도 단백질을 추출하여 이를 다시 체세포에 주입함으로써 배아 줄기세포와 같은 다능성을 갖는 줄기세포를 유도 만능 줄기세포 또는 역분화 줄기세포라고 한다.
본 발명에서, “자연살해 세포 (NK cell, Natural killer cell, Large Granular Lymphocytes, LGL, 이하 NK 세포)”는 선천 면역을 담당하는 중요한 세포이다. 세포독성 T세포와 유사한 기능을 수행하는데, 자연살해 세포는 감염 후 약 3일 후에 작용하여 바이러스에 감염된 세포에 대한 빠른 반응을 제공하고 종양 형성에 반응할 수 있다.
본 발명에서, “증식 (또는 확장)”이란, 본 발명의 NK 세포 분화 방법에 따라 줄기세포 또는 조혈전구세포로부터 분화되는 NK 세포의 수가 증가하는 것, 상기 증가 현상이 촉진/활성화되는 것을 의미할 수 있다. 또한 본 발명에서 “분화”란, 본 발명의 NK 세포 분화 방법에 따라 줄기세포 또는 조혈전구세포로부터 NK 세포로의 변화는 과정을 의미할 수 있다.
본 발명에서, “골수 (bone marrow)”는 뼈의 안쪽 공간에 위치한 유연한 조직으로, 성인의 대부분의 혈액을 생성하는 조혈 기관에 해당한다. 골수는 적색골수 (red marrow)와 황색골수 (yellow marrow)로 나뉜다. 적색골수는 적혈구와 백혈구, 혈소판을 만드는 곳으로 혈관과 혈액이 많아 붉은색으로 보이고, 황색골수는 혈액이 적고 지방세포 (fat cell)가 많아 황색으로 보인다. 성인은 평균 2.6kg의 골수를 가지며, 그 중 절반 정도가 적색골수이다. 초기의 골수는 모두 적색골수이지만, 노화 등에 의해 적색골수가 황색골수로 변할 수 있고, 또한 출혈이 심한 경우 혈액 생산을 늘리기 위해 황색골수가 적색골수로 돌아갈 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 골수세포는 마취 하에서 외과적 시술에 의해 채집될 수 있고, 채취된 골수는 항응고제와 혼합될 수 있는 용기에 채집될 수 있다. 골수가 채집되면, 지방, 뼛조각, 세포 부스러기 등을 세포부유물에서 제거하기 위해 일련의 멸균된 필터 혹은 기기를 이용할 수 있다. 필요시 골수는 냉동 보관할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, “조혈줄기세포 (hematopoietic stem cell, HSCs, hemocytoblasts)”는 조혈모세포와 호환되어 사용되는 것으로 혈액의 주요한 구성성분으로 잠재적으로 분화할 수 있는 세포이다. 조혈줄기세포는 혈액과 면역체계의 모체세포로서 생존유지에 절대적으로 필요하며 보통 골수나 아기의 태반과 탯줄에 존재한다. 조혈줄기세포는 골수 조직에 있는 세포들의 1/10000이라는 작은 비율을 차지하지만, 매일 수십억 개의 새로운 혈구가 조혈모세포에서 파생되어 체내에서 생성된다. 조혈줄기세포는 자기 자신을 복제할 수 있기에 혈액의 구성성분을 생산할 수 있다. 대부분의 성숙한 혈액 줄기 세포는 수명이 제한되어 있기 때문에, 조혈줄기세포가 자가 증식을 통해 평생 동안 새로운 혈구를 생성하는 능력은 생명을 유지하는 데 매우 중요하다. 조혈줄기세포는 골수에서 자가 복제 (duplication)와 증식 (proliferation)을 할 수 있으며 혈액 내 여러 세포 (적혈구, 혈소판, 호산구, 호염구, 단핵구, 중성구, T 림프구, B림프구, 자연살상세포, 가지돌기 세포)로 분화 (differentiation)할 수 있는 능력을 가지고 있다.
본 발명에서, “골수 조혈줄기세포”란 골수에서 수득된 조혈줄기세포를 의미할 수 있고, NK 세포로의 배양, 보관 등을 통해 전처리 과정을 처리한 조혈줄기세포를 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포는 골수 조혈줄기세포 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포가 골수 조혈줄기세포 유래인 경우,
상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 조혈전구세포의 CD34 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 조혈전구세포의 CD34 발현 수준이 낮은 경우, 상기 유도만능줄기세포를 NK 세포 분화 고효율 유도만능줄기세포로 선별하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, “분화된 조혈전구세포”는 본 발명의 방법으로 선별된 골수 조혈줄기세포를 배양하여 분화된 조혈전구세포를 의미할 수 있다. 본 발명에서는, 유도만능줄기세포를 본 발명에서 도 1의 배양 모식도/배양 조건에 따라 전체 배양 과정 중 9일 내지 19일 사이의 세포인 조혈전구세포를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 바람직하게는 도 1의 배양 모식도/배양 조건 하에서 전체 배양 과정 중 14일차에 분석한 NK 세포를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, “CD34”는 인간, 생쥐, 쥐 및 기타 종에서 CD34 유전자에 의해 암호화된 막관통 인산당단백질 단백질로, 세포 표면 항원을 식별하는 분화 프로토콜 클러스터에서 명명되었으며, 조혈줄기세포에서 세포 표면 당단백질로 작용하고 세포-세포 접착 인자로 기능한다는 것이 공지되었다. 또한, 조혈줄기세포가 골수 세포외 기질에 부착되거나 간질 세포에 직접 부착되는 것을 중재할 수도 있는 것으로 알려졌다. 임상적으로 이는 골수 이식을 위한 조혈줄기세포의 선택 및 강화와 관련이 있다. CD34 발현은 조혈 세포와 거의 편재적으로 관련되어 있으나 실제로는 다른 많은 세포 유형에서도 발견될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포가 골수 조혈줄기세포 유래인 경우,
상기 유도만능줄기세포로부터 분화중인 NK 세포의 CD56CD45 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포로부터 분화중인 NK 세포의 CD56CD45 발현 수준이 높은 경우, 상기 유도만능줄기세포를 NK 세포 분화 고효율 유도만능줄기세포로 선별하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, “분화중인 NK 세포”는 조혈전구세포를 배양하여 최종적으로 NK 세포로 분화되기 전의 NK 세포를 의미할 수 있다. 본 발명에서 도 1의 배양 모식도/배양 조건에 따라 전체 배양 과정 중 33일 내지 43일 사이의 NK 세포를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 바람직하게는 도 1의 배양 모식도/배양 조건 하에서 전체 배양 과정 중 38일차에 분석한 NK 세포를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, “CD56”은 인간 NK 세포 하위 집합을 결정하는 데 있어 기본적인 마커이다. CD56 발현 정도는 인간 NK 세포 성숙, 기능적 및 조직 특이적 하위 집합을 정의하는 데 널리 사용되지만 NK 세포에서 CD56 발현 정도에 대한 통일된 의미는 아직 공지된 바 없다.
본 발명에서, “CD45”는 모든 분화된 조혈 세포(적혈구 및 혈장 세포 제외)의 다양한 이소형에 존재하는 I형 막횡단 단백질로, CD45는 T세포 및 B세포 항원 수용체 신호전달의 필수 조절인자로 알려져 있다.
본 발명에서, “CD56CD45”가 평균 대비 낮을 경우 NK 세포의 성숙 마커 (maturation marker)의 발현이 현저히 감소될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, “성숙 마커”는 NK 세포의 성숙도를 나타내는 마커로서, 이 때 “성숙”이란 NK 세포의 형태적 또는 기능적 성숙을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. NK 세포는 미성숙 세포에서 특정 마커의 발현에 따라 성숙 세포가 된 것으로 판단할 수 있고, 성숙 NK 세포는 IFN-γ와 같은 용해성 분자 또는 사이토카인 등을 발현할 수 있는 것으로 알려져 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서, NK 세포의 성숙 마커는 NKG2D, CD16, CD7, NKp30, NKp44, NKp46, 2B4, KIR(a, h, g), KIR (b1, b2), KIR (e1, e2), LFA-1, 또는 DNAM-1일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포가 골수 조혈줄기세포 유래인 경우,
상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 NK 세포의 NKp46 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, “분화된 NK 세포”는 본 발명의 선별방법에 따라 NK 세포 고효율 유도만능줄기세포로 선별된 유도만능줄기세포를 배양하여 최종적으로 분화 및 수득된 NK 세포를 의미할 수 있다. 바람직하게는, 유도만능줄기세포를 본 발명에서 도 1의 배양 모식도/배양 조건에 따라 전체 배양 과정 중 46일 내지 52일 사이의 NK 세포를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 바람직하게는 도 1의 배양 모식도/배양 조건 하에서 전체 배양 과정 중 50일차에 분석한 NK 세포를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, “NKp46”은 NK 세포 수용체인 NCR1에 의해 암호화된 활성화 수용체로 NK 세포 독성에 관여하여 NKp46의 차단은 많은 암 표적의 NK 살해를 억제하는 것으로 공지되어있다. NKp46의 표면 밀도는 NK 세포마다 상이한 것으로 알려져 있으며 이와 같은 경향성은 정확히 알려진 바 없다는 점에서 NK 세포에서의 NKp46 발현 수준에 따라 NK 세포의 기능, 분화 효율 등이 상이하게 나타날 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 유도만능줄기세포를 배양하는 단계를 포함하고,
상기 유도만능줄기세포는 골수 조혈줄기세포, 섬유아세포, 피부 섬유아세포, 및 제대혈 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 것인, 유도만능줄기세포로부터 NK 세포를 고효율로 분화하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포가 골수 조혈줄기세포 유래인 경우,
상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 조혈전구세포 중 CD34 발현 수준이 낮은 조혈전구세포를 제외하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포가 골수 조혈줄기세포 유래인 경우,
상기 유도만능줄기세포로부터 분화 중인 NK 세포 중 CD56CD45 발현 수준이 낮은 세포를 제외하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 제대혈 줄기세포는 제대혈 중간엽 줄기세포를 의미할 수 있으나, 이는 일 예로서, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 유도만능줄기세포의 NK 세포 분화용 조성물, 및 설명서를 포함하는, 유도만능줄기세포로부터 NK 세포를 고효율로 분화하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 설명서에는 상기 방법이 기재될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, “키트”는 본 발명의 방법으로 NK 세포를 분화할 수 있도록 하는 도구를 의미한다. 본 발명의 키트에는 상기 물질 외에도 이들의 보관, 처리 방법에 통상적으로 필요한 다른 구성성분, 조성물, 용액, 장치 등이 포함될 수 있다. 구체적인 예로는 이때, 각 구성은 1회 이상 횟수에 제한 없이 적용될 수 있으며, 각 물질을 적용하는 선후에는 제한이 없고, 각 물질의 적용은 동시에 진행될 수도 있고 미시에 진행될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 컨테이너; 지시서; 등을 포함할 수 있다. 상기 컨테이너는 상기 물질을 포장하는 역할을 할 수 있고, 보관 및 고정하는 역할을 할 수도 있다. 상기 컨테이너의 재질은 예컨대, 병, 통 (tub), 작은 봉지 (sachet), 봉투 (envelope), 튜브, 앰플 (ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있고, 이들은 부분적 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있으며, 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 지시서를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, “포함하는”이라는 용어가 사용될 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
[실험방법]
인간 유도만능줄기세포 배양
1.1. 배양 용기 코팅
iMatrix-511 (175 μg)을 꺼내서, 6well 1well 당 DPBS 1.5ml에 9.6ul을 첨가하여 coating 인큐베이터에서 1시간 동안 코팅하였다. 1시간 동안 후 계대배양을 실행하였다.
1.2. 배양 배지 제조 (stemfit004)
배양 배지를 상온에서 녹이고 (절대로 37℃ warming 하지 않음), stemfit004에 항생제 Primocin 1ml을 첨가 후 혼합하여 complete medium을 제조하였다.
1.3. 10mM y-27632 제조
DW에y-27632를 10mM이 되도록 제조한 후 EP tube에 Aliquot하여 -20℃에 보관하였다.
1.4. 인간 유도만능줄기세포 배양 방법
complete medium를 상온에서 30분 이상 warming하여 준비하였다.
1.4.1 일반 배양
6well plate에서 배양하는 세포의 배지를 제거 후 배양액을 매일 2.5ml씩 교체하였다.
1.4.2 계대 배양
10mM y-27632를 상온에서 녹인 후 상온에서 warming된 complete medium에 1000x로 첨가하였다. 계대배양할 세포가 있는 plate의 배양 배지를 제거하였다.
6-well plate에 well 1칸당 DPBS 1mL씩 넣고 워싱하였다. TrypLE reagents 1ml을 첨가하고 15분 incubation (37℃, 5% CO2)하였다. 세포가 떨어지는 것을 확인한 후 complete media 8ml이 들어있는 15ml tube에 반응시킨 TrypLE reagents 1ml을 넣어 주고 한 번 더 media를 넣어 다시 세포를 모아 15ml tube에 넣어주었다.
이후 원심 분리기 300g에 5분 돌리고, 세포만 남긴 후 media를 제거하였다. 이후 media + y-26532를 3ml 넣어 세포를 계수하였으며, 6well 기준 3x10^4 cells/well/2.5ml로 시딩 (seeding)하였다.
1.5 유도만능줄기세포 기원
1.5.1 본 발명에 사용된 유도만능줄기세포 (iPSCs) 세포주 WT, BMHSC-iPSC는 자사에서 직접 reprogramming시켜 표 1과 같이 제작하였다. 이 때, BMHSC-iPSC#1, #7, 및 #10은 골수 조혈줄기세포를 표 1에 따라 리프로그래밍하였을 때 수득되는 서로 다른 콜로니를 명명한 것이다.
| 구분 | 기원 | 리프로그래밍 |
| WT | fibroblast | Retrovirus (Integration), Oct4, Sox2, Klf4 및 C-myc로 리프로그래밍 |
| hDF-iPSC | human dermal fibroblasts | Retrovirus (Integration), Oct4, Sox2, Klf4 및 C-myc로 리프로그래밍 |
| UCB-MSC-iPSC | umbilical cord blood mesenchymal stem cells | Retrovirus (Integration), Oct4, Sox2, Klf4 및 C-myc로 리프로그래밍 |
| BMHSC-iPSC#1 | Bone marrow HSC | Episomal plasmid (non-integration)를 Oct4, Sox2, Klf4 ,L-myc 및 Lin28으로 리프로그래밍 |
| BMHSC-iPSC#7 | ||
| BMHSC-iPSC#10 |
2. 인간 유도만능줄기세포로부터 NK 세포로의 분화
2.1. 배양 용기 코팅
iMatrix-511 (175 μg)을 꺼내서, T-75 flask에 DPBS 15ml에 75ul을 첨가하여 coating 인큐베이터에서 1시간 동안 코팅하였다.
2.2. stemfit004
배양 배지를 상온에서 녹이고 (절대로 37℃ warming하지 않음), stemfit004에 항생제 Primocin 1ml을 첨가 및 혼합하여 proliferation complete medium을 제조하였다.
2.3. 10mM y-27632 제조
DW에 y-27632를 10mM이 되도록 제조한 후 EP tube에 Aliquot하여 -20℃에 보관하였다.
2.4. 인간 유도 만능 줄기세포로부터 NK 세포로의 분화
proliferation complete medium을 상온에서 30분 이상 warming하여 준비하였다.
2.4.1 spheroid 제작
SPHERICAL PLATE 5D plate를 사용하여 spheroid를 제작하였다. 1well 당 7.5x10^5 cells를 시딩 (seeding)하였다. Seeding 방법은 1.4.2의 방법을 동일하게 적용하였으며, 이 후 24시간 동안, 37℃, 5% CO2에 incubation하였다.
2.4.2 spheroid seeding
제작된 spheroid를 코딩된 T-75 flask에 시딩하였다. 1well 당 T-75 flask 7장에 media는 총 15ml에 맞춰서 하였으며, 이 후 colony size가 750um~100um이 될 때까지 배양을 진행하였다 (day 3~5일 동안 일반 배양).
2.4.3 자연 살해 세포로의 분화 Scheme (도 1)
2.4.3.1 자연 살해 세포로의 분화 과정
2.4.3.1.1 배양 과정
Day 0 : Growth media (stemfit 004)를 suction하여 제거 후 Essential 8 media로 washing, 분화 미디어 1 vol 15ml을 첨가 후 incubation.
Day 2~3 : 분화 미디어 1 suction하여 제거, 분화 미디어 2 vol 15ml을 첨가 후 incubation.
Day 4~5 : 분화 미디어 2 suction하여 제거, 분화 미디어 3 vol 15ml을 첨가 후 incubation.
Day 6~7 : 분화 미디어 3 vol 15ml 첨가 (total vol 30ml).
Day 8~10 : media half change. Flask에 있는 media를 15ml harvest하여 50ml tube에 첨가. 이후 300g에 5분 원심분리 후 media 제거 분화 3 media를 분화 중인 flask에 첨가 후 incubation.
Day 10~14 :분화 중인 T75에 있는 media를 harvest (30ml/T75), 300g 5min 원심 분리 후 분화 미디어 4-1를 15ml 첨가 (15ml/T75).
Day 12~16 : 분화 미디어 4-1를 15ml 첨가 (total vol 30ml).
Day 16~20 : 분화 미디어 4-1에서 IL3를 제외한 분화 미디어로 full change. 300g 5min 원심 분리 후 분화 미디어 4-2를 15ml 첨가.
Day 18~22 : 분화 미디어 4-2를 15ml 첨가.
Day 26~48 : 4일에 한번씩 media half change. T75당 15ml 씩 50ml tube에 넣어 300g에 5분 원심 분리 이후 media 제거, 새로운 분화미디어 4-2를 15ml 넣어 세포를 풀어주고 flask에 넣음.
Day 46~52 : 분화 종료, 분석을 위해 cell harvest. Flask에 있는 media를 harvest하여 50ml tube에 넣은 후 300g에 5분 원심분리 후 분화 media를 넣어 cell counting (cell counter X, manual counting으로 진행)하여 각각의 분석을 위한 세포 수 확인함.
2.4.3.2 줄기세포로 부터 NK 세포로 분화 검증 과정 (FACS) (표 1)
2.4.3.2.1 각각의 단계에서 분화 중인 세포를 harvest 한 후, 300g에 5분에 원심 분리하였다.
2.4.3.2.2 이후, media를 제거 후 FACS buffer를 10ml 첨가하여 300g에 5분에 원심 분리기를 돌려 washing하였다.
2.4.3.2.3 tube에 1x10^5cells를 첨가하였다.
2.4.3.2.4 tube에 각각의 antibody, isotype에 1ul씩 첨가하였다.
2.4.3.2.5 Ice에 1시간 incubation하였다.
2.4.3.2.6 이후 FACS buffer를 1ml씩 넣어 첨가하여 300g에 5분에 원심 분리기를 돌려 washing하였다.
2.4.3.2.7 2.4.3.2.6 방법을 3번 반복하였다.
2.4.3.2.8 이후 FASC 기기로 측정하였다.
| 분석 Day | tube 개수 | maker | 형광 | 비고 |
| day 0 | tube 1 | no | ||
| tube 2 | IgGM | PE | isotype | |
| tube 3 | TRA-1-81 | PE | iPSC marker | |
| tube 4 | TRA-1-60 | PE | iPSC marker | |
| tube 5 | IgG3 | PE | isotype | |
| tube 6 | SSEA4 | PE | iPSC marker | |
| day10~14 | tube 1 | no | compensation | |
| tube 2 | CD31 | PE | compensation | |
| tube 3 | CD34 | APC | compensation | |
| tube 4 | IgGK1 | APC/PE | isotype | |
| tube 5 | CD34KDR | APC/PE | HPC marker | |
| tube 6 | CD34CD31 | APC/PE | HPC marker | |
| tube 7 | CD34CD43 | APC/PE | HPC marker | |
| tube 8 | CD34CD45 | APC/PE | HPC marker | |
| tube 9 | CD56CD45 | APC/PE | NK marker | |
| day34~38 | tube 1 | no | compensation | |
| tube 2 | CD45 | PE | compensation | |
| tube 3 | CD56 | APC | compensation | |
| tube 4 | IgGK1 | APC/PE | isotype | |
| tube 5 | CD34CD31 | APC/PE | HPC marker | |
| tube 6 | CD34CD43 | APC/PE | HPC marker | |
| tube 7 | CD34CD45 | APC/PE | HPC marker | |
| tube 8 | CD56CD45 | APC/PE | NK marker | |
| tube 9 | CD56NKG2A | APC/PE | NK marker | |
| tube 10 | CD56NKG2D | APC/PE | NK marker | |
| tube 11 | CD56NKp30 | APC/PE | NK marker | |
| tube 12 | CD56NKp44 | APC/PE | NK marker | |
| tube 13 | CD56NKp46 | APC/PE | NK marker | |
| tube 14 | CD56CD7 | APC/PE | NK marker | |
| tube 15 | CD56CD16 | APC/PE | NK marker | |
| tube 16 | CD56CD3 | APC/PE | NK marker | |
| day46~52 | tube 1 | no | compensation | |
| tube 2 | CD45 | PE | compensation | |
| tube 3 | CD56 | APC | compensation | |
| tube 4 | IgGK1 | APC/PE | isotype | |
| tube 5 | CD56CD45 | APC/PE | NK marker | |
| tube 6 | CD56NKG2A | APC/PE | NK marker | |
| tube 7 | CD56NKG2D | APC/PE | NK marker | |
| tube 8 | CD56NKp30 | APC/PE | NK marker | |
| tube 9 | CD56NKp44 | APC/PE | NK marker | |
| tube 10 | CD56NKp46 | APC/PE | NK marker | |
| tube 11 | CD56CD7 | APC/PE | NK marker | |
| tube 12 | CD56CD16 | APC/PE | NK marker | |
| tube 13 | CD56CD3 | APC/PE | NK marker | |
| tube 14 | CD56KIR(a,h,g) | APC/PE | NK marker | |
| tube 15 | CD56KIR(b1,b2) | APC/PE | NK marker | |
| tube 16 | CD56KIR(e1, e2) | APC/PE | NK marker | |
| tube 17 | IgGM | PE | isotype | |
| tube 18 | TRA-1-81 | PE | iPSC marker | |
| tube 19 | TRA-1-60 | PE | iPSC marker | |
| tube 20 | IgG3 | PE | isotype | |
| tube 21 | SSEA4 | PE | iPSC marker |
실시예 1. CD34 발현 증가에 따른 NK 세포 분화 지연 활성 확인
표 1의 줄기세포를 NK 세포 분화 14일 차에 2.4.3.2. FACS 실험 방법에 따라 분석하였다.
그 결과, CD34KDR, CD34CD31, CD34CD43, 및 CD34CD45의 마커 발현 비율은 도 2a 및 도 2b와 같이 확인되었고, 이를 정량화한 그래프 및 표는 도 2c 및 도 2d와 같다.
이에 따르면, 기원에 따라서 조혈전구세포 (HPC)로 분화하는 것에 차이가 나타나지는 않는 것으로 확인되었다.
그러나, BM-HSC iPSC #1은 CD34의 발현이 현저히 높은 것으로 나타났고, 이와 같은 높은 CD34의 발현이 NK 세포의 분화를 지연시키는 것으로 분석되었다.
실시예 2. CD56CD45 발현 감소에 따른 NK 세포 성숙도 감소 확인
표 1의 줄기세포를 NK 세포 분화 38일 차에 2.4.3.2. FACS 실험 방법에 따라 분석하였다.
그 결과, CD45, NKG2A, NKG2D, CD16, CD3, CD7, NKp30, NKp44, 및 NKP46의 마커 발현 비율은 도 3a 내지 도 3f와 같이 확인되었고, 이를 정량화한 그래프는 도 3g 및 도 3h와 같다.
NK 세포 분화 38일 째의 주요 NK 세포 마커에 따르면 기원마다 분화 속도가 다르게 나타나는 것이 확인되었다.
이 때, 실시예 1에서 NK 세포 분화 14일 차에 높은 CD34 발현 수준을 유지하는 것으로 조사되었던 BM-HSC #1에서는 기원이 상이한 유도만능줄기세포 및 동일 기원의 유도만능줄기세포로부터 분화된 BM-HSC #7 및 BM-HSC #10 대비 CD56CD45의 발현 수준이 현저히 감소하는 것으로 나타났으며, 이에 따라 NK 세포 성숙 마커 (maturation maker)들의 발현 역시 현저하게 감소되는 것이 확인되었다.
실시예 3. NKp46 발현 감소에 따른 NK 세포 배양 효율 확인
실시예 3-1. 줄기세포 50일 차 배양 종료 후 FACS 분석 결과
표 1의 줄기세포를 NK 세포 분화 50일 차, 즉, 분화 완료 후 2.4.3.2. FACS 실험 방법에 따라 분석하였다.
그 결과, CD45, NKG2A, NKG2D, CD16, CD3, CD7, NKp30, NKp44, NKP46, PD-1, LAG-3, CD57, TIGIT, 2B4, KIR(a, h, g), KIR (b1, b2), KIR (e1, e2), LFA-1, 및 DNAM-1의 마커 발현 비율은 도 4a 내지 도 4f와 같이 확인되었고, 이를 정량화한 그래프 및 표는 도 4g 및 도 4h와 같다.
이에 따르면, 기원에 따라 특정 마커에 대해 상이한 발현 수준을 나타내는 것이 관찰되었고, 특히, BM-HSC #1은 38일 차 실험 결과와 마찬가지로 성숙 마커들의 발현이 낮은 수준인 것으로 확인되었다. 또한, 특이적으로 BM-HSC #7에서 NKp46의 발현은 기원이 상이한 유도만능줄기세포 및 동일 기원의 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포 대비 낮은 수준인 것으로 확인되었다. 또한, BM-HSC #7 및 BM-HSC#10은 유사한 마커 발현 양상을 나타내는 것이 확인되었다.
실시예 3-2. 줄기세포 50일 차 배양 종료 후 NK 세포 수 분석 결과
표 1에 따른 줄기세포 50일 차 배양 종료 후, 분화되어 최종적으로 수득된 NK 세포를 계수하여 분화 효율을 비교하였다.
그 결과 도 4i 및 표 3과 같이 확인되었다.
| 구분 | cell number AVE | 평균 +/- |
| wt | 2.75.E+07 | 7428473.7 |
| hDF | 2.54.E+07 | 8607877.5 |
| UCB | 2.03.E+07 | 8259674.5 |
| BMHSC 1 | 1.55.E+07 | 5167419.3 |
| BMHSC 7 | 4.49.E+07 | 6154311.9 |
| BMHSC 10 | 4.35.E+07 | 15312159.6 |
이와 같은 결과에 따르면, BM-HSC #7은 wt, hDF, UCB 대비 각각 1.6배, 1.8배, 2.2배의 분화 효율을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, BM-HSC #10은 wt, hDF, UCB 대비 각각 1.6배, 1.7배, 2.1배의 분화 효율을 나타내는 것으로 확인되었다. 즉, 골수 유래 조혈줄기세포는 기원이 다른 줄기세포 대비 현저히 우수한 NK 세포 분화 효율을 나타내는 것이 증명되었다.
또한, BM-HSC #7 및 BM-HSC #10은 BM-HSC #1 대비 각각 약 2.9배, 및 2.8배의 NK 분화 효율을 나타내었다. 이와 같은 결과에 따르면 동일한 기원을 유래로 하는 유도만능줄기세포를 사용하더라도 특정 배양 단계에서의 특정 마커의 발현 수준, 즉, CD34의 발현이 높거나, CD56CD45의 발현이 낮은 경우에는 최종적인 NK 세포 분화 효율이 현저히 감소하며, 동일 기원의 유도만능줄기세포에서 클론간의 차이에 의하여 NKp46의 차이가 있음을 확인 하였다.
이와 같은 BM-HSC #1의 NK 세포 분화 효율은 기원이 상이한 줄기세포와 비교하더라도 상당히 낮은 수준이라는 점에서 유도만능줄기세포의 기원뿐만 아니라 클론간의 차이도 있음을 시사하는 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
Claims (11)
- 유도만능줄기세포를 배양하는 단계를 포함하고,
상기 유도만능줄기세포는 골수 조혈줄기세포, 섬유아세포, 피부 섬유아세포, 및 제대혈 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 것인, NK 세포 분화 고효율 유도만능줄기세포를 선별하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 유도만능줄기세포는 골수 조혈줄기세포 유래인 것인, NK 세포 분화 고효율 유도만능줄기세포를 선별하는 방법.
- 제2항에 있어서,
상기 유도만능줄기세포가 골수 조혈줄기세포 유래인 경우,
상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 조혈전구세포의 CD34 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것인, NK 세포 분화 고효율 유도만능줄기세포를 선별하는 방법.
- 제3항에 있어서,
상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 조혈전구세포의 CD34 발현 수준이 낮은 경우, 상기 유도만능줄기세포를 NK 세포 분화 고효율 유도만능줄기세포로 선별하는 단계를 더 포함하는 것인, NK 세포 분화 고효율 유도만능줄기세포를 선별하는 방법.
- 제2항에 있어서,
상기 유도만능줄기세포가 골수 조혈줄기세포 유래인 경우,
상기 유도만능줄기세포로부터 분화중인 NK 세포의 CD56CD45 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것인, NK 세포 분화 고효율 유도만능줄기세포를 선별하는 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 유도만능줄기세포로부터 분화중인 NK 세포의 CD56CD45 발현 수준이 높은 경우, 상기 유도만능줄기세포를 NK 세포 분화 고효율 유도만능줄기세포로 선별하는 단계를 더 포함하는 것인, NK 세포 분화 고효율 유도만능줄기세포를 선별하는 방법.
- 유도만능줄기세포를 배양하는 단계를 포함하고,
상기 유도만능줄기세포는 골수 조혈줄기세포, 섬유아세포, 피부 섬유아세포, 및 제대혈 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 것인, 유도만능줄기세포로부터 NK 세포를 고효율로 분화하는 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 유도만능줄기세포가 골수 조혈줄기세포 유래인 경우,
상기 유도만능줄기세포로부터 분화된 조혈전구세포 중 CD34 발현 수준이 높은 조혈전구세포를 제외하는 단계를 더 포함하는 것인, 유도만능줄기세포로부터 NK 세포를 고효율로 분화하는 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 유도만능줄기세포가 골수 조혈줄기세포 유래인 경우,
상기 유도만능줄기세포로부터 분화 중인 NK 세포 중 CD56CD45 발현 수준이 낮은 세포를 제외하는 단계를 더 포함하는 것인, 유도만능줄기세포로부터 NK 세포를 고효율로 분화하는 방법.
- 유도만능줄기세포의 NK 세포 분화용 조성물, 및 설명서를 포함하는, 유도만능줄기세포로부터 NK 세포를 고효율로 분화하기 위한 키트.
- 제10항에 있어서,
상기 설명서에는 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법이 기재된 것인, 유도만능줄기세포로부터 NK 세포를 고효율로 분화하기 위한 키트.
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|---|---|---|---|
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR20210068510A (ko) | 2018-10-01 | 2021-06-09 | 유니버시테이트 젠트 | 항체-의존적 세포독성 활성이 증강된 성숙한 자연 살해 세포로의 가속화된 인간 조혈 줄기세포 분화 |
-
2023
- 2023-11-07 KR KR1020230153090A patent/KR20240066125A/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210068510A (ko) | 2018-10-01 | 2021-06-09 | 유니버시테이트 젠트 | 항체-의존적 세포독성 활성이 증강된 성숙한 자연 살해 세포로의 가속화된 인간 조혈 줄기세포 분화 |
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