KR20240063841A - CpG 부위 cg22499381의 메틸화 수준을 이용한 임신중독증 진단을 위한 분석방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 임신중독증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상자의 시료 중 특정 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법을 제공한다.

Description

CpG 부위 cg22499381의 메틸화 수준을 이용한 임신중독증 진단을 위한 분석방법{Analytical method for diagnosing preeclampsia using methylation level of the CpG site cg22499381}
본 발명은 CpG 부위의 메틸화 수준을 이용하여 임신중독증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 분석방법에 관한 것이다.
임신중독증(Preeclampsia, PE)은 전 세계적으로 모든 임신의 2∼8%에 영향을 미치는 임신성 고혈압 질환으로 산모 사망률과 이환율의 주요 원인 중 하나이다. 임신중독증은 임신 20주 이후에 산모에게 새롭게 발병하는 고혈압과 단백뇨를 특징으로 하는 다기관 장애(multisystem disorder)이다. 단백뇨가 없는 상태에서, 혈소판감소, 신부전, 간기능 장애, 폐부종을 포함한 산모의 장기 기능장애를 동반한, 새로 발병한 고혈압의 소견은 이를 진단하기에 충분하다. 따라서 임상 표현형은 혈압 상승으로부터 신장 및 간 기능 장애 및 발작을 포함하여 더 심각한 합병증에 이르기까지 증후군의 징후에 따라 다양하다. 따라서 최근에는, 일반적으로 경증, 중등도, 중증으로 알려진 증상의 중증도에 따라 PE를 소분류하는 것이 아니라, 심각한 모체 및 태아의 특징 유무에 따라 분류하도록 권장되고 있다. PE의 원인과 병태생리는 대체로 미스터리로 남아 있다. 그러나 유전적, 면역학적, 내분비적, 환경적 요인이 모두 관련되어 있다(Espinoza J. Abnormal fetal-maternal interactions: an evolutionary value, Obstet Gynecol. 2012;120:370-374). 수많은 연구에서, 영양막 운동성 및 침습, 혈관 신생, 세포 부착 및 면역 반응을 포함하여, PE와 관련된 다양한 메커니즘에서의 유전자 발현의 변화가 보고된 바 있다. 후성학적 사건은 이러한 유전자 발현 변화에 중요한 역할을 한다. 이는 PE의 다양한 증상과 발달에 대한 후성학적 변형의 기여를 나타낸다.
후성학적 변형은 DNA 서열을 변화시키지 않고 유전자 발현을 조절한다. DNA 메틸화는 가장 일반적인 후성학적 기전이며, 이는 CpG 부위에서 주로 발생하며 최적의 태반 및 태아 발달에 중요하다. 몇몇 연구는 PE에 의해 나타나는 태반에서의 전체적인 DNA 메틸화의 변화를 조사하였고, 이러한 연구는 후성유전체의 다양한 DNA 영역이 정상 태반에 비해 PE 태반에서 과메틸화 및/또는 저메틸화됨을 보여준다(Blair JD, et al., Mol Hum Reprod. 2013;19:697-708; Ching T, et al., Mol Hum Reprod. 2014;20:885-904; Wang T, et al. Epigenomics. 2019;11:1003-1019; Gao WL, et al. Hypertens Res. 2011;34:655-661; Kulkarni A, et al., DNA Cell Biol. 2011;30:79-84; Leavey K, et al., Clin Epigenetics. 2018;10:28). 그러나 PE의 중증도(severe features)에 따른 DNA 메틸화에 대한 연구는 거의 없다. 따라서 중증도 특징에 따른 PE 태반에서의 DNA 메틸화 프로파일링 분석(comparative DNA methylation profiling analysis)은 이러한 질병의 병태생리에 대한 이해를 향상시킬 수 있다.
본 발명자들은 PE, 중증 PE(PE with severe features), 및 정상 임신부의 태반에서 후성유전체-전체 DNA 메틸화 패턴을 분석하였으며, 상이하게 메틸화된 CpG 부위(differentially methylated CpGs. DMCs)를 동정하였다. 그 결과, 15개의 DMCs가 중증 여부와 관계없이 PE 임신부에서 유의성 있는 메틸화 수준 차이를 나타낸다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 임신중독증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 상기 15개의 CpG 부위 중 하나 이상의 메틸화 수준을 측정하는 것을 포함하는 분석방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양태에 따라, 임신중독증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상자의 시료 중 cg04502985, cg14543412, cg16070018, cg24440941, cg22339775, cg08317794, cg22324103, cg24836826, cg11144986, cg04823299, cg00979438, cg20772657, cg22499381, cg12342501, 및 cg10288111로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법이 제공된다.
본 발명의 분석방법에 있어서, 상기 대상자의 시료는 체외로 분리된 산모의 태반 시료일 수 있다. 상기 메틸화 수준의 측정은 메틸화-특이적 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(methylation-specific quantitative real-time PCR)에 의하여 수행될 수 있다.
일 구현예에서, cg04502985, cg14543412, cg16070018, cg24440941, cg22339775, cg08317794, cg22324103, cg24836826, cg11144986, cg04823299, cg00979438, 및 cg20772657로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 CpG 부위의 과메틸화 여부를 측정하는 단계를 포함하는 분석방법이 제공된다.
다른 구현예에서, cg22499381, cg12342501, 및 cg10288111로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 CpG 부위의 저메틸화 여부를 측정하는 단계를 포함하는 분석방법이 제공된다.
특정 CpG 부위, 즉 cg04502985, cg14543412, cg16070018, cg24440941, cg22339775, cg08317794, cg22324103, cg24836826, cg11144986, cg04823299, cg00979438, cg20772657, cg22499381, cg12342501, 및 cg10288111에서의 메틸화 수준이, 중증(severe features) 여부와 관계없이, 임신중독증 임신부에서 정상 임신부에 비하여 유의성 있게 상이하다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 상기 CpG 부위의 과메틸화(hypermethylation) 또는 저메틸화((hypomethylation)를 측정하는 것을 포함하는 본 발명의 분석방법은 임신중독증을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 PE에서 상이하게 메틸화된 CpG 부위(DMCs)의 계층적 클러스터링을 나타낸다. 850K 어레이의 메틸화 정도 값은 독립적인 t 테스트(P < 0.05) 및 배수-변경 기준(fold-change criterion)(|메틸 정도의 델타 평균|≥0.2)로 평가하였다. 다중 테스트로부터의 위양성 결과(false positive results)를 제어하기 위해 Benjamini 및 Hochberg 위발견 비율 방법(false discovery rate method)을 사용하여 P 값을 보정하였다. DMCs에 대한 메틸화 정도 값은 계층적 클러스터링을 거쳤다. DMCs는 x축에 있고 생물학적 샘플은 y축에 있으며, 강한 메틸화는 황색으로 표시하였고, 메틸화가 약하거나 없는 것은 청색으로 표시하였다. a 대조군 대 PE. b 대조군 대 중증 PE. Con:컨트롤. PE: 임신중독증, PES: 중증 임신중독증(preeclampsia with severe features)
도 2는 유의성 있는 변화를 갖는 DMCs의 중첩을 보여주는 벤 다이어그램이다. NT: 정상 임신부, PT: 임신중독증 임신부, PTS: 중증 임신중독증 임신부
PE는 태반 영양막 침습 실패로 인해 산모와 태아 모두에게 심각한 이환율을 보이는 산과 질환이다. 그러나, 그 병태생리학은 여전히 불분명하다. 본 발명자들은 DNA 메틸화 프로파일링을 수행하여 PE 중증도에 관계없이 PE 태반에서 나타나는 DNA 메틸화의 상이한 패턴을 확인하였다. 정상 13명, PE 5명, 중증 PE 임신부 8명의 태반 조직에서 DNA를 추출하였다. Illumina HumanMethylation 850K BeadChip을 사용하여 게놈 전체의 DNA 메틸화 분석을 수행하였다. Illumina HumanMethylation 850K BeadChip을 통해 확보된 β 값은 메틸화된 프로브와 메틸화되지 않은 프로브 사이의 강도 비율을 사용하여 Illumina 어레이의 보정 및 정량에 의해 얻어진다. 즉, β 값은 어레이 상에서 음성 대조군을 사용하여 배경을 빼고, 메틸화된 신호 강도와 메틸화된 신호 및 메틸화되지 않은 신호의 합에 대한 비율로부터 계산되며, 각 CpG 부위에서의 0 내지 1의 β 값은 0 내지 100%까지 메틸화 백분율과 관련된다. 따라서, 대상자로부터 얻어진 태반 시료 중, 특정 CpG 부위에 대한 어레이 데이터로부터 추출된 β 값이 +0.2 보다 클 경우, 해당 CpG 부위에서 유의성 있게 과메틸화(hypermethylation)된 것으로 판단할 수 있다. 또한, 대상자로부터 얻어진 태반 시료 중, 특정 CpG 부위에 대한 어레이 데이터로부터 추출된 β 값이 -0.2 보다 작을 경우, 해당 CpG 부위에서 유의성 있게 저메틸화(hypomethylation)된 것으로 판단할 수 있다.
정상 태반 조직과 비교하여, PE에서의 243개 DMCs와 중증 PE에서의 155개 DMCs를 포함하여, 398개 DMCs에서 유의한 차이가 명확하였다. 이 중 12개의 과메틸화된 DMCs와 3개의 저메틸화된 DMCs는 두 PE 그룹 모두에서 관찰되었으므로 중증도와 무관한 것으로 밝혀졌다.
본 명세서에서, 용어 "CpG 또는 CpGs"라 함은 시토신 및 구아노신 염기를 함유하는 DNA의 디뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 디뉴클레오티드 서열은 인간의 DNA에서 메틸화될 수 있다. 또한, 용어 "DMC(differentially methylated CpG site) 또는 DMCs(differentially methylated CpG sites)"는 상이하게 메틸화된 CpG 부위(들)을 말한다.
본 발명은 임신중독증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상자의 시료 중 cg04502985, cg14543412, cg16070018, cg24440941, cg22339775, cg08317794, cg22324103, cg24836826, cg11144986, cg04823299, cg00979438, cg20772657, cg22499381, cg12342501, 및 cg10288111로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법을 제공한다.
상기 CpG 부위의 프로브 ID(Probe ID) 서열은 각각 서열번호 1 내지 15와 같다. 즉, 서열번호 1은 프로브 ID cg04502985의 서열이고, 서열번호 2는 프로브 ID cg14543412의 서열이고, 서열번호 3은 프로브 ID cg16070018의 서열이고, 서열번호 4는 프로브 ID cg24440941의 서열이고, 서열번호 5는 프로브 ID cg22339775의 서열이고, 서열번호 6은 프로브 ID cg08317794의 서열이고, 서열번호 7은 프로브 ID cg22324103의 서열이고, 서열번호 8은 프로브 ID cg24836826의 서열이고, 서열번호 9는 프로브 ID cg11144986의 서열이고, 서열번호 10은 프로브 ID cg04823299의 서열이고, 서열번호 11은 프로브 ID cg00979438의 서열이고, 서열번호 12는 프로브 ID cg20772657의 서열이고, 서열번호 13은 프로브 ID cg22499381의 서열이고, 서열번호 14는 프로브 ID cg12342501의 서열이고, 서열번호 15는 프로브 ID cg10288111의 프로브 ID(Probe ID)의 서열이다.
본 발명의 분석방법에 있어서, 상기 대상자의 시료는 인체로부터 체외로 분리된 시료를 말하며, 예를 들어 체외로 분리된 산모의 태반 시료를 포함한다. 산모의 태반 시료는 산부인과에서 실시되는 생검 등을 통하여 얻을 수 있다.
본 발명의 분석방법은 특정 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 메틸화 수준의 측정은 생명공학 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 메틸화 수준의 측정은 메틸화-특이적 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(methylation-specific quantitative real-time PCR)에 의하여 수행될 수 있다. 메틸화-특이적 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하여 얻어진 데이터로부터, 메틸화 수준의 차이는 ΔCt를 통해 추출할 수 있다. ΔCt 값은 ΔCt = Ct MSRE - Ct input으로 계산되며, ΔCt가 작을수록 값이 메틸화 수준이 높은 것을 나타낸다. 이를 이용하여 정상인과 PE 환자의 상기 메틸화 수준 차이를 ΔCt 값을 통해 확인할 수 있다.
본 발명에 의해 cg04502985, cg14543412, cg16070018, cg24440941, cg22339775, cg08317794, cg22324103, cg24836826, cg11144986, cg04823299, cg00979438, 및 cg20772657의 CpG 부위가 중증(severe features) 여부와 관계없이, 임신중독증 임신부에서 정상 임신부에 비하여 유의성 있게 높게 메틸화된다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, cg04502985, cg14543412, cg16070018, cg24440941, cg22339775, cg08317794, cg22324103, cg24836826, cg11144986, cg04823299, cg00979438, 및 cg20772657로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 CpG 부위의 과메틸화 여부를 측정하는 단계를 포함하는 분석방법이 제공된다. 상기 구현예에서, 유의성 있는(예를 들어, Δβ > +0.2) 과메틸화가 밝혀질 경우, 해당 대상자는 임신중독증 위험 환자로 분류될 수 있다.
또한, 본 발명에 의해, cg22499381, cg12342501, 및 cg10288111의 CpG 부위가 중증(severe features) 여부와 관계없이, 임신중독증 임신부에서 정상 임신부에 비하여 유의성 있게 낮게 메틸화된다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 다른 구현예에서, cg22499381, cg12342501, 및 cg10288111로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 CpG 부위의 저메틸화 여부를 측정하는 단계를 포함하는 분석방법이 제공된다. 상기 구현예에서, 유의성 있는(예를 들어, Δβ < -0.2) 저메틸화가 밝혀질 경우, 해당 대상자는 임신중독증 위험 환자로 분류될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
1. 물질 및 시험방법
(1) 시험 대상자
본 연구는 제일병원과 분당차병원 IRB(Institutional Review Board) 윤리위원회의 승인을 받았다(#CGH-IRB-2017-22, CHAMC 2018-12-063-022). 2010년 8월에서 2017년 8월 사이에 제일병원 산부인과에서 산전 관리에 참석한 단태(singleton) 임신부가 본 연구에 등록하였다. 샘플 수집 및 후속 분석 전에 모든 참가자로부터 서면 동의(written informed consent)를 받았다.
태반의 게놈-규모 DNA 메틸화를 PE(n=5), 중증 PE(PE with severe features)(n=8) 및 대조군(n=13)의 세 가지 임신 그룹에서 비교하였다. PE는 임신 20주 후 고혈압(수축기 혈압, SBP≥140 mmHg 및/또는 확장기 혈압, DBP≥90 mmHg, 최소 2회 4시간 간격) 및 단백뇨(24시간 소변 수집 표본에서 ≥300 mg 및/또는 딥스틱 검사에서 ≥1+)로 정의하였다. PE는 Leveno KJ, Spong CY, Dashe JS, Casey BM, Hoffman BL, Cunningham FG, et al. Williams Obstetrics, 25 edition. McGraw-Hill Education; 2018. CHAPTER 40: Hypertensive disorders에 개시된 기준에 따라 "PE" 및 "중증 PE(PE with severe features)"로 세분화하였다. PE의 중증(severe features)은 DBP ≥110 mmHg, SBP ≥ 160 mmHg, 임신 34주 이전 발병 또는 출생 시 성별 및 재태 연령을 기준으로 10번째 백분위수 미만의 출생 체중으로 정의하였다. 대조군은 만삭(임신 37주 이상)에 분만을 위해 제시된 의학적 및 산과적 합병증이 없는 여성으로 정의하였다. 분만 직후(≤30분), 태반의 태아 쪽에서 태반 생검을 수집하였다. 이 샘플(1 g)을 인산염완충식염수(phosphate-buffered saline)로 세척하여 산모의 혈액 및 양수 오염을 제거하고, 액체 질소에서 급속냉동(snap-frozen)하고, 필요할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
(2) 게놈-규모의 DNA 메틸화 마이크로어레이
제조업체의 프로토콜에 따라 QIAamp 조직 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 태반 조직에서 게놈 DNA를 추출하였다. 태반 DNA는 EZ DNA 메틸화 키트(Zymo Research, Irvine, CA, USA)를 사용하여 소듐 바이설파이트 변환을 행하였다. 바이설파이트 변환된 DNA(bisulfite-converted DNA)(200 ng)를 Illumina HumanMethylationEPIC BeadChip(Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)(850K 어레이)에 혼성화하였으며, 이는 샘플당 > 850,000 CpG 메틸화 부위를 포함하는 전체 게놈 범위를 제공한다. 증폭, 혼성화, 세척, 라벨링 및 850K 어레이의 스캐닝은 마크로젠(서울, 한국)에서 수행하였다.
데이터(raw data)는 R 워터멜론 패키지(R watermelon package)를 사용하여 각 샘플에 대하여 각 CpG에 대한 β 값으로 추출하였다. 상기 β 값은 어레이 상에서 음성 대조군을 사용하여 배경을 빼고, 메틸화된 신호 강도와 메틸화된 신호 및 메틸화되지 않은 신호의 합에 대한 비율을 취하여 계산하였다. 0 내지 1의 β 값을 각 CpG 부위에 대하여 보고하였으며, 이는 0 내지 100%까지 메틸화 백분율과 관련된다. Illumina 어레이 데이터 분석을 위한 품질 관리(quality control) 단계로서, 모든 샘플에서 스튜던트 t 테스트(Student's t test)에서의 검출 P 값이 > 0.05인 프로브를 제거하였다. 성 염색체 및/또는 알려진 단일 염기 다형성에 매핑된 프로브는 분석에서 제거하였다.
그룹 간의 DMCs는 평균 DNA 메틸화 수준 차이(델타 베타, Δβ) 비교 및 유의성 분석을 기반으로 동정하였다. 후보 유전자의 최종 세트는 거짓 발견률(false discovery rates, FDR) ≤ 0.05, |Δβ| > 0.2 (DNA 메틸화에서 > 20% 차이를 나타냄) 및 스튜던트 t 테스트에 의한 P 값 < 0.05로 구성하였다.
(3) DMCs의 메틸화-특이적 정량적 실시간 PCR
850K 어레이의 메틸화 수준을 메틸화 특이적 제한 효소(methylation specific restriction enzyme, MSRE)를 사용하여 실시간 PCR로 확인하였다. 850K 어레이에 사용된 샘플을 메틸화-특이적 정량적 실시간 PCR에 사용하였다. 사용된 PCR 프라이머의 서열 및 PCR 조건(총 20 ㎕로 수행)은 하기 표 1 및 표 2와 같다.
표적 DMCs 서열번호 프라이머 서열 Tm(℃) 증폭(bp)
cg14543412
cg16070018
cg24440941
cg22339775		 16 정방향 TTG GGA CTG AGC AGA GTG TG 59.55 201
17 역방향 GGG AGC AGA GTC AGG AGA 60.61
표적 DMCs 단계 Tm(℃) 시간 사이클 콤포넌트 양
cg14543412
cg16070018
cg24440941
cg22339775		 전변성 95 30초 - TB Green Premix Ex Taq II 10 ㎕
변성 95 5초 40
사이클		 정방향/역방향 프라이머 각각 10 pmol
어닐링/연장 58 35초 ROX Reference Dye II 0.4 ㎕
Melting* 75-95 - 주형 약 10 ng
* 10초 동안, 0.2℃씩 증가
DMC 메틸화 수준의 분석을 위하여, 델타(Δ) 역치 주기(Ct) 값은 ΔCt = CtMSRE - Ctinput으로 계산하였다. ΔCt 값이 작을수록 표적 유전자의 메틸화 수준이 높아진다.
(4) 통계 분석
데이터는 평균 및 표준 편차로 표시하고, 카테고리 변수는 비율 및 개수로 표시하였다. 시험 그룹의 메틸화 수준은 Kruskal-Wallis 테스트에 이어 다중 비교를 위한 사후 Bonferroni 보정 테스트(post hoc Bonferroni correction test)와 두 그룹 간의 비교를 위한 Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 비교하였다. P 값 < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 통계 분석은 Social Sciences version 25.0(SPSS Inc. Chicago, IL, USA)을 사용하여 수행하였다. 본 연구의 통계적 검정력은 G*Power program 3.1.9.2(Heinrich-Heine-Universitat, Dusseldorf, Germany)의 사후 분석을 사용하여 계산하였다. 유효 크기 0.8을 기준으로, 본 연구에 사용된 샘플 크기는 양측 α 오류 0.05에서 > 90% 검정력을 갖는다.
2. 시험결과
(1) 시험 그룹의 임상 특성
시험군의 임상적 특성은 하기 표 3과 같다. 산모의 연령, 임신전 체질량지수, 임신력, 임신 초기 혈압은 세 군 간에 차이가 없었다. 그러나, 대조군에 비해 PE를 갖는 두 하위 그룹에서 초산 백분율 및 임신 중 최고 혈압이 증가하였다. 단백뇨는 PE 그룹에서만 검출되었다. 최고 혈압, 단백뇨, 혈소판 수 및 혈청 크레아티닌 수치에 관해서는 PE의 두 하위 그룹 간에 차이가 없었다. 간 트랜스아미나제의 증가된 수준이 2명의 중증 PE 임신부에서 관찰되었다. 출산(pregnancy outcome)에서, 분만 시 재태 연령은 대조군에 비해 중증 PE에서 더 낮았다. 출생 체중과 태아 성장 백분율도 다른 군들보다 중증 PE에서 더 낮았다. 따라서 신생아 중환자실 입원 비율은 다른 그룹에 비해 중증 PE 그룹에서 더 높았다. 태아의 성비는 모든 시험 그룹에서 다르지 않았다.
특성 대조군(n = 13) PE (n = 5) 중증 PE (n = 8)
산모 연령 (년) 35.7 ± 4.2 37.4 ± 5.0 35.6 ± 2.1
임신 전 체질량 지수 (kg/m2) 24.1 ± 3.5 23.7 ± 4.3 24.8 ± 4.4
임신력 (n) 2.3 ± 0.9 1.8 ± 0.8 1.9 ± 0.6
초산율 (nulliparous) (%) 46.2 (6/13) 60 (3/5) 87.5 (7/8)
혈압 및 단백뇨
임신 시 SBP(mmHg)* 111.4 ± 10.9 127.2 ± 10.9 123.9 ± 14.1
임신 시 DBP(mmHg)** 64.9 ± 12.1 78.4 ± 4.2 74.8 ± 8.7
최고 SBP(mmHg)* 122.5 ± 8.7 151.2 ± 7.2 155.0 ± 6.7
최고 DBP(mmHg)** 72.2 ± 7.4 93.4 ± 6.6 97.3 ± 5.9
단백뇨(딥스틱 결과) 0 2.4 ± 0.9 1.9 ± 0.4
출산
분만 시 재태 연령(주) 38.8 ± 1.2 38.4 ± 1.9 35.8 ± 2.4
37주 미만 출산(%) 0 (0/13) 0 (0/5) 62.5 (5/8)
출생 체중(kg) 3.3 ± 0.3 3.1 ± 0.5 2.0 ± 0.5
태아 성장 백분율 46.7 ± 6.3 42.4 ± 7.4 5.4 ± 4.1
신생아 중환자실 입원 비율(%) 0 (0/13) 40 (2/5) 87.5 (7/8)
남성 태아(Male infant)(%) 46.2 (6/13) 20 (1/5) 62.5 (5/8)
* SBP: 수축기 혈압(systolic blood pressure)
** DBP: 이완기 혈압(diastolic blood pressure)
(2) PE 태반의 전체 게놈에서 DNA 메틸화의 변화
태반의 메틸화 프로파일은 세 가지 비교 그룹에서 별도로 비교되었다: PE 대 대조군, 중증 PE 대 대조군, PE 대 중증 PE. 총 398개의 DMCs가 확인되었다: 대조군에 비하여, PE에서 243개(51.9% 저(hypo) DMCs, n = 126, 48.1% 고(hyper) DMCs, n = 117) 및 중증 PE에서 155개(47.7% 고 DMCs, n = 74 및 52.3% 저 DMCs, n = 81)(도 1). 이 중 12개의 과메틸화된 DMCs와 3개의 저메틸화된 DMCs가 중증 유무에 관계없이 PE에서 공통적으로 관찰되었다(도 2). 대조군과 비교하여 PE에서 유의성 있는 차이(Δβ > 0.2)를 나타내는 과메틸화된 DMCs의 CpG 부위(즉, 프로브 ID)에 대한 마이크로어레이 분석 결과는 표 4와 같으며, 대조군과 비교하여 PE에서 유의성 있는 차이(Δβ < -0.2)를 나타내는 저메틸화된 DMCs의 CpG 부위(즉, 프로브 ID)에 대한 마이크로어레이 분석 결과는 표 5와 같다. 대조군과 비교하여 중증 PE에서 유의성 있는 차이(Δβ > 0.2)를 나타내는 과메틸화된 DMCs의 CpG 부위(즉, 프로브 ID)에 대한 마이크로어레이 분석 결과는 표 6과 같으며, 대조군과 비교하여 중증 PE에서 유의성 있는 차이(Δβ < -0.2)를 나타내는 저메틸화된 DMCs의 CpG 부위(즉, 프로브 ID)에 대한 마이크로어레이 분석 결과는 표 7과 같다. 즉, 상기 12개의 과메틸화된 DMCs는 cg04502985, cg14543412, cg16070018, cg24440941, cg22339775, cg08317794, cg22324103, cg24836826, cg11144986, cg04823299, cg00979438, 및 cg20772657이다(표 4 및 표 6). 또한, 상기 3개의 저메틸화된 DMCs는 cg22499381, cg12342501, 및 cg10288111이다(표 5 및 표 7).
PE에서 과메틸화된 DMCs 중 중증도에 관계없이 PE에서 공통적인 메틸화 차이를 보이는 DMCs (대조군과 비교)
No Probe ID P value 대상자 Δβ>0.2 CHR* MAPINFO
대조군 PE
1 cg04502985 0.039 0.273 0.497 0.224 5 77268452
2 cg14543412 0.016 0.108 0.310 0.202 6 26224100
3 cg16070018 0.006 0.173 0.409 0.236 6 26224392
4 cg24440941 0.029 0.175 0.379 0.204 6 26224668
5 cg22339775 0.022 0.256 0.468 0.212 6 26224925
6 cg08317794 0.017 0.575 0.811 0.236 11 131925126
7 cg22324103 0.006 0.667 0.884 0.217 11 133175639
8 cg24836826 0.031 0.648 0.946 0.298 12 124929963
9 cg11144986 0.001 0.612 0.871 0.260 12 132935765
10 cg04823299 0.000 0.541 0.905 0.364 14 24098569
11 cg00979438 0.014 0.452 0.881 0.429 16 73199845
12 cg20772657 0.005 0.618 0.826 0.208 18 73638846
* CHR: 염색체(chromosome) 번호
PE에서 저메틸화된 DMCs 중 중증도에 관계없이 PE에서 공통적인 메틸화 차이를 보이는 DMCs (대조군과 비교)
No Probe ID P value 대상자 Δβ<-0.2 CHR* MAPINFO
대조군 PE
1 cg22499381 0.000 0.876 0.635 -0.242 1 11024967
2 cg12342501 0.025 0.766 0.404 -0.363 2 8530521
3 cg10288111 0.007 0.859 0.566 -0.293 7 112062682
* CHR: 염색체(chromosome) 번호
중증 PE에서 과메틸화된 DMCs 중 중증도에 관계없이 PE에서 공통적인 메틸화 차이를 보이는 DMCs (대조군과 비교)
No Probe ID P value 대상자 Δβ>0.2 CHR* MAPINFO
대조군 중증 PE
1 cg04502985 0.014 0.273 0.502 0.229 5 77268452
2 cg14543412 0.003 0.108 0.361 0.253 6 26224100
3 cg16070018 0.001 0.173 0.434 0.261 6 26224392
4 cg24440941 0.003 0.175 0.456 0.281 6 26224668
5 cg22339775 0.001 0.256 0.554 0.298 6 26224925
6 cg08317794 0.001 0.575 0.826 0.251 11 131925126
7 cg22324103 0.001 0.667 0.876 0.210 11 133175639
8 cg24836826 0.034 0.648 0.893 0.245 12 124929963
9 cg11144986 0.000 0.612 0.855 0.243 12 132935765
10 cg04823299 0.000 0.541 0.753 0.212 14 24098569
11 cg00979438 0.036 0.452 0.750 0.298 16 73199845
12 cg20772657 0.001 0.618 0.818 0.200 18 73638846
* CHR: 염색체(chromosome) 번호
중증 PE에서 저메틸화된 DMCs 중 중증도에 관계없이 PE에서 공통적인 메틸화 차이를 보이는 DMCs (대조군과 비교)
No Probe ID P value 대상자 Δβ<-0.2 CHR* MAPINFO
대조군 중증 PE
1 cg22499381 0.005 0.876 0.575 -0.301 1 11024967
2 cg12342501 0.037 0.766 0.527 -0.239 2 8530521
3 cg10288111 0.005 0.859 0.625 -0.234 7 112062682
* CHR: 염색체(chromosome) 번호
(3) 메틸화-특이적 정량적 실시간 PCR에 의한 마이크로어레이 분석 검증
DMCs의 마이크로어레이 결과를 확인하기 위하여, 두 개 이상의 연속 DMCs 및 MSRE 인식 부위를 포함하는 DNA 영역을 선택하였다. 이 중, 질병의 중증도와 상관없이 PE에서 HIST1H3E의 과메틸화된 DMC 영역(cg14543412, cg16070018, cg24440941, cg22339775)을 최종적으로 선별하여, 메틸화-특이적 정량적 실시간 PCR을 사용하여 이들의 DNA 메틸화 패턴을 확인하였다. HIST1H3E의 ΔCt 값은 대조군보다 두 PE 하위 그룹에서 유의하게 낮았다. 이는 이 DMC 영역이 대조군에 비해 PE 및 중증 PE 모두에서 유의하게 과메틸화되었음을 나타낸다(표 8).
3. 고찰
본 연구에서 본 발명자들은 정상, PE, 및 중증 PE 임신부의 태반에서 DNA 메틸화 프로파일링을 마이크로어레이 분석을 통해 수행하였고, 질환의 중증도에 관계없이 DNA 메틸화의 상이한 패턴을 보이는 DMCs를 발굴하였다. 이들의 메틸화 정도는 메틸화-특이적 실시간 PCR로 검증되었고, 결과는 마이크로어레이 분석의 결과와 일치하였다. 이 중 HIST1H3E의 과메틸화된 DMC 영역(cg14543412, cg16070018, cg24440941, cg22339775)은 PE에서 중요한 잠재력을 가지고 있는 것으로 나타났다. 이는 히스톤 H3 계열의 구성원인 복제-의존 히스톤을 코딩하며, 트랜스크립트(Transcripts)는 메틸화 부위를 갖는 회문 종결 요소(palindromic termination element)를 포함한다. 관련 경로 중 활성화된 PKN1은 안드로겐 수용체-조절 유전자 KLK2 및 KLK3의 전사와 면역계에서 사이토카인 신호전달을 자극한다. 그러나 HIST1H3E가 PE와의 상호 작용에 의해 조절되는 정확한 메커니즘은 아직 결정되어 있지 않다. 본 연구에서 본 발명자들은 HIST1H3E의 TSS1500 영역이 질환의 중증도와 관계없이 PE에서 과메틸화된다는 것을 발견하였다. PE에서 HIST1H3E의 이러한 후성학적 변화는 관련 유전자의 조절 오류로 생성된 PE의 병태생리에 대한 추가적인 통찰을 제공할 수 있다.
<110> SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION <120> Analytical method for diagnosing preeclampsia using methylation levels of CpG sites <130> PN0973 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID: cg04502985 <400> 1 cggcgggact cccatgcgcc gagggaccca agtctccact ccacccacac 50 <210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID: cg14543412 <400> 2 tttcccctcc ctggaggacg ggggctccag catattcatg atgtcaatcg 50 <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID: cg16070018 <400> 3 ttcttaaaga atgacattac agcctaacac tattgtgaat taacctatcg 50 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID: cg24440941 <400> 4 actgcgccat tgttgtctta cagagaaaca accttctaac actctcttcg 50 <210> 5 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID: cg22339775 <400> 5 cgaggaatca ttgagagata cttaggcaac ggattttaaa tgagtgaata 50 <210> 6 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID: cg08317794 <400> 6 tcacttgaac accttttatt ggcactaaat ttgttttagg ataatgaacg 50 <210> 7 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID: cg22324103 <400> 7 aataattaat aactatgcat gttcccagag catcctggga cctccttccg 50 <210> 8 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID: cg24836826 <400> 8 tgcagcaggg gacaccagca gcgcccgaag caggtggcgg tgggagggcg 50 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID: cg11144986 <400> 9 cgcagaggcg gctgctgtcc acatccacgg gactcgcaga tgagactcac 50 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID: cg04823299 <400> 10 agcaaattga tgagatgcac tgaaaactgc aacacctgca gcaggcatcg 50 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID: cg00979438 <400> 11 cgactgtggg cctaataaca ggtttatgta atttaatgag cagaaatatg 50 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID: cg20772657 <400> 12 cgccaggtag gacagacacc gactaaagtg aagatagcat ggcactttgc 50 <210> 13 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID: cg22499381 <400> 13 ggaattttat gtctcataaa cccagccttg gctgggcttg gtggctcacg 50 <210> 14 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID: cg12342501 <400> 14 cggaggacat agtccacgtt aaataaatga cagcgactgc tgtttcactg 50 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID: cg10288111 <400> 15 atgcccttgg attgcacagg caagattagg aaattaataa catagttgcg 50 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 ttgggactga gcagagtgtg 20 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 gggagcagag tcaggaga 18

Claims (1)

  1. 임신중독증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 체외로 분리된 산모의 태반 시료 중 cg22499381의 CpG 부위의 저메틸화 여부를 메틸화-특이적 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응에 의하여 측정하는 단계를 포함하는 분석방법.
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