KR20240058212A - 곡물 맥아의 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용, 염증 또는 암의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

곡물 맥아의 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용, 염증 또는 암의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항산화용, 염증 또는 암의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로 곡물 맥아의 부산물 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 항산화 효과가 우수하며, 염증 또는 암을 개선, 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, 독성이 없으므로 식품의 형태로 섭취할 수 있다.

Description

곡물 맥아의 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용, 염증 또는 암의 개선, 예방 또는 치료용 조성물{A composition for anti-oxidant, anti-inflammatory or anti-cancer containing extract of malt by-product}
본 발명은 곡물 맥아의 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하여 항산화용으로 사용할 뿐만 아니라, 염증 또는 암을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
활성산소는 대부분 불안정하여 전자를 잃거나 얻어서 보다 안정된 상태로 가려는 성질이 있으며 이들의 높은 반응성은 생체내에서 산화적 손상을 일으킨다. 생체의 산화반응 과정 중에 생성되는 활성산소들은 체내의 SOD(superoxide dismutase), 카탈라아제(catalase), 글루타치온 산화효소(glutathione peroxidase)와 같은 항산화 효소에 의해 제거되지만, ROS(reactive oxygen species)는 지질과산화, 단백질산화, 단백질 분해효소의 활성화, DNA산화와 같은 손상을 야기한다. 이러한 손상의 결과로 고혈압, 당뇨병, 아토피성 피부염, 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환이 발생하게 된다. 이와 같은 과량의 ROS로 인한 산화적 스트레스가 항산화 물질에 의해 감소하는 것이 알려지면서 항산화 물질을 개발하기 위한 연구들이 지속적으로 이루어지고 있으며, 합성 항산화제의 부작용이 증가함에 따라 천연물 유래의 항산화제에 관한 연구가 더욱 활발히 진행되고 있다.
한편, 염증(inflammation)은 병원체의 침입 또는 손상된 조직 제거를 개시하기 위해 상처부위에 대해 나타나는 지역적인 반응이다. 염증의 긍정적인 역할에도 불구하고 인간질병을 위한 가장 일반적인 발병 메커니즘의 하나가 되었다. 활성화된 백혈구(monocytes) 및 대식세포에 의한 산화질소(NO)의 생성이 강력한 염증 반응을 개시하고, 세균 병원체에 대한 초기 면역반응에서 가장 중요한 부분이 된다(Bogdan C., Nat. Immunol., 2:907, 2001).
염증 반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상을 나타낸다. 정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능 회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 이끈다.
한편, 암(악성 종양)은 현대사회에서 사망률 1위를 차지하는 주요 질병으로서 현재까지 많은 연구에도 불구하고 획기적인 치료법이 없는 실정이다. 암의 치료에 있어 항암제와 같은 화학요법제를 이용한 치료는 어느 정도 효과를 거두고는 있으나 암의 다양한 발병기작과 항암제 내성 발현으로 인하여 많은 연구가 요구되고 있다.
최근 수십 년간 진단과 치료기술의 발달로 암치료에 대해 제한적으로나마 치료율의 향상과 기능적 보존이라는 긍정적인 결과를 얻기도 했지만 많은 진행성 암에 있어서 5년 생존율은 5 내지 50%에 맴돌고 있다. 이러한 암은 공격적인 침습, 림프절전이, 원격전이와 이차 암의 발생이 특징이라 할 수 있는데 일부 암에 있어서는 다양한 연구와 치료에도 불구하고 지난 20년간 생존율이 크게 변하지 못한 상태이다. 최근에는 이러한 암에 대해 분자 생물학적인 접근을 통해 치료효과를 높이려는 시도가 많아지고, 암의 증식, 전이와 세포사멸과 관련된 표적치료에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
따라서, 부작용 없이 체내의 항산화 활성을 강화시키고 염증 반응을 예방할 수 있으며, 항암 효과를 나타내는 천연물 유래 소재가 요구되고 있다.
대한민국 공개특허 제2021-0021366호 일본 공개특허 제2016-0064992호
본 발명의 목적은 곡물 맥아의 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하여 항산화용으로 사용할 뿐만 아니라, 염증 또는 암을 개선 또는 예방할 수 있는 식품 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 곡물 맥아의 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하여 항산화용으로 사용할 뿐만 아니라, 염증 또는 암을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 항산화용, 염증 또는 암의 개선 또는 예방용 식품 조성물은 곡물 맥아의 부산물 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
상기 곡물 맥아의 부산물은 곡물 맥아를 제조 시 맥아에서 분리되는 뿌리, 옆아(acrospire) 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 혼합물은 뿌리 및 옆아가 1 : 0.5-1의 중량비로 혼합된 것일 수 있다.
상기 곡물 맥아의 부산물 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 에틸렌글리콜, 에틸에테르 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것일 수 있다.
상기 탄소수 1 내지 4의 저급알코올은 20 내지 80%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올일 수 있다.
상기 곡물 맥아의 부산물 추출물은 20 내지 50 kHz의 진동수 및 50 내지 2000 W의 파워의 초음파기로 5 내지 15시간 동안 30 내지 70 ℃ 하에서 처리될 수 있다.
상기 식품 조성물은 위암, 대장암, 폐암, 간암, 담관암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 방광암 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 암을 개선 또는 예방할 수 있다.
상기 곡물 맥아의 부산물은 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 쌀 및 귀리로 이루어진 군에서 선택된 1종의 곡물로부터 수득될 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 항산화용, 염증 또는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 곡물 맥아의 부산물 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
상기 곡물 맥아의 부산물은 곡물 맥아를 제조 시 맥아에서 분리되는 뿌리, 옆아(acrospire) 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 약학 조성물은 위암, 대장암, 폐암, 간암, 담관암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 방광암 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 암을 예방 또는 치료할 수 있다.
상기 곡물 맥아의 부산물 추출물은 20 내지 50 kHz의 진동수 및 50 내지 2000 W의 파워의 초음파기로 5 내지 15시간 동안 30 내지 70 ℃ 하에서 처리될 수 있다.
본 발명의 곡물 맥아 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용, 염증 또는 암의 개선, 예방 또는 치료용 조성물은 독성이 없으며, 항산화 효과가 우수하고 염증 또는 암에 대한 개선, 예방 또는 치료 효과가 매우 뛰어나 경쟁력 있는 식품 조성물 및 약학 조성물의 제조에 효과적이다.
도 1은 통밀(W), 침지 밀(S1, S2), 발아밀(G1-G4) 및 맥아(M)의 순으로 변화하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)과 맥아 추출물(M, 비교예 1) 간의 판별 분석(OPLS-DA)을 사용한 잠재 구성 요소에 대한 직교 투영의 쌍별 비교로서, 도 2a는 1H NMR 스펙트럼에서 파생된 OPLS-DA 점수이고, 도 2b는 로딩 플롯 그래프이다.
도 3은 본 발명의 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)과 맥아 추출물(M, 비교예 1) 간의 당류, 아미노산 및 유기산의 함량을 나타낸 그래프이다.
도 4a 내지 도 4d는 본 발명의 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1) 및 맥아 추출물(M, 비교예 1)로부터 측정된 TPC, TFC, TEAC 및 ORAC를 각각 나타낸 그래프이다.
본 발명은 곡물 맥아의 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하여 항산화용으로 사용할 뿐만 아니라, 염증 또는 암을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 곡물 맥아의 부산물은 곡물로부터 맥아를 제조 시 맥아에서 분리되는 뿌리, 옆아(acrospire) 또는 이들의 혼합물로서, 밀싹과 같은 곡물의 싹을 포함하지 않는다.
구체적으로, 상기 뿌리 및 옆아는 곡물의 일 부분에서 성장하여 영양분을 흡수하는 것과 달리, 싹은 곡물의 다른 부분에서 상기 뿌리 및 옆아가 성장한 후 자라기 시작하여 지상부를 향하여 성장하는 것으로서, 상기 뿌리 및 옆아와, 싹은 서로 다른 종류이며 본 발명에서는 싹을 포함하지 않는다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 항산화용으로 사용할 뿐만 아니라, 염증 또는 암을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물은 곡물 맥아의 부산물 추출물을 유효성분으로 함유한다.
상기 곡물 맥아는 통제된 조건에서 발아된 곡물을 건조시켜 제조된 것으로서, 주로 양조에 사용되며 2018년 세계 맥아 원료 시장에서 맥아의 시장 규모는 198억 달러로 평가되었다. 맥아를 생산할 수 있는 곡물로는 맥아를 생산할 수 있다면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 쌀 및 귀리로 이루어진 군에서 선택된 1종을 들 수 있다.
일반적으로 맥아가 제조되는 과정은 침지, 발아 및 킬닝(kilning, 맥아를 건조시키는 과정)의 세 부분으로 구성된다. 상기 침지는 곡물의 수분 함량을 증가시키는 작업으로서 흡수 곡물(imbibition kernel)이 배아의 호흡을 자극시키고 배유에 저장된 성분을 수화시킨다. 특히, 천연 식물 호르몬(예: 지베렐린)은 배아에서 새싹으로 성장시키는데 도움이 될 수 있다. 또한, 상기 발아는 효소 형성 및 해당 구성 요소의 분해를 위한 뿌리 및 옆아(acrospire)를 형성시키기 위해 며칠 동안 수행된다. 상기 발아는 세포벽뿐만 아니라 단백질과 전분 화합물이 더 작은 분자로 분해 및 변형되는 것을 포함하여 여러 복잡한 생리 활성 절차에 의해 유발된다. 마지막으로, 상기 킬닝은 발아된 곡물을 3~5%의 수분 함량으로 건조시켜 맥아를 제조함으로써 안정성을 확보하고 생화학적 반응을 지연시킨다.
본 발명에서 사용되는 맥아 부산물은 뿌리 및 옆아가 존재하는 발아된 곡물을 킬링 과정에서 건조 시 맥아가 제조되면서 상기 뿌리 및 옆아(맥아 부산물)가 분리되는데, 이때 분리된 뿌리 및 옆아(맥아 부산물)를 의미한다. 상기 맥아 부산물을 맥아로부터 분리하는 방법은 자연적으로 분리되거나 수동적으로 분리할 수 있다.
구체적으로, 상기 본 발명의 맥아 부산물을 형성되는 과정을 도 1을 참조하여 설명하면 다음과 같다.
곡물(W)을 물에 침지시킨 곡물(S1, S2)에서는 뿌리 및 옆아가 발생하지 않았지만, 상기 물에 침지시킨 곡물을 발아(G1 내지 G4)시키면서 점차 뿌리 및 옆아가 성장하기 시작한다. 발아가 완료되면 상기 발아된 곡물을 건조시켜 뿌리 및 옆아(맥아 부산물)가 제거된 맥아(M)를 수득할 뿐만 아니라, 건조과정에서 제거된 상기 뿌리 및 옆아(맥아 부산물)도 수득된다.
상기 맥아로부터 분리된 뿌리 및 옆아는 각각 단독으로 사용되거나 혼합하여 사용될 수 있는데, 뿌리 및 옆아를 혼합하여 사용하는 것이 뿌리 또는 옆아를 단독으로 사용하는 경우에 비하여 항산화, 항염 또는 항암 효과가 1.5-3배 더욱 우수하다.
상기 뿌리 및 옆아의 혼합물은 뿌리 및 옆아가 1 : 0.5-1의 중량비, 바람직하게는 1 : 0.6-0.8의 중량비로 혼합된 것이다. 뿌리를 기준으로 옆아의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 항산화, 항염 또는 항암 효과가 저하될 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 효과가 증대되지 못할 수 있다.
본 발명의 맥아 부산물 추출물은 추출용매 하에서 초음파처리를 통해 추출되는 것으로서, 구체적으로 맥아 부산물과 추출용매가 1 : 5 내지 35의 중량비, 바람직하게는 1 : 20 내지 30의 중량비로 혼합되어 20 내지 50 kHz, 바람직하게는 20 내지 40 kHz의 진동수 및 50 내지 2000 W, 바람직하게는 150 내지 800 W 파워의 초음파기로 30 내지 70 ℃, 바람직하게는 40 내지 50 ℃ 하에서 5 내지 15시간, 바람직하게는 6 내지 10시간 동안 처리된다.
맥아 부산물을 추출 시 초음파 추출이 아니라 열수 추출, 용매 추출 또는 침지 추출인 경우에는 유효성분이 소량 추출될 뿐만 아니라 항산화 효과 또는 염증 또는 암의 개선, 예방 또는 치료 효과가 낮을 수 있다.
상기 맥아 부산물과 추출용매의 중량비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 추출물에 맥아 부산물의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있다.
또한, 초음파기의 진동수 및 파워가 상기 하한치 미만인 경우에는 맥아 부산물의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 유효물질의 열분해, 중합 또는 유효성분 외에 다른 물질도 다량으로 추출되어 효과가 저하될 수 있다.
또한, 추출온도가 상기 하한치 미만인 경우에는 맥아 부산물의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 맥아 부산물로부터 추출되는 성분이 변성될 수 있다.
상기 추출물을 추출하는 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 에틸렌글리콜, 에틸에테르 또는 이들의 혼합용매이다. 상기 저급알코올로는 20 내지 80%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올을 들 수 있다.
상기 추출용매로는 특별히 한정하는 것은 아니지만 20 내지 80%의 에탄올 수용액으로 추출된 추출물이 우수한 항산화 효과 또는 염증 또는 암의 개선, 예방 또는 치료에 바람직하게 작용한다.
본 명세서에서 맥아 부산물을 언급하면서 사용되는 용어 ‘추출물’은 추출용매를 처리하여 얻은 조추출물뿐만 아니라 맥아 부산물 추출물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 맥아 부산물 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 맥아 부산물 추출물은 광의로는 맥아 부산물을 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 맥아 부산물 추출물 가공물, 예컨대, 맥아 부산물 추출물 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 맥아 부산물로 실험을 진행하긴 하였으나, 맥아 부산물 가공물과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상가능할 것이다.
한편, 본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 함유하는’이란 맥아 부산물 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 일예로, 상기 맥아 부산물 추출물은 10 내지 1500 ㎍/㎖, 바람직하게는 100 내지 1000 ㎍/㎖의 농도로 사용된다. 맥아 부산물 추출물은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 맥아 부산물 추출물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 맥아 부산물 추출물은 항염증 활성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 "항염증 활성"은 염증을 억제하는 모든 작용을 포함하는 것을 의미하며, 일반적으로 염증의 예방, 치료 또는 개선을 의미한다. 염증 반응은 생체 내 복구 체계의 증강 및 손상을 감소시키기 위하여 야기되는데, 그 정도가 심하거나 오랜 기간 지속되면 세포의 손상이 야기되어 다양한 염증성 질환이 발병될 수 있다. 구체적으로 염증 관련 매개물질 또는 활성산소(ROS)의 생성을 억제하는 것일 수 있고, 상기 염증 관련 매개물질은 NO(nitric oxide)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 염증성 질환의 예로는 염증성 장질환, 크론병, 궤양성 대장염, 염증성 피부 질환, 다발성 경화증, 췌장염, 천식, 비염, 낭포성 섬유증, 기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 루게릭병, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 류마티스성 다발성근육통, 관절세포동맥염, 척추측만증, 혈색소증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 배체트병, 전신성 홍반성 루푸스, 패혈증, 다발성 장기부전, 류마티스성 관절염, 접촉성 피부염, 아토피 피부염, 건선, 부비동염, 결핵, 과민대장 증후군, 만성피로 증후군, 파키슨병, 갑상선염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 맥아 부산물 추출물은 항암 활성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 "항암 활성"은 암을 억제하는 모든 작용을 포함하는 것을 의미하며, 일반적으로 암의 예방, 치료 또는 개선을 의미한다.
암 질환의 예로는 위암, 대장암, 폐암, 간암, 담관암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 방광암 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 맥아 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용, 염증 또는 암의 개선, 예방 또는 치료용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 맥아 부산물 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 맥아 부산물 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명은 상기 맥아 부산물 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용, 염증 또는 암의 개선, 예방 또는 치료용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 맥아 부산물 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 맥아 부산물 추출물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 항산화용, 염증 또는 암의 개선, 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 맥아 부산물 추출물의 용도를 제공한다. 상기한 바와 같이 맥아 부산물 추출물은 항산화용, 염증 또는 암의 개선, 예방 또는 치료를 위한 용도로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 맥아 부산물 추출물을 투여하는 것을 포함하는 항산화용, 염증 또는 암의 개선, 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 목단피, 백복령, 택사 및 단삼의 혼합 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.001 g/kg 내지 10 g/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 맥아 부산물 추출물을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
제조예 1. 맥아 및 맥아 부산물의 제조
밀맥아 및 밀맥아 부산물을 제조하기 위하여, 24시간 간격으로 총 9점을 수집하였다. 구체적으로 통밀(W, Triticum aestivum L.), 1일 동안 침지한 통밀(S1), 2일 동안 침지한 통밀(S2), 침지시킨 밀을 1일 동안 발아시킨 통밀(G1), 2일 동안 발아시킨 통밀(G2), 3일 동안 발아시킨 통밀(G3), 4일 동안 발아시킨 통밀(G4), 발아시킨 통밀을 건조시킨 후 뿌리 및 옆아를 제거한 밀맥아(M) 및 상기 제거된 뿌리 및 옆아(R, 맥아 부산물)를 수득하였다.
상기 맥아 및 맥아 부산물의 제조는 마이크로 맥아제조 시스템(MMSG; Custom Laboratory Products, Milton Keynes, UK)을 사용하여 수행되었으며, 통밀 샘플은 무작위 배치로 6회 반복하여 준비된 천공 스테인리스 스틸 케이지에 500 g 분취량으로 고르게 분배하였다. 인큐베이션은 등온(15 ℃) 및 등습(상대 습도 > 90%) 조건의 챔버에서 수행되었으며, 온도, 시간, 상대습도 조건은 MEBAK® 2.5.3.1: barley malting scheme(MEBAK®, 1997)을 참조하여 결정되었다. 이에, 발아는 습식-건식-습식-건식-습식(19-5-19-4-1시간)이 반복된 습-건식 사이클로 96시간 동안 수행되었다. 발아가 완료되면, 건조장치로 옮기서 미리 정해진 프로그램 온도(50 ℃에서 21시간, 60 ℃에서 1시간, 70 ℃에서 1시간, 80 ℃에서 1시간)에서 건조되었다. 맥아 부산물(뿌리 및 옆아)는 건조가 끝날 때 맥아로부터 수동으로 제거되었다.
실시예 1. 맥아 부산물 추출물
상기 제조예 1에서 수득한 뿌리 및 옆아의 혼합물(1 : 0.7의 중량부)과 70% 에탄올 수용액을 1 : 30의 중량비로 혼합하여 초음파기(VCX-750(Sonics & Materials, Newtown, USA)에 투입 후 40 ℃에서 초음파(20 kHz, 750 W)를 이용하여 8시간 동안(10초 간격으로 펄스 온/오프) 추출한 다음 상등액을 수집하여 회전 증발기로 에탄올을 제거함으로써 맥아 부산물 추출물을 수득하였다.
비교예 1. 맥아 추출물
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 맥아 부산물 대신 상기 제조예 1에서 수득한 맥아를 이용하여 맥아 추출물을 수득하였다.
<시험예>
통계 분석
모든 실험결과는 평균 ± 표준오차로 표시하였고, XLSTAT 버전(2019.4.2., Addinsoft Inc., 파리, 프랑스)를 사용하였다.
시험예 1. 대사산물 변화 측정
실험방법은 100 μg 분말의 시료를 0.0002% 소듐 트리메틸실릴 프로피오네이트를 포함하는 메탄올-d4와 중수소수(D2O)의 혼합물에 용해한 후 상온에서 20분간 초음파 처리한 다음 10 ℃, 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 그런 다음, 분석을 위해 상층액(600 μL)을 분리하여 NMR 튜브로 옮겼다. 1H NMR 스펙트럼은 700.40 MHz 1H 주파수 및 298 K의 온도에서 작동하는 Bruker Avance 700 분광계(Bruker Biospin, Rheinstetten, Germany)를 사용하여 극저온 삼중 공명 프로브 및 Bruker 자동 주입기를 사용하여 획득하였으며, 시료의 1차원(1D) NMR 스펙트럼을 획득하기 위해 1D 핵 오버하우저 효과 분광법(NOESY) 펄스 시퀀스를 수행하여 잔류 수분 신호를 억제하는데 사용했다. 신호 또는 대사산물은 2차원(2D) 총 상관 분광법(TOCSY) 및 이핵 단일 양자 상관(HSQC) 및 스파이크 실험에 의해 수행되었다.
1H NMR 스펙트럼 절차 및 대사체 데이터 수집에서 모든 1D NMR 스펙트럼은 TOPSPIN 소프트웨어(Version 3.2, Bruker Biospin, Rheinstetten, Germany)를 사용하여 위상 및 기준선 왜곡에 대해 수동으로 수정한 다음 ASCII 형식 데이터를 MATLAB R2010b 소프트웨어(The Mathworks Inc., Natick, 매사추세츠, 미국)로 처리하였다. 전체 해상도 스펙트럼은 Savorani, Tomasi 및 Engelsen(2010)이 제안한 ico-shift 방법을 통해 정렬되었으며, 획득한 데이터 세트는 데이터 비닝 및 버킷팅 없이 다변수 통계 분석에 사용되었다. 그런 다음 1H NMR 스펙트럼의 공명 영역 '-0.5-0.5 ppm' 및 '4.74-4.90 ppm'을 제거하여 각각 sodium trimethylsilyl propionate 및 잔류 물에 해당하는 신호를 제외하였다.
도 2는 본 발명의 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)과 맥아 추출물(M, 비교예 1) 간의 판별 분석(OPLS-DA)을 사용한 잠재 구성 요소에 대한 직교 투영의 쌍별 비교로서, 도 2a는 1H NMR 스펙트럼에서 파생된 OPLS-DA 점수이고, 도 2b는 로딩 플롯 그래프이다.
도 2a 및 도 2b에 도시된 바와 같이, 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)에서는 트리고넬린(trigonelline), 포름산염(formate), 우리딘(uridine), 푸마레이트(fumarate), 우라실(uracil), 글루코오스(glucose), 베타인(betaine), 콜린(choline), GABA, 아스파라긴(asparagine), 알라닌(alanine), 트레오닌(threonine), 발린(valine), 아이소루신(isoleucine)이 풍부한 것을 확인하였다. 반면, 트립토판(tryptophan), 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 수크로오스(sucrose), 라피노오스(raffinose), 말토트리오스(maltotriose), 갈락토오스(galactose), 수크로오스(sucrose), 글루타민(glutamine), 글루타메이트(glutamate), 글루타민(glutamine), 지질(lipids), 2,3-부테인디올(2,3-butainediol) 및 류신(leucine)은 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1) 보다 맥아 추출물(M, 비교예 1)에서 더 높은 것을 확인하였다.
즉, 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)과 맥아 추출물(M, 비교예 1)은 대사산물의 함량이 서로 다르다는 것을 확인하였다.
시험예 2. 당류, 아미노산, 유기산 함량 측정
상기 시험예 1에서 측정한 NMR 스펙트럼의 피크를 이용하여 적분 면적을 기준으로 한 상대적인 양을 측정하였다.
도 3은 본 발명의 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)과 맥아 추출물(M, 비교예 1) 간의 당류, 아미노산 및 유기산의 함량을 나타낸 그래프이다.
전체적으로 왼쪽 그래프가 맥아 추출물(M, 비교예 1)이고, 오른쪽 그래프가 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)이며, *는 독립표본 t-검정(student's t-test)을 실시하여 p < 0.001 수준에서 두 시료 간에 유의성 있게 높은 양을 나타낸 시료에 표시하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 당류 중에서 말토트리오스(maltotriose), 라피노오스(raffinose), 갈락토오스(galactose), 자당(sucrose)이 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)보다 맥아 추출물(M, 비교예 1)에서 함량이 더 많았으며, 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)은 글루코오스(glucose)만 유의하게 맥아 추출물(M, 비교예 1) 보다 높은 것을 확인하였다.
또한, 아미노산 중에서 발린(valine), 이소류신(isoleucine), 알라닌(alanine), 트레오닌(threonine), GABA, 아스파라긴(asparagine) 및 메티오닌(methionine)은 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)이 맥아 추출물(M, 비교예 1)에 비하여 더 높은 것을 확인하였다. 반면, 루신(leucine), 글루타민(glutamine), 글루타메이트(glutamate), 티로신(tyrosine), 페닐알라닌(phenylalanine) 및 트립토판(tryptophan)은 맥아 추출물(M, 비교예 1)에 풍부하게 함유된 것을 확인하였다.
또한, 유기산(푸마레이트 및 포름산염)과 에탄올아민 대사물질(콜린 및 베타인)은 주로 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)에서 고농도로 관찰되었다.
본 발명의 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)에는 여러 아미노산과 유기산이 풍부한 것으로 확인되었으며, 특히 맥아 추출물(M, 비교예 1)에 비해 높은 GABA 및 아스파라긴 함량을 보이는 것을 확인하였다.
시험예 3. 항산화 활성 측정
3-1. 페놀산 측정
맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)과 맥아 추출물(M, 비교예 1)에 함유된 페놀 화합물의 잠재적인 기능적 특성은 방향족 수산기의 수소 원자를 자유 라디칼에 기증함으로써 항산화 물질로 작용하는 것으로 알려져 있다.
측정방법은 동결 건조된 시료(50 g)를 강화 강철 그라인딩 볼(No. 50.1090.00)이 장착된 Planetary Ball Mill(Pulverisette 5/4 classic line, Fritsch GmbH, Germany)에 의해 300 rpm에서 10분 동안 미세하게 분쇄시킨 후 분말 시료 1 g을 80% 냉각된 에탄올 15 mL로 10분 동안 3회 추출하였다. 그 후 3400 xg에서 10분 동안 원심분리한 다음 상등액을 SpeedVac 진공 시스템(Savant SPD131DDA, Thermo Scientific Inc., Waltham, MA, USA)을 사용하여 농축하고 건조 물질을 80% 메탄올로 최종 부피 5 mL로 재구성하였다. 이 부피는 유리 페놀 함량 측정에 사용되었다. 결합 추출(bound extraction)의 경우에는 잔류물을 염기 가수분해에 이어 산 가수분해로 순차적으로 가수분해한 후 염기 분해와 관련하여 증류수(5 mL), 메탄올(5 mL) 및 10 N 수산화나트륨(5 mL)을 유리 추출물(free extract)의 나머지 부분에 첨가하고 상기 혼합물을 주위 온도에서 16시간 동안 교반하였다. 그 후 6N 염산 적당량을 사용하여 혼합물의 pH를 pH 2로 조절한 후, 85 ℃에서 30분간 산가수분해를 수행하였다. 혼합 유기용액(디에틸에테르와 에틸아세테이트; 1:1, v/v)을 총 55 mL로 첨가하여 가수분해함으로써 페놀화합물을 유리시켰으며, 혼합물을 정확히 1분 동안 볼텍싱한 다음 3400 xg에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리한 추출물을 80% 메탄올로 최종 부피 5 mL로 재구성하여 결합된 페놀 화합물을 식별하는데 사용하였다. 각 추출물은 개별 페놀산, 항산화 특성 및 자유 라디칼 소거 테스트를 정량화하는데 사용되었다.
페놀산 조성의 정량화는 HPLC(Waters e2695 separation module, Waters Corporation, Milford, DE, USA)를 이용하였으며, ZORBAX Eclipse XDB-C18 컬럼(4.6 X 250 mm, 5 μm, Agilent Technologies, Inc., CA, USA)을 사용하였다. 구배 용리는 20분 내에 21%에서 22%, 10분 내에 22%에서 23%, 15분 내에 23%에서 55% 및 10분 내에 55%에서 21%로 프로그램되었으며, 유속은 1.0 mL/min이고 주입 부피는 10 μL이다. 개별 페놀산의 정량분석을 위해 각각의 페놀산 표준물질을 준비하였으며, 피크 면적의 증가와 머무름 시간을 비교하여 샘플의 피크를 식별하기 위해 스파이킹 및 외부 표준 방법이 사용되었다.
페놀산 함량은 건조 중량 기준(dwb)으로 시료 그램당 마이크로그램(μg/g)으로 표시되었다. 각 페놀산에 대한 표준 반응 곡선은 높은 상관 계수(R2 > 0.99)로 0-500 μg/mL의 8가지 농도 각각에서 얻은 값에 맞춰진 선형 회귀이다. 질량 기준의 정량화는 피크 면적을 기준으로 하였으며, 상대 표준 편차(RSD) 값은 피크 영역의 경우 < 1.0%, 머무름 시간의 경우 < 0.5%였다.
하기 [표 1]은 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)과 맥아 추출물(M, 비교예 1)의 페놀산 함량을 나타낸 것이며, 6가지 페놀성 화합물인 페룰산(ferulic acid), p-쿠마르산(p-coumaric acid), 갈산(gallic acid), 카페산(caffeic acid), 시린산(syringic acid) 및 바닐산(vanillic acid)이 확인되었다.
구분(단위: ug/g d.w.b.) 맥아 부산물(R, 실시예 1) 맥아(M, 비교예 1) 통밀(W)
Ferulic Free 22.45±0.08 8.79±0.21b 2.06±0.02e
Bound 2796.78±56.22 898.07±22.10b 679.23±13.56d
Total 2819.23±56.30 906.86±21.88b 681.29±13.58d
p-Coumaric acid Free 55.92±0.22 1.86±0.05a 0.38±0.00e
Bound 811.71±4.00 47.58±1.07d 13.32±1.85g
Total 867.63±3.78 49.44±1.03d 13.70±1.85g
Gallic acid Free 561.03±0.85 59.23±1.10b 17.64±0.07g
Bound 85.08±2.75 25.94±4.36bc 22.38±2.05bc
Total 646.11±1.90 85.17±3.35b 40.02±2.12f
Caffeic acid Free 274.01±3.07 14.87±0.02f 25.38±0.34e
Bound ND ND ND
Total 274.01±3.07 14.87±0.02f 25.38±0.34e
Syringic acid Free 50.08±0.49 1.43±0.98d 1.80±0.21ed
Bound 53.95±0.41 20.85±3.41a 15.38±0.19ab
Total 104.02±0.09 22.28±2.43abc 17.18±0.02d
Vanillic acid Free 5.15±0.16 2.17±0.15a 1.09±0.09f
Bound 17.17±0.54 7.23±0.48a 4.00±0.05f
Total 22.32±0.71 9.40±0.63a 5.09±0.04f
위 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)과 맥아 추출물(M, 비교예 1)에서 갈산(gallic acid) 및 카페산(caffeic acid)을 제외한 나머지 페놀성 화합물에서 페놀류의 결합 형태(Bound)가 유리 형태(Free)보다 높은 것을 확인하였다.
특히, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 맥아 부산물 추출물(R)은 통밀(W)에 비하여 모든 페놀성 화합물이 4 내지 60배 높으며, 맥아(M, 비교예 1)에 비하여 모든 페놀성 화합물이 2 내지 54배 높은 것을 확인하였다.
상기 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)에 함유된 풍부한 페놀산은 강력한 항산화 공급원이므로 본 발명의 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)이 항산화 특성이 있는 천연 물질로 사용될 수 있음을 의미한다.
3-2. 항산화 활성 측정
총 페놀 함량(TPC)은 Folin-Ciocalteu 방법에 의해 결정되었다(Swain & Hillis, 1959). 시료(50 μL), 초순수(450 μL) 및 Folin-Ciocalteu(30 μL)을 혼합하여 5분 동안 반응시킨 후, 7% 탄산나트륨 용액(350 μL)을 첨가한 후 암실 하, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax i3, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 765 nm에서 판독되었으며, 표준 곡선은 샘플과 동일한 조건에서 제조된 0 내지 500 ㎍의 갈산(3,4,5-트리하이드록시벤조산) 사이의 선형이다. 시료의 흡광도 값이 갈산 표준 곡선의 선형 범위를 초과하면 물을 첨가하여 시료를 희석한다. 얻어진 결과는 그램당 갈산 당량의 마이크로그램(mg GAE/g)으로 표시된다.
또한, 총 플라보노이드 함량(TFC)은 염화알루미늄 비색법을 사용하여 측정되었다. 시료(100 μL), 초순수(400 μL), 5% 아질산나트륨 용액(30 μL)을 혼합한 후 상온에서 6분간 배양한 다음 10% 염화알루미늄 용액(30μL) 및 1N 수산화나트륨(200μL)을 첨가하였다. 혼합물의 흡광도는 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax i3, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 510 nm에서 측정되었으며, 표준 곡선은 0 내지 500 mg의 (+)-카테킨 수화물 사이에서의 선형이다. 샘플 흡광도 값이 표준 곡선의 선형 범위를 초과하는 경우에는 시료를 희석하기 위해 물을 추가하였다. 얻어진 결과는 그램당 카테킨 당량의 마이크로그램(μM CE/g)으로 표시된다.
또한, Trolox 등가 항산화 능력(TEAC)은 Re, Pellegrini, Proteggente, Pannala, Yang 및 Rice-Evans(1999)의 방법을 일부 수정하였다. 7.4 mM ABTS+[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt]와 2.6 mM의 포타슘 퍼설페이트 용액을 동량 혼합하여 원액을 제조하고, 혼합물을 암실 하의 실온에서 16시간 동안 반응시켰다. ABTS 원액을 파장 734 nm에서 흡광도 0.70 ± 0.01로 희석하여 라디칼 소거 시험에 사용하였다. 각 시료(20 μL)와 희석된 ABTS 용액(980 μL)을 혼합한 혼합물을 6분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(SpectraMax i3, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 곡선은 0~1000μM Trolox[(±)-6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산] 사이의 선형이다. 샘플 흡광도 값이 표준 곡선의 선형 범위를 초과하는 경우 시료를 희석하기 위해 물을 추가하였다. 얻어진 결과는 그램당 마이크로몰 Trolox 당량(μM TE/g)으로 표시된다.
또한, 산소 라디칼 흡광도(ORAC) 활성은 Ou, Huang, Hampsch-Woodill, Flanagan 및 Deemer(2002)에 따라 약간의 수정하여 결정되었다. 플루오레세인(3′,6′-dihydroxyspiro [2-benzofuran-3,9′-xanthene]-1-one) 용액(100 nM) 및 AAPH(2,2′-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride) 용액(75 mM)은 pH 7.4에서 75 mM 인산염 완충액에 준비하고 4 ℃에서 보관하고 형광 프로브로 사용된다. Black-walled 96-well plate에 인산염 완충액(샘플), Trolox 표준물질(0-50 μM) 또는 인산염 완충액(blank)으로 희석된 25 μL의 추출물을 제공받은 후 150 μL의 플루오레세인 용액을 각 웰에 첨가한 후 37 ℃에서 30분 동안 사전 배양한 다음 25 μL의 AAPH 용액을 플레이트의 각 웰에 중첩하여 퍼옥실 라디칼을 생성하였다. 형광 강도의 동역학은 자동화된 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax i3, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 측정되었다. 형광은 다음과 같이 모니터링되었다: 여기(파장: 485 nm) 및 방출(파장: 528 nm)은 37 ℃에서 매분 기록의 91 사이클 동안 기록되었다. 블랭크의 면적을 빼서 계산한 형광 감쇠 곡선 아래 면적을 더하여 결과를 얻었으며, 얻어진 결과는 Trolox 표준 회귀(0-50 μM)에 해당하며 건조 중량 기준 샘플의 그램당 Trolox 등가물(μM TE/g)로 표시되었다.
도 4a 내지 도 4d는 본 발명의 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1) 및 맥아 추출물(M, 비교예 1)로부터 측정된 TPC, TFC, TEAC 및 ORAC를 각각 나타낸 그래프이다.
상기 TPC와 TFC는 항산화 활성에 기여하는 곡물의 주요성분이며, TEAC와 ORAC는 항산화 능력을 나타내는 자유 라디칼 생성에 대한 반응 억제 능력을 평가한다.
도 4a 내지 도 4d에 도시된 바와 같이, 항산화 특성은 유리 형태보다 결합 형태에서 훨씬 더 높았으며, 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)은 맥아 추출물(M, 비교예 1) 및 통밀(W)을 포함한 침지 밀(S1, S2), 발아밀(G1-G4)에 비하여 TPC, TFC, TEAC 및 ORAC 함량이 월등히 높은 것을 확인하였다.
시험예 4. 항염증 활성 측정
항염증 효과 분석은 대식세포 RAW264.7에 LPS(Lipopolysaccharide)를 이용하여 인위적인 염증반응을 유도한 후 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)을 농도(0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2 mg/mL)별로 처리한 후 NO(Nitric Oxide) 생성에 의한 항염증 효과를 분석하였다.
도 5는 염증을 유도한 대식세포에 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 맥아 부산물 추출물(R)을 농도별로 처리 시 NO 생성량을 나타낸 그래프이며, 하기 [표 2]는 상기 도 5의 값을 정량화한 것이다.
구분 NO(uM)
맥아 부산물(R, 실시예 1) 맥아(M, 비교예 1) 통밀(W)
LPS 19.92±0.26a
LPS 0.1 mg/ml 19.68±0.55a 19.88±0.62a 19.90±0.75a
0.25 mg/ml 17.54±0.30b 18.84±0.58a 19.15±0.64a
0.5 mg/ml 16.84±0.18c 18.02±0.43b 18.11±0.59b
0.75 mg/ml 11.48±0.31d 14.55±0.19c 15.46±0.88c
1 mg/ml 4.73±0.26e 11.07±0.27d 12.98±0.34c
1.5 mg/ml 1.90±0.19f 9.43±0.50d 11.56±0.61d
2 mg/ml 1.45±0.18fg 8.17±0.31d 10.87±0.42d
LPS 생략 1.05±0.15g
위 표 2에 나타낸 바와 같이, 모든 군에서 처리 농도가 높을수록 항염증 효과가 우수한 것을 확인하였으며, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 맥아 부산물 추출물(R)로 처리 시 맥아 추출물(M, 비교예 1) 및 통밀(W)로 처리하는 경우에 비하여 항염증 효과가 우수한 것을 확인하였다.
특히, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 맥아 부산물 추출물(R)은 추출물 농도 0.1 mg/mL일 때 LPS만을 처리한 군과 NO 생성량의 차이가 없었으나 추출물 농도 0.25 mg/mL 이상에서 항염증 효과를 보이는 것을 확인하였다. 더욱이, 추출물 농도 0.75 mg/mL에서는 LPS만을 처리한 군에 비하여 25%까지 NO 생성이 감소하는 것을 확인하였으며, 농도가 증가할수록 NO 생성이 점차 감소하는 것을 확인하였다.
시험예 5. 항암 활성 측정_위암, 대장암
5-1. 위암세포(KATO III)
항암 효과 분석은 위암세포(KATO III, MTB-38, European. Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, Wilts)에 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)을 농도(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 5 mg/mL)별로 처리한 후 암세포 증식억제를 측정하였다. 즉, 처리 농도에 따른 세포 생존율(%)을 측정한 것이다.
구분(단위: %) day1*** day2*** day3***
맥아 부산물(R, 실시예 1) 0 mg/ml 100.0a 100.0a 100.0a
0.1 mg/ml 98.41±2.39a 96.80±0.89a 93.09±3.30b
0.25 mg/ml 97.58±2.07a 90.89±2.52b 88.39±1.03c
0.5 mg/ml 96.57±1.20a 88.73±0.68b 83.90±1.61d
1 mg/ml 90.14±0.61b 81.37±0.79c 71.85±2.27e
2 mg/ml 84.15±0.76c 71.85±3.70d 57.42±1.93f
3 mg/ml 74.87±2.07d 61.95±1.02e 51.94±0.72g
5 mg/ml 51.72±0.25e 41.83±1.35f 33.29±0.50h
맥아(M, 비교예 1) 0 mg/ml 100.0a 100.0a 100.0a
0.1 mg/ml 99.08±2.46a 98.15±1.96a 97.61±2.46a
0.25 mg/ml 98.59±2.07a 96.27±2.46a 95.88±2.08a
0.5 mg/ml 97.18±1.94a 94.11±1.85b 93.57±1.85b
1 mg/ml 96.55±2.48a 91.28±2.04b 90.43±0.74b
2 mg/ml 90.11±1.06b 88.75±2.16b 86.72±0.96c
3 mg/ml 86.58±0.86c 84.30±0.95c 83.07±1.85c
5 mg/ml 80.11±1.55c 77.61±1.05d 76.52±0.72d
통밀(W) 0 mg/ml 100.0a 100.0a 100.0a
0.1 mg/ml 99.18±2.49a 98.88±2.35a 98.12±1.85a
0.25 mg/ml 98.84±2.81a 97.76±2.08a 97.03±1.96a
0.5 mg/ml 98.06±2.16a 96.17±1.67a 95.34±2.36a
1 mg/ml 97.18±1.59a 94.27±2.43b 93.50±1.88b
2 mg/ml 94.22±2.06b 92.10±0.94b 91.75±2.61b
3 mg/ml 92.18±1.68b 90.67±1.65b 89.85±0.94b
5 mg/ml 90.44±1.47b 88.56±1.82c 87.13±1.57c
*** : significantly differ at p < 0.001 respectively.
abc : 같은 column 내 같은 alphabet은 같은 수준임
위 표 3에 나타낸 바와 같이, 모든 군에서 처리 농도가 높을수록 위암세포인 KATO III의 증식이 억제되는 것을 확인하였으며, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 맥아 부산물 추출물(R)로 처리 시 맥아 추출물(M, 비교예 1) 및 통밀(W)로 처리하는 경우에 비하여 위암세포인 KATO III의 증식이 억제되는 것을 확인하였다. 무처리군(0 mg/m)의 위암세포에 비하여 증식억제 효과가 우수한 것을 확인하였다.
또한, 실시예 1의 맥아 부산물 추출물(R)을 처리하는 시간이 길수록 다른 군에 비하여 위암세포인 KATO III의 증식억제 효과가 현저히 증가하는 것을 확인하였다.
5-2. 위암세포(AGS)
항암 효과 분석은 위암세포(AGS, ATCC CRL 1739, Rockville, MD)에 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)을 농도(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 5 mg/mL)별로 처리한 후 암세포 증식억제를 측정하였다. 즉, 처리 농도에 따른 세포 생존율(%)을 측정한 것이다.
구분(단위: %) day1*** day2*** day3***
맥아 부산물(R, 실시예 1) 0 mg/ml 100.0a 100.0a 100.0a
0.1 mg/ml 96.24±0.78b 95.85±0.34b 89.23±1.15b
0.25 mg/ml 95.69±1.44b 94.74±0.22b 83.36±0.86c
0.5 mg/ml 91.63±2.55c 87.67±0.43c 75.03±2.25d
1 mg/ml 86.97±2.39d 79.62±2.72d 67.28±0.87e
2 mg/ml 75.70±0.51e 55.10±0.67e 45.63±1.07f
3 mg/ml 53.73±0.53f 16.98±0.58f 14.13±0.12g
5 mg/ml 23.62±0.68g 15.68±0.72f 13.57±0.12g
맥아(M, 비교예 1) 0 mg/ml 100.0a 100.0a 100.0a
0.1 mg/ml 98.52±2.46a 97.88±1.84a 96.11±1.94b
0.25 mg/ml 97.28±1.84a 96.36±1.73b 94.18±1.56b
0.5 mg/ml 96.07±2.07b 95.67±2.50b 93.09±1.43b
1 mg/ml 94.88±2.26b 93.86±2.06b 91.57±2.07c
2 mg/ml 92.18±1.90b 91.06±2.11c 90.08±2.25c
3 mg/ml 89.96±1.45c 87.24±1.85c 85.57±2.43d
5 mg/ml 85.11±0.94d 83.02±1.24d 80.13±1.56d
통밀(W) 0 mg/ml 100.0a 100.0a 100.0a
0.1 mg/ml 99.18±2.38a 98.67±1.57a 97.37±2.15a
0.25 mg/ml 98.18±1.76a 97.69±2.15a 95.15±0.94b
0.5 mg/ml 97.33±2.09a 97.08±2.63a 94.62±2.67b
1 mg/ml 95.67±2.68b 94.18±2.41b 93.69±1.49b
2 mg/ml 93.19±1.58b 92.43±1.84b 91.67±2.05c
3 mg/ml 91.15±1.67c 90.63±1.99c 88.84±1.85c
5 mg/ml 87.64±1.44c 85.39±2.07d 84.60±2.00d
*** : significantly differ at p < 0.001 respectively.
abc : 같은 column 내 같은 alphabet은 같은 수준임
위 표 4에 나타낸 바와 같이, 모든 군에서 처리 농도가 높을수록 위암세포인 AGS의 증식이 억제되는 것을 확인하였으며, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 맥아 부산물 추출물(R)로 처리 시 맥아 추출물(M, 비교예 1) 및 통밀(W)로 처리하는 경우에 비하여 위암세포인 AGS의 증식이 억제되는 것을 확인하였다. 무처리군(0 mg/m)의 위암세포에 비하여 증식억제 효과가 우수한 것을 확인하였다.
또한, 실시예 1의 맥아 부산물 추출물(R)을 처리하는 시간이 길수록 다른 군에 비하여 위암세포인 AGS의 증식억제 효과가 현저히 증가하는 것을 확인하였다.
5-3. 대장암세포(Caco-2)
항암 효과 분석은 대장암세포(Caco-2)에 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)을 농도(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 5 mg/mL)별로 처리한 후 암세포 증식억제를 측정하였다. 즉, 처리 농도에 따른 세포 생존율(%)을 측정한 것이다.
구분(단위: %) day1*** day2*** day3***
맥아 부산물(R, 실시예 1) 0 mg/ml 100.0a 100.0a 100.0a
0.1 mg/ml 97.70±1.39a 96.70±0.36a 94.30±1.50b
0.25 mg/ml 92.65±0.95b 89.63±2.67b 85.64±2.61c
0.5 mg/ml 89.52±0.37b 86.22±1.06c 76.92±1.20d
1 mg/ml 86.39±0.85c 72.50±1.60d 68.69±2.99e
2 mg/ml 79.56±0.37d 60.48±2.56e 52.29±1.58f
3 mg/ml 73.90±0.81d 44.28±0.32f 39.65±1.18g
5 mg/ml 46.67±0.44f 34.49±0.14g 28.30±0.42h
맥아(M, 비교예 1) 0 mg/ml 100.0a 100.0a 100.0a
0.1 mg/ml 98.87±2.42a 97.64±2.81a 96.18±1.48a
0.25 mg/ml 95.99±1.84a 94.31±2.64b 93.39±2.64b
0.5 mg/ml 94.28±2.38b 93.16±2.01b 92.45±1.85b
1 mg/ml 92.08±1.22b 90.45±2.34b 89.54±1.70b
2 mg/ml 89.56±0.94b 88.75±1.53b 87.30±2.43b
3 mg/ml 88.65±1.67b 86.94±1.94c 85.76±0.84c
5 mg/ml 81.15±1.85c 79.99±1.12c 78.06±0.70c
통밀(W) 0 mg/ml 100.0a 100.0a 100.0a
0.1 mg/ml 99.15±1.84a 98.47±2.08a 97.60±2.15a
0.25 mg/ml 96.43±1.09a 95.72±2.67a 94.72±1.84b
0.5 mg/ml 95.27±2.53a 94.63±2.01b 93.87±1.69b
1 mg/ml 93.18±2.00b 92.06±2.24b 91.26±2.43b
2 mg/ml 91.44±2.91b 90.06±2.38b 89.27±0.88b
3 mg/ml 89.94±2.43b 89.01±1.67b 87.86±0.97b
5 mg/ml 86.11±0.84c 84.67±2.06c 83.12±1.85c
*** : significantly differ at p < 0.001 respectively.
abc : 같은 column 내 같은 alphabet은 같은 수준임
위 표 5에 나타낸 바와 같이, 모든 군에서 처리 농도가 높을수록 대장암세포인 Caco-2의 증식이 억제되는 것을 확인하였으며, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 맥아 부산물 추출물(R)로 처리 시 맥아 추출물(M, 비교예 1) 및 통밀(W)로 처리하는 경우에 비하여 대장암세포인 Caco-2의 증식이 억제되는 것을 확인하였다. 무처리군(0 mg/m)의 대장암세포에 비하여 증식억제 효과가 우수한 것을 확인하였다.
또한, 실시예 1의 맥아 부산물 추출물(R)을 처리하는 시간이 길수록 다른 군에 비하여 대장암세포인 Caco-2의 증식억제 효과가 현저히 증가하는 것을 확인하였다.
5-4. EC 50
상기 표 2 내지 표 5에 나타낸 결과를 바탕으로 암세포를 50% 억제하는데 필요한 맥아 부산물 추출물(R, 실시예 1)의 농도를 확인하였다.
구분(단위: mg/ml) day1 day2 day3
Kato Ⅲ*** 5.42a 4.15b 3.27c
AGS*** 3.33a 2.42b 2.10c
Caco-2*** 4.94a 3.24b 2.60c
** : significantly differ at p < 0.001 respectively.
abc : 같은 column 내 같은 alphabet은 같은 수준임
위 표 6에 나타낸 바와 같이, 암세포를 50% 억제하는데 필요한 암세포별, 처리시간별 실시예 1의 맥아 부산물 추출물(R)의 농도는 추출물의 처리시간이 길수록 낮아졌으며, 같은 위암세포(Kato III, AGS)라도 세포의 종류에 따라 암세포 증식억제효과를 나타내는 실시예 1의 맥아 부산물 추출물(R)의 농도가 상이한 것을 확인하였다.
하기에 본 발명의 분말을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 500 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 300 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 200 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 600 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 4 g
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 과립제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 1,000 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 mg
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 기능성 음료의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 1,000 mg
구연산 1,000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (11)

  1. 곡물 맥아의 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용, 염증 또는 암의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 곡물 맥아의 부산물은 곡물 맥아를 제조 시 맥아에서 분리되는 뿌리, 옆아(acrospire) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 항산화용, 염증 또는 암의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 혼합물은 뿌리 및 옆아가 1 : 0.5-1의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 항산화용, 염증 또는 암의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 곡물 맥아의 부산물 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 에틸렌글리콜, 에틸에테르 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것을 특징으로 하는 항산화용, 염증 또는 암의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 탄소수 1 내지 4의 저급알코올은 20 내지 80%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올인 것을 특징으로 하는 항산화용, 염증 또는 암의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 곡물 맥아의 부산물 추출물은 20 내지 50 kHz의 진동수 및 50 내지 2000 W의 파워의 초음파기로 5 내지 15시간 동안 30 내지 70 ℃ 하에서 처리된 것을 특징으로 하는 항산화용, 염증 또는 암의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 식품 조성물은 위암, 대장암, 폐암, 간암, 담관암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 방광암 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 암을 개선 또는 예방하는 것을 특징으로 하는 항산화용, 염증 또는 암의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 곡물 맥아의 부산물은 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 쌀 및 귀리로 이루어진 군에서 선택된 1종의 곡물로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 항산화용, 염증 또는 암의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  9. 곡물 맥아의 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용, 염증 또는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 곡물 맥아의 부산물은 곡물 맥아를 제조 시 맥아에서 분리되는 뿌리, 옆아(acrospire) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 항산화용, 염증 또는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 곡물 맥아의 부산물 추출물은 20 내지 50 kHz의 진동수 및 50 내지 2000 W의 파워의 초음파기로 5 내지 15시간 동안 30 내지 70 ℃ 하에서 처리된 것을 특징으로 하는 항산화용, 염증 또는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2016064992A (ja) 2014-09-22 2016-04-28 和伎獅子株式会社 発毛・育毛用及び肌状態改善用粉末状皮膚外用剤
KR20210021366A (ko) 2018-06-14 2021-02-25 안헤우저-부시 인베브 에스.에이. 맥아 및 맥아 뿌리로 곡물-기반 음료를 제조하는 방법

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