KR20240053709A - 홍해삼의 다형성 ssr dna 마커 및 이를 이용한 개체식별 방법 - Google Patents
홍해삼의 다형성 ssr dna 마커 및 이를 이용한 개체식별 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20240053709A KR20240053709A KR1020220133344A KR20220133344A KR20240053709A KR 20240053709 A KR20240053709 A KR 20240053709A KR 1020220133344 A KR1020220133344 A KR 1020220133344A KR 20220133344 A KR20220133344 A KR 20220133344A KR 20240053709 A KR20240053709 A KR 20240053709A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- sea cucumber
- red sea
- individuals
- ulleungdo
- cucumber individuals
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 241001137884 Cucumaria miniata Species 0.000 claims abstract description 371
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 42
- 241000251511 Holothuroidea Species 0.000 claims description 33
- 102100040004 Gamma-glutamylcyclotransferase Human genes 0.000 claims description 24
- 101000886680 Homo sapiens Gamma-glutamylcyclotransferase Proteins 0.000 claims description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 12
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- SMRJSACRIKPVSW-UHFFFAOYSA-N (2E)-2-[(E)-3-[3-(5-carboxypentyl)-1,1-dimethyl-6,8-disulfobenzo[e]indol-3-ium-2-yl]prop-2-enylidene]-3-ethyl-1,1-dimethyl-6-sulfobenzo[e]indole-8-sulfonate Chemical compound CCN1\C(=C/C=C/C2=[N+](CCCCCC(O)=O)c3ccc4c(cc(cc4c3C2(C)C)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)C(C)(C)c2c1ccc1c(cc(cc21)S(O)(=O)=O)S([O-])(=O)=O SMRJSACRIKPVSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102100022524 Alpha-1-antichymotrypsin Human genes 0.000 claims description 4
- 101000678026 Homo sapiens Alpha-1-antichymotrypsin Proteins 0.000 claims description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 4
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 3
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 2',7'-difluorofluorescein Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(F)C(=O)C=C2OC2=CC(O)=C(F)C=C21 VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QCPFFGGFHNZBEP-UHFFFAOYSA-N 4,5,6,7-tetrachloro-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound O1C(=O)C(C(=C(Cl)C(Cl)=C2Cl)Cl)=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 QCPFFGGFHNZBEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- COCMHKNAGZHBDZ-UHFFFAOYSA-N 4-carboxy-3-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]benzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(C([O-])=O)=CC=C1C(O)=O COCMHKNAGZHBDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=C(C(O)=O)C=C2C21C1=CC(OC)=C(O)C(Cl)=C1OC1=C2C=C(OC)C(O)=C1Cl IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 claims description 2
- NULAJYZBOLVQPQ-UHFFFAOYSA-N N-(1-naphthyl)ethylenediamine Chemical compound C1=CC=C2C(NCCN)=CC=CC2=C1 NULAJYZBOLVQPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 claims description 2
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FMKJUUQOYOHLTF-OWOJBTEDSA-N (e)-4-azaniumylbut-2-enoate Chemical compound NC\C=C\C(O)=O FMKJUUQOYOHLTF-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims 2
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 claims 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 claims 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 26
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 18
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 3
- LGZXYFMMLRYXLK-UHFFFAOYSA-N mercury(2+);sulfide Chemical compound [S-2].[Hg+2] LGZXYFMMLRYXLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 abstract description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 abstract description 2
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 97
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 4
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191291 Abies alba Species 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920013627 Sorona Polymers 0.000 description 1
- 208000003028 Stuttering Diseases 0.000 description 1
- 244000223014 Syzygium aromaticum Species 0.000 description 1
- 235000016639 Syzygium aromaticum Nutrition 0.000 description 1
- 241000205188 Thermococcus Species 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- 241000589498 Thermus filiformis Species 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000014102 seafood Nutrition 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/151—Modifications characterised by repeat or repeated sequences, e.g. VNTR, microsatellite, concatemer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 홍해삼의 개체 식별용 SSR 마커 조성물, 상기 SSR 마커 조성물을 포함하는 홍해삼의 개체 식별용 키트 및 상기 SSR 마커 조성물 또는 상기 키트를 이용하여 홍해삼의 개체를 식별하는 방법에 관한 기술이다.
본 발명의 홍해삼의 개체 식별용 SSR 유전자좌 및 상기 유전자좌를 증폭하는 프라이머를 이용하는 경우, 지역별 홍해삼들을 구분할 수 있고, 더 나아가 국내산 홍해삼과 중국산 홍해삼을 구분할 수 있으므로, 이를 통해 영양성 및 경제성이 높은 국내산 홍해삼에 대한 신뢰도를 확보할 수 있고, 수산업의 발전에 크게 이바지할 수 있다.
또한, 본 발명의 홍해삼의 개체 식별용 SSR 유전자좌는 홍해삼 집단의 유전변이 분석, 유전다양성 등 유전적 연구, DNA 지문 정보를 구축하는데 유용하게 활용될 수 있고, 홍해삼 개체의 과학적 인증 기술로 활용이 가능하다.
본 발명의 홍해삼의 개체 식별용 SSR 유전자좌 및 상기 유전자좌를 증폭하는 프라이머를 이용하는 경우, 지역별 홍해삼들을 구분할 수 있고, 더 나아가 국내산 홍해삼과 중국산 홍해삼을 구분할 수 있으므로, 이를 통해 영양성 및 경제성이 높은 국내산 홍해삼에 대한 신뢰도를 확보할 수 있고, 수산업의 발전에 크게 이바지할 수 있다.
또한, 본 발명의 홍해삼의 개체 식별용 SSR 유전자좌는 홍해삼 집단의 유전변이 분석, 유전다양성 등 유전적 연구, DNA 지문 정보를 구축하는데 유용하게 활용될 수 있고, 홍해삼 개체의 과학적 인증 기술로 활용이 가능하다.
Description
본 발명은 홍해삼의 다형성 SSR DNA 마커 및 이를 이용한 개체식별 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 홍해삼의 개체 식별용 SSR 마커 조성물, 상기 SSR 마커 조성물을 포함하는 홍해삼의 개체 식별용 키트, 및 상기 SSR 마커 조성물 또는 상기 키트를 이용하여 홍해삼의 개체를 식별하는 방법에 관한 것이다.
2010년 공표된 나고야의정서는 생물자원을 활용하여 생기는 이익을 공유하기 위한 국제협약으로, 동 협약은 2017년 8월 17일부터 우리나라에서도 발효 중이다. 우리나라는 국립생물자원관과 2012년 설립되는 국립생태원을 중심으로, 10만여 종의 국내 생물 유전자원을 발굴하고 자원 이용을 위한 데이터베이스를 만들어 나고야의정서에 대비하고 있다.
'나고야의정서'가 발효되면서 우리 생물주권을 지키고 보전하는 것이 매우 중요한 문제로 떠오르고 있다. 우리 생물자원 보존과 관련하여 지리산과 한라산의 대표 식물인 구상나무는 1904년 서양으로 반출되어 크리스마스 트리로 외국에서 널리 사용된 바 있고, 1947년 미국으로 반출되어 '미스킴라일락'으로 불리며 정원수로 높은 인기를 누리고 있는 정향나무나, 소로나로 알려진 우리나라 토종 밀인 앉은뱅이밀은 모두 해외로 반출된 우리나라 생물자원이다.
따라서, 우리나라 고유생물의 무단 반출을 막고, 생물자원을 확보하기 위한 다양한 노력이 필요하다. 특히, 나고야의정서에 대비하고, 경제적 잠재가치가 높은 해산물인 해삼과 같은 고유종의 경우에는 생물 주권 보장을 위한 품종 특이적 마커의 개발이 필수적인 상황이다.
또한, 유전적 다양성은 생물안정성(biological stability) 유지에 결정적인 역할을 하며 분류(taxonomic), 종분화(speciation), 보전(conservation) 연구를 위해 활용된다. DNA 마커는 유전적 유연관계 분석과 집단 유전학 연구를 포함하여 생물체의 유전적 특성을 분석할 수 있는 기술이다.
국제 신품종 보호 연맹(UPOV)은 품종 식별을 위하여 분자 마커의 활용을 고려하고 있으며, 특히 품종 간 다형성 정도, 분석의 재현성, 염색체상의 분포 정도를 고려할 때 SSR(simple sequence repeat or microsatellite), SNP(single nucleotide polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 등을 이용하는 것을 제안하고 있다.
분자 마커 중 SSR을 이용한 분석법은 품종 식별과 유전자원 관리에 널리 이용되고 있는데, 그 이유는 유전체 상에 SSR 변이가 널리 존재하며, 개체 식별에 이용될 수 있을 만큼 변이가 풍부할 뿐만 아니라, 연쇄중합반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 그 변이를 신속하고 쉽게 검출할 수 있기 때문이다.
한편, 해삼은 전세계적으로 약 1,500여 종이 알려져 있는데, 우리나라에 분포, 서식하는 해삼은 순수목 돌기해삼과 돌기해삼속에 속하는 약 14종으로, 색깔에 따라 청해삼, 홍해삼, 흑해삼으로 구분된다.
우리나라에 분포, 서식하는 해삼은 순수목 돌기해삼과 돌기해삼속에 속하는 약 14종으로, 색깔에 따라 청해삼, 홍해삼, 흑해삼으로 구분하며 지금까지 이들 3종을 같은 종으로 취급하였으나, 최근 Isozyme 연구결과 1개의 유전자좌에서 유전적 다형이 존재하는 것이 알려지면서 별개의 종으로 구분하여 취급하고 있다.
청해삼은 대한민국에서 생산되는 해삼의 대부분을 차지하고 있다. 청해삼은 순수한 뻘 지역을 제외한 암반, 작은 돌, 조약돌과 연결된 모래 또는 사니질 지역에 홍해삼보다 넓게 분포한다. 어릴 때는 내만의 해조류 서식장, 암초 지대 등에서 홍해삼과 섞여 생활하나 성장함에 따라 외양의 사니질 깊은 곳으로 이동해 서식한다. 조류 소통이 좋고 용존산소가 풍부한 해역에 많으며, 홍해삼보다 맛은 떨어지고, 흑해삼과 비교하여도 가격이 싼 편이다.
흑해삼은 개체 색이 매우 검은 편이라 홍해삼과는 구별이 쉬우며, 홍해삼과 비교하여 맛도 많이 떨어지고 가격도 저렴하나, 청해삼보다는 가격이 다소 비싸게 거래된다.
홍해삼은 울릉도, 제주, 동해안 해안지역의 특산품으로 주로 제주해역을 비롯해 강원도, 울릉도 일부 연안에서만 서식하며, 생산량이 매우 적으나, 청해삼과 비교하여 칼슘, 인, 마그네슘 등 무기 영양성분을 다량 포함하고 크기도 대형이다. 또한, 홍해삼은 청해삼에 비해 크기가 크고 맛도 좋아 가격도 비싸게 거래되고, 일본인들이 가장 선호하는 해삼이다.
이에 따라, 홍해삼의 종묘 생산, 양식 방법 개발 등 다양한 기술 개발을 통해 홍해삼의 생산량을 증대시키려는 노력이 국가 차원에서 진행되고 있으나, 일부 경로를 통해 중국에서 수입되는 홍해삼이 국내산으로 둔갑하여 유통됨에 따라 국내 수산업계에 큰 위협이 되는 상황이다.
국내산 홍해삼의 개체 식별을 위한 분석 안정성과 다형적 정보성이 높은 SSR 마커의 개발이 시급한 실정이나, 아직까지 홍해삼의 개체 식별을 위한 분석 안정성과 다형적 정보성이 높은 SSR 마커는 개발된 바 없다.
따라서 본 발명의 목적은 홍해삼의 개체 식별용 SSR 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 SSR 마커 조성물을 포함하는 홍해삼의 개체 식별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 SSR 마커 조성물 또는 상기 키트를 이용하여 홍해삼의 개체 식별 및 원산지 판별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 Una288, UNo69, UNoT15, JJ93, UNoT26, UNoT31, UNoT10, UNaT17, UNaT18, JJP19, JJP13, UJiT10, JJP20, 및 UJiT11로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SSR 유전자좌에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 포함하는 홍해삼 개체 식별용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 우리나라에 자생하는 고부가가치 어종인 홍해삼 유전자원의 보존, 관리 및 지속가능한 이용을 위한 유전다양성 평가 기술로서 분석 안정성과 다형적 정보성이 높은 마커를 발굴하고자 지속적으로 연구하였고, 이 과정에서 상기 Una288, UNo69, UNoT15, JJ93, UNoT26, UNoT31, UNoT10, UNaT17, UNaT18, JJP19, JJP13, UJiT10, JJP20, 및 UJiT11의 SSR 마커들이 울릉도(자연산), 울릉도(양식), 제주, 울진 및 울주 지역에서 서식하는 각각의 홍해삼 개체에 따라 각각 고유한 SSR 유전자좌를 갖고, 이를 홍해삼 개체의 식별 및 서식지 판별에 이용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에서, 용어 'SSR(simple sequence repeat)'은 1~6개의 염기서열이 반복되는 구조를 갖고, 하나는 좌위(loci)마다 여러 대립유전자를 검출할 수 있는 분자마커의 한 종류이다. SSR 분자마커는 개체 또는 종에 따라 반복단위의 반복 수가 다양할 수 있으므로, 반복되는 부분의 양쪽 염기쌍 중에 게놈 상에서 독특한 서열을 프라이머 서열로 디자인하고 PCR 증폭을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물의 크기를 비교하여 개체 또는 종을 식별할 수 있다. 따라서, SSR 반복을 중심으로 설계된 프라이머를 사용하여 길이 다형성을 진단하기 위한 절편들의 분석을 통해 유전학적 다양성을 쉽게 진단할 수 있으며, 본 발명에서는 홍해삼의 개체 식별에 이용된다. 본 발명의 상기 SSR 유전자좌를 이용한 분석은 높은 재현성과 정확성을 보이는 장점이 있다.
본 발명에서, 용어 '유전자좌'는 SSR(simple sequence repeat) 반복단위의 반복 수에 변이가 존재하여 발생하는 다형성을 나타내어 개체 식별이 가능케 하는 유전체 상의 위치를 의미하며, '마커(marker)'와 동일한 의미로 사용된다.
본 발명에서 용어, "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라, 온도 및 이온 강도와 같은 이용 조건에 의존할 것이다. 구체적 예로, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 구아닌 및 시토신의 함량(GC contents), GC 배열, 어닐링(annealing) 온도 및 이온 강도 등 여러 조건을 고려하여 결정해야 한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약과 서로 다른 4종 뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTPs)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 "정방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 유전자 증폭반응에 의해 증폭되는 유전자의 특정 부위의 3'-말단 및 5'-말단에 각각 결합하여 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머를 의미한다.
상기 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 상기 표지는 일례로는 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제 등과 같은 효소, 33P 등과 같은 방사성 동위원소, 바이오틴 등과 같은 화학 그룹 및 형광성 분자 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 홍해삼 개체 식별용 마커 조성물에서, 상기 SSR 유전자좌인 Una288에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트이고, 상기 SSR 유전자좌인 UNo69에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트이며, 상기 SSR 유전자좌인 UNoT15에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트이고, 상기 SSR 유전자좌인 JJ93에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트이며, 상기 SSR 유전자좌인 UNoT26에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트이고, 상기 SSR 유전자좌인 UNoT31에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 세트이며, 상기 SSR 유전자좌인 UNoT10에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 세트이고, 상기 SSR 유전자좌인 UNaT17에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 세트이며, 상기 SSR 유전자좌인 UNaT18에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머 세트이고, 상기 SSR 유전자좌인 JJP19에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머 세트이며, 상기 SSR 유전자좌인 JJP13에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 21 및 서열번호 22의 프라이머 세트이고, 상기 SSR 유전자좌인 UJiT10에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이머 세트일 수 있다(표 2 참조).
상기 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 상기 표지는 일례로는 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제 등과 같은 효소, 33P 등과 같은 방사성 동위원소, 바이오틴 등과 같은 화학 그룹 및 형광성 분자 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 홍해삼 개체 식별용 마커 조성물에서, 상기 프라이머 세트는 각 정방향(forward) 염기서열 5' 말단에 형광 염료로 표지되어 분석의 편의성을 제공할 수 있다. 이 경우 각각의 유전자좌에 대한 프라이머 세트는 각기 다른 형광 염료로 표지되어 동시에 다중 분석이 가능하도록 설계될 수 있다. 상기 형광 염료의 예로는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichloro fluorescein), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), Cy3.5, 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 홍해삼 개체 식별용 마커 조성물에서, 상기 SSR 유전자좌인 Una288은 반복서열 (CATT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 7회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 14회, 제주 홍해삼 개체에서 20회, 울진 홍해삼 개체에서 8회, 울주 홍해삼 개체에서 16회 반복되는 것을 특징으로 하고, 상기 SSR 유전자좌인 UNo69는 반복서열 (AACT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 16회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 19회, 제주 홍해삼 개체에서 7회, 울진 홍해삼 개체에서 7회, 울주 홍해삼 개체에서 19회 반복되는 것을 특징으로 하며, 상기 SSR 유전자좌인 UNoT15는 반복서열 (AATG)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 23회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 17회, 제주 홍해삼 개체에서 25회, 울진 홍해삼 개체에서 25회, 울주 홍해삼 개체에서 17회 반복되는 것을 특징으로 하고, 상기 SSR 유전자좌인 JJ93은 반복서열 (ACGC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 6회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 6회, 제주 홍해삼 개체에서 10회, 울진 홍해삼 개체에서 7회, 울주 홍해삼 개체에서 6회 반복되는 것을 특징으로 하며, 상기 SSR 유전자좌인 UNoT26은 반복서열 (ACAT)(AC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 (ACAT) 25회 및 (AC) 18회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 (ACAT) 21회 및 (AC) 14회, 제주 홍해삼 개체에서 (ACAT) 19회 및 (AC) 17회, 울진 홍해삼 개체에서 (ACAT) 27회 및 (AC) 17회, 울주 홍해삼 개체에서 (ACAT) 21회 및 (AC) 14회 반복되는 것을 특징으로 하고, 상기 SSR 유전자좌인 UNoT31은 반복서열 (CAGT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 18회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 26회, 제주 홍해삼 개체에서 12회, 울진 홍해삼 개체에서 27회, 울주 홍해삼 개체에서 26회 반복되는 것을 특징으로 하며, 상기 SSR 유전자좌인 UNoT10은 반복서열 (CATT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 15회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 13회, 제주 홍해삼 개체에서 20회, 울진 홍해삼 개체에서 14회, 울주 홍해삼 개체에서 13회 반복되는 것을 특징으로 하고, 상기 SSR 유전자좌인 UNaT17은 반복서열 (GTCT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 8회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 17회, 제주 홍해삼 개체에서 15회, 울진 홍해삼 개체에서 9회, 울주 홍해삼 개체에서 17회 반복되는 것을 특징으로 하며, 상기 SSR 유전자좌인 UNaT18은 반복서열 (TGTC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 14회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 8회, 제주 홍해삼 개체에서 6회, 울진 홍해삼 개체에서 9회, 울주 홍해삼 개체에서 8회 반복되는 것을 특징으로 하고, 상기 SSR 유전자좌인 JJP19는 반복서열 (TGAC)(GGAC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 7회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 16회, 제주 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 10회, 울진 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 9회, 울주 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 16회 반복되는 것을 특징으로 하며, 상기 SSR 유전자좌인 JJP13은 반복서열 (TACA)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 6회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 10회, 제주 홍해삼 개체에서 12회, 울진 홍해삼 개체에서 11회, 울주 홍해삼 개체에서 10회 반복되는 것을 특징으로 하고, 상기 SSR 유전자좌인 UJiT10은 반복서열 (AGAC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 5회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 8회, 제주 홍해삼 개체에서 10회, 울진 홍해삼 개체에서 11회, 울주 홍해삼 개체에서 8회 반복되는 것을 특징으로 하며, 상기 SSR 유전자좌인 JJP20은 반복서열 (ACTG)(GCTG)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 (ACTG) 10회 및 (GCTG) 7회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 (ACTG) 9회 및 (GCTG) 7회, 제주 홍해삼 개체에서 (ACTG) 17회 및 (GCTG) 9회, 울진 홍해삼 개체에서 (ACTG) 13회 및 (GCTG) 8회, 울주 홍해삼 개체에서 (ACTG) 9회 및 (GCTG) 7회 반복되는 것을 특징으로 하고, 상기 SSR 유전자좌인 UJiT11은 반복서열 (AGAC)(AAAC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 (AGAC) 1회 및 (AAAC) 4회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 (AGAC) 5회 및 (AAAC) 5회, 제주 홍해삼 개체에서 (AGAC) 6회 및 (AAAC) 3회, 울진 홍해삼 개체에서 (AGAC) 1회 및 (AAAC) 3회, 울주 홍해삼 개체에서 (AGAC) 5회 및 (AAAC) 5회 반복되는 것을 특징으로 하여, 울릉도(자연산), 울릉도(양식), 제주, 울진 및 울주의 지역별 홍해삼 개체의 원산지를 용이하게 식별 가능한 장점이 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 홍해삼 개체 식별용 마커 조성물을 포함하는 홍해삼 개체 식별용 키트를 제공한다.
본 발명의 "키트"는 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 상기 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합효소(예를 들면, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu) 균주로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2 등을 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. 이때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 준다. 일반적으로 Mg2+ 이온이 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭 산물이 증가하고, Mg2+ 이온이 부족한 경우 PCR 산물의 산출률이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 BSA(Bovine Serum Albumin)이 추가로 포함될 수도 있다.
상기 홍해삼 개체 식별용 키트는 상기 프라이머 세트 외에도 DNA 폴리머라제, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), 반응 완충액, DNAse 억제제, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 비롯하여 폴리뉴클레오티드의 증폭을 통하여 홍해삼 개체를 판별하는데 필요한 모든 생물학적 또는 화학적 시약, 사용설명서 등을 포함할 수 있다. 이러한 키트의 다른 구성은 상기 키트의 형태에 따라서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 분석하고자 하는 해삼 개체의 생물학적 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 DNA를 Una288, UNo69, UNoT15, JJ93, UNoT26, UNoT31, UNoT10, UNaT17, UNaT18, JJP19, JJP13, UJiT10, JJP20, 및 UJiT11로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SSR 유전자좌에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 PCR 반응의 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 홍해삼의 개체 식별 방법을 제공한다.
본 발명의 홍해삼 개체 판별 방법에서, 상기 SSR 유전자좌인 Una288은 반복서열 (CATT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 7회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 14회, 제주 홍해삼 개체에서 20회, 울진 홍해삼 개체에서 8회, 울주 홍해삼 개체에서 16회 반복되는 것을 특징으로 하고, 상기 SSR 유전자좌인 UNo69는 반복서열 (AACT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 16회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 19회, 제주 홍해삼 개체에서 7회, 울진 홍해삼 개체에서 7회, 울주 홍해삼 개체에서 19회 반복되는 것을 특징으로 하며, 상기 SSR 유전자좌인 UNoT15는 반복서열 (AATG)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 23회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 17회, 제주 홍해삼 개체에서 25회, 울진 홍해삼 개체에서 25회, 울주 홍해삼 개체에서 17회 반복되는 것을 특징으로 하고, 상기 SSR 유전자좌인 JJ93은 반복서열 (ACGC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 6회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 6회, 제주 홍해삼 개체에서 10회, 울진 홍해삼 개체에서 7회, 울주 홍해삼 개체에서 6회 반복되는 것을 특징으로 하며, 상기 SSR 유전자좌인 UNoT26은 반복서열 (ACAT)(AC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 (ACAT) 25회 및 (AC) 18회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 (ACAT) 21회 및 (AC) 14회, 제주 홍해삼 개체에서 (ACAT) 19회 및 (AC) 17회, 울진 홍해삼 개체에서 (ACAT) 27회 및 (AC) 17회, 울주 홍해삼 개체에서 (ACAT) 21회 및 (AC) 14회 반복되는 것을 특징으로 하고, 상기 SSR 유전자좌인 UNoT31은 반복서열 (CAGT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 18회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 26회, 제주 홍해삼 개체에서 12회, 울진 홍해삼 개체에서 27회, 울주 홍해삼 개체에서 26회 반복되는 것을 특징으로 하며, 상기 SSR 유전자좌인 UNoT10은 반복서열 (CATT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 15회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 13회, 제주 홍해삼 개체에서 20회, 울진 홍해삼 개체에서 14회, 울주 홍해삼 개체에서 13회 반복되는 것을 특징으로 하고, 상기 SSR 유전자좌인 UNaT17은 반복서열 (GTCT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 8회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 17회, 제주 홍해삼 개체에서 15회, 울진 홍해삼 개체에서 9회, 울주 홍해삼 개체에서 17회 반복되는 것을 특징으로 하며, 상기 SSR 유전자좌인 UNaT18은 반복서열 (TGTC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 14회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 8회, 제주 홍해삼 개체에서 6회, 울진 홍해삼 개체에서 9회, 울주 홍해삼 개체에서 8회 반복되는 것을 특징으로 하고, 상기 SSR 유전자좌인 JJP19는 반복서열 (TGAC)(GGAC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 7회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 16회, 제주 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 10회, 울진 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 9회, 울주 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 16회 반복되는 것을 특징으로 하며, 상기 SSR 유전자좌인 JJP13은 반복서열 (TACA)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 6회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 10회, 제주 홍해삼 개체에서 12회, 울진 홍해삼 개체에서 11회, 울주 홍해삼 개체에서 10회 반복되는 것을 특징으로 하고, 상기 SSR 유전자좌인 UJiT10은 반복서열 (AGAC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 5회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 8회, 제주 홍해삼 개체에서 10회, 울진 홍해삼 개체에서 11회, 울주 홍해삼 개체에서 8회 반복되는 것을 특징으로 하며, 상기 SSR 유전자좌인 JJP20은 반복서열 (ACTG)(GCTG)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 (ACTG) 10회 및 (GCTG) 7회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 (ACTG) 9회 및 (GCTG) 7회, 제주 홍해삼 개체에서 (ACTG) 17회 및 (GCTG) 9회, 울진 홍해삼 개체에서 (ACTG) 13회 및 (GCTG) 8회, 울주 홍해삼 개체에서 (ACTG) 9회 및 (GCTG) 7회 반복되는 것을 특징으로 하고, 상기 SSR 유전자좌인 UJiT11은 반복서열 (AGAC)(AAAC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 (AGAC) 1회 및 (AAAC) 4회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 (AGAC) 5회 및 (AAAC) 5회, 제주 홍해삼 개체에서 (AGAC) 6회 및 (AAAC) 3회, 울진 홍해삼 개체에서 (AGAC) 1회 및 (AAAC) 3회, 울주 홍해삼 개체에서 (AGAC) 5회 및 (AAAC) 5회 반복되는 것을 특징으로 한다.
따라서, 증폭된 PCR 반응산물의 반복서열과 반복 회수를 간단하게 분석해내어 분석대상 홍해삼 개체의 원산지를 용이하게 식별 가능하다.
상기 표적 서열의 증폭은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplex PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reationc), DNA 칩(DNA chip), 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
PCR 반응의 증폭 산물의 분석은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정 등 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 형광 측정 방법은 마커의 5'-말단에 FAM, HEX, TAMRA, Cy3.5 등의 형광표지를 부착하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 실시예 4에서는 상기 Una288, UNo69, UNoT15, JJ93, UNoT26, UNoT31, UNoT10, UNaT17, UNaT18, JJP19, JJP13, UJiT10, JJP20, 및 UJiT11로 구성된 SSR 유전자좌와 이들에 대응되어 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 28의 프라이머 세트로 홍해삼 개체의 유전자 서열을 증폭하는 경우, 서로 구별되는 뚜렷하게 구분되는 지역별 홍해삼 특이적인 PCR 산물이 증폭되는 것을 확인하였다.
따라서, 지역별 홍해삼 특이적인 SSR 유전자좌에 기반한 홍해삼 개체 식별용 마커 조성물을 이용하여 홍해삼 원산지 판별을 용이하게 수행할 수 있으며, 더 나아가 국내산 홍해삼 품종과 중국산 홍해삼 품종을 용이하게 구분이 가능함을 확인할 수 있었다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 홍해삼의 개체 식별용 SSR 마커 조성물, 상기 SSR 마커 조성물을 포함하는 홍해삼의 개체 식별용 키트 및 상기 SSR 마커 조성물 또는 상기 키트를 이용하여 홍해삼의 개체를 식별하는 방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 홍해삼의 개체 식별용 SSR 유전자좌 및 상기 유전자좌를 증폭하는 프라이머를 이용하는 경우, 지역별 홍해삼들을 구분할 수 있고, 더 나아가 국내산 홍해삼과 중국산 홍해삼을 구분할 수 있으므로, 이를 통해 영양성 및 경제성이 높은 국내산 홍해삼에 대한 신뢰도를 확보할 수 있고, 수산업의 발전에 크게 이바지할 수 있다.
(c) 또한, 본 발명의 홍해삼의 개체 식별용 SSR 유전자좌는 홍해삼 집단의 유전변이 분석, 유전다양성 등 유전적 연구, DNA 지문 정보를 구축하는데 유용하게 활용될 수 있으며, 홍해삼 개체의 과학적 인증 기술로 활용이 가능하다.
도 1은 홍해삼 친자 및 계통 분석용 SSR 마커를 개발하기 위해 반복단위에 따른 SSRs(simple sequence repeats)를 분석한 결과 그래프이다.
도 2는 선발된 30개의 후보 SSRs 마커를 증폭하기 위한 PCR 반응 조건을 정리한 표이다.
도 3은 16종의 PCR 프라이머 세트를 이용하여 해삼 샘플에 대해 PCR 반응을 수행한 결과 사진이다.
도 4는 각 지역의 홍해삼 SSRs 마커의 가상적 PCR에 따른 PCR 산물 변화 폭을 size와 variation으로 표시하였고, 반복단위 및 반복개수를 정리한 표이다.
도 5는 UNa288, UNo69, UNoT15, JJ93, UNoT26, UNoT31, UNoT10 및 UNaT17로 구성된 SSR 마커에 대한 프라이머 세트(A 세트)들을 이용한 multiple PCR 반응 결과를 정리한 그래프이다.
도 6은 JJP1, UNaT18, UNaT30, JJP19, JJP13, UJiT10, JJP20 및 UJiT11로 구성된 SSR 마커에 대한 프라이머 세트(B 세트)들을 이용한 multiple PCR 반응 결과를 정리한 그래프이다.
도 7은 홍해삼 종묘를 생산하는 3개 업체로부터 모삼과 종묘를 각각 구입하여 홍해삼의 친자 분석을 수행한 결과를 정리한 표이다.
도 2는 선발된 30개의 후보 SSRs 마커를 증폭하기 위한 PCR 반응 조건을 정리한 표이다.
도 3은 16종의 PCR 프라이머 세트를 이용하여 해삼 샘플에 대해 PCR 반응을 수행한 결과 사진이다.
도 4는 각 지역의 홍해삼 SSRs 마커의 가상적 PCR에 따른 PCR 산물 변화 폭을 size와 variation으로 표시하였고, 반복단위 및 반복개수를 정리한 표이다.
도 5는 UNa288, UNo69, UNoT15, JJ93, UNoT26, UNoT31, UNoT10 및 UNaT17로 구성된 SSR 마커에 대한 프라이머 세트(A 세트)들을 이용한 multiple PCR 반응 결과를 정리한 그래프이다.
도 6은 JJP1, UNaT18, UNaT30, JJP19, JJP13, UJiT10, JJP20 및 UJiT11로 구성된 SSR 마커에 대한 프라이머 세트(B 세트)들을 이용한 multiple PCR 반응 결과를 정리한 그래프이다.
도 7은 홍해삼 종묘를 생산하는 3개 업체로부터 모삼과 종묘를 각각 구입하여 홍해삼의 친자 분석을 수행한 결과를 정리한 표이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 실험 재료 및 방법
1-1. 실험재료
본 발명에서는 제주도(Jeju), 울진(Uljin), 울주(Ulju), 울릉도(토착)(UNa), 및 울릉도(양식)(UNo)의 홍해삼을 포획하여 홍해삼 유전체 분석을 위한 시료로 사용하였다.
1-2. 게놈 DNA 분리 및 서열 분석
QuickGene DNA Whole Blood Kit S(KURABO, Osaka, Japan)를 사용하여 홍해삼에서 게놈 DNA를 분리하였고, DNA 서열분석에 사용하였다.
1-3. DNA Libary 구축 및 sequencing
분리된 DNA는 Covaris S2 ultra sonicator system을 이용하여 fragmentation 단계를 거친 후, Truseq Nano DNA sample prep kit(Illumina, Inc., San Diego, CA)을 이용하여 350bp의 DNA 단편으로 구성된 라이브러리를 구축하였고, 최종 산물은 2100 BioAnalyzer 기기를 이용하여 확인하였다.
DNA 단편들은 블런트 말단(blunt end)으로 제작하였고, 인산화한 후에, single "T" overhang을 갖는 어뎁터에 라이게이션 하기 위해 single "A" 뉴클레오티드를 3-말단에 추가하였다. 게놈 DNA 단편의 양 말단에 어뎁터 라이게이션은 게놈 단편에 각 가닥의 5'-와 3'-말단에 다른 서열을 제공하였다. 라이브러리의 질은 capillary electrophoresis(Bioanalyzer, Agilent) 기기를 사용하여 검증하였다.
QX200 Droplet Digital PCR System(Bio-Rad) 기기를 사용하여 정량한 후에, Whole-genome sequencing 분석을 Illumina NovaSeq 6000 system(Illumina) 기기를 사용하여 수행하였다.
1-4. 유전체 정보 확보를 위한 생물정보학 분석
확보된 서열 리드(sequence reads)는 sickle(v1.33) 및 BWA(ver. 0.7.12.) 프로그램을 사용하여 고품질의 리드(reads)만 필터링하여 얻었고, 이것은 홍해삼에 대해 맵핑(mapping) 및 게놈 어셈블리(genome assembly)를 하는데 사용되었다.
맵핑(mapping) 이후, 로컬 재정렬(local realignment)은 GATK(ver. 3.1-1) 프로그램을 사용하여 수행하였고, 중합체(duplicates)는 Picard(ver. 1.98)(http://picard.sourceforge.net) 프로그램을 사용하여 분석하였다. 서열상의 변이들은 GATK(ver 3.1-1) 프로그램을 통해 콜링(calling)이 이루어졌으며, 변이에 대한 어노테이션(annotation)은 SnpEff(v.4.1) 프로그램에 의해서 수행되었다.
1-5. 일반적인 유전자 조작 및 형광유전자 마커 분석
일반적인 유전자 조작은 Sambrook et al(1989)의 방법에 의해 수행되었다. 유전체 정보 분석을 통해 확보된 후보 분자마커는 PCR 증폭을 위해 프라이머(primer)(바이오니아, 한국)를 디자인하고, 합성하였다. 프라이머 세트(primer set)와 PCR PreMix(AccuPower PCRMix, Bioneer)를 사용하여, 각 후보 분자마커를 증폭한 후, 아가로스 겔(agarose gel)에서 확인하였다.
형광 다이(dye)가 부가되어 PCR을 수행한 산물은 Gene Analyzer 3500 (Thermo Fisher Scientific, USA) 기기에 의해 분석되었다. Gene Analyzer 3500 기기에 의해 분석된 피크(peak)는 Gene mapper software(Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 표준 마커(standard maker)와 비교한 피크 사이즈를 분석하였다.
실시예 2. 홍해삼 SSR 유전자좌의 반복단위 분석
홍해삼 친자 및 계통 분석용 SSR 마커를 개발하기 위해 반복단위에 따른 SSRs(simple sequence repeats)를 분석하였고, 분석 결과를 [도 1]에 정리하였다.
[도 1]을 참조하면, [다이(Di)→트리(tri)→테트라(tetra)→펜타(penta)→헥사(hexa)] 뉴클레오타이드(nucleotides)의 반복 순서로 반복단위가 적을수록 관찰되는 개수가 높은 것으로 나타났다. 특히, 낮은 반복 수인 다이-뉴클레오타이드(di-nucleotides, 81.3%)와 트리-뉴클레오타이드(tri-nucleotides, 14.8%)를 합치면 96%로 SSRs의 대부분을 차지하는 것으로 나타났다. 이와 같은 양상은 대부분의 유전체 분석에서 나타나는 일반적인 양태와 유사한 것으로 보인다[Gutierrez et al., 2017; Lei et al., 2021; Liu et al., 2017; Song et al., 2021].
다이-뉴클레오타이드 및 트리-뉴클레오타이드의 반복단위를 갖는 SSRs은 일반적으로 중복밀림현상(stutter)이나 우선 증폭(preferential amplification) 현상이 발생할 수 있으므로 법의학에서는 전혀 활용되지 않는다. 따라서 본 연구에서는 다이-뉴클레오타이드 및 트리-뉴클레오타이드의 낮은 반복수 단위를 추가 실험에서 완전히 배제하였다.
이하, 추가 연구에서 고려된 SSRs 마커는 4 또는 5 반복단위를 갖는 SSRs 마커를 대상으로 하였다.
실시예 3. 후보 유전자 마커 선발 및 PCR 분석
테트라(tetra) 또는 펜타(penta) 뉴클레오타이드의 반복단위를 갖는 SSRs 마커 중에서 제주도(Jeju), 울진(Uljin), 울주(Ulju), 울릉도(토착)(UNa), 및 울릉도(양식)(UNo)의 5 지역의 홍해삼 샘플에 대해 모두 검출된 SSRs 마커 중에서 1차로 30개의 SSRs 마커를 선발하였다.
선발된 각 SSRs 마커에 대한 프라이머가 합성되었고, 각각에 대해 [도 2]에서 제시된 조건으로 PCR 반응을 수행하여 DNA 단편의 증폭하였다.
PCR 반응의 수행결과, DNA 증폭이 불량하거나 멀티플 밴드(multiple band)가 유발되는 SSRs 마커와 이에 대한 프라이머 세트들은 배제하고 최종적으로 16종의 SSRs 마커(표 1)와 이에 대한 프라이머 세트(표 2)를 선별하였다.
[표 1]
[표 2]
선별된 프라이머 세트들은 PCR 산물의 길이에 따라 250bps 이하와 251 bps 이상으로 분류하였고, 각각을 2개의 그룹으로 분류하였다. 예외적으로 UNa288과 UNo69로 구성된 프라이머 세트를 살펴보면, UNa288은 268bps 이하까지 구성되는 것으로 나타났으나, UNo69는 275 bps 이상으로 구성되었다.
구축된 각 쌍의 PCR 프라이머 세트로 해삼 샘플들의 DNA 단편 증폭을 실시한 결과는 [도 3]과 같다.
[도 3]을 참조하면, 각 프라이머 세트로 실시된 PCR 반응은 대체적으로 밴드(band) 형성이 양호하게 나타났다. 양식 중인 홍해삼 샘플 2종(YK1, YK2)으로 PCR 반응을 수행하였으며, 모든 프라이머 세트에 대해 밴드 형성이 뚜렷하게 나타났다. 본 프라이머 세트들이 청해삼에 대해서도 DNA 단편 증폭이 가능한지 확인하기 위해 양식 중인 청해삼 샘플 YK3 및 YK4을 시료로 하여 PCR 반응을 수행한 결과, 청해삼 샘플에 대해서도 모두 뚜렷하게 밴드 형성이 관찰되었으며, 향후 본 프라이머 세트를 이용하여 청해삼 샘플에 대한 유전자 마커로도 활용할 수 있을 것으로 분석되었다.
실시예 4. 형광 dye를 사용한 DNA 단편 증폭
PCR 반응을 수행한 결과, 16종의 프라이머 세트에서 모두 뚜렷한 밴드를 형성하였기 때문에, 각 프라이머 세트에 대해 [도 4]에 정리한 바와 같이 A 세트와 B 세트로 분류하였고, 4종의 FAM, Hex, TAMRA, Cy3.5로 각 프라이머의 forward 프라이머의 5' 위치에 형광 dye를 부착하였다.
[표 3]
각 형광 dye 내에서는 PCR 산물 분자량에 따라 각 프라이머 2쌍을 분배하였다. 또한, [도 4]에는 각 지역의 홍해삼 SSRs 마커의 가상적 PCR에 따른 PCR 산물 변화 폭을 size와 variation으로 표시하였고, 반복단위 및 반복개수 등을 나타내었다. JJP1 마커는 5 뉴클레오타이드(nucleotide) 반복단위로 구성되어 있으나, 나머지 15종의 SSRs 마커들은 모두 뉴클레오타이드(nucleotide) 반복단위로 구성되어 있다.
각 프라이머 세트에 의한 PCR 산물은 GC 함량이 32~50% 사이에 존재하여 비교적 PCR을 수행하기 용이한 것으로 나타났다.
다른 한편으로, JJP1 및 UNaT30 마커는 엑손 부위에 존재할 것으로 추정되는 반면에, UNo69, UNoT31, UNaT17, 및 JJT13의 마커들은 인트론 부위에 존재하는 것으로 분석되었다. 나머지 마커들은 모두 유전자간 부위(intergenic region)에 존재하는 것으로 분석되었다. Genetic Analyzer 3500 (Thermo Fisher Scientific, USA)와 GeneMapper ID v3.2(ABI, USA)를 통해 분석한 결과, JJP1 및 UNaT30 마커는 피크(peak) 생산이 명확하게 나타나지 않는 것으로 관찰되었다(data not shown). 따라서, 추가적인 연구에서 JJP1와 UNaT30 마커는 제외되었다.
[도 5] 및 [도 6]은 [도 4]의 A와 B 세트를 이용한 multiple PCR 반응을 수행한 실험 결과를 정리한 그래프이다. 두 세트 모두 peak 생산이 명확하게 관찰된다.
상기 결과를 바탕으로 홍해삼 종묘를 생산하는 3개 업체로부터 모삼과 종묘를 각각 구입하여 홍해삼의 친자 분석을 수행하였다. 분석 결과를 정리한 [도 7]을 참조하면, 업체별 및 유연관계 별로 명확한 결과가 도출되는 것을 확인할 수 있었다.
[도 7]을 참조하면, Group 1 실험군은 동일업체에서 확보된 모삼과 종묘로 친자분석을 실시한 실험군이다. 18.75% 샘플은 14개 마커가 모두 일치하였고, 37.38% 샘플은 1개 마커가 불일치하였으며, 및 40.93% 샘플은 2개 마커가 불일치하였다. 현재 청해삼 친자 분석의 경우 2개 마커의 불일치까지 친자관계를 인정하고 있다. 따라서, 청해삼 친자 분석과 유사하게 대입시 2개 마커 이상 불일치도는 93.75%로 나타나 본 발명의 14종 마커의 정확도는 93.75%임을 확인할 수 있다.
또한, Group 3 실험군은 C 업체의 모삼과 A 업체의 종묘를 샘플로 하여 친자분석을 실시한 실험군으로 2개 마커 이상 불일치도는 65.63%로 나타나, A 업체와 C 업체가 비교적 유연관계가 높은 모삼을 사용하여 홍해삼을 생산하는 것으로 분석되었다.
반면, Group 2의 A 업체 모삼과 B 업체 종묘, Group 4의 C 업체 모삼과 B 업체 종묘로 친자분석한 분석 결과를 참조하면, B 업체는 A 업체 또는 C 업체와 유연관계가 낮은 종묘를 이용하는 것으로 추정된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (9)
- Una288, UNo69, UNoT15, JJ93, UNoT26, UNoT31, UNoT10, UNaT17, UNaT18, JJP19, JJP13, UJiT10, JJP20, 및 UJiT11로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SSR 유전자좌에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 포함하는 홍해삼 개체 식별용 마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 SSR 유전자좌인 Una288에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트이고, 상기 SSR 유전자좌인 UNo69에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트이며, 상기 SSR 유전자좌인 UNoT15에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트이고, 상기 SSR 유전자좌인 JJ93에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트이며, 상기 SSR 유전자좌인 UNoT26에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트이고, 상기 SSR 유전자좌인 UNoT31에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 세트이며, 상기 SSR 유전자좌인 UNoT10에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 세트이고, 상기 SSR 유전자좌인 UNaT17에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 세트이며, 상기 SSR 유전자좌인 UNaT18에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머 세트이고, 상기 SSR 유전자좌인 JJP19에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머 세트이며, 상기 SSR 유전자좌인 JJP13에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 21 및 서열번호 22의 프라이머 세트이고, 상기 SSR 유전자좌인 UJiT10에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는,
홍해삼 개체 식별용 마커 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 각 정방향(forward) 염기서열 5' 말단에 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichloro fluorescein), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), Cy3.5, 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 형광물질로 표지된 것을 특징으로 하는,
홍해삼 개체 식별용 마커 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 SSR 유전자좌인 Una288은 반복서열 (CATT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 7회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 14회, 제주 홍해삼 개체에서 20회, 울진 홍해삼 개체에서 8회, 울주 홍해삼 개체에서 16회 반복되는 것을 특징으로 하고,
상기 SSR 유전자좌인 UNo69는 반복서열 (AACT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 16회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 19회, 제주 홍해삼 개체에서 7회, 울진 홍해삼 개체에서 7회, 울주 홍해삼 개체에서 19회 반복되는 것을 특징으로 하며,
상기 SSR 유전자좌인 UNoT15는 반복서열 (AATG)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 23회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 17회, 제주 홍해삼 개체에서 25회, 울진 홍해삼 개체에서 25회, 울주 홍해삼 개체에서 17회 반복되는 것을 특징으로 하고,
상기 SSR 유전자좌인 JJ93은 반복서열 (ACGC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 6회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 6회, 제주 홍해삼 개체에서 10회, 울진 홍해삼 개체에서 7회, 울주 홍해삼 개체에서 6회 반복되는 것을 특징으로 하며,
상기 SSR 유전자좌인 UNoT26은 반복서열 (ACAT)(AC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 (ACAT) 25회 및 (AC) 18회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 (ACAT) 21회 및 (AC) 14회, 제주 홍해삼 개체에서 (ACAT) 19회 및 (AC) 17회, 울진 홍해삼 개체에서 (ACAT) 27회 및 (AC) 17회, 울주 홍해삼 개체에서 (ACAT) 21회 및 (AC) 14회 반복되는 것을 특징으로 하고,
상기 SSR 유전자좌인 UNoT31은 반복서열 (CAGT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 18회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 26회, 제주 홍해삼 개체에서 12회, 울진 홍해삼 개체에서 27회, 울주 홍해삼 개체에서 26회 반복되는 것을 특징으로 하며,
상기 SSR 유전자좌인 UNoT10은 반복서열 (CATT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 15회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 13회, 제주 홍해삼 개체에서 20회, 울진 홍해삼 개체에서 14회, 울주 홍해삼 개체에서 13회 반복되는 것을 특징으로 하고,
상기 SSR 유전자좌인 UNaT17은 반복서열 (GTCT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 8회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 17회, 제주 홍해삼 개체에서 15회, 울진 홍해삼 개체에서 9회, 울주 홍해삼 개체에서 17회 반복되는 것을 특징으로 하며,
상기 SSR 유전자좌인 UNaT18은 반복서열 (TGTC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 14회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 8회, 제주 홍해삼 개체에서 6회, 울진 홍해삼 개체에서 9회, 울주 홍해삼 개체에서 8회 반복되는 것을 특징으로 하고,
상기 SSR 유전자좌인 JJP19는 반복서열 (TGAC)(GGAC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 7회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 16회, 제주 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 10회, 울진 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 9회, 울주 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 16회 반복되는 것을 특징으로 하며,
상기 SSR 유전자좌인 JJP13은 반복서열 (TACA)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 6회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 10회, 제주 홍해삼 개체에서 12회, 울진 홍해삼 개체에서 11회, 울주 홍해삼 개체에서 10회 반복되는 것을 특징으로 하고,
상기 SSR 유전자좌인 UJiT10은 반복서열 (AGAC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 5회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 8회, 제주 홍해삼 개체에서 10회, 울진 홍해삼 개체에서 11회, 울주 홍해삼 개체에서 8회 반복되는 것을 특징으로 하며,
상기 SSR 유전자좌인 JJP20은 반복서열 (ACTG)(GCTG)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 (ACTG) 10회 및 (GCTG) 7회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 (ACTG) 9회 및 (GCTG) 7회, 제주 홍해삼 개체에서 (ACTG) 17회 및 (GCTG) 9회, 울진 홍해삼 개체에서 (ACTG) 13회 및 (GCTG) 8회, 울주 홍해삼 개체에서 (ACTG) 9회 및 (GCTG) 7회 반복되는 것을 특징으로 하고,
상기 SSR 유전자좌인 UJiT11은 반복서열 (AGAC)(AAAC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 (AGAC) 1회 및 (AAAC) 4회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 (AGAC) 5회 및 (AAAC) 5회, 제주 홍해삼 개체에서 (AGAC) 6회 및 (AAAC) 3회, 울진 홍해삼 개체에서 (AGAC) 1회 및 (AAAC) 3회, 울주 홍해삼 개체에서 (AGAC) 5회 및 (AAAC) 5회 반복되는 것을 특징으로 하여,
울릉도(자연산), 울릉도(양식), 제주, 울진 및 울주의 지역별 홍해삼 개체를 식별 가능한 것을 특징으로 하는 홍해삼 개체 식별용 마커 조성물. - 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 마커 조성물을 포함하는 홍해삼 개체 식별용 키트.
- 제5항에 있어서, 상기 키트는 PCR 키트인 것인 홍해삼 개체 식별용 키트.
- (a) 분석하고자 하는 해삼 개체의 생물학적 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 DNA를 Una288, UNo69, UNoT15, JJ93, UNoT26, UNoT31, UNoT10, UNaT17, UNaT18, JJP19, JJP13, UJiT10, JJP20, 및 UJiT11로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SSR 유전자좌에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 반응의 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는,
홍해삼의 개체 식별 방법. - 제7항에 있어서,
상기 SSR 유전자좌인 Una288은 반복서열 (CATT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 7회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 14회, 제주 홍해삼 개체에서 20회, 울진 홍해삼 개체에서 8회, 울주 홍해삼 개체에서 16회 반복되는 것을 특징으로 하고,
상기 SSR 유전자좌인 UNo69는 반복서열 (AACT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 16회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 19회, 제주 홍해삼 개체에서 7회, 울진 홍해삼 개체에서 7회, 울주 홍해삼 개체에서 19회 반복되는 것을 특징으로 하며,
상기 SSR 유전자좌인 UNoT15는 반복서열 (AATG)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 23회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 17회, 제주 홍해삼 개체에서 25회, 울진 홍해삼 개체에서 25회, 울주 홍해삼 개체에서 17회 반복되는 것을 특징으로 하고,
상기 SSR 유전자좌인 JJ93은 반복서열 (ACGC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 6회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 6회, 제주 홍해삼 개체에서 10회, 울진 홍해삼 개체에서 7회, 울주 홍해삼 개체에서 6회 반복되는 것을 특징으로 하며,
상기 SSR 유전자좌인 UNoT26은 반복서열 (ACAT)(AC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 (ACAT) 25회 및 (AC) 18회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 (ACAT) 21회 및 (AC) 14회, 제주 홍해삼 개체에서 (ACAT) 19회 및 (AC) 17회, 울진 홍해삼 개체에서 (ACAT) 27회 및 (AC) 17회, 울주 홍해삼 개체에서 (ACAT) 21회 및 (AC) 14회 반복되는 것을 특징으로 하고,
상기 SSR 유전자좌인 UNoT31은 반복서열 (CAGT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 18회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 26회, 제주 홍해삼 개체에서 12회, 울진 홍해삼 개체에서 27회, 울주 홍해삼 개체에서 26회 반복되는 것을 특징으로 하며,
상기 SSR 유전자좌인 UNoT10은 반복서열 (CATT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 15회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 13회, 제주 홍해삼 개체에서 20회, 울진 홍해삼 개체에서 14회, 울주 홍해삼 개체에서 13회 반복되는 것을 특징으로 하고,
상기 SSR 유전자좌인 UNaT17은 반복서열 (GTCT)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 8회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 17회, 제주 홍해삼 개체에서 15회, 울진 홍해삼 개체에서 9회, 울주 홍해삼 개체에서 17회 반복되는 것을 특징으로 하며,
상기 SSR 유전자좌인 UNaT18은 반복서열 (TGTC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 14회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 8회, 제주 홍해삼 개체에서 6회, 울진 홍해삼 개체에서 9회, 울주 홍해삼 개체에서 8회 반복되는 것을 특징으로 하고,
상기 SSR 유전자좌인 JJP19는 반복서열 (TGAC)(GGAC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 7회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 16회, 제주 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 10회, 울진 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 9회, 울주 홍해삼 개체에서 (TGAC) 5회 및 (GGAC) 16회 반복되는 것을 특징으로 하며,
상기 SSR 유전자좌인 JJP13은 반복서열 (TACA)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 6회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 10회, 제주 홍해삼 개체에서 12회, 울진 홍해삼 개체에서 11회, 울주 홍해삼 개체에서 10회 반복되는 것을 특징으로 하고,
상기 SSR 유전자좌인 UJiT10은 반복서열 (AGAC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 5회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 8회, 제주 홍해삼 개체에서 10회, 울진 홍해삼 개체에서 11회, 울주 홍해삼 개체에서 8회 반복되는 것을 특징으로 하며,
상기 SSR 유전자좌인 JJP20은 반복서열 (ACTG)(GCTG)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 (ACTG) 10회 및 (GCTG) 7회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 (ACTG) 9회 및 (GCTG) 7회, 제주 홍해삼 개체에서 (ACTG) 17회 및 (GCTG) 9회, 울진 홍해삼 개체에서 (ACTG) 13회 및 (GCTG) 8회, 울주 홍해삼 개체에서 (ACTG) 9회 및 (GCTG) 7회 반복되는 것을 특징으로 하고,
상기 SSR 유전자좌인 UJiT11은 반복서열 (AGAC)(AAAC)를 포함하되, 상기 반복서열이 울릉도(자연산) 홍해삼 개체에서 (AGAC) 1회 및 (AAAC) 4회, 울릉도(양식) 홍해삼 개체에서 (AGAC) 5회 및 (AAAC) 5회, 제주 홍해삼 개체에서 (AGAC) 6회 및 (AAAC) 3회, 울진 홍해삼 개체에서 (AGAC) 1회 및 (AAAC) 3회, 울주 홍해삼 개체에서 (AGAC) 5회 및 (AAAC) 5회 반복되는 것을 특징으로 하는,
홍해삼의 개체 식별 방법. - 제7항에 있어서, 단계 (b)의 PCR 반응은 중합효소연쇄반응, 다중 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, 실시간 중합효소연쇄반응, 실시간 정량적 중합효소연쇄반응, DNA 칩 및 등온증폭법으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나를 이용하는 것인,
홍해삼의 개체 식별 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220133344A KR20240053709A (ko) | 2022-10-17 | 2022-10-17 | 홍해삼의 다형성 ssr dna 마커 및 이를 이용한 개체식별 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220133344A KR20240053709A (ko) | 2022-10-17 | 2022-10-17 | 홍해삼의 다형성 ssr dna 마커 및 이를 이용한 개체식별 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240053709A true KR20240053709A (ko) | 2024-04-25 |
Family
ID=90885052
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220133344A KR20240053709A (ko) | 2022-10-17 | 2022-10-17 | 홍해삼의 다형성 ssr dna 마커 및 이를 이용한 개체식별 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20240053709A (ko) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101083015B1 (ko) | 2011-06-13 | 2011-11-22 | 대한민국 | 돌기해삼의 체색변이 종인 홍해삼과 청해삼의 유전학적 구별 방법 및 이에 이용되는 대립유전자 특이적 프라이머 |
| KR102037636B1 (ko) | 2019-06-10 | 2019-10-28 | 제주특별자치도(제주특별자치도해양수산연구원장) | 홍해삼 수정란 생산방법 |
-
2022
- 2022-10-17 KR KR1020220133344A patent/KR20240053709A/ko unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101083015B1 (ko) | 2011-06-13 | 2011-11-22 | 대한민국 | 돌기해삼의 체색변이 종인 홍해삼과 청해삼의 유전학적 구별 방법 및 이에 이용되는 대립유전자 특이적 프라이머 |
| KR102037636B1 (ko) | 2019-06-10 | 2019-10-28 | 제주특별자치도(제주특별자치도해양수산연구원장) | 홍해삼 수정란 생산방법 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4226476B2 (ja) | 環状化可能プローブを用いた複数の標的配列の分析と検出 | |
| WO2006094360A1 (en) | Method of amplifying nucleic acid | |
| KR102077917B1 (ko) | 넙치 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법 | |
| KR20230100949A (ko) | 작약의 품종을 판별하기 위한 단일염기다형성을 갖는 유전자 마커 | |
| WO1995015400A1 (en) | Genotyping by simultaneous analysis of multiple microsatellite loci | |
| CN111304356B (zh) | 一组快速高通量鉴定香榧性别性状的分子标记引物组合及其应用 | |
| KR20230149050A (ko) | 인삼의 품종을 판별하기 위한 단일염기다형성을 갖는 유전자 마커 | |
| CN110438252B (zh) | 与菠菜雌雄性别紧密连锁的分子标记及其应用 | |
| Marmiroli et al. | Advanced PCR techniques in identifying food components | |
| CN114774570B (zh) | 与小麦茎基腐病抗性qtl紧密连锁的分子标记及应用 | |
| KR20180077873A (ko) | 수박 분자마커이용여교잡 선발용 snp 마커 | |
| KR102121570B1 (ko) | 인삼 품종 또는 자원의 판별 및 분류를 위한 snp 기반 kasp용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| CN110551844A (zh) | 一种甘蔗栽培种基因组ssr分子标记开发方法和应用 | |
| US20210332433A1 (en) | Method for identifying genetic sex of Portunus trituberculatus | |
| CN107475414B (zh) | 一种筛选长牡蛎高糖原含量亲贝的方法 | |
| Seifi et al. | Overview of real-time PCR principles | |
| KR102586202B1 (ko) | 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용하여 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비를 판별하는 방법 | |
| Lee et al. | Identification and characterization of simple sequence repeat markers for Pythium aphanidermatum, P. cryptoirregulare, and P. irregulare and the potential use in Pythium population genetics | |
| KR20240053709A (ko) | 홍해삼의 다형성 ssr dna 마커 및 이를 이용한 개체식별 방법 | |
| CN114606335A (zh) | 玉米抗甘蔗花叶病毒病基因的kasp分子标记的开发及应用 | |
| WO2004001016A2 (en) | Methods for detection of genetic alterations associated with cancer | |
| KR101649589B1 (ko) | 사과에서 유래된 ssr 프라이머 및 이의 용도 | |
| KR102111238B1 (ko) | 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커 조성물 및 이를 이용한 자바리 분석방법 | |
| KR20230133678A (ko) | 홍해삼의 다형성 초위성체 dna 마커 및 이를 이용한 개체식별 방법 | |
| CN107988380B (zh) | 一种紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝物种间分子鉴定的方法 |