KR20240025636A - 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기를 포함하는 분자 복합체에 관한 것이다: - 트랜스포사제의 적어도 2개의 결합 절반-부위를 포함하는 제1 단일 가닥 핵산 분자, 및 - 트랜스포사제의 적어도 하나의 결합 절반-부위를 포함하는 제2 단일 가닥 핵산 분자. 상기 복합체는, 상기 트랜스포사제의 2개의 이중 가닥 결합 부위를 정의하도록, 상기 제1 및 제2 단일 가닥 핵산 분자가 Watson 및 Crick에 의해 정의된 염기 상보성에 따라 쌍을 이루도록 되어 있다. 본 발명은 또한, 특히 DNA 편집을 위한, 상기 복합체의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
살아있는 세포의 유전 정보 변형이 미치는 영향을 이해하려는 욕구는 유전학의 제1 단계로 거슬러 올라간다.
우선, 통상적인 유전학은 특정 유전 부위를 선택함으로써 유전학적 변형과 그에 따른 표현형을 이해하려고 시도한다.
그 후, 생화학자들은 실험 유기체에서 유전적 돌연변이의 확률을 높이기 위해 방사선과 화학적 돌연변이 유발 물질을 사용해 왔다. 이들 방법은 매우 유용하기는 하지만, 비용이 많이 들고 유전 물질에 도입된 변형을 쉽게 제어할 수 없다.
숙주 유기체에 대한 방어 또는 세포 복구를 위한 분자 메커니즘에 대한 지식 및 분자 생물학을 통해 수많은 기술을 개발할 수 있게 되었고, 이를 통해 소위 역유전학의 개발이 가능해졌으며, 이의 목적은 소위 통상적인 유전학적 스크리닝과 반대된다.
역유전학은 결과적인 표현형 효과를 측정하고 분석할 목적으로 유전 물질에 돌연변이를 도입하는 것을 목표로 한다.
게놈 편집 전략은 지난 30년 동안 발전해 왔으며, 표적화된 유전자 변형의 맥락에서의 가장 최근의 혁신과 혁명은 CRISPR/CRISPR 관련 단백질 9(Cas9)시스템(CRISPR/Cas-9)이다. 이와 관련하여, 2개의 특허(유럽 특허 EP 3 144 390 B1호 및 미국 특허 US 8 697 359 B1호)가 언급될 수 있으며, 두 특허 모두 이 기술을 기재한다.
따라서 CRISPR/Cas-9 시스템은 유전학적 변형을 위한 참조 도구로 자리 잡았다. 그러나 이 CRISPR 혁명은 분자 가위와 유사하며, 이는 전체 엑손의 전체 재조합을 허용하는 데 충분하지 않다.
최근에는, CRISPR(트랜스포존-인코딩되는 CRISPR-Cas 시스템) 시스템에 의해 인코딩되는 트랜스포사제가 CRISPR 기술의 결함에 대한 절반의 대응이 되고 있다. 실제로 이 기술은 트랜스포존 Tn7을 통한 표적화된 통합 및 이어서 CRISPR 기술을 통해 게놈에 서열을 추가하는 것 둘 모두를 사용한다. 그러나 어떤 경우에도, 이는 재조합은 아니다.
프라임 편집(prime editing) 기술은 CRISPR 도구를 역전사효소와 결합시키는 유전자 대체의 또 다른 가능성이다. 게놈 편집에서의 최근의 발전은, 2개의 DNA 가닥 중 하나의 크기에 따라 대체를 허용하며, 이는, 세포 통합 및 복구 시스템에 내재되어 있으며 이에 따라 달라지는 강력한 제한으로 남아 있다.
또한, 본 발명은 특히, 선행 기술의 이러한 단점을 극복하는 것을 목표로 한다.
본 발명의 목적 중 하나는 게놈 편집을 허용하는 재조합 도구를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이 새로운 도구가 조작된 서열의 크기에 의존하지 않도록 하고 이 시스템이 사용자에 의해 제어되고 제어 가능하도록 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 제어되고 제한된 방식으로 DNA 복구 시스템을 사용하여 사용자의 의지에 따라 관심 분자의 단일 가닥 또는 이중 가닥 대체를 가능하게 하는 도구를 제공하는 것이다.
본 발명은 관심 핵산의 상보적 서열의 삽입을 허용하는 A 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성된 제1 단일 가닥 핵산 분자에 관한 것이며,
여기서 상기 A 서열은 5'에서 40 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 제1 T-풍부 서열에 결합하고, 3'에서 40 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 제2 T-풍부 서열에 결합하며, 상기 제1 및 제2 T-풍부 서열은 각각 6 내지 12개의 G/C-풍부 뉴클레오티드의 제1 및 제2 도메인을 포함하고, 상기 제1 도메인의 서열은 상기 제2 도메인의 서열에 상보적이고, 상기 제1 및 제2 도메인은 상기 A 서열로부터 15 내지 52개 뉴클레오티드에 위치하며, 상기 제1 분자는 5' 말단에 트랜스포사제를 인식하기 위한 5'에서 3' 방향으로 배향된 제1 서열을 포함하고, 3' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 적어도 하나의 제2 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 분자 복합체에 관한 것이며, 이는,
- 관심 핵산의 상보적 서열의 삽입을 허용하는 A 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성된 제1 단일 가닥 핵산 분자, -
여기서 상기 A 서열은 5'에서 40 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 제1 A/T-풍부, 특히 T-풍부 서열에 결합하고, 3'에서 40 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 제2 A/T-풍부, 특히 T-풍부 서열에 결합하며, 상기 제1 및 제2 A/T-풍부, 특히 T-풍부 서열은 각각 6 내지 12개의 G/C-풍부 뉴클레오티드의 제1 및 제2 도메인을 포함하고, 상기 제1 도메인의 서열은 상기 제2 도메인의 서열에 상보적이고, 상기 제1 및 제2 도메인은 상기 A 서열로부터 15 내지 52개 뉴클레오티드에 위치하며, 상기 제1 분자는 5' 말단에 트랜스포사제를 인식하기 위한 5'에서 3' 방향으로 배향된 제1 서열을 포함하고, 3' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 적어도 하나의 제2 서열을 포함함 -; 및
- 5' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 적어도 하나의 상보적 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성된 제2 단일 가닥 핵산 분자를 포함하고,
상기 복합체는, 상기 트랜스포사제의 2개의 이중 가닥 결합 부위를 정의하도록, 상기 제1 및 제2 단일 가닥 핵산 분자가 Watson 및 Crick에 의해 정의된 염기 상보성에 따라 쌍을 이루도록 되어 있다.
이는 본 발명이 제1 단일 가닥 핵산 분자와 제2 단일 가닥 핵산 분자를 포함하는 분자 복합체에 관한 것이며, 여기서 상기 제2 단일 가닥 핵산 분자는 5' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 적어도 하나의 상보적 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되며,
상기 복합체는, 상기 트랜스포사제의 2개의 이중 가닥 결합 부위를 정의하도록, 상기 제1 및 제2 단일 가닥 핵산 분자가 Watson 및 Crick에 의해 정의된 염기 상보성에 따라 쌍을 이루도록 되어 있음을 의미한다.
본 발명은 관심 핵산의 영역을 표적화할 수 있는 특정 단일 가닥 가이드의 사용이 제어된 "부위 특이적" 방식으로 트랜스포사제를 동원하는 것을 가능하게 하여, 관심 분자의 서열을 대체하도록 상기 트랜스포사제의 재조합 특성을 사용하는 것을 가능하게 한다는 본 발명자의 예상치 못한 관찰에 기초한다.
전술된 분자 복합체는 사실상 본 발명에 정의된 기술의 기본 단위이다. 이 기본 단위는 재조합, 및 따라서 서열 대체가 일어나야 하는 특정 부위로 재조합효소를 안내하는 데 유용하다. PAM 유형(NGG) 서열의 존재를 요구하는 CRISPR/Cas9 시스템과 달리, 본원에 정의된 분자 도구는 서열에 관계없이 임의의 표적 서열에 사용될 수 있다.
따라서 전술된 분자 복합체는 하기에 의해 완성되는 기본 단위이다:
- 표적 서열의 상동성 영역, 및
- 표적 서열의 대체 영역.
따라서 이는 이후에 기재되는 도구의 중간 생성물이다.
상기 분자 복합체는 DNA 분자, RNA 분자 또는 혼합 RNA 및 DNA 분자일 수 있는 2개의 단일 가닥 핵산 분자로 구성된다.
이 두 분자는 Watson과 Crick에 의해 정의된 핵산의 염기 상보성에 따라 부분적으로 서로 상보적이며, 즉, 아데닌은 티미딘 또는 우라실과 쌍을 이루고 시토신은 구아닌과 쌍을 이루며, 그 반대도 마찬가지이다.
보다 구체적으로, 전술된 복합체를 형성하는 2개의 분자 각각은 트랜스포사제의 결합 서열에 해당하는 이중 가닥 분자의 가닥 중 하나의 서열을 포함한다. 또한, 따라서, 각각의 단일 가닥 분자는 트랜스포사제 결합 "반서열(half sequence)"을 포함하므로 상기 해당하는 트랜스포사제와의 상호작용을 허용할 수 없다. 반면에, 상기 복합체의 두 분자가 상기에 정의된 바와 같은 염기 쌍 결합에 의해 함께 상호작용하는 경우, 이중 가닥 분자가 형성되어 상기 트랜스포사제의 이중 가닥 결합 부위를 재구성하고, 따라서 후자는 형성된 분자와 상호작용할 수 있다.
제1 분자.
상기 복합체의 제1 분자는, 일단 변형되면, 관심 핵산 분자의 관심 영역을 특이적으로 표적화하는 것을 가능하게 하는 핵산 서열을 포함하는 분자이다. 이 관심 서열은 선택된 표적에 따라 시스템 사용자에 의해 선택된다. 이 관심 서열은 상기 A 영역에서 상기 복합체의 제1 분자에 삽입된다. 이 A 영역은, 표적 분자를 표적화하는 것을 가능하게 하는 서열이 그 중간에 삽입되는 2개의 핵산에 적어도 해당한다. 핵산의 방향성 구조(5'에서 3' 방향)를 고려할 때, 표적 서열과 쌍을 이루기 위해서는, 관심 영역을 표적화하는 것을 가능하게 하는 서열이 올바른 방향으로 위치하는 것이 중요하다.
또한, 유리하게는, 상기 A 영역은 방향성 삽입을 촉진하기 위해 제한 효소를 인식하는 하나 이상의 부위를 포함한다. 하기 부위 중 하나 이상이 상기 A 영역에 존재할 수 있다:
[표 1]
분명히, 상기 제1 분자의 화학적 합성의 맥락에서, 표적 영역을 표적화하는 것을 가능하게 하는 서열의 클로닝(또는 삽입) 부위를 가질 필요는 없으며, 오히려 올바른 방향의 서열을 제공하기 위해 세심한 주의를 기울여야 한다. 그러나 이것은 물론 가능하다.
상기 제1 분자는, 구조의 특정 유연성을 허용하기 위해, 상기 A 영역의 양쪽에서, A/T-풍부 서열로 추가로 구성되거나, 또는 RNA의 경우, A/U-풍부 서열로 추가로 구성된다. A/T-풍부 또는 A/U-풍부는, 본 발명에서, 서열을 구성하는 뉴클레오티드의 전체 수에 대해, 50% 초과의 A 또는 T 또는 U, 바람직하게는 50% 초과의 T 또는 U를 포함하는 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 상기 A 영역의 양쪽에 있는 이들 서열은 10개 뉴클레오티드 내지 60개 뉴클레오티드 범위의 뉴클레오티드 크기를 갖는다.
수많은 A, T 또는 U 염기의 존재로 인해 상기 A 영역의 측면에 위치하는 이러한 서열의 유연성은, 아마도 상기 복합체가 표적 분자를 아직 인식하지 않은 경우에도, 충분히 제어되지 않은 재조합효소를 통해 재조합을 허용하는 효과를 가질 수 있다.
또한, 이러한 문제를 극복하기 위해, 상기 A 영역에 접해 있는 A/T-풍부, 특히 T-풍부, 또는 A/U-풍부 서열 각각에 GC-풍부 서열이 도입된다. 이들 G/C-풍부 영역은 6 내지 12개 뉴클레오티드로 구성되며, 여기서 C 또는 G 염기의 양은 상기 G/C-풍부 서열에 함유된 뉴클레오티드의 50%를 초과한다.
상기 제1 분자의 구조를 안정화하고, 전술된 바와 같이, 의도하지 않은 재조합을 방지하기 위해, 상기 G/C-풍부 영역은 상기 A 영역의 말단으로부터 15 내지 52개 뉴클레오티드에 위치한다.
더 명확하게 하기 위해, 상기 A 영역이 3개의 뉴클레오티드로 구성된 경우(중앙 뉴클레오티드는 위치 0에 해당함), 상기 A/T-풍부 또는 A/U-풍부 영역은 좌측에서는 위치 -2 및 우측에서는 위치 +2에서 시작한다. 따라서 좌측에는 상기 G/C 풍부 영역이 위치 -17에서 위치 -54까지 위치하고, 우측에는 위치 +17에서 위치 +54까지 위치한다.
또 다른 중요한 요소: 상기 A 영역의 우측(또는 5')에 있는 G/C-풍부 서열은 (Watson과 Crick의 쌍 형성 규칙에 따라) 상기 A 영역의 우측(또는 3')의 G/C-풍부 영역에 반드시 상보적이다. 또한, 상기 제1 단일 가닥 분자는 G/C-풍부 영역에서 그 자체와 쌍을 이루며, 이는, 상기 제1 분자의 A 영역에 삽입되는 영역의 상보적 표적 서열과 상호작용이 없는 한, 상기 트랜스포사제에 의한 재조합을 방지한다.
마지막으로, 상기 제1 분자는 5' 말단에 트랜스포사제에 결합하기 위한 제1 부위에 해당하는 서열을 포함하고, 3' 말단에 상기 트랜스포사제에 결합하기 위한 제2 부위를 포함한다.
상기 제1 결합 부위와 상기 제2 결합 부위는 유리하게는 동일하며, 특히, 둘 모두 상기 트랜스포사제의 이중 가닥 결합 부위의 동일한 가닥에 해당한다. 이는 상기 제1 분자의 5' 영역에 존재하는 제1 트랜스포사제 결합 부위가 3' 영역에 존재하는 트랜스포사제 결합 부위와 완전하게 및 따라서 안정적으로만 쌍을 이룰 수 있음을 의미한다.
상기 제1 결합 부위와 상기 제2 결합 부위는 유리하게는 동일하지만, 각각은 이중 가닥 트랜스포사제 결합 부위의 다른 가닥에 해당한다. 또한, 예를 들어, 상기 제1 트랜스포사제 결합 부위가 센스 가닥에 해당하는 경우, 상기 제2 트랜스포사제 결합 부위는 상보적 가닥의 서열에 해당한다. 그러면 하기의 두 가지 구성을 갖는 것이 가능하다: i) 상보적 가닥에 해당하는 제2 결합 부위는 3'에서 5' 방향으로 배향되며, 이 경우 이는 상기 제1 트랜스포사제 결합 부위와 쌍을 이루어 이중 가닥 부위를 형성할 수 있음, ii) 상보적 가닥에 해당하는 제2 결합 부위가 5'에서 3' 방향으로 배향되며, 이 경우 이는, 배향이 상보적이지 않기 때문에 상기 제1 트랜스포사제 결합 서열과 쌍을 이룰 수 없음. 전술된 i)의 경우, 상기 제1 단일 가닥 분자가 상기 제1 및 제2 결합 부위에서 스스로 쌍을 이루면, 전술된 복합체를 형성할 수 없는데, 그 이유는 2개의 이중 가닥 트랜스포사제 결합 부위를 형성하도록 상기 제2 분자와 쌍을 이루기 위해 이용 가능한 단일 가닥 상보적 영역이 더 이상 존재하지 않기 때문이다.
또한, 상기 제1 분자는, 상기 A 부분의 표적 부위의 상보적 서열이 결여되거나, 이러한 표적 서열을 포함하지만 후자가 상기 표적 서열과 상호작용하지 않는(쌍을 이루지 않는) 경우, 3차원 분자를 형성하며, 여기서 전체 분자는, 서로 쌍을 이루는 G/C-풍부 영역에 해당하는 영역을 제외하고, 단일 가닥이다.
상기 제1 분자의 선형 개략도가 [도 1]에 도시되어 있고, 쌍을 이룬 형태의 개략도가 [도 2]에 도시되어 있다.
제2 분자.
전술된 복합체의 제2 분자는 제1 분자보다 더 간단한다. 이는, 5' 부분에, 상기 제1 분자의 3' 부분에 존재하는 상기 트랜스포사제에 결합하기 위한 부위에 상보적인 트랜스포사제 결합 부위를 포함한다. 따라서, 상기 복합체가 형성될 때, 상기 제1 분자의 3'에 위치한 (단일 가닥) 트랜스포사제 결합 절반-부위(half-site)는, 이중 가닥 트랜스포사제 결합 부위, 즉, 상기 트랜스포사제가 결합할 수 있는 이중 가닥 부위를 형성하도록, 상기 제2 분자의 5'에 위치한 (단일 가닥) 트랜스포사제 결합 절반-부위와 쌍을 이룰 수 있다.
상기 제2 분자의 3' 부분에는 상기 제1 분자의 A 영역과 유사한 영역이 존재하며, 이 영역은 관심 표적 분자 대신 삽입될 서열에 해당하는 특정 서열을 수용하는 것을 가능하게 한다. 하기는 이러한 치환을 허용하는 제2 분자를 제조하는 방법에 대한 보다 자세한 설명이다.
복합체
상기 제1 분자와 상기 제2 분자로 형성된 복합체는 [도 3]에 개략적으로 도시되어 있다.
상기 복합체는, 상기 제1 분자와 상기 제2 분자가 상기 트랜스포사제 결합 절반-부위를 통해 쌍을 이룰 때, 상기 복합체가, 재조합을 허용하는 기능적 이량체인 트랜스포사제 이량체에 결합할 수 있도록 하는 것이다.
또한, 상기 제1 분자 또는 제2 분자 중 하나는 상기 제1 분자의 5'에 위치한 트랜스포사제 결합 절반-부위의 상보적 서열을 추가로 포함한다. 상기 제1 분자의 5'에 위치한 트랜스포사제 결합 부위의 이러한 상보적 영역은 상기 제1 분자의 5' 또는 3'에 위치할 수 있거나, 또는 심지어 상기 제2 분자의 5'에, 바람직하게는 상기 제1 분자의 3'에 위치한 트랜스포사제 결합 부위의 상보적 서열의 5'에 위치할 수 있다.
본 발명에서, "상기 복합체는, 상기 트랜스포사제의 2개의 이중 가닥 결합 부위를 정의하도록, 상기 제1 및 제2 단일 가닥 핵산 분자가 Watson 및 Crick에 의해 정의된 염기 상보성에 따라 쌍을 이루도록 되어 있다". 상기 제1 분자는 5' 영역에 적어도 하나의 트랜스포사제 결합 절반-부위 및 3' 영역에 적어도 하나의 트랜스포사제 결합 절반-부위를 포함하고, 상기 제2 분자 또한 적어도 하나의 트랜스포사제 결합 절반-부위를 포함하므로, 이는 상기 제1 분자와 제2 분자가 쌍을 이루는 동안 2개의 완전한 부위가 형성됨을 의미하는데, 그 이유는,
* 상기 제1 분자는 5' 영역에 제1 트랜스포사제 결합 부위의 제1 서열과 상기 제1 트랜스포사제 결합 부위의 제1 서열의 상보적 서열을 포함하고, 3' 부분에 제2 트랜스포사제 결합 부위의 제2 서열을 포함하고,
* 상기 제2 분자는 상기 제2 트랜스포사제 결합 부위의 제2 서열의 상보적 서열을 포함하거나,
* 상기 제1 분자는 5' 영역에 제1 트랜스포사제 결합 부위의 제1 서열을 포함하고, 3' 부분에 제2 트랜스포사제 결합 부위의 제2 서열과 상기 제1 트랜스포사제 결합 부위의 제1 서열의 상보적 서열을 포함하고,
* 상기 제2 분자는 상기 제2 트랜스포사제 결합 부위의 제2 서열의 상보적 서열을 포함하거나,
* 상기 제1 분자는 5' 영역에 제1 트랜스포사제 결합 부위의 제1 서열을 포함하고, 3' 부분에 제2 트랜스포사제 결합 부위의 제2 서열을 포함하고,
* 상기 제2 분자는 상기 제1 트랜스포사제 결합 부위의 제1 서열의 상보적 서열, 및 상기 제2 트랜스포사제 결합 부위의 제2 서열의 상보적 서열을 포함하기 때문이다.
사용된 용어인 "적어도" 및 상기 분자가 트랜스포사제 인식 부위를 형성하는 서열을 "포함한다"는 사실은, 당업자로 하여금 결합 부위를 형성하는 반서열의 위치를 선택하도록 허용하여, 궁극적으로, 상기 복합체가 형성될 때 2개의 전체 부위가 재구성된다.
세 가지 옵션이 [도 4]에 개략적으로 도시되어 있으며, 이 중 두 가지가 아래에 상술되었다.
유리하게는, 본 발명은 전술된 복합체에 관한 것이며, 여기서 상기 A 서열은 관심 핵산의 상보적 서열을 포함한다.
전술된 바와 같이, 상기 A 영역은 관심 핵산의 상보적 서열을 함유할 수 있다. 보다 구체적으로, 전술된 복합체의 제1 분자의 A 영역에 함유된 서열은 관심 분자의 서열의 5' 또는 3'에 있는 서열과 상보적이므로, 상기 복합체는 상기 핵산 분자의 이 영역의 특이적 인식을 허용하고, 상기 복합체로 하여금 상기 A 영역에 함유된 서열에 상보적인 영역에 상보적인 영역에 인접한 영역을 대체하도록 허용한다.
다시 말하면, 본 발명은 유리하게는 전술된 복합체에 관한 것이며, 상기 복합체는,
- 관심 핵산의 상보적 서열의 삽입을 허용하는 A 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성된 제1 단일 가닥 핵산 분자 - 여기서 상기 상보적 A 서열은 5'에서 40 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 제1 A/T-풍부, 특히 T-풍부 서열에 결합하고, 3'에서 40 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 제2 A/T-풍부, 특히 T-풍부 서열에 결합하며, 상기 제1 및 제2 A/T-풍부, 특히 T-풍부 서열은 각각 6 내지 12개의 G/C-풍부 뉴클레오티드의 제1 및 제2 도메인을 포함하고, 상기 제1 도메인의 서열은 상기 제2 도메인의 서열에 상보적이고, 상기 제1 및 제2 도메인은 상기 A 서열로부터 15 내지 52개 뉴클레오티드에 위치하며, 상기 제1 분자는 5' 말단에 트랜스포사제를 인식하기 위한 5'에서 3' 방향으로 배향된 제1 서열을 포함하고, 3' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 적어도 하나의 제2 서열을 포함함 -; 및
- 5' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 적어도 하나의 상보적 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성된 제2 단일 가닥 핵산 분자를 포함하고,
상기 제1 및 제2 단일 가닥 핵산 분자는 상기 트랜스포사제의 2개의 이중 가닥 결합 부위를 정의하도록 Watson 및 Crick에 의해 정의된 염기 상보성에 따라 쌍을 이룬다.
유리한 일 실시형태에서, 본 발명은 전술된 복합체에 관한 것이며, 여기서 상기 제1 분자는 5' 말단에 트랜스포사제를 인식하기 위한 5'에서 3' 방향으로 배향된 제1 서열을 포함하고, 3' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 5'에서 3' 방향으로 배향된 제2 서열을 포함하며,
상기 제2 분자는 5' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제1 서열의 제1 상보적 서열, 및 이어서, 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 제2 상보적 서열을 포함한다.
본 발명의 복합체의 이러한 유리한 실시형태에서, 상기 제1 분자는 위치 5'에 제1 트랜스포사제 인식 서열을 포함하고 위치 3'에 제2 트랜스포사제 인식 서열을 포함한다. 이어서, 상기 제2 분자는 위치 5'에 상기 제1 분자의 제1 트랜스포사제 인식 서열의 제1 상보적 서열, 및 이어서, 상기 제1 분자의 제2 트랜스포사제 인식 서열의 제2 상보적 서열을 포함한다. 또한, 상기 복합체의 각각의 분자는 2개의 트랜스포사제 결합 절반-부위를 포함하므로, 상기 복합체가 형성될 때, 즉 상기 제1 분자가 상기 제2 분자와 쌍을 이룰 때, 2개의 인접한 이중 가닥 트랜스포사제 결합 부위가 형성되고, 트랜스포사제 이량체가 이에 결합할 수 있다.
[도 5]는 이 실시형태를 개략적으로 도시한다.
유리하게는, 본 발명은 전술된 복합체에 관한 것이며, 여기서 상기 제1 분자는 5' 말단에 트랜스포사제를 인식하기 위한 5'에서 3' 방향으로 배향된 제1 서열을 포함하고, 3' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 제2 서열, 및 이어서 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제1 서열의 제1 상보적 서열을 포함하고,
상기 제2 분자는 5' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 상보적 서열을 포함한다.
본 발명의 복합체의 이러한 유리한 실시형태에서, 상기 제1 분자는 위치 5'에 제1 트랜스포사제 인식 서열을 포함하고 위치 3'에 제2 트랜스포사제 인식 서열을 포함하며, 후자 바로 뒤에는 상기 제1 분자의 5'에 위치한 트랜스포사제 인식 서열의 제1 상보적 서열이 뒤따른다. 이어서, 상기 제2 분자는 위치 5'에 상기 제1 분자의 제2 트랜스포사제 인식 서열의 제2 상보적 서열을 포함한다.
또한, 이 실시형태에서, 상기 제1 분자는 제1 분자의 5'에 있는 제1 인식 서열과 상기 분자의 3'에 있는 제1 인식 서열의 쌍을 이룸으로써, 트랜스포사제 인식 이중 가닥 결합 부위를 재형성할 수 있다. 이어서, 상기 제2 분자는, 상기 제1 분자의 3'에 있는 제2 인식 서열과 상기 제2 분자의 5'에 위치한 제2 상보적 트랜스포사제 인식 서열을 사용하여 상기 제2 이중 가닥 트랜스포사제 결합 부위를 재구성하기 위해, 상기 제1 분자와 쌍을 이루어야 한다.
도 6b는 이 실시형태를 개략적으로 도시한다.
또한, 본 발명에 따른 복합체의 또 다른 유리한 실시형태를 구상하는 것도 가능하며, 여기서 상기 제1 분자는 5'에 제1 트랜스포사제 인식 부위의 제1 상보적 서열, 및 이어서, 제1 트랜스포사제 인식 부위를 포함한다. 또한, 상기 제1 분자는 3'에 제2 트랜스포사제 인식 부위를 포함한다. 이어서, 상기 제2 분자는 이전에 기재된 실시형태와 관련하여 변경되지 않은 상태로 유지된다.
여기서, 상기 제1 분자의 5' 부분은, 상기 제1 인식 부위 및 바로 인접한 상보적 서열을 사용하여, 쌍 형성에 의해, 이중 가닥 트랜스포사제 인식 부위를 재구성하도록 자체적으로 접힌다. 이 실시형태는 [도 7]에 도시되어 있다.
추가적인 유사한 실시형태가 존재하며, 여기서 상기 제1 분자는 5'에 상기 제1 트랜스포사제 부위의 제1 상보적 서열, 및 이어서, 상기 제1 트랜스포사제를 인식하기 위한 제1 부위를 포함한다.
유리하게는, 전술된 트랜스포사제는 트랜스포존 Tn5의 트랜스포사제, 트랜스포존 Tn9의 트랜스포사제, 트랜스포존 Tn10, Tn903, Tn602의 트랜스포사제, 또는 심지어 트랜스포존 Tc1, 또는 더 일반적으로는, 마리너 트랜스포존 슈퍼패밀리의 트랜스포사제로부터 선택된 박테리아형 트랜스포사제이다.
본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 트랜스포사제의 다른 예는 하기와 같다: 비브리오 하베이 트랜스포사제(Agilent에 의해 특성화되고 제품 SureSelect QXT에 사용되는 트랜스포사제), MutA 트랜스포사제 및 말단 서열 R1 및 R2를 포함하는 Mu 트랜스포사제 인식 부위, 황색포도상구균 트랜스포존 Tn552의 트랜스포사제, 트랜스포존 Tn7의 트랜스포사제, Tn/O 및 IS10 트랜스포사제, 트랜스포존 Tn3의 트랜스포사제.
Tn5 트랜스포사제가 가장 잘 알려져 있다. 이는 트랜스포존 Tn5의 Tnp 유전자에 의해 코딩된다. 상기 트랜스포사제는 표적 서열에 결합하는 트랜스포사제 이량체를 형성함으로써 전위를 개시한다. 이 복합체의 맥락에서, 상기 트랜스포사제는 네 가지 인산화 전달 반응(DNA 절단, DNA 헤어핀 형성, 헤어핀 분해 및 표적 DNA로의 가닥 전달)을 촉매하여, 트랜스포존을 새로운 DNA 부위로 통합하며, 이는 "태그먼트화(tagmentation)"로 알려져 있다.
본 발명은 이러한 태그먼트화 원리에 기초한다. 트랜스포사제의 태그먼트화 특성을 사용함으로써, 전술된 복합체로 인해, 표적화된 방식으로 하나의 서열을 또 다른 서열에 삽입하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 맥락에서, 트랜스포사제에 대해 언급하는 경우, 전술된 트랜스포사제, 즉 트랜스포존 Tn5, Tn9, Tn10 또는 Tc1/마리너의 트랜스포사제(또는 이들의 전위 또는 태그먼트화 활성을 증가시키기 위해 돌연변이된 트랜스포사제) 중 하나가 언급된다.
본 발명에서, 여러 개의 트랜스포사제가 동시에 사용되고, 하나는 상기 제1 분자와 제3 분자가 형성하는 복합체에 결합하고, 다른 하나는 상기 제2 분자와 제3 분자가 형성하는 복합체에 결합하는 경우, 트랜스포존 Tn5 및 Tn10으부터 생성되는 트랜스포사제 쌍이 바람직하다.
유리한 일 실시형태에서, 본 발명은 키트에 관한 것이며, 이는 전술된 복합체의 제1 분자의 발현을 허용하는 벡터 및 전술된 제2 분자의 발현을 허용하는 벡터를 포함한다.
이 키트의 맥락에서, 상기 벡터는 우선적으로, 숙주 세포(원핵 세포 및/또는 진핵 세포)에서의 복제를 허용하는 모든 요소를 갖고 전술된 복합체의 제1 또는 제2 분자의 발현을 허용하기 위한 요소를 갖는 이중 가닥 DNA의 원형 분자이다.
제1 분자와 제2 분자가 단일 가닥 DNA 분자 형태여야 하는 경우, 상기 제1 및 제2 분자 각각의 서열은 이중 가닥 DNA로부터의 단일 가닥 DNA의 합성을 가능하게 하는 서열의 제어를 받는다. 예를 들어, 파지미드 유형 벡터에 함유된 f1 박테리오파지의 복제 서열의 기원이 여기에 해당된다. f1 서열을 활성화하는 데 필요한 모든 유전자를 운반하는 보조 단계 M13이 있는 경우, 상기 벡터는 이중 가닥 플라스미드 DNA로부터 단일 가닥 DNA를 생성한다.
따라서, 상기 키트는 전술된 복합체를 형성하는 제1 및 제2 분자 중 하나 또는 다른 것의 서열을 각각 함유하는 2개의 독립적인 벡터, 또는 상기 2개의 서열을 포함하지만 유전적으로 서로 분리된 단일 벡터를 포함할 수 있다.
전술된 키트는 또한 전위를 가능하게 하는 트랜스포사제와 같은 다른 요소를 함유할 수 있다.
유리하게는, 전술된 복합체는, 상기 제1 및 제2 트랜스포사제 인식 서열이 하기 서열 중 하나를 갖는 Tn5 트랜스포사제를 인식하기 위한 서열이도록 하는 것이다:
- CTGtCTCTTataCAcAtcT(서열 번호 1),
- CTGACTCTTataCACAagT(서열 번호 3), 및
- CTGtCTCTTgatCAgATCT(서열 번호 5).
결과적으로, 해당하는 상보적 서열은 하기와 같다:
- AgaTgTGtatAAGAGaCAG(서열 번호 2),
- ActTGTGtatAAGAGTCAG(서열 번호 4), 및
- AGATcTGatcAAGAGaCAG(서열 번호 6).
다른 트랜스포사제 인식 서열은 하기와 같다:
Tn5MErev,
5′-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3′(서열 번호 11)
Tn5ME-A(Illumina FC-121-1030),
5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3′; (서열 번호 12)
및 Tn5ME-B(Illumina FC-121-1031),
5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3′(서열 번호 13)
추가적인 서열은 하기와 같으며:
- 센스 서열 서열 번호 i
- 안티센스 서열 서열 번호 i+1,
여기서 i는 269 내지 424 범위이다.
이는, 예를 들어, 하기의 각각의 센스 및 안티센스 서열 쌍이 고려된다는 것을 의미한다: 서열 번호 269 및 서열 번호 270; 서열 번호 271 및 서열 번호 272; 서열 번호 273 및 서열 번호 274; 서열 번호 275 및 서열 번호 276; 서열 번호 277 및 서열 번호 278; 서열 번호 279 및 서열 번호 280; 서열 번호 281 및 서열 번호 282; 서열 번호 283 및 서열 번호 284; 서열 번호 285 및 서열 번호 286; 서열 번호 287 및 서열 번호 288; 서열 번호 289 및 서열 번호 290; 서열 번호 291 및 서열 번호 292; 서열 번호 293 및 서열 번호 294; 서열 번호 295 및 서열 번호 296; 서열 번호 297 및 서열 번호 298; 서열 번호 299 및 서열 번호 300; 서열 번호 301 및 서열 번호 302; 서열 번호 303 및 서열 번호 304; 서열 번호 305 및 서열 번호 306; 서열 번호 307 및 서열 번호 308; 서열 번호 309 및 서열 번호 310; 서열 번호 311 및 서열 번호 312; 서열 번호 313 및 서열 번호 314; 서열 번호 315 및 서열 번호 316; 서열 번호 317 및 서열 번호 318; 서열 번호 319 및 서열 번호 320; 서열 번호 321 및 서열 번호 322; 서열 번호 323 및 서열 번호 324; 서열 번호 325 및 서열 번호 326; 서열 번호 327 및 서열 번호 328; 서열 번호 329 및 서열 번호 330; 서열 번호 331 및 서열 번호 332; 서열 번호 333 및 서열 번호 334; 서열 번호 335 및 서열 번호 336; 서열 번호 337 및 서열 번호 338; 서열 번호 339 및 서열 번호 340; 서열 번호 341 및 서열 번호 342; 서열 번호 343 및 서열 번호 344; 서열 번호 345 및 서열 번호 346; 서열 번호 347 및 서열 번호 348; 서열 번호 349 및 서열 번호 350; 서열 번호 351 및 서열 번호 352; 서열 번호 353 및 서열 번호 354; 서열 번호 355 및 서열 번호 356; 서열 번호 357 및 서열 번호 358; 서열 번호 359 및 서열 번호 360; 서열 번호 361 및 서열 번호 362; 서열 번호 363 및 서열 번호 364; 서열 번호 365 및 서열 번호 366; 서열 번호 367 및 서열 번호 368, 서열 번호 369 및 서열 번호 370; 서열 번호 371 및 서열 번호 372; 서열 번호 373 및 서열 번호 374; 서열 번호 375 및 서열 번호 376; 서열 번호 377 및 서열 번호 378; 서열 번호 379 및 서열 번호 380; 서열 번호 381 및 서열 번호 382; 서열 번호 383 및 서열 번호 384; 서열 번호 385 및 서열 번호 386; 서열 번호 387 및 서열 번호 388; 서열 번호 389 및 서열 번호 390; 서열 번호 391 및 서열 번호 392; 서열 번호 393 및 서열 번호 394; 서열 번호 395 및 서열 번호 396; 서열 번호 397 및 서열 번호 398; 서열 번호 399 및 서열 번호 400; 서열 번호 401 및 서열 번호 402; 서열 번호 403 및 서열 번호 404; 서열 번호 405 및 서열 번호 406; 서열 번호 407 및 서열 번호 408; 서열 번호 409 및 서열 번호 410; 서열 번호 411 및 서열 번호 412; 서열 번호 413 및 서열 번호 414; 서열 번호 415 및 서열 번호 416; 서열 번호 417 및 서열 번호 418; 서열 번호 419 및 서열 번호 420; 서열 번호 421 및 서열 번호 422; 서열 번호 423 및 서열 번호 424;
유리하게는, 상기 제1 분자의 제1 G/C-풍부 도메인은 상기 제2 G/C-풍부 도메인이 동일하도록 하기 서열 GG CGATCGC(서열 번호 425)에 해당한다. 실제로, 분자 자체의 접힘으로 인해, 상기 제2 G/C-풍부 도메인은 상기 제1 G/C-풍부 도메인에 상보적이고 역평행 배향을 가지며, 상호작용은 회문 영역(상기 서열의 밑줄친 부분)에서 발생한다.
상기 제1 및 제2 G/C-풍부 도메인은 또한 하기 서열 GCG GCGATCGGC(서열 번호 426)일 수 있다. 전술된 설명이 필요한 부분만 수정하여 적용된다.
다른 G/C-풍부 도메인 서열은 하기와 같을 수 있다:
- 서열 GGTCGC(서열 번호 427)의 제1 G/C-풍부 도메인 및 서열 GCGACC(서열 번호 428)의 제2 C/C-풍부 도메인.
이들 예는 단지 예시로서 제시된 것이며 본 발명의 범위를 제한할 수 없다.
유리한 일 실시형태에서, 상기 복합체의 제1 분자의 A/T-풍부 서열은 본질적으로 A 또는 T로 구성되거나 이로 구성된다.
보다 유리하게는, 상기 복합체의 제1 분자의 A/T-풍부 서열은 T로 구성된다.
보다 유리하게는, 전술된 복합체는 이것이 상기 제1 분자에 해당하는 하기 서열을 포함하도록 하는 것이며:
5′-TGCAGCTGCTGTCTCTTATACACATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGATCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT XTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGATCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTGATACATGTTT AGATGTGTATAAGAGACAGCTGTAAGC-3′(서열 번호 7),
여기서 X는 뉴클레오티드 없음, 2개의 뉴클레오티드 또는 적어도 하나의 제한 부위를 나타낸다.
상기 제1 트랜스포사제 결합 부위는 측면에 표시되어 있고 상기 제2 트랜스포사제 결합 부위는 밑줄로 표시되어 있다.
보다 유리하게는, 전술된 복합체는 이것이 상기 제2 분자에 해당하는 하기 서열을 포함하도록 하는 것이며:
5′- AGATGTGTATAAGAGACAGCAGCTGCAGACAAAGCTTACAGCTGTCTCTTATACACATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTcatatgccaagt Y-3′(서열 번호 8)
여기서 Y는 뉴클레오티드 없음, 2개의 뉴클레오티드 또는 적어도 하나의 제한 부위를 나타낸다.
상기 제1 트랜스포사제 결합 부위는 측면에 표시되어 있고 상기 제2 트랜스포사제 결합 부위는 밑줄로 표시되어 있다.
유리하게는, 전술된 복합체는 이것이 상기 제1 분자에 해당하는 하기 서열을 포함하도록 하는 것이며:
5′-ATCATCCTGTCTCTTATACACATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATAGTAG CTGTCTCTTATACACATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGATCGCTTTTTTTTTTTTTTTT XTTTTTTTTTTTTTTTTGCGATCGCCTTTTTTTTTTTTTGATACATTT AGATGTGTATAAGAGACAG GATGAT-3′(서열 번호 9)
여기서 X는 뉴클레오티드 없음, 2개의 뉴클레오티드 또는 적어도 하나의 제한 부위를 나타낸다.
상기 제1 트랜스포사제 결합 부위와 상기 제2 트랜스포사제 결합 부위의 상보적 서열은 밑줄로 표시되어 있고, 상기 제1 트랜스포사제 결합 부위는 이탤릭체 및 밑줄로 표시되어 있다.
이 실시형태에서, 전술된 복합체는 이것이 상기 제2 분자에 해당하는 하기 서열을 포함하도록 하는 것이며:
5′-YacttggTTAATTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGATGTGTATAAGAGACAGCTACTATC-3′(서열 번호 10)
여기서 Y는 뉴클레오티드 없음, 2개의 뉴클레오티드 또는 적어도 하나의 제한 부위를 나타낸다.
상기 제2 트랜스포사제 결합 부위의 상보적 서열은 밑줄로 표시되어 있다.
유리하게는, 본 발명은 하기 복합체에 관한 것이다:
- 하기 서열의 제1 분자
5′-TGCAGCTGR1TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGATCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTXTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGATCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTGATACATGTTTR2CTGTAAGC-3′(서열 번호 436)
여기서 R1은 5′-CTGtCTCTTataCAcAtcT(서열 번호 1)이고,
R2는 5'-AgaTgTGtatAAGAGaCAG(서열 번호 2)이고,
X는 표적 영역의 인식을 허용하는 서열에 해당함,
및
- 하기 서열을 포함하는 제2 분자:
5′-R2CAGCTGCAGACAAAGCTTACAGR1TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTcatatgccaagtY-3′(서열 번호 437)
여기서 R1은 5′-CTGtCTCTTataCAcAtcT(서열 번호 1)이고,
R2는 5'-AgaTgTGtatAAGAGaCAG(서열 번호 2)이고,
Y는 뉴클레오티드 없음 또는 표적 영역의 대체 서열에 해당함.
이는 상기 복합체가 하기 서열의 분자로 구성됨을 의미한다:
5′-TGCAGCTGCTGtCTCTTataCAcAtcTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGATCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTXTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGATCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTGATACATGTTTAgaTgTGtatAAGAGaCAG CTGTAAGC-3′(서열 번호 438)
및
5′-AgaTgTGtatAAGAGaCAGCAGCTGCAGACAAAGCTTACAGCTGtCTCTTataCAcAtcTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTcatatgccaagtY-3′(서열 번호 439)
또는 X 및 Y는 상기에 정의된 바와 같다.
유리하게는, 본 발명은 하기 복합체에 관한 것이다:
- 하기 서열의 제1 분자
5′-ATCATCR1TTTTTTTTTTTTTTTTTGATAGTAG R1 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGATCGCTTTTTTTTTTTTTTTT XTTTTTTTTTTTTTTTTGCGATCGCCTTTTTTTTTTTTTGATACATTT R2 GATGAT-3′(서열 번호 641)
여기서 R1은 5′-CTGtCTCTTataCAcAtcT(서열 번호 1)이고,
R2는 5'-AgaTgTGtatAAGAGaCAG(서열 번호 2)이고,
X는 표적 영역의 인식을 허용하는 서열에 해당함,
및
- 하기 서열을 포함하는 제2 분자:
5′-YacttggTTAATTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTR2CTACTATC-3′(서열 번호 642)
여기서 R1은 5′-CTGtCTCTTataCAcAtcT(서열 번호 1)이고,
R2는 5'-AgaTgTGtatAAGAGaCAG(서열 번호 2)이고,
Y는 뉴클레오티드 없음 또는 표적 영역의 대체 서열에 해당함.
유리하게는, 본 발명은 하기 복합체에 관한 것이다:
- 하기 서열의 제1 분자
5′-TGCAGCTGR2TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGATCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTXTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGATCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTGATACATGTTTR2CTGTAAGC-3′(서열 번호 643)
여기서 R1은 5′-CTGtCTCTTataCAcAtcT(서열 번호 1)이고,
R2는 5'-AgaTgTGtatAAGAGaCAG(서열 번호 2)이고,
X는 표적 영역의 인식을 허용하는 서열에 해당함,
및
- 하기 서열을 포함하는 제2 분자:
5′-R1CAGCTGCAGACAAAGCTTACAGR1TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTcatatgccaagtY-3′(서열 번호 644)
여기서 R1은 5′-CTGtCTCTTataCAcAtcT(서열 번호 1)이고,
R2는 5'-AgaTgTGtatAAGAGaCAG(서열 번호 2)이고,
Y는 뉴클레오티드 없음 또는 표적 영역의 대체 서열에 해당함.
유리하게는, 본 발명은 하기 복합체에 관한 것이다:
- 하기 서열의 제1 분자
5′-ATCATCR2TTTTTTTTTTTTTTTTTGATAGTAG R2 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGATCGCTTTTTTTTTTTTTTTTXTTTTTTTTTTTTTTTTGCGATCGCCTTTTTTTTTTTTTGATACATTT R1 GATGAT-3′(서열 번호 645)
여기서 R1은 5′-CTGtCTCTTataCAcAtcT(서열 번호 1)이고,
R2는 5'-AgaTgTGtatAAGAGaCAG(서열 번호 2)이고,
X는 표적 영역의 인식을 허용하는 서열에 해당함,
및
- 하기 서열을 포함하는 제2 분자:
5′-YacttggTTAATTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTR1CTACTATC-3′(서열 번호 646)
여기서 R1은 5′-CTGtCTCTTataCAcAtcT(서열 번호 1)이고,
R2는 5'-AgaTgTGtatAAGAGaCAG(서열 번호 2)이고,
Y는 뉴클레오티드 없음 또는 표적 영역의 대체 서열에 해당함.
유리하게는, 전술된 복합체는 하기의 서열 쌍으로 구성된다:
[표 2]
다시 말하면, 본 발명은 유리하게는 전술된 복합체에 관한 것이며, 상기 복합체는 제1 분자와 제2 분자의 쌍을 포함하고, 상기 제1 분자와 제2 분자는 하기의 각각의 서열을 포함한다:
- 서열 번호 440 및 서열 번호 441, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 440 및 서열 번호 441, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 440 및 서열 번호 442, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 440 및 서열 번호 442, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 440 및 서열 번호 443, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 440 및 서열 번호 443, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 444 및 서열 번호 445, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 444 및 서열 번호 445, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 444 및 서열 번호 446, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 444 및 서열 번호 446, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 444 및 서열 번호 447, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 444 및 서열 번호 447, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 448 및 서열 번호 445, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 448 및 서열 번호 445, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 448 및 서열 번호 446, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 448 및 서열 번호 446, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 448 및 서열 번호 447, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 448 및 서열 번호 447, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 449 및 서열 번호 445, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 449 및 서열 번호 445, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 449 및 서열 번호 446, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 449 및 서열 번호 446, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 449 및 서열 번호 447, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 449 및 서열 번호 447, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 450 및 서열 번호 451, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 450 및 서열 번호 451, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 450 및 서열 번호 452, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 450 및 서열 번호 452, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 450 및 서열 번호 453, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 450 및 서열 번호 453, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 454 및 서열 번호 451, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 454 및 서열 번호 451, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 454 및 서열 번호 452, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 454 및 서열 번호 452, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 454 및 서열 번호 453, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 454 및 서열 번호 453, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 455 및 서열 번호 451, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 455 및 서열 번호 451, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 455 및 서열 번호 452, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 455 및 서열 번호 452, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 455 및 서열 번호 453, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 455 및 서열 번호 453, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 456 및 서열 번호 451, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 456 및 서열 번호 451, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 456 및 서열 번호 452, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 456 및 서열 번호 452, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 456 및 서열 번호 453, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 456 및 서열 번호 453, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 457 및 서열 번호 451, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 457 및 서열 번호 451, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 457 및 서열 번호 452, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 457 및 서열 번호 452, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 457 및 서열 번호 453, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 457 및 서열 번호 453, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 458 및 서열 번호 459, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 458 및 서열 번호 459, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 458 및 서열 번호 460, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 458 및 서열 번호 460, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 458 및 서열 번호 461, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 458 및 서열 번호 461, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 462 및 서열 번호 459, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 462 및 서열 번호 459, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 462 및 서열 번호 460, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 462 및 서열 번호 460, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 462 및 서열 번호 461, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 462 및 서열 번호 461, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 463 및 서열 번호 459, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 463 및 서열 번호 459, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 463 및 서열 번호 460, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 463 및 서열 번호 460, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 463 및 서열 번호 461, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 463 및 서열 번호 461, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 464 및 서열 번호 459, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 464 및 서열 번호 459, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 464 및 서열 번호 460, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 464 및 서열 번호 460, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 464 및 서열 번호 461, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 464 및 서열 번호 461, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 465 및 서열 번호 459, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 465 및 서열 번호 459, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 465 및 서열 번호 460, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 465 및 서열 번호 460, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 465 및 서열 번호 461, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 465 및 서열 번호 461, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 466 및 서열 번호 459, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 466 및 서열 번호 459, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 466 및 서열 번호 460, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 466 및 서열 번호 460, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임,
- 서열 번호 466 및 서열 번호 461, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 짝수이고, R2는 서열 번호 n+1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 짝수임,
- 서열 번호 466 및 서열 번호 461, 여기서 R1은 서열 번호 n 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 홀수이고, R2는 서열 번호 n-1 서열 중 어느 하나이고, n은 269 내지 424 범위의 R1과 동일한 홀수임.
유리하게는, 본 발명은 전술된 복합체에 관한 것이며, 상기 복합체는 하기 표 4의 300쌍의 제1 및 제2 분자 중 하나를 포함한다:
[표 4]
또 다른 양태에서, 본 발명은 앙상블(ensemble)에 관한 것이며, 이는,
- 관심 핵산의 상보적 서열의 삽입을 허용하는 A 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되거나, 또는 관심 핵산의 상보적 서열을 포함하는 제1 단일 가닥 핵산 분자 - 여기서 상기 상보적 A 서열은 5'에서 40 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 제1 A/T-풍부, 특히 T-풍부 서열에 결합하고, 3'에서 40 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 제2 A/T-풍부, 특히 T-풍부 서열에 결합하며, 상기 제1 및 제2 A/T-풍부, 특히 T-풍부 서열은 각각 6 내지 12개의 G/C-풍부 뉴클레오티드의 제1 및 제2 도메인을 포함하고, 상기 제1 도메인의 서열은 상기 제2 도메인의 서열에 상보적이고, 상기 제1 및 제2 도메인은 상기 A 서열로부터 15 내지 52개 뉴클레오티드에 위치하며, 상기 제1 분자는 5' 말단에 트랜스포사제를 인식하기 위한 5'에서 3' 방향으로 배향된 제1 서열을 포함하고, 3' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 적어도 하나의 제2 서열을 포함함 -,
- 관심 핵산의 상보적 서열의 삽입을 허용하는 B 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되거나, 또는 관심 핵산의 상보적 서열을 포함하는 제2 단일 가닥 핵산, - 여기서 상기 상보적 B 서열은 5'에서 40 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 제3 T-풍부 서열에 결합하고 3'에서 40 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 제4 T-풍부 서열에 결합하며, 상기 제3 및 제4 T-풍부 서열은 각각 6 내지 12개의 G/C-풍부 뉴클레오티드의 제3 및 제4 도메인을 포함하고, 상기 제3 도메인의 서열은 상기 제4 도메인의 서열에 상보적이고, 상기 제3 및 제4 도메인은 상기 B 서열로부터 15 내지 52개 뉴클레오티드에 위치하며, 상기 제2 분자는 5' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 5'에서 3' 방향으로 배향된 적어도 하나의 제1 서열을 포함하고 3' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 제2 서열을 포함하고,
상기 B 서열은 상기 관심 핵산의 상보적 서열이고, 상기 A 서열은 상기 관심 핵산의 관심 영역의 5'에 위치하고 상기 B 서열은 상기 관심 핵산의 관심 영역의 3'에 위치함 -, 및
- 하기를 포함하는 제3 단일 가닥 분자를 포함하고:
5' 부분에, (상기 제1 분자의) 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 적어도 하나의 상보적 서열,
3' 부분에, (상기 제2 분자의) 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제1 서열의 적어도 하나의 상보적 서열, 및
- 대체 핵산 분자(단일 가닥)의 삽입을 허용하는, (상기 제1 분자의) 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 상보적 서열과 (상기 제2 분자의) 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제1 서열의 상보적 서열 사이에 위치한 영역,
상기 제1 및 제3 단일 가닥 핵산 분자는 상기 트랜스포사제의 2개의 이중 가닥 결합 부위를 정의하도록 Watson 및 Crick에 의해 정의된 염기 상보성에 따라 쌍을 이루고, 상기 제2 및 제3 단일 가닥 핵산 분자는 상기 트랜스포사제의 2개의 이중 가닥 결합 부위를 정의하도록 Watson 및 Crick에 의해 정의된 염기 상보성에 따라 쌍을 이룬다.
따라서, 전술된 앙상블은 전술된 분자 복합체를 포함한다. 또한, 상기 분자 복합체에 대해 전술된 모든 실시형태 및 기술적 세부 사항은 필요한 부분만 수정하여 전술된 앙상블에 적용된다.
본 발명의 이러한 양태에서, 관심 핵산에 함유된 서열을 선택된 서열로 정확하게 대체하는 것을 가능하게 하는 3개 분자의 앙상블이 기재된다.
본 발명에 따른 앙상블은 전술된 복합체를 기초로 하며, 이 복합체는 상기 제1 분자와 유사한 제3 분자로 보충된다. [도 8]은 본 발명에 따른 앙상블을 개략적으로 도시한다.
상기 복합체의 제1 분자는 상기 앙상블의 제1 분자에 해당하고, 상기 복합체의 제2 분자는 상기 앙상블의 제3 분자에 해당하며, 상기 앙상블의 제3 분자가 추가되며 이는 상기 앙상블 또는 상기 복합체의 제1 분자와 구조적으로 유사하다.
본 발명에 따른 앙상블은, 상기 3개의 분자가 올바르게 쌍을 이룰 때, 하기의 2쌍의 트랜스포사제 인식 이중 가닥 결합 부위를 포함한다:
- 상기 제1 분자와 상기 제3 분자의 혼성화에 의해 수득된 제1 쌍, 및
- 상기 제2 분자와 상기 제3 분자의 혼성화에 의해 수득된 제2 쌍.
상기 앙상블의 제1 분자에 함유된 A 서열은, 상기 제2 분자에 함유된 B 서열에 상보적인 핵산의 동일한 가닥에 상보적이다. 다시 말하면, 상기 제1 분자에 함유된 A 서열과 상기 제2 분자에 함유된 B 서열은 동일한 핵산과 동시에 혼성화할 수 있는데, 그 이유는 상기 두 서열 A와 B가 동일한 서열을 인식하지 않기 때문이다.
설명을 더욱 명확하게 하기 위해, 본 발명에서 정의된 앙상블의 관심은 상기에 정의된 바와 같은 제1 분자와 제2 분자를 제안하는 것이며, 각각의 서열 A 및 B는, 하나는 관심 핵산의 표적 서열의 5'에 위치한 서열을 인식할 수 있고, 다른 하나는 관심 핵산의 동일한 표적 서열의 3'에 위치한 서열을 인식할 수 있도록 하는 것이다. 따라서 상기 서열 A 및 B는 관심 핵산 분자의 대체하고자 하는 관심 서열과 접해 있는 영역에 상보적이다.
따라서, 대체될 서열의 측면에 위치하기 위해, 상기 제1 및 제2 관심 분자는 관심 분자를 특이적으로 표적화하는 데 필수적이다.
이어서, 상기 앙상블의 제3 분자는 대체 서열을 함유하는 핵산 분자를 제공하는 분자이다.
기계적 관점에서 볼 때, 본 발명에 따른 앙상블은, 이것이 3개의 분자로 구성되고, 상기 제1 및 제2 분자는 G/C-풍부 영역이 쌍을 이루도록 공간적으로 구조적으로 구성되도록 하는 것이다.
상기 제3 분자의 양쪽, 즉 5' 및 3'에서, 상기 제1 및 제2 분자와의 혼성화로 인해 트랜스포사제에 결합하기 위한 두 쌍의 부위는, 트랜스포사제가 존재할 때, 트랜스포사제 이량체로 하여금 상기 앙상블에 결합하도록 허용한다.
상기 제1 분자의 트랜스포사제 결합 부위는 상기 제2 분자의 것과 동일하거나 다를 수 있다는 점에 유의해야 한다. 상기 결합 서열이 동일한 경우, (상기 제1 분자와 상기 제3 분자의 5' 부분의 혼성화에 의한) 상기 제3 분자의 5'에 있는 트랜스포사제 및 (상기 제2 분자와 상기 제3 분자의 3' 부분의 혼성화에 의한) 상기 제3 분자의 3'에 있는 트랜스포사제는 동일하다. 또한, 예를 들어, 결합 부위가 모두 Tn5 트랜스포사제에 대한 결합 부위인 경우, 상기 앙상블은 2개의 Tn5 트랜스포사제 이량체와 결합된다.
상기 제1 분자와 상기 제2 분자의 결합 부위가 동일한 트랜스포사제를 인식하지 못하는 것도 가능하다. 이 경우에, 및 앞서 제시된 앙상블의 정의에 따라, 상기 제3 분자의 5' 부분은, 상기 제1 분자와의 혼성화에 의해, 제1 트랜스포사제에 결합하기 위한 2개의 이중 가닥 부위를 형성하고, 상기 제3 분자의 3' 부분은, 상기 제2 분자와의 혼성화에 의해, 제2 트랜스포사제에 결합하기 위한 2개의 이중 가닥 부위를 형성한다.
2개의 트랜스포사제 이량체에 연결된 전술된 앙상블은, 5' 부분이 상기 앙상블의 제1 분자의 A 서열에 상보적이고 3' 부분이 상기 앙상블의 제2 분자의 B 서열에 상보적인 관심 핵산 분자의 존재에 적용되고, 이어서 상기 관심 핵산 분자는 전술된 영역 A 및 B에서 상기 앙상블과 쌍을 이룬다. 이러한 상호작용은 상기 앙상블의 제1 및 제2 분자 각각의 2개의 G/C-풍부 서열의 상호작용을 파괴하는 결과를 낳는다. 따라서, 상기 제3 분자와 관심 핵산 분자는 공간적으로 서로 더 가깝도록 이동되고, 상기 트랜스포사제는 태그먼트화 활성을 발휘할 수 있으며, 그 결과 서열 A 및 B의 상보적 서열에 접해 있는 관심 분자의 서열이 5' 및 3'의 상기 트랜스포사제(들)에 결합하기 위한 절반-부위 사이에 위치한 상기 앙상블의 제3 분자의 서열에 의해 대체된다.
본 발명에서, 상기 앙상블의 제1 분자, 제2 분자 및 제3 분자는 유리하게는, 단일 가닥 DNA 분자를 형성하기 위해, 데옥시리보뉴클레오티드로 구성된 분자이다.
보다 유리하게는, 상기 앙상블의 제1 분자, 제2 분자 및 제3 분자는 하이브리드 DNA/RNA 분자이고, 여기서 상기 분자의 "백본"은 DNA이고, 관심 핵산 분자의 인식 서열 A 및 B 및 상기 제3 분자의 중앙 영역은 RNA이다. 이는, 본 발명을 가능하게 하는 서열 대체가 RNA 분자에 대해 직접 수행되는 경우 특히 유리하다.
[도 9]-a는 관심 분자와 본 발명에 따른 앙상블 사이의 상호작용을 예시한다.
유리하게는, 본 발명은 전술된 복합체에 관한 것이며, 여기서 상기 제1 분자 또는 상기 제2 분자, 또는 두 분자 모두는, 특히 변형된 뉴클레오티드를 통해, 효소와 결합된다. 이 효소는 관심 분자의 대체를 촉진하기 위한 것이다. 이는 하기일 수 있다:
- 초나선형이거나 심지어 히스톤과 같은 단백질과 결합되어 있는 이중 가닥 분자를 개방할 수 있는 효소인 헬리카제,
- 일시적 절단을 생성함으로써 DNA의 위상적 구조에 작용하는 효소인 토포이소머라제,
- 뉴클레오티드의 인산염 5' 말단과 또 다른 뉴클레오티드의 OH 3' 말단 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성할 수 있게 하는 리가제, - 개시 부위인 유리 OH 3'으로부터 5'에서 3' 방향으로, 특히 Watson과 Crick 모델에 따라 역평행 상보적 가닥을 복사함으로써, 핵산 분자를 합성하는 폴리머라제.
본 발명의 범위에서 고려되는 서열 대체를 가능하게 하는 데 필요한 모든 효소 물질을 갖기 위해, 상기 효소 중 2개 이상을 조합하는 것 또한 가능하다.
특정한 일 양태에서, 상기 앙상블의 제1 분자는 5' 부분에, 보다 정확하게는 상기 제1 트랜스포사제 결합 부위와 상기 A 영역 사이에, 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 동일한 방식으로, 상기 앙상블의 제3 분자는 3' 부분에, 보다 정확하게는 상기 제1 트랜스포사제 결합 부위와 상기 3 영역 사이에, 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
이 변형된 뉴클레오티드는 특히, 치환된 탄소 사슬에 단백질 태그 또는 스트렙타비딘이나 비오틴과 같은 특정 상호작용을 가능하게 하는 분자를 이식함으로써 변형된다.
이러한 변형은 태그먼트화 및 서열 대체를 촉진하는 데 유용할 수 있는 효소를 상기 앙상블의 제1 분자에 특이적으로 결합시키는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 이중 가닥 분자를 개방하는 데 유용한 비오틴화된 헬리카제 이식을 가능하게 하는 스트렙타비딘 이식(또는 반대로, 비오틴화된 뉴클레오티드 및 스트렙타비딘에 이식된 헬리카제)을 갖는 것이 특히 유리하다. 3' 말단에서 재조합 가닥을 연결하기 위해, 비오틴화된 리가제(또는 스트렙타비딘과 결합된 리가제)를 사용한 이식을 고려하는 것이 또한 가능하다.
또한 올리고뉴클레오티드를 상기 앙상블의 제1 분자 또는 제2 분자와 결합시켜 상기 올리고뉴클레오티드가 상기 제1 또는 제2 분자의 미리 결정된 영역에서 쌍을 이루도록 하는 것도 가능하다. 이 올리고뉴클레오티드는 유리하게는, 이전에 설명된 바와 같은 이식 분자와 결합된다.
전술된 앙상블은 단일 가닥 서열 대체, 예를 들어 단일 가닥 DNA 분자 또는 RNA 상의 서열의 대체에 적합하다.
이중 가닥 분자의 두 가닥을 대체하기 위해서는, 전술된 앙상블에서 2개를 사용하는 것이 유용하며, 이 두 앙상블은 하기와 같도록 하는 것이다:
- 제1 앙상블은 상기에 정의된 바와 같은 제1, 제2, 및 제3 분자를 포함하고,
- 제2 앙상블은 제4, 제5, 및 제6 서열을 포함하며,
여기서,
- 상기 제3 및 제6 서열은 각각 대체 서열의 가닥을 포함하며, 이들 서열은 Watson과 Crick 쌍 형성에 따라 상보적이며;
- 상기 제1 및 제4 서열은, 상기 A 영역 및 A' 영역(상기 A' 영역은 상기 제1 분자의 A 영역의 제4 분자의 등가물임)에, 각각 대체될 영역의 5' 부분 및 대체될 영역의 상보적 가닥의 3' 부분을 인식하는 서열을 포함하고,
- 상기 제2 및 제5 서열은, 상기 B 영역 및 B' 영역(상기 B' 영역은 상기 제2 분자의 B 영역의 제5 분자의 등가물임)에, 각각 대체될 영역의 3' 부분 및 대체될 영역의 상보적 가닥의 5' 부분을 인식하는 서열을 포함한다.
이 이중 복합체 또는 이 이중 앙상블은 [도 10]-a에 도시되어 있다.
유리하게는, 본 발명은 전술된 앙상블에 관한 것이며, 상기 앙상블은 하기 표 5의 300쌍의 제1 및 제3 분자 중 하나를 포함한다:
[표 5]
또 다른 양태에서, 본 발명은 키트 또는 세트에 관한 것이며, 이는 재조합효소의 발현을 허용하는 적어도 하나의 벡터 및 상기에 정의된 바와 같은 앙상블의 제1, 제2, 제3 분자를 포함한다.
상기 키트는 상기 앙상블의 세 분자를 포함하는 하나의 용기 또는 여러 개의 별도 용기로 구성된다.
전술된 키트에 함유된 트랜스포사제는 상기 복합체의 제1 분자와 제3 분자, 및/또는 상기 복합체의 제2 분자와 제3 분자 사이의 상호작용에 의해 형성된 결합 부위를 인식할 수 있는 트랜스포사제이다.
상기 복합체가, 이것이 2개의 서로 다른 트랜스포사제에 대한 2개의 결합 부위를 함유하도록 하는 것인 경우, 상기 키트는, 각각 상기 트랜스포사제 중 하나를 코딩하는 2개의 서로 다른 벡터를 포함한다.
상기 키트는 또한, 상기에 논의된 바와 같이, 다른 효소, 예를 들어 헬리카제 또는 리가제를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 유리하게는 상기에 정의된 바와 같은 2개의 앙상블을 형성하는데 필요한 것을 포함한다.
본 발명은 또한 핵산 조작을 위한, 특히 표적 서열을 관심 서열로 대체하기 위한, 상기에 정의된 바와 같은 앙상블의 용도에 관한 것이다. 전술된 용도는 특히, 이것이 인간의 생식계열 유전적 정체성을 변형시키는 방법을 포함하지 않고/거나 상기 용도가 사람이나 동물의 신체를 수술이나 치료법으로 치료하는 방법이 아닌 것을 조건으로 한다.
상기에 설명된 바와 같이, 전술된 앙상블은, 트랜스포사제 태그먼트화 특성을 사용함으로써, 표적 영역을 특이적으로 표적화하고 이를 관심 서열로 대체하는 것을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 앙상블은 특히, 다양한 살아있는 유기체에서, 예를 들어 유전자 변형 식물을 수득하기 위한 식물에서, 또는 인간의 질병의 모델 또는 살아있는 치료 도구를 생산하여 약물 시험을 가능하게 하기 위한 동물에서, 표적화된 유전자 변형(및 특히 유전자 또는 비코딩 서열의 대체)을 수행하는 데 유리하다.
또한, 본 발명은 약물로서의, 보다 구체적으로, 유전자 치료 약물로서의 용도를 위한, 특히 핵산 변형과 관련된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 전술된 앙상블에 관한 것이다.
전술된 앙상블은 특정 서열의 치환을 허용하므로, 치환, 결실, 또는 삽입과 같은 변형을 통해, 돌연변이된 유전자를 특이적으로 인식하는 제1 및 제2 분자를 설계하고, 상기 돌연변이된 유전자의 참조 야생형 서열을 포함하는 제3 분자를 설계하는 것이 가능하다.
또한, 적절한 트랜스포사제의 존재 하에, 돌연변이된 유전자의 서열을 야생형 서열로 대체함으로써 상기 유전자의 돌연변이로 인한 질병을 앓고 있는 개체를 치료할 수 있다.
본 발명은 또한 핵산 변형과 관련된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약물을 제조하기 위한 전술된 복합체의 용도에 관한 것이다.
일부 양태에서 이러한 약물은 인간의 생식계열 정체성을 변형시키려는 의도가 아니며, 동물에게 부당한 고통을 유발하려는 의도 또한 없다.
본 발명은 또한 하이브리드 핵산 분자를 수득하기 위해 핵산 분자의 표적 영역을 또 다른 핵산 분자의 관심 영역으로, 특히 시험관 내에서, 대체하는 방법에 관한 것이며, 이는,
- 상기에 정의된 바와 같은 앙상블을 표적 영역을 포함하는 핵산과 접촉시키는 단계, -
여기서 상기 앙상블은 상기 제1 분자의 A 서열이 표적 영역의 바로 5'에 위치한 영역의 상보적 서열을 포함하고,
상기 제1 분자의 B 서열이 표적 영역의 바로 3'에 위치한 영역의 상보적 서열을 포함하고,
상기 제3 분자는, 대체 복합체를 수득하기 위해, 상기 제1 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 상보적 서열과 상기 제2 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제1 서열의 상보적 서열 사이에 위치한 영역에 상기 관심 영역을 포함하도록 하는 것임 -,
- 상기 앙상블에 함유된 상기 트랜스포사제의 이중 가닥 결합 부위를 인식하는 트랜스포사제의 존재 하에 상기 대체 복합체를 배치하여 재조합 복합체를 수득하는 단계, 및
- 표적 영역 대신 관심 영역을 포함하는 하이브리드 핵산 분자를 수득하기 위해 상기 조합 복합체를 재조합하는 단계를 포함한다.
대체, 즉, 상기 트랜스포사제에 의한 태그먼트화 동안, 대체 단편의 3' 말단은, 포스포디에스테르 결합에 의해, 대체된 서열 바로 뒤에 오는 서열의 5' 말단에 결합한다는 점에 유의해야 한다. 이 결찰은 태그먼트화 중에 발생한다.
반대로, 대체된 서열 바로 앞에 위치한 서열의 3' 말단과 대체 가닥의 5' 말단은 서로 결합하지 않는다. 또한 대체를 완료하려면, 리가제를 사용하여 이 두 말단을 연결해야 한다.
또한 대체 부위에서, 대체 분자는 3' 및 5'에서 트랜스포사제 인식 서열에 접해 있음을 주목해야 한다.
단일 가닥 표적의 대체 메커니즘은 [도 9]에 도시되어 있다.
제1 단계에서, 표적 서열의 5' 부분의 상보적 영역, 표적 서열의 3' 부분의 상보적 영역 및 관심 서열을 각각 포함하는 제1, 제2, 제3 분자로 구성된 앙상블은, 상기 제1 분자의 G/C-풍부 상보적 영역이 서로 쌍을 이루고 상기 제2 분자의 G/C-풍부 상보적 영역이 서로 쌍을 이루도록 공간적으로 구성된다([도 9]-a).
표적 서열이 존재하는 경우, 상기 제1 및 제2 분자에 각각 함유된 표적 서열의 5' 부분 및 3' 부분의 상보적 영역은, 표적 분자와 상기 앙상블의 세 분자를 함유하는 4-분자 복합체를 형성하도록, 각각의 상보적 영역과 쌍을 이룬다. 상기 제1 및 제2 분자와 이들의 표적 사이의 상호작용(또는 쌍 형성)은 G/C-풍부 영역의 상호작용을 파괴하는 효과가 있어서, 트랜스포사제 이량체가 위치하는 트랜스포사제 결합 부위가 표적 분자에 공간적으로 가깝게 위치하게 된다. 그런 다음, 상기 트랜스포사제는 활성을 발휘하여 [도 9]-b에 도시된 바와 같이 표적 분자와 관심 분자 둘 모두(두 결합 부위 사이)를 절단할 수 있다.
따라서 태그먼트화가 수행되어,
- 상기 제3 분자의 3' 말단은 표적 서열의 3'에 있는 영역에서 상기 트랜스포사제에 의해 생성된 유리 5' 말단에 결합한다. 이 결합은 상기 두 말단의 결찰에 의한 공유 결합이며,
- 상기 제3 분자의 5' 말단은 표적 서열의 5'에 있는 영역에서 상기 트랜스포사제에 의해 생성된 유리 3' 말단의 반대편에 위치하게 된다. 9개 염기 쌍의 결실은 표적 서열의 5'에 있는 영역에서 상기 트랜스포사제에 의해 생성된다([도 9]-c에서 점선 원으로 도시됨). 초기 표적 서열의 5'와 3' 영역 사이에 위치한 관심 서열을 갖는 전체 분자를 회수하기 위해서는, 결찰이 필요하다.
태그먼트화로부터 생성된 최종 분자는, 5'에서 3' 방향으로, 부분적으로 9개 염기 쌍이 결실된 초기 표적 서열의 5' 영역의 일부, 및 이어서 제2 트랜스포사제 결합 서열, 및 이어서 관심 서열 자체, 및 이어서 제1 트랜스포사제 결합 서열, 및 마지막으로 초기 표적 서열의 5' 영역의 일부로 구성된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 방법, 특히 세포의 게놈을 편집하기 위한 시험관 내 또는 생체 외 방법에 관한 것이며, 이는, 이중 가닥 DNA의 특정 단편 대신에 다른 관심 이중 가닥 DNA 단편을 포함하는 재조합 하이브리드 게놈을 수득하기 위해, 상기 세포의 상기 게놈의 이중 가닥 DNA의 특정 단편을 관심 또 다른 관심 이중 가닥 DNA 단편으로 대체하는 것을 가능하게 하며, 상기 방법은,
- 상기에 정의된 바와 같은 제1 앙상블을 제조하는 단계, -
여기서 상기 제1 분자의 A 서열은 상기 특정 단편의 5'에 인접한 영역의 상보적 서열을 포함하고;
상기 제2 분자의 B 서열은 상기 특정 단편의 3'에 인접한 영역의 상보적 서열을 포함하고;
상기 제3 분자는, 상기 제1 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 상보적 서열과 상기 제2 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제1 서열의 상보적 서열 사이에 위치한 영역 사이에, 상기 특정 단편의 가닥 중 하나의 서열을 포함함 -;
- 및 선택적으로, 상기에 정의된 바와 같은 제2 앙상블을 제조하는 단계, -
여기서, 재조합 복합체를 수득하기 위해, 상기 제2 앙상블의 제1 분자의 상기 상보적 영역의 A 서열은 상기 특정 단편의 5'에 인접한 영역의 상보적 서열을 포함하고;
상기 제2 앙상블의 제2 분자의 상기 상보적 영역의 B 서열은 상기 특정 단편의 3'에 인접한 영역의 상보적 서열을 포함하고;
상기 제2 앙상블의 제3 분자는, 상기 제2 앙상블의 제1 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 상보적 서열과 상기 제2 앙상블의 제2 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제1 서열의 상보적 서열 사이에 위치한 영역 사이에, 상기 제1 앙상블의 제3 서열에 함유된 상기 특정 단편의 상보적 가닥의 서열을 포함하고;
상기 제1 앙상블의 제1 분자의 A 영역에 함유된 특정 단편의 5'에 인접한 영역의 상보적 서열은 상기 제2 앙상블의 제1 분자의 A 영역에 함유된 특정 단편의 5'에 인접한 영역의 상보적 서열에 최대 95% 상보적이고;
상기 제1 앙상블의 제1 분자의 B 영역에 함유된 특정 단편의 3'에 인접한 영역의 상보적 서열은 상기 제2 앙상블의 제1 분자의 B 영역에 함유된 특정 단편의 3'에 인접한 영역의 상보적 서열에 최대 95% 상보적임 -;
- 편집될 준비가 된 세포를 수득하기 위해, 상기 세포를 상기 재조합 복합체와 접촉시키는 단계,
- 편집된 세포를 수득하기 위해, 편집될 준비가 된 상기 세포에서 상기 트랜스포사제를 발현시키는 단계,
- 편집된 세포를 선택하는 단계 - 여기서 상기 편집된 세포의 게놈은 상기 특정 이중 가닥 DNA 단편 대신에 다른 관심 이중 가닥 DNA 단편을 포함함 -를 포함하고,
단, 상기 방법은 인간의 생식계열 유전적 정체성을 변형시키는 방법이 아니며, 상기 방법은 사람이나 동물의 신체를 수술이나 치료법으로 치료하는 방법이 아니다.
유리하게는, 본 발명은 세포의 게놈을 편집하기 위한 방법에 관한 것이며, 이는 이중 가닥 DNA의 특정 단편 대신에 다른 관심 이중 가닥 DNA 단편을 포함하는 재조합 하이브리드 게놈을 수득하기 위해, 상기 세포의 게놈의 이중 가닥 DNA의 특정 단편을 관심 또 다른 관심 이중 가닥 DNA 단편으로 대체하는 것을 가능하게 하며, 상기 방법은,
- 상기에 정의된 바와 같은 제1 앙상블을 제조하는 단계, -
여기서 상기 제1 분자의 A 서열은 상기 특정 단편의 5'에 인접한 영역의 상보적 서열을 포함하고;
상기 제2 분자의 B 서열은 상기 특정 단편의 3'에 인접한 영역의 상보적 서열을 포함하고;
상기 제3 분자는, 상기 제1 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 상보적 서열과 상기 제2 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제1 서열의 상보적 서열 사이에 위치한 영역 사이에, 상기 특정 단편의 가닥 중 하나의 서열을 포함함 -;
- 및 상기에 정의된 제2 앙상블을 제조하는 단계, -
여기서, 재조합 복합체를 수득하기 위해, 상기 제2 앙상블의 제1 분자의 상기 상보적 영역의 A 서열은 상기 특정 단편의 5'에 인접한 영역의 상보적 서열을 포함하고;
상기 제2 앙상블의 제2 분자의 상기 상보적 영역의 B 서열은 상기 특정 단편의 3'에 인접한 영역의 상보적 서열을 포함하고;
상기 제2 앙상블의 제3 분자는, 상기 제2 앙상블의 제1 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 상보적 서열과 상기 제2 앙상블의 제2 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제1 서열의 상보적 서열 사이에 위치한 영역 사이에, 상기 제1 앙상블의 제3 서열에 함유된 상기 특정 단편의 상보적 가닥의 서열을 포함하고;
상기 제1 앙상블의 제1 분자의 A 영역에 함유된 특정 단편의 5'에 인접한 영역의 상보적 서열은 상기 제2 앙상블의 제1 분자의 A 영역에 함유된 특정 단편의 5'에 인접한 영역의 상보적 서열에 최대 95% 상보적이고;
상기 제1 앙상블의 제1 분자의 B 영역에 함유된 특정 단편의 3'에 인접한 영역의 상보적 서열은 상기 제2 앙상블의 제1 분자의 B 영역에 함유된 특정 단편의 3'에 인접한 영역의 상보적 서열에 최대 95% 상보적임 -;
- 편집될 준비가 된 세포를 수득하기 위해, 상기 세포를 상기 재조합 복합체와 접촉시키는 단계,
- 편집된 세포를 수득하기 위해, 편집될 준비가 된 상기 세포에서 상기 트랜스포사제를 발현시키는 단계,
- 편집된 세포를 선택하는 단계 - 여기서 상기 편집된 세포의 게놈은 상기 특정 이중 가닥 DNA 단편 대신에 다른 관심 이중 가닥 DNA 단편을 포함함 -를 포함하고,
단, 상기 방법은 인간의 생식계열 유전적 정체성을 변형시키는 방법이 아니며, 상기 방법은 사람이나 동물의 신체를 수술이나 치료법으로 치료하는 방법이 아니다.
이 게놈 편집 방법이 전술된 단일 분자를 대체하는 방법을 기초로 하고 전술된 앙상블을 사용하는 한, 전술된 모든 특징과 모든 변이체가, 필요한 부분만 수정하여, 여기에 적용된다.
본 발명의 이러한 양태에서, 고려되는 앙상블(제1 또는 제2)의 제1 분자는 고려되는 상기 앙상블의 제3 분자의 5'에 항상 위치한다는 점에 유의해야 한다.
또한 상기 제1 앙상블의 제1 분자는 상기 제2 앙상블의 제2 분자의 "위"에 위치하며 그 반대도 마찬가지이다. 또한, 전술된 5'에서 3' 방향은 표적 서열에 대해 관심 서열을 올바르게 위치시키는 것을 가능하게 한다.
게놈 편집은 높은 정밀도로 세포의 게놈을 변형시키는 것으로 구성된다. 유전자를 비활성화하거나, 표적화된 돌연변이를 도입하거나, 특정 돌연변이를 수정하거나, 새로운 유전자를 삽입하는 것이 가능하다. 이 유전 공학 기술은 포스포디에스테르 결합에서 핵산을 절단할 수 있는 뉴클레아제, 본원에는 트랜스포사제를 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 및 이전에 설명된 바와 같이, 본 발명에 따른 앙상블의 제1 및 제2 분자는, 표적 영역이 상기 제3 서열에 함유된 관심 서열로 대체되도록, 표적 영역의 측면에 위치하도록 상기 앙상블을 표적 영역에 위치시키는 것을 가능하게 한다.
이중 가닥 분자를 편집하는 것과 관련하여, 표적 분자의 두 가닥을 동시에 대체하여 본 발명에 따른 2개의 앙상블을 갖도록 하기 위해, 각각의 앙상블이 표적 분자의 두 가닥 중 하나를 특이적으로 표적화하는 것이 필요하다.
상기 제1 앙상블의 제1 분자의 A 서열에 함유된 상보적 서열은 상기 제2 앙상블의 제1 분자의 A 서열에 함유된 상보적 서열에 상보적이지 않다는 점에 유의해야 한다. 마찬가지로, 상기 제1 앙상블의 제2 분자의 B 서열은 상기 제2 앙상블의 제2 분자의 B 서열에 함유된 상보적 서열에 상보적이지 않다.
더욱이, 상기 제1 앙상블의 제1 분자의 A 서열에 함유된 상보적 서열이 상기 제1 앙상블의 제2 분자의 B 서열에 함유된 상보적 서열과 관련하여 상쇄되는 것이 유리하며, 이들 두 분자는 하나가 다른 것의 "위"에 위치한다. 이는 이러한 상보적 서열을 인식하는 영역이 최대 95%라는 것을 의미한다. 즉, 상기 A 서열과 상기 B 서열에 함유된 상보적 서열이 20개의 뉴클레오티드를 함유하는 경우, 상기 상보적 서열은 최대 19개의 뉴클레오티드에 대해서만 서로 상보적이다.
그러나 이들 상보적 영역의 상호 상보성은 가능한 한 낮거나, 심지어 상호 상보적이지 않은 것이 바람직하다.
이러한 설명을 명확하게 예시하기 위해, 표적 서열의 5' 부분이 40개의 뉴클레오티드를 포함하는 것으로 간주되는 경우, 상기 제1 앙상블의 제1 분자의 A 서열에 함유된 상보적 영역이 처음 20개의 뉴클레오티드와 상보적인 것이 적절할 것인 반면, 상기 제2 앙상블의 제2 분자의 B 서열에 함유된 상보적 영역은 표적 서열의 5' 부분의 상보적 서열의 마지막 20개의 뉴클레오티드에 상보적이다.
이 상쇄는, 서열 배향이 이를 가능하게 하지 않게 하더라도, 관심 서열의 임의의 잘못된 배향을 방지한다.
태그먼트화 단계의 순서와 결과는 [도 10]에 설명되어 있다.
최종 분자를 수득하기 위해, 그리고 태그먼트화 이후 5'에서 9개의 염기 쌍이 결실되는 관계로, 세포는 구멍을 메우기 위해, 특히 태그먼트화 동안 3' 말단이 결합된 상보적 가닥을 복사하는 DNA 폴리머라제를 사용함으로써, 복구 시스템을 동원해야 한다.
본 발명은 하기 실시예와 도면을 읽음으로써 보다 잘 이해될 것이다.
[도 1] [도 1]은 선형 형태의 제1 핵산 분자의 개략도이다. 화살표가 있는 직사각형은 트랜스포사제에 결합하기 위한 부위를 나타내고, 사선 막대가 있는 직사각형은 G/C-풍부 영역을 나타낸다.
[도 2] [도 2]는 구조화된 형태의 제1 핵산 분자의 개략도이다. 삽화 설명은 [도 1]에 대한 것과 같다.
[도 3] [도 3]은 본 발명에 따른 복합체의 개략도이다. 삽화 설명은 [도 1]에 대한 것과 같다.
[도 4] [도 4]는 본 발명에 따른 복합체의 두 가지 버전의 개략도이다. 삽화 설명은 [도 1]에 대한 것과 같다. 다양한 옵션이 점선으로 도시되었다.
[도 5] [도 5]는 본 발명에 따른 복합체의 제1 실시형태의 개략도이다. 삽화 설명은 [도 1]에 대한 것과 같다.
[도 6] [도 6]은 본 발명에 따른 복합체의 제2(6a) 및 제3(6b) 실시형태의 개략도이거나, 또는 제1 서열의 3' 영역은 2개의 트랜스포사제 절반-부위를 포함한다. 삽화 설명은 [도 1]에 대한 것과 같다.
[도 7] [도 7]은 본 발명에 따른 복합체의 제3 실시형태의 개략도이다. 삽화 설명은 [도 1]에 대한 것과 같다.
[도 8] [도 8]은 본 발명에 따른 앙상블의 개략도이다. 삽화 설명은 [도 1]에 대한 것과 같다.
[도 9] [도 9]는 단일 가닥 분자의 표적 서열을 관심 서열로 대체하는 특정 단계의 순서에 대한 개략도이다.
a는 쌍을 이루지 않은 표적 분자와 앙상블을 나타낸다.
b는 쌍을 이룬 표적 분자와 앙상블을 나타낸다. 트랜스포사제는 점선으로 표시되고 절단은 가위로 표시되었다. 상기 앙상블의 제3 분자에 대한 절단은 상기 분자의 양쪽에 있는 2개의 트랜스포사제 결합 부위 사이에서 수행된다는 점에 유의해야 한다(2개의 절단).
c는 태그먼트화로 인해 생성된 분자를 나타낸다. 대체된 영역의 5'에 있는 9개 염기의 결실은 점선으로 표시되었다.
[도 10] [도 10]은 이중 가닥 분자의 표적 서열을 그 자체가 이중 가닥인 관심 서열로 대체하는 특정 단계의 순서에 대한 개략도이다.
a는 쌍을 이루지 않은 표적 분자와 앙상블을 나타낸다.
b는 쌍을 이룬 표적 분자와 앙상블을 나타낸다. 트랜스포사제는 점선으로 표시되고 절단은 가위로 표시되었다. 상기 앙상블의 제3 분자에 대한 절단은 상기 분자의 양쪽에 있는 2개의 트랜스포사제 결합 부위 사이에서 수행된다는 점에 유의해야 한다(2개의 절단).
c는 태그먼트화로 인해 생성된 분자를 나타낸다. 대체된 영역의 5'에 있는 9개 염기의 결실은 점선으로 표시되었다.
[도 11] [도 11]은 본 발명에 따른 태그먼트화를 나타내는 아가로스 겔을 도시한다. a. 세 그룹의 샘플이 포함된 아가로스 겔; mCherry-CD9 플라스미드, HEK 293T 전체 mRNA의 PCR 증폭, 및 mCherry-CD9 플라스미드로 형질감염된 HEK 293T 전체 mRNA의 PCR 증폭을 사용한 다양한 트랜스포사제 복합체(음성 대조군, Tn5 WT, Tn5 Me 및 Tn5 DREAMT, 즉 본 발명에 따른 것)의 시험(PCR +/- 대조군 추가). b. 다양한 트랜스포사제 혼합물의 아가로스 겔(a 참조)은 mCherry-CD9 플라스미드에 10배 더 집중되어 있다.
[도 12] [도 12]는 Tn5 DREAMT 혼합물에 대한 양성 증폭 밴드(겔 [도 10] a)의 Sanger 서열분석 결과를 나타낸다.
수득된 서열(서열 번호 429) 및 해당하는 크로마토그램을 제시하였다. **는 GFP 삽입 영역을 나타낸다. GFP 서열은 측면에 위치하며 mCherry 서열에는 밑줄로 표시되어 있다.
[도 13] [도 13]은 세 그룹의 샘플이 포함된 아가로스 겔을 도시한다; mCherry-CD9 플라스미드, HEK 293T 전체 cDNA의 PCR 증폭, 및 mCherry-CD9 플라스미드로 형질감염된 HEK 293T 전체 cDNA의 PCR 증폭을 사용한 다양한 트랜스포사제 복합체(음성 대조군, Tn5 WT, Tn5 Me 및 Tn5 DREAMT)의 시험(PCR +/- 대조군 추가),
[도 14] [도 14]는 Tn5 DREAMT 혼합물에 대한 양성 증폭 밴드(겔 [도 13])의 Sanger 서열분석 결과를 나타낸다. 수득된 서열(서열 번호 430) 및 해당하는 크로마토그램을 제시하였다. **는 GFP 삽입 영역을 나타낸다. CD9 서열이 측면에 위치한다.
[도 15] [도 15]은 세 그룹의 샘플이 포함된 아가로스 겔을 도시한다; mCherry-CD9 플라스미드, HEK 293T 전체 cDNA의 PCR 증폭, 및 mCherry-CD9 플라스미드로 형질감염된 HEK 293T 전체 cDNA의 PCR 증폭을 사용한 다양한 트랜스포사제 복합체(음성 대조군, Tn5 WT, Tn5 Me 및 Tn5 DREAMT)의 시험(PCR +/- 대조군 추가),
[도 16] [도 16]은 Tn5 DREAMT 혼합물에 대한 양성 증폭 밴드(겔 [도 15])의 Sanger 서열분석 결과를 나타낸다. 수득된 서열(서열 번호 431) 및 해당하는 크로마토그램을 제시하였다. **는 GFP 삽입 영역을 나타낸다. CD9 서열이 측면에 위치한다.
[도 17] [도 17]은 mCherry-CD9 플라스미드에 대한 "새로운 설계"의 UVRD-mSA/Tn5/DREAMT 복합체의 시험을 도시한다. HEK 293T 세포에 mCherry-CD9 플라스미드 및 이어서 DREAMT 기술을 주입(형질감염)한 후, 가시적인 색상 변화(도면에 언급된 바와 같이 적색 -> 녹색)를 찾는다.
[도 18] [도 18]은 mCherry-CD9를 안정적으로 발현하는 HEK 293T 세포주에서 본 발명에 따른 기술을 형질감염시킨 후 가시적인 색상 변화(도면에 언급된 바와 같이 적색 -> 녹색)를 찾는 것을 도시한다.
[도 19] [도 19]는 "새로운 설계"의 DREAMT 기술로 형질감염된 HEK 293T 세포(D18에 사용된 세포)의 mCherry-CD9+ 세포주에서 유래한 cDNA 라이브러리로부터의 증폭된 GFP 단편의 Sanger 서열분석 결과를 나타낸다(서열 번호 432 - GFP 대체는 측면에 표시되어 있음). 서열 번호 433의 서열은 이론적 GFP 서열(측면 부분)을 나타낸다.
[도 1] [도 1]은 선형 형태의 제1 핵산 분자의 개략도이다. 화살표가 있는 직사각형은 트랜스포사제에 결합하기 위한 부위를 나타내고, 사선 막대가 있는 직사각형은 G/C-풍부 영역을 나타낸다.
[도 2] [도 2]는 구조화된 형태의 제1 핵산 분자의 개략도이다. 삽화 설명은 [도 1]에 대한 것과 같다.
[도 3] [도 3]은 본 발명에 따른 복합체의 개략도이다. 삽화 설명은 [도 1]에 대한 것과 같다.
[도 4] [도 4]는 본 발명에 따른 복합체의 두 가지 버전의 개략도이다. 삽화 설명은 [도 1]에 대한 것과 같다. 다양한 옵션이 점선으로 도시되었다.
[도 5] [도 5]는 본 발명에 따른 복합체의 제1 실시형태의 개략도이다. 삽화 설명은 [도 1]에 대한 것과 같다.
[도 6] [도 6]은 본 발명에 따른 복합체의 제2(6a) 및 제3(6b) 실시형태의 개략도이거나, 또는 제1 서열의 3' 영역은 2개의 트랜스포사제 절반-부위를 포함한다. 삽화 설명은 [도 1]에 대한 것과 같다.
[도 7] [도 7]은 본 발명에 따른 복합체의 제3 실시형태의 개략도이다. 삽화 설명은 [도 1]에 대한 것과 같다.
[도 8] [도 8]은 본 발명에 따른 앙상블의 개략도이다. 삽화 설명은 [도 1]에 대한 것과 같다.
[도 9] [도 9]는 단일 가닥 분자의 표적 서열을 관심 서열로 대체하는 특정 단계의 순서에 대한 개략도이다.
a는 쌍을 이루지 않은 표적 분자와 앙상블을 나타낸다.
b는 쌍을 이룬 표적 분자와 앙상블을 나타낸다. 트랜스포사제는 점선으로 표시되고 절단은 가위로 표시되었다. 상기 앙상블의 제3 분자에 대한 절단은 상기 분자의 양쪽에 있는 2개의 트랜스포사제 결합 부위 사이에서 수행된다는 점에 유의해야 한다(2개의 절단).
c는 태그먼트화로 인해 생성된 분자를 나타낸다. 대체된 영역의 5'에 있는 9개 염기의 결실은 점선으로 표시되었다.
[도 10] [도 10]은 이중 가닥 분자의 표적 서열을 그 자체가 이중 가닥인 관심 서열로 대체하는 특정 단계의 순서에 대한 개략도이다.
a는 쌍을 이루지 않은 표적 분자와 앙상블을 나타낸다.
b는 쌍을 이룬 표적 분자와 앙상블을 나타낸다. 트랜스포사제는 점선으로 표시되고 절단은 가위로 표시되었다. 상기 앙상블의 제3 분자에 대한 절단은 상기 분자의 양쪽에 있는 2개의 트랜스포사제 결합 부위 사이에서 수행된다는 점에 유의해야 한다(2개의 절단).
c는 태그먼트화로 인해 생성된 분자를 나타낸다. 대체된 영역의 5'에 있는 9개 염기의 결실은 점선으로 표시되었다.
[도 11] [도 11]은 본 발명에 따른 태그먼트화를 나타내는 아가로스 겔을 도시한다. a. 세 그룹의 샘플이 포함된 아가로스 겔; mCherry-CD9 플라스미드, HEK 293T 전체 mRNA의 PCR 증폭, 및 mCherry-CD9 플라스미드로 형질감염된 HEK 293T 전체 mRNA의 PCR 증폭을 사용한 다양한 트랜스포사제 복합체(음성 대조군, Tn5 WT, Tn5 Me 및 Tn5 DREAMT, 즉 본 발명에 따른 것)의 시험(PCR +/- 대조군 추가). b. 다양한 트랜스포사제 혼합물의 아가로스 겔(a 참조)은 mCherry-CD9 플라스미드에 10배 더 집중되어 있다.
[도 12] [도 12]는 Tn5 DREAMT 혼합물에 대한 양성 증폭 밴드(겔 [도 10] a)의 Sanger 서열분석 결과를 나타낸다.
수득된 서열(서열 번호 429) 및 해당하는 크로마토그램을 제시하였다. **는 GFP 삽입 영역을 나타낸다. GFP 서열은 측면에 위치하며 mCherry 서열에는 밑줄로 표시되어 있다.
[도 13] [도 13]은 세 그룹의 샘플이 포함된 아가로스 겔을 도시한다; mCherry-CD9 플라스미드, HEK 293T 전체 cDNA의 PCR 증폭, 및 mCherry-CD9 플라스미드로 형질감염된 HEK 293T 전체 cDNA의 PCR 증폭을 사용한 다양한 트랜스포사제 복합체(음성 대조군, Tn5 WT, Tn5 Me 및 Tn5 DREAMT)의 시험(PCR +/- 대조군 추가),
[도 14] [도 14]는 Tn5 DREAMT 혼합물에 대한 양성 증폭 밴드(겔 [도 13])의 Sanger 서열분석 결과를 나타낸다. 수득된 서열(서열 번호 430) 및 해당하는 크로마토그램을 제시하였다. **는 GFP 삽입 영역을 나타낸다. CD9 서열이 측면에 위치한다.
[도 15] [도 15]은 세 그룹의 샘플이 포함된 아가로스 겔을 도시한다; mCherry-CD9 플라스미드, HEK 293T 전체 cDNA의 PCR 증폭, 및 mCherry-CD9 플라스미드로 형질감염된 HEK 293T 전체 cDNA의 PCR 증폭을 사용한 다양한 트랜스포사제 복합체(음성 대조군, Tn5 WT, Tn5 Me 및 Tn5 DREAMT)의 시험(PCR +/- 대조군 추가),
[도 16] [도 16]은 Tn5 DREAMT 혼합물에 대한 양성 증폭 밴드(겔 [도 15])의 Sanger 서열분석 결과를 나타낸다. 수득된 서열(서열 번호 431) 및 해당하는 크로마토그램을 제시하였다. **는 GFP 삽입 영역을 나타낸다. CD9 서열이 측면에 위치한다.
[도 17] [도 17]은 mCherry-CD9 플라스미드에 대한 "새로운 설계"의 UVRD-mSA/Tn5/DREAMT 복합체의 시험을 도시한다. HEK 293T 세포에 mCherry-CD9 플라스미드 및 이어서 DREAMT 기술을 주입(형질감염)한 후, 가시적인 색상 변화(도면에 언급된 바와 같이 적색 -> 녹색)를 찾는다.
[도 18] [도 18]은 mCherry-CD9를 안정적으로 발현하는 HEK 293T 세포주에서 본 발명에 따른 기술을 형질감염시킨 후 가시적인 색상 변화(도면에 언급된 바와 같이 적색 -> 녹색)를 찾는 것을 도시한다.
[도 19] [도 19]는 "새로운 설계"의 DREAMT 기술로 형질감염된 HEK 293T 세포(D18에 사용된 세포)의 mCherry-CD9+ 세포주에서 유래한 cDNA 라이브러리로부터의 증폭된 GFP 단편의 Sanger 서열분석 결과를 나타낸다(서열 번호 432 - GFP 대체는 측면에 표시되어 있음). 서열 번호 433의 서열은 이론적 GFP 서열(측면 부분)을 나타낸다.
실시예
실시예 1 - 시험관 내에서의 본 발명의 구현.
본 실시예의 목적은 본 발명에 따른 앙상블이 단일 가닥 핵산 분자(RNA 또는 cDNA)의 서열을 관심 서열로 쉽고 특이적으로 대체하는 것을 가능하게 한다는 것을 입증하는 것이다.
이 실시예의 목표는 mCherry-CD9의 서열을 GFP 서열로 대체하는 것이다.
- mCherry-CD9를 표적화하는 재조합 앙상블의 제조.
하기를 함유하는 2개의 별도 튜브 준비:
- 튜브 1(10 μL)의 경우:
+ A 영역에 mCherry의 서열을 인식하기 위한 서열을 포함하는 루프 A 올리고뉴클레오티드(제1 분자) 10 μM;
+ 3'에 제한 절반-부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드 A(제3 분자) 10 μM
+ 역방향 BSPEi Frag 올리고(10 μM)
- 튜브 2(10 μL)의 경우,
+ B 영역에 CD9의 서열을 인식하기 위한 서열을 포함하는 루프 B 올리고뉴클레오티드(제2 분자) 10 μM;
+ 3'에 제한 절반-부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드 A(제3 분자) 10 μM
+ NdeI Frag 올리고(10 μM).
그런 다음 2개의 튜브를 5분 동안 95℃로 가열한 다음 실온에서 1시간 동안 방치한다.
실온에 도달하고 나면, 제한 부위가 분해될 수 있도록 NdeI 효소 또는 BSPEi 효소의 존재 하에 튜브의 내용물을 놓아둔다.
분해 생성물을 PCR 정제 키트(용출 20 μL)로 정제한다.
동시에, 5' 및 3'에 Nde I 및 BSPEi 제한 부위를 갖기 위해 GFP를 코딩하는 서열을 증폭시킨다. 그런 다음, PCR 생성물을 상기 두 가지 제한 효소로 분해하고, 분해 생성물을 PCR 정제 키트(용출 20 μL)로 정제한다.
그런 다음, 튜브 1과 2의 내용물을 T4 파지(4 μL, 즉 100 U)의 리가제와 5 μL의 T4 완충액(10X) 및 1 μL의 ddH20의 존재 하에 GFP 단편(증폭 및 분해됨)과 조합하여, 50 μL의 총 반응 부피를 얻는다.
그런 다음, 용액을 실온에서 1시간 동안 방치한 다음, 겔 정제를 수행하여, 재조합 복합체를 형성하기 위해, 1 킬로베이스(kb)보다 크고 5' 및 3' 말단에 상기 2개의 단일 가닥 분자(상기 앙상블의 제1 및 제2 분자)를 포함하는 가장 큰 GFP 단편을 단리한다.
이제, 재조합 복합체는 트랜스포사제 이량체와 함께 배양될 준비가 되어 있다.
대조군에서는, 각각 10 μM의 하기 MeA 및 MeB 올리고뉴클레오티드가, 95℃에서 5분 동안 쌍 형성을 수행한 다음 주변 온도에서 1시간 동안 방치함으로써, MERev 단편으로 제조되었다(문헌[S. Picelli et al Genome Res 2014]에 이전에 기재됨):
Tn5MErev,
5′-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3′(서열 번호 11)
Tn5ME-A(Illumina FC-121-1030),
5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3′; (서열 번호 12)
및 Tn5ME-B(Illumina FC-121-1031),
5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3′(서열 번호 13)
이들 올리고는 태그먼트화 반응에 대한 양성 대조군으로 유용하다.
Tn5 트랜스포사제의 제조와 관련하여, 이는 하기 출판물의 권장 사항을 사용하여 제조된다: 문헌[S. Picelli et al. Genome res 2014].
이전의 두 가지 제조물, 즉, 재조합 복합체와 양성 대조 올리고를 하기 프로토콜을 통해 Tn5 트랜스포사제 제조물과 혼합하였다:
0.125 vol.의 재조합 복합체 또는 대조군 올리고의 10 μM 용액(또는 소위 WT 야생형 Tn5에 대한 투석 완충액(문헌[S. Picelli et al. Genome, 2014] 참조)) + 0.4 vol.의 100% 글리세롤 용액 + 0.24 vol.의 투석 완충액(문헌[S. Picelli et al. Genome res 2014] 참조) + 0.36 vol.의 Tn5 용액.
그런 다음, 유전자 증폭기에서 4분마다 1℃씩 감소시킴으로써, 반응을 30분에 걸쳐 45℃에서 37℃로 변화시킨다.
동시에, 본 발명에 따른 기술을 시험하기 위해 여러 표적을 제조하였다.
mCherry-CD9 플라스미드뿐만 아니라, 이전에 mCherry-CD9 벡터와 함께 리포펙타민 3000으로 형질감염된 HEK 293T 세포에서 유래한 mRNA 및 cDNA 라이브러리의 제조물도 음성 대조군으로 사용되었다.
HEK 세포의 형질감염 및 육안 검사(mCherry의 발현으로 인한 적색 막) 후 48시간이 지나면, mRNA의 전체 집단이 추출되고 cDNA로 역전사된다.
이어서, 이러한 mRNA 또는 cDNA 라이브러리는 DREAMT 기술의 "튜브 내" 시험에 사용된다.
본 발명에 따른 기술을 특성화하고 시험하기 위해, 다양한 mRNA/cDNA 및 플라스미드 표적을 하기와 접촉시켰다:
- Tn5 WT 이량체: 올리고 무포함,
- Tn5 Me: Me 올리고 포함(양성 대조군) 및
- Tn5 복합체: 본 발명에 따른 앙상블 포함.
세 가지 유형의 표적, 즉, mCherry-CD9 플라스미드 및 mCherry-CD9의 형질감염을 포함하거나 포함하지 않는 mRNA 또는 cDNA 라이브러리를 시험하였다.
이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA/RNA 용액은 하기 반응을 통해 활성화된 다양한 Tn5 용액과 접촉되었다:
- X 또는 10X 농도의 Tn5 WT, Tn5 Me, Tn5 복합체 용액 또는 동일한 부피의 ddH20 + 500 ng의 mCherry-CD9 플라스미드 또는 2 μL의 cDNA 또는 mRNA
+ 5X 태그먼트화 완충액(100 mM HEPES, 50 mM MgCl2, 40% PEG 3500)
+ ddH20 Q.S. 20 μL.
각각의 태그먼트화 반응을 유전자 증폭기에서 55℃에서 7분 동안 수행한 다음, 트랜스포사제를 비활성화하기 위해 55℃에서 7분 동안의 제2 배양 온도 전에 0.5 μL의 단백질분해효소 K 용액(20 μg/μL)을 첨가한다.
따라서, [도 11]에 나타난 바와 같이, GFP의 3' 말단의 침강(결찰)이 mCherry 표적 서열을 향해 수행되었다.
[Fig. 11]의 아가로스 겔 상에서, mCherry-CD9 플라스미드(Davidson Lab)는 두 가지 농도(X 및 10X)의 Tn5 용액과 접촉되었다. 예상한 대로, 고농도(10X)에서, Tn5 WT 혼합물과 Tn5 Me 양성 대조군은 태그먼트화를 수행하였으며, 이는 플라스미드의 분해(플라스미드 밴드의 소멸, 얼룩)에 의해 실증된다.
또한, 예상한 대로, 아가로스 겔 상의 DNA 밴드의 보존에 의해 실증되는 바와 같이([도 11]), 앙상블만으로는 태그먼트화(플라스미드 분해)를 수행할 수 없었다[그 이유는, 이것은 Tn5 분자를 방출하고 태그먼트화를 허용하는 mCherry-CD9 표적과의 쌍 형성을 위해 플라스미드의 이중 가닥 DNA를 개방하기 위한 분자(헬리카제)를 포함하지 않기 때문이다]. 이 데이터는, 표적 단일 가닥(여기서는 mCherry-CD9 mRNA 단편)과 재조합될 가닥과 쌍을 이룸으로써만 태그먼트화 활성을 수행할 수 있는 Tn5 복합체 이량체를 국한시킴으로써 결론을 내리는 것을 가능하게 한다.
동일한 농도의 Tn5 용액(X)을 2 μL의 mRNA 라이브러리(정상 또는 mCherry-CD9로 형질감염된 HEK 293T 세포에서 유래함)와 함께 사용하였다. 그런 다음 mCherry 정방향 및 GFP 정방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다(표 3 참조).
표 3: PCR 반응 및 플라스미드 구축에 사용되는 올리고
[표 3]
예상한 대로, mCherry-CD9 벡터로 형질감염되지 않은 세포에서 수득한 mRNA 라이브러리에 대해서는 신호가 검출되지 않았다. 또한, 음성 대조군(mRNA 단편 단독, mRNA + Tn5 WT, mRNA + Tn5 Me) 및 mCherry-CD9로 형질감염된 mRNA 라이브러리 샘플에 대해서도 마찬가지로 증폭이 검출되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 동일한 배치(batch)의 샘플에서, mCherry-CD9를 GFP 서열로 대체한 것에 해당하는 샘플(Tn5 복합체)에 대해 정확한 분자량 ≒ 1 kb에서 명확한 밴드가 검출되었다([도 11]). 이 밴드는 GFP 3' 말단(센스 가닥)의 삽입에 따른 mCherry 3' 말단(안티센스 mRNA)의 절단 또는, 다시 말하면, 3'에서 5' 방향의 GFP 센스 가닥에 대한 mCherry mRNA 안티센스 가닥의 결찰을 강조한다.
증폭 생성물을 서열분석하였고, 수득된 서열을 [도 12]에 나타냈다. 예상한 대로, 결찰에 의해 연결된 두 서열의 검출과 함께 GFP 3' 측면을 향한 mCherry의 증폭이 검출되었다. 이 서열분석의 크로마토그램은 표적 서열로부터 10 bp 위치에서의 침강 영역(태그먼트화)을 명확하게 나타낸다([도 12]).
동일한 분석을 반복했으며, 이번에는 3' 측면에 대한 결찰 설계를 변경하였다: cDNA 센스 가닥의 CD9([도 12]). 따라서, 증폭 겔을 사용하여 동일한 결과를 얻었으며, 이는 mCherry-CD9 형질감염을 갖고 본 발명에 따른 앙상블(Tn5 복합체)과 접촉된 cDNA 라이브러리에 대해 약 1kb 방향으로 예상되는 밴드를 나타냈으며([도 13]), 수득된 단편의 서열분석을 수행하였다([도 14]). 예상한 대로, 이 서열분석은, 표적 서열로부터 5 bp에 GFP 5' 측면 센스 가닥의 복수의 서열(GFP 센스 서열의 3'에서 결찰; [도 14])을 갖는 침강된 cDNA의 CD9 센스 가닥의 서열을 식별하는 것을 가능하게 하였다.
실시예 2 - 세포 내에서의 본 발명의 구현
이러한 고무적인 결과에 힘입어, 상기 앙상블, 상기 Tn5 플라스미드 및 가닥 개방 단백질(단량체 스트렙타비딘과 융합되는 UVRD 박테리아 헬리카제의 플라스미드(UVRD-mSA 플라스미드))의 직접 형질감염과 양립 가능한 버전을 수득하기 위해 설계가 수정되었으며, 결과적으로 후자는 이전에 비오틴화된 올리고를 통해 상기 앙상블의 분자 중 하나에 계내에서 부착된다. 이를 위해, 배치를 더 쉽게 하고 설계를 거의 100% 제어할 수 있도록(신호등 석관(Beacon sarcophagus) 시스템에 의해 국한되지 않는 Tn5 이량체 및 이에 따라 관련 "비표적"의 감소) 새로운 버전의 앙상블이 개발되었다. 따라서 이 "새로운 설계의 앙상블"에서는, 이전과 동일한 유형의 프로토콜이 특정한 주요 변경 사항과 함께 수행되었다. 실제 설계와 관련하여, 루프 nDREAMT A, B, C 및 D 올리고(4개 표적 영역의 태그먼트화를 위한 표적당 하나 및 Tn5 이량체당 하나 - 완전한 이중 가닥 대체)는 더 길며 트랜스포사제에 대한 부착을 위한 3개의 서열을 갖는다. 이는, mCherry-CD9 표적 단편을 대체하기 위한 GFP 단편(nDREAMT A, B, C 및 D 올리고)에 연결된 트랜스포사제에 대한 부착을 위한 마지막 서열을 간단히 추가하여 빠르고 제어된 쌍 형성을 허용한다. 또한, 다른 nDREAMT Bio A 및 B 올리고(비오틴화된 올리고)가 첨가되어 UVRD-mSA 융합 단백질과의 앙상블의 세포내 조립을 허용한다.
하기 올리고머를 2개의 별도 튜브 1과 2에서 혼합하였다: 튜브 1(10 μL)의 경우, nDREAMT A 및 C 루프(10 μM) + nDREAMT A 및 C 올리고(10 μM) + nDREAMT Bio A 올리고(10 μM); 튜브 2(10 μl)의 경우, nDREAMT B 및 D 루프(10 μM) + nDREAMT B 및 D 올리고(10 μM) + nDREAMT Bio B 올리고(10 μM). 그런 다음 2개의 튜브를 5분 동안 95℃로 가열한 다음 실온에서 1시간 동안 방치한 후, 각각의 튜브를 해당하는 제한 효소로 분해하고 PCR 정제 키트(용출 20 μL)로 정제한다.
동시에, 5'의 제한 효소 NdeI 및 3'의 BSPEi의 서열의 측면에 위치한 말단으로서 포함하는 GFP의 증폭된 서열(PCR 후 분해된 제한 부위 구조를 갖는 올리고)을 증폭시킨 다음, 해당하는 제한 효소로 분해하고 20 μL의 부피로 용출되는 PCR 정제 키트로 정제하였다.
그런 다음 튜브 1과 2의 내용물을, 증폭 및 분해된 GFP neo 단편, T4 리가제의 용액(4 μL 또는 100 U), 5 μL의 T4 완충액(10X) 및 1 μL의 ddH20 용액과 혼합하여 50 μL의 총 반응 부피를 얻는다. 용액을 실온에서 1시간 동안 방치한 후 겔 정제를 수행하여 1 kb보다 크고 5' 및 3' 말단에 4개의 석관 A, B, C 및 D를 포함하는 가장 큰 GFP 단편을 단리한다. 5' 및 3' 말단에 4개의 석관이 위치한 GFP 대체 단편은 이제 트랜스포사제 이량체를 수용할 준비가 되어 있다([도 15]).
세포 수준에서 이 시스템을 시험하기 전에, 이전의 mCherry-CD9 표적 cDNA(센스 가닥)의 CD9 측면에 대한 GFP 3' 측면 결찰(센스 가닥)의 경우에서와 동일한 일련의 실험을 통해 새로운 설계를 시험하였다. 따라서, GFP 정방향 및 CD9 역방향 PCR 프라이머를 통한 증폭 후 이전과 동일한 유형의 결과를 얻었으며(나머지 모든 음성 대조군은 검출 불가능함). 0.5 kb 방향의 예상되는 밴드를 얻었다([도 15]). 이 밴드의 Sanger 서열분석 후, 예상대로, 5'에서 3' 방향의 CD9 단편의 검출이, 원래 표적 서열의 두 염기 내에서([도 16]), 3' 말단에서의 GFP의 복수의 서열의 결찰을 사용하여 수행되었다([도 16]).
이 새로운 설계에 대한 긍정적인 검증 후, mCherry-CD9를 발현하는 HEK 293T 세포에서의 계내 시험이 수행되었다. 이를 위해, Tn5 트랜스포사제 및 UVRD-mSA 단백질에 대한 2개의 세포내 단백질 발현 플라스미드를 생성하였다. Tn5 플라스미드의 경우, Tn5 서열을 PTXB1-Tn5 플라스미드를 통해 PCR로 증폭시켰다(문헌[S. Picelli et al Genome Res 2014]). 키틴 비드와의 결합 및 자가 절단을 통해 Tn5 트랜스포사제의 정제를 허용하여 Tn5 단백질 상에 태그 요소를 남기지 않는 인테인 테일 태그는(문헌[S. Picelli et al Genome Res 2014]) 종결 코돈으로 대체되었다. BMT1 및 EcoR1 제한효소를 통해 mCherry-CD9 플라스미드(Davidson Lab)의 mCherry-CD9 단편 대신에, 전체를 클로닝하여 CMV-Tn5 프로모터 플라스미드를 최종적으로 수득하였다. mSA 단편의 PCR 증폭은 5'에서의 BMT1 제한 부위와 3'에서의 EcoR1 제한 부위의 추가와 함께 pRSET-mSA 플라스미드(Sheldon Park Lab)(표 1)를 통해 수행되었다(표 1). 제1 클로닝 단계는 BM1 및 EcoR1 효소를 통해 mCherry-CD9 플라스미드에서 수행되었으며, 이는 mCherry-CD9 단편을 CMV-mSA 프로모터 플라스미드를 수득하는 mSA 단편으로 대체하였다. UVRD 단편의 경우 E. coli 박테리아의 cDNA 라이브러리가 생성되었다(DH5α). UVRD cDNA의 PCR 증폭은 정확한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행되었다(표 1). 5' 측면에는, 클로닝을 위한 BMT1 서열 및 Kozac 서열과 같은 일반적인 요소가 발견될 뿐만 아니라, 완전한 복합체 + Tn5 + UVRD-mSA 복합체가 세포 핵으로 도입될 수 있도록 하는 NLS 도입 서열도 발견된다. 3'에는, PMiI mSA 5' 서열에 함유된 정확한 제한 효소에 대한 mSA 5' 서열의 하나의 말단인 유연한 부분(GGGSx3 유형 폴리글리신 테일)이 추가되었다. 그런 다음, UVRD 서열의 5'에서의 첨가를 허용하고 CMV-UVRD-mSA 프로모터 유형의 최종 플라스미드를 수득하는 BMT1 및 PMiI 제한 효소를 사용하여 제2 클로닝 단계를 수행하였다.
HEK 293T 세포의 형질감염은 mCherry-CD9 플라스미드와 함께 리포펙타민 3000에 의해 수행되었다. 24시간을 기다리고 세포질막의 적색 신호를 공초점 현미경으로 확인한 후, 세포를 세 가지 화합물, 즉, CMV-Tn5 및 CMV-UVRD-mSA 플라스미드 및 새로운 설계의 복합체로 형질감염시켰다. 이 완전한 복합체는 CMV-GFP 서열을 사용한 4개의 표적(4중 표적, 2개의 mCherry 측면 및 2개의 CD9 측면) 사이에 위치한 서열의 이중 가닥 대체를 허용한다. 따라서 이 실험에서는 적색 막 신호가 감소하거나 심지어 녹색 세포질 신호로 대체될 것으로 예상되었다.
예상대로 및 [도 17]에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 기술을 사용한 제2 형질감염 후 5일째에, 녹색 세포가 검출되었다.
이들 세포는 세포 계측법에 의한 세포 분류에 의해 단리되었으며, CMV-GFP 단편이 CMV-mCherry-CD9 플라스미드의 mCherry-CD9 부분을 대체했다는 것을 알고 있으므로, 이 새로운 CMV-GFP 플라스미드는 NeoR/KanR 세포주를 생성하기 위한 항생제 선택 서열을 함유해야 한다. 6일 초과의 형질감염 후, 이들 녹색 세포를 2 mg/ml의 G418을 포함하는 배지에 넣었고, 배지는 14일 동안 매일 교체된 다음 3개월 동안 0.5 mg/ml의 농도에서 유지되었다.
예상대로, 형질감염 후 19일째에 새로운 GFP+ 녹색 세포주가 수득되었으며, 이는 반복적인 동결 및 해동 주기에도 불구하고 매우 안정적이었다([도 17] 참조).
이 결과를 더 확실하게 계내에서 재확인하기 위해, CMV-mCherry-CD9 플라스미드를 사용한 형질감염 및 이전과 같이 2 mg/ml의 G418로 처리하여 안정적인 HEK 293T 적색 막 세포주를 생성하였다. 2주간의 처리 후에 HEK 293T 적색막 세포주를 수득하였다.
이 세포주는 전술된 기술을 사용하여 이전과 같이 형질감염되었다. 3일의 형질감염 후에, 제1 녹색 세포가 나타나기 시작하였다([도 18] 참조). 형질감염 후 14일 후에 특정 그룹의 녹색 세포가 식별되었고 추가적인 분석을 위해 단리되었다([도 18] 참조).
이들 세포를 단리한 후, cDNA 라이브러리를 수득하기 위해, 형질감염 후 18일째에 이들 세포를 사용하여 역전사를 수행하였다.
이어서, GFP 서열을 PCR에 의해 증폭시키고, 증폭된 단편을 Sanger 방법에 따라 서열분석하였다.
예상한 대로, 서열 데이터베이스(NCBI BLAST)와 비교하여 분석한 결과, mCherry-CD9 서열을 대체하는 이론적 GFP 단편과 매우 가까운 유사성이 발견되었다[도 19]. 또한, 거의 한 달이 지나도, 수득된 녹색 세포는 강한 녹색 신호와 함께 안정적인 상태를 유지한다([도 18]). 이러한 결과는 본 발명에 따른 기술의 세포내 효능을 확인시켜 주며, 이는 mCherry-CD9 표적 서열을 GFP 대체 서열로 대체하는 것을 가능하게 하며, 이는 막의 적색에서 세포질의 녹색으로의 색상 변화에 의해 실증된다. 이러한 색상 변화는, 새로운 설계 + Tn5 + UVRD-mSA 복합체(UVRD의 N-Term 서열 상에 NLS 포함)의 핵 도입, 두 5' 및 3' 측면 헬리카제에 의해 수행되는 DNA 가닥의 개방, 4개의 원하는 표적 지점(mCherry 측면에 2개, CD9 측면에 2개)에서의 쌍 형성 및 본 발명에 따른 기술에 의한 CMV-GFP 단편을 사용한 mCherry-CD9 서열의 대체를 검증하는 것을 가능하게 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> QUIDDITAS THERAPEUTICS
<120> Composition et methode permettant l'edition gnomique
<130> BR 132275
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ctgtctctta tacacatct 19
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sequence de liaison Tn5
<400> 12
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sequence de liaison Tn5
<400> 13
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligo GFP sens
<400> 14
ctggtcgagc tggacggcga cg 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligo GFP reverse
<400> 15
cacgaactcc agcaggacca tg 22
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligo mCherry sens
<400> 16
aagggcgagg aggataacat g 21
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligo CD9 reverse
<400> 17
gaccatctcg cggttcct 18
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligo GFP Nde1 sens
<400> 18
acttggcata tgatggtgag caagggcgag ga 32
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligo GFP Nde1 reverse
<400> 19
acttggcata tgcttgtaca gctcgtccat 30
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligo GFP BSPEI sens
<400> 20
tacaagtccg gaatggtgag caagggcgag ga 32
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligo GFP BSPEI reverse
<400> 21
tacaagtccg gacttgtaca gctcgtccat 30
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligo CMV Nde1 sens
<400> 22
acttggcata tgccaagtac gccccctatt ga 32
<210> 23
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligo UVRD sens
<400> 23
ctcttcgcta gctgccacca tgacgcgtgg ccccaagaaa aagcggaaag tgggaccggc 60
caccatggac gtttcttacc tgctcg 86
<210> 24
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligo UVRD reverse
<400> 24
aacaacacgt gccggtgata cccgcttccg cgcctgatcc accaccacct gacccaccac 60
cagccaccga ctccagccgg g 81
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligo mSA sens
<400> 25
ctcttcgcta gcgcggaagc gggtatcac 29
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligo mSA reverse
<400> 26
aacaagaatt cttattattt aactttggtg aaggt 35
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligo Tn5 sens
<400> 27
ctcttcgcta gcatgattac cagtgcactg cat 33
<210> 28
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligo Tn5 reverse
<400> 28
aacaagaatt cttattagat tttaatgccc tgcgcca 37
<210> 29
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 29
aacgtt 6
<210> 30
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 30
aagctt 6
<210> 31
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 31
aatatt 6
<210> 32
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 32
aatt 4
<210> 33
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 33
acatgt 6
<210> 34
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 34
accggt 6
<210> 35
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 35
acctgc 6
<210> 36
<211> 7
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 36
accwggt 7
<210> 37
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 37
acgcgt 6
<210> 38
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 38
acggc 5
<210> 39
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 39
acgt 4
<210> 40
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 40
acngt 5
<210> 41
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(6)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 41
acnnnngtay c 11
<210> 42
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(7)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 42
acnnnnnctc c 11
<210> 43
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 43
acrygt 6
<210> 44
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 44
actagt 6
<210> 45
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 45
actgg 5
<210> 46
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 46
actggg 6
<210> 47
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 47
agatct 6
<210> 48
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 48
agcgct 6
<210> 49
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 49
agct 4
<210> 50
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 50
aggcct 6
<210> 51
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 51
agtact 6
<210> 52
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 52
atcgat 6
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 53
atctatgtcg ggtgcggaga aagaggtaat 30
<210> 54
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 54
atgcat 6
<210> 55
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 55
attaat 6
<210> 56
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 56
atttaaat 8
<210> 57
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(8)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 57
caannnnngt gg 12
<210> 58
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 58
caattg 6
<210> 59
<211> 7
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 59
cacctgc 7
<210> 60
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 60
cacgag 6
<210> 61
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 61
cacgag 6
<210> 62
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 62
cacgtc 6
<210> 63
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 63
cacgtg 6
<210> 64
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 64
cacnnngtg 9
<210> 65
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(7)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 65
cacnnnngtg 10
<210> 66
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 66
cagcag 6
<210> 67
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 67
cagctg 6
<210> 68
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 68
cagnnnctg 9
<210> 69
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 69
cagtg 5
<210> 70
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 70
catatg 6
<210> 71
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 71
catg 4
<210> 72
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 72
catg 4
<210> 73
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 73
catg 4
<210> 74
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(7)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 74
caynnnnrtg 10
<210> 75
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(12)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 75
ccannnnnnn nntgg 15
<210> 76
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(9)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 76
ccannnnnnt gg 12
<210> 77
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(8)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 77
ccannnnntg g 11
<210> 78
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 78
ccatc 5
<210> 79
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 79
ccatgg 6
<210> 80
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 80
cccagc 6
<210> 81
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 81
cccgc 5
<210> 82
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 82
cccggg 6
<210> 83
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 83
cccggg 6
<210> 84
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 84
ccdg 4
<210> 85
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 85
ccgc 4
<210> 86
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 86
ccgcgg 6
<210> 87
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 87
ccgctc 6
<210> 88
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 88
ccgg 4
<210> 89
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 89
ccngg 5
<210> 90
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 90
ccngg 5
<210> 91
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 91
ccnngg 6
<210> 92
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(9)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 92
ccnnnnnnng g 11
<210> 93
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 93
ccrygg 6
<210> 94
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 94
ccsgg 5
<210> 95
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 95
cctagg 6
<210> 96
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 96
cctc 4
<210> 97
<211> 7
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 97
cctcagc 7
<210> 98
<211> 7
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 98
cctcagc 7
<210> 99
<211> 7
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 99
cctcagc 7
<210> 100
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 100
cctgcagg 8
<210> 101
<211> 7
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 101
cctnagc 7
<210> 102
<211> 7
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 102
cctnagg 7
<210> 103
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(8)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 103
cctnnnnnag g 11
<210> 104
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 104
ccttc 5
<210> 105
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 105
ccwgg 5
<210> 106
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 106
ccwgg 5
<210> 107
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 107
ccwwgg 6
<210> 108
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(9)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 108
cgannnnnnt gc 12
<210> 109
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 109
cgatcg 6
<210> 110
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 110
cgcg 4
<210> 111
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 111
cggccg 6
<210> 112
<211> 7
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 112
cggwccg 7
<210> 113
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 113
cgrycg 6
<210> 114
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 114
cgtacg 6
<210> 115
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 115
cgtctc 6
<210> 116
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 116
cgtctc 6
<210> 117
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 117
cgwcg 5
<210> 118
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 118
cmgckg 6
<210> 119
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(21)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 119
cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ng 22
<210> 120
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 120
cnnr 4
<210> 121
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 121
crccggyg 8
<210> 122
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 122
ctag 4
<210> 123
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 123
ctcag 5
<210> 124
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 124
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<210> 125
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 125
ctcttc 6
<210> 126
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 126
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<210> 127
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 127
ctgcag 6
<210> 128
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 128
ctggag 6
<210> 129
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 129
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<210> 130
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 130
ctryag 6
<210> 131
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 131
cttaag 6
<210> 132
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 132
cttgag 6
<210> 133
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 133
ctyrag 6
<210> 134
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 134
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<210> 135
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 135
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<210> 136
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 136
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<210> 137
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(7)
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<400> 137
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<210> 138
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 138
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<210> 139
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 139
gaatgc 6
<210> 140
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 140
gaattc 6
<210> 141
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 141
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<210> 142
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 142
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<210> 143
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 143
gacgtc 6
<210> 144
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 144
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<210> 145
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(7)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 145
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<210> 146
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(8)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 146
gacnnnnngt c 11
<210> 147
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(9)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 147
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<210> 148
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 148
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<210> 149
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 149
gagctc 6
<210> 150
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 150
gaggag 6
<210> 151
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 151
gagtc 5
<210> 152
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 152
gagtc 5
<210> 153
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 153
gagtc 5
<210> 154
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 154
gantc 5
<210> 155
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 155
gatatc 6
<210> 156
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 156
gatc 4
<210> 157
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 157
gatc 4
<210> 158
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(7)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 158
gatnnnnatc 10
<210> 159
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 159
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<210> 160
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 160
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<210> 161
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 161
gcaatg 6
<210> 162
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 162
gcagc 5
<210> 163
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 163
gcagtg 6
<210> 164
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 164
gcagtg 6
<210> 165
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(8)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 165
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<210> 166
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 166
gcatc 5
<210> 167
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 167
gcatgc 6
<210> 168
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 168
gcccgggc 8
<210> 169
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 169
gccgag 6
<210> 170
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 170
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<210> 171
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 171
gccggc 6
<210> 172
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(8)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 172
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<210> 173
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 173
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<210> 174
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 174
gcgatg 6
<210> 175
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 175
gcgc 4
<210> 176
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 176
gcgc 4
<210> 177
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 177
gcgcgc 6
<210> 178
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 178
gcggccgc 8
<210> 179
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 179
gcngc 5
<210> 180
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 180
gcnngc 6
<210> 181
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(9)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 181
gcnnnnnnng c 11
<210> 182
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 182
gctagc 6
<210> 183
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 183
gctagc 6
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<211> 7
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 184
gctcttc 7
<210> 185
<211> 7
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 185
gctcttc 7
<210> 186
<211> 7
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 186
gctnagc 7
<210> 187
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 187
gcwgc 5
<210> 188
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 188
gdgchc 6
<210> 189
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 189
ggatc 5
<210> 190
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 190
ggatc 5
<210> 191
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 191
ggatcc 6
<210> 192
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 192
ggatg 5
<210> 193
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 193
ggatg 5
<210> 194
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 194
ggcc 4
<210> 195
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 195
ggccggcc 8
<210> 196
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(9)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 196
ggccnnnnng gcc 13
<210> 197
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 197
ggcgcc 6
<210> 198
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 198
ggcgcc 6
<210> 199
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 199
ggcgcc 6
<210> 200
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 200
ggcgcc 6
<210> 201
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 201
ggcgcgcc 8
<210> 202
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 202
ggcgga 6
<210> 203
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 203
gggac 5
<210> 204
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 204
gggccc 6
<210> 205
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 205
gggccc 6
<210> 206
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 206
ggncc 5
<210> 207
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 207
ggnncc 6
<210> 208
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 208
ggtacc 6
<210> 209
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 209
ggtacc 6
<210> 210
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 210
ggtctc 6
<210> 211
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 211
ggtga 5
<210> 212
<211> 7
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 212
ggtnacc 7
<210> 213
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 213
ggwcc 5
<210> 214
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 214
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<210> 215
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 215
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<210> 216
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 216
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<210> 217
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 217
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<210> 218
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 218
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<210> 219
<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 219
gtac 4
<210> 220
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 220
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<210> 221
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 221
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<210> 222
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 222
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<210> 223
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 223
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<210> 224
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 224
gtctc 5
<210> 225
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 225
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<210> 226
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 226
gtgcag 6
<210> 227
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 227
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<210> 228
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 228
gtnnac 6
<210> 229
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 229
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<210> 230
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 230
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<210> 231
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 231
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<210> 232
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 232
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<210> 233
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 233
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<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 234
nncastgnn 9
<210> 235
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 235
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<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 236
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<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> restriction site
<400> 237
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 238
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 239
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<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 240
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<210> 241
<211> 7
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 241
rggnccy 7
<210> 242
<211> 7
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 242
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 243
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<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 244
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 245
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<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 246
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<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 247
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<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 248
tccrac 6
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<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 249
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<210> 250
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 250
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<210> 251
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 251
tcnga 5
<210> 252
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 252
tcnnga 6
<210> 253
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 253
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<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 254
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<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 255
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<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 256
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 257
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 258
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<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 259
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<211> 4
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 260
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<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 261
ttaattaa 8
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<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 262
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<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 263
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<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 264
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<210> 265
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 265
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<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 266
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<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 267
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> restriction site
<400> 268
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 269
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 270
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<210> 271
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
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<210> 272
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 272
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<210> 273
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 273
ctgagagatc ccctcataat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 274
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<210> 275
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 275
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 276
taatactccc ctagagagtc 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 277
ctgagagatc ccctcataat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 281
ctgagagatc ccctcataat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
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attatgaggg gatctctcag 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 283
gactctctag gggagtatta 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 284
taatactccc ctagagagtc 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 285
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<210> 286
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 286
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 287
ctgagagatc ccctcataat ttccccaaa 29
<210> 288
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 288
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 290
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<210> 291
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 291
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<210> 292
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 292
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<210> 293
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 293
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<210> 294
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 294
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<210> 295
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 295
cactacagtt gcattttgtg tcgtgagtg 29
<210> 296
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 296
cactcacgac acaaaatgca actgtagtg 29
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 297
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<210> 298
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 298
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<210> 299
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 299
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<210> 300
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 300
atggttcaac ccttaagtta gcgcttatg 29
<210> 301
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 301
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<210> 302
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 302
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<210> 303
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 303
catgcccatc aacttaagaa caaaaataa 29
<210> 304
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 304
ttatttttgt tcttaagttg atgggcatg 29
<210> 305
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 305
catcgccatc aagctaagga aaaggagat 29
<210> 306
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 306
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<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 307
catcgccatc aagctaacga aattgaact 29
<210> 308
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 308
agttcaattt cgttagcttg atggcgatg 29
<210> 309
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 309
taatgccgat cagttaagga tcagttcac 29
<210> 310
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 310
gtgaactgat ccttaactga tcggcatta 29
<210> 311
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 311
taatgccagt cagttaagca actgactgg 29
<210> 312
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 312
ccagtcagtt gcttaactga ctggcatta 29
<210> 313
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 313
taagagagtt aatttataat ctattttca 29
<210> 314
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 314
tgaaaataga ttataaatta actctctta 29
<210> 315
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 315
taaggatgtt aatttattaa tttaaaagg 29
<210> 316
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 316
ccttttaaat taataaatta acatcctta 29
<210> 317
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 317
ctgactctta tacacaagta gcgtcctga 29
<210> 318
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 318
tcaggacgct acttgtgtat aagagtcag 29
<210> 319
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 319
caggcgtgtt gattatccaa taaaatccca 30
<210> 320
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 320
caggggatca agatctgatc aagagacag 29
<210> 321
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 321
caggcgtgtt gattatccaa taaaatccca 30
<210> 322
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 322
tgggatttta ttggataatc aacacgcctg 30
<210> 323
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 323
cacgagtgtt gattatccaa aattataaca 30
<210> 324
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 324
tgttataatt ttggataatc aacactcgtg 30
<210> 325
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 325
cttaacgggt gacaaggcat cctctagcct 30
<210> 326
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 326
aggctagagg atgccttgtc acccgttaag 30
<210> 327
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 327
cttaacgggt gacaacgtag cctacgaagc 30
<210> 328
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 328
gcttcgtagg ctacgttgtc acccgttaag 30
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<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 329
ccttaattcc gcaacactat agtttaaca 29
<210> 330
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 330
tgttaaacta tagtgttgcg gaattaagg 29
<210> 331
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 331
cctcaaatcc gcaacctata gggtttagt 29
<210> 332
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 332
actaaaccct ataggttgcg gatttgagg 29
<210> 333
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 333
cagtacctca caaagccggt tagttgaga 29
<210> 334
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 334
tctcaactaa ccggctttgt gaggtactg 29
<210> 335
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 335
cagtacctca caaagcattc tcggctagc 29
<210> 336
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 336
gctagccgag aatgctttgt gaggtactg 29
<210> 337
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 337
ggccgtgaac ccataaactg ggtaccggat tactgat 37
<210> 338
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 338
atcagtaatc cggtacccag tttatgggtt cacggcc 37
<210> 339
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 339
ggccgtagac tcataagccc gcagccacag gcgcatt 37
<210> 340
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 340
aatgcgcctg tggctgcggg cttatgagtc tacggcc 37
<210> 341
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 341
gggcttgtct gcattcaagg attccctttt gtacgaa 37
<210> 342
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 342
ttcgtacaaa agggaatcct tgaatgcaga caagccc 37
<210> 343
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 343
gggcgtgtct gcattcaacg taaccagatc atagcgc 37
<210> 344
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 344
gcgctatgat ctggttacgt tgaatgcaga cacgccc 37
<210> 345
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 345
ggctttgttg aataaatcga acttttgctg agttgaa 37
<210> 346
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 346
ttcaactcag caaaagttcg atttattcaa caaagcc 37
<210> 347
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 347
ggctttgttg aataaatcag atttcgggta agtctcc 37
<210> 348
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 348
ggagacttac ccgaaatctg atttattcaa caaagcc 37
<210> 349
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 349
ggtgatgctg ccaacttact gatttagt 28
<210> 350
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 350
actaaatcag taagttggca gcatcacc 28
<210> 351
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 351
ggtaatgact ccaacttatt gatagtgt 28
<210> 352
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 352
acactatcaa taagttggag tcattacc 28
<210> 353
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 353
ggtgatgcct ctaattagtt gaatctga 28
<210> 354
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 354
tcagattcaa ctaattagag gcatcacc 28
<210> 355
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 355
ggtgatgctt ccaattagta gaacatgt 28
<210> 356
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 356
acatgttcta ctaattggaa gcatcacc 28
<210> 357
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 357
ggtcatgcat tcaatgcgga gcggagat 28
<210> 358
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 358
atctccgctc cgcattgaat gcatgacc 28
<210> 359
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 359
ggtcatgtat tcaatctggt tattagta 28
<210> 360
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 360
tactaataac cagattgaat acatgacc 28
<210> 361
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 361
gagagtttca aatagataat gatgtggg 28
<210> 362
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 362
cccacatcat tatctatttg aaactctc 28
<210> 363
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 363
gagagtttca agaaagtaat gagaggcg 28
<210> 364
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 364
cgcctctcat tactttcttg aaactctc 28
<210> 365
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 365
ggcattggta gttaattata gttatata 28
<210> 366
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 366
tatataacta taattaacta ccaatgcc 28
<210> 367
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 367
ggtattgtta attaaatata gataactc 28
<210> 368
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 368
gagttatcta tatttaatta acaatacc 28
<210> 369
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 369
gatagtgccg tcattaagct atttatat 28
<210> 370
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 370
atataaatag cttaatgacg gcactatc 28
<210> 371
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 371
gatagtgtcg tcattaagct acaaattc 28
<210> 372
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 372
gaatttgtag cttaatgacg acactatc 28
<210> 373
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(46)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 373
gggagtgttc tcatgcagtc atnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnttat attag 55
<210> 374
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 374
ctaatataan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnatgactg catgagaaca ctccc 55
<210> 375
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(46)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 375
gggagtgttc tcatgcagtc atnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnatat taagg 55
<210> 376
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 376
ccttaatatn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnatgactg catgagaaca ctccc 55
<210> 377
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(40)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 377
gggactgttc tcaaacagtc atnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtaatatta 49
<210> 378
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(27)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 378
taatattacn nnnnnnnnnn nnnnnnnatg actgtttgag aacagtccc 49
<210> 379
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(40)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 379
gggactgttc tcaaacagtc atnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtaaaaata 49
<210> 380
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(27)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 380
tatttttacn nnnnnnnnnn nnnnnnnatg actgtttgag aacagtccc 49
<210> 381
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 381
cagtgctggc caaaaagata tccacttttg gttttttgtg tgtaactttt ttct 54
<210> 382
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 382
agaaaaaagt tacacacaaa aaaccaaaag tggatatctt tttggccagc actg 54
<210> 383
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 383
gtcacgaccg gtttttctat aggtgaaaac caaaaaacac acattgaaaa aaga 54
<210> 384
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 384
tcttttttca atgtgtgttt tttggttttc acctatagaa aaaccggtcg tgac 54
<210> 385
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> N=T
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> N= C ou A
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> N=A
<400> 385
nngttgaagt cggaagttta catacactta ag 32
<210> 386
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> N=T
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> N=G ou A
<400> 386
cttaagtgta tgtaaacttc cgacttcaac nn 32
<210> 387
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> N = T ou C
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> N = A
<400> 387
nngttgaagt cggaagttta catacacctt ag 32
<210> 388
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> N= T
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> N= G ou A
<400> 388
ctaaggtgta tgtaaacttc cgacttcaac nn 32
<210> 389
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 389
ctttcgcgtt tttcgtgcgc cg 22
<210> 390
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 390
cggcgcacga aaaacgcgaa ag 22
<210> 391
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 391
ttttcgcatt tatcgtgaaa cg 22
<210> 392
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 392
cgtttcacga taaatgcgaa aa 22
<210> 393
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 393
ctttcgcgtt tttcgtgcgc cg 22
<210> 394
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 394
cggcgcacga aaaacgcgaa ag 22
<210> 395
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 395
gttttcgcat ttatcgtgaa acg 23
<210> 396
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 396
cgtttcacga taaatgcgaa aac 23
<210> 397
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 397
ctttcgcgtt tttcgtgcgc cg 22
<210> 398
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 398
cggcgcacga aaaacgcgaa ag 22
<210> 399
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 399
ttttcgcatt tatcgtgaaa cg 22
<210> 400
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 400
cgtttcacga taaatgcgaa aa 22
<210> 401
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 401
gaaagcgcaa aaagcacgcg gcgcaaaaag cacgcggc 38
<210> 402
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 402
gccgcgtgct ttttgcgctt tcgccgcgtg ctttttgcgc tttc 44
<210> 403
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 403
ctttcgcgtt tttcgtgcgc cg 22
<210> 404
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 404
cggcgcacga aaaacgcgaa ag 22
<210> 405
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 405
tgtgggggga caaaaaagtc tcaaactgga caaaaaagat c 41
<210> 406
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 406
gatctttttt gtccagtttg agactttttt gtccgcccac a 41
<210> 407
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 407
gatctatttt gttcagttca agactttatt gtccgcccac a 41
<210> 408
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 408
tgtgggcgga caataaagtc ttgaactgaa caaaatagat c 41
<210> 409
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 409
ggggtttggg gagcaacgga accaaaaacc aacgtaaggc ttagctagag 50
<210> 410
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 410
ctctagctaa gccttacgtt ggtttttggt tccgttgctc cccaaacccc 50
<210> 411
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 411
ggggtttggg gagcaacgga acagaaagtg cacttaagcc cagcgcctgc 50
<210> 412
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 412
gcaggcgctg ggcttaagtg cactttctgt tccgttgctc cccaaacccc 50
<210> 413
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 413
ggggtttggg gagcaacgga accaaaaacc aacttaaggc ttagctagag 50
<210> 414
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 414
ctctagctaa gccttaagtt ggtttttggt tccgttgctc cccaaacccc 50
<210> 415
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 415
ggggtttggg gagcaacgga acagaaagtg cacttaagcc cagcgcctgc 50
<210> 416
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 416
gcaggcgctg ggcttaagtg cactttctgt tccgttgctc cccaaacccc 50
<210> 417
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 417
ggggtttggg gagcaacgga accaaaaacc aacgtaaggc ttaccaacgc 50
<210> 418
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 418
gcgttggtaa gccttacgtt ggtttttggt tccgttgctc cccaaacccc 50
<210> 419
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 419
ggggtttggg gagcaatgga accaaaaacc aacgtaagct ctgaatccc 49
<210> 420
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 420
gggattcaga gcttacgttg gtttttggtt ccattgctcc ccaaacccc 49
<210> 421
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 421
ggggtttggg gagcaacgga accaaaaacc aacgtaaggc ttaccacctg 50
<210> 422
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 422
caggtggtaa gccttacgtt ggtttttggt tccgttgctc cccaaacccc 50
<210> 423
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 423
ggggtttggg gagcaaggaa ccaaaaacca acgtaagccc taccagcgc 49
<210> 424
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> transposase binding site
<400> 424
gcgctggtag ggcttacgtt ggtttttggt tccttgctcc ccaaacccc 49
<210> 425
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> domaine riche en G/C
<400> 425
ggcgatcgc 9
<210> 426
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> domaine riche en G/C
<400> 426
gcggcgatcg gc 12
<210> 427
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> domaine riche en G/C
<400> 427
ggtcgc 6
<210> 428
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> domaine riche en G/C
<400> 428
gcgacc 6
<210> 429
<211> 798
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sequence de la figure 12
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (78)..(88)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (214)..(215)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (218)..(219)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (225)..(226)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (228)..(228)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (230)..(230)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (232)..(232)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (236)..(237)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (240)..(240)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (243)..(243)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (248)..(248)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (250)..(251)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (254)..(254)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (257)..(259)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (264)..(264)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (266)..(267)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (269)..(269)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (271)..(271)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (274)..(274)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (276)..(281)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (284)..(284)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (317)..(317)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (323)..(323)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (325)..(327)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (329)..(329)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (339)..(339)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (341)..(341)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (343)..(343)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (351)..(352)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (357)..(357)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (359)..(359)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (364)..(364)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (374)..(375)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (381)..(381)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (383)..(383)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (386)..(387)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (389)..(389)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (392)..(394)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (399)..(399)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (401)..(404)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (686)..(687)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (728)..(728)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (738)..(739)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (753)..(753)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (768)..(769)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (787)..(787)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (794)..(794)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 429
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnna gctcgccgan cactaccagc agaacacccc 60
caccatgtta tcctcctnnn nnnnnnnncg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc 120
tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg 180
ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acanntcnnc aatgnnancn gnggannggn 240
ggncctcngn ncgntcnnnc tgtncnncna nggngnnnnn ntcnttgtgg gaggtgatgt 300
ccaacttgat gttgacnttg tangnnncng gcagctgcnc ngncttcttg nncttgnang 360
tggncttgac ctcnncgtcg nanggnncnc cnnncttcnt nnnnagcctc tgcttgatct 420
cgcccttcag ggcgccgtcc tcggggtaca tccgctcgga ggaggcctcc cagcccatgg 480
tcttcttctg cattacgggg ccgtcggagg ggaagttggt gccgcgcagc ttcaccttgt 540
agatgaactc gccgtcctgc agggaggagt cctgggtcac ggtcaccacg ccgccgtcct 600
cgaagttcat cacgcgctcc cacttgaagc cctcggggaa ggacagcttc aagtagtcgg 660
ggatgtcggc ggggtgcttc acgtanncct tggagccgta catgaactga ggggacagga 720
tgtcccangc gaagggcnng ggccaccctt ggncaccttc agcttggnng tctgggtgcc 780
ctcgtanggg cggncctc 798
<210> 430
<211> 392
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sequence de la figure 14
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(27)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(34)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (143)..(152)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (154)..(165)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (167)..(167)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (172)..(172)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (175)..(175)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (178)..(182)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (184)..(190)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (192)..(193)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (195)..(196)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (198)..(201)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (203)..(224)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (226)..(229)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (232)..(235)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (238)..(248)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (250)..(250)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (253)..(253)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (255)..(256)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (258)..(262)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (264)..(267)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (269)..(271)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (274)..(278)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (280)..(281)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (285)..(287)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (290)..(290)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (292)..(298)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (300)..(302)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (305)..(311)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (313)..(324)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (327)..(330)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (332)..(333)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (336)..(337)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (340)..(341)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (344)..(348)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (351)..(356)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (360)..(383)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (385)..(388)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (390)..(392)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 430
nnnnnnnnnn nnnnnnnnng tnanannggn nnnntccnca tcatcggcgc agtgggcatc 60
ggcattgccg tggtcatgat atttggcatg atcttcagta tgatcttgtg ctgtgctatc 120
cgcaggaacc gcgagatggt cannnnnnnn nntnnnnnnn nnnnngngtg anggncannn 180
nnannnnnnn anngnnannn nannnnnnnn nnnnnnnnnn nnnncnnnnc cnnnnccnnn 240
nnnnnnnncn tcntnnannn nncnnnntnn nttnnnnntn ntccnnnacn tnnnnnnncn 300
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<220>
<221> misc_feature
<222> (528)..(544)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (546)..(549)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (552)..(553)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (555)..(555)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (557)..(571)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (574)..(584)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (586)..(589)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (591)..(594)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (597)..(606)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (609)..(610)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (612)..(617)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (621)..(622)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (624)..(624)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (627)..(630)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (632)..(633)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (635)..(635)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (641)..(641)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (643)..(643)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (645)..(646)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (649)..(654)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (656)..(656)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (658)..(664)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (666)..(666)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (668)..(671)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 432
nnnnnnnnnn tnnnnnnnnn nnnnagnncn nnnnnnnngn nnctcnnnnn ntnngnnnnn 60
ngnntnnnnc ngcantnnng nnnntgnccg tgncnngncc cnncctcnng annncnntgn 120
cntacngcgt gnagngnttc ngccgctacn cntaccacnt gannnnncan nacttcttca 180
nntccnccnt gcccnaangc tanntccang ancgcaccat cttcttcnnn gacnacggcn 240
actacnnnac ccncgccgag gtgaanttcn agggcnacnc cctgnnnnan cncntcnagc 300
tgaanggcat cnacttcnnn gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact 360
acnnnnnccn caacgtcnnn ntcatggccg actnnnnnan naacggcntc nnggtgaant 420
tcnagatccn ccncnncntc nangacngna ncnnnnnnnn nnnngannnn nnccancnna 480
ncnnccnnnt ngnnnnnggn nnctnnnnnn ntncnnnann nnnannannn nnnnnnnnnn 540
nnnncnnnna annanannnn nnnnnnnnnn nacnnnnnnn nnnncnnnnt nnnnaannnn 600
nnnnnnacnn cnnnnnntcc nntngannnn tnnantgtat ntnanngtnn nnnntntnnn 660
nnnntntnnn n 671
<210> 433
<211> 812
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sequence de la figure 19
<400> 433
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggataataat tttttttttt tttttttttt tagatgtgta taagagacag ctgggcacgc 780
gtataagcag ctgagatgtg tataagagac ag 812
<210> 434
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sequence de la figure 19
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(45)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(49)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(60)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (64)..(64)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (67)..(67)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (73)..(73)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (76)..(76)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(82)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (90)..(90)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (106)..(108)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (112)..(112)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (118)..(118)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (124)..(126)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (131)..(131)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (144)..(144)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (148)..(148)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (154)..(154)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (157)..(157)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (163)..(166)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (168)..(168)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (170)..(170)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (172)..(172)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (175)..(175)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (183)..(183)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (190)..(190)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (196)..(198)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (241)..(245)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (248)..(248)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (256)..(259)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 434
tacngcgtgn agngnttcng ccgctacncn taccacntga nnnnncanna cttcttcann 60
tccnccntgc ccnaangcta nntccangan cgcaccatct tcttcnnnga cnacggcnac 120
tacnnnaccc ncgccgaggt gaanttcnag ggcnacnccc tgnnnnancn cntcnagctg 180
aanggcatcn acttcnnnga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 240
nnnnnccnca acgtcnnnnt catggccgac 270
<210> 435
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sequence de la figure 19
<400> 435
tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 60
tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 120
tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 180
aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 240
aacagccaca acgtctatat catggccgac 270
<210> 436
<211> 131
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> premi?e molcule du complexe
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(66)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (123)..(123)
<223> site de liaison ?la transposase
<400> 436
tgcagctgnt tttttttttt tttttttttt ttttttggcg atcgcttttt tttttttttt 60
tttttntttt tttttttttt ttttttgcga tcgccttttt tttttttttt tgatacatgt 120
ttnctgtaag c 131
<210> 437
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> deuxi?e molcule du complexe
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(59)
<223> replacement sequence
<400> 437
ncagctgcag acaaagctta cagntttttt tttttttttt ttttttcata tgccaagtn 59
<210> 438
<211> 167
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> premi?e molcule du complexe
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<400> 438
tgcagctgct gtctcttata cacatctttt tttttttttt tttttttttt ttttggcgat 60
cgcttttttt tttttttttt tttntttttt tttttttttt ttttgcgatc gccttttttt 120
tttttttttg atacatgttt agatgtgtat aagagacagc tgtaagc 167
<210> 439
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> deuxi?e molcule du complexe
<220>
<221> misc_feature
<222> (95)..(95)
<223> replacement sequence
<400> 439
agatgtgtat aagagacagc agctgcagac aaagcttaca gctgtctctt atacacatct 60
tttttttttt tttttttttt ttcatatgcc aagtn 95
<210> 440
<211> 125
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (117)..(117)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 440
tgcagctgnt tttttttttt tttttttttt ttttttggtc gctttttttt tttttttttt 60
ttnttttttt tttttttttt tttgcgacct tttttttttt tttttgatac atgtttnctg 120
taagc 125
<210> 441
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(47)
<223> replacement sequence
<400> 441
ncagctgcag acaaagctta cagntttttt tttttttttt ttttttncca agt 53
<210> 442
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(53)
<223> replacement sequence
<400> 442
ncagctgcag acaaagctta cagntttttt tttttttttt ttttttccaa gtn 53
<210> 443
<211> 137
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (129)..(129)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 443
tgcagctgnt tttttttttt tttttttttt ttttttgcgg cgatcggctt tttttttttt 60
ttttttttnt tttttttttt tttttttttg ccgatcgccg cttttttttt tttttttgat 120
acatgtttnc tgtaagc 137
<210> 444
<211> 125
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (117)..(117)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 444
gtgcccagnt ttctcgatca tttttttttt ttttttggtc gctttttttt tttttttttt 60
ttnttttttt tttttttttt tttgcgacct tttttttttt tttttttttt ttttttnctg 120
cttat 125
<210> 445
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 445
ntacaagtcc ggataataat tttttttttt tttttttttt tnctgggcac gcgtataagc 60
agn 63
<210> 446
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> replacement sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 446
tacaagntaa taattttttt tttttttttt tttttnctgg gcacgcgtat aagcagn 57
<210> 447
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 447
ntacaagtaa taattttttt tttttttttt tttttnctgg gcacgcgtat aagcagn 57
<210> 448
<211> 131
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(66)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (123)..(123)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 448
gtgcccagnt ttctcgatca tttttttttt ttttttggcg atcgcttttt tttttttttt 60
tttttntttt tttttttttt ttttttgcga tcgccttttt tttttttttt tttttttttt 120
ttnctgctta t 131
<210> 449
<211> 137
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (129)..(129)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 449
gtgcccagnt ttctcgatca tttttttttt ttttttgcgg cgatcggctt tttttttttt 60
ttttttttnt tttttttttt tttttttttg ccgatcgccg cttttttttt tttttttttt 120
ttttttttnc tgcttat 137
<210> 450
<211> 129
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (78)..(78)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (123)..(123)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 450
atcatcnttt tttttttttt ttttgatagt agnttttttt tttttttttt tttttggtcg 60
cttttttttt tttttttntt tttttttttt ttttgcgacc tttttttttt tttgatacat 120
ttngatgat 129
<210> 451
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 451
nacttggtta attaattttt tttttttttt tttttttnct actatc 46
<210> 452
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> replacement sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 452
acttggntta attaattttt tttttttttt tttttttnct actatc 46
<210> 453
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 453
nacttggcat atgttaatta attttttttt tttttttttt tttnctacta tc 52
<210> 454
<211> 141
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (135)..(135)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 454
atcatcnttt tttttttttt ttttgatagt agnttttttt tttttttttt tttttgcggc 60
gatcggcttt tttttttttt tttntttttt tttttttttt gccgatcgcc gctttttttt 120
tttttgatac atttngatga t 141
<210> 455
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (105)..(105)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (135)..(135)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 455
gatagtagnt tttttttttt tttttttttt tggcgatcgc tttttttttt ttttttnttt 60
tttttttttt tttgcgatcg cctttttttt tttttgatac atttngatga tttttttttt 120
ttttttttat catcn 135
<210> 456
<211> 129
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(54)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (99)..(99)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (129)..(129)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 456
gatagtagnt tttttttttt tttttttttt tggtcgcttt tttttttttt tttntttttt 60
tttttttttt gcgacctttt tttttttttg atacatttng atgatttttt tttttttttt 120
ttatcatcn 129
<210> 457
<211> 141
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)..(60)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (111)..(111)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (141)..(141)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 457
gatagtagnt tttttttttt tttttttttt tgcggcgatc ggcttttttt tttttttttn 60
tttttttttt ttttttgccg atcgccgctt tttttttttt tgatacattt ngatgatttt 120
tttttttttt ttttatcatc n 141
<210> 458
<211> 138
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(56)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (103)..(103)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (132)..(132)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 458
cacgtgnttt ctcgatcatt attatttttt ggcgatcgct tttttttttt tttttntttt 60
tttttttttt ttgcgatcgc cttttttttt tttttttttt ttngacgaat attttttttt 120
tttttttttt tncacgtg 138
<210> 459
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> replacement sequence
<400> 459
tattcgtcnt tttttttttt tttttttatt aattattact tgtan 45
<210> 460
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 460
tattcgtcnt tttttttttt tttttttatt aattattanc ttgta 45
<210> 461
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> replacement sequence
<400> 461
tattcgtcnt tttttttttt tttttttatt aattattatc cggacttgta n 51
<210> 462
<211> 132
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(53)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(97)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (126)..(126)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 462
cacgtgnttt ctcgatcatt attatttttt ggtcgctttt tttttttttt ttnttttttt 60
tttttttttg cgaccttttt tttttttttt ttttttngac gaatattttt tttttttttt 120
tttttncacg tg 132
<210> 463
<211> 144
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(59)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (109)..(109)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (138)..(138)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 463
cacgtgnttt ctcgatcatt attatttttt gcggcgatcg gctttttttt ttttttttnt 60
tttttttttt tttttgccga tcgccgcttt tttttttttt ttttttttng acgaatattt 120
tttttttttt tttttttnca cgtg 144
<210> 464
<211> 138
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (130)..(130)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 464
ncacgtgttt tttttttttt tttttttcac gtgntttctc gatcattatt attttttggc 60
gatcgctttt tttttttttt ttnttttttt tttttttttg cgatcgcctt tttttttttt 120
tttttttttn gacgaata 138
<210> 465
<211> 132
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(80)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (124)..(124)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 465
ncacgtgttt tttttttttt tttttttcac gtgntttctc gatcattatt attttttggt 60
cgcttttttt tttttttttn tttttttttt ttttttgcga cctttttttt tttttttttt 120
tttngacgaa ta 132
<210> 466
<211> 144
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> Site de liaison ?la transposase
<220>
<221> misc_feature
<222> (86)..(86)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (136)..(136)
<223> Site de liaison ?la transposase
<400> 466
ncacgtgttt tttttttttt tttttttcac gtgntttctc gatcattatt attttttgcg 60
gcgatcggct tttttttttt tttttntttt tttttttttt ttgccgatcg ccgctttttt 120
tttttttttt tttttngacg aata 144
<210> 467
<211> 167
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 467
tgcagctgct gtctcttata cacatctttt tttttttttt tttttttttt ttttggcgat 60
cgcttttttt tttttttttt tttntttttt tttttttttt ttttgcgatc gccttttttt 120
tttttttttg atacatgttt agatgtgtat aagagacagc tgtaagc 167
<210> 468
<211> 167
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 468
tgcagctgag atgtgtataa gagacagttt tttttttttt tttttttttt ttttggcgat 60
cgcttttttt tttttttttt tttntttttt tttttttttt ttttgcgatc gccttttttt 120
tttttttttg atacatgttt ctgtctctta tacacatctc tgtaagc 167
<210> 469
<211> 161
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 469
tgcagctgct gtctcttata cacatctttt tttttttttt tttttttttt ttttggtcgc 60
tttttttttt tttttttttt nttttttttt tttttttttt tgcgaccttt tttttttttt 120
tttgatacat gtttagatgt gtataagaga cagctgtaag c 161
<210> 470
<211> 161
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 470
tgcagctgag atgtgtataa gagacagttt tttttttttt tttttttttt ttttggtcgc 60
tttttttttt tttttttttt nttttttttt tttttttttt tgcgaccttt tttttttttt 120
tttgatacat gtttctgtct cttatacaca tctctgtaag c 161
<210> 471
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 471
tgcagctgct gtctcttata cacatctttt tttttttttt tttttttttt ttttgcggcg 60
atcggctttt tttttttttt ttttttnttt tttttttttt tttttttgcc gatcgccgct 120
tttttttttt tttttgatac atgtttagat gtgtataaga gacagctgta agc 173
<210> 472
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 472
tgcagctgag atgtgtataa gagacagttt tttttttttt tttttttttt ttttgcggcg 60
atcggctttt tttttttttt ttttttnttt tttttttttt tttttttgcc gatcgccgct 120
tttttttttt tttttgatac atgtttctgt ctcttataca catctctgta agc 173
<210> 473
<211> 161
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 473
gtgcccagct gtctcttata cacatctttt ctcgatcatt tttttttttt ttttggtcgc 60
tttttttttt tttttttttt nttttttttt tttttttttt tgcgaccttt tttttttttt 120
tttttttttt ttttagatgt gtataagaga cagctgctta t 161
<210> 474
<211> 161
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 474
gtgcccagag atgtgtataa gagacagttt ctcgatcatt tttttttttt ttttggtcgc 60
tttttttttt tttttttttt nttttttttt tttttttttt tgcgaccttt tttttttttt 120
tttttttttt ttttctgtct cttatacaca tctctgctta t 161
<210> 475
<211> 167
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 475
gtgcccagct gtctcttata cacatctttt ctcgatcatt tttttttttt ttttggcgat 60
cgcttttttt tttttttttt tttntttttt tttttttttt ttttgcgatc gccttttttt 120
tttttttttt tttttttttt agatgtgtat aagagacagc tgcttat 167
<210> 476
<211> 167
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 476
gtgcccagag atgtgtataa gagacagttt ctcgatcatt tttttttttt ttttggcgat 60
cgcttttttt tttttttttt tttntttttt tttttttttt ttttgcgatc gccttttttt 120
tttttttttt tttttttttt ctgtctctta tacacatctc tgcttat 167
<210> 477
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 477
gtgcccagct gtctcttata cacatctttt ctcgatcatt tttttttttt ttttgcggcg 60
atcggctttt tttttttttt ttttttnttt tttttttttt tttttttgcc gatcgccgct 120
tttttttttt tttttttttt ttttttagat gtgtataaga gacagctgct tat 173
<210> 478
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 478
gtgcccagag atgtgtataa gagacagttt ctcgatcatt tttttttttt ttttgcggcg 60
atcggctttt tttttttttt ttttttnttt tttttttttt tttttttgcc gatcgccgct 120
tttttttttt tttttttttt ttttttctgt ctcttataca catctctgct tat 173
<210> 479
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (117)..(117)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 479
atcatcctgt ctcttataca catctttttt tttttttttt ttgatagtag ctgtctctta 60
tacacatctt tttttttttt tttttttttt tggcgatcgc tttttttttt ttttttnttt 120
tttttttttt tttgcgatcg cctttttttt tttttgatac atttagatgt gtataagaga 180
caggatgat 189
<210> 480
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (117)..(117)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 480
atcatcagat gtgtataaga gacagttttt tttttttttt ttgatagtag agatgtgtat 60
aagagacagt tttttttttt tttttttttt tggcgatcgc tttttttttt ttttttnttt 120
tttttttttt tttgcgatcg cctttttttt tttttgatac atttctgtct cttatacaca 180
tctgatgat 189
<210> 481
<211> 183
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (114)..(114)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 481
atcatcctgt ctcttataca catctttttt tttttttttt ttgatagtag ctgtctctta 60
tacacatctt tttttttttt tttttttttt tggtcgcttt tttttttttt tttntttttt 120
tttttttttt gcgacctttt tttttttttg atacatttag atgtgtataa gagacaggat 180
gat 183
<210> 482
<211> 183
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (114)..(114)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 482
atcatcagat gtgtataaga gacagttttt tttttttttt ttgatagtag agatgtgtat 60
aagagacagt tttttttttt tttttttttt tggtcgcttt tttttttttt tttntttttt 120
tttttttttt gcgacctttt tttttttttg atacatttct gtctcttata cacatctgat 180
gat 183
<210> 483
<211> 195
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (120)..(120)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 483
atcatcctgt ctcttataca catctttttt tttttttttt ttgatagtag ctgtctctta 60
tacacatctt tttttttttt tttttttttt tgcggcgatc ggcttttttt tttttttttn 120
tttttttttt ttttttgccg atcgccgctt tttttttttt tgatacattt agatgtgtat 180
aagagacagg atgat 195
<210> 484
<211> 195
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (120)..(120)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 484
atcatcagat gtgtataaga gacagttttt tttttttttt ttgatagtag agatgtgtat 60
aagagacagt tttttttttt tttttttttt tgcggcgatc ggcttttttt tttttttttn 120
tttttttttt ttttttgccg atcgccgctt tttttttttt tgatacattt ctgtctctta 180
tacacatctg atgat 195
<210> 485
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (75)..(75)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 485
gatagtagct gtctcttata cacatctttt tttttttttt tttttttttg gcgatcgctt 60
tttttttttt ttttnttttt tttttttttt tgcgatcgcc tttttttttt tttgatacat 120
ttagatgtgt ataagagaca ggatgatttt tttttttttt ttttatcatc ctgtctctta 180
tacacatct 189
<210> 486
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (75)..(75)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 486
gatagtagag atgtgtataa gagacagttt tttttttttt tttttttttg gcgatcgctt 60
tttttttttt ttttnttttt tttttttttt tgcgatcgcc tttttttttt tttgatacat 120
ttctgtctct tatacacatc tgatgatttt tttttttttt ttttatcatc agatgtgtat 180
aagagacag 189
<210> 487
<211> 183
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 487
gatagtagct gtctcttata cacatctttt tttttttttt tttttttttg gtcgcttttt 60
tttttttttt tntttttttt ttttttttgc gacctttttt tttttttgat acatttagat 120
gtgtataaga gacaggatga tttttttttt ttttttttat catcctgtct cttatacaca 180
tct 183
<210> 488
<211> 183
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 488
gatagtagag atgtgtataa gagacagttt tttttttttt tttttttttg gtcgcttttt 60
tttttttttt tntttttttt ttttttttgc gacctttttt tttttttgat acatttctgt 120
ctcttataca catctgatga tttttttttt ttttttttat catcagatgt gtataagaga 180
cag 183
<210> 489
<211> 195
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (78)..(78)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 489
gatagtagct gtctcttata cacatctttt tttttttttt tttttttttg cggcgatcgg 60
cttttttttt tttttttntt tttttttttt ttttgccgat cgccgctttt tttttttttg 120
atacatttag atgtgtataa gagacaggat gatttttttt tttttttttt atcatcctgt 180
ctcttataca catct 195
<210> 490
<211> 195
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (78)..(78)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 490
gatagtagag atgtgtataa gagacagttt tttttttttt tttttttttg cggcgatcgg 60
cttttttttt tttttttntt tttttttttt ttttgccgat cgccgctttt tttttttttg 120
atacatttct gtctcttata cacatctgat gatttttttt tttttttttt atcatcagat 180
gtgtataaga gacag 195
<210> 491
<211> 192
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (74)..(74)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 491
cacgtgctgt ctcttataca catcttttct cgatcattat tattttttgg cgatcgcttt 60
tttttttttt tttntttttt tttttttttt gcgatcgcct tttttttttt tttttttttt 120
agatgtgtat aagagacagg acgaatattt tttttttttt tttttttaga tgtgtataag 180
agacagcacg tg 192
<210> 492
<211> 192
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (74)..(74)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 492
cacgtgagat gtgtataaga gacagtttct cgatcattat tattttttgg cgatcgcttt 60
tttttttttt tttntttttt tttttttttt gcgatcgcct tttttttttt tttttttttt 120
ctgtctctta tacacatctg acgaatattt tttttttttt tttttttctg tctcttatac 180
acatctcacg tg 192
<210> 493
<211> 186
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 493
cacgtgctgt ctcttataca catcttttct cgatcattat tattttttgg tcgctttttt 60
tttttttttt nttttttttt tttttttgcg accttttttt tttttttttt ttttagatgt 120
gtataagaga caggacgaat attttttttt tttttttttt tagatgtgta taagagacag 180
cacgtg 186
<210> 494
<211> 186
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 494
cacgtgagat gtgtataaga gacagtttct cgatcattat tattttttgg tcgctttttt 60
tttttttttt nttttttttt tttttttgcg accttttttt tttttttttt ttttctgtct 120
cttatacaca tctgacgaat attttttttt tttttttttt tctgtctctt atacacatct 180
cacgtg 186
<210> 495
<211> 198
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (77)..(77)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 495
cacgtgctgt ctcttataca catcttttct cgatcattat tattttttgc ggcgatcggc 60
tttttttttt ttttttnttt tttttttttt tttgccgatc gccgcttttt tttttttttt 120
ttttttagat gtgtataaga gacaggacga atattttttt tttttttttt tttagatgtg 180
tataagagac agcacgtg 198
<210> 496
<211> 198
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (77)..(77)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 496
cacgtgagat gtgtataaga gacagtttct cgatcattat tattttttgc ggcgatcggc 60
tttttttttt ttttttnttt tttttttttt tttgccgatc gccgcttttt tttttttttt 120
ttttttctgt ctcttataca catctgacga atattttttt tttttttttt tttctgtctc 180
ttatacacat ctcacgtg 198
<210> 497
<211> 192
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (119)..(119)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 497
agatgtgtat aagagacagc acgtgttttt tttttttttt tttttcacgt gctgtctctt 60
atacacatct tttctcgatc attattattt tttggcgatc gctttttttt ttttttttnt 120
tttttttttt tttttgcgat cgcctttttt tttttttttt tttttagatg tgtataagag 180
acaggacgaa ta 192
<210> 498
<211> 192
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (119)..(119)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 498
ctgtctctta tacacatctc acgtgttttt tttttttttt tttttcacgt gagatgtgta 60
taagagacag tttctcgatc attattattt tttggcgatc gctttttttt ttttttttnt 120
tttttttttt tttttgcgat cgcctttttt tttttttttt tttttctgtc tcttatacac 180
atctgacgaa ta 192
<210> 499
<211> 186
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (116)..(116)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 499
agatgtgtat aagagacagc acgtgttttt tttttttttt tttttcacgt gctgtctctt 60
atacacatct tttctcgatc attattattt tttggtcgct tttttttttt tttttntttt 120
tttttttttt ttgcgacctt tttttttttt ttttttttta gatgtgtata agagacagga 180
cgaata 186
<210> 500
<211> 186
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (116)..(116)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 500
ctgtctctta tacacatctc acgtgttttt tttttttttt tttttcacgt gagatgtgta 60
taagagacag tttctcgatc attattattt tttggtcgct tttttttttt tttttntttt 120
tttttttttt ttgcgacctt tttttttttt tttttttttc tgtctcttat acacatctga 180
cgaata 186
<210> 501
<211> 198
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (122)..(122)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 501
agatgtgtat aagagacagc acgtgttttt tttttttttt tttttcacgt gctgtctctt 60
atacacatct tttctcgatc attattattt tttgcggcga tcggcttttt tttttttttt 120
tntttttttt ttttttttgc cgatcgccgc tttttttttt tttttttttt tagatgtgta 180
taagagacag gacgaata 198
<210> 502
<211> 198
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (122)..(122)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 502
ctgtctctta tacacatctc acgtgttttt tttttttttt tttttcacgt gagatgtgta 60
taagagacag tttctcgatc attattattt tttgcggcga tcggcttttt tttttttttt 120
tntttttttt ttttttttgc cgatcgccgc tttttttttt tttttttttt tctgtctctt 180
atacacatct gacgaata 198
<210> 503
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (95)..(95)
<223> replacement sequence
<400> 503
agatgtgtat aagagacagc agctgcagac aaagcttaca gctgtctctt atacacatct 60
tttttttttt tttttttttt ttcatatgcc aagtn 95
<210> 504
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (95)..(95)
<223> replacement sequence
<400> 504
ctgtctctta tacacatctc agctgcagac aaagcttaca gagatgtgta taagagacag 60
tttttttttt tttttttttt ttcatatgcc aagtn 95
<210> 505
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> replacement sequence
<400> 505
agatgtgtat aagagacagc agctgcagac aaagcttaca gctgtctctt atacacatct 60
tttttttttt tttttttttt ttnccaagt 89
<210> 506
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> replacement sequence
<400> 506
ctgtctctta tacacatctc agctgcagac aaagcttaca gagatgtgta taagagacag 60
tttttttttt tttttttttt ttnccaagt 89
<210> 507
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 507
ntacaagtcc ggataataat tttttttttt tttttttttt tagatgtgta taagagacag 60
ctgggcacgc gtataagcag ctgtctctta tacacatct 99
<210> 508
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 508
ntacaagtcc ggataataat tttttttttt tttttttttt tctgtctctt atacacatct 60
ctgggcacgc gtataagcag agatgtgtat aagagacag 99
<210> 509
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> replacement sequence
<400> 509
tacaagntaa taattttttt tttttttttt tttttagatg tgtataagag acagctgggc 60
acgcgtataa gcagctgtct cttatacaca tct 93
<210> 510
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> replacement sequence
<400> 510
tacaagntaa taattttttt tttttttttt tttttctgtc tcttatacac atctctgggc 60
acgcgtataa gcagagatgt gtataagaga cag 93
<210> 511
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 511
ntacaagtaa taattttttt tttttttttt tttttagatg tgtataagag acagctgggc 60
acgcgtataa gcagctgtct cttatacaca tct 93
<210> 512
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 512
ntacaagtaa taattttttt tttttttttt tttttctgtc tcttatacac atctctgggc 60
acgcgtataa gcagagatgt gtataagaga cag 93
<210> 513
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 513
nacttggtta attaattttt tttttttttt tttttttaga tgtgtataag agacagctac 60
tatc 64
<210> 514
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 514
nacttggtta attaattttt tttttttttt tttttttctg tctcttatac acatctctac 60
tatc 64
<210> 515
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> replacement sequence
<400> 515
acttggntta attaattttt tttttttttt tttttttaga tgtgtataag agacagctac 60
tatc 64
<210> 516
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> replacement sequence
<400> 516
acttggntta attaattttt tttttttttt tttttttctg tctcttatac acatctctac 60
tatc 64
<210> 517
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 517
nacttggcat atgttaatta attttttttt tttttttttt tttagatgtg tataagagac 60
agctactatc 70
<210> 518
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 518
nacttggcat atgttaatta attttttttt tttttttttt tttctgtctc ttatacacat 60
ctctactatc 70
<210> 519
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> replacement sequence
<400> 519
tattcgtcct gtctcttata cacatctttt tttttttttt tttttattaa ttattacttg 60
tan 63
<210> 520
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> replacement sequence
<400> 520
tattcgtcag atgtgtataa gagacagttt tttttttttt tttttattaa ttattacttg 60
tan 63
<210> 521
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> replacement sequence
<400> 521
tattcgtcct gtctcttata cacatctttt tttttttttt tttttattaa ttattanctt 60
gta 63
<210> 522
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> replacement sequence
<400> 522
tattcgtcag atgtgtataa gagacagttt tttttttttt tttttattaa ttattanctt 60
gta 63
<210> 523
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> replacement sequence
<400> 523
tattcgtcct gtctcttata cacatctttt tttttttttt tttttattaa ttattatccg 60
gacttgtan 69
<210> 524
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> replacement sequence
<400> 524
tattcgtcag atgtgtataa gagacagttt tttttttttt tttttattaa ttattatccg 60
gacttgtan 69
<210> 525
<211> 167
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 525
tgcagctgct gactcttata cacaagtttt tttttttttt tttttttttt ttttggcgat 60
cgcttttttt tttttttttt tttntttttt tttttttttt ttttgcgatc gccttttttt 120
tttttttttg atacatgttt acttgtgtat aagagtcagc tgtaagc 167
<210> 526
<211> 167
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 526
tgcagctgac ttgtgtataa gagtcagttt tttttttttt tttttttttt ttttggcgat 60
cgcttttttt tttttttttt tttntttttt tttttttttt ttttgcgatc gccttttttt 120
tttttttttg atacatgttt ctgactctta tacacaagtc tgtaagc 167
<210> 527
<211> 161
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 527
tgcagctgct gactcttata cacaagtttt tttttttttt tttttttttt ttttggtcgc 60
tttttttttt tttttttttt nttttttttt tttttttttt tgcgaccttt tttttttttt 120
tttgatacat gtttacttgt gtataagagt cagctgtaag c 161
<210> 528
<211> 161
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 528
tgcagctgac ttgtgtataa gagtcagttt tttttttttt tttttttttt ttttggtcgc 60
tttttttttt tttttttttt nttttttttt tttttttttt tgcgaccttt tttttttttt 120
tttgatacat gtttctgact cttatacaca agtctgtaag c 161
<210> 529
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 529
tgcagctgct gactcttata cacaagtttt tttttttttt tttttttttt ttttgcggcg 60
atcggctttt tttttttttt ttttttnttt tttttttttt tttttttgcc gatcgccgct 120
tttttttttt tttttgatac atgtttactt gtgtataaga gtcagctgta agc 173
<210> 530
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 530
tgcagctgac ttgtgtataa gagtcagttt tttttttttt tttttttttt ttttgcggcg 60
atcggctttt tttttttttt ttttttnttt tttttttttt tttttttgcc gatcgccgct 120
tttttttttt tttttgatac atgtttctga ctcttataca caagtctgta agc 173
<210> 531
<211> 161
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 531
gtgcccagct gactcttata cacaagtttt ctcgatcatt tttttttttt ttttggtcgc 60
tttttttttt tttttttttt nttttttttt tttttttttt tgcgaccttt tttttttttt 120
tttttttttt ttttacttgt gtataagagt cagctgctta t 161
<210> 532
<211> 161
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 532
gtgcccagac ttgtgtataa gagtcagttt ctcgatcatt tttttttttt ttttggtcgc 60
tttttttttt tttttttttt nttttttttt tttttttttt tgcgaccttt tttttttttt 120
tttttttttt ttttctgact cttatacaca agtctgctta t 161
<210> 533
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (117)..(117)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 533
atcatcctga ctcttataca caagtttttt tttttttttt ttgatagtag ctgactctta 60
tacacaagtt tttttttttt tttttttttt tggcgatcgc tttttttttt ttttttnttt 120
tttttttttt tttgcgatcg cctttttttt tttttgatac atttacttgt gtataagagt 180
caggatgat 189
<210> 534
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (117)..(117)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 534
atcatcactt gtgtataaga gtcagttttt tttttttttt ttgatagtag acttgtgtat 60
aagagtcagt tttttttttt tttttttttt tggcgatcgc tttttttttt ttttttnttt 120
tttttttttt tttgcgatcg cctttttttt tttttgatac atttctgact cttatacaca 180
agtgatgat 189
<210> 535
<211> 183
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (114)..(114)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 535
atcatcctga ctcttataca caagtttttt tttttttttt ttgatagtag ctgactctta 60
tacacaagtt tttttttttt tttttttttt tggtcgcttt tttttttttt tttntttttt 120
tttttttttt gcgacctttt tttttttttg atacatttac ttgtgtataa gagtcaggat 180
gat 183
<210> 536
<211> 183
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (114)..(114)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 536
atcatcactt gtgtataaga gtcagttttt tttttttttt ttgatagtag acttgtgtat 60
aagagtcagt tttttttttt tttttttttt tggtcgcttt tttttttttt tttntttttt 120
tttttttttt gcgacctttt tttttttttg atacatttct gactcttata cacaagtgat 180
gat 183
<210> 537
<211> 195
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (120)..(120)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 537
atcatcctga ctcttataca caagtttttt tttttttttt ttgatagtag ctgactctta 60
tacacaagtt tttttttttt tttttttttt tgcggcgatc ggcttttttt tttttttttn 120
tttttttttt ttttttgccg atcgccgctt tttttttttt tgatacattt acttgtgtat 180
aagagtcagg atgat 195
<210> 538
<211> 195
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (120)..(120)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 538
atcatcactt gtgtataaga gtcagttttt tttttttttt ttgatagtag acttgtgtat 60
aagagtcagt tttttttttt tttttttttt tgcggcgatc ggcttttttt tttttttttn 120
tttttttttt ttttttgccg atcgccgctt tttttttttt tgatacattt ctgactctta 180
tacacaagtg atgat 195
<210> 539
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (75)..(75)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 539
gatagtagct gactcttata cacaagtttt tttttttttt tttttttttg gcgatcgctt 60
tttttttttt ttttnttttt tttttttttt tgcgatcgcc tttttttttt tttgatacat 120
ttacttgtgt ataagagtca ggatgatttt tttttttttt ttttatcatc ctgactctta 180
tacacaagt 189
<210> 540
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (75)..(75)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 540
gatagtagac ttgtgtataa gagtcagttt tttttttttt tttttttttg gcgatcgctt 60
tttttttttt ttttnttttt tttttttttt tgcgatcgcc tttttttttt tttgatacat 120
ttctgactct tatacacaag tgatgatttt tttttttttt ttttatcatc acttgtgtat 180
aagagtcag 189
<210> 541
<211> 183
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 541
gatagtagct gactcttata cacaagtttt tttttttttt tttttttttg gtcgcttttt 60
tttttttttt tntttttttt ttttttttgc gacctttttt tttttttgat acatttactt 120
gtgtataaga gtcaggatga tttttttttt ttttttttat catcctgact cttatacaca 180
agt 183
<210> 542
<211> 183
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 542
gatagtagac ttgtgtataa gagtcagttt tttttttttt tttttttttg gtcgcttttt 60
tttttttttt tntttttttt ttttttttgc gacctttttt tttttttgat acatttctga 120
ctcttataca caagtgatga tttttttttt ttttttttat catcacttgt gtataagagt 180
cag 183
<210> 543
<211> 195
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (78)..(78)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 543
gatagtagct gactcttata cacaagtttt tttttttttt tttttttttg cggcgatcgg 60
cttttttttt tttttttntt tttttttttt ttttgccgat cgccgctttt tttttttttg 120
atacatttac ttgtgtataa gagtcaggat gatttttttt tttttttttt atcatcctga 180
ctcttataca caagt 195
<210> 544
<211> 195
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (78)..(78)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 544
gatagtagac ttgtgtataa gagtcagttt tttttttttt tttttttttg cggcgatcgg 60
cttttttttt tttttttntt tttttttttt ttttgccgat cgccgctttt tttttttttg 120
atacatttct gactcttata cacaagtgat gatttttttt tttttttttt atcatcactt 180
gtgtataaga gtcag 195
<210> 545
<211> 192
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (74)..(74)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 545
cacgtgctga ctcttataca caagttttct cgatcattat tattttttgg cgatcgcttt 60
tttttttttt tttntttttt tttttttttt gcgatcgcct tttttttttt tttttttttt 120
acttgtgtat aagagtcagg acgaatattt tttttttttt tttttttact tgtgtataag 180
agtcagcacg tg 192
<210> 546
<211> 192
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (74)..(74)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 546
cacgtgactt gtgtataaga gtcagtttct cgatcattat tattttttgg cgatcgcttt 60
tttttttttt tttntttttt tttttttttt gcgatcgcct tttttttttt tttttttttt 120
ctgactctta tacacaagtg acgaatattt tttttttttt tttttttctg actcttatac 180
acaagtcacg tg 192
<210> 547
<211> 186
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 547
cacgtgctga ctcttataca caagttttct cgatcattat tattttttgg tcgctttttt 60
tttttttttt nttttttttt tttttttgcg accttttttt tttttttttt ttttacttgt 120
gtataagagt caggacgaat attttttttt tttttttttt tacttgtgta taagagtcag 180
cacgtg 186
<210> 548
<211> 186
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 548
cacgtgactt gtgtataaga gtcagtttct cgatcattat tattttttgg tcgctttttt 60
tttttttttt nttttttttt tttttttgcg accttttttt tttttttttt ttttctgact 120
cttatacaca agtgacgaat attttttttt tttttttttt tctgactctt atacacaagt 180
cacgtg 186
<210> 549
<211> 198
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (77)..(77)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 549
cacgtgctga ctcttataca caagttttct cgatcattat tattttttgc ggcgatcggc 60
tttttttttt ttttttnttt tttttttttt tttgccgatc gccgcttttt tttttttttt 120
ttttttactt gtgtataaga gtcaggacga atattttttt tttttttttt tttacttgtg 180
tataagagtc agcacgtg 198
<210> 550
<211> 198
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (77)..(77)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 550
cacgtgactt gtgtataaga gtcagtttct cgatcattat tattttttgc ggcgatcggc 60
tttttttttt ttttttnttt tttttttttt tttgccgatc gccgcttttt tttttttttt 120
ttttttctga ctcttataca caagtgacga atattttttt tttttttttt tttctgactc 180
ttatacacaa gtcacgtg 198
<210> 551
<211> 192
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (119)..(119)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 551
acttgtgtat aagagtcagc acgtgttttt tttttttttt tttttcacgt gctgactctt 60
atacacaagt tttctcgatc attattattt tttggcgatc gctttttttt ttttttttnt 120
tttttttttt tttttgcgat cgcctttttt tttttttttt tttttacttg tgtataagag 180
tcaggacgaa ta 192
<210> 552
<211> 192
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (119)..(119)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 552
ctgactctta tacacaagtc acgtgttttt tttttttttt tttttcacgt gacttgtgta 60
taagagtcag tttctcgatc attattattt tttggcgatc gctttttttt ttttttttnt 120
tttttttttt tttttgcgat cgcctttttt tttttttttt tttttctgac tcttatacac 180
aagtgacgaa ta 192
<210> 553
<211> 186
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (116)..(116)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 553
acttgtgtat aagagtcagc acgtgttttt tttttttttt tttttcacgt gctgactctt 60
atacacaagt tttctcgatc attattattt tttggtcgct tttttttttt tttttntttt 120
tttttttttt ttgcgacctt tttttttttt ttttttttta cttgtgtata agagtcagga 180
cgaata 186
<210> 554
<211> 186
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (116)..(116)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 554
ctgactctta tacacaagtc acgtgttttt tttttttttt tttttcacgt gacttgtgta 60
taagagtcag tttctcgatc attattattt tttggtcgct tttttttttt tttttntttt 120
tttttttttt ttgcgacctt tttttttttt tttttttttc tgactcttat acacaagtga 180
cgaata 186
<210> 555
<211> 198
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (122)..(122)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 555
acttgtgtat aagagtcagc acgtgttttt tttttttttt tttttcacgt gctgactctt 60
atacacaagt tttctcgatc attattattt tttgcggcga tcggcttttt tttttttttt 120
tntttttttt ttttttttgc cgatcgccgc tttttttttt tttttttttt tacttgtgta 180
taagagtcag gacgaata 198
<210> 556
<211> 198
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (122)..(122)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 556
ctgactctta tacacaagtc acgtgttttt tttttttttt tttttcacgt gacttgtgta 60
taagagtcag tttctcgatc attattattt tttgcggcga tcggcttttt tttttttttt 120
tntttttttt ttttttttgc cgatcgccgc tttttttttt tttttttttt tctgactctt 180
atacacaagt gacgaata 198
<210> 557
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (95)..(95)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 557
acttgtgtat aagagtcagc agctgcagac aaagcttaca gctgactctt atacacaagt 60
tttttttttt tttttttttt ttcatatgcc aagtn 95
<210> 558
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (95)..(95)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 558
ctgactctta tacacaagtc agctgcagac aaagcttaca gacttgtgta taagagtcag 60
tttttttttt tttttttttt ttcatatgcc aagtn 95
<210> 559
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 559
acttgtgtat aagagtcagc agctgcagac aaagcttaca gctgactctt atacacaagt 60
tttttttttt tttttttttt ttnccaagt 89
<210> 560
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 560
ctgactctta tacacaagtc agctgcagac aaagcttaca gacttgtgta taagagtcag 60
tttttttttt tttttttttt ttnccaagt 89
<210> 561
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 561
ntacaagtcc ggataataat tttttttttt tttttttttt tacttgtgta taagagtcag 60
ctgggcacgc gtataagcag ctgactctta tacacaagt 99
<210> 562
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 562
ntacaagtcc ggataataat tttttttttt tttttttttt tctgactctt atacacaagt 60
ctgggcacgc gtataagcag acttgtgtat aagagtcag 99
<210> 563
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> replacement sequence
<400> 563
tacaagntaa taattttttt tttttttttt tttttacttg tgtataagag tcagctgggc 60
acgcgtataa gcagctgact cttatacaca agt 93
<210> 564
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> replacement sequence
<400> 564
tacaagntaa taattttttt tttttttttt tttttctgac tcttatacac aagtctgggc 60
acgcgtataa gcagacttgt gtataagagt cag 93
<210> 565
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 565
ntacaagtaa taattttttt tttttttttt tttttacttg tgtataagag tcagctgggc 60
acgcgtataa gcagctgact cttatacaca agt 93
<210> 566
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 566
ntacaagtaa taattttttt tttttttttt tttttctgac tcttatacac aagtctgggc 60
acgcgtataa gcagacttgt gtataagagt cag 93
<210> 567
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 567
nacttggtta attaattttt tttttttttt tttttttact tgtgtataag agtcagctac 60
tatc 64
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<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 568
nacttggtta attaattttt tttttttttt tttttttctg actcttatac acaagtctac 60
tatc 64
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> replacement sequence
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acttggntta attaattttt tttttttttt tttttttact tgtgtataag agtcagctac 60
tatc 64
<210> 570
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> replacement sequence
<400> 570
acttggntta attaattttt tttttttttt tttttttctg actcttatac acaagtctac 60
tatc 64
<210> 571
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 571
nacttggcat atgttaatta attttttttt tttttttttt tttacttgtg tataagagtc 60
agctactatc 70
<210> 572
<211> 70
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 572
nacttggcat atgttaatta attttttttt tttttttttt tttctgactc ttatacacaa 60
gtctactatc 70
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> replacement sequence
<400> 573
tattcgtcct gactcttata cacaagtttt tttttttttt tttttattaa ttattacttg 60
tan 63
<210> 574
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> replacement sequence
<400> 574
tattcgtcac ttgtgtataa gagtcagttt tttttttttt tttttattaa ttattacttg 60
tan 63
<210> 575
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> replacement sequence
<400> 575
tattcgtcct gactcttata cacaagtttt tttttttttt tttttattaa ttattanctt 60
gta 63
<210> 576
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> replacement sequence
<400> 576
tattcgtcac ttgtgtataa gagtcagttt tttttttttt tttttattaa ttattanctt 60
gta 63
<210> 577
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> replacement sequence
<400> 577
tattcgtcct gactcttata cacaagtttt tttttttttt tttttattaa ttattatccg 60
gacttgtan 69
<210> 578
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> replacement sequence
<400> 578
tattcgtcac ttgtgtataa gagtcagttt tttttttttt tttttattaa ttattatccg 60
gacttgtan 69
<210> 579
<211> 167
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> replacement sequence
<400> 579
tgcagctgct gtctcttgat cagatctttt tttttttttt tttttttttt ttttggcgat 60
cgcttttttt tttttttttt tttntttttt tttttttttt ttttgcgatc gccttttttt 120
tttttttttg atacatgttt agatctgatc aagagacagc tgtaagc 167
<210> 580
<211> 167
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> replacement sequence
<400> 580
tgcagctgag atctgatcaa gagacagttt tttttttttt tttttttttt ttttggcgat 60
cgcttttttt tttttttttt tttntttttt tttttttttt ttttgcgatc gccttttttt 120
tttttttttg atacatgttt ctgtctcttg atcagatctc tgtaagc 167
<210> 581
<211> 161
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> replacement sequence
<400> 581
tgcagctgct gtctcttgat cagatctttt tttttttttt tttttttttt ttttggtcgc 60
tttttttttt tttttttttt nttttttttt tttttttttt tgcgaccttt tttttttttt 120
tttgatacat gtttagatct gatcaagaga cagctgtaag c 161
<210> 582
<211> 161
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> replacement sequence
<400> 582
tgcagctgag atctgatcaa gagacagttt tttttttttt tttttttttt ttttggtcgc 60
tttttttttt tttttttttt nttttttttt tttttttttt tgcgaccttt tttttttttt 120
tttgatacat gtttctgtct cttgatcaga tctctgtaag c 161
<210> 583
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 583
tgcagctgct gtctcttgat cagatctttt tttttttttt tttttttttt ttttgcggcg 60
atcggctttt tttttttttt ttttttnttt tttttttttt tttttttgcc gatcgccgct 120
tttttttttt tttttgatac atgtttagat ctgatcaaga gacagctgta agc 173
<210> 584
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 584
tgcagctgag atctgatcaa gagacagttt tttttttttt tttttttttt ttttgcggcg 60
atcggctttt tttttttttt ttttttnttt tttttttttt tttttttgcc gatcgccgct 120
tttttttttt tttttgatac atgtttctgt ctcttgatca gatctctgta agc 173
<210> 585
<211> 161
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 585
gtgcccagct gtctcttgat cagatctttt ctcgatcatt tttttttttt ttttggtcgc 60
tttttttttt tttttttttt nttttttttt tttttttttt tgcgaccttt tttttttttt 120
tttttttttt ttttagatct gatcaagaga cagctgctta t 161
<210> 586
<211> 161
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 586
gtgcccagag atctgatcaa gagacagttt ctcgatcatt tttttttttt ttttggtcgc 60
tttttttttt tttttttttt nttttttttt tttttttttt tgcgaccttt tttttttttt 120
tttttttttt ttttctgtct cttgatcaga tctctgctta t 161
<210> 587
<211> 167
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 587
gtgcccagct gtctcttgat cagatctttt ctcgatcatt tttttttttt ttttggcgat 60
cgcttttttt tttttttttt tttntttttt tttttttttt ttttgcgatc gccttttttt 120
tttttttttt tttttttttt agatctgatc aagagacagc tgcttat 167
<210> 588
<211> 167
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 588
gtgcccagag atctgatcaa gagacagttt ctcgatcatt tttttttttt ttttggcgat 60
cgcttttttt tttttttttt tttntttttt tttttttttt ttttgcgatc gccttttttt 120
tttttttttt tttttttttt ctgtctcttg atcagatctc tgcttat 167
<210> 589
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 589
gtgcccagct gtctcttgat cagatctttt ctcgatcatt tttttttttt ttttgcggcg 60
atcggctttt tttttttttt ttttttnttt tttttttttt tttttttgcc gatcgccgct 120
tttttttttt tttttttttt ttttttagat ctgatcaaga gacagctgct tat 173
<210> 590
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 590
gtgcccagag atctgatcaa gagacagttt ctcgatcatt tttttttttt ttttgcggcg 60
atcggctttt tttttttttt ttttttnttt tttttttttt tttttttgcc gatcgccgct 120
tttttttttt tttttttttt ttttttctgt ctcttgatca gatctctgct tat 173
<210> 591
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (117)..(117)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 591
atcatcctgt ctcttgatca gatctttttt tttttttttt ttgatagtag ctgtctcttg 60
atcagatctt tttttttttt tttttttttt tggcgatcgc tttttttttt ttttttnttt 120
tttttttttt tttgcgatcg cctttttttt tttttgatac atttagatct gatcaagaga 180
caggatgat 189
<210> 592
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (117)..(117)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 592
atcatcagat ctgatcaaga gacagttttt tttttttttt ttgatagtag agatctgatc 60
aagagacagt tttttttttt tttttttttt tggcgatcgc tttttttttt ttttttnttt 120
tttttttttt tttgcgatcg cctttttttt tttttgatac atttctgtct cttgatcaga 180
tctgatgat 189
<210> 593
<211> 183
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (114)..(114)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 593
atcatcctgt ctcttgatca gatctttttt tttttttttt ttgatagtag ctgtctcttg 60
atcagatctt tttttttttt tttttttttt tggtcgcttt tttttttttt tttntttttt 120
tttttttttt gcgacctttt tttttttttg atacatttag atctgatcaa gagacaggat 180
gat 183
<210> 594
<211> 183
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (114)..(114)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 594
atcatcagat ctgatcaaga gacagttttt tttttttttt ttgatagtag agatctgatc 60
aagagacagt tttttttttt tttttttttt tggtcgcttt tttttttttt tttntttttt 120
tttttttttt gcgacctttt tttttttttg atacatttct gtctcttgat cagatctgat 180
gat 183
<210> 595
<211> 195
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (120)..(120)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 595
atcatcctgt ctcttgatca gatctttttt tttttttttt ttgatagtag ctgtctcttg 60
atcagatctt tttttttttt tttttttttt tgcggcgatc ggcttttttt tttttttttn 120
tttttttttt ttttttgccg atcgccgctt tttttttttt tgatacattt agatctgatc 180
aagagacagg atgat 195
<210> 596
<211> 195
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (120)..(120)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 596
atcatcagat ctgatcaaga gacagttttt tttttttttt ttgatagtag agatctgatc 60
aagagacagt tttttttttt tttttttttt tgcggcgatc ggcttttttt tttttttttn 120
tttttttttt ttttttgccg atcgccgctt tttttttttt tgatacattt ctgtctcttg 180
atcagatctg atgat 195
<210> 597
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (75)..(75)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 597
gatagtagct gtctcttgat cagatctttt tttttttttt tttttttttg gcgatcgctt 60
tttttttttt ttttnttttt tttttttttt tgcgatcgcc tttttttttt tttgatacat 120
ttagatctga tcaagagaca ggatgatttt tttttttttt ttttatcatc ctgtctcttg 180
atcagatct 189
<210> 598
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (75)..(75)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 598
gatagtagag atctgatcaa gagacagttt tttttttttt tttttttttg gcgatcgctt 60
tttttttttt ttttnttttt tttttttttt tgcgatcgcc tttttttttt tttgatacat 120
ttctgtctct tgatcagatc tgatgatttt tttttttttt ttttatcatc agatctgatc 180
aagagacag 189
<210> 599
<211> 183
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 599
gatagtagct gtctcttgat cagatctttt tttttttttt tttttttttg gtcgcttttt 60
tttttttttt tntttttttt ttttttttgc gacctttttt tttttttgat acatttagat 120
ctgatcaaga gacaggatga tttttttttt ttttttttat catcctgtct cttgatcaga 180
tct 183
<210> 600
<211> 183
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 600
gatagtagag atctgatcaa gagacagttt tttttttttt tttttttttg gtcgcttttt 60
tttttttttt tntttttttt ttttttttgc gacctttttt tttttttgat acatttctgt 120
ctcttgatca gatctgatga tttttttttt ttttttttat catcagatct gatcaagaga 180
cag 183
<210> 601
<211> 195
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (78)..(78)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 601
gatagtagct gtctcttgat cagatctttt tttttttttt tttttttttg cggcgatcgg 60
cttttttttt tttttttntt tttttttttt ttttgccgat cgccgctttt tttttttttg 120
atacatttag atctgatcaa gagacaggat gatttttttt tttttttttt atcatcctgt 180
ctcttgatca gatct 195
<210> 602
<211> 195
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (78)..(78)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 602
gatagtagag atctgatcaa gagacagttt tttttttttt tttttttttg cggcgatcgg 60
cttttttttt tttttttntt tttttttttt ttttgccgat cgccgctttt tttttttttg 120
atacatttct gtctcttgat cagatctgat gatttttttt tttttttttt atcatcagat 180
ctgatcaaga gacag 195
<210> 603
<211> 192
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (74)..(74)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 603
cacgtgctgt ctcttgatca gatcttttct cgatcattat tattttttgg cgatcgcttt 60
tttttttttt tttntttttt tttttttttt gcgatcgcct tttttttttt tttttttttt 120
agatctgatc aagagacagg acgaatattt tttttttttt tttttttaga tctgatcaag 180
agacagcacg tg 192
<210> 604
<211> 192
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (74)..(74)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 604
cacgtgagat ctgatcaaga gacagtttct cgatcattat tattttttgg cgatcgcttt 60
tttttttttt tttntttttt tttttttttt gcgatcgcct tttttttttt tttttttttt 120
ctgtctcttg atcagatctg acgaatattt tttttttttt tttttttctg tctcttgatc 180
agatctcacg tg 192
<210> 605
<211> 186
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 605
cacgtgctgt ctcttgatca gatcttttct cgatcattat tattttttgg tcgctttttt 60
tttttttttt nttttttttt tttttttgcg accttttttt tttttttttt ttttagatct 120
gatcaagaga caggacgaat attttttttt tttttttttt tagatctgat caagagacag 180
cacgtg 186
<210> 606
<211> 186
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 606
cacgtgagat ctgatcaaga gacagtttct cgatcattat tattttttgg tcgctttttt 60
tttttttttt nttttttttt tttttttgcg accttttttt tttttttttt ttttctgtct 120
cttgatcaga tctgacgaat attttttttt tttttttttt tctgtctctt gatcagatct 180
cacgtg 186
<210> 607
<211> 198
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (77)..(77)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 607
cacgtgctgt ctcttgatca gatcttttct cgatcattat tattttttgc ggcgatcggc 60
tttttttttt ttttttnttt tttttttttt tttgccgatc gccgcttttt tttttttttt 120
ttttttagat ctgatcaaga gacaggacga atattttttt tttttttttt tttagatctg 180
atcaagagac agcacgtg 198
<210> 608
<211> 198
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (77)..(77)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 608
cacgtgagat ctgatcaaga gacagtttct cgatcattat tattttttgc ggcgatcggc 60
tttttttttt ttttttnttt tttttttttt tttgccgatc gccgcttttt tttttttttt 120
ttttttctgt ctcttgatca gatctgacga atattttttt tttttttttt tttctgtctc 180
ttgatcagat ctcacgtg 198
<210> 609
<211> 192
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (119)..(119)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 609
agatctgatc aagagacagc acgtgttttt tttttttttt tttttcacgt gctgtctctt 60
gatcagatct tttctcgatc attattattt tttggcgatc gctttttttt ttttttttnt 120
tttttttttt tttttgcgat cgcctttttt tttttttttt tttttagatc tgatcaagag 180
acaggacgaa ta 192
<210> 610
<211> 192
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (119)..(119)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 610
ctgtctcttg atcagatctc acgtgttttt tttttttttt tttttcacgt gagatctgat 60
caagagacag tttctcgatc attattattt tttggcgatc gctttttttt ttttttttnt 120
tttttttttt tttttgcgat cgcctttttt tttttttttt tttttctgtc tcttgatcag 180
atctgacgaa ta 192
<210> 611
<211> 186
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (116)..(116)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 611
agatctgatc aagagacagc acgtgttttt tttttttttt tttttcacgt gctgtctctt 60
gatcagatct tttctcgatc attattattt tttggtcgct tttttttttt tttttntttt 120
tttttttttt ttgcgacctt tttttttttt ttttttttta gatctgatca agagacagga 180
cgaata 186
<210> 612
<211> 186
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (116)..(116)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 612
ctgtctcttg atcagatctc acgtgttttt tttttttttt tttttcacgt gagatctgat 60
caagagacag tttctcgatc attattattt tttggtcgct tttttttttt tttttntttt 120
tttttttttt ttgcgacctt tttttttttt tttttttttc tgtctcttga tcagatctga 180
cgaata 186
<210> 613
<211> 198
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (122)..(122)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 613
agatctgatc aagagacagc acgtgttttt tttttttttt tttttcacgt gctgtctctt 60
gatcagatct tttctcgatc attattattt tttgcggcga tcggcttttt tttttttttt 120
tntttttttt ttttttttgc cgatcgccgc tttttttttt tttttttttt tagatctgat 180
caagagacag gacgaata 198
<210> 614
<211> 198
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (122)..(122)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 614
ctgtctcttg atcagatctc acgtgttttt tttttttttt tttttcacgt gagatctgat 60
caagagacag tttctcgatc attattattt tttgcggcga tcggcttttt tttttttttt 120
tntttttttt ttttttttgc cgatcgccgc tttttttttt tttttttttt tctgtctctt 180
gatcagatct gacgaata 198
<210> 615
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (95)..(95)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 615
agatctgatc aagagacagc agctgcagac aaagcttaca gctgtctctt gatcagatct 60
tttttttttt tttttttttt ttcatatgcc aagtn 95
<210> 616
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (95)..(95)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 616
ctgtctcttg atcagatctc agctgcagac aaagcttaca gagatctgat caagagacag 60
tttttttttt tttttttttt ttcatatgcc aagtn 95
<210> 617
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 617
agatctgatc aagagacagc agctgcagac aaagcttaca gctgtctctt gatcagatct 60
tttttttttt tttttttttt ttnccaagt 89
<210> 618
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire d'un acide nuclique d'intrt
<400> 618
ctgtctcttg atcagatctc agctgcagac aaagcttaca gagatctgat caagagacag 60
tttttttttt tttttttttt ttnccaagt 89
<210> 619
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 619
ntacaagtcc ggataataat tttttttttt tttttttttt tagatctgat caagagacag 60
ctgggcacgc gtataagcag ctgtctcttg atcagatct 99
<210> 620
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 620
ntacaagtcc ggataataat tttttttttt tttttttttt tctgtctctt gatcagatct 60
ctgggcacgc gtataagcag agatctgatc aagagacag 99
<210> 621
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> replacement sequence
<400> 621
tacaagntaa taattttttt tttttttttt tttttagatc tgatcaagag acagctgggc 60
acgcgtataa gcagctgtct cttgatcaga tct 93
<210> 622
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> replacement sequence
<400> 622
tacaagntaa taattttttt tttttttttt tttttctgtc tcttgatcag atctctgggc 60
acgcgtataa gcagagatct gatcaagaga cag 93
<210> 623
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 623
ntacaagtaa taattttttt tttttttttt tttttagatc tgatcaagag acagctgggc 60
acgcgtataa gcagctgtct cttgatcaga tct 93
<210> 624
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 624
ntacaagtaa taattttttt tttttttttt tttttctgtc tcttgatcag atctctgggc 60
acgcgtataa gcagagatct gatcaagaga cag 93
<210> 625
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 625
nacttggtta attaattttt tttttttttt tttttttaga tctgatcaag agacagctac 60
tatc 64
<210> 626
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 626
nacttggtta attaattttt tttttttttt tttttttctg tctcttgatc agatctctac 60
tatc 64
<210> 627
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> replacement sequence
<400> 627
acttggntta attaattttt tttttttttt tttttttaga tctgatcaag agacagctac 60
tatc 64
<210> 628
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> replacement sequence
<400> 628
acttggntta attaattttt tttttttttt tttttttctg tctcttgatc agatctctac 60
tatc 64
<210> 629
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 629
nacttggcat atgttaatta attttttttt tttttttttt tttagatctg atcaagagac 60
agctactatc 70
<210> 630
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<400> 630
nacttggcat atgttaatta attttttttt tttttttttt tttctgtctc ttgatcagat 60
ctctactatc 70
<210> 631
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> replacement sequence
<400> 631
tattcgtcct gtctcttgat cagatctttt tttttttttt tttttattaa ttattacttg 60
tan 63
<210> 632
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> replacement sequence
<400> 632
tattcgtcag atctgatcaa gagacagttt tttttttttt tttttattaa ttattacttg 60
tan 63
<210> 633
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> replacement sequence
<400> 633
tattcgtcct gtctcttgat cagatctttt tttttttttt tttttattaa ttattanctt 60
gta 63
<210> 634
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> replacement sequence
<400> 634
tattcgtcag atctgatcaa gagacagttt tttttttttt tttttattaa ttattanctt 60
gta 63
<210> 635
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> replacement sequence
<400> 635
tattcgtcct gtctcttgat cagatctttt tttttttttt tttttattaa ttattatccg 60
gacttgtan 69
<210> 636
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> replacement sequence
<400> 636
tattcgtcag atctgatcaa gagacagttt tttttttttt tttttattaa ttattatccg 60
gacttgtan 69
<210> 637
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> replacement sequence
<400> 637
tattcgtcct gtctcttgat cagatctttt tttttttttt tttttattaa ttattanctt 60
gta 63
<210> 638
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> replacement sequence
<400> 638
tattcgtcag atctgatcaa gagacagttt tttttttttt tttttattaa ttattanctt 60
gta 63
<210> 639
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> replacement sequence
<400> 639
tattcgtcct gtctcttgat cagatctttt tttttttttt tttttattaa ttattatccg 60
gacttgtan 69
<210> 640
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> replacement sequence
<400> 640
tattcgtcag atctgatcaa gagacagttt tttttttttt tttttattaa ttattatccg 60
gacttgtan 69
<210> 641
<211> 136
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (82)..(82)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (130)..(130)
<223> transposase binding site
<400> 641
atcatcnttt tttttttttt ttttgatagt agnttttttt tttttttttt ttttttggcg 60
atcgcttttt tttttttttt tntttttttt ttttttttgc gatcgccttt tttttttttt 120
gatacatttn gatgat 136
<210> 642
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> transposase binding site
<400> 642
nacttggtta attaattttt tttttttttt tttttttnct actatc 46
<210> 643
<211> 131
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(66)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (123)..(123)
<223> transposase binding site
<400> 643
tgcagctgnt tttttttttt tttttttttt ttttttggcg atcgcttttt tttttttttt 60
tttttntttt tttttttttt ttttttgcga tcgccttttt tttttttttt tgatacatgt 120
ttnctgtaag c 131
<210> 644
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(59)
<223> replacement sequence
<400> 644
ncagctgcag acaaagctta cagntttttt tttttttttt ttttttcata tgccaagtn 59
<210> 645
<211> 136
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> transposase binding site
<220>
<221> misc_feature
<222> (82)..(82)
<223> squence A permettant l'insertion d'une squence complmentaire
d'un acide nuclique d'intrt
<220>
<221> misc_feature
<222> (130)..(130)
<223> transposase binding site
<400> 645
atcatcnttt tttttttttt ttttgatagt agnttttttt tttttttttt ttttttggcg 60
atcgcttttt tttttttttt tntttttttt ttttttttgc gatcgccttt tttttttttt 120
gatacatttn gatgat 136
<210> 646
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> molecule of the complex
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> replacement sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> transposase binding site
<400> 646
nacttggtta attaattttt tttttttttt tttttttnct actatc 46
Claims (15)
- 복합체로서,
- 관심 핵산의 상보적 서열의 삽입을 허용하는 A 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성된 제1 단일 가닥 핵산 분자, -
여기서 상기 A 서열은 5'에서 40 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 제1 A/T-풍부, 특히 T-풍부 서열에 결합하고, 3'에서 40 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 제2 A/T-풍부, 특히 T-풍부 서열에 결합하며, 상기 제1 및 제2 A/T-풍부, 특히 T-풍부 서열은 각각 6 내지 12개의 G/C-풍부 뉴클레오티드의 제1 및 제2 도메인을 포함하고, 상기 제1 도메인의 서열은 상기 제2 도메인의 서열에 상보적이고, 상기 제1 및 제2 도메인은 상기 A 서열로부터 15 내지 52개 뉴클레오티드에 위치하며, 상기 제1 분자는 5' 말단에 트랜스포사제를 인식하기 위한 5'에서 3' 방향으로 배향된 제1 서열을 포함하고, 3' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 적어도 하나의 제2 서열을 포함함 -; 및
- 5' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 적어도 하나의 상보적 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성된 제2 단일 가닥 핵산 분자를 포함하고,
상기 복합체는, 상기 트랜스포사제의 2개의 이중 가닥 결합 부위를 정의하도록, 상기 제1 및 제2 단일 가닥 핵산 분자가 Watson 및 Crick에 의해 정의된 염기 상보성에 따라 쌍을 이루도록 되어 있는, 복합체. - 제1항에 있어서, 상기 A 서열은 관심 핵산의 상보적 서열을 포함하는, 복합체.
- 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분자는 5' 말단에 트랜스포사제를 인식하기 위한 5'에서 3' 방향으로 배향된 제1 서열을 포함하고, 3' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 5'에서 3' 방향으로 배향된 제2 서열을 포함하며,
상기 제2 분자는 5' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제1 서열의 제1 상보적 서열, 및 이어서, 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 제2 상보적 서열을 포함하는, 복합체. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분자는 5' 말단에 트랜스포사제를 인식하기 위한 5'에서 3' 방향으로 배향된 제1 서열을 포함하고, 3' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 제2 서열, 및 이어서 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제1 서열의 제1 상보적 서열을 포함하며,
상기 제2 분자는 5' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 상보적 서열을 포함하는, 복합체. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스포사제는 박테리아 트랜스포사제, 특히 Tn5, Tn9, Tn10 또는 Tc1/마리너로부터 선택된 트랜스포사제인, 복합체.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분자는, 특히 변형된 뉴클레오티드를 통해, 효소와 결합되는, 복합체.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분자는 하기 서열, 즉, 서열 번호 436, 서열 번호 440, 서열 번호 443, 서열 번호 444, 서열 번호 448, 서열 번호 449, 서열 번호 450, 서열 번호 454, 서열 번호 455, 서열 번호 456, 서열 번호 457, 서열 번호 458, 서열 번호 462, 서열 번호 463, 서열 번호 464, 서열 번호 465, 서열 번호 466 및 서열 번호 641 중 하나를 포함하는, 복합체.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체는 한 쌍의 제1 및 제2 분자를 포함하고, 상기 제1 및 제2 분자는 표 2에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는, 복합체.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체는 표 4에 정의된 바와 같은 300쌍의 제1 및 제2 분자 중 하나를 포함하는, 복합체.
- 앙상블(ensemble)로서,
- 관심 핵산의 상보적 서열의 삽입을 허용하는 A 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되거나, 또는 관심 핵산의 상보적 서열을 포함하는 제1 단일 가닥 핵산 분자 - 여기서 상기 상보적 서열은 5'에서 40 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 제1 T-풍부 서열에 결합하고 3'에서 40 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 제2 T-풍부 서열에 결합하며, 상기 제1 및 제2 T-풍부 서열은 각각 6 내지 12개의 G/C-풍부 뉴클레오티드의 제1 및 제2 도메인을 포함하고, 상기 제1 도메인의 서열은 상기 제2 도메인의 서열에 상보적이고, 상기 제1 및 제2 도메인은 상기 A 서열로부터 15 내지 52개 뉴클레오티드에 위치하며, 상기 제1 분자는 5' 말단에 트랜스포사제를 인식하기 위한 5'에서 3' 방향으로 배향된 적어도 하나의 제1 서열을 포함하고 3' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 제2 서열을 포함함 -,
- 관심 핵산의 상보적 서열의 삽입을 허용하는 B 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되거나, 또는 관심 핵산의 상보적 서열을 포함하는 제2 단일 가닥 핵산 분자 - 여기서 상기 상보적 B 서열은 5'에서 40 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 제3 T-풍부 서열에 결합하고 3'에서 40 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 제4 T-풍부 서열에 결합하며, 상기 제3 및 제4 T-풍부 서열은 각각 6 내지 12개의 G/C-풍부 뉴클레오티드의 제3 및 제4 도메인을 포함하고, 상기 제3 도메인의 서열은 상기 제4 도메인의 서열에 상보적이고, 상기 제3 및 제4 도메인은 상기 B 서열로부터 15 내지 52개 뉴클레오티드에 위치하며, 상기 제2 분자는 5' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 5'에서 3' 방향으로 배향된 적어도 하나의 제1 서열을 포함하고 3' 말단에 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 제2 서열을 포함하며,
상기 B 서열은 상기 관심 핵산의 상보적 서열이고, 상기 A 서열은 상기 관심 핵산의 관심 영역의 5'에 위치하고 상기 B 서열은 상기 관심 핵산의 관심 영역의 3'에 위치함 -, 및
- 하기를 포함하는 제3 단일 가닥 분자를 포함하고:
5' 부분에, 상기 제1 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 적어도 하나의 상보적 서열,
3' 부분에, 상기 제2 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제1 서열의 적어도 하나의 상보적 서열, 및
- 단일 가닥 대체 핵산 분자의 삽입을 허용하는, 상기 제1 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 상보적 서열과 상기 제2 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제1 서열의 상보적 서열 사이에 위치한 영역,
상기 제1 및 제3 단일 가닥 핵산 분자는 상기 트랜스포사제의 2개의 이중 가닥 결합 부위를 정의하도록 Watson 및 Crick에 의해 정의된 염기 상보성에 따라 쌍을 이루고, 상기 제2 및 제3 단일 가닥 핵산 분자는 상기 트랜스포사제의 2개의 이중 가닥 결합 부위를 정의하도록 Watson 및 Crick에 의해 정의된 염기 상보성에 따라 쌍을 이루는, 앙상블. - 제10항에 있어서, 상기 앙상블은 표 5에 정의된 바와 같은 300쌍의 제1 및 제3 분자 중 하나를 포함하는, 앙상블.
- 키트로서, 재조합효소의 발현을 허용하는 적어도 하나의 벡터 및 제10항에 정의된 바와 같은 앙상블의 제1, 제2, 및 제3 분자를 포함하는 키트.
- 핵산을 조작하기 위한, 특히 표적 서열을 관심 서열로 대체하기 위한, 제10항에 정의된 바와 같은 앙상블의 용도로서, 단, 상기 용도는 인간의 생식계열 유전적 정체성을 변형시키는 방법을 포함하지 않고, 상기 용도는 사람이나 동물의 신체를 수술이나 치료법으로 치료하는 방법이 아닌, 용도.
- 하이브리드 핵산 분자를 수득하기 위해 핵산 분자의 표적 영역을 또 다른 핵산 분자의 관심 영역으로 시험관 내에서 대체하는 방법으로서,
- 제10항에 정의된 바와 같은 앙상블을 표적 영역을 포함하는 핵산과 접촉시키는 단계, -
여기서 상기 앙상블은,
상기 제1 분자의 A 서열이 표적 영역의 바로 5'에 위치한 영역의 상보적 서열을 포함하고,
상기 제1 분자의 B 서열이 표적 영역의 바로 3'에 위치한 영역의 상보적 서열을 포함하고,
상기 제3 분자는, 대체 복합체를 수득하기 위해, 상기 제1 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 상보적 서열과 상기 제2 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제1 서열의 상보적 서열 사이에 위치한 영역에 상기 관심 영역을 포함하도록 하는 것임 -,
- 상기 앙상블에 함유된 상기 트랜스포사제의 이중 가닥 결합 부위를 인식하는 트랜스포사제의 존재 하에 상기 대체 복합체를 배치하여 재조합 복합체를 수득하는 단계, 및
- 표적 영역 대신 상기 관심 영역을 포함하는 하이브리드 핵산 분자를 수득하기 위해 상기 조합 복합체를 재조합하는 단계를 포함하고,
단, 상기 방법은 인간의 생식계열 유전적 정체성을 변형시키는 방법이 아니며, 상기 방법은 사람이나 동물의 신체를 수술이나 치료법으로 치료하는 방법이 아닌, 방법. - 세포의 게놈을 편집하기 위한 시험관 내 또는 생체 외 방법으로서, 이중 가닥 DNA의 특정 단편 대신에 다른 관심 이중 가닥 DNA 단편을 포함하는 재조합 하이브리드 게놈을 수득하기 위해, 상기 세포의 상기 게놈의 이중 가닥 DNA의 특정 단편을 또 다른 관심 이중 가닥 DNA 단편으로 대체하는 것을 가능하게 하며, 상기 방법은,
- 제10항에 정의된 바와 같은 제1 앙상블을 제조하는 단계, -
여기서 상기 제1 분자의 A 서열은 상기 특정 단편의 5'에 인접한 영역의 상보적 서열을 포함하고;
상기 제2 분자의 B 서열은 상기 특정 단편의 3'에 인접한 영역의 상보적 서열을 포함하고;
상기 제3 분자는, 상기 제1 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 상보적 서열과 상기 제2 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제1 서열의 상보적 서열 사이에 위치한 영역 사이에, 상기 특정 단편의 가닥 중 하나의 서열을 포함함 -;
- 및 선택적으로, 제10항에 정의된 바와 같은 제2 앙상블을 제조하는 단계, -
여기서, 재조합 복합체를 수득하기 위해, 상기 제2 앙상블의 제1 분자의 상기 상보적 영역의 A 서열은 상기 특정 단편의 5'에 인접한 영역의 상보적 서열을 포함하고;
상기 제2 앙상블의 제2 분자의 상기 상보적 영역의 B 서열은 상기 특정 단편의 3'에 인접한 영역의 상보적 서열을 포함하고;
상기 제2 앙상블의 제3 분자는, 상기 제2 앙상블의 제1 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제2 서열의 상보적 서열과 상기 제2 앙상블의 제2 분자의 상기 트랜스포사제를 인식하기 위한 상기 제1 서열의 상보적 서열 사이에 위치한 영역 사이에, 상기 제1 앙상블의 제3 서열에 함유된 상기 특정 단편의 상보적 가닥의 서열을 포함하고;
상기 제1 앙상블의 제1 분자의 A 영역에 함유된 특정 단편의 5'에 인접한 영역의 상보적 서열은 상기 제2 앙상블의 제1 분자의 A 영역에 함유된 특정 단편의 5'에 인접한 영역의 상보적 서열에 최대 95% 상보적이고;
상기 제1 앙상블의 제1 분자의 B 영역에 함유된 특정 단편의 3'에 인접한 영역의 상보적 서열은 상기 제2 앙상블의 제1 분자의 B 영역에 함유된 특정 단편의 3'에 인접한 영역의 상보적 서열에 최대 95% 상보적임 -;
- 편집될 준비가 된 세포를 수득하기 위해, 상기 세포를 상기 재조합 복합체와 접촉시키는 단계,
- 편집된 세포를 수득하기 위해, 편집될 준비가 된 상기 세포에서 상기 트랜스포사제를 발현시키는 단계,
- 편집된 세포를 선택하는 단계 - 여기서 상기 편집된 세포의 게놈은 상기 특정 이중 가닥 DNA 단편 대신에 다른 관심 이중 가닥 DNA 단편을 포함함 -를 포함하고,
단, 상기 방법은 인간의 생식계열 유전적 정체성을 변형시키는 방법이 아니며, 상기 방법은 사람이나 동물의 신체를 수술이나 치료법으로 치료하는 방법이 아닌, 방법.
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