KR20240011895A - 돌외추출물-금속나노입자 복합체, 그의 제조방법 및 용도 - Google Patents

돌외추출물-금속나노입자 복합체, 그의 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항비만 및 비만매개염증 억제 활성이 현저히 증가된 돌외추출물과 금속나노입자를 포함하는 친환경 돌외추출물-금속나노입자 복합체(Gynostemma pentaphyllum extract-metal nanoparticle composite), 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 의한 상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체는 우수한 할비만 또는 항염증 효과를 나타내므로, 의약품, 건겅기능식품, 화장품, 동물사료제 또는 동물사료 첨가제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

돌외추출물-금속나노입자 복합체, 그의 제조방법 및 용도{Gynostemma pentaphyllum extract-metal nanoparticle composite, method of manufacturing the same and use thereof}
본 발명은 돌외추출물-금속나노입자 복합체(Gynostemma pentaphyllum extract-metal nanoparticle composite), 그의 제조방법 및 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항비만 및 비만매개염증 억제 활성이 현저히 증가된 돌외추출물과 금속나노입자를 포함하는 친환경 나노복합체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
비만(obesity)은 에너지 섭취가 에너지 소비보다 훨씬 많으면 지방 조직이 증식하고 비대하여 팽창되는 것을 특징으로 하여 발생한다. 비만의 인구는 생활 습관과 식습관 변화로 인해 급격히 증가하고 있다. 1975년 이래로 전 세계 비만율은 3배나 증가되었고, 세계보건기구(WHO, 2019)는 2030년에는 11억 2천만 명이 비만이 될 것이며, 21억 6천만 명이 과체중이 될 것으로 예측하고 있다.
비만은 가장 흔한 건강 문제인 당뇨병, 고혈압, 심혈관 질환, 뇌졸중, 암 및 비알코올성 지방간 질환을 포함한 여러 대사 장애와 관련이 있다. 지방 조직은 과량의 글리세롤, 비에스테르화 지방산, 전염증성 사이토카인, 기타 호르몬 등을 분비한다.
비만은 또한 감염에 의해 유발되는 고전적 염증과 구별되는 또 하나의 저급 염증을 특징으로 하는 염증성 질환으로 인식될 수 있다. 또한 염증성 사이토카인이 비만 설치류에서 높게 발현된다는 것이 이미 10여년 전에 발견되었다. 췌장, 지방, 간, 골격근, 뇌, 심장 등 여러 장기가 비만으로 인한 염증에 관여한다. 이 외에도 고지방식이는 고지혈증에 이어 반응성 활성산소종(ROS)을 포함한 지방산 산화를 증가시킨다. 또한, 이는 NF-κB(nuclear factor kappa beta) 경로를 활성화하고, 다양한 조직에서 전염증성 사이토카인의 분비를 증가시킨다.
최근 연구에 따르면, 면역 세포, 특히 단핵구/대식세포는 비만 유발 염증 및 합병증에 더 활동적이다. 비만인의 경우 지방조직에서 대식세포의 작동 상태 수가 증가하여 비만 유발 염증에 크게 기여한다. 지방 조직은 트리글리세리드(TG)를 저장하고 비만과 만성 염증을 연결하는 아디포카인(adipokine)을 생성한다.
이와 같이 증가된 수준의 TNF-α는 다중 세포 신호 전달 경로의 활성화, 지방분해 증가, 인슐린 수용체의 티로신 키나제 활성 억제 및 인슐린 작용과 관련이 있다. TNF-α는 또한 많은 유형의 세포에서 세포 증식, 세포자멸사, 분화 및 생존에 영향을 미칠 수 있다. 최근에 대사 증후군으로 진단받은 피험자들은 장기간의 항-TNF-α억제제 치료가 아디포넥틴 수치를 증가시키고 공복 혈당을 개선하는 것으로 나타났으며, 이는 인간의 비만 관련 인슐린 저항성에서 TNF-α의 역할을 확인시켜주는 것이다.
또한, 혈류에 높은 수준의 지질다당류(LPS)가 존재하는 고지방식이 조건에서는 내독소혈증이 발생한다. 현재 시판되고 있는 승인된 항비만제는 주로 에너지 섭취 감소에 효과적이지만, 에너지 소비에 영향을 미치는 승인된 약물은 없다. 또한, 항비만제를 장기간 사용하면 심각한 부작용을 일으킬 수 있다. 따라서, 부작용이 없는 비만 및 관련 대사 장애를 치료할 수 있는 새로운 약물의 개발이 필요한 실정이다.
이에 약용식물 추출물을 금속 나노입자로 합성하여 의약품, 화장품 등 다양한 분야에 응용하고자 하는 시도가 있었다. 즉, 인삼 열매 추출물을 포함하는 금속 나노입자 제조용 조성물 및 이의 용도(대한민국 공개특허공보 제10-2018-0000784호), 가시오가피 추출물을 포함하는 금속 나노입자 제조용 조성물 및 이의 이용(대한민국 공개특허공보 제10-2018-0036951호), 황칠 추출물을 포함하는 금속 나노입자의 제조용 조성물 및 이의 이용(대한민국 공개특허공보 제10-2017-0094046호) 등이 개시되어 있다.
그러나, 돌외 추출물을 이용하여 금속나노입자를 합성한 돌외추출물-금속나노입자 복합체에 대해서는 알려져 있지 않은 실정이다.
대한민국 공개특허공보 제10-2018-0000784호 대한민국 공개특허공보 제10-2018-0036951호 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0094046호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 비만 및 비만매개염증 억제를 위해 장기간 투여해도 부작용이 없는 천연물을 개발하고, 이를 간단하고 친환경적인 나노입자 제조기술을 도입하여 돌외추출물에 비하여 항비만 및 비만매개염증 억제 활성이 현저히 증가된 돌외추출물(GPE)-금속나노입자(AuNPs) 복합체를 제공할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 항비만 및 비만매개염증 억제 활성을 갖는 돌외추출물(GPE)-금속나노입자(AuNPs) 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항비만 및 비만매개염증 억제 활성을 갖는 돌외추출물(GPE)-금속나노입자(AuNPs) 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 돌외추출물(GPE)-금속나노입자(AuNPs) 복합체의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 돌외추출물 및 금속나노입자를 포함하는 돌외추출물-금속나노입자 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 금속은 금 또는 은일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 돌외추출물은 돌외의 뿌리, 잎 및 줄기로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 추출물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체는 수용액 중 UV-vis 흡수 스펙트럼의 최대 피크가 525~540 nm에서 형성될 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체는 면심 입방체(FCC) 또는 구형 구조일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체는 돌외추출물에 비하여, 항비만 및 비만매개염증 억제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 활성이 증가될 수 있다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, (a) 돌외추출물과 금속염을 수용성 용매에서 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합된 돌외추출물과 금속염을 반응시켜 돌외추출물-금속나노입자 복합체를 합성하는 단계; 및 (c) 상기 합성된 돌외추출물-금속나노입자 복합체를 원심분리하여 반응하지 않은 돌외추출물 또는 금속염을 회수하는 단계를 포함하는, 돌외추출물-금속나노입자 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 금속은 금 또는 은일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 합성은 상기 돌외추출물이 담황색에서 보라색으로 변하는 것에 의해 확인할 수 있다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는 항비만용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 조성물은 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 조성물은 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 조성물은 비만 예방 또는 개선용 동물사료 또는 동물사료 첨가제 조성물일 수 있다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 조성물은 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 조성물은 염증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 조성물은 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 조성물은 염증 예방 또는 개선용 동물사료 또는 동물사료 첨가제 조성물일 수 있다.
본 발명에 의하면, 친환경적으로 간편하게 제조할 수 있는 항비만 및 비만매개염증 억제 활성이 현저히 증가된 돌외추출물-금속나노입자 복합체를 제공할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 의한 상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체는 우수한 할비만 또는 항염증 효과를 나타내므로, 의약품, 건겅기능식품, 화장품, 동물사료제 또는 동물사료 첨가제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 돌외추출물-금나노입자 복합체의 를 함성하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 돌외추출물-금나노입자 복합체 및 돌외추출물의 UV vis 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 돌외추출물-금나노입자 복합체의 합성을 위한 최적 조건을 나타낸 것으로서, 돌외추출물(도 3a), 시간(도 3b), pH (도 3c)이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 돌외추출물-금나노입자 복합체의 전자현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 돌외추출물-금나노입자 복합체의 XRD 분석자료를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 돌외추출물-금나노입자 복합체의 FT-IR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7a 및 도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 돌외추출물-금나노입자 복합체의 세포성장에 미치는 영향을 나타낸 것으로서, 도 7a는 Raw264.7 세포, 도 7b는 3T3L1 세포에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 8a 및 도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 돌외추출물(도 8a) 및 돌외추출물-금나노입자 복합체(도 8b)이 3T3-L1세포에서 지방축적에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 돌외추출물-금 나노입자 복합체가 3T3-L1 세포에서 지방분해 연관 유전자의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다(MDI 대비 *P < 0.05, ***P < 0.001).
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 돌외추출물-금 나노입자 복합체가 RAW264.7 세포에서 염증 관련 유전자의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다(LPS 처리군 대비 **p < 0.01, ***p< 0.001, LPS 처리 세포 대비 ###p< 0.001)
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 돌외추출물-금 나노입자 복합체의 프리디칼 소거능을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 돌외추출물-금 나노입자 복합체가 3T3L1 세포에서 ROS 생성에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 13a 내지 도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따른 돌외추출물(도 13a) 및 돌외추출물-금 나노입자 복합체(도 13b)가 RAW264.7 세포에서 NO생성에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
본 발명의 제1 구현예는 돌외추출물 및 금속나노입자를 포함하는 돌외추출물-금속나노입자 복합체에 관한 것이다.
최근 나노 기반 치료법은 나노과학 및 나노물질의 발전으로 인해 나노 약물 전달을 위한 선도적인 플랫폼이 되었다. 나노입자는 제2형 당뇨병을 비롯한 다양한 대사 질환에서 약물 전달을 위한 탁월한 수단으로서, 최근 나노입자는 백색지방조직(WAT)과 갈색지방조직(BAT)을 포함한 특정 조직을 표적으로 삼아 지방세포에 축적된 과도한 지질을 제거하는 데 사용되고 있다.
또한, 이러한 광범위한 기능은 약물을 표적에 전달하는 방법을 포함하여 대사 조건에서 향상된 용해도, 안정성 및 생체 효율성과 같은 나노 입자의 고유한 특성을 가지고 있다.
금속나노입자, 예컨대 금나노입자(AuNPs)는 제조의 용이성, 안정성, 광학적 특성, 내산화성 및 생체적합성 등의 장점으로 인해 나노기술 분야에서 매우 중요한 연구의 한 분야가 되었다.
금 나노입자 등과 같은 금속 나노입자는 광역학 요법, x-선 영상, 약물 전달, 감지 및 생물 의학에서 광범위하게 적용되고 있다. 대부분의 연구자들은 금속 나노입자를 구연산염(citrate), 히드라진(hydrazine), 수소화붕소(borohydride) 등과 같은 다른 환원제로 금속 이온을 환원시켜 합성하였다. 금속 나노입자의 크기와 모양은 물리적, 화학적, 생물학적 경로를 통해 다양하게 합성할 수 있다. 그러나 물리적, 화학적 방법은 고비용, 낮은 수율, 높은 에너지 소비, 가혹한 환원제로 작용하여 환경적 피해를 주는 단점이 있다.
반면에 식물이나 생물체를 이용한 금속 나노입자의 그린 합성은 독성이 없고 친환경적이어서 주목받고 있다. 더 나아가서 식물 추출물을 이용한 나노 입자의 제조는 중성 pH의 용액, 상온에서, 저렴한 비용 및 환경 친화적인 방법으로 합성할 수 있는 새로운 방법이다.
식물은 자연의 "화학 공장"이며 알카로이드, 폴리페놀, 페놀산, 단백질, 당 및 테르페노이드와 같은 다양한 생리 활성 성분을 포함하고 있다. 식물 추출물의 이러한 구성 요소는 금속 이온을 환원시키기 위한 환원제로서 나노 입자를 안정화시키는 역할을 하는 작용기를 가지고 있다.
돌외(Gynostemma pentaphyllum)는 박과(Cucurbitaceae)에 속하는 여러해살이 덩굴식물이다. 산이나 들의 숲 속에서 자생하며 뿌리줄기는 옆으로 뻗고 마디에 흰털이 있고 엉키면서 자라지만 굴손으로 기어라가기도 한다. 돌외 잎을 말려 만든 차는 여러 장기들의 기능을 회복시키고, 건강한 피부를 유지하게 한다.
돌외는 또한 항스트레스 효과, 이완성 및 경련성 변비 억제 효과, 지사효과 등이 있으며 기관지 천식, 노인성 만성기관지염, 진해, 거담 작용, 트레스성 궤양에도 효과가 있으며 간염, 동맥경화 예방, 진통작용 등이 있다고도 알려져 있다.
돌외의 주요 생리활성 성분은 인삼의 진세노사이드와 구조적으로 유사한 지페노사이드(gypenosides)로 많은 연구자들로부터 주목을 받고 있다. 지페노사이드는 항염증, 항암, 면역력 증강, 항산화, 간 보호, 과체중 개선에 유효한 효능이 밝혀졌다. 돌외는 이 외에도 플라보노이드, 다당류, 스테롤, 아미노산 등 다양한 생리활성 성분을 함유하고 있다.
본 발명에서, "추출물"은 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온 또는 가온 상태에서 일정 시간 동안 추출하여 수득한 액상 성분, 상기 액상 성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다.
이에 따라, 본 발명에서 상기 "돌외추출물"은 돌외를 추출 처리하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함하는 것으로 해석될 수 있다.
상기 돌외추출물을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법은 열수 추출법, 용매 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 추출에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체에서, 상기 금속은 금 또는 은, 바람직하게는 금일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 돌외추출물은 돌외의 뿌리, 잎 및 줄기로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상, 바람직하게는 돌외 잎의 추출물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체는 수용액 중 UV-vis 흡수 스펙트럼의 최대 피크가 525~540 nm, 바람직하게는 530~535 nm에서 형성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체는 면심 입방체(FCC) 또는 구형 구조, 바람직하게는 더 넓은 표적을 갖는 장점이 있다는 점에서 구형 구조일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체는 돌외추출물에 비하여, 항비만 및 비만매개염증 억제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 활성, 바람직하게는 항비만 활성 및 비만매개염증 억제활성이 현저히 증가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제2 구현예는 (a) 돌외추출물과 금속염을 수용성 용매에서 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합된 돌외추출물과 금속염을 반응시켜 돌외추출물-금속나노입자 복합체를 합성하는 단계; 및 (c) 상기 합성된 돌외추출물-금속나노입자 복합체를 원심분리하여 반응하지 않은 돌외추출물 또는 금속염을 회수하는 단계를 포함하는, 돌외추출물-금속나노입자 복합체의 제조방법에 관한 것이다.
약용식물 추출물을 금속 나노입자로 합성하여 의약품 화장품 등 다양한 분여에 응용하고자 하는 시도가 있었지만, 돌외(Gynostemma pentaphyllum) 추출물을 이용하여 금속나노입자, 예컨대 금나노입자를 합성한 것은 최초로서, 돌외추출물-금나노입자(GP-AuNPs)의 합성은 색의 변화로 확연히 알 수 있다.
즉, 반응 전에는 옅은 노량색이지만 반응이 진행될수록 짙은 보라색으로 변한다. 혼합물의 짙은 보라색은 돌외추출물로 수성 HAuCl4 이온을 환원함으로써, 금 나노입자가 형성됨을 확인할 수 있다.
돌외에 함유되어 있는 지페노사이드(gypenosides)의 약 25%는 인삼의 진세노사이드와 비슷하고, 특히, 지페노사이드 III, IV, VIII, XII는 진세노사이드 Rb1, Rb3, Rd 및 F2와 매우 유사하다. 돌외에 함유되어 있는 이와 같은 식물 화학물질들(phytochemicals)은 환원제로 작용할수 있기 때문에, 금속나노입자 형성을 위한 금속염의 환원에 이용된 것으로 판단된다. 본 발명의 상기 돌외추출물-금나노입자(GP-AuNPs)의 제조방법은 친환경적이며, 매우 간단한 방법이다.
본 발명의 상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체의 제조방법에서, 상기 금속은 금 또는 은, 바람직하게는 금일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체의 제조방법에서, 상기 합성은 상기 돌외추출물이 담황색에서 보라색으로 변하는 것에 의해 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체의 제조방법은 가장 간단하고 시간이 적게 효과적인 방법으로서, 이에 관한 보다 상세한 내용은 이하의 실시예에서 설명될 것이므로, 여기에서는 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 제3 구현예는 상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는 항비만용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제4 구현예는 상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, "비만"은 일반적으로 체내에 지방조직이 과다한 상태이거나 또는 신체비만지수(체질량지수, Body mass index: 체중(kg)을 신장(m)의 제곱으로 나눈 값)가 25 이상인 경우를 의미한다. 비만 증상이 발생한 개체에서는 통상적으로 혈장으로부터 지방세포로 유입된 지방산과 포도당이 에스테르화하여 주로 중성지방의 형태로 축적된다.
본 발명에서, "염증성 질환(Inflammatory disease)"은 염증 유발인자 또는 방사선 조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화 질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 염증성 질환은 예를 들면 알레르기성 염증질환, 염증성 피부질환, 염증성 안구질환, 염증성 골관절질환, 염증성 근육질환, 염증성 장질환 등을 들 수 있고, 다른 예로서, 알레르기 비염, 맥관부종, 알러지성 결막염 등의 알레르기성 염증질환; 아토피피부염, 건선, 접촉성피부염, 습진성 피부염, 광선피부염, 지루피부염, 포진성피부염, 편평태선, 경화태선, 괴저성 농피증, 천포창, 수포성 표피박리증 등의 염증성 피부질환; 안검염, 퇴행성 또는 염증성 안구염 등의 염증성 안구질환; 관절염, 류마티 스관절염, 척추염 등의 염증성 골관절질환; 전신성 경화증, 피부근염, 다발성근염, 염증성 근병변 등의 염증성 근육질환; 궤양성 대장염, 크론병 등의 염증성 장질환을 들 수 잇으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "예방"은 상기 약학 조성물의 투여로 염증성 질환 또는 비만을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, "치료"는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하는데, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적으로 완화시키며, 예후를 개선시키는 것 등이 포함된다.
본 발명의 상기 제3 구현에에서, 상기 항비만용 조성물은 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물, 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물, 또는 비만 예방 또는 개선용 동물사료 또는 동물사료 첨가제 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 제4 구현에에서, 상기 항염증용 조성물은 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 염증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물, 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물, 또는 염증 예방 또는 개선용 동물사료 또는 동물사료 첨가제 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 제3 구현예 및 제4 구현예에서, 상기 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것 은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하 여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
상기 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/㎏일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체의 1일 투여량은, 5 내지 500 mg/kg일 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 250 mg/kg일 수 있고, 더욱 바람직하게는 10 내지 150 mg/kg일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 15 내지 150 mg/kg일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 15 내지 100 mg/kg일 수 있고, 가장 바람직하게는 15 내지 50 mg/kg일 수 있다.
상기 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써, 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 제3 구현예 및 제4 구현예에서, 상기 "건강기능식품"은
특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 '기능'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.
상기 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 건강기능식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 건강기능식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나므로, 비만 예방 또는 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
한 구체예에서, 상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태일 수 있다. 이와 같은 건강기능식품 조성물에 있어서의 돌외추출물-금속나노입자 복합체의 첨가량은, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형 태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.01 내지 100 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 50 중량%, 0.5 내지 50 중량 %의 범위에서 첨가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 제4 구현예에서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스 킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제{화장용}, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크 림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제 (핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜 워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다.
이를 위해 본 발명의 상기 화장료 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 물, 식염 수, DMSO 또는 이들의 조합을 사용할 수 있고, 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지 방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다.
상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.
지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며, 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용가능하며, 가능한 한천 연물 유래의 계면활성제가 바람직하다.
본 발명의 상기 제3 구현예에 따른 항비만용 조성물 및 제4 구현예에 따른 항염증용 조성물은 인체와 유사한 반려동물에도 적용이 가능할 것이므로, 동일한 효과를 위하여 펫용 건강식품, 동물사료, 동물사료 첨가제 등으로 바람직하게 적용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
<실시예>
1. 돌외추출물의 조제
돌외 원료는 대한민국 인천 소재 고려홍삼원㈜에서 구입하였다. 채취한 돌외 잎은 수돗물과 증류수로 깨끗이 세척하고 그늘에서 건조한 후, 그라인더를 사용하여 분말 형태로 분쇄하였다.
돌외 잎 분말은 1:20 부피비의 증류수를 가하여 잘 섞은 후 용액을 100℃에서 40분 동안 초음파 처리하였다. 이 용액을 고압 멸균한 후 5000rpm에서 15분 동안 원심분리하고 상등액을 4℃에 보관하였다.
하기 표 1(고압가열에 의한 돌외잎 추출물의 성분 변화)에서 보는 바와 같이, 돌외추출물은 초음파 처리 및 오토클레이빙을 통해 총 페놀화합물(total phenolic compound)이 약 28.8% 증가되었음을 알 수 있다.
성분명 단위 처리 전 처리 후
총 페놀화합물 mg/g 5.2 6.7
2. 돌외추출물-금나노입자(GP-AuNPs)의 제조
돌외 추출물을 사용한 금 나노입자를 합성하기 위하여, 먼저 5 ml의 돌외추출물 취하여 25 ml의 증류수와 혼합하였다. 그 다음 이 추출액에 1mM의 HAuCl4.3H2O 용액을 첨가하고, 80℃에서 1시간 동안 반응시켜 추출물의 담황색이 보라색으로 변할 때까지 유지하여 나노입자의 형성을 확인하였다. 이러한 색상 변화는 금 이온이 원자로 환원됨(Au+에서 Au로)을 나타낸다.
합성이 완료된 후 나노입자를 15,000 rpm에서 15분간 원심분리하고 입자를 증류수로 세척하여 반응하지 않은 물질들을 제거하였다. 마지막으로, 돌외추출물-금나노입자(GP-AuNPs)는 하루 밤 동안 공기 건조 후 수집하고 특성조사 등 실험을 위해 상기 돌외추출물-금나노입자를 PBS에 용해시켰다(도 1 참조).
3. 돌외추출물-금나노입자(GP-AuNPs)의 특성 분석
(1). UV-visible 스펙트럼 분석
금 나노 입자는 특정 파장의 빛과 상호 작용하여 금 나노 입자의 독특한 광학적 특성을 나타낸다. 따라서, GP-AuNPs 입자의 형성은 반응 혼합물의 흡광도 스펙트럼을 모니터링하였다. 이때 녹색 합성 나노입자 용액을 UV-vis 스펙트로포토미터(Ultrospec 2100 Pro, Amersham Biosciences)로 300~700nm 범위에서 스캔하여 금염의 생물학적 환원을 확인하였다.
자외선 가시광선 분광법(UV-Vis)은 표면 플라즈모닉 공명이라고 하는 특정 파장의 개별 피크와 함께 특정 파장의 빛에 의한 여기를 유발한다. 연구에 따르면 금 나노입자는 500~600 nm 범위에서 가장 높은 흡광도를 나타낸다.
본 발명에서 돌외추출물을 이용하여 개발된 나노 입자의 UV-vis 특성을 조사한 결과, 300-700 nm 내에서 최대 흡광도가 금 나노 입자의 식별 피크인 532 nm에서 관찰되었으며, 이 나노입자를 20℃에서 보관한 후에도 나노입자 용액의 UV-Vis 스펙트럼에는 변화가 없었다. 그러나 돌외추출물 자체에는 이 파장 범위에서 흡수되지 않았다(도 2 참조).
돌외추출물-금나노입자의 합성을 위한 최적조건 설정을 위해 돌외추출물의 농도를 1~4% 첨가하며 조사한 결과 4%에서 가장 높았다. 이는 이보다 낮은 농도에서는 Au+에서 Au로 환원하는데 충분하지 않은 것을 알 수 있었다. 반응시간은 최대 20분까지 시간이 증가할수록 높았으며, 반응액의 pH는 3.5에서 가장 높았다(도 3a 내지 도 3b 참조).
(2). 전자현미경적 분석(Emission-transmission electron microscopy(FE-TEM)
합성된 GP-AuNPs 나노복합물의 형태, 분포 및 순도는 200kV로 작동되는 방출-투과 전자현미경(FE-TEM, JEM-2100F(JEOL)에 의해 결정되었다. 이를 위해 부분 정제된 나노입자 용액을 탄소 코팅된 구리 그리드에 놓고 이어서, 샘플을 60℃ 오븐에서 건조시킨 다음 FE-TEM으로 옮겨 나노 입자의 구성 및 크기 범위를 분석하였다.
EDX 분석은 나노 입자의 순도를 결정하기 위해 수행되었으며, 원소 매핑은 대상 성분(Au)의 분포와 위치를 조사하기 위해 사용되었다. 또한 전자 회절 패턴(SAED)을 사용하여 합성된 나노 입자의 결정 구조를 조사하였다.
도 4는 합성된 나노입자의 크기와 모양을 전자현미경(FE-TEM) 분석 결과이다. 제조된 나노 입자는 20~200 nm 크기의 구형이었다(도 4의 a, b 및 d 참조).
선택 영역 회절 패턴(SAED)을 사용하여 형성된 GP-AuNP의 결정도를 조사한 결과, 고리 형태의 회절 패턴의 결정질 특성을 나타내었다(도 4의 c 참조). 또한 원소 매핑으로 조사한 금 나노입자의 최대 분포는 GP-AuNP의 우세한 분포를 확인되었다. EDX 분석에서 GP-AuNP의 광흡수 밴드 피크는 약 2.2keV에서 나타나, 순수한 나노입자가 형성되었음을 알 수 있다(도 4의 e 및 f 참조).
(3). X선 회절 분석
X선 회절(XRD)은 40kv, 40mA에서 작동되는 X선 회절분석기(D8 Advance, Bruker, Germany)를 이용하여 수행하였다. 이때 CuKα 방사선은 20~80°의 2θ 범위에 걸쳐 0.02 단계 크기로 6°/분의 속도로 스캐닝하는 데 사용되었다. X선 회절분석을 정제된 나노입자 분말 5~6mg이 사용되었다.
도 5는 X선 회절 분광법(XRD)으로 GP-AuNPs의 결정 구조와 순도를 관찰한 것이다. 여기서, 38.1°, 44.41°, 64.60° 및 78.31°에서 회절 피크는 각각 (111), (200), (220) 및 (311) 격자 평면에 기인된 것이다. XRD 결과는 GP-AuNP가 면심 입방체(FCC) 구조를 가지고 있음을 나타내는 것이다.
이와 같은 GP-AuNPs 특성 연구 결과들은 돌외추출물을 사용하여 합성된 나노입자의 순도, 안정성 및 결정성을 확인해 준다.
(4). FT-IR 분석
FT-IR 조사를 위하여, 건조된 나노입자 분말을 FT-IR 분광기(PerkinElmer Spectrum One)를 사용하여 4cm-1의 분해능에서 4000-450cm-1에 걸쳐 스캔하였다.
FT-IR은 촉매와 캡핑제로서 나노입자에 이용 가능한 작용기 사이의 상호작용을 확인하기 위해 수행되었으며, 기록된 스펙트럼은 투과율 대 파수(cm-1)의 %로 표시하였다.
도 6에서 보는 바와 같이, 외추출물-금나노입자의 FT-IR 분석 결과, 3273.52, 2920.93, 1620.11, 1590.1, 1508.79, 1457.12, 1158.05, 1113.63, 1038.52, 803.38, 638.79 및 513.04 cm-1에서 흡수 밴드를 나타내었다.
GP-AuNPs에서 3,500~3,000 cm-1의 밴드는 일가 아민(N-H) 및 -OH기이며. 3273.52 cm-1의 피크는 페놀(-OH)로서, 돌외추출물 자체의 3278.39 cm-1와 비교된다. 또한 2920.93 cm-1의 흡수 피크는 C-H 스트레칭에 의한 것으로 다당류에 함유되어 있는 알칸과 페놀 영역과 비교된다.
파장 1650에서 1450 cm-1에서 보여주는 피크는 방향족환(aromatic ring)과 C=C이며, 1230에서 1020 cm-1의 밴드는 C-N기의 존재를 암시한다. 더 나아가서 1100에서 1010 cm-1에서의 흡수 피크는 C-O와 C-H 결합 본드이다.
FT-IR 분석에 따르면, 돌외추출물의 방향족 유기 화합물과 단백질은 금속 이온을 금속 나노 입자로 생물학적 환원시키는 역할을 한다. 단백질과 아미노산 잔기의 출현은 생합성 나노입자의 안정성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
또한, 돌외 추출물의 페놀 화합물은 나노입자를 코팅하고 GP-AuNP의 안정성을 촉진할 수 있다. 다음으로, 유리 아미노 그룹과 단백질은 캡핑 층을 형성하고 나노 입자의 응집을 방지하는 역할을 한다.
그 이상으로 GP-AuNPs의 활성 그룹은 자유 표면 그룹으로 인해 일부 약물 또는 생체 분자에 결합할 수 있으며, 이는 추가 약물 전달에 중요한 역할을 할 수 있다.
(5). 돌외추출물-금나노입자(GP-AuNPs)의 안정성 분석
돌외추출물-금나노입자(GP-AuNPs)에 대하여 온도, 시간 및 pH에 대한 안정성을 UV-vis 스펙트로포토미터를 이용하여 조사하였다. 시간의 변화에 따른 안정성을 확인하기 위하여, 수집된 나노입자의 흡광도를 30초에서 20분까지 측정하였고, 비슷한 방법으로 pH 안정성은 pH 3∼1의 범위에서 측정하였다.
4. 돌외추출물(GP-Ex) 및 돌외추출물-금나노입자(GP-AuNPs)의 생리활성 측정
(1). 세포 배양
돌외추출물(GP-Ex) 및 돌외추출물-금나노입자(GP-AuNPs)의 생리활성을 측정하기 위하여, 3T3-L1 섬유아세포 지방전구세포를 10% BCS 및 1% P/S(페니실린/스트렙토마이신)가 포함된 DMEM 완전 배지에서, 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 또한 RAW264.7 세포를 동일한 조건에서 10% 소태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다.
지방전구세포는 성숙한 지방세포와 구별되었다. 지방전구세포를 2 x 105개 세포/웰의 밀도로 12개의 건강한 플레이트에 간단히 플레이팅하였다. 세포는 90% 컨플루언스에 도달하도록 유지하고, 48시간 후 분화 배지 또는 지방생성 유도배지(MDI)를 사용하여 세포를 자극하였다.
MDI는 배지를 완성하기 위해 1μM 덱사메타손, 0.5mM IBMX 및 10μg/mL 인슐린을 사용하여 준비되었다. 2일째에, 세포를 GP-AuNP의 첨가 여부에 관계없이 지방형성 성숙 배지(완전 배지에 대한 10㎍/mL 인슐린)로 자극하고, 2일 동안 추가로 배양하였다. 8일째에 지방전구세포는 성숙한 지방세포로 분화되었고 현미경으로 관찰했을 때 지질 방울이 나타났다. 대조군으로는 세포를 완전 배지로만 성장시킨 것을 사용하였다.
(2). 세포독성 측정
3T3-L1 지방전구 세포와 RAW264.7 세포의 성장에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 먼저 RAW264.7 세포를 96-웰 플레이트에 1×104 cells/well의 밀도로 시딩하고 세포가 부착되도록 5% CO2, 37℃에서 하루 밤 배양하였다.
한편 3T3-L1 지방전구세포는 96-웰 플레이트(2 x 104 세포/웰)에 접종하고, DMEM/고글루코스 배지에서 밤새 부착되도록 하였다. 배양 배지를 버린 후 다양한 농도 (3.125~100μg/mL)의 돌외추출물(GP-Ex) 및 돌외추출물-금나노입자(GP-AuNP)를 각 웰에 추가하였다.
그런 다음 세포를 24시간 동안 인큐베이션하고 처리되지 않은 세포를 대조군으로 사용하였다. 24시간 후, 배지를 교체하고 MTT (3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 용액을 첨가하고(20 μL/웰) 2~3시간 동안 배양하였다.
마지막으로, 100 μL DMSO를 사용하여 세포를 염색하여 포르마잔(formazan) 결정을 유색 용액으로 생성시키고, 흡광도는 마이크로플레이트 리더(Bio-Tek In-struments, Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 570 nm에서 측정하였다. 다양한 농도의 GP 추출물 및 GP-AuNP와 함께 3T3L1 및 Raw 264.7 세포를 24시간 동안 배양한 후 GP-AuNP의 세포 생존 능력을 조사하였다.
도 7a 및 도 7b는 돌외추출물-금나노입자가 3T3L1 세포(도 7a) 및 Raw264.7 세포(도 7b)의 생존율에 미치는 영향을 측정한 결과로서, 대조군 또는 처리되지 않은 세포의 생존율의 백분율로 나타내었다.
도 7a 및 도 7b에서 볼 수 있듯이, 3.125μg/mL~100μg/mL 농도 범위의 돌외추출물 및 GP-AuNP와 함께 배양한 후 처리되지 않은 세포와 비교하여 Raw 364.7 세포에서 100μg/mL까지 유의한 독성이나 세포 사멸이 나타나지 않았다. 그러나 3T3L1 세포에서 100μg/mL에서 GP-AuNP는 독성을 나타내기 시작하였다. 따라서 후속 실험을 위해 3.125, 12.5 및 50 μg/mL의 농도를 선택하였다.
(3). 지방 축적에 미치는 영향 측정
지방전구세포(3T3-L1)에서 돌외추출물(GP-Ex)과 돌외추출물-금나노입자 (GP-AuNPs)복합물이 지방축적에 미치는 영향을 측정하기 위하여, 배양 14일째에 오일 레드(Oil Red) O 염색을 통해 세포내에 생성된 지질 방울을 시각화하였다.
즉, 성숙된 지방세포를 1xPBS로 세척한 후 10% 포르말린으로 1시간 또는 수일 동안 고정한 다음, 세포를 60% 이소프로판올에 담그고 완전히 건조시켰다. 그런 다음 성숙한 지방세포(adipocytes)를 오일 레드 O 용액을 사용하여 30분 동안 염색하고, 증류수로 세척하여 과도한 얼룩을 제거하였다.
도립 광학현미경(Nikon Instruments, Melville, NJ, USA)으로 완전히 분화된 세포에서 표현형 변화를 포착하고, 마지막으로, 성숙한 지방세포에 100% 이소프로판올을 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양한 후, 520 nm에서 흡광도를 측정하여 지방세포의 중성지방 함량(지질 축적)을 평가하였다.
과도한 지질은 인슐린 저항성으로 인해 트리글리세리드에 축적되어 지방 세포의 에너지 항상성의 불균형을 유발한다.
GP-Ex 및 GP-AuNP의 항비만 활성을 평가하기 위하여, 이들을 3.125~50μg/ml 농도로 처리하고 지방전구세포를 성숙한 지방세포로 분화한 후, 세포내 지질 방울을 오일 레드 O 염료로 염색하였다.
그 결과, 양성 대조군로 처리된 세포에서 과다하게 생성된 지질 방울을 볼 수 있다. 반면, GP-Ex 및 GP-AuNP로 처리된 세포는 양성 대조군보다 낮은 지질 축적을 나타내었다(도 8a 및 도 8b 참조). 지질 축적은 용량 의존적으로 감소되었으며, 현미경 이미지에 따르면 돌외추출물보다 합성된 나노입자가 지질 방울을 뚜렷하게 감소시켰음을 보여주었다.
도 8a 및 도 8b의 막대 그림은 위 결과를 흡광도를 측정하여 중성지방 함량을 정량적으로 보여준다. 여기서도 GP-Ex 및 GP-AuNP로 처리된 세포는 양성 대조군보다 트리글리세리드 함량이 더 낮았다. 이러한 결과는 GP-AuNPs 처리된 세포가 GP-Ex 처리된 세포보다 트리글리세리드 함량이 더 낮음을 보여준다.
(4). 지방분해 및 염증관련 유전자 발현에 미치는 영향 분석
돌외추출물-금나노입자(GP-AuNPs)를 처리한 지방세포(3T3-L1) 및 Raw 264.7 세포로부터 총 RNA를 분리하고, cDNA는 권장 프로토콜에 따라 상업용 cDNA 합성 키트(Onebio, Lithuania, EU)를 사용하여 1μg의 총 RNA에서 합성되었다. cDNA 합성 조건은 42°C에서 1시간, 그 다음 72°C에서 5분이었으며, 합성된 cDNA를 표적 유전자의 증폭에 사용하였다. RT-PCR에 사용되는 프라이머는 하기 표 2와 같다.
역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)은 94°C 변성 온도에서 30초 동안 PPAR-γ 및 CEPBα에 대해 수행되었고, 반응은 54°C에서 어닐링되었으며, 확장은 72°C에서 1분 30주기 동안 수행되었다.
TNF-α의 경우 반응이 94°C에서 변성되어, 54°C에서 32 사이클을 사용한 어닐링 온도. 증폭된 산물의 재어닐링을 허용하기 위해 최종 사이클을 완료한 후, 온도를 72°C에서 5분 동안 유지하였다. 마지막으로, 전기영동 및 PCR 샘플을 1% 아가로스 겔에 로딩하였다.
GP-AuNPs 지방세포 분화 억제 효과를 알아보기 위하여, RT-PCR을 통해 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 조사하였다.
도 9는 그 결과로서, GP-AuNPs 처리로 PPARγ, C/EBPα 발현이 농도 의존적으로 현저하게 억제되었다. 이러한 결과는 GP-AuNP가 전사 인자를 유의하게 하향 조절함으로써, 지방 생성을 억제함을 시사해 준다.
도 10은 GP-AuNPs의 항염증 효과를 조사하기 위하여, LPS 유도 RAW 264.7 세포에서 TNF-α의 mRNA 발현을 측정한 결과이다. TNF-α는 많은 사이토카인이 염증 반응과 가장 필수적인 사이토카인 중 하나인 종양 괴사 인자이다.
TNF-α 수준은 비만인의 혈장 및 지방 조직에서 더 높으며, 순환혈액 수준은 인간의 체중 감소와 함께 감소한다. 3가지 농도의 GP-AuNP에서 TNF-α 유전자 발현을 결정하기 위해 RT-PCR을 수행한 결과, GP-AuNP는 TNF-α 발현을 유의하게 억제하였다.
(5). 자유라디칼 소거능 측정
돌외추출물-금나노입자(GP-AuNPs)의 항산화활성 측정의 일환으로 자유라디칼 소거능을 DPPH 방법으로 측정하였다. 즉 다양한 농도의 GP-AuNPs(25, 50, 100, 200, 400 μg/mL)를 선택하고, 20μL의 나노입자 용액을 1 mM 메탄올성 DPPH 용액 180 μL에 첨가하며, 용액을 암실에서 30분 동안 보온하였다. 양성 대조군으로 비타민 C를 사용하여 보온이 끝난 후 517 nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다. 자유라디칼 소거활성(% 억제) = ([대조군 OD - 샘플 OD]/대조군 OD) × 100으로 결정하였다.
도 11은 그 결과로서, GP-AuNPs의 프리라디칼 소거 활성은 용량 의존적으로 증가하였다. 돌외는 이미 항산화 활성이 있는 것으로 입증되었으며, 이는 항산화 활성을 갖는 생리 활성 화합물의 존재함을 말해 준다. GP-AuNPs의 잠재적인 항산화 능력은 NPs에 의한 GP의 생리활성 분자 흡착에 기인할 수 있으며, 구형 GP-AuNPs는 더 넓은 표면적을 갖는 장점이 있다.
(6). 세포내 활성산소종 생성에 미치는 영향 측정
세포내 ROS(Reactive Oxygen Species) 생성은 분화된 세포를 실온에서 PBS로 세척하여 평가하였다. ROS 생성 수준은 일반적으로 사용되는 세포투과성 형광발색 프로브인 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트(H2DCFDA)를 이용하였다.
즉, 세포를 세척한 후, 10μM H2DCFDA(Sigma, USA)의 비형광 프로브를 30분 동안 첨가하고, 37℃의 암실에서 인큐베이션하였다. 마지막으로, 형광 방출 강도는 Spectra Fluor 다중 웰 형광 판독기로 각각 485와 495 nm에서 측정되었다.
도 12는 3T3L1 지방 세포에서 세포 ROS 생성을 조사한 결과이다. 도 12에서와 같이, 미처리 세포와 비교하여 MDI 분화 세포에서 세포 내 ROS가 현저히 증가하였다. 그럼에도 불구하고 DMI 유도 세포에 샘플 GP-AuNP를 처리했을 때 ROS 생성이 용량 의존적으로 감소하였다.
이러한 결과는 GP-AuNP는 항산화 특성을 가지고 있기 때문에, 3T3L1 세포에서 ROS 형성을 억제할 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
(7). 세포내 NO 생성에 미치는 영향 측정
세포내 NO 생성에 미치는 영향을 측정하기 위하여, RAW 264.7 세포를 다양한 농도의 돌외추출물(GP-Ex) 및 돌외추출물-나노입자(GP-AuNPs)로 1시간 동안 전처리하였다.
그 다음 세포를 1μg/ml LPS로 자극한 다음 24시간 동안 인큐베이션하고 배지 내 아질산염(nitrite) 수준을 Griess 시약을 사용하여 정량하였다. 즉, 100μl의 Griess 시약을 100μl의 상등액과 혼합하고, 최종적으로 마이크로플레이트 리더(Bio-Tek Instruments, Inc.)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
도 13a 및 도 13b는 돌외추출물(도 13a) 및 돌외추출물-금나노입자(도 13b)가 NO 생성에 미치는 영향을 측정한 결과이다. 두 시료 모두 LPS에 의해 유도된 NO 생성을 유의하게 억제하였으나, 돌외추출물-금나노입자가 항염증 효과가 더 높게 나타났다.
일반적으로 나노입자는 크기가 작고 표면적이 크며, 식물 추출물의 생리활성 분자를 흡수할 수 있다. 따라서 이러한 나노 입자는 용해도가 증가하여 생체 이용률이 향상된다. 따라서 GP-AuNP는 GP 추출물보다 비만 유발 염증에 대해 더 효과적임을 알 수 있다.
(8). 통계분석
데이터는 세 가지 독립적인 실험의 평균±SEM으로 표시하였으며, 처리군의 평균값은 Student's t-test를 사용하여 무처리군과 비교하였다. 그리고, 통계적 유의성은 P<0.05 수준에서 수용되었다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.
따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (18)

  1. 돌외추출물 및 금속나노입자를 포함하는 돌외추출물-금속나노입자 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 금속은 금 또는 은인 것을 특징으로 하는 돌외추출물-금속나노입자 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 돌외추출물은 돌외의 뿌리, 잎 및 줄기로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 추출물인 것을 특징으로 하는 돌외추출물-금속나노입자 복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체는 수용액 중 UV-vis 흡수 스펙트럼의 최대 피크가 525~540 nm에서 형성되는 것을 특징으로 하는 돌외추출물-금속나노입자 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체는 면심 입방체(FCC) 또는 구형 구조인 것을 특징으로 하는 돌외추출물-금속나노입자 복합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체는 돌외추출물에 비하여, 항비만 및 비만매개염증 억제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 활성이 증가되는 것을 특징으로 하는 돌외추출물-금속나노입자 복합체.
  7. (a) 돌외추출물과 금속염을 수용성 용매에서 혼합하는 단계;
    (b) 상기 혼합된 돌외추출물과 금속염을 반응시켜 돌외추출물-금속나노입자 복합체를 합성하는 단계; 및
    (c) 상기 합성된 돌외추출물-금속나노입자 복합체를 원심분리하여 반응하지 않은 돌외추출물 또는 금속염을 회수하는 단계를 포함하는, 돌외추출물-금속나노입자 복합체의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 금속은 금 또는 은인 것을 특징으로 하는 돌외추출물-금속나노입자 복합체의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 합성은 상기 돌외추출물이 담황색에서 보라색으로 변하는 것에 의해 확인하는 것을 특징으로 하는 돌외추출물-금속나노입자 복합체의 제조방법.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 돌외추출물-금속나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는 항비만용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 조성물이 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 항비만용 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 조성물이 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물인 것을 특징으로 하는 항비만용 조성물.
  13. 제10항에 있어서, 상기 조성물이 비만 예방 또는 개선용 동물사료 또는 동물사료 첨가제 조성물인 것을 특징으로 하는 항비만용 조성물.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 돌외추출물-금속나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 조성물이 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 조성물이 염증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 상기 조성물이 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
  18. 제14항에 있어서, 상기 조성물이 염증 예방 또는 개선용 동물사료 또는 동물사료 첨가제 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
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