KR20240010699A - 메탄자화균의 세포질 내막에서 이종 단백질 발현을위한 유전자 구조체 및 이를 이용한 백신 조성물 - Google Patents
메탄자화균의 세포질 내막에서 이종 단백질 발현을위한 유전자 구조체 및 이를 이용한 백신 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 목적 단백질을 암호화하는 제1 유전자; 상기 제1 유전자의 상류에 연결되고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 제2 유전자; 및 상기 제1 유전자의 하류에 연결되고, 서열번호 6의 아미노산 서열을 암호화하는 제3 유전자;를 포함하는 유전자 구조체, 이를 포함하는 벡터, 상기 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균 및 상기 메탄자화균을 유효성분으로 하는 백신 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 안정성이 향상된 내부막 발현을 위한 유전자 구조체 및 상기 유전자 구조체를 포함하는 메탄자화균에 관한 것이다.
메탄자화균은 유일한 탄소원이자 에너지원으로 메탄을 사용함으로써 호기적인 환경에서 생존할 수 있는 그람-음성(gram-negative) 미생물이다. 메탄자화균은 에너지 대사 과정에서 메탄가스를 산화시켜 이를 메탄올과 같은 고부가 화학물질로 전환시킬 수 있으며, 이러한 이유로 메탄자화균은 친환경적 미생물로서 학계의 주목을 받고 있다.
다수의 원핵생물은 세관(tubule), 연결된 소포체(interconnected vesicles) 또는 단일 또는 적층된 형태의 박막층(lamellae)의 형태로 세포질내막(intracytoplasmic membrane; ICM)을 발달시켜 에너지의 변환 및 대사 과정을 위한 막 표면적을 증가시키는 구조를 갖고 있다. 메탄자화균 역시 복잡한 세포질내막 구조를 가지고 있으며, 상기 메탄가스의 산화에 관여하는 메탄모노옥시게나제(particulate methane monooxygenase; pMMO) 효소 등의 단백질을 ICM에 고정된 채로 발현시키고 있다.
한편, 효소, 단백질, 펩타이드 등 외래의 목적 단백질을 다량 발현시키기 위한 미생물로서 종래에는 유산균과 같은 GRAS(generally regarded as safe) 미생물이 사용되곤 하였다. 예를 들어서, 유산균의 외막(outer membrane)에 항원 등 외래의 목적 단백질을 다량 발현시킨 뒤에 동물에게 주입시켜 면역반응을 유발시킴으로써, 종래 GRAS 미생물은 백신 조성물에 항원 전달체로서 포함될 수 있었다(Development of an Antigen Delivery Platform Using Lactobacillus acidophilus Decorated With Heterologous Proteins: A Sheep in Wolf's Clothing Story, 2020, Front Microbiol.). 또한 GRAS 미생물뿐만 아니라 메탄자화균을 이용하여, 외막인 S-층(S-layer) 단백질에 외래 목적 단백질을 결합시킨 형태로 발현시키는 기술도 개발되고 있는 실정이다(US 2021/0070810 A).
그러나, 세포 외막 발현이라는 위치의 특성상, 단백질의 발현량을 증가시키는데 한계가 있고, 세포 배양 중에 단백질이 단백질 분해효소(protease)에 쉽게 노출되어 안정적으로 발현되기 어렵다는 문제가 존재하여, 안정적으로 다량의 외래 목적 단백질을 발현시킬 수 있는 방법의 필요성이 존재하였다.
본 발명은 메탄자화균의 내막에서 목적 단백질의 발현을 유도할 수 있는 유전자 구조체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 구조체를 포함하는 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 구조체를 포함하는 메탄자화균을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균과, 알루미늄 애주번트를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면은, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 목적 단백질을 암호화하는 제1 유전자; 상기 제1 유전자의 상류에 연결되고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 제2 유전자; 및 상기 제1 유전자의 하류에 연결되고, 서열번호 6의 아미노산 서열을 암호화하는 제3 유전자;를 포함하는 유전자 구조체를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 본 발명은 상기 유전자 구조체를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 본 발명은 상기 유전자 구조체를 포함하는 메탄자화균을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 본 발명은 항원을 암호화하는 제1 유전자; 상기 제1 유전자의 상류에 연결되고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 제2 유전자; 및 상기 제1 유전자의 하류에 연결되고, 서열번호 6의 아미노산 서열을 암호화하는 제3 유전자;를 포함하는 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균과, 알루미늄 애주번트를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에 따라 메탄자화균의 내막에 외래의 목적 단백질을 발현시킬 경우, 목적 단백질을 외막에 발현시키는 것에 비해 발현량을 쉽게 증가시킬 수 있어, 효소, 단백질, 펩타이드 등 다양한 타깃을 미생물에 대량 발현하여 고정화 할 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 메탄자화균의 내막에서 목적 단백질을 발현시킬 경우, 균 외부의 단백질 분해효소에 의한 목적 단백질의 분해를 최소화할 수 있어, 기존 표면 발현의 안정성 문제를 효과적으로 개선할 수 있다.
또한, 메탄자화균은 생체 내 등 메탄이 존재하지 않는 환경에서는 증식이 차단되므로 사균화 과정에서 남아있을 수 있는 생균의 위험성을 최대한 억제시킬 수 있다는 장점이 있다.
특히, 메탄자화균의 내막에 항원 단백질을 집적 발현시키는 경우, 항원의 발현량을 쉽게 증가시킬 수 있으며, 이러한 메탄자화균을 백신의 유효성분으로 사용할 경우 개선된 면역원성을 나타낼 수 있다.
도 1은 메탄자화균의 내막에서 목적 단백질의 발현을 유도할 수 있는 유전자 구조체의 모식도를 도시한다. 대조군으로 세포질에서 발현되는 목적 단백질인 sfGFP를 암호화하는 서열로 이루어진 1번 유전자 구조체, 메탄올탈수소효소의 서브유닛과 sfGFP 서열을 연결한 2번 및 3번 유전자 구조체, pmoB 서열의 N-말단 도메인을 sfGFP 서열로 치환한 4번 유전자 구조체, 4번 구조체에 pmoC와 A 서브유닛을 암호화하는 유전자들이 추가된 5번 유전자 구조체, 그리고 pmoC, A 서열 및 pmoB의 C-말단 도메인을 대체하여 sfGFP를 도입한 6번 유전자 구조체를 포함한다.
도 2는 1번을 제외한 2번 내지 6번 유전자 구조체를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 메탄자화균을 배양 후, 이들의 흡광도 및 형광값 결과를 도시한다.
도 3은 4번을 제외한 1번 내지 3번, 5번 및 6번 유전자 구조체를 포함하는 재조합 벡터가 도입한 메탄자화균을 배양한 후, 세포 생장이 느린 3번 유전자 구조체를 포함하는 경우는 제외하고, 전세포 단백질 또는 파쇄된 세포에서 수용성 및 불용성 단백질로 분리하여 SDS-PAGE 분석한 결과를 도시한다.
도 4는 1번, 4번 및 5번 유전자 구조체를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 메탄자화균의 공초점 현미경 형광 결과를 도시한다.
도 5는 마우스에 대한 메탄자화균 투입 및 혈청 채취 스케줄과 항체 생성 확인을 위한 간접 ELISA 방법의 모식도를 도시한다.
도 6은 sfGFP를 고정 항원으로 하여, 메탄자화균이 투입된 마우스로부터 채취한 세럼을 처리함으로써 수행한 간접 ELISA 실험 결과를 도시한다.
도 2는 1번을 제외한 2번 내지 6번 유전자 구조체를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 메탄자화균을 배양 후, 이들의 흡광도 및 형광값 결과를 도시한다.
도 3은 4번을 제외한 1번 내지 3번, 5번 및 6번 유전자 구조체를 포함하는 재조합 벡터가 도입한 메탄자화균을 배양한 후, 세포 생장이 느린 3번 유전자 구조체를 포함하는 경우는 제외하고, 전세포 단백질 또는 파쇄된 세포에서 수용성 및 불용성 단백질로 분리하여 SDS-PAGE 분석한 결과를 도시한다.
도 4는 1번, 4번 및 5번 유전자 구조체를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 메탄자화균의 공초점 현미경 형광 결과를 도시한다.
도 5는 마우스에 대한 메탄자화균 투입 및 혈청 채취 스케줄과 항체 생성 확인을 위한 간접 ELISA 방법의 모식도를 도시한다.
도 6은 sfGFP를 고정 항원으로 하여, 메탄자화균이 투입된 마우스로부터 채취한 세럼을 처리함으로써 수행한 간접 ELISA 실험 결과를 도시한다.
이하, 본 발명은 상세히 설명한다.
1. 메탄자화균의 내막에서의 단백질 발현을 위한 유전자 구조체 및 이를 포함하는 벡터
본 발명의 일 측면은 메탄자화균의 내막에서 목적 단백질을 발현하기 위한 유전자 구조체를 제공한다.
상기 본 발명의 유전자 구조체에는 목적 단백질을 암호화하는 제1 유전자, 상기 제1 유전자의 상류에 연결되고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 제2 유전자 및 상기 제1 유전자의 하류에 연결되고, 서열번호 6의 아미노산 서열을 암호화하는 제3 유전자가 포함된다.
본 발명의 '목적 단백질'은 메탄자화균의 내막에서 발현시키고자 하는 임의의 단백질일 수 있다. 예를 들어서, 본 발명의 목적 단백질은 항원, 항원의 단편, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 리셉터, 리셉터의 단편, 항체, 단선 항체, 항체의 단편, 구조 단백질, 독소 단백질, 또는 이들의 일부 또는 전부가 융합된 단백질 등일 수 있다.
본 발명의 '제1 유전자', '제2 유전자', '제3 유전자' 등은 특정 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 의미한다. 구체적으로, '제1 유전자'의 경우, 상기 목적 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 의미하며, '제2 유전자'의 경우, PmoB 단백질의 N-말단에 위치한 1~34 아미노산을 암호화하는 핵산 서열을 의미하고, '제3 유전자'의 경우, 상기 PmoB 단백질의 N-말단에 위치한 166~277 아미노산을 암호화하는 핵산 서열을 의미한다. 이와 같은 '제1 유전자', '제2 유전자' 및 '제3 유전자'는 통상의 기술자가 당 기술분야에 알려진 적절한 방법을 채택하여 제조할 수 있으며, 예를 들어서 인공적 합성 방법, 분자생물학적 기법 등을 통하여 제조할 수 있다.
상기 'PmoB 단백질'은 메탄모노옥시게나제(particulate methane monooxygenase; pMMO) 단백질을 구성하고 있는 서브유닛 중 하나를 의미한다. 구체적으로, pMMO 단백질은 메탄자화균의 내막에서 고정되어 발현되는 단백질 중 하나로, 메탄을 메탄올로 산화하는 촉매(효소)이며, 서브유닛인 PmoB, PmoA 및 PmoC로 구성되어 있다. 본 발명의 'PmoB 단백질' 및 후술하는 PmoA 단백질' 또는 'PmoC 단백질'은 상기 pMMO 단백질을 구성하고 있는 서브유닛 단백질을 지칭한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은, 상기 PmoB 단백질의 N-말단에 위치한 1~34 아미노산을 암호화하는 제2 유전자가, 상기 목적 단백질을 암호화하는 제1 유전자의 상류에 연결되고, 상기 PmoB 단백질의 N-말단에 위치한 166~277 아미노산을 암호화하는 제3 유전자가, 상기 제1 유전자의 하류에 연결된 것인 유전자 구조체를 제공한다.
본 발명에서 '하류(downstream)' 및 '상류(upstream)'는 DNA 또는 RNA와 같은 핵산서열에서의 상대적인 위치를 의미한다. DNA 또는 RNA의 가닥에서 5-탄당의 인산기가 결합된 한쪽 끝을 5'-말단이라고 하고, 5-탄당의 3'-위치에 하이드록실기가 노출된 다른 쪽 끝을 3'-말단이라고 하여, DNA 또는 RNA 가닥은 각각 5'-말단과 3'-말단을 가지고 있다. 이러한 가닥 상에서 위치를 특정할 때, '하류'란 상대적으로 3'-말단 쪽의 위치를 의미하며, 상류란 상대적으로 5'-말단 쪽의 위치를 의미한다. 즉, 본 발명에서 상기 제2 유전자가 제1 유전자의 하류에 연결되었다는 것은, 제2 유전자가 제1 유전자의 3'-말단 쪽에 위치한 것을 의미한다.
본 발명에서 유전자의 '연결'이란, 본 발명의 유전자 구조체 상에서 유전자가 작동 가능하게 연결(operably linked)되어 있음을 의미하는 것이다. '작동 가능하게 연결'된 것이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적 단백질 등 유전자 구조체의 구성요소를 암호화하는 핵산서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어있는 상태를 의미한다. 예를 들어, 프로모터와 목적 단백질을 암호화하는 핵산서열이 작동 가능하게 연결되어, 암호화하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 벡터에서 핵산서열의 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 연결된 것일 수 있다.
상기 제2 유전자는 PmoB 단백질을 세포 내부 또는 외부의 목적지로 표적화시키기 위한 신호 서열(signal peptide)일 수 있다..
본 발명에서 'PmoB 단백질의 신호서열'이란, PmoB 단백질을 메탄자화균의 내막으로 표적화시키기 위한 신호서열을 의미하며, 구체적으로 PmoB 단백질의 N-말단에 위치한 1~34 아미노산 길이의 신호서열을 의미한다. 본 발명에서 'PmoB 단백질의 신호서열'은 서열번호 1의 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 PmoB 단백질의 신호서열은 서열번호 1의 서열을 암호화하는 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 또 다른 일 측면에서, 상기 제1 유전자와 상기 제3 유전자는 링커를 통해 연결되는 것인 유전자 구조체를 제공한다.
본 발명에서 '링커'란, 연결하고자 하는 유전자 또는 핵산서열 사이에 인위적으로 합성하여 삽입한 짧은 핵산서열 절편을 의미한다. 본 발명에서, 상기 링커는 글리신 및 세린을 포함하는 GS링커일 수 있다. GS링커는 특유의 유연성 때문에 다양한 융합 단백질에 이용되어 단백질의 접힘과 안정성을 향상시킬 수 있다.
GS링커는 (GGGGS)n의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산서열 절편으로 기재될 수 있으며, 상기 n은 1 내지 5의 정수이다. 본 발명에 따라 상기 목적 단백질과 PmoB 단백질이 링커를 통해 연결되는 경우, 접힘 과정에서 목적 단백질 및 pmoB 단백질의 잠재적 간섭을 최소화하여 각 단백질이 올바른 방향으로 안정적으로 형성될 수 있게 된다. 또한, GS링커는 고정된 구조를 갖지 않아 비면역원성이므로 체내에 투입된 경우에 불필요한 면역반응을 일으키지 않는다는 장점이 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은, PmoA를 암호화하는 제4 유전자 및 PmoC를 암호화하는 제5 유전자로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나를 더 포함하는 유전자 구조체를 제공한다.
상기 제4 유전자와 상기 제5 유전자는 제1 유전자, 제2 유전자 및/또는 상기 제3 유전자와 작동가능하게 연결되는 것일 수 있다.
상기 작동가능하게 연결된 것은 상기 제4 유전자 및/또는 제5 유전자와 상기 제1 유전자, 상기 제2 유전자 및 상기 제3 유전자가 모두 발현 가능할 수 있도록 연결된 것을 의미한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은, 상기 제2 유전자의 상류에 PmoA 단백질을 암호화하는 제4 유전자 및 PmoC 단백질을 암호화하는 제5 유전자로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나를 더 포함하는 유전자 구조체를 제공한다.
상기 제4 유전자 및/또는 상기 제5 유전자는 상기 PmoB의 신호 서열의 상류에 위치하는 것일 수 있다. 상기 제4 유전자와 제5 유전자가 모두 포함되는 경우에는, 상기 제4 유전자와 상기 제5 유전자가 상기 제2 유전자의 상류에 차례대로 위치하도록 연결되거나 상기 제5 유전자와 상기 제4 유전자가 상기 제2 유전자의 상류에 차례대로 위치하도록 연결되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는, 상기 제5 유전자, 상기 제4 유전자, 상기 제2 유전자 및 상기 제1 유전자의 순서로 위치하는 유전자 구조체일 수 있다. 본 발명의 또 다른 일 측면은, 상기 유전자 구조체를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 '벡터'는, 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물로서, 벡터 내 삽입된 유전자 구조체에 암호화된 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 재조합 발현벡터(recombinant expression vector)로서, 메탄자화균에 형질전환되어 상기 유전자 구조체를 발현시킬 수 있는 기능을 갖는 벡터를 지칭한다. 예를 들어서, 본 발명의 발현벡터는 플라스미드 벡터 또는 코스미드 벡터일 수 있다.
상기 플라스미드 벡터는 상업적으로 개발된 pUC18 플라스미드, pBAD 플라스미드, pIDTSAMRT-AMP 플라스미드, pJK001 플라스미드 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 '벡터'는, 상기 본 발명의 유전자 구조체에 더하여, RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터(operator) 서열, 리보좀(ribosome) 결합 부위를 암호화하는 개시코돈, 전사 및 해독의 종결을 암호화하는 종결코돈 등의 발현조절 요소와, 벡터가 메탄자화균에 형질전환된 경우에 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 더 포함할 수 있다. 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 단백질을 암호화하는 핵산서열의 일부로 간주되며, 단백질을 암호화하는 핵산서열의 해독틀(reading frame)과 일치해야 한다.
본 발명의 유전자 구조체 및 벡터는, 메탄자화균의 내막에서 상기 목적 단백질의 발현시키기 위한 것일 수 있다.
상기 '목적 단백질의 발현'이란, 목적 단백질을 메탄자화균 내막에 집적 발현함으로써, 본 발명의 유전자 구조체를 사용하지 않은 경우와 달리 목적 단백질을 발현시킬 수 있다는 것을 의미한다.
2. 유전자 구조체 또는 벡터를 포함하는 메탄자화균
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 유전자 구조체 또는 상기 벡터를 포함하는 메탄자화균을 제공한다.
본 발명에서 '메탄자화균(methanotroph)'이란, 메탄산화세균이라고도 호칭되며, 메탄을 유일한 탄소원으로 이용하여 생육하는 원핵생물을 의미한다. 대부분의 메탄자화균은 대기중의 메탄을 탄소원으로 사용하는데, 대체로 메탄을 메탄올의 형태로 산화시킨 뒤에, 생체 내 대사에 사용한다.
본 발명의 메탄자화균은 이에 제한되는 것은 아니나, 메틸로모나스 속(Methylomonas), 메틸로마이크로비움 속(Methylomicrobium), 메틸로박터 속(Methylobacter), 메틸로코커스 속(Methylococcus), 메틸로스페라 속(Methylosphaera), 메틸로칼덤 속(Methylocaldum), 메틸로글로버스 속(Methyloglobus), 메틸로사르시나 속(Methylosarcina), 메틸로프로펀더스 속(Methyloprofundus), 메틸로썰머스 속(Methylothermus), 메틸로할로비우스 속(Methylohalobius), 메틸로게아 속(Methylogaea), 메틸로마리넘 속(Methylomarinum), 메틸로벌럼 속(Methylovulum), 메틸로마리노범 속(Methylomarinovum), 메틸로러브럼 속(Methylorubrum), 메틸로파라코커스 속(Methyloparacoccus), 메틸로시너스 속(Methylosinus), 메틸로시스티스 속(Methylocystis), 메틸로셀라 속(Methylocella), 메틸로캡사 속(Methylocapsa), 메틸로퍼룰라 속(Methylofurula), 메틸아시디필럼 속(Methylacidiphilum) 및 메틸아시디마이크로비움 속(Methylacidimicrobium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 메탄자화균은 메틸로코커스 속의 균주일 수 있으며, 보다 바람직하게는 메틸로코커스 캡술라투스(Methylococcus capsulatus)일 수 있다.
상기 메탄자화균이 상기 유전자 구조체를 포함하는 경우, 유전자 구조체는 메탄자화균의 유전체에 도입(integration)되거나, 벡터에 포함된 상태로 상기 메탄자화균의 세포질에 도입된 것일 수 있다.
또한 본 발명에서 상기 벡터는, 메탄자화균에 벡터를 포함하는 리포좀을 이용하여 도입하는 방법, PEG를 이용하여 재조합 발현벡터를 도입하는 방법, 상기 재조합 발현벡터의 직접주입법, 미세입자충격법, 유전자총, 전기천공법(electroporation), 바이러스를 이용한 형질전환법 등에 의해 메탄자화균에 포함될 수 있다. 바람직하게는, 상기 발현벡터를 도입하는 방법은 접합(conjugation)일 수 있다.
본 발명의 메탄자화균에 상기 유전자 구조체 또는 벡터를 도입한 후에 배양시킬 경우, 유전자 구조체 또는 벡터에 포함된 유전자가 발현된다.
메탄자화균의 배양에 사용되는 배지는, 메탄자화균의 배양에 사용되는 것으로 알려진 NMS(nitrate mineral salts) 배지를 사용할 수 있다. 또한 상기 배지에는 NaCl, KCl 등의 염류, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 염기 화합물, 인산 또는 황산과 같은 산 화합물이 더 첨가될 수 있으며, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수도 있다.
본 발명의 유전자 구조체 또는 벡터를 포함하는 메탄자화균은 내막에서 목적 단백질을 발현함에 따라, 목적하는 단백질을 안정적으로 집적하여 발현시킬 수 있고, 발현된 목적 단백질이 메탄자화균의 외부로 노출되지 않기 때문에 외부의 환경에 의해 영향을 받지 않은 상태로 발현된 목적 단백질을 보존할 수 있다. 따라서 본 발명의 상기 메탄자화균은 상기와 같이 발현된 목적 단백질의 운반체(carrier)로 이용될 수도 있다.
상기 '목적 단백질', 'PmoB의 N-말단에 위치한 1~34 아미노산을암호화하는 제2 유전자', 'pmoA를 암호화하는 제4 유전자', 'pmoC를 암호화하는 제5 유전자', 'PmoB의 신호서열', '링커' 및 '벡터'는 상술한 1. 목적 단백질 및 PmoB를 암호화하는 유전자 구조체 및 2. 유전자 구조체를 포함하는 벡터 항목에서 설명한 바와 같다.
3. 백신 조성물
본 발명의 또 다른 측면은, 목적 단백질이 항원인 상기 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에서 '항원'이란 면역반응을 유도할 수 있는 성분으로서, 바이러스 또는 박테리아 등의 병원균이 발현하는 단백질일 수 있다.
상기 목적 단백질이 항원인 경우에는 상기 항원이 상기 메탄자화균의 내막에서 발현될 수 있다. 상기와 같이 내막에서 항원이 발현된 본 발명의 메탄자화균은 내막 발현이라는 위치의 특성상 항원을 안정적으로 다량 집적하여 발현할 수 있고, CH4 또는 CH3OH가 존재하지 않는 환경에서는 증식이 차단되어 사균화 과정에서 남아있을 수 있는 생균의 위험성을 원천 차단하여 안전한 항원 전달체가 될 수 있다는 특성이 있는바, 백신 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은, 애주번트를 더 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에서 '애주번트'는 백신의 면역 유도 효과를 높이기 위해 사용되는 물질을 의미하며, 면역증강제라고 불리기도 한다. 상기 본 발명에 사용될 수 있는 알루미늄 애주번트는 수산화알루미늄(aluminum hydroxide), 인산알루미늄(aluminum phosphate) 또는 알루미늄 히드록사이드 포스페이트(aluminum hydroxide phosphate)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 알루미늄 원소를 제공할 수 있는 화합물이라면 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 애주번트로 수산화알루미늄을 이용하였고, 그 결과 마우스 생체 내(in-vivo)에서 목적 단백질에 대해 특이적인 항체가 생성된다는 것을 확인하였다(실험예 3 및 도 6 참조).
상기 본 발명의 '백신 조성물'은 동물에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나 이상의 면역학적으로 활성인 성분을 함유하는 조성물을 의미한다.
상기 백신 조성물은 항원, 약제학적 허용가능한 담체, 적절한 보조제, 기타 통상적인 물질들을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 항원인 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편 또는 이의 바이러스-유사 입자를 생체내 부위에 전달하는데 적합한 임의의 성분을 의미하며, 구체적으로, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 혈청 함유 용액, 한스 용액, 기타 수용성의 생리학적 평형 용액, 오일, 에스테르 및 글리콜 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 담체는 화학적 안정성 및 등장성을 증진시키기 위해 적합한 보조 성분과 보존제를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 트레할로스, 글라이신, 솔비톨, 락토오스 또는 모노소듐 글루타메이트(MSG)와 같은 안정화제를 포함시켜 온도 변화 또는 동결건조에 대해 상기 백신 조성물을 보호할 수 있다.
상기 본 발명의 백신 조성물은 부형제 및/또는 안정화제 등의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어서, 본 발명의 백신 조성물은 산완충용액(phosphate buffered saline, PBS), 완충제(buffer), 등장화제(tonicity agent), 계면활성제(surfactant), 항산화제(antioxidant) 및/또는 염류(salts)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 백신 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 및 동결건조제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 본 발명의 백신 조성물은 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 또는 비강으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 투여경로를 통해 투여될 수 있다.
상기 본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 또는 수의학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 본 발명에서 '약학적으로 또는 수의학적으로 유효한 양'은 의학적 및/또는 수의학 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 백신 조성물은 면역학적 효과량으로 투여되는 것일 수 있다. 상기 "면역학적 효과량"이란 상기 항원 관련 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 항원에 따라 달라지며 면역 반응의 발생을 검사하기 위하여 당업자가 공지의 방법을 이용하여 이를 결정할 수 있다. 또한, 투여 형태 및 경로, 수용자의 연령, 건강 및 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 및 치료 횟수에 따라 변화될 수 있다.상기 약학 및/또는 수의학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
[실험예 1]
목적 단백질을 암호화하는 유전자 구조체의 제조
메탄자화균의 내막에서 목적 단백질을 가장 잘 합성하는 유전자 구조체를 선별하기 위하여, 아래 [표 1]의 6종의 유전자 구조체를 pAWP78 플라스미드 벡터(Addgene)에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다. 이때 클로닝 편의성을 위하여 대장균 내 복제개수(copy number)를 낮게 유지할 수 있게 벡터에서 oriVColE1를 제거한 버전을 만들어 이용하였다.
| 1 | pAWP-Po-sfGFP |
| 2 | pAWP-Po-mxaF-sfGFP |
| 3 | pAWP-Po-mxaI-sfGFP |
| 4 | pAWPS-Po-sfGFP-pmoB |
| 5 | pAWP-Po-pmoC-pmoA-sfGFP-pmoB |
| 6 | pAWP-Po-pmoC-pmoA-pmoB-sfGFP |
상기 [표 1]에 기재 및 도 1에 도시된 것처럼, 본 발명의 유전자 구조체 6종은 모두 Po 프로모터 부위, DmpR 암호화 부위 및 목적 단백질인 sfGFP의 암호화 부위를 포함하고 있다(도 1 참조). 구체적으로, 본 발명의 유전자 구조체에 암호화된 sfGFP(서열번호 2)는 Po 프로모터의 하류에 위치하고 있는 본 발명의 목적 단백질로서, Po 프로모터에 전사인자 및 RNA 폴리머라아제가 결합함으로써 전사된다. DmpR 단백질은 Po 프로모터에 결합하는 전사인자의 일종으로서, 본 발명의 유전자 구조체에서 DmpR 단백질을 암호화하는 부위는 Po 프로모터의 상류에 위치되어 있다.
각각의 유전자 구조체를 구체적으로 살펴보면, 1번 유전자 구조체에는 Po 프로모터의 하류에, sfGFP를 암호화하는 서열만이 메탄자화균 유래의 타 단백질을 암호화하는 서열과 결합되지 않은 채 단독으로 포함되어 있다.
2번 및 3번 유전자 구조체에는 Po 프로모터의 하류에, sfGFP를 암호화하는 서열과 메탄자화균 유래의 타 단백질을 암호화하는 서열이 결합된 형태로 포함되어 있다. 구체적으로, sfGFP를 암호화하는 서열(서열번호 2, start codon, ATG 제외)이 메탄자화균의 내막에 고정되어 발현되는 메탄올 탈수소 효소(methanol dehydrogenase)의 큰 서브유닛인 mxaF를 암호화하는 서열(서열번호 3)과 결합되어 있고(2번 유전자 구조체), 상기 효소의 작은 서브유닛인 mxaI을 암호화하는 서열(서열번호 4)과 결합되어 있는(3번 유전자 구조체) 형태로 포함되어 있다.
4번 유전자 구조체에는 Po 프로모터의 하류에, sfGFP를 암호화하는 서열(서열번호 2, 시작 코돈(start codon), ATG 제외)이 PmoB의 aa1-34의 아미노산 서열을 암호화하는 서열(서열번호 10)과 GS링커를 암호화하는 서열(서열번호 5)사이에 결합된 형태로 포함되어 있고, GS링커 서열의 하류에 PmoB의 aa167-277의 아미노산 서열을 암호화하는 서열(알파 헬릭스 막관통(alpha helix tansmembrane) 도메인과 C-말단 도메인, 서열번호 15)이 포함되어 있다.
5번 유전자 구조체에는 Po 프로모터의 하류에, sfGFP를 암호화하는 서열(서열번호 2, 시작 코돈(start codon), ATG 제외)이 PmoB의 aa1-34의 아미노산 서열을 암호화하는 서열(서열번호 10)과 GS링커를 암호화하는 서열(서열번호 5)사이에 결합된 형태로 포함되어 있고, GS링커 서열의 하류에 PmoB의 aa167-277의 아미노산 서열을 암호화하는 서열(알파 헬릭스 막관통(alpha helix tansmembrane) 도메인과 C-말단 도메인, 서열번호 15)이 포함되어 있으며, Po 프로모터의 하류이자 pmoB의 신호 서열의 상류에는 PmoC 및 PmoA 서브유닛을 암호화하는 서열(서열번호 7 및 서열번호 8)이 포함되어 있다.
6번 유전자 구조체에는 Po 프로모터의 하류에, PmoB 서브유닛의 aa1-aa268의 아미노산 서열을 암호화하는 서열(N-말단 도메인과 알파 헬릭스 막관통 도메인, 서열번호 9)이 GS링커를 암호화하는 서열(서열번호 5) 및 sfGFP를 암호화하는 서열(서열번호 2, 시작 코돈, ATG 제외)과 순차적으로 결합된 형태로 포함되어 있고, 상기 Po 프로모터의 하류이자 상기 PmoB의 aa1-34의 아미노산 서열을 암호화하는 서열의 상류에는 PmoC 및 PmoA 서브유닛을 암호화하는 서열(서열번호 7 및 서열번호 8)이 포함되어 있다.
5번 및 6번 유전자 구조체는 sfGFP 및 PmoB를 암호화하는 서열의 결합 방식에 차이점이 있다. PmoB 서브유닛의 N-말단에는 aa1-aa34 길이의 아미노산 신호서열(signal peptide)이 존재한다. 먼저, 5번 유전자 구조체는 상기 신호서열을 암호화하는 서열이 sfGFP를 암호화하는 서열과 결합되어 있고, sfGFP를 암호화하는 서열의 하류에 PmoB 서브유닛의 알파 헬릭스 막관통(alpha helix tansmembrane) 도메인과 C-말단 부분의 아미노산 서열(aa166-aa277)을 암호화하는 서열이 링커를 암호화하는 서열로 결합된 형태로 제작되어, PmoB 서브유닛의 신호서열이 나머지 PmoB 서브유닛 부분과 분리되어 있다. 반면, 6번 유전자 구조체는 상기 신호서열을 암호화하는 서열이 PmoB 서브유닛을 암호화하는 서열과 결합되어 있고, 그 하류에 sfGFP를 암호화하는 서열이 링커를 암호화하는 서열을 통해 결합된 형태로서, 상기 신호서열을 암호화하는 서열이 PmoB 서브유닛을 암호화하는 서열과 분리되지 않은채 도입되었다는 점에서 5번 구조체와 차이점이 있다.
[실험예 2]
메탄자화균 내막에서의 목적 단백질의 발현 확인
[2-1] 흡광도와 형광값을 통한 발현 확인
목적 단백질 발현 양상 및 이로 인한 세포 생장 저해 여부를 확인하기 위하여, 상기 [실험예 1]에서 제조된 재조합 벡터 6종을 메탄자화균(M. capsulatus)(American Type Culture Collection, ATCC)에 접합(conjugation)으로 도입시킨 뒤에 배양하였다. 상기6종의 메탄자화균과 야생형 메탄자화균에 대하여 세포 생장과 sfGFP의 발현을 각각 흡광도(OD600)와 형광값을 측정하였다. 흡광도는 배양된 메탄자화균을 분광광도계 (spectrophotometer (Biochrom, Cambridge, Cambridgeshire, UK))를 이용하여 600 nm 파장에서 측정하였다. 형광값은 FACSAriaⅢ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 Scatter (FSC)=350V, Phycoerythrin (PE)=500V 조건에서 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 3번 유전자 구조체의 경우 야생형 메탄자화균에 비하여 흡광도가 현저히 낮게 나타나, 세포 생장에 문제가 있는 것으로 확인되었으나, 5번 유전자 구조체의 경우에는 야생형 메탄자화균과 비슷한 수준의 흡광도를 나타내어, 세포 생장에 문제가 없는 점을 확인할 수 있었다. 또한, 2번, 3번, 5번 및 6번 유전자 구조체의 경우 야생형 메탄자화균에 비하여 모두 형광값이 증가되는 것으로 확인되었으며, 특히, 5번 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균에서는 발현되는 sfGFP에 의한 형광값이 현저히 높은 것으로 확인되었다.
[2-2] SDS-PAGE 통한 발현 확인
배양된 메탄자화균을 용해하여 전세포 단백질(whole cell protein)의 총 용해물을 수득하였다(T; Total Lysate). 총 용해물로부터 세포파쇄기(sonicator (Sonics & Materials, Newtown, CT, USA))를 사용하여 세포를 파쇄한 뒤 원심분리하여 가용성 및 비가용성 분획을 수득하였다.
총 용해물, 가용성 분획 및 비가용성 분획에 대하여 12% gel을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하여, 각각의 유전자 구조체에서 합성된 단백질의 발현 양상을 분석하였다(도 3 참조).
각각의 유전자 구조체에서 합성된 단백질을 구체적으로 살펴보면, 먼저 1번 유전자 구조체에서 합성된 sfGFP 단백질은 27.8 kDa의 크기를 갖는다. 1번 유전자 구조체에서 합성된 sfGFP 단백질은 메탄자화균 유래의 타 단백질과 결합되지 않은 형태이므로, SDS-PAGE시 가용성 분획에서 밴드가 확인될 것으로 예상되었으며, 예상대로 27.8 kDa 크기에 해당하는 밴드가 가용성 분획에서 확인되었다.
2번 유전자 구조체에서 합성된 MxaF-sfGFP 융합단백질은 94.1 kDa의 크기를 갖고, 3번 유전자 구조체에서 합성된 MxaI-sfGFP 융합단백질은 38.1 kDa의 크기를 갖는다. MxaF 및 MxaI 서브유닛은 둘 다 메탄자화균의 내막에 부착하여 발현되는 메탄올 탈수소 효소를 구성하고 있는 서브유닛이므로, SDS-PAGE시 비가용성 분획에서 밴드가 확인될 것으로 예상되었다. 관찰 결과, 2번 유전자 구조체의 경우 가용성 분획에서 MxaF-sfGFP 융합단백질의 크기에 해당하는 밴드가 확인되어, 이는 메탄자화균의 내막에 잘 고정되지 않은 채로 발현되는 것으로 추측되었다. 3번 유전자 구조체의 경우 세포 생장에 문제가 있는 것을 확인하였다. 다른 유전자를 포함하는 경우에 비해 세포가 매우 느리게 자라서 발현 양상은 같이 비교해 보지 못했다.
한편, 5번 유전자 구조체에서 합성된 sfGFP-PmoB 융합단백질은 58.5 kDa의 크기를 갖고, 6번 유전자 구조체에서 합성된 PmoB-sfGFP 융합단백질은 57.3 kDa의 크기를 갖는다. SDS-PAGE 결과, 5번 및 6번 유전자 구조체에서 합성된 sfGFP-PmoB 및 PmoB-sfGFP 융합단백질의 크기에 해당하는 밴드는 모두 비가용성 분획에서 확인이 되어, 이들 융합단백질은 모두 메탄자화균의 내막에 고정된 채로 발현되는 것으로 추측되었다.
다만, 5번 및 6번 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균에서 합성된 융합단백질에 해당하는 SDS-PAGE 상에서 5번 밴드의 두께가 6번에 비해 두꺼워, 5번 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균에서 발현되는 sfGFP의 발현량이 6번에 비해 큰 것으로 판단되었다.
[2-3] 공초점 현미경 관찰을 통한 발현 확인
상기 SDS-PAGE으로 확인한 목적 단백질 발현 양상을 가시적으로 확인하기 위하여, 대조군으로서 1번 유전자 구조체를 포함하는 메탄자화균, 가장 발현 수준이 우수하고 세포 생장 저해가 없었던 5번 유전자 구조체를 포함하는 메탄자화균 및 이의 비교군으로서 4번 유전자 구조체를 포함하는 메탄자화균을 공초점 현미경으로 관찰하였다. 상기 3종의 메탄자화균을 공초점 현미경(Carl Zeiss LSM 800)을 이용하여 렌즈 100X/1.3 oil, 레이저 파장 488 및 506nm(sfGFP Ex: 488, Em: 509, FM 4-64 Ex: 506, Em: 751)의 조건 하에 관찰하였다.
그 결과, sfGFP 단백질이 메탄자화균 유래의 타 단백질과 결합되지 않은 채로 합성된 바, 세포질 전반에 걸쳐 형광이 관찰되었다.
한편, 5번 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균에서는 초록색 형광이 메탄자화균의 내막에 집적된 형태로 관찰되었고, 빨간 염색제(dye)로 염색된 내부막과 일치하여 sfGFP-PmoB 융합단백질이 메탄자화균의 내막에 고정된 형태로 발현되는 것으로 확인되었다(도 4 참조). 또한, 도 4에 도시된 바와 같이, 4번 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균에서는 초록색 형광이 메탄자화균의 내에 집적된 형태로 관찰되었으나, 빨간 염색제로 염색된 내부막과 일치하지 않아, sfGFP-PmoB가 메탄자화균의 내막에 잘 고정되지 않은 형태로 발현되는 것으로 확인되었다. 특히, 5번 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균에서는 초록색 형광 신호와 빨간색 형광 신호의 상관 계수(Correlation coefficient)가 1번 또는 4번 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균에 비하여 유의적으로 높은 것으로 확인되었다. 이로부터 5번 유전자 구조체가 도입된 경우에 단백질의 자연적 폴딩(native folding)이 더 잘 일어나서 온전한 발광 활성을 갖는 sfGFP가 합성된 것으로 추측할 수 있었다.
상기 흡광도, 형광값, SDS-PAGE 및 공초점 현미경의 관찰 결과를 종합적으로 고려했을 때, 5번 유전자 구조체를 메탄자화균에 도입할 경우 목적 단백질인 sfGFP의 발현율 및 단백질 폴딩 안정성이 가장 우수한 것으로 판단되었다. 이에, 하기 [실험예 3]에서 마우스에 주입하기 위한 메탄자화균으로서, 5번 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균을 최종 선별하였다.
[실험예 3]
목적 단백질의 전달체로서 메탄자화균의 유용성 확인
메탄자화균이 목적 단백질의 전달체로서 기능할 수 있는지 확인하기 위하여, 상기 [실험예 2]에서 선별된 메탄자화균을 마우스에 주입하였을 때 항-sfGFP 항체가 생성되는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, '대조군 1'으로서 야생형의 메탄자화균(M. capsulatus Bath WT)이 현탁된 PBS 용액 0.1 mL, '대조군 2'로서 1번 유전자 구조체가 형질도입된 메탄자화균이 현탁된 PBS 용액 0.1 mL '실험군 1'로서 4번 유전자 구조체가 형질도입된 메탄자화균이 현탁된 PBS 용액 0.1 mL, '실험군 2'로서 5번 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균 및 현탁된 PBS 용액 0.1 mL을 사용하였다. 모든 대조군과 실험군에는 애주번트로서 수산화알루미늄(Alhydrogel® adjuvant 2% (vac-alu-250))이 포함되었다. 상기 대조군 1, 대조군 2, 실험군 1 및 실험군 2를 각각 6주령의 암컷 마우스(BALB/c)(두열바이오텍)에, 0일차(1차 투입) 및 14일차(2차 투입)에 근육주사(intramuscular injection) 하였다. 이때, 한 실험군의 용액을 여러 마리의 마우스에 주사하였다. 1차 투입 및 2차 투입된 세포량은 아래 [표 2]에 기재된 바와 같으며, 1차와 2차 투입 모두 세포량은 1x107 cells로 하였다.
| 1차 투입 세포량 | 2차 투입 세포량 | ||
| 메탄자화균 야생형+ 알루미늄 애주번트 | 대조군 1 | 1x107 cells | 1x107 cells |
|
1번 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균
+ 알루미늄 애주번트 |
대조군 2 | 1x107 cells | 1x107 cells |
|
4번 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균
+ 알루미늄 애주번트 |
실험군 1 | 1x107 cells | 1x107 cells |
|
5번 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균
+ 알루미늄 애주번트 |
실험군 2 | 1x107 cells | 1x107 cells |
상기 대조군 1, 대조군 2, 실험군 1 및 실험군 2의 메탄자화균을 첫번째 주입한 후 42일이 경과한 시점에 마우스를 희생시켰다. 각각의 마우스 개체의 심장에서 개체당 0.4~0.7 mL의 혈액을 채혈하고 상온에 20분동안 방치하여 혈액을 응고시킨 다음 4℃에서 1500× g로 10분간 원심분리를 하여 상청액으로부터 개체당 200μL의 혈청을 수득하였다. 상기와 같이 수득된 혈청을 대상으로, 간접 ELISA를 통해 항-GFP 항체가 생성되었는지를 확인하였다.
[3-1] 항체 생성능 확인 1 - Indirect ELISA
상기와 같이 수득된 혈청을 PBS를 이용하여 1:100으로 희석시킨 뒤에, 100 μL씩 항원인 sfGFP가 고정된 플레이트에 처리하였다. 그 이후, HRP(horseradish peroxidase)로 표지된 항-마우스 IgG 항체(ThermoFisher)를 1:10000로 희석하여 2차 항체로서 처리하였다(도 5의 b 참조).
HRP는 기질인 TMB(tetramethylbenzidine)와의 효소반응이 완료되면 450 nm 파장의 파란 빛을 흡수하기 때문에 노란 빛을 띈다. 따라서, 위 2차 항체에 표지된 HRP의 기질인 TMB를 처리하고 효소 반응이 완료된 뒤에, 분광 광도계를 이용하여 450 nm 파장에서의 흡광도를 측정함으로써 항-sfGFP 항체의 양을 측정하였다.
그 결과, 대조군 1 및 대조군 2의 메탄자화균이 주입된 마우스 혈청을 처리한 경우에는 O.D. 값이 약 0.2로 측정이 되어, 유의미하게 항-sfGFP 항체가 생성된 것으로 보기 어려웠다. 한편, 실험군 2의 메탄자화균이 주입된 마우스 혈청을 처리한 경우, O.D. 값이 0.432로 대조군 메탄자화균에 비하여 약 2 배 이상 가량 높게 측정되었다(도 6 참조). 또한, 도 6에 도시된 바와 같이, 대조군 1의 마우스 대비 실험군 2의 마우스에서는 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio, S/N)가 8.9이고, 대조군 2의 마우스 대비 실험군 2의 마우스에서는 신호 대 잡음비가 5.8인 것으로 확인되었다. 이로부터, 대조군 1 및 대조군 2의 마우스에 비하여 본 발명의 메탄자화균이 주입된 실험군 2의 마우스에서 항-sfGFP 항체가 상당량 생성된 것을 확인할 수 있었다.
상기한 결과로부터, 5번 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균과 알루미늄 애주번트를 마우스에 함께 주입하는 경우에 마우스에서 목적 단백질에 특이적인 항체가 잘 생성된다는 것을 확인하였다.
특히, 마우스에 메탄자화균을 주입할 때 균의 외막을 파쇄하지 않았음에도 불구하고, 내막에 고정되어 합성된 목적 단백질에 대해 특이적인 항체가 잘 형성된 것이 확인된바, 마우스의 면역 시스템에 의해 메탄자화균의 외막이 깨지고 내막에 고정된 목적 단백질이 항원으로서 잘 노출된 것임을 유추할 수 있다. 또한, 살아있는 메탄자화균을 주입한 경우에도 마우스가 생존하여 목적 단백질에 대한 항체를 생성한 바, 본 발명의 메탄자화균이 안정한 항원 전달체로 기능할 수 있음을 확인하였다.
즉, 본 발명의 5번 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균은, 목적 단백질을 마우스 생체 내로 유효하고 안정적으로 전달할 수 있는 항원 전달체로 기능할 수 있을 뿐만 아니라, 실험군 2에서와 같이 알루미늄 애주번트와 함께 주입되는 경우에는 목적 단백질에 특이적인 항체를 잘 생성해낼 수 있음을 알 수 있다.
상기에서는 본 발명의 대표적인 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
Claims (12)
- 목적 단백질을 암호화하는 제1 유전자;
상기 제1 유전자의 상류에 연결되고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 제2 유전자; 및
상기 제1 유전자의 하류에 연결되고, 서열번호 6의 아미노산 서열을 암호화하는 제3 유전자;를 포함하는 유전자 구조체.
- 청구항 1에 있어서,
상기 제1 유전자와 상기 제3 유전자는 링커를 통해 연결되는 것인, 유전자 구조체.
- 청구항 2에 있어서,
상기 링커는 (GGGGS)n 링커이고, 상기 n은 1 내지 5의 정수인 것인, 유전자 구조체.
- 청구항 1에 있어서,
상기 유전자 구조체는 PmoA를 암호화하는 제4 유전자 및 PmoC를 암호화하는 제5 유전자로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나를 더 포함하는 것인 유전자 구조체.
- 청구항 4에 있어서,
상기 PmoA를 암호화하는 제4 유전자 및 PmoC를 암호화하는 제5 유전자로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나는 상기 제1 유전자의 상류에 포함되는 것인 유전자 구조체.
- 청구항 4에 있어서,
상기 제2 유전자의 상류에 PmoA를 암호화하는 제4 유전자 및 PmoC를 암호화하는 제5 유전자를 더 포함하는 것인, 유전자 구조체.
- 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유전자 구조체는 메탄자화균의 내막에서 상기 목적 단백질의 발현을 향상시키기 위한 것인 유전자 구조체.
- 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 유전자 구조체를 포함하는, 메탄자화균의 내막에서 목적 단백질의 발현을 향상시키기 위한 벡터.
- 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 유전자 구조체를 포함하는 메탄자화균.
- 청구항 8의 벡터를 포함하는 메탄자화균.
- 항원을 암호화하는 제1 유전자; 상기 제1 유전자의 상류에 연결되고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 제2 유전자; 및 상기 제1 유전자의 하류에 연결되고, 서열번호 6의 아미노산 서열을 암호화하는 제3 유전자;를 포함하는 유전자 구조체가 도입된 메탄자화균과, 알루미늄 애주번트를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
- 청구항 11에 있어서,
상기 유전자 구조체는 상기 제1 유전자의 상류에 PmoA를 암호화하는 제4 유전자 및 PmoC를 암호화하는 제5 유전자로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나를 더 포함하는 것인 백신 조성물.
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2023
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